Ronéo n°5, UE 1 cours 9 1 sur 14

UE 1 Biochimie- Biologie moléculaire

Pr. LE BRAS

Le 22/10/19 de 15H30 à 17H30

Ronéotypeurs et ronéoficheurs : Marine LUCIANO et Maëlle CHAILLEUX

Cours n°9 : Cycle cellulaire, senescence et apoptose

La professeure a accepté de relire la ronéo. Elle a demandé de réfléchir à des questions d’examens pour mieux

apprendre son cours, celles citées en cours sont retranscrites à la fin de cette ronéo.

Elle a ajouté que le temps imparti à l’épreuve de biochimie serait rallongé et que les questions posées seraient plus

générales. De plus, un cadre de réponse serai mis en place pour éviter les hors sujets mais l’épreuve sera toujours

constituée de deux questions rédactionnelles.

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SOMMAIRE :

I. Introduction

II. La sénescence

a) Définition de la sénescence

b) Sénescence réplicative : les télomères

c) Sénescence réplicative : les effets délétères

d) Télomères : le lien entre croissance réplicative, vieillissement & cancer

e) Les pathologies

III. Le lien entre la sénescence et le cancer

a) L’exemple du gène RAS

b) Activation de P53 dans le traitement de l’APL

c) Le SASP

IV. Cycle cellulaire, sénescence, apoptose et métabolisme énergétique

a) Le sirtuines, senseurs de l’état énergétique de la cellule

b) Le stress oxydatif

c) La détoxification des radicaux libres et le ralentissement de la senescence

d) Le facteur de transcription P53

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La première partie du cours a fait l’objet d’une interaction étudiants/professeur, ayant pour but de rappeler et de

définir les termes : cycle cellulaire, senescence et mort cellulaire. La deuxième partie du cours explique en

profondeur la sénescence.

I. Introduction

Le cycle cellulaire est composé de 4 phases : G1, S (réplication), G2 et M. Il est au centre de régulations importantes,

notamment avec la protéine p53 ou encore avec les cyclines (CDK) et la protéine Rb. Il existe aussi une phase Go, une

phase de quiescence, qui est surtout réversible. La phase Go n’est pas une phase de sénescence (il ne faut surtout pas

confondre). En effet, une cellule peut rentrer dans une phase Go, rester dans cette phase, puis en sortir pour continuer

son cycle. Une cellule sénescente perd toutes ses capacités de prolifération. La senescence est irréversible.

La mort cellulaire regroupe plusieurs types de mort : l’apoptose, l’autophagie ou encore la nécrose.

Dans un premier temps l’autophagie est un processus de survie pour la cellule. Elle va se digérer elle-même pour

faire face à une carence de ses constituants (briques de construction). Mais si la carence persiste, la cellule va arrêter

de s’auto digérer (autodigestion limitée) et va entrer dans une voie d’apoptose (on passe d’un processus de survie à un

processus de mort).

La nécrose (cellule qui gonfle, explose et relargue son contenu dans le milieu environnant) se différencie de

l’apoptose par l’inflammation. La nécrose se produit à cause d’un stress sur la cellule (radicaux libres, agents

pathogènes). Elle ne consomme pas d’énergie (a contrario de l’apoptose qui consomme de l’ATP).

L’apoptose est une voie active qui nécessite de l’énergie. Elle est extrêmement régulée. Elle fait intervenir des

caspases (famille des protéinases), qui coupent des protéines après un acide aspartique.

Elle se caractérise par deux voies :

- La voie intrinsèque : le principal organite de cette voie est la mitochondrie. Cette voie nécessite des

protéines pro apoptotiques telles que BAX, BAK, BID et des protéines anti apoptotiques telles que BCL2

(calme le jeu). Ces protéines résident dans la mitochondrie. C’est la balance (formation de dimères) entre ces

protéines pro et anti apoptotiques qui conduit à la mort cellulaire ou non : BAX-BAX (mort cellulaire), BAX-

BCL2 (neutre), BCL2-BCL2 (survie).

- La voie extrinsèque : Fas, DISC, TNF-R (boîte de récepteurs de mort cellulaire) : actif en extracellulaire, ils

induisent la mort de la cellule lorsqu’ils sont activés.

L’apoptose permet aussi de protéger les cellules environnantes : en effet, il vaut mieux qu’une cellule incorrecte meurt

plutôt qu’elle ne prolifère de façon incontrôlée.

La sénescence est associée au vieillissement. On va développer cette phase dans la partie suivante.

II. La sénescence

Il existe deux théories concernant la sénescence, qui ne s’opposent pas forcément. La première stipule que la

sénescence est programmée : les années qui passent, l’horloge biologique et donc le vieillissement. La deuxième

explique qu’au fur et à mesure des années,

l’organisme se fatigue, et accumule des erreurs

(mutations, etc…) et des altérations qui ne seront

plus réparées.

a) Définition de la sénescence

Dans un premier temps, la cellule prolifère mais ce

mécanisme diminue avec le temps. Lorsque la

prolifération ralentie, c’est la phase de sénescence.

L’activité mitogénique est donc plutôt stable tout au

long de ce processus.

Au niveau phénotypique, on peut décrire la sénescence selon 3 points :

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- C’est un mécanisme de réponse au stress. Cette découverte date des années 60, elle a été faite par Hayflick

& Moorhead. On parle d’ailleurs de limite de Hayflick : limite de division cellulaire propre à chaque cellule.

Ils identifient la sénescence comme un mécanisme de réponse au stress. Si la cellule subit un stress important,

elle va s’arrêter de cycler mais ne va pas mourir pour autant (différent de l’apoptose).

- Blocage de la prolifération cellulaire : Cette phase peut durer très longtemps, l’activité métabolique

continue (permet de caractériser la sénescence), simplement la prolifération s’arrête. Une cellule sénescente

ne peut pas reprendre la prolifération lorsqu’on injecte des facteurs de croissances (insensible). On observe

aussi des changements morphologiques : le cytoplasme s’agrandit et le rapport noyau/cytoplasme diminue.

- Différents processus cellulaires impliqués : Dans un premier temps, on observe un raccourcissement des

télomères (le télomère se trouve à l’extrémité du chromosome, il s’agit d’une partie non codante, qui a pour

principal objectif de protéger l’ADN (métaphore du télomère par Ali : le télomère, c’est le bout de plastique

qu’on a au bout de notre lacet (chromosome) qui permet de le protéger. Au début ce bout de plastique est tout

beau, puis au fur et à mesure du temps, il s’abime, jusqu’à disparaitre, alors le lacet va s’effiler). Dans un

second temps, il y a une upregulation du locus CDNKN2A (locus qui code pour ARF qui contrôle p53 et

P16 qui contrôle Rb) et accumulation de dommages de l’ADN.

La senescence peut être induite par de nombreux de facteurs (la cellule sénescente apparait bleue car il s’agit du

marquage permettant de mettre en évidence l’activité métaboliques des cellules sénescentes) :

- Le stress oxydatif

- Le changement de milieu de cultures de façon répétée

- Les anomalies au niveau de l’ADN

- Les drogues

- Les gènes oncogéniques

- Les anomalies au niveau des télomères

b) Sénescence réplicative : les télomères

Ce graphique nous donne la taille du télomère en fonction du nombre de mitoses (plus on a de mitose, plus la taille

du télomère diminue). Au début, les télomères sont

longs, ils font environ 8 Kbs. Ils permettent de

protéger l’ADN. Passage après passage, leur taille

atteint 4 ou 5 Kbs, la protection est de moins en

moins importante.

Il y’a alors deux possibilités : Réparer les télomères

pour permettre de continuer la prolifération, ou

entrer en sénescence, pour éviter que la dégradation

du télomère ne continue trop (le risque étant

d’abîmer l’ADN codant).

Dans certaines situations particulières, ou on va

passer en dessous du 4 ou 5 Kbs, et donc donner

des cancers.

Pour éviter d’arriver à ce stade critique, il existe des

mécanismes qui permettent de rallonger les télomères : les télomérases : elles évitent la sénescence (permettent aux

télomères de garder une taille minimale). Certaines pathologies sont induites par les télomérases : en effet, des cellules

vieilles (avec beaucoup d’erreurs), qui devrait s’arrêter et mourir, continue de proliférer grâce à la réparation des

télomères : cela conduit à l’immortalisation des cellules.

Télomérases = Enzymes clés de la sénescence.

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c) Sénescence réplicative : les effets délétères

Comme mentionné précédemment, à chaque réplication il y’a un risque de dégradation des télomères et donc de

l’ADN (suppression d’une partie du chromosome). Pourquoi, et comment la cellule va-t-elle contrer cette sénescence

réplicative ?

Pourquoi ?

Petit rappel sur la réplication : le brin d’ADN va s’ouvrir pour former

deux brins. L’un des brins est répliqué de façon continue et l’autre de

façon discontinue. La synthèse du brin discontinu est permise grâce à

des primers ARN dégradés par la suite, et resynthétisés par la polymérase

1 pour obtenir un brin correct.

Lors de la dégradation du primer, des interstices se forment, posant

problème par la suite. Là où il y’a la matrice d’ADN, cela ne va pas poser

de problème, il pourra y avoir réplication et jonction des brins

discontinus. Par contre, au niveau de l’extrémité, le système Polymérase

I ne peut pas s’accrocher et ne peut donc pas répliquer (perte

d’information génétique)

Comment la cellule va-t-elle contrer cette sénescence réplicative ?

La télomérase ajoute une partie suplémentaire à l’extrémité du brin

pour permettre l’ancrage de la polymérase I et donc de synthétiser la

partie manquante.

Ainsi, réplication après réplication, le matériel génétique est conservé

(si on laissait le morceau non répliqué, on aurait alors un simple brin.

Pour la cellule, un ADN simple brin correspond à une erreur de

réplication, donc la cellule en attendant que l’ADN soit réparé, va se

mettre en pause.)

La télomérase n’agit pas seule. Il s’agit d’un grand complexe protéique (nommé Shelterin) composé de TFR1 et de

TFR2. La télomérase est responsable de l’activité enzymatique. Le

complexe Shelterin permet de protéger la télomérase. (Le schéma

énorme qui fait peur, n’est pas à apprendre).

d) Télomères : le lien entre croissance réplicative, vieillissement & cancer

Sans télomérase Avec télomérase

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La sénescence est en lien avec le vieillissement et la production de cellules immortelles : les cellules cancéreuses.

On s’est rendu compte, il y’a quelques années que la surexpression de la télomérase est très souvent retrouvée dans

les cancers chez homme.

Exemple expérience : dans un premier temps, on prélève une cellule épithéliale ou un fibroblaste sauvage et on le met

en contact avec différents agents qui ne modifient pas son activité. Puis on injecte une télomérase activé, ce qui induit

une immortalisation de la cellule, avec apparition de cancer.

A l’inverse, si on prend une tumeur de l’ovaire par exemple, et qu’on enlève par recombinaison génétique les

télomérases, alors la cellule ne vit plus, on observe une destruction des cellules tumorales.

e) Les pathologies

Exemple 1 : La progéria (des enfants qui ont un aspect de personnes très âgées)

Accentuation du vieillissement qui est dû à une dégénération de la taille des

télomères et à une modification des lamines du noyau cellulaire.

Exemple 2 : Syndrome de Werner

Maladie très rare. Induit une sénescence précoce, problème de réparation de l’ADN, accumulation d’anomalies de

l’ADN.

Tableau donnant tous les rôles de la protéine WRN.

Les exemples 1 et 2, sont des maladies très rares et extrêmement graves. Il existe des maladies plus fréquentes, liées à

des anomalies de sénescence.

Lamines d’un

patient sain

Lamines d’un

patient atteint

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Exemple 3 :

• Maladie d’Alzheimer (dans les maladies neurodégénératives, avec une augmentation de la sénescence et de

l’apoptose)

• Maladie de Parkinson

• Hypertension artérielle

• Dyslipidémies (niveau métabolique)

• Athérosclérose

• Diabète type 2

• Syndrome métabolique

• Cancer

Dans le diaporama, vous pouvez retrouver un joli texte en anglais qui vous explique le rapport entre sénescence et

lipides.

III. Le lien entre la senescence et le cancer

Il existe une autre maladie associée à la senescence : le cancer (même si ce concept est contre intuitif du fait de

l’implication du cancer dans la prolifération plutôt que dans la senescence).

En effet, on observe dans les cancers un cross talk entre ces deux grandes voies avec un passage de la senescence

réplicative (physiologique) à la senescence induite par les oncogènes.

a) Exemple du gène RAS

Le gène Ras activé (HRASG12V), muté, est un exemple de gène oncogénique qui induit une senescence. Ce

phénomène est prouvé in vitro mais il est aussi valable in vivo. Certaines cellules sénescentes ont été observées dans

des lésions précancéreuses chez la souris, mais aussi chez l’homme notamment dans le pancréas, les poumons ou

encore dans les mélanocytes nevi (les grains de beauté). La senescence permet d’expliquer leur faible taux de

malignité (faible taux de prolifération). In vivo, les lésions précancéreuses sont déjà engagées dans une voie mais

exprime quand même tous les marqueurs de la senescence. Seulement, la senescence induite par l’oncogène observée

dans les lésions précancéreuses est temporaire, il s’agit d’une solution de dernier recours. L’oncogène favorise la

prolifération mais dans le cadre de la senescence, il provoque soit une apoptose directe soit, lorsque c’est impossible,

un arrêt complet de la prolifération et de la réplication, avec un blocage de la télomérase. La senescence réplicative est

un phénomène naturel (vieillissement), tandis que la senescence induite par un oncogène est un outil déployé par la

cellule comme rempart contre l’oncogène. Ainsi, ils sont présents dans les petites lésions à faible taux de croissance

(peu maligne) afin d’empêcher la prolifération de l’oncogène.

Aujourd’hui, il existe de nombreux

exemples chez l’homme de

senescence induite par un oncogène

ou par la perte d’un gène suppresseur

de tumeur et qui présentent tous les

marqueurs spécifiques de la

senescence comme l’activation de p53

ARF par exemple ou SABG

(senescence-associated -

galactosidase) qui sont des gènes

suppresseurs de tumeurs. SABG

correspond au marquage bleu observé

au niveau des cellules sénescentes.

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Ces marqueurs sont observables dans les tumeurs mammaires mais aussi dans les poumons, les navis, la prostate ou

encore le thymus par exemple. Ainsi, de nombreuses pathologies tumorales présentent des phénotypes sénescents si

elles sont prises très tôt.

Evidences in vivo chez l’homme

Conclusion : Lorsqu’un phénomène de prolifération se développe de manière incontrôlée, on observe une activation

de l’oncogène (gène dominant) ou une suppression du gène suppresseur de tumeur bloquant la prolifération (ce

gène est en général récessif) pour induire une sénescence.

Depuis la découverte de ce mécanisme, de nombreux laboratoires cherche à utiliser l’induction de la senescence

comme stratégie thérapeutique. En effet, son action durable pourrait être un atout majeur dans de nombreuses

thérapeutiques.

b) Activation de P53 dans le traitement de l’APL

L’activation de p53 est utilisée dans le traitement d’un type particulier de leucémie.

La leucémie est étudiée grâce à une souris malade, traitée ou pas, dont on prélève la moelle osseuse pour la greffer à

une souris receveuse et en observer les conséquences.

Cette première expérience est effectuée sur des souris exprimant le gène p53. Dans le cas de souris p53 knock out, les

courbes se superpose : en l’absence du gène p53, le bénéfice du traitement est perdu, il est donc nécessaire pour

obtenir une réponse au traitement. De plus, l’absence de p53 entraine une accélération du processus de mort chez les

souris, traitées ou non (100 de souris mortes au 20eme jour).

Dans le cas des souris malades non

traitées, toutes les souris receveuses sont

mortes à j38. En l’absence de traitement

(acide rétinoïque) les cellules leucémiques

ont envahi leur moelle osseuse,

provoquant le décès des souris greffées.

Dans le cas des souris malades mais

traitées, la première souris receveuse

meurt plus tardivement qu’en l’absence de

traitement (45eme contre 25eme jour) et

certaines sont toujours en vie après 80

jours. Cette différence significative entre

les deux courbes permet de conclure que

le traitement est efficace.

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c) Le SASP

Les cellules qui ne s’exprime plus ne sont pas mortes, elles ne prolifèrent plus et peuvent rester immobiles longtemps

mais elles interagissent avec leur environnement. Elles répondent à différentes cytokines une fois entrées en

senescence et peuvent communiquer par SMS ou SASP (Senescent Associated Secretory Phenotype) avec des cellules

sénescentes voisines pour protéger le tissu et éviter la prolifération (c’est le cas des grains de beauté qui n’évoluent

jamais s’ils ne subissent pas d’autres altérations par exemple). Par production de cytokines, les cellules sénescentes

peuvent induire la senescence de cellules de leur environnement proche, pour lutter contre un stress par exemple. Les

cellules sénescentes peuvent aussi interagir avec les cellules stromales du microenvironnement pour pousser le stroma

à arrêter l’induction de la prolifération et maintenir la sénescence de cellules altérée. Enfin, elles peuvent recruter le

système immunitaire pour phagocyter les cellules apoptotiques grâce à leur communication via cytokines. Ces

différents aspects de la senescence correspondent au côté positif de ce mécanisme et concerne plus spécialement la

senescence réplicative.

Ainsi, deux gènes sont essentiels à la survie

cellulaire : les gènes P53 et PML. Un

transcriptome a été réalisé pour observer les

différents gènes modulés et, parmi eux, on

retrouve beaucoup de cibles de p53. Le traitement

à l’acide rétinoïque induit de nombreux gènes

différents qui répondent à p53 et qui sont

impliqués dans la senescence. Cela peut expliquer

la possibilité de soigner des patients avec de

l’acide rétinoïque par la voie de la senescence,

contrôlée par p53 et PML. Ces deux gènes ont une

importance majeure en thérapeutique : Il est

impossible de soigner un patient leucémique avec

de l’acide rétinoïque si ce dernier présente une

mutation p53 inactivatrice même si ce traitement

est efficace en temps normal.

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IV. Cycle cellulaire, sénescence, apoptose et métabolisme énergétique

Le métabolisme est le lien entre cycle cellulaire, senescence et apoptose et est contrôlé par un acteur essentiel (cf

cours précédent).

a) Le sirtuines, senseurs de l’état énergétique de la cellule (cf cours précédent)

Les sirtuines jouent un rôle essentiel dans le métabolisme, par le biais des mitochondries notamment et de l’équilibre

énergétique. Les localisations des sirtuines sont nombreuses, par exemple la sirtuine 1 (histone deacétylase) qui

modifie P53 et les histones est nucléaire. D’autres sirtuines sont retrouvées dans les mitochondries, dans le

cytoplasme ou encore le nucléole des cellules. De multiples passway moléculaires sont régulés par ces sirtuines

(enzymes deacétylantes) dépendantes du statut énergétique de la cellule en NADH, H+ et dont les cibles principales

sont les facteurs de transcription comme P53 et FOXO. En fonction du niveau globale en sirtuines qui dépend donc

du niveau énergétique de la cellule, le niveau global d’acétylation va varier : avec un taux faible de sirtuines (low), la

cellule est globalement acétylée et avec un taux élevé en sirtuines (fort taux de NADH) on observe plutôt une

deacétylation de la cellule.

Les cellules tumorales, elles,

sont capables de s’emparer de

la signalisation cytokinique

afin d’en tirer un avantage :

elles ont la capacité de dérégler

les systèmes de production des

cytokines afin d’obtenir une

aide proliférative des cellules

stromales dont le rôle

physiologique est de

normalement bloquer cette

prolifération cellulaire. Ces

deux systèmes peuvent

coexister dans la cellule.

Ronéo n°5, UE 1 cours 9 11 sur 14

b) Le stress oxydatif

c) La détoxification des radicaux libres et le ralentissement de la senescence

Au niveau métabolique et mécanistique la détoxification s’opère par des enzymes du système de réparation qui

contrôle ces niveaux d’oxydation.

D’autres facteurs vont tenir

lieu de senseurs de l’état

énergétique de la cellule.

Certains vont bloquer la

sénescence comme les

sirtuines, la restriction

calorique, la p53 ou encore le

resveratrol et d’autre vont au

contraire la favoriser comme

la voie qui implique les

facteurs de croissance ou

insulinique, la voie TGF- ou

encore augmentation du stress

oxydatif par la respiration

mitochondriale.

Tout ceci permet de contrôler

l’état énergétique de la cellule

et de faire la balance entre

prolifération, senescence et

apoptose.

Le stress oxydatif conduit à un arrêt du

cycle cellulaire, à la senescence ou à

l’apoptose. Il est composé de différentes

molécules notamment l’oxygène (cf cours

dédié) et est produit par pleins de passway

différents, endogènes ou exogènes qui

impliquent la mitochondrie ainsi que des

altérations de l’ADN.

Ronéo n°5, UE 1 cours 9 12 sur 14

Au niveau métabolique et alimentaire, il est possible d’influer sur le stress redox en favorisant une

alimentation riche en antioxydants avec par exemple le resveratrol contenu dans le raisin, mais aussi d’autres

antioxydants présents dans les fruits et légumes frais, les huiles de poisson (contiennent aussi des lipides saturés très

bon pour la santé). Cela correspond au régime crétois ou méditerranéen.

d) Le facteur de transcription p53

P53 est un acteur central dans toutes les voies : il est proapoptotique, anti-cycle, inducteur de la senescence et il

contrôle le métabolisme. Il s’agit d’un facteur de transcription très peu exprimé dans la cellule : il est constamment

dégradé par ubiquitination par l’ubiquitine ligase MDM2.

Les cellules stressées émettent différents signaux qui

converge vers des cascades de signalisation

(phosphorylation par exemple). P53 va être modifié,

phosphorylé, acétylé et ainsi stabilisé pour ensuite

être activé et pouvoir jouer son rôle de facteur de

transcription. Parmi toutes les voies qu’il régule, il y a

celle de l’arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M

après la réplication s’il survient une anomalie grâce à

gad45 entre autre ou en phase G1/S avant la

réplication via l’expression de p21, ainsi que celle de

l’apoptose. Les gènes cibles de p53 correspondent à

des gènes de réparation de l’ADN, des gènes de la

senescence (abordés dans l’exemple de la souris

leucémique qui ne peut guérir qu’en présence de p53

et du traitement) ainsi que des gènes essentiels du

métabolisme (il s’agit de voies ancestrales, connues

depuis 70 ans) notamment les gènes qui associent la

voie de la glycolyse et celle des pentoses phosphates.

Ronéo n°5, UE 1 cours 9 13 sur 14

P53 est capable de réguler un gène inhibant la

glycolyse en fonction des besoins en antioxydants

(NADPH) : s’il est nécessaire de privilégier le

shunt pour détoxifier les ROS, P53 active la voie

des pentoses phosphates plutôt que la glycolyse

pour produire NADPH et permettre l’inhibition

des ROS mitochondriales. Les traitements

induisent P53 qui lui-même provoque l’induction

de p21 et TIGAR selon un lien de cause à effet. La

réponse antioxydante est essentielle au bon

fonctionnement de la cellule, P53 fait donc partie

des molécules centrales, tout comme les sirtuines

et la régulation du métabolisme.

Lorsque la cellule subit un petit stress, P53

privilégie les molécules antioxydantes afin de

détoxyfier la cellule et revenir à un état normal.

En revanche, si le stress est trop important, P53

induit des molécules prooxydantes pour

déclencher l’apoptose. Il s’agit d’un équilibre

subtil : en l’absence de stress, p53 a une action

antioxydant afin de diminuer la quantité de ROS et

éviter les problèmes mutationnels mais si le stress

devient trop important, P53 augmente les ROS et

conduit à la mort cellulaire. Le fait que le facteur

p53 soit muté dans 1 cancer sur 2 explique leur

capacité à proliférer de façon incontrôlée et

l’accumulation possible de mutations.

Ronéo n°5, UE 1 cours 9 14 sur 14

Shéma bilan :

Questions type examen :

- Décrivez l’effet de la restriction calorique, de la suralimentation.

- A travers l’exemple de la senescence, expliquez le cross talk entre le métabolisme et la signalisation.

- Expliquez en quoi les modifications post traducyionelles peuvent avoir un impact sur la senescence.