Cours Microbiologie MST-PE1

DESAMicrobiologie & Bio-ingnierie

M.A. BAHLAOUI

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SOMMAIREIntroduction la Microbiologie Prparation et coloration des chantillons La taille, la forme et larrangement cellulaire Organisation de la cellule procaryote Rappels de la chimie des molcules organiques Les besoins nutritifs courants Les besoins en carbone, oxygne et hydrogneM.A. BAHLAOUI FSTM 2006 3

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SOMMAIRELes types nutritionnels chez les micro-org. Les besoins en azote, phosphore et soufre Les facteurs de croissance Labsorption des nutriments par la cellule Les types de milieux de culture La morphologie et la croissance des colonies Lisolement des cultures puresM.A. BAHLAOUI FSTM 2006 4

SOMMAIREMicro-organismes et cosystmes aquatiques Lois dinteractions entre micro-organismes Les micro-organismes agents biogochimiques Micro-organismes et eaux naturelles Micro-organismes et eaux dalimentation Les tapes danalyse microbiologique des eaux Les mthodes de dnombrement bactrienM.A. BAHLAOUI FSTM 2006 5

SOMMAIRELes tapes de lidentification bactrienne Les pralables lidentification Les mthodes traditionnelles didentification Lidentification numrique Les bactries tmoins de contamination fcale La recherche et lidentification des germes totaux La recherche et lidentification des coliformesM.A. BAHLAOUI FSTM 2006 6

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SOMMAIRELa recherche et lidentification des streptocoques La recherche et lidentification des spores Les normes bactriologiques des eaux potables Linterprtation des rsultats danalyse Biodgradation des xnobiotiques Atelier : Systmatique bactrienne Synthse et cltureM.A. BAHLAOUI FSTM 2006 7

Principales rfrences suggres r suggMICROBIOLOGIE GENERALE. H. Leclerc, J.-L. Gaillard et M. SimonetDoin Editeur, Paris, 1995

ABREGE DE MICROBIOLOGIE. P. Singleton, D. SainsburyMasson Editeur, Paris, 1984

MICROBIOLOGIE GENERALE. J.-P. Rgnaut,Dcarie Vigot Editeur, Paris, Montral, 1990

GENERAL MICROBIOLOGY. H. G. Schlegel Sixth Edition. Cambridge University Press, 1986 MICROBIOLOGIE DES EAUX DALIMENTATION.C. Haslay, H. Leclerc Tec. & Doc. Lavoisier, Paris, Londre, New York, 1993

MICROBIOLOGIE: LE TUBE DIGESTIF, LEAU ET LES ALIMENTSH. Leclerc, D. A. A. Mossel, Doin Editeur, Paris, 1989M.A. BAHLAOUI FSTM 2006 8

Introduction1- Quest ce que la microbiologie Qu

Etude dorganismes trop petits pour tre vus lil nu, cest--dire les micro-organismes On classe aujourdhui parmi les micro-organismes : Les algues et les myctes Les protozoaires Les bactries Les virus

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Introduction2- Bref historique de la microbiologie

Premires observations : La dcouverte des micro-organismes Premires tudes exprimentales : Le dbat sur la gnration spontane Bases scientifiques de la microbiologie : Origine bactrienne des maladies infectieuses Dcouverte du rle cologique des bactries : Leur effet sur la matire organique Importantes dcouvertes concernant les bactries : Le rgne de la biologie molcualireM.A. BAHLAOUI FSTM 2006 10


Premires observations : La dcouverte des micro-organismes Observation et application empirique de phnomnes de nature bactrienne Van Leeuwenhoeck (1632 1723)Premires observations et description des bactries

Deux sicles plus tard Les bactries demeurent une simple curiosit scientifique

Relance du dbat sur la gnration spontane lintervention des tres vivants prexistants nest pas ncessaire la procration

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Premires tudes exprimentales : Le dbat sur la gnration spontane Francesco Redi (1626 1697)Mise en doute de la thorie de la gnration spontane en ce qui concerne les organismes plus grands

John Needham (1713 1782)La matire organique possde une force vitale qui pouvait donner les proprits de vie la matire non vivante

Plus tard Lazzaro spallanzani (1729 1799) Thodore schwann (1810 1882) Georges Friedrich Schroder et autres Origine arienne des contaminations

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Premires tudes exprimentales : Le dbat sur la gnration spontane Felix Pouchet (1859)Les micro-organismes se dveloppent sans la contamination par lair

Louis Pasteur (1822 1895)Coup de grce, en 1861, la thorie de la gnration spontane

Naissance de la thorie germinale Un organisme vivant ne peut provenir que dun organisme vivantM.A. BAHLAOUI FSTM 2006 13


Bases scientifiques de la microbiologie : Origine bactrienne des maladies infectieuses Davaine (1882)Description de bactridies immobiles dans le sang danimaux morts de la maladie du charbon

Rober Koch (1843 1910) et Louis PasteurPremire dmonstration directe du rle des bactries dans les maladies (tude du charbon)

1884 : Publication du Postulat de KochLe micro-organisme doit tre prsent dans chaque cas de maladie, mais absent des organismes sains Le micro-organisme suspect doit tre isol et cultive en culture pure La maladie doit se dvelopper quand le micro-organisme isol est inocul un hte sain Le mme micro-organisme doit de nouveau tre isol de lhte malade

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Bases scientifiques de la microbiologie : Origine bactrienne des maladies infectieuses Lister (1867)Strilisation des instruments chirurgicaux par la chaleur, utilisation du phnol sur les pansements

Koch (1843 1910)Tentatives pour isoler les bactries en culture pure (surface de pommes de terre et glatine comme agent solidifiant)

Fannie Hesse (1850 - 1934)Introduction de lagar comme agent solidifiant

Richard Ptri (1887)Mise au point de la bote de Ptri

Koch (1882)Lancement du bouillon nutritif et de la glose nutritiveFSTM 2006 15

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Introduction2- Bref historique de la microbiologieMaladie Charbon Blennorragie Fivre typhode Fi typho Malaria Tuberculose Cholra Chol Diphtrie Dipht Ttanos Diarrhe Diarrh Pneumonie Mningite Fivre ondulante Fi Gangrne gazeuse Gangr Peste Botulisme Dycentrie Dycent Syphilis M.A. BAHLAOUI Agent causant la maladie Bacillus anthracis Neisseria gonorrhoeae Salmonella typhi Plasmodium sp. Mycobacterium tuberculosis Vibrio cholerae Corynobacterium diphteriae Clostridium tetani Escherichia coli Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis Brucella sp. Clostridium perfreingens Yersinia pestis Clostridium botulinum Shigella dycenteriae Treponema pallidium FSTM 2006 Scientifique responsable Koch / Pasteur Neisser Eberth Lawran Koch Koch Klebs et Loeffler Nicolaier Escherich Frankel Weischelbaum Bruce Welch et Nuttal Kitasato et Yersin Van Ermengem Shiga Schaudin et Hoffman Date 1876 1879 1880 1880 1882 1883 1883-84 18831885 1885 1886 1887 1887 1892 1894 1896 1898 1905 16


Bases scientifiques de la microbiologie : Origine bactrienne des maladies infectieuses PasteurDcouverte du vaccin et prparation du premier vaccin contre la rage

Emile Von Behring (1890)Prparation des antitoxines contre la Diphtrie et le Ttanos Dcouverte indirect de limmunit humorale (Anticorps)

Elie Metchinkoff (1884)Dcouverte de la phagocytose Dcouverte indirecte de limmunit cellulaire

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Dcouverte du rle cologique des bactries : Leur effet sur la matire organique Thodore Schwann (1837) Pasteur (entre 1847 et 1857) La vie ne produit pas de corps symtrique

La fermentation est la vie sans lair

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Dcouverte du rle cologique des bactries : Leur effet sur la matire organique Sergei Winogradsky (1856 1931)Dcouverte de loxydation du fer, du soufre et de lammoniaque par les bactries du sol Dcouverte de lincorporation du CO2 par les bactries photosynthtiques Isolement des bactries anarobies du sol et des bactries fixatrices dazote

Martinus Beijerink (1851 - 1931)Dcouverte des bactries fixatrices dazote (Azotobacter) et de la bactrie symbiotique des lgumineuses (Rhizobium) Etude des bactries sulfato-rductrices et sulfo-oxydantes Dveloppement des techniques denrichissement des cultures et lutilisation de milieux selectifs

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Importantes dcouvertes concernant les bactries : Le rgne de la biologie molculaire Annes 1940Relation troite entre la microbiologie et les autres sciences biologiques

Entre 1950 et 1970 : Age dor de la biologie molculaireElucidation du code gntique Mcanismes de synthse de lADN, de lARN et des protines

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Importantes dcouvertes concernant les bactries : Le rgne de la biologie molculaire Chatton (1937)Dcouverte des cellules Eucaryotes et Procaryotes

Griffith (1928)Dcouverte de la transformation

Avery, MacLeod et McCarty (1944)Identification de la substance dpositaire du message hrditaire et correspondant aux gnes

Existence de multiples moyens, trs rpandus qui rendent les bactries gntiquement solidaires par un change optimal de gnes qui se produit, de faon courante, dans la natureM.A. BAHLAOUI FSTM 2006 21

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Introduction3- Domaines et rles de la microbiologie Microbiologie mdicaleMaladies humaines et animales Identification de lagent responsable dune maladie infectieuse Identification de nouveau agents pathognes

Microbiologie de la sant publiqueLimiter la propagation des maladies contagieuses Vrification des rserves alimentaires Contrle de la qualit des eaux dalimentation

Microbiologie agro-alimentaireMaladies vgtales qui affectent les cultures dimportance alimentaire Transmission des maladies alimentaires (botulisme, salmonelloses) Augmenter la fertilit des sols

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Introduction3- Domaines et rles de la microbiologie Microbiologie industrielleUtilisation des micro-organismes pour produire des substances telles que des antibiotiques, des vaccins, des alcools et autres solvants, des vitamines, des acides amins, des enzymes etc

Ecologie bactrienneRelations entre les bactries et leur environnement Fonctionnement des cycles biogochimiques

immunologieFonctionnement du systme immunitaire Mise au point de techniques de production et dutilisation des anticorps

Gntique microbienne et biologie molculaireNature de linformation gntique tude des mutations et de transfert gntiques

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Introduction4- Proprits fondamentales des micro-organismes Propri microCaractristiques distinctives des vgtaux et des animaux

Vgtauxo Le plus souvent fixs o Sensibilit et motilit discrtes o Absorption de gaz et de substances dissoutes o Cellule habituellement avec paroi o Le plus souvent chlorophylliens et autotrophesM.A. BAHLAOUI

Animauxo Le plus souvent libres o Sensibilit et motilit prononcs o Ingestion daliments solides o Cellule le plus souvent sans paroi o Non chlorophylliens, non autotrophes24

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Introduction4- Proprits fondamentales des micro-organismes Propri micro-

1886 (Haeckel) Proposa le rgne des protistes Organisation cellulaire Unicellularit et indivisibilit Taille cellulaire Flexibilit mtabolique Potentiel de reproduction Omniprsence et abondanceFSTM 2006 25

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Organisation cellulaire 1838 (Schleiden et Schwann) : thorie cellulaire la cellule est lunit fonctionnelle de tout tre vivant capable de fonctionner de manire autonome

1937 (Chatton) : deux types de cellulesLa cellule eucaryote : noyau entour dune membrane et renfermant un certain nombre dorganites cellulaires La cellule procaryote : organisation cellulaire rudimentaire

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Introduction4- Proprits fondamentales des micro-organismes Propri microPrincipales caractristiques distinctives des eucaryotes et des procaryotes Caractristiques CaractOrganisation cellulaire Organisation nuclaire nucl Organites spcialiss sp cialis Type dorganisation d Principaux reprsentants reprM.A. BAHLAOUI

EucaryotesComplexe Noyau vrai Nombreux Unicellulaure Pluricellulaire Coenocytique Algues Myctes protozoairesFSTM 2006

ProcaryotesSimple Appareil nuclaire Rares Unicellulaire

Bactries27

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Introduction4- Proprits fondamentales des micro-organismes Propri microm mm m nm Ordre de grandeur10-10 10-7 10-4 0,1 1-4 -7 -10

10-9 10-6 10-3 1 10-3 -6

-9

10-8 10-5 0,01 10 100-5

-8

10-7 10-4 0,1 100 1033 -4

-7

10-6 10-3 1 103 1044 3 -3

-6

10-5 0,01 10 104 1055 4

-5

10-4 0,1 100 105 1066 5

-4

10-3 1 103 106 1077 6 3

-3

10-2 10 104 107 1088 7 4

-2

10-1 100 105 108 1099 8 5

-1

Chlamydomonas

Atomes

Molcules Petits virus

Bactrio- Bactries phage

Globule Paramcie rouge

Puce

Mouche

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Flexibilit mtabolique Trs grand nombre de substrats Plusieurs sources dnergie

Potentiel de reproduction La plus part des bactries se divisent toutes les heures Escherichia coli : 20 minutes Vibrio parahaemolyticus : 10 minutes

Omniprsence et abondance Les bactries sont ubiquistes La trs grande majorit est utile pour lhomme Intervention dans les cycles biogochimiquesFSTM 2006 29

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La cellule procaryote : structure & fonction1- Mthode dtude par microscopie lumire dtude lumi Les lentilles et la dviation de la lumire

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La cellule procaryote : structure & fonction1- Mthode dtude par microscopie lumire dtude lumi La rsolution du microscopeObjectif

Distance De travail

Lame Porte objet avec chantillon

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La cellule procaryote : structure & fonction1- Mthode dtude par microscopie lumire dtude lumi La rsolution du microscope

Lame porte-objet

Lame couvre-objet

Air

Huile

d=

(0,5) (530 nm) = 212 nm = 0,2 m 1,25FSTM 2006 32

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La cellule procaryote : structure & fonction2- Prparation et coloration des chantillons Pr

La fixation Procd par lequel les structures internes et externes des cellules et des organismes sont conserves et fixes sur place Inactive les enzymes qui peuvent dtruire la morphologie cellulaire Durcit les structures cellulaires qui pourraient tre modifies par coloration

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La fixation Deux types fondamentalement diffrents de fixation : Fixation la chaleur

Fixation chimique

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La fixation Les principaux fixateurs contiennent des composs tels que : Lthanol Lacide actique Le chlorure mercurique Le formaldhyde et le glutaraldhyde

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Les colorants et la coloration simple Deux proprits pour les colorants : Ils sont colors grce la prsence de groupes chromophores possdant des doubles liaisons conjugues Ils se lient aux cellules par interactions ioniques, covalentes ou hydrophobes

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Les colorants et la coloration simple Les colorants ionisables se divisent en deux classes : Les colorants basiques (cationiques)Se fixent aux molcules charges ngativement comme les acides nucliques et les protines. Ex. : Bleu de mthylne, Fuchsine basique, Cristal violet, Safranine

Les colorants acides (anioniques)Se fixent sur les molcules charges positivement. Ex. : Eosine, Rose bengal, Fuchsine acide

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La coloration de GRAM Dveloppe en 1883 par le mdecin danois Christian Gram. Cest la mthode de coloration diffrentielle la plus utilise en microbiologie. Elle permet de diviser les bactries en deux grands groupes : les Gram positives et les Gram ngatives.

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La coloration acido-alcoolo-rsistante Chauffage avec un mlange de Fuchsine basique et de phnol, suivi dun lavage lalcool-acide

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La coloration des capsules Ralise par coloration ngative lencre de chine ou la ngrosine

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La coloration des spores Procd de Shaeffer-Fulton : les endospores sont dabord colores par chauffage des cellules bactriennes avec la safranine, ensuite les cellules sont laves et contre colores au vert de malachite

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La coloration des flagelles Les flagelles sont dabord paissit en les entourant de mordant comme lacide tannique ou lalun de potasse. Elles sont ensuite colores de fuchsine basique (mthode de Gray) ou de pararosaniline (mthode de Leifson)

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La cellule procaryote : structure & fonction3- La taille, la forme et larrangement cellulaire l

Les bactries de forme ronde sont des coques Groupes en chanettes. Ce sont alors en gnrale des streptocoquesSTREPTOCOQUES (GRAM +)Les streptocoques constituent un genre important dans lequel on trouve : Des espces pathognes comme Streptococcus pyogenes esp pathog agents, par exemple dangines rouges d Des espces non pathognes et utilises dans lindustrie laitire : esp pathog utilis laiti les streptocoques lactiques Des espces non pathognes peuplant la muqueuse buccale esp pathogM.A. BAHLAOUI FSTM 2006 44


Les bactries de forme ronde sont des coques Groupes en amas plus ou moins irrguliers. Ce sont alors des staphylocoques ou microcoquesSTAPHYLOCOQUES ET MICROCOQUES (GRAM +)

Les staphylocoques possdent une espce pathogne : poss esp pathog Staphylococcus aureus (ou staphylocoque dor) agent de dor suppurations cutane (pus, anthrax) et de nombreuses autres cutan anthrax infections localises ou gnralises localis g ralis Les autres espces peuvent tre considres comme non esp consid pathognes habitent la peau (Staphylococcus epidermidis) ou le pathog (Staphylococcus epidermidis) cuir chevelu (Staphylococcus capitis). Les microcoques ne sont (Staphylococcus capitis). pas pathognes et peuplent la peau pathogM.A. BAHLAOUI FSTM 2006 45

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Les bactries de forme ronde sont des coques Groupes en amas cubiques. Cest le cas des SarcinesSARCINA (GRAM +)

Ces bactries, sans pouvoir pathogne, sont trs rpandue dans bact pathog tr r la nature

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Les bactries de forme ronde sont des coques Relies par deux : se sont des diplocoquesLE PNEUMOCOQUE (GRAM +)Streptococcus pneumoniae est responsable chez lhomme de l pneumonies aigus, de mningites et dinfection de la sphre ORL aigu m d sph

NEISSERIA (GRAM -)Le genre Neisseria comprends Deux espces pathognes : esp pathog Neisseria gonorrhoeae, agent dune maladie sexuellement gonorrhoeae, d transmissible : la blennorragie. Neisseria meningitidis, agent de redoutables mningites crbromeningitidis, m c brospinales - Des espces non pathognes qui peuplent notre pharynx esp pathog-

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Les bactries de forme cylindrique sont des bacilles Tailles et groupements variables

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La cellule procaryote : structure & fonction4- Organisation de la cellule procaryote

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La membrane plasmique La membrane plasmique contient la fois des protines et des lipides en proportions variables. La plus part des lipides membranaires sont structurellement asymtriques, avec un cot polaire et un cot non polaire. Ils sont appels amphipatiques. Le modle le mieux accept de la structure membranaire est le modle de la membrane en mosaque fluide de S. Jonathon Singer et Garth Nicholson

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La membrane plasmique Modle de la mosaque fluide

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La membrane plasmique Deux types de protines membranaires Les protines extrincques (ou priphriques)Associes la membrane de manire faible Solubles dans les solutions aqueuses 20 30 % des protines membranaires totales

Les protines intrincques (ou intgrales)Fortement lies la membrane Insolubles dans les solutions aqueuses Sont amphipatiques (comme les lipides membranaires)

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La membrane plasmique Principaux rles de la membrane plasmique Elle contient le cytoplasme et le spare de lextrieur Barrire permable et slective Transport dlments nutritifs et de dchets Site de plusieurs processus mtaboliques importants Contient des molcules rceptrices spciales qui permettent la bactrie de dtecter et de rpondre des substances chimiques prsentent dans son environnementFSTM 2006 53

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Le cytoplasme Dpourvu dorganites dlimits par une membrane Contient beaucoup deau (70 % de la masse bactrienne) Pas de structure dfinie au microscope lectronique et contient beaucoup de ribosomes La membrane plasmique et tout ce quelle contient = protoplaste

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Les corps dinclusion Les corps dinclusion organiques Le glycogne : polymre de glucose (liaison glycosidique (1 4) dispers dans le cytoplasme sous forme de granules visibles uniquement au microscope lectronique Le poly--hydroxybutyrate (PHB) : molcules de -hydroxybutyrates relis par des liaisons esters entre groupe carboxyle et hydroxyle de molcules adjacentes Le glycogne et le PHB reprsentent des rserves de carbone pour la production de lnergie et pour la biosynthse

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Rappels : Chimie des molcules organiques mol1- Les molcules organiques mol Molcules qui contiennent du carbone Le carbone tend former quatre liaisons covalentes de manire complter sa couche lectronique externe avec huit lectrons Cette proprit permet la formation de chanes et de cycles datomes de carbone qui peuvent galement fixer de lhydrogne et dautres atomes

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Rappels : Chimie des molcules organiques mol2- Les groupes fonctionnels

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Rappels : Chimie des molcules organiques mol3- Les glucides Les glucides sont des aldhydes ou des ctones dalcools polyhydroxyls. Les glucides les plus petits et les moins complexes sont les sucres simples ou monosaccharides

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Rappels : Chimie des molcules organiques mol3- Les glucides

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Rappels : Chimie des molcules organiques mol4- Les protines prot Lhydrolyse dune protine, par chauffage 100 C en milieu acide, donne un ensemble de petites molcules appels : acides amins

COOHFormule gnrale :

R CH NH2

Le carbone qui porte la fonction acide et la fonction amine est un carbone asymtrique. Il en rsulte deux possibilits disomrisation dsignes par les lettres L et D

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Rappels : Chimie des molcules organiques mol4- Les protines prot Les acides amins appartiennent la srie L lorsque la disposition spatiale des groupements autour du carbone asymtrique correspond celle de la L-glycraldhyde

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Rappels : Chimie des molcules organiques mol4- Les protines prot Classification des acides amins

1. HYDROPHOBES - R aliphatique ou aromatique

Glycine (Gly)

Alanine (Ala)

Valine (Val)

Leucine (Leu)

Isoleucine (Ile)

- R contenant un atome de soufre

Phnylalanine (Phe)

Tryptophane (Trp)

Mthionine (Met)

Cystine (Cys)

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2. HYDROPHILES NON IONISES - R avec groupement hydroxyle -OH

- R avec groupement amide -CONH2

Serine (Ser)

Thronine (Thr)

Asparagine (Asn)

Glutamine (Gln)

Tyrosine (Tyr) M.A. BAHLAOUI

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3. HYDROPHILES ET IONISES - R avec groupement carboxylique -COOH

- R avec groupement amine -NH2

Acide aspartique (Asp)

Acide glutamique (Glu)

Lysine (Lys)

Arginine (Arg)

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4. SINGULIERS

Histidine (His)M.A. BAHLAOUI FSTM 2006

Proline (Pro)72

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Rappels : Chimie des molcules organiques mol4- Les protines prot Liaison peptidique

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Rappels : Chimie des molcules organiques mol4- Les protines prot Les structures primaires, secondaires et tertiaires

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Rappels : Chimie des molcules organiques mol5- Les associations entre espces chimiques esp Le terme glycoprotine dsigne des corps qui ont plus de proprits de protines que de proprits de polysaccharides. La moiti glucidique ny tant pas trs importante et ntant pas caractrise par des proprits polyanioniques Le terme mucoprotine dsigne dnormes difices o la moiti polysaccharidique est macromolculaire, polyanionique et associe des quantits moins importantes de protines Le terme de peptidoglycane dsigne des difices gigantesques dans lesquels de trs longues chanes de type polysaccharidiques, ranges cote cote, sont transversalement relies pa des chanons oligosaccharidiques Dans ces trois cas, les monomres de la partie saccharidique sont forms par des drivs de sucres simplesM.A. BAHLAOUI FSTM 2006 75

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Rappels : Chimie des molcules organiques mol5- Les associations entre espces chimiques esp

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Rappels : Chimie des molcules organiques mol5- Les associations entre espces chimiques esp

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Les corps dinclusion Les corps dinclusion organiquesLes cyanobactries possdent trois corps dinclusion organique distincts Granules de cyanophycines : grands polypeptides (acide aspartique + arginine). Ce sont des rserves dazote Les carboxysomes: molcules polydriques contenant de la rubulose 1-5 biphosphate carboxylase. Ce sont des rserves denzymes pouvant te le site de fixation du CO2 La vacuole gazeuse : prsente aussi chez les bactries photosynthtiques pourpres et vertes. Elle a un rle dans la flotaison

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Les corps dinclusion Les corps dinclusion inorganiques Granules de polyphosphates ou Volutine : polymre linaire dorthophosphates lis par liaisons ester. Ce sont des rservoirs de phosphate. Granules de soufre: les bactries photosynthtiques pourpres utilisent le sulfure dhydrogne (H2S) comme donneur dlectrons pour la photosynthse et accumulent le soufre produit soit dans lespace priplasmique soit dans des globules cytoplasmiques spciaux.

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Les ribosomes Structures faiblement lies la membrane plasmique Elments complexes (protines et ARN) Rle dans la synthse des protines Lgrement plus petits que les ribosomes des eucaryotes Appeles souvent ribosomes 70 S Elles mesurent 14 15 nm sur 20 nm ; PM = 2,7 Millions Formes de deux (2) sous units : 50 S et 30 S S = unit SVEDBERG (unit du coefficient de sdimentation)

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Le nuclode Les cellules Eucaryotes : 2 ou plusieurs chromosomes dlimits par un noyau Les Procaryotes : pas de noyau Le chromosome procaryote est circulaire Le nuclode est visible au microscope optique aprs coloration de Feulgen Analyse du nuclode : 60 % dADN Peu dARN Faible quantit de protines Escherichia coli (2 6 mm); le cercle dADN : 1400 mmFSTM 2006 81

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Le nuclodeDe nombreuses bactries contiennent des plasmides en plus du chromosome Molcules circulaires ADN double brin Soit indpendant soit li au chromosome Peut tre transmis la descendance Pas ncessaire au dveloppement et la reproduction Peut porter des gnes avantageux Rsistance aux mdicaments Nouvelles possibilits mtaboliques Pathognicit Etc FSTM 2006 82

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La structure du peptidoglycane Enorme polymre constitu de plusieurs sous units lies entre elles Le polymre contient deux drivs de sucre : La N-actylglucosamine La N-actylmuramique (NAM) Et plusieurs acides amins diffrents Ossature constitue de lalternance de rsidus NAG et NAM Un ttapptide est li au groupe carboxyle de la NAM Les chanes du peptidoglycane sont lies par liaisons interpeptidiques Souvent le groupe carboxyle de la D-alanine terminal est li directement au groupe amine de lacide diaminopimliqueFSTM 2006 83

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La cellule procaryote : structure & fonction

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La cellule procaryote : structure & fonction

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La paroi cellulaire procaryote Une des parties les plus importantes de la cellule la plupart des bactries ont une paroi Donne la forme et protge contre la lyse osmotique Protge contre les substances toxiques Site daction de plusieurs antibiotiques

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La paroi cellulaire procaryote La paroi cellulaire des bactries Gram positives : Couche mince de peptidoglycane ou murine 20 80 nm dpaisseur La paroi cellulaire des bactries Gram ngatives : plus complexe Couche de murine (1 3 nm dpaisseur) Membrane externe (7 8 nm dpaisseur)

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La paroi cellulaire procaryote Espace priplasmique des bactries Gram ngatives 1 71 nm ; 20 40 % du volume cellulaire Protines priplasmiques (enzymes hydrolysantes) Protines fixatrices (transport de molcules) Espace priplasmique des bactries Gram positives Moins de protines priplasmiques Excrtion denzymes (exoenzymes)

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La paroi cellulaire procaryote La paroi des bactries GRAM positives Paroi paisse et homogne Constitue principalement de peptydoglycane Contient une grande quantit dacides tichoques Des acides amins (D-alanine) ou sucres (glucose) sont attachs au glycrol ou au rubitol Les acides tichoques sont connects: Soit la murine elle-mme :acides tichoques Soit aux lipides membranaires : acides lipotichoques Les acides tichoques donnent la paroi sa charge ngativeFSTM 2006 89

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La paroi cellulaire procaryote La paroi des bactries GRAM ngatives Paroi plus complexe que celle des bactries Gram positives Couche fine de peptidoglycane Protine la plus abondante : Lipoprotine de Braun Les lments les plus particuliers : les lipopolysaccharides

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La paroi cellulaire procaryote La paroi des bactries GRAM ngatives IMPORTANCE DES LPS chapper aux dfenses immunitaires de lhte Contribuer la charge ngative de la paroi Aider la stabilisation de la structure membranaire Les LPS sont souvent toxiques (endoenzymes) IMPORTANCE DE LA MEMBRANE EXTERNE Barrire de protection Empche lentre des sels biliaires, des antibiotiques et autres substances toxiques Plus permable que la membrane plasmique Empche la perte des constituants cellulairesFSTM 2006 92

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La paroi cellulaire procaryote La paroi cellulaire et la protection osmotique Protge la bactrie contre la pression osmotique Leau a tendance entrer dans la cellule bactrienne et la pression osmotique peut atteindre 20 atmosphres La membrane plasmique ne supporte pas une telle pression. Elle va gonfler, se lyser en labsence de la paroi La plasmolyse est linverse de la turgescence. Elle est utile pour la prservation de la nourriture.

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Les capsules et les couches mucodes Certaines bactries ont une couche supplmentaire lextrieur de la paroi cellulaire. Exemple : Klebsiella pneumoniae, Bacteroides Si cette capsule est : Organise : capsule Diffuse : couche mucode Capsules et couches mucodes sont composs de polysaccharides, mais peuvent contenir dautres substances. Exemple : acide poly-Dglutamique de Bacillus anthracis Facilement visibles au microscope optique aprs coloration ngative ou coloration particulire

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Les capsules et les couches mucodes Le rle des capsules Rsistance la phagocytose Protection contre la dessiccation Protection contre les virus bactrien (bactriophages) Protection contre la plupart des substances toxiques hydrophobes (dtergents) Site dattache des bactries sur les surfaces solides

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Les pili ou fimbriae Les pili ou fimbriae Courts appendices fins (comme les cheveux), plus minces que les flagelles et ne sont pas impliqus dans le mouvement Une cellule peut tre couverte de 1000 fimbriae, mais on ne les voient quau microscope lectronique Ils apparaissent comme de minces tubes composs de sous-units protiques arranges en hlice 3 10 nm de diamtre sur plusieurs micromtres de long Rle dans ladhsion des bactries aux surfaces

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Les pili ou fimbriae Les pili sexuels Appendices similaires mais diffrents des fimbriae Une cellule peut contenir de 1 10 pili sexuels

Souvent plus pais que les fimbriae (9 10 nm de diamtre) Rle dans lappariement des bactries Site de fixation des virus bactrien

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Les flagelles et la mobilit Appendices locomoteurs qui stendent lextrieur de la membrane plasmique et de la paroi cellulaire Structures minces (environ 20 nm de diamtre sur 15 20 mm de long) Ils sont fins et doivent tre paissies pour tre observes au microscope (cf. coloration des flagelles)

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Les flagelles et la mobilit On distingue : Les bactries monotriches Un seul flagelle une extrmit, il es dit polaire Les bactries amphitriches Un seul flagelle chaque extrmit Les bactries lophotriches Une touffe de flagelles une ou a chaque extrmit Les bactries pritriches Flagelles distribues sur toute la surface

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a

b

c

Exemples de distribution de flagelles

a) Monotriche polaire :Pseudomonas b) Lophotriche :Spirillum c) P ritriche :Proteus vulgarisM.A. BAHLAOUI FSTM 2006 101


Lendospore bactrienne Structure spciale, rsistante et dormante Les endospores se dveloppent dans les cellules vgtatives de quelques genres bactriens : Bacillus, Clostridium (bacilles), Sporosarcina (coque) et autres Les endospores sont rsistantes la chaleur, aux UV, la dessiccation et aux substances chimiques Les endospores ont une grandes importance en microbiologie industrielle et mdicale Les endospores reprsentent le moyen de survie au manque deau et dlments nutritifs

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Lendospore bactrienne Cintique de destruction thermiqueInactivation thermique de Bacillus stearothermophilus (population initiale : N0 = 1012) 126 C Temps (min) 0 1 2 3 4 5 6 9 12 15 18 Log N 12 11,34 10,67 10 9,34 8,67 8 6 4 2 0 Temps (min) 0 1 2 3 4 6 8 12 16 24 32 48 FSTM 2006 121 C Log N 12 11,75 11,5 11,25 11 10,5 10 9 8 6 4 0 Temps (min) 0 6 12 18 24 30 60 120 144 116 C Log N 12 11,5 11 10,5 10 9,5 7 2 0

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Lendospore bactrienne Cintique de destruction thermique

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Lendospore bactrienne Cintique de destruction thermiqueInactivation thermique de Clostridium botulinum (population initiale : N0 = 1012) 121 C Temps (min) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 2 Log N 12 11 10 9 8 7 2 Temps (min) 0 0,2 1 2 4 10 15 20 24 111 C Log N 12 11,9 11,5 11 10 7 4,5 2 0 Temps (min) 0 0,2 1 4 10 20 40 60 120 200 240 101 C Log N 12 11,99 11,95 11,8 11,5 11 10 9 6 2 0

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Conclusion Le nombre de micro-organisme survivant un traitement strilisant dcrot exponentiellement avec le temps Ces rsultats et ces courbes permettent de dfinir le temps de rduction dcimale D.

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Lendospore bactrienne Cintique de destruction thermiquePour Bacillus stearotherophilus : 121 C : au temps 0 : N0 = 1012 (log N0 = 12) au temps 4 min : N = 1011 (log N = 11) donc D = 4 min 126 C : au temps 0 : N0 = 1012 (log N0 = 12) au temps 1,5 min : N = 1011 (log N = 11) donc D = 1,5 min12 116 C : au temps 0 : N0 = 10 (log N0 = 12) au temps 12 min : N = 1011 (log N = 11) donc D = 12 min

Pour Clostridium botulinum :12 121 C : au temps 0 : N0 = 10 (log N0 = 12) au temps 0,2 min : N = 1011 (log N = 11) donc D = 0,2 min

111 C : au temps 0 : N0 = 1012 (log N0 = 12) au temps 2 min : N = 1011 (log N = 11) donc D = 2 min12 101 C : au temps 0 : N0 = 10 (log N0 = 12) au temps 20 min : N = 1011 (log N = 11) donc D = 20 min

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Consquences Pour la plupart des spores : destruction efficace partir de 120 C On peut quantifier le traitement thermique T units de traitement = t minutes 121 C. t est appel valeur strilisatrice Elle sexprime sans units.M.A. BAHLAOUI FSTM 2006 110


Lendospore bactrienne Notion de risque

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Lendospore bactrienne La spore peut tre subterminale, terminale ou centrale La spore est constitue de : Un exosporium : enveloppe dlicate Une tunique : responsable de la rsistance Un cortex : plus de la moiti du volume de la spore Une paroi de la spore : entoure le protoplaste Mcanisme de la rsistance des spores Stabilisation des composs comme lADN grce au complexe acide dipicolinique-calcium Dshydratation du protoplaste grce au cortex Stabilisation accrue des protines cellulaires chez les bactries adaptes une croissance des tempratures levesFSTM 2006 112

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La nutrition bactrienne bact1- Les besoins nutritifs courants

Les macrolments Les lments majeurs : Carbone, Oxygne, Hydrogne, Azote, Soufre, Phosphore Se sont des constituants des glucides, lipides, protines et acides nucliques Requis des concentrations exprimes en g/l

Les lments mineurs Potassium, Calcium, Magsium et Fer Ils existent dans la cellule ltat de cations Requis des concentrations exprimes en mg/l

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La nutrition bactrienne bact1- Les besoins nutritifs courants

Les oligolments Manganse, Zinc, Cobalt, Molybdne, Nickel, et Cuivre Ils font partie des enzymes et des cofacteurs Ils aident la catalyse des ractions et au maintien de la structure des protines Requis des concentrations exprimes en g/l

Les besoins spcifiques ou spciaux Ils refltent la nature particulire de leur morphologie ou de leur environnement

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La nutrition bactrienne bact2- Les besoins en carbone, hydrogne et oxygne hydrog oxyg Ils sont souvent satisfaits ensembles. Les autotrophes : CO2 comme seul source de carbone. Les htrotrophes : molcules prformes rduites. Extraordinaires possibilits des micro-organismes en ce qui concerne les sources de carbone. Les besoins nutritifs des micro-organismes sont trs diffrents dune espce lautre et peuvent changer au sein de la mme espce suite des mutations.

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La nutrition bactrienne bact2- Les besoins en carbone, hydrogne et oxygne hydrog oxyg

Prototrophe : micro-organisme qui requiert les mmes nutriments que la plupart des autres membres de son espce

Auxotrophe : mutant prototrophe qui a perdu la capacit de synthtiser un lment essentiel et auquel on doit fournir cet lment ou son prcurseur

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Source de carbone, dnergie et dhydrogneSource de carbone Autotrophes Htrotrophes Source dnergie dnergie Phototrophes Chimiotrophes Source dhydrogne/ d hydrog ne/ Lithotrophes OrganotrophesM.A. BAHLAOUI

CO2 comme seule ou principale source de C. Molcules organiques prformes rduites Mol pr form r

Lumire Lumi Oxydation composs org. et inorganiques compos org.

Molcules inorganiques rduites Mol r Molcules organiques rduites Mol rFSTM 2006 117

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Principaux types nutritionnelsPrincipaux types Autotrophes photolithotrophes Sources dnergie, dH/ et de carbone dnergie, d H/ Energie lumineuse Donneur inorganique dH/ d H/ CO2 comme source de Carbone Htrotrophes photoorganotrophes Energie lumineuse Donneur organique dH/ d H/ Source organique de carbone Autotrophes chimiolithotrophes Source chimique dnergie (inorganique) dnergie Donneur inorganique dH/ d H/ CO2 comme source de carbone Htrotrophes chimioorganotrophes M.A. BAHLAOUI Source chimique dnergie (organique) dnergie Donneur organique dH/ d H/ FSTM 2006 Source organique de carbone 118

La nutrition bactrienne bact3- Les besoins en azote, phosphore et soufre Le phosphore Ncessaire la synthse des acides nucliques, des phospholipides, des nuclotides comme lATP et de quelques cofacteurs. Tous les micro-organismes utilisent le phosphate inorganique comme source de phosphore et lincorpore directement Le soufre Ncessaire la synthse de substances comme la cystine et la mthionine, de quelques glucides, de la biotine et de la thiamine La plus part des micro-organismes utilisent le sulfate comme source de soufre et le rduisent. Certains exigent une source rduite du soufre comme la cystine Lazote Ncessaire la synthse des acides amins, des purines, des pyrimidines et de certains glucides et lipidesFSTM 2006 119

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La nutrition bactrienne bact4- Les facteurs de croissance Dfinition Ce sont des constituants cellulaires essentiels (ou leurs prcurseurs) qui ne peuvent pas tre synthtiss par un organisme. Ce dernier doit donc lobtenir de son environnement Les classes de facteurs de croissance Les acides amins : Synthse protique Les purines et pyrimidines : synthse des acides nucliques Les vitamines : petites molcules organiques formant des cofacteurs ou une partie de ceux-ci. Ils sont ncessaires la croissance en quantit trs faible Intrt Dosage microbiologique de nombreuses substances

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La nutrition bactrienne bact5- Labsorption des lments nutritifs Les micro-organismes absorbent les nutriments Les mcanismes dabsorption sont spcifiques Les micro-organismes doivent tre capables de transporter les nutriments Les nutriments doivent traverser la membrane plasmique

Il existe plusieurs mcanismes de transports diffrents

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La nutrition bactrienne bact5- Labsorption des lments nutritifs

La diffusion facilite Diffusion passive (= diffusion) Les molcules se dplacent dune rgion de concentration leve vers une rgion de concentration faible. Processus peu efficace et peu utilis. Diffusion facilite Processus mdi par des transporteurs membranaires appels permases. Cest une vritable diffusion, les mouvements des molcules travers la membrane est d au gradient de concentration et aucune nergie nest ncessaire.

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La diffusion facilite

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Le transport actif Cest le transport de molcules contre un gradient de concentration grce lutilisation de lnergie mtabolique. Il ressemble au transport facilit (recours des protines de transport). Les transporteurs ont une spcificit vis vis des molcules. Dans les deux cas (transport passif et actif), des molcules similaires peuvent entrer en comptition avec la mme protine de transport.

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Le transport actif Le transport actif se caractrise aussi par la saturation des transporteurs des concentrations leves en solut.

Le transport actif diffre de la diffusion facilite par son utilisation dnergie mtabolique et sa capacit concentrer des substances.

Les systmes de transports utilisent des protines spciales localises dans le priplasme des bactries Gram ngatives.

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Le transport actifDeux sources dnergie sont utilises : LATP ou autres composs riches en nergie Escherichia coli : arabinose, maltose, galactose, ribose, glutamate, histidine, leucine) La force proton-motrice Exemple de systme de transport utilisant la force proton-motrice : la permase du lactose chez E. coli. La permase utilise le symport de protons pour transporter le lactose. Escherichia coli emploi ce systme pour importer des acides amins, des acides organiques (succinate, malate)

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Le transport actifLa force proton-motrice peut contribuer indirectement au transport + actif, souvent par la formation dun gradient dions sodium (Na ) Le gradient de sodium gnr, par le systme antiport de protons, conduit limportation de sucres et dacides amins Chez E. coli, les systmes de transport importent le mlobiose et lacide glutamique quand le sodium est en mme temps vhicul lintrieur de la cellule Les micro-organismes : diversit de systme de transport donc avantage comptitif supplmentaire

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Le transport actif

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La translocation du groupe Processus au cours duquel une molcule est transfre dans la cellule toute en tant modifie chimiquement

Le plus connu est la phosphotransferase des sucres (PTS) dpendant du phosphonolpyruvate (PEP). Il transfert une varit de sucres dans les cellules procaryotes en les phosphorylant et en utilisant le PEP comme donneur de phosphate

PEP + SUCRE (extrieur)

PYRUVATE + SUCRE-P (intrieur)

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La translocation du groupe Le PTS est trs complexe chez Escherichia coli et Salmonella typhimurium. Il est constitu par trois enzymes et une protine thermostable (HPr). Les enzymes II et III sont spcifiques et varient selon les PTS. Lenzyme I et HPr sont communes tous les PTS Les membres des genres Escherichia, Salmonella, Staphylococcus et dautres bactries anarobies facultatives ainsi que des bactries anarobies strictes (Clostridium) possdent des PTS. Escherichia coli et Salmonella typhimurium absorbent le glucose, le fructose, la lactose, le mannitol, le sorbitol et dautres sucres par la translocation du groupeFSTM 2006 130

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La translocation du groupe

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La capture du fer Presque tous les micro-organismes ont besoin du fer pour les cytochromes et de nombreux enzymes. La capture du fer est difficile car les ions ferriques (Fe ) et leurs drivs sont trs insolubles. Beaucoup de bactries et de myctes ont surmonts cette difficult en secrtant des sidrophores. Les sidrophores sont des petites molcules de faible poids molculaire qui complexes les ions ferriques et les fournissent la cellule Exemple de sidrophore : le ferrichrome3+

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Les milieux de culture1- Dfinition Prparations solides ou liquides contenant tous les lments nutritifs ncessaires la croissance et au dveloppement dun micro-organisme La composition dun milieu de culture dpend de lespce cultiver La fonction dun milieu de culture dtermine sa composition.

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Les milieux de culture2- Les milieux synthtiques ou dfinis synth d Milieux de culture de composition connue Trs utiliss en recherche (besoins nutritifs des micro-organismes)

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Les milieux de culture3- Les milieux complexes Milieux de culture contenant des ingrdient de composition inconnue Peptones : source de carbone, dnergie et dazote Extrait de buf : source da.a., de peptides, de nuclotides .. Extrait de levure : source de vitamine B et dautres composs azots Les milieux complexes sont utiles car un milieu peut tre suffisamment riche pour satisfaire les besoins de nombreux microorganismes Les milieux complexes sont parfois ncessaires lorsque les besoins nutritifs din micro-organisme particulier sont inconnus

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Les milieux de culture3- Les milieux complexes On peut solidifier un milieu de culture liquide en y ajoutant de lagar 1,5 % Lagar est un polymre sulfat compos de D-galactose, de 3,6anhydro-L-galactose et dacide D-glucoronique On peut parfois utiliser dautres agents solidifiants Exemple : Gel de silice pour lidentification des sources de carbone

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Les milieux de culture3- Les milieux complexes

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Les milieux de culture4- Les types de milieux

Les milieux non slectifs Milieux utilisation gnrale permettant la croissance de la plupart des micro-organismes Bouillon et glose nutritives Bouillon et glose au soja

Les milieux slectifs Milieux de culture qui favorisent la croissance de micro-organismes particuliers en inhibant celle des micro-organismes indsirables ou en avantageant seulement celle des micro-organismes recherches. Glose lactose au TTC et Tergitol Glose de MacConkey Glose Bile-Esculine-AzideFSTM 2006 138

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Les milieux de culture4- Les types de milieux

Les milieux diffrentielles Milieux de culture permettant la distinction entre des groupes de micro-organismes sur la base des caractristiques biologiques diffrentes Glose lactose au TTC et Tergitol Glose de MacConkey Glose Pril-Xylose-Ampicilline-agar (PXA-agar)

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Les milieux de culture5- Mode daction dun milieux slectif et diffrentiel d d s diff

La Glose lactose au TTC et Tergitol Composition (en g/l) Peptone bactriologique Extrait de viande Lactose Bleu de bromothymol Agar 10 5 20 0,05 12,75

TTC : ajout strilement (5 ml TTC 0,05 % /100 ml) Tergitol : ajout strilement (5 ml de Tergitol 7 0,2 % /100 ml

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La Glose lactose au TTC et Tergitol Lheptadodcyl sulfate de sodium (Tergitol 7) Inhibe les bactries Gram positives Le chlorure de Triphnyl 2,3,5 Tetrazolium chloride (TTC) Rduit en un compos color en rouge par presque tous les coliformes, sauf Escherichia coli et Enterobacter aerogenes. Le lactose Ferment par les Entrobactries en acide Le bleu de bromothymol Indicateur color (jaune a pH acide ; vert pH neutre ; bleu pH basique

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La Glose lactose au TTC et Tergitol

ColoniesJaunes avec halo jaunes Rouges ventuellement avec halo jaunes Rougetres avec halo bleutreM.A. BAHLAOUI

Micro-organismes MicroEsherichia coli

Autres coliformes

Germes lactose ngatifs n142

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Les milieux de culture6- Descripteurs morpho-macroscopiques utiliss morphoutilis La taille de la colonie Diamtre < 1 mm ; 1 5 mm ; > 5 mm La forme de la colonie 2 formes horizontales : irrgulire, circulaire 4 formes verticales : convexe, concave, plate, pyramidale Le bord de la colonie Rgulier chancr filamenteux

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Les milieux de culture6- Descripteurs morpho-macroscopiques utiliss morphoutilis La transparence de la colonie Transparente Translucide opaque La surface de la colonie tat : lisse, granulaire, ambilique Aspect : brillante, terne Texture : muqueuse, ferme La couleur de la colonie et sa pigmentation Rose, blanche, jaune, orange Pigment diffusible ou non

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Les milieux de culture7- La morphologie et la croissance des colonies bactriennes bactExemple de colonies bactriennes

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Les milieux de culture11- Lisolement des cultures pures 11-

Quelques dfinitions Culture pure : population de cellules identiques provenant dune seule cellule Colonie : Ensemble de micro-organismes se dveloppant sur (ou dans) une surface solide comme celle dun milieu de culture glos, souvent visible lil nu, mais pouvant tre microscopique.

Approches de lobtention de cultures pures Isolement sur botes par talement en surface et par la technique des stries. Isolement sur botes par inclusion en profondeur. Isolement laide de milieux slectifs et/ou diffrentiels.FSTM 2006 146

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Cours Microbiologie MST-PE1

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