Cours M1 - 2012

Introduction aux techniques de biologie

moléculaire

ADN

ARNmProtéine

Expression des gènes

Analyse des ARNm

Analyse des protéines

ADN

ARNmProtéine

Expression des gènes

Analyse des ARNm

Analyse des protéines

Analyse des interactions protéines/protéines

Analyse des interactions protéines/ADN

Expression des protéines

Western-blot

Immunoprécipitation

Immunocytochimie

ELISA

Western-blot

Principe:

Séparation des protéines selon leur poids moléculaire

Immunodétection de la protéine d’intérêt

Étapes:

Extraction et préparation des protéines des échantillons

biologiques (dosage de protéine)

Migration et transfert sur membrane

Immunodétection

Expression des protéines

Dosage des protéines: pourquoi ?

- Échantillons différents: foie, cœur, poumon, rein, etc…

- Conditions différentes: - témoin,

- traitement inducteur ou inhibiteur

Expression différente de la protéine d’intérêt

Uniformisation des échantillons

Même quantité de protéines analysée quelque soit l’origine de

l’échantillon ou le traitement reçu

Dosage des protéines

Préparation des échantillonsProtéines: grande hétérogénéité de poids, charges et formes

Contrecarrer ces effets Différenciation sur 1 seul paramètre

Glycérol augmente densité échantillon

-

H2N COOH

+

+

+

+

-

- Ebullition dénaturation

H2N COOH-

--

+

++

Détergent anionique lipophile (SDS) charges négatives solvatation

+ empêche précipitation

Solution tampon (Laemmli)

Composant sulfhydryl (β-mercaptoéthanol, DTT) empêche

régénération des ponts disulfures

H2N COOH-

--+

++- -

--

- --- -- -

H2N COOH- ----- -

Protéines dépliées et uniformément chargées (Fct masse) Migration en fonction du poids moléculaire (+ petite, + vite)

Western-blot

Immunodétection

Blocage des sites aspécifiques

Incubation avec Anticorps primaires

Incubation avec Anticorps secondaires

Révélation

Western-blot

Blocage de la membrane

Blocage des sites aspécifiques:

- Protéines de lait (solution de lait à 5% dans tampon TBS-Tween)

- BSA (Bovine Serum Albumin – 3-5% dans tampon TBS-Tween)

MembraneX X X X

Blocage avec des protéines inertes

Membrane

Western-blot

Incubation avec Anticorps primaires

Anticorps primaires = dirigé contre un épitope de la protéine X

Dilués dans la solution de blocage (lait ou BSA)

X X X X

MembraneX X X X

Lavage = supprime l’excès d’Ac 1aires

Western-blot

Incubation avec Anticorps secondaires Anticorps secondaire = dirigé contre l’espèce à laquelle

appartient l’anticorps primaire (ex: souris, chèvre, lapin)

Couplés à une enzyme (peroxydase ou phosphatase alcaline)

MembraneX X X X

Perox Perox Perox Perox

Pero

xPerox

Perox

X X X X

Perox Perox Perox Perox

Pero

x

PeroxPerox

Lavage = supprime l’excès d’Ac 2aires

Western-blot

Révélation par chemiluminescence Ajout du substrat de l’enzyme

Clivage avec relargage d’un produit émettant de la lumière

Impression d’un film photographique

Révélation photo

X X X X

Perox Perox Perox Perox

Ex: Stabilisation du facteur de

transcription HIF-1α par l’hypoxie

Normoxie

Hypoxie

Western-blot

Western-blot: Résumé

Extraction et préparation des échantillons- Protection vis-à-vis des protéases- Dosage- Dénaturation

Electrophorèse- Dépôt et migration des échantillons sur gel (selon leur poids moléculaire)- Transfert sur membrane

Immunodétection- Blocage des sites aspécifiques- Incubations avec Ac 1aire puis 2aire- Révélation

Immunoprécipitation Isoler une protéine d’intérêt à partir d’un lysat cellulaire Utiliser un Ac spécifique de la protéine d’intérêt Précipiter le complexe Protéine-Ac avec une forme insoluble de protéines se liant à

des anticorps (ex: Protein G) Centrifuger la suspension: la protéine d’intérêt est séparée

Interactions protéines-protéines, protéine-médicament Concentration d’une protéines présente en faible quantité

Western-blot

Western-blot

Méthode d’analyse des cellules in situ par une technique

d’immunofluorescence Révéler et cibler une molécule biologique à l’échelle cellulaire avec des

anticorps spécifiques Utilisation d’un fluorochrome couplé à:

- anticorps primaire = immunofluorecence directe

- anticorps secondaire = immunofluorecence indirecte

Ex: Mise en évidence du cytosquelette Anticorps 1aire anti-tubuline Anticorps 2aire couplé à la fluorescéine

Immunocytochimie

Immunocytochimie

Immunocytochimie: Méthode

Immunocytochimie

Cellules en culture

Fixation (PFA 4%) Lavages au PBS

Perméabilisation au Triton X-100 (0,05%)

Blocage des sites aspécifiques (BSA 3%)

Anticorps 1aire(une nuit – 4°C)

X X

X

Anticorps 2airecouplé au

fluorochrome

Lavages au PBS

Analyse au microscope

Anti-actine

Immunocytochimie: exemple

Immunocytochimie

Facteur de transcription HIF-1α (Hypoxia Inducible Factor)

- Présence O2 cytoplasmique

- Absence O2 nucléaire transcription de gènes nécessaires à la survie

cellulaire

Fibroblastes de membrane synoviale humains

+ mimétique (CoCl2 150 µM) pendant 24 h

Témoin CoCl2

Les fluorochromesExemples

Immunocytochimie

DAPI- Excitation à 365 nm; émission à 420 nm- Contre-coloration de fond des noyaux - Fluorescence bleue

FITC: Isothiocyanate de Fluorescéine- Excitation à 490 nm ; émission à 520 nm- Fluorescence verte

TRITC: Tetra methyl Rhodamine Iso Thio Cyanate- Excitation à 541 nm ; émission à 572 nm- Fluorescence rouge

IMMUNIHISTOCHIMIE ET IMMUNOHYSTOFLUO

Méthode d’analyse des cellules in situ dans les tissu Révéler et cibler une molécule biologique à l’échelle cellulaire avec des

anticorps spécifiques

Utilisation un anti corps secondaire couplé à une enzyme (HRP ou ALP)Utilisation un anti corps secondaire couplé d’un fluorochrome

- anticorps primaire = immunofluorecence directe

- anticorps secondaire = immunofluorecence indirecte

IMMUNIHISTOCHIMIE ET IMMUNOHYSTOFLUO

Détection du collagène type deux Révéler par ALP coloration rouge

Détection du GFAPRévéler par fluorescence

Les differents type de microscopie

ELISA

.

ELISA

Expression des gènes

Étude de l’expression

Extraction des ARNs

Reverse Transcriptase

PCR semi quantitative et quantitative

Blocage de l’expression

siRNA

Extraction d’ARN

Extraction d’ARN

Cellules en culture - Enlever le milieu de culture- Ajouter le Trizol- Gratter avec une spatule- Récupérer dans un tube

Ajout Chloroforme

VortexIncubation sur glace

Protéines

Culot d’ARN

Resuspension dans l’eau UPLavage à l’Ethanol 70°C

Conservation à -80°CDosage à 260 nm

Centrifugation

Phénol + Chloroforme = Débris cellulaires

Phase aqueuse = ARN totauxAjout Isopropanol

= Précipitation ARN à -20°CCentrifugation

Transcription inverse (1)

Transcription inverse

ARN ADN complémentaire

Molécule moins fragile

Conservation à -20°C

Sélection des ARNm

Matrice pour la réaction d’amplification

Enzyme Transcriptase inverse isolée de rétrovirus à ARN

Transcription inverse (2)

Transcription inverse

Kits commerciaux avec:

- Enzyme + tampon d’activité

- dNTPs en quantité suffisante

- DTT élimination des structures 2aires des

ARNs

- Amorces polydT sélection des ARNm

AAAAA

10 min à 70°CDTT

AAAAAAAATTTTTTTTT

Amorce oligo dT1h – 37°C15 min – 70°C

ARNm

TTTTTTTTTADNc

Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR

Méthode d’amplification génique in vitro

Permet de copier en grand nombre (facteur de multiplication de l'ordre du

milliard), une séquence d'ADN ou d'ARN connue, à partir d'une faible quantité

(pg) d'acide nucléique

Utilisation d’amorces spécifiques constituées d'oligonucléotides de synthèse

(20 à 25 nucléotides) obtention d’un amplicon de taille connue

Basée sur:

L’utilisation d’enzymes ADN polymérase ADN dépendantes thermostables

Les propriétés d’hybridation et de déshybridation des brins complémentaires

d’ADN en fonction de la température

PCR: étapes d’un cycle

PCR

PCR: en pratique

PCR

Animation Flash

Au final, on obtient un très grand nombre de copies du

gène d’intérêt, visualisables sur gel

PCR: dépôt sur gel

PCR

Gel d’agarose = maillage

Plus solide et moins toxique que l’acrylamide

ADN chargé négativement, migre selon sa taille (ADN linéaire)

Plus % agarose est élevé, plus on sépare les petits fragments

Visualisation avec du Bromure d’Ethidium (agent intercalant)

- Ajouté lors de la préparation du gel

- En solution dans laquelle le gel est plongé après migration

M échantillons

PCR quantitative ou en temps réel

PCR

A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN total ou d’amplicon est

mesurée grâce à un marqueur fluorescent.

Suivi de la cinétique complète = quantification absolue de la quantité initiale

d’ADN cible

2 techniques:

- agents se liant à l’ADN (ex: SYBR Green)

- sondes fluorescentes (ex: Taqman)

2 conditions:

- Fluorescence augmentée lorsque lié à l’ADN double brin

- Pas d’inhibition de la réaction de PCR

PCRq: SYBR Green

PCR

Étape de dénaturation: le colorant libre émet

peu de fluorescence

Étape de dénaturation: extinction de la

fluorescence

Mesure à la fin de l’étape d’élongation

Étape d’hybridation et d’élongation:

fluorescence associée à la quantité de colorant se

fixant à l’ADN double brin

Lorsque suivi en temps réel, l’augmentation du

signal de fluorescence est observée pendant l’étape

de polymérisation et l’émission fluorescente décroît

complètement lorsque l’ADN est dénaturé à l’étape

suivante

PCRq: SYBR Green

PCR

Avantages:

Utilisation simple

Pas de sonde

Nécessité d’amorces spécifiques

Pas affectée par la présence de mutations sur l’ADN cible

Inconvénient

Se fixe à n’importe quelle molécule d’ADN double brin

Visualisation des produits aspécifiques

PCRq: Technologie TaqmanHydrolyse de sonde

PCR

Basée sur l’activité 5’-exonucléasique de la Taq polymérase pour hydrolyser

une sonde hybridée à sa séquence cible sur l’amplicon durant l’étape

d’hybridation/extension de la PCR.

Lorsque stimulé, le fluorochrome émetteur transfère son énergie au

fluorochrome suppresseur voisin par le principe FRET (fluorescence resonance

energy transfer) qui dissipe cette énergie sous forme de chaleur plutôt que

d’émettre de la fluorescence.

Un fluorochrome émetteur (reporter) (ex. FAM : 6-carboxyfluorocein) est fixé

à l’extrémité 5’ de la sonde d’hybridation et son émission est inhibée par un

second fluorochrome suppresseur (quencher) présent à l’extrémité 3’ (ex.

TAMRA : 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine).

PCRq: Technologie TaqmanHydrolyse de sonde

PCR

Hybridation de la sonde

Fixation de l’amorce et

élongation

Hydrolyse de la sonde

Émission de fluorescence

L’émission de fluorescence augmente à chaque cycle proportionnellement au taux d’hydrolyse de la sonde

PCRq: Technologie TaqmanHydrolyse de sonde

PCR

Précautions:

Nécessité d’un A, un C ou un T à l’extrémité 5’ parce qu’un G supprime

la fluorescence de l’émetteur même après clivage

Tm de 5 à 10 °C plus élevé que les amorces afin de s’assurer qu’elles

s’hybrideront avant les amorces et qu’elles demeureront hybridées

pendant l’étape combinée d’hybridation et de polymérisation

Avantage:

Plus spécifique

Inconvénient:

Pas idéale pour la détection des mutations

PCRq: Cycle seuil (Ct)

PCR

Base de la quantification précise et reproductible de l’ADN par fluorescence

Valeurs de fluorescence enregistrées à chaque cycle représentent la quantité

d’amplicons produits à un instant précis

Plus il y a de matrices à amplifier au

départ de la réaction de PCR, moins élevé

sera le nombre de cycles requis pour

atteindre un point où le signal d’émission

de fluorescence sera statistiquement et

significativement plus élevé que le bruit de

fond)

Ce point est défini comme étant le cycle seuil (Ct) et apparaîtra toujours au cours de

la phase exponentielle d’amplification.

PCRq: Courbe de fusion« Melting curve »

PCR

Chaque produit d'ADN double brin synthétisé a une température de

fusion (Tm) spécifique, définie comme étant la température à partir de

laquelle 50% de l'ADN est sous forme double brin et 50% sous forme

simple brin.

Étape supplémentaire programmée en fin des cycles d’amplification

45°C à 75°C par palier de 0.1°C avec acquisition de la fluorescence en

continu

PCRq: Courbe de fusion« Melting curve »

PCR

Dérivée première de la fluorescence en fonction de la température

Vérification de la spécificité des sondes

PCRq vs PCR classique

PCR

Quelques ng d’ADN suffisent

Rapidité du run (~ 1 h vs 2h30)

Sensibilité

Quantification précise (si droite d’étalonnage avec une quantité connue)

Logiciels d’analyse = exportation des résultats et gain de temps

Autre aplication de la qpcr

Etude interaction proteine proteine

Co Immuno précipitation

Fretcolocalisation

Etude interaction proteine adn

gemsashipTrans activation

Régulation expérimental de l’expression des gène

TransfectionSi RNA

Les animaux transgenic Transgenique KoEt conditionelle

Conclusions Importance des outils de la biologie moléculaire

Etude de l’expression génique

- Transcriptionnel (ARNm)

- Traductionnel (Protéines)

Etudes de localisation

- Localisation fonctionnelle

- Physiologique vs pathologique

ne correspondent pas toujours

Limites: - Disposer d’un matériel en quantité suffisante

- Spécificité (anticorps, amorces, etc…)