Cours Genie Genetique L3 Partie1

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  • 7/24/2019 Cours Genie Genetique L3 Partie1

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    Enseignant responsable de la matire : Pr, KITOUNI Mahmoud

    Objectifs de lenseignement

    Faire comprendre les multiples applications de ces techniques chez les

    microorganismes et leurs applications biotechnologies. .

    (anne universitaire 2014/2015)Gnie gntique

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    Contenu de la matire

    1. Introduction au Gnie Gntique

    - transferts des gnes entre organismes

    - profils de restriction modification et dcouverte des enzymes de restriction

    - potentialits du gnie gntique

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    2.1-. lments ncessaires au clonage

    - lADN cloner

    - les enzymes de restriction : leur dnomination et leurs proprits

    - les vecteurs de clonage, leur construction et leurs caractristiques

    (les vecteurs plasmidique, les vecteurs phagiques, les vecteurscosmidiques)

    - les cellules hte : - mthodes de transformation et transfection

    2. Principes gnraux du gnie gntique

    2.2. Les tapes du clonage - construction du vecteur

    - insertion de lADN cloner

    - slection des recombinants

    - mise en vidence des recombinants

    - mise en vidence des gnes clons grce aux vecteurs plasmidiques

    - mise en vidence des gnes clons grce aux vecteurs phagiques

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    3.- Applications et potentialits du gnie gntique- production de protine par la bactrie E. coli. ,

    - production par la levure Saccharomyces cerevisiae,

    - production de linsuline sur E.coli trangnique

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    Gnie gntique

    I. DFINITION

    Lexpressiongnie gntique ou la technologie de lADNrecombinant sapplique la

    recombinaison de lADN in vitro, puis au transfert de lADN recombinant dans un

    hte appropri qui en assure sa rplication, voir son expression.

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    Le gnie gntique principalement trois buts :

    II. OBJECTIFS

    1- Obtenir de grande quantits dun ou plusieurs gnes pour en analyser la squence,

    lorganisation,la rgulation, etc

    2- Obtenir grande chelle lexpression dun gne dont le produit est particulirement

    interessant (enzyme, hormone, antigne pour vaccin, etc.

    Gnie gntique

    3- Modifier le phnotype dunorganisme vivant (cellule, animal, vgtale, virus) en leur

    insrant un gne provenant dunautre organisme.

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    III. APPLICATIONS

    Gnie gntique

    - Production de vaccins vivants

    - Production de plantes rsistantes des insectes ou des pesticides

    - Production danimaux transgniques comme modles de maladies humaines

    - Thrapie gnique

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    III. METHODOLOGIE

    Gnie gntique

    Le clonage de gnes est la base du gnie gntique. Il implique :

    - Lisolementet la fragmentation de la source de lADNet linsertion des fragments dADN

    dans un vecteur (plasmides, ADN de phages ou de virus etc.)

    - Lincorporationde lADNrecombinant dans une cellule hte capable dassurerla rplication

    du vecteur

    - La dtection et lisolement du clone cellulaire contenant le gne intressant

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    Gnie gntiqueIsolement d'ADN

    provenant dedeux sources

    Les diffrentes tapes engnie gntique

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    Gnie gntique

    Les diffrentes tapes engnie gntique

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    Gnie gntiqueDveloppement du gnie gntique

    Le gnie gntique sestdvelopp grce aux progrs raliss dans les domaines

    de la microbiologie et de lenzymologie

    Conjugaison

    Le mle dE. coli montre des pili, dont un pilus sexuel qui se joint une cellule femelle . Le pilus sexuel tubulaire tablit une jonction cytoplasmique traverslaquelle le mle transmettra de lADN la femelle .

    Campbell, BiologieDeBoeck Universit (1995) p359

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    Gnie gntiqueDveloppement du gnie gntique

    Le gnie gntique sestdvelopp grce aux progrs raliss dans les domaines

    de la microbiologie et de lenzymologie

    Pont cytoplasmiquepermettant

    lchange dematriel gntique

    Conjugaison

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    Le schma montre un transfert en cours : passage d'un monobrin avec rplication chez le donneuret l'accepteur. Il ne montre pas le rsultat final : la bactrie donatrice reste F+ et la receveusedevient F+ (le monobrin qui passe et se rplique est recircularis en plasmide F complet,fonctionnel).

    Gnie gntiqueDveloppement du gnie gntique

    Le gnie gntique sestdvelopp grce aux progrs raliss dans les domaines

    de la microbiologie et de lenzymologieConjugaison

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21942/#A1314

    Chromosomebactrien

    Bactrie donatrice

    Bactrie rceptrice

    Plasmide

    Pilus

    Pont deconjugaison

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21942/#A1314http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21942/#A1314
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    Gnie gntiqueDveloppement du gnie gntique

    Le gnie gntique sestdvelopp grce aux progrs raliss dans les domaines

    de la microbiologie et de lenzymologie

    Transduction

    Figure 17.1

    Virus injectant son ADN dans unebactrie. Ce schma reprsente la premiretape de lundes phnomne biologiques lesplus remarquables : lassujettissementgntique dune cellule par un Virus.Linfectiondbute lorsque le Virus injecte sonADN dans la cellule hte. Dans le casprsent ici, la cellule est la Bactrie E. coliet le Virus est un Bactriophage T4. Cestentudiant les Virus et les Bactries que lesbiologistes ont entrevenu pour la premirefois la subtilit des mcanismes molculairesde lhrdit.

    Campbell, BiologieDeBoeck Universit 1995 p344

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    Gnie gntiqueDveloppement du gnie gntique

    Le gnie gntique sestdvelopp grce aux progrs raliss dans les domaines

    de la microbiologie et de lenzymologieTransduction

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    Gnie gntiqueDveloppement du gnie gntique

    Le gnie gntique sestdvelopp grce aux progrs raliss dans les domainesde la microbiologie et de lenzymologie

    Transduction

    G

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    Gnie gntiqueDveloppement du gnie gntique

    Le gnie gntique sestdvelopp grce aux progrs raliss dans les domainesde la microbiologie et de lenzymologie

    Transformation

    Binding

    DNA

    Uptake of DNA

    RecA-mediated

    homologousrecombination

    (a) (b)

    (c)(d)

    G i i

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    Gnie gntique

    Dveloppement du gnie gntique

    Le gnie gntique sestdvelopp grce aux progrs raliss dans les domainesde la microbiologie et de lenzymologie

    Enzymes agissant sur les acides nucliques

    La polynuclotide kinase, la terminal transferase, la phosphatase alcaline, la DNApolymrases, la reverse transcriptase, la RNA polymrases, la poly(A) polymrase,la DNA ligases, la RNA ligase, la topoisomrase, les enzymes de restriction, lesribonuclases (A, T1, H), les dsoxyribonuclases, la protinase K, la -galactosidase.

    G i ti

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    ADN de lhtenon mthyl

    5

    3

    3

    5

    G AA T T C

    C T TAA G

    Enzyme demthylation

    EcoR1ADN trangernon mthyl

    Enzyme derestriction

    EcoR1

    5

    3

    3

    5

    G A A T T C

    C T T A A G

    Hydrolyse

    53 35

    G AA T T C

    C T TAA G

    Enzyme derestriction

    EcoR1

    CH3

    CH3

    Lenzyme de restrictionEcoR1 ne peut pas cliver

    lADN mthyl

    Extrmit cohsives

    53

    35

    A A T T C

    C T T A A

    G

    G

    Gnie gntiqueDveloppement du gnie gntique

    Le gnie gntique sestdvelopp grce aux progrs raliss dans les domainesde la microbiologie et de lenzymologie

    (a) : Restriction (b) : Modification

    G i ti

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    Gnie gntique

    Les enzymes de restriction

    - Les endonuclases de restriction sont des enzymes bactriennes participant unmcanisme de dfense des bactries vis--vis des virus : systme de restriction-modification.

    - Elles catalysent la coupure de lADNnon mthyl en des endroits caractriss parune squence spcifique de nuclotides (site de restriction). Les produits de cettedigestion sont les fragments de restriction, dont la longueur, toujours la mme pourun ADN donn, ne dpend que de la squence primaire de cet ADN.

    G i ti

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    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Type 1 Type II Type III

    Exemple EcoB EcoRI EcoPI

    Site de reconnaissance TGAN8TGCT GAATTC AGACC

    Site daction (clivage) Environ 1kb aprs le

    site de reconnaissance

    Entre G et A

    (des deux brins)

    24-26 pb 3 ausite

    de reconnaissance

    Site de mthylation

    TGAN8TGCT

    ACTN8 ACGA

    GAATTC

    CTTAAG

    AGACC

    Un seul brin

    mthyl

    Nuclase et mthylase sur lamme enzyme

    Oui Non Oui

    Besoin pour le clivage ATP, Mg2+, S-AdoMet Mg2+, Mn2+ Mg2+, S-AdoMet

    Besoin pour la mthylation ATP, Mg2+, S-AdoMet S-AdoMet Mg2+, S-AdoMet

    S-AdoMet : S-adnosyle-mthionine

    Gnie gntique

    Les enzymes de restriction

    Il existe trois types isols des bactries

    G i ti

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    - Lanalysede la longueur des fragments de restriction, la recherche de variationsindividuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) estune des techniques danalyse de la squence primaire de lADN la recherchede substitutions, dinsertions ou de dltions qui modifient le nombre de sites derestriction et donc la longueur des fragments de restriction.

    - Les extrmits des fragments de restriction peuvent tre formes de deux brinsdgale longueur (bouts francs) ou bien prsenter un brin plus long que lautre dequelques nuclotides (bouts collants).

    Gnie gntique

    Les enzymes de restriction

    - Le type II est le plus utilis car le site de reconnaissance est lui-mme le site decoupure,

    G i ti

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    bouts francs

    bouts collants(cohsifs)

    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    G i ti

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    Nomenclature des enzymes de restriction

    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    G i ti

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    - Les enzymes de restriction sont des hydrolases (classe 3 de la E.C.) agissant sur desliaisons esters (sous-classe 3.1), cest--dire des estrases.

    - Parmi les estrases on distingue celles qui hydrolysent un acide nuclique enfragments polynuclotidiques (endonuclases) et en particulier celles dont les produitsgardent leur phosphate 5initial (sous-sous-classe 3.1.21).

    - Enfin en fonction des cofacteurs, les enzymes de restriction ne ncessitent que laprsence de lionMg++dans le milieu (3.1.21.4)

    - Le nom de chaque enzyme est driv du nom despceou de varit de la Bactrie quila produit. On crit linitialedu nom du genre, les deux initiales du nom de lespce,1lettre ou 1 nombre pour dsigner la varit (ou souche) et aprs un espace un chiffreromain pour dsigner successivement les diffrentes enzymes de restriction obtenues partir de la mme souche.

    Nomenclature des enzymes de restriction

    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Gnie gntiq e

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    Restriction (raction gnrale)

    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    - La raction gnrale catalyse par les enzymes de restriction implique la prsencedans le milieu ractionnel des facteurs suivants :

    Enzyme Substrat : ADN double brin non digr Produit : ADN double brin digr Cofacteurs

    Substrat

    (ADN)

    Produit

    (ADN digr)

    - En gnral, seul le Mg++est indispensable. Quelques endonuclases font appel

    dautrescofacteurs. Les enzymes de mthylation ont pour coenzyme la S-Adnosyl-Mthionine (S-AdoMet).

    - Des facteurs physiques contrlent aussi ces ractions : pH, potentieldoxydorduction, force ionique. Lnergie libre dgage par lhydrolyse estsuffisamment importante pour que la raction ne soit pratiquement pasrversible dans les conditions habituelles.

    Gnie gntique

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    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Tampons dincubation (restriction)

    - Diffrents tampons sont utiliss pour les enzymes de restriction permettantloptimisationdes ractions de multiples enzymes avec le mme tampon.

    - Toutes les enzymes de restriction ncessitent la prsence de lionMg++

    - Le pH (7,0 - 7,9), le potentiel doxydo-rduction (dithiothritol 1 mM), la forceionique (NaCl ou CH3COOK de 0 100 mM) varient duntampon lautre.

    - De rares enzymes ncessitent des conditions spciales prcises par leur modedemploi.

    Gnie gntique

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    10 mM Tris propane-HCl(pH 7,0 25 C)10 mM MgCl2

    (1 mM DTT)

    10 mM Tris-HCl(pH 7,9 25 C)10 mM MgCl2

    50 mM NaCl(1 mM DTT)

    10 mM Tris-HCl(pH 7,9 25 C)10 mM MgCl2100 mM NaCl(1 mM DTT)

    20 mM Tris-CH3COOH(pH 7,9 25 C)10 mM Mg(CH

    3

    COO)250 mM CH3COOK

    (1 mM DTT)

    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Tampons dincubation (restriction)

    Gnie gntique

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    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Exemples denzymes de restriction

    EcoR I

    NNNNGAATTCNNNN

    NNNNCTTAAGNNNN

    NNNNG

    NNNNCTTAA

    AATTCNNNN

    GNNNN

    +

    2H2O Mg++

    ADN double brin ADN digr

    - EcoR Iest une enzyme de restriction produite par Escherichia coli, souche R.

    - Le site de liaison lADNest form de six paires de nuclotides :

    5 GAATTC 33 CTTAAG 5

    Gnie gntique

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    - Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sontidentiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).Lorsque lhydrolysedes liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie

    du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : lesfragments qui en rsultent sont dits bouts collants .

    - La mthylation des adnines ou de la cytosine du site dhydrolyse inhibent lareconnaissance du site par EcoR I. LADNde la bactrie ainsi mthyl nestpashydrolys alors que lADNparasite qui nestpas mthyl sera hydrolys.

    5 GAATTC 33 CTTAAG 5

    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Exemples denzymes de restriction

    EcoR I

    Gnie gntique

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    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Exemples denzymes de restriction

    EcoR V

    ADN double brin ADN digr

    NNNNGATATCNNNN

    NNNNCTATAGNNNN

    NNNNGAT

    NNNNCTA

    ATCNNNN

    TAGNNNN+

    2H2O Mg++

    Mthylation (-)

    - EcoR Vest une enzyme de restriction produite par Escherichia coli, souche R.

    - Le site de liaison lADNest form de six paires de nuclotides :

    5 GATATC 33 CTATAG 5

    Gnie gntique

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    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Exemples denzymes de restriction

    EcoR V

    - Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sontidentiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).Lorsque lhydrolysedes liaisons phosphodiester se fait au centre de symtriedu

    palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments quien rsultent sont dits bouts francs .

    - La mthylation des adnines du site dhydrolyseinhibent la reconnaissance du sitepar EcoR V. LADNde la bactrie ainsi mthyl nestpas hydrolys alors que lADNparasite qui nestpas mthyl sera hydrolys.

    5 GATATC 33 CTATAG 5

    Gnie gntique

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    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Exemples denzymes de restriction

    Pvu II

    NNNNCAGCTGNNNN

    NNNNGTCGACNNNN

    NNNNCAG

    NNNNGTC

    CTGNNNN

    GACNNNN+

    2H2O Mg++

    Mthylation (-)

    ADN double brin ADN digr

    - Pvu II est une enzyme de restriction produite par Proteus vulgaris.

    - Le site de liaison lADNest form de six paires de nuclotides :

    5 CAGCTG 33 GTCGAC 5

    Gnie gntique

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    - Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sontidentiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).Lorsque lhydrolysedes liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du

    palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments quien rsultent sont dits bouts francs .

    - La mthylation des cytosines au niveau du site dhydrolyse inhibe lareconnaissance du site par Pvu II. LADNde la bactrie ainsi mthyl nestpashydrolys alors que lADNparasite qui nestpas mthyl sera hydrolys.

    5 CAGCTG 33 GTCGAC 5

    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Exemples denzymes de restriction

    Pvu II

    Gnie gntique

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    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Exemples denzymes de restriction

    Hae III

    NNNNGGCCNNNN

    NNNNCCGGNNN

    NNNNNGG

    NNNNNCC

    CCNNNNN

    GGNNNNN+

    2H2O Mg++

    Mthylation (-)

    ADN double brin ADN digr

    - Hae IIIest une enzyme de restriction produite par Haemophilus aegypticus.

    - Le site de liaison lADNest form de quatre paires de nuclotides :

    5 GGCC 33 CCGG 5

    Gnie gntique

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    - Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sontidentiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).Lorsque lhydrolysedes liaisons phosphodiester se fait au centre de symtriedu

    palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments quien rsultent sont dits bouts francs .

    - La mthylation de la cytosine immdiatement en aval du site dhydrolyseinhibe lareconnaissance du site par Hae III. LADNde la bactrie ainsi mthyl nestpashydrolys alors que lADNparasite qui nestpas mthyl sera hydrolys.

    5 GGCC 33 CCGG 5

    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Exemples denzymes de restriction

    Hae III

    Gnie gntique

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    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Exemples denzymes de restriction

    Pvu I

    ADN double brin ADN digr

    NNNNCGATCGNNNN

    NNNNGCTAGCNNNN

    NNNNCGAT

    NNNNGC

    CGNNNN

    TAGCNNNN+

    2H2O Mg++

    Mthylation (-)

    - Pvu Iest une enzyme de restriction produite par Proteus vulgaris.

    - Le site de liaison lADNest form de six paires de nuclotides :

    5 CGATCG 33 GCTAGC 5

    Gnie gntique

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    - Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sontidentiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).Lorsque lhydrolysedes liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie

    du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : lesfragments qui en rsultent sont dits bouts collants .

    - La mthylation de la deuxime cytosine proche du site dhydrolyse inhibe lareconnaissance du site par Pvu I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pashydrolys alors que lADNparasite qui nestpas mthyl sera hydrolys.

    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Exemples denzymes de restriction

    Pvu I

    5 CGATCG 33 GCTAGC 5

    Gnie gntique

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    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Exemples denzymes de restriction

    ADN double brin ADN digr

    - Pst Iest une enzyme de restriction produite par Providencia stuartii.

    - Le site de liaison lADNest form de six paires de nuclotides :

    5 CTGCAG 33 GACGTC 5

    Pst I

    NNNNCTGCAGNNNN

    NNNNGACGTCNNNN

    NNNNCTGCA

    NNNNG

    GNNNN

    ACGTCNNNN+

    2H2O Mg++

    Mthylation (-)

    Gnie gntique

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    - Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quilssontidentiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).Lorsque lhydrolysedes liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie

    du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : lesfragments qui en rsultent sont dits bouts collants .

    - La mthylation de la premire cytosine ou de ladninedu site dhydrolyseinhibentla reconnaissance du site par Pst I. LADNde la bactrie ainsi mthyl nestpashydrolys alors que lADNparasite qui nestpas mthyl sera hydrolys..

    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Exemples denzymes de restriction

    Pst I

    5 CTGCAG 33 GACGTC 5

    Gnie gntique

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    Gnie gntiqueAlphabet dgnr

    Alphabet dgnr du code gntique

    A = AdnosineR = A ou puRine

    H = non G (A, C ou T)

    C = Cytosine V = non T (A, C ou G)

    G = Guanine Y = C ou TpYrimidine

    D = non C (A, G ou T)

    T = Thymidine B = non A (C, G ou T)

    K = G ou T ctone(keto en anglais)

    S = C ou G 3 liaisons H(strong en anglais)

    M = A ou C aMineW = A ou T 2 liaisons H

    (weak en anglais)

    N = A, C, G ou T

    Le complment de A C G T R Y K M S W B D H V N

    est T G C A Y R M K S W V H D B N

    Gnie gntique

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    - La spcificit large de certaines enzymes ou encore la dgnrescence du code

    gntique implique quon doit indiquer quelquefois dans les squences des lettrescorrespondant plusieurs bases azotes diffrentes pour le mme nuclotide prsent une position.

    - Le choix peut porter sur deux des 4 nuclotides : A ou G, C ou T, G ou T, A ou C, Cou G, A ou T ; ou bien sur 3 nuclotides : C, G ou T, A, G ou T, A, C ou T, A, C ou G ;

    ou enfin sur les 4 nuclotides : A, C, G ou T.

    Gnie gntiqueAlphabet dgnr

    - Les rgles de complmentarit impliquent videmment une dgnrescence de lasquence de lautrebrin en regard duneposition dgnre.

    Gnie gntique

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    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    ADN double brin ADN digr

    Ava II

    NNNNGGWCCNNNN

    NNNNCCWGGNNNN

    NNNNG

    NNNNCCWG

    GWCCNNNN

    GNNNN+

    2H2O Mg++

    Mthylation (-)

    -Ava IIest une enzyme de restriction produite parAnabaena variabilis.

    - Le site de liaison lADNest form de cinq paires de nuclotides :

    5 GGWCC 33 CCWGG 5

    Gnie gntique

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    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Ava II

    - Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quilssontidentiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).Lorsque lhydrolysedes liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie

    du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : lesfragments qui en rsultent sont dits bouts collants .

    - La mthylation des cytosines du site dhydrolyseinhibe la reconnaissance du siteparAva II. LADNde la bactrie ainsi mthyl nestpas hydrolys alors que lADNparasite qui nestpas mthyl sera hydrolys..

    5 GGWCC 33 CCWGG 5

    Gnie gntique

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    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    ADN double brin ADN digr

    Hind II

    - Hind II est une enzyme de restriction produite par Haemophilus influenzae,souche Rd.

    - Le site de liaison lADNest form de six paires de nuclotides :

    5 GTYRAC 33 CARYTG 5

    NNNNGTYRACNNNN

    NNNNCARYTGNNNN

    NNNNGTY

    NNNNCAR

    RACNNNN

    YTGNNNN+

    2H2O Mg++

    Mthylation (-)

    Gnie gntique

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    - Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sontidentiques sur les deux brins de lADN(mais antiparallles sur lautrebrin). Lorsquelhydrolysedes liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du palindrome

    toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments qui en rsultentsont dits bouts francs .

    - La mthylation de ladninedu site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du sitepar Hind II. LADNde la bactrie ainsi mthyl nestpas hydrolys alors que lADNparasite qui nestpas mthyl sera hydrolys.

    Gnie gntiqueLes enzymes de restriction

    Hind II

    5 GTYRAC 33 CARYTG 5

    Gnie gntique

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    Gnie gntiqueLes enzymes de restrictionDigestion dune squence (Hae III)

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    - Chacune des squences GGCC engendre une coupure de lADN,ce qui produit des

    fragments de restriction dont le longueur dpend de la frquence de cette squencesur lADN.

    - Voici le rsultat de la digestion du gne de lapoA-II (brin codant) par Hae III.

    g qLes enzymes de restriction

    Digestion dune squence (Hae III)

    - Les apolipoprotines A et B (Apo A et B) sont des lipoprotines fabriques par lefoie, intervenant dans le mtabolisme des lipides (graisses). L'ApoA1 sert au retourdu cholestrol vers le foie o il va tre dtruit : de ce fait, elle est surtout un

    marqueur de protection vis--vis des maladies cardio-vasculaires. L'ApoB participeplutt au transport et aux dpts de cholestrol sur les parois des artres. Elle estdonc un marqueur d'athrosclrose, responsable de maladies cardio-vasculaires(notamment d'infarctus du myocarde).

    Gnie gntique

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    - On peut tablir des cartes des emplacements de ces sites sur lADN (cartes derestriction).

    - La recherche de ces sites sur lADN extrait dun sujet permet de dtecter des

    squences diffrentes qui ajoutent ou suppriment des sites de restriction. Il enrsulte que les fragments de restriction chez ces individus nont pas la mmelongueur que les mmes fragments chez les autres individus : il y a unpolymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP = RestrictionFragment Length Polymorphism).

    g qLes enzymes de restriction

    Digestion dune squence (Hae III)