Techniques Chromatographiques d’Analyse

Classification des méthodes chromatographiques

LA CHROMATOGRAPHIE D'ADSORPTION :

Chromatographie liquide-solide basée sur la (ré)partition des solutés entre l'adsorbant fixe et la phase liquide mobile.

Chacun des solutés est soumis à une force de rétention (par adsorption) et une force d'entraînement par la phase mobile. L'équilibre qui en résulte aboutit à une migration différentielle des solutés de l'échantillon à analyser, ce qui permet leur séparation. La figure suivante représente le mécanisme de l’adsorption et de la désorption.

Répartition des molécules entre les deux phases les molécules sont adsorbées à la surface du solide.

L'adsorption : fixation des molécules dissoutes par la phase solide. Cette fixation est due à l'établissement de liaisons secondaires de surface entre l'adsorbant et la molécule adsorbée : liaison dipôle-ion, ou dipôle-dipôle ou liaison de Van der Waals.

Illustration de la différence entre

adsorption et absorption

DEFINITION

* Les adsorbants à faible capacité d'adsorption comme l'alumine, le talc (métasilicate acide de magnésium) ou le carbonate de sodium. * Les adsorbants forts comme le gel de silice.

Silices polaires greffées.

Adsorbants

Silices apolaires greffées.

Pour un système chromatographique donné (caractérisé par une phase stationnaire, la température, la pression et le soluté), le pouvoir éluant dépend de la polarité du solvant.

Solvants :

Ether de pétrole Cyclohexane Tétrachlorométhane Trichloroéthène Toluène Benzène Dichlorométhane Ether diéthylique Trichlorométhane Ethanoate d'éthyle Pyridine Propanone Propanol - 1 Ethanol Méthanol Eau Acide éthanoïque

" pouvoir éluant" croissant

Série éluotropique des solvants

•sur colonne : ouverte à pression ambiante, en flash chromatographie, à moyenne pression, en HPLC;

•sur papier : en chromatographie ascendante ou radiale ; dans cette technique le papier constitue la phase fixe ;

•sur couche mince : le gel adsorbant (cellulose, silice) est coulé sur une plaque (verre, aluminium, plastique), mélangé à un liant (platre).

La chromatographie d'adsorption est appliquée selon différentes techniques :

Technologies

Remarque : Dans la pratique, chromatographie phase inverse ne s'applique qu'en HPLC, elle porte le nom de RP-HPLC (ou Reverse Phase HPLC, ou HPLC en phase inverse). La RP-HPLC s'applique bien à la séparation de petites molécules apolaires : lipides, acides aminés, peptides.

Structure des billes de silice utilisées pour les phases stationnaires en chromatographie en phase reverse

Les matrices pour chromatographie en phase reverse sont souvent à base de silice.

On obtient une phase stationnaire qui contient plus ou moins de groupements silanols libres. Le taux de greffage est un paramètre très important pour la résolutivité d'une phase stationnaire.

Des chaînes alkylées sont greffées sur les groupements silanols

Un autre paramètre important est la forme des billes qui peuvent être sphériques ou irrégulières.

Chromatographie liquide-liquide fondée sur la (ré)partition différentielle de chacun des solutés entre deux liquides non miscibles, l'un constituant la phase stationnaire, l'autre la phase

mobile. C'est une technique essentiellement qualitative.

LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

Théorie de la partition : La distribution d'un soluté A entre deux solvants non-miscibles, l'un aqueux (Saq), l'autre organique (Sorg), relève de l'équilibre :

* [ASorg] : concentration en soluté A dans la phase organique

* [ASaq] : concentration en soluté A dans la phase aqueuse.

Remarque : soluté plus miscible dans le solvant organique que dans le solvant aqueux. K aura donc une valeur supérieure à 1.

Solvants : Généralement, le solvant fixe est polaire : très souvent, ce sera l'eau. Le solvant mobile non-polaire est souvent un mélange plus ou moins apolaire, choisi selon les nécessités de la séparation.

Technologie : C'est une technique essentiellement qualitative.

sur colonne : la colonne est remplie d'un support inerte imprégné du solvant fixe, le tout constituant la phase stationnaire.

sur papier : en chromatographie ascendante ou descendante.

sur couche mince : le support inerte du liquide qui constituera la phase mobile est coulé sur une plaque de verre. Les solvants migreront par capillarité.

Ce type de chromatographie est encore appelé : tamisage

moléculaire, gel-filtration ou perméation de gel.

Séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur forme. On utilise pour cela des granules de gel poreux. Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont donc éluées les premières, au niveau du volume mort (Vm ou V0). Les petites et moyennes molécules sont éluées plus

tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est freinée.

Schéma du tamisage moléculaire

LA CHROMATOGRAPHIE D'EXCLUSION

Types de gels :

Gels hydratés (les plus utilisés) : le SéphadexTM (G10 à G200) qui sont des

polyosides bactériens de type dextran (poly D-glucopyranosyl a, 1 6),

le SépharoseTM (agarose).

Gels permanents : ce sont des copolymères organiques ou bien des minéraux (silice). Ici, des effets d'adsorption s'ajoutent au tamisage moléculaire.

Structure du gel "Sephadex™"

La série des gels "Sephadex™" (G-25, G-50, G-75, ...) est très largement employée en chromatographie de filtration sur gel.

  Le type de gel est choisi en fonction du domaine de

fractionnement dans lequel se trouvent les molécules à séparer.   Les indices : G-25, G-50, G-75, ...indiquent la granulométrie des

billes du gel, c'est-à-dire leur volume.   Les billes de "Sephadex™" sont constituées d'un dérivé du

dextran : ce sont des chaînes de glucose liées par des liaisons osidiques 1-> 4 et 1->6.

Représentation des résultats

Soit l'on porte logarithme de la masse moléculaire en fonction du volume d'élution : log MM = f (Ve)

Une molécule totalement incluse sera éluée avec un volume d'élution V* = Vm + Vi, où Vi est le volume

d'eau interne aux granules de gel. Les solutés sont donc élués dans l'ordre inverse des masses moléculaires.

Détermination de la masse molaire (2ème méthode)

Un mélange de molécules de masse molaire connue est séparé par chromatographie de filtration sur gel (pics d'élution 1 à 7).

Chaque pic est caractérisé par un volume d'élution Ve.

Le volume d'exclusion du gel (V0) est le volume d'élution d'une molécule NON retardée, ici le bleu dextran.

Le volume total du gel (Vt) est la somme du volume des billes et du volume externe aux billes. Il est donné par le volume d'élution d'une molécule qui diffuse totalement dans les billes (donc totalement retardée), ici la ruonosine

On définit le coefficient de partition :

KD = (Ve - V0) / (Vt - V0) On trace la droite étalon : log

(masse molaire) = f (KD) (ou masse molaire = f(KD) sur une échelle semi-logarithmique

La partie linéaire de cette droite (en rouge) permet de déterminer la masse molaire d'une molécule X dont le volume d'élution a été mesuré dans les mêmes conditions, en reportant son KD.

LA CHROMATOGRAPHIE SUR ECHANGEURS D'IONS :

Principe : Les échangeurs d'ions sont des macromolécules insolubles portant des groupements ionisables, qui ont la propriété d'échanger de façon réversible certains de leurs ions, au contact d'autres ions provenant d'une solution.

Résine cationique : qui échange réversiblement des cations. Une résine cationique est chargée négativement. Résine-G- / X+ + cation+<=>Résine-G- / cation++ X+

Résines anioniques : qui échange réversiblement des anions. Une résine anionique est chargée positivement.

Résine-G+ / Y-+anion-<=>Résine-G+ /anion-+ Y-

Technologie : La chromatographie par échange d'ions se pratique le plus souvent sur colonne, mais la méthode peut être transposée sur couche mince. Du papier échangeur d'ions est également commercialisé.

Propriétés des échangeurs d'ions : Le support peut être minéral, mais il est le plus souvent organique (résine de copolymérisation, polyosides : dextrans ou celluloses. Les groupements fonctionnels chargés des résines sont fixés par covalence sur le support.

* Résines cationiques fortes : ** sulfoniques (très fortement ionisées, quel que

soit le pH) :

Résine sous forme acide Résine-SO3

- / H+

(contre-ion : H+)

Résine sous forme sodique Résine-SO3

- / Na+

(contre-ion : Na+)

* Résines cationiques intermédiaire :

** à groupement phospho : Résine-H2PO4

- / H+ Résine-H2PO4- / Na+* Résines cationiques faibles :

** carboxyliques (non ionisées en milieu fortement acide) :

Résine-COO- / H+ Résine-COO- / Na+

** à groupement carboxyméthyl :

Résine-CH2-COO-/H+ Résine-CH2-COO- / Na+

* Résines cationiques très faibles : ** phénoliques (uniquement ionisées en milieu

alcalin) :

Résine-O- / H+ Résine-O- / Na+

Résines anioniques fortes : ** résines à groupements aminés quaternaires.** résines à groupements aminés tertiaires.

Résines anioniques faibles : ** résines à groupements aminés secondaires et primaires.

Les Groupements fonctionnels des résines anioniques :

Capacité de rétention d'un échangeur d'ions : C'est le nombre de millimoles (mmol) d'ions que la résine peut échanger par unité de masse. On l'exprime par gramme de résine sèche (ou moins souvent par unité de volume : par ml de résine humide).

Elution : L'élution consiste à déplacer l'ion fixé par un autre, de densité de chargé et de concentration plus élevée on utilise de petits ions fortement chargés : Cl-, HO-, Na+, H+...

Séparation des acides aminés

Structure d'une bille de résine pour échange d'ions

Structure d'une bille de résine obtenue par polymérisation de [styrène - divinylbenzène] d'un diamètre de 50 à 100 µm.

Chaque bille est en fait constituée d'un assemblage de microparticules sphériques (diamètre 1000 Å).

Cet assemblage crée des macropores au sein de la bille.

Choix du type d'échangeur d'ions en fonction du pI de la protéine à séparer et du pH du tampon

      Considérons une protéine de pI = 5 :    

si le pH du tampon utilisé pour la chromatographie est inférieur au pI de la protéine (zone bleue), celle-ci est chargée positivement ; il faut utiliser un échangeur de cations ;

   si le pH du tampon utilisé pour la

chromatographie est supérieur au pI de la protéine (zone rouge), celle-ci est chargée négativement ; il faut utiliser un échangeur d'anions.

 

La phase stationnaire est un support macromoléculaire chimiquement inerte sur lequel est greffé un effecteur qui présente une affinité biologique pour un

soluté de l'échantillon à analyser.

Trois types d'affinités sont utilisées : affinité enzyme-substrat affinité ligand-récepteur affinité antigène-anticorps

Très souvent, la molécule fixée sera le substrat, le ligand, ou bien l'anticorps. Ceci permettra de purifier l'enzyme, le récepteur ou l'antigène, respectivement.

LA CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITÉ

Les trois étapes d'une chromatographie d'affinité.

La phase stationnaire (le gel d'affinité) : constituée d'un effecteur fixé par covalence à un support

(carboxyméthylcellulose, Séphadex, gel de polyacrylamide) par l'intermédiaire d'un bras de fixation ("spacer" en anglais).

Elution : elle peut être réalisée de différentes façons : * Tampon de pH différent de celui ayant permis la charge :

changement de l'état d'ionisation de la protéine : désorption

* Tampon de force ionique différente de celle ayant permis la charge : changement de conformation de la protéine.