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Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de

aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate

Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de

CORPOICA.

Eberto Rodríguez Henao

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Palmira, Colombia

2015

Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de

aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate


CORPOICA.

Eberto Rodríguez Henao

Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias Agrarias

Directores:

Ph.D, Jaime Eduardo Muñoz Flórez M.Sc. Álvaro Caicedo Arana

Línea de Investigación:

Mejoramiento genético vegetal

Grupo de Investigación:

Diversidad biológica – Frutales del trópico

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Palmira, Colombia

2015

(Dedicatoria)

Este trabajo lo dedico a mi familia, en especial

a mis padres Luz Marina Henao y Eberto

Rodríguez quienes impartieron en mí la

importancia de la fe en Dios como ser

supremo, a quien agradezco mi vida, presente

y futura. A mis hermanos Alexander y

Alexandra por apoyarme moralmente y

hacerme ver que cada día es una oportunidad

más que tenemos para hacer las cosas mejor.

Por lo anterior y por brindarme amor

incondicional.

Agradecimientos

Expreso mis más sinceros agradecimientos a todas las personas que de una u otra forma hicieron parte y posible la realización de este trabajo. A CORPOICA Centro de Investigación Palmira y en especial al Sistema de Bancos de Germoplasma Vegetal Palmira por permitir realizar el estudio con el germoplasma de aguacate presente en este centro de investigación. A COLCIENCIAS y CORPOICA por financiar económicamente el presente trabajo como joven investigador e innovador Colciencias mediante la convocatoria 566 del 2012. Al Dr. Álvaro Caicedo Investigador de CORPOICA por sus importantes aportes como codirector del presente trabajo de investigación, sin los cuales no hubiese sido posible realizar este trabajo. Al Dr. Jaime Eduardo Muñoz profesor asociado de la Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira, director del presente trabajo de investigación por su continua orientación y aportes para el presente trabajo. A la Dra. Elizabeth Álvarez investigadora del CIAT por participar como guía para la selección de la presente investigación como trabajo de tesis. A Hermilzon Escobar Lourido asistente de investigación de CORPOICA por su apoyo en el proceso de inoculación, parte fundamental en este trabajo de investigación. A la Dra. Nubia Murcia y su equipo de apoyo por su colaboración en la parte de trabajo de laboratorio. A los investigadores Demian Kondo Ph.D. Entomólogo y Marilyn Manrique Ing. Agrónoma por sus aportes para mejorar la redacción de este documento.

Resumen y Abstract IX

Resumen

Como aporte a la búsqueda de cultivares de aguacate Persea americana Mill.,

potencialmente resistentes a la enfermedad de pudrición de raíces causada por

Phytophthora cinnamomi Rands, se evaluaron 21 accesiones del banco de germoplasma

de aguacate antillano de CORPOICA, seleccionadas por distanciamiento genético

mediante caracterización morfológica, utilizando dos cepas patogénicas de este oomiceto.

El objetivo fue identificar accesiones con potencial de uso como portainjertos, práctica de

manejo preventivo de esta enfermedad. Se evaluó la infección con micelio del patógeno

mediante la técnica de herida al tallo. Se midió periódicamente el largo y ancho del avance

de síntomas. Con estos registros se estableció el área bajo la curva del progreso de la

enfermedad (ABCPE) en el tejido de la planta. Se utilizó un diseño en bloques completos

al azar con arreglo factorial de 3 x 21 x 8 en parcelas subdivididas (dos cepas del patógeno

y una cepa testigo, 21 accesiones de aguacate y 8 lecturas en el tiempo de avance de la

enfermedad). El análisis estadístico mostró diferencias significativas del ABCPE para

algunas accesiones de aguacate, la prueba de separación de medias de Tukey reveló seis

niveles de respuesta y permitió identificar la cepa Ag A-041 de Tribunas Córcega,

Risaralda como la más patogénica. Se identificó la accesión NATU-001 proveniente de

Tumaco, Nariño, como promisoria por su alta resistencia y la accesión CANO-008 de

Norcasia, Caldas, testigo resistente de acuerdo a estudio realizado por Jaramillo et al.

(2009), el cual presentó el segundo menor valor de ABCPE. Los testigos susceptibles, i.e.,

cultivar Hass y portainjerto Topa-Topa, presentaron muy baja resistencia al patógeno junto

con la accesión QUIQUI-030 de Quimbaya, Quindío.

Palabras clave: Phytophthora cinnamomi Rands, Persea americana Mill., banco de

germoplasma, cultivares criollos, accesiones, resistencia.

X Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de

aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora

cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.

Abstract

As a cultural control strategy for preventing root rot disease caused by Phytophthora

cinnamomi Rands on cultivated avocados, 21 accessions of native, antillano cultivars of

Persea americana Mill. from the Colombian Corporation for Agricultural Research

(CORPOICA), Palmira Research Station Germplasm Bank, selected by their genetic

distances and characterized by morphology, using two strains of the pathogenic oomycete.

The objective of this study was to identify avocado accessions with potential use as

rootstock, as a preventive management practice of this plant disease. Infection was

evaluated with mycelium of the pathogen by the cut-stem inoculation method. The length

and width of the progression symptoms were measured periodically. With these data, the

area under the curve of disease progress (AUDPC) on plant tissue was established. A

randomized complete block design, under a 3 x 21 x 8 factorial arrangement in subdivided

parcels (two strains of the pathogen, a control strain, 21 accessions of avocados and 8

reads at the time of disease progression). Statistical analysis showed significant

differences in AUDPC for some avocado accessions and the Duncan's test revealed six

levels of response, and the most pathogenic culture was Ag A-041 de Tribunas Córcega,

Risaralda. Accession NATU-001 from Tumaco, Nariño, was identified as promising for its

high resistance and CANO-008 from Norcasia, Caldas, as a resistant control accession

according to Jaramillo et al. (2009) had the second lowest value of ABCPE. Susceptible

accessions used as control, i.e., Hass cultivar and Topa-Topa rootstock, had very low

resistance to the pathogen along with QUIQUI-030 accession from Quimbaya, Quindío.

Keywords: Accessions, Germplasm bank, native criollo cultivars, Persea americana

Mill., Phytophthora cinnamomi Rands, resistance.

Contenido XI

Contenido

Pág.

Resumen ........................................................................................................................ IX

Lista de figuras ............................................................................................................ XIII

Lista de tablas .............................................................................................................. XV

Lista de anexos ........................................................................................................... XVI

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Planteamiento del problema .................................................................................... 7

2. Objetivos ................................................................................................................... 9 2.1 Objetivo general............................................................................................... 9 2.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 9

3. Marco teórico y estado del arte ............................................................................. 11 3.1 Taxonomía del aguacate ............................................................................... 11

3.1.1 Sinonimia ............................................................................................ 11 3.2 Centro de origen del aguacate ....................................................................... 12 3.3 Importancia económica del aguacate ............................................................. 12 3.4 Caracterización morfológica........................................................................... 14 3.5 Importancia económica de Phytophthora cinnamomi ..................................... 15 3.6 Taxonomía de Phytophthora cinnamomi Rands............................................. 16 3.7 Características morfológicas de Phytophtora cinnamomi ............................... 17 3.8 Ciclo biológico de Phytophthora cinnamomi ................................................... 18 3.9 Sintomatología ............................................................................................... 20 3.10 Portainjertos de aguacate resistentes a Phytophthora cinnamomi ................. 21 3.11 Métodos de evaluación de la resistencia a Phytophthora cinnamomi en Persea americana ................................................................................................................ 22

4. Materiales y métodos ............................................................................................. 27 4.1 Localización ................................................................................................... 27 4.2 Caracterización morfológica del Banco de Germoplasma de Aguacate de CORPOICA C.I. Palmira ........................................................................................... 27 4.3 Selección del material vegetal ....................................................................... 29 4.4 Selección de cepas de Phytophthora cinnamomi ........................................... 29 4.5 Producción del material vegetal ..................................................................... 30

4.5.1 Manejo agronómico ............................................................................. 30 4.6 Clonación del material vegetal ....................................................................... 32

XII

4.7 Clonación del material vegetal ....................................................................... 34 4.8 Monitoreo climatológico ................................................................................. 35 4.9 Diseño experimental ...................................................................................... 36 4.10 Variable de respuesta.................................................................................... 36 4.11 Inoculación .................................................................................................... 36

5. Resultados y discusión ......................................................................................... 39 5.1 Caracterización morfológica del banco de germoplasma de aguacate del C.I. Palmira .................................................................................................................... 39 5.2 Selección del material vegetal ....................................................................... 42 5.3 Monitoreo climatológico en el área de estudio ............................................... 43 5.4 Síntomas y niveles de expresión de la enfermedad por cepa evaluada ......... 45 5.5 Síntomas de la enfermedad en las plantas inoculadas .................................. 50 5.6 Análisis de varianza (ANDEVA) para la interacción cultivar criollo vs. Cepa de P. cinnamomi Rands ................................................................................................ 51 5.7 Respuesta de las accesiones criollas de aguacate a las cepas de P. cinnamomi ............................................................................................................... 53

6. Conclusiones y recomendaciones ....................................................................... 61 6.1 Conclusiones ................................................................................................. 61 6.2 Recomendaciones ......................................................................................... 62

Anexos:.......................................................................................................................... 65

Bibliografía .................................................................................................................... 73

Contenido XIII

Lista de figuras

Pág.

Figura: 1 Ciclo de infección de Phytophthora cinnamomi Rands. Tomado de Lemus, 2009)

....................................................................................................................................... 19

Figura: 2 Materiales de aguacate conservados en materas en el B.G. de CORPOICA C.I.

Palmira y poda para incentivar el crecimiento de yemas. ............................................... 31

Figura: 3 Colecta, marcación y embalaje de las yemas. ................................................ 33

Figura: 4 Proceso de injertación: corte para injerto en púa terminal (A), encinte (B) y planta

injertada (C). .................................................................................................................. 33

Figura: 5 Acondicionamiento de plantas en vivero, aisladas del suelo, en soporte de

materas plásticas de 6 litros. .......................................................................................... 35

Figura: 6 Estación meteorológica portátil para monitoreo de condiciones ambientales. . 35

Figura: 7 Temperatura (ºC) registrada durante el periodo de las evaluaciones. ............. 44

Figura: 8 Humedad relativa máxima, mínima y promedio (%) registrada durante el periodo

de las evaluaciones. ....................................................................................................... 44

Figura: 9 Necrosamiento del tallo de planta de aguacate causado por la cepa Ag A-041 de

Phytophthora cinnamomi cinco días después de la inoculación en la accesión de aguacate

Quiqui-030. ..................................................................................................................... 45

Figura: 10 Necrosamiento reducido del tallo de planta de aguacate causado por la cepa

Ag A-003 de Phytophthora cinnamomi 20 días después de la inoculación en la accesión

de aguacate Quiqui-030. ................................................................................................ 46

Figura: 11 Oxidación del tejido afectado por el corte con inoculación de agar más agua,

sin expresión de síntoma de necrosis causado por Phytophthora cinnamomi 20 días

después de la inoculación en la accesión de aguacate Quiqui-030. ............................... 47

Figura: 12 Plantas de aguacate con crecimiento blanquecino sobre el área afectada por la

inoculación con Phytophthora cinnamomi. ...................................................................... 48

Figura: 13 Crecimiento de colonia de micelio tipo petaloide de reaislamiento de material

vegetal de aguacate inoculado con cepas de Phytophthora cinnamomi. ........................ 49

Figura: 14 Micelio tipo coraloide (micelio con protuberancias o nodos) de la cepa Ag A-

041 de Phytophthora cinnamomi. ................................................................................... 50

Figura: 15 Planta con alta resistencia (izquierda), planta con resistencia intermedia

(centro) y planta susceptible (derecha). .......................................................................... 51

Figura: 16 Avance de la enfermedad para dos cepa de Phytophthora cinnamomi (Ag A-

041 muy patogénica, Ag A-003 poco patogénica y Ag A-000 testigo agar más agua) sobre

XIV

tres accesiones de aguacate: Quiqui-030 muy susceptible, Cepu-008 medianamente

resistente y Natu-001 muy resistente. ............................................................................. 52

Figura: 17 Niveles de resistencia de 6 accesiones de aguacate a la cepa Ag A-041 de

Phytophthora cinnamomi según el ABCPE y respuesta de tratamiento testigo con la cepa

Ag A-000. ........................................................................................................................ 57



Ag A-000. ........................................................................................................................ 58

Contenido XV

Lista de tablas

Pág.

Tabla: 1 Variables seleccionadas para la caracterización morfológica del Banco de

Germoplasma de aguacate y sus respectivas escalas de medición (IPGRI, 1995). ........ 29

Tabla: 2 Resumen de las características cualitativas registradas en 187 accesiones de

aguacate ........................................................................................................................ 40

Tabla: 3 Análisis de correspondencia múltiple para variables cualitativas en 187

accesiones de Persea americana presentes en el banco de germoplasma de Corpoica C.I.

Palmira. .......................................................................................................................... 40

Tabla: 4 Accesiones de aguacate seleccionados para el estudio y su respectiva

procedencia .................................................................................................................... 43

Tabla: 5 Análisis de Varianza del ABCPE de la inoculación de 21 clones de aguacate con

dos aislamientos de Phytophthora cinnamomi. ............................................................... 52

Tabla: 6 Niveles de patogenicidad de 2 cepas de Phytophthora cinnamomi sobre aguacate

y cepa testigo (agar más agua). ..................................................................................... 53

Tabla: 7 Niveles de resistencia de 21 accesiones de aguacate del Banco de Germoplasma

de CORPOICA C.I. Palmira a 2 cepas de Phytophthora cinnamomi. .............................. 56

Contenido XVI

Lista de anexos

Pág.

Anexo: A Ubicación de la procedencia de los genotipos de aguacate y vivero de

injertación y desarrollo de la evaluación. ......................................................................... 65

Anexo: B Distribución de las 21 accesiones de aguacate de acuerdo al diseño

experimental en BCA con arreglo factorial en Parcelas Subdivididas. ............................. 66

Anexo: C Diagrama del proceso de infección con micelio mediante la técnica de herida al

tallo. ................................................................................................................................ 67

Anexo: D Clasificación jerárquica de 187 accesiones de aguacate del Banco de

Germoplasma de CORPOICA C.I. Palmira obtenido a partir de análisis de correspondencia

múltiple (ACM). ............................................................................................................... 68

Anexo: E Registro de Temperatura (cada 30 minutos) durante el periodo de las

evaluaciones. .................................................................................................................. 69

Anexo: F de Humedad relativa (cada 30 minutos) durante el periodo de las evaluaciones.

....................................................................................................................................... 69

Anexo: G Niveles de resistencia de 21 accesiones de aguacate a la cepa Ag A-041 de

Phytophthora cinnamomi según el ABCPE. .................................................................... 70

Anexo: H Niveles de resistencia de 21 accesiones de aguacate a la cepa Ag A-003 de

Phytophthora cinnamomi según el ABCPE. .................................................................... 70

Anexo: I Niveles de resistencia de 21 accesiones de aguacate a la cepa Ag A-000 de

Phytophthora cinnamomi según el ABCPE (cepa testigo agar más agua). ..................... 71

Introducción

El aguacate, Persea americana Mill. Es un cultivo de importancia a nivel mundial, así lo

reflejan las estadísticas para el año 2013 de la FAOSTAT (FAOSTAT 2015), con una

producción global de 4.717.102 Toneladas Métricas. El principal productor es México con

1.467.837 TM (31,11%), seguido por Republica Dominicana con 387.546 TM (8,21%),

Colombia con 303.340 TM (6,43%), Perú con 288.387 TM (6,11%), Indonesia con 276.311

TM (5,85%), Kenia con 191.505 TM (4,05%), Estados Unidos de América con 175.226 TM

(3,71%), Chile con 164.750 TM (3,49%), Brasil con 157.482 TM (3,33%) y Rwanda con

148.823 TM (3,15%). En menor porcentaje otros 42 países con 1.155.895 TM (24,50%).

En Colombia el cultivo de aguacate presenta importancia creciente por las áreas que ocupa

y por el crecimiento anual que estas tienen frente a otros productos agrícolas. Según

AGRONET (2015), durante los últimos años se ha presentado un importante incremento

del área sembrada, llegando al año 2013 a 32.066 ha, según cifras oficiales de la

Secretaria Técnica de la Cadena del Aguacate de Colombia, con una producción de

303.352 toneladas y rendimientos promedios de 9,5 ton/ha con una tasa de crecimiento

promedio anual en los últimos 10 años de 4,2% en producción, 5,4% en área cosechada y

-1,3% en rendimiento, la reducción de este último es en parte debida a las nuevas áreas

sembradas que aún no se encuentran en producción, pero se debe principalmente a

problemas fitosanitarios con énfasis en la marchitez causada por la pudrición radical.

A través del tiempo el aguacate primitivo, P. americana dio lugar a tres tipos diferentes, los

cuales por el aislamiento geográfico entre ellos se convirtieron en tres tipos botánicos

diferentes, a los cuales se les denomina razas: mexicana, guatemalteca y antillana. En la

botánica sistemática se les conoce como variedades botánicas, las cuales se designaron

como: P. americana var. Drymifolia conocida como raza mexicana, P. americana var.

guatemaltensis conocida como raza guatemalteca y P. americana var. americana conocida

como raza antillana (Storey et al., 1986), igualmente esta diferenciación botánica se debe

a las divergencias climáticas de las zonas donde fueron adaptándose a través del tiempo,

2 Introducción

es así como la raza antillana se adapta bien a climas comprendidos entre los 0 y 1.000

m.s.n.m.; la raza guatemalteca se adapta bien a climas comprendidos entre los 1.000 y

2.000 m.s.n.m. y la raza mexicana la cual se adapta bien a climas comprendidos entre los

1.500 y 3.000 m.s.n.m. (Bergh, 1992). La raza Mexicana y la raza Guatemalteca se

caracterizan por tolerar temperaturas muy bajas, incluyendo heladas y estar adaptadas a

suelos muy bien drenados y con nivel freático profundo. La raza antillana se adapta a zonas

tropicales y tierras bajas con climas cálidos y secos; son resistentes a suelos alcalinos y

tolerantes a dos enfermedades, la roya y la antracnosis. En Colombia el aguacate puede

crecer desde el nivel del mar hasta los 2.500 m.s.n.m, en zonas de cordillera. (Bernal et

al., 2008). Las tres razas de aguacate no presentan diferencias fenotípicas suficientemente

amplias como para ser consideradas especies diferentes, pero sí las suficientes para

considerarlas como formas separadas, ya sea como subespecies o variedades botánicas

(Bergh y Ellstrand, 1986; Storey et al., 1986). Según Bergh (1992), las tres razas de

aguacate son genéticamente similares, hipótesis comprobada mediante análisis realizado

con marcadores genéticos del ADN de las tres razas usando la técnica de Amplificación al

Azar de ADN Genómico (RAPD) en 1996 por Bufler y Fiedler apud. López y Barrientos,

(2001). Debido a que las tres razas tienen un genoma similar (2n=24) la hibridación entre

ellas se da con facilidad con la ventaja de que sus híbridos consiguen ventajas de

adaptación climática, así como características agronómicas mejoradas (Bergh, 1992).

La diversidad genética del aguacate ha sido estudiada mediante técnicas moleculares

AFLP (polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados) y caracterizaciones

morfológicas, las cuales han permitido identificar que los agrupamientos obtenidos

mediante ambas técnicas (moleculares y evaluaciones morfológicas) son similares;

además de permitir relacionar las diferencias observadas, las cuales se deben al origen

geográfico (Cañas et al., 2015).

El cultivo del aguacate presenta importantes problemas fitosanitarios dentro de los cuales

se enfatiza el problema de marchitez, el cual está asociado a distintos agentes causales

que afectan las raíces y el sistema vascular de los árboles en etapa temprana y adulta,

provocando la aparición de síntomas de marchitez en la parte aérea de la planta (Ramírez,

2013), siendo considerado Phytophthora el patógeno de mayor incidencia en este

desorden fisiológico (Zentmyer, 1980; Pérez, 2008).

Introducción 3

Son varias las especies de Phytophthora que afectan el aguacate en diferentes regiones

del mundo entre ellas están: P. citricola, P. cactorum, P. parasitica, P. cinnamomi, P.

palmivora y P. heveae. Algunas causan chancros o pudriciones del tallo, sin embargo, en

Colombia, sólo la especie P. cinnamomi ha sido claramente establecida en las zonas

productoras de aguacate, como Antioquia, Caldas, Cesar, Bolívar, Cundinamarca,

Quindío, Risaralda, Tolima y Valle del Cauca. Provocando pérdidas que oscilan entre 30 y

50% de los árboles en la etapa de vivero y durante los dos primeros años de

establecimiento del cultivo (Tamayo, 2007). Phytophthora cinnamomi Rands es un

oomiceto perteneciente a la familia Pythiaceae, que afecta plantas de cualquier edad,

causando marchitez de raíces y cáncer en el tallo, retraso del crecimiento, perdida de vigor,

color, brillo y amarillamiento de las hojas con marchitez generalizada (Andrade-Hoyos,

2012; Tamayo, 2007).

Rands reporto por primera vez el patógeno en 1922 afectando un árbol de canela

Cinnamomum burmannii Blume en Sumatra. Desde entonces, P. cinnamomi ha sido

identificado ampliamente en más de 75 países en todo el mundo (Pérez, 2008). En general

P. cinnamomi se distribuye globalmente con presencia principalmente en zonas cálidas,

tropicales y subtropicales del mundo, es un patógeno que se encuentra naturalmente en

el suelo y puede infectar cerca de 3.000 especies de plantas, causando problemas en

agricultura y forestales (Hardham, 2005). P. cinnamomi es el agente causal de la

enfermedad conocida como pudrición radical por Phytophthora en aguacate y es la

enfermedad más importante de Persea americana a nivel mundial (Zentmyer, 1980;

Pagliaccia et al., 2013; Coffey, 1987).

Esta enfermedad actualmente ha eliminado áreas comerciales en América Latina y es el

mayor limitante de la producción de aguacate en Australia, Sur África y California (Ploetz

et al., 2002), también ha diezmado importantes repositorios de germoplasma de aguacate

como los registrados por USDA-ARS en Isabella, Puerto Rico y en Pan American School

of Agriculture en Zamorano, Honduras (Violi et al., 2006).

Existen limitadas medidas de control efectivas para mitigar la pudrición radical del aguacate

causada por P. cinnamomi, estrategias integradas suelen ser necesarias para controlar la

enfermedad (Coffey, 1987), entre estas la prevención, el control químico, biológico y el uso

de portainjertos resistentes al patógeno (Tamayo, 2007), siendo la producción de patrones

4 Introducción

tolerantes uno de los componentes más promisorios del manejo de la enfermedad (Menge,

2011; Violi et al., 2006). Las medidas más eficaces de control se obtienen con la aplicación

de sustancias químicas como metalaxyl y mefanoxam (Ridomil y Ridomil Gold,

respectivamente), fosetil de aluminio (Aliette) y varios fosforados que reducen la

enfermedad por periodos cortos (meses) pero no eliminan a P. cinnamomi. Su continua

aplicación por largos periodos de forma repetitiva puede generar la selección de resistencia

en poblaciones del patógeno (Cohen y Coffey, 1986). P. americana Mill. y P. cinnamomi

tienen sitios de origen en diferentes áreas del mundo (no coevolucionaron) por lo cual no

ha ocurrido selección evolutiva por resistencia a pudrición radical en el cultivo de aguacate.

Dependiendo del cultivar, las plantas tardan entre cinco y 15 años en madurar. Solo el 1%

de las flores que son producidas llegan a formar el fruto, y estos pueden ser el resultado

de cruzamiento o de autopolinización (Davenport et al., 1994). Portainjertos tolerantes a

pudrición radical se han producido en California. Este éxito fue resultado de décadas de

recolección de germoplasma y selección de los Doctores George Zentmyer y Jhon Menge

de la Universidad Riverside de California, infortunadamente, estos patrones son poco

adecuados para climas tropicales (Violi et al., 2006), portainjertos resistentes al patógeno

como las variedades Duke 6, Duke 7, G6, D9, Toro Canyon, Thomas y Martin Grande

(G755) (Cortés et al., 2010) no se utilizan comercialmente en Colombia (Tamayo, 2007), a

excepción del Duke 7 clonado por el vivero Profrutales Ltda (Profrutales, 2013). Árboles

injertados en patrones resistentes muestran un buen desempeño y productividad aún en

suelos con presencia del patógeno. Esta alternativa aún no se ha explorado en Colombia

debido a la falta de clones resistentes y/o a métodos para propagarlos adecuadamente

(Jaramillo et al., 2009).

Gracias a la diversidad existente dentro de la especie P. americana, los programas de

mejoramiento genético se han enfocado en obtener materiales de aguacate para uso como

portainjertos al pseudohongo P. cinnamomi (Bellon et al., 2009), sin alcanzar el pleno éxito,

por lo cual debe ser una prioridad para el manejo de este patógeno (Andrade-Hoyos, 2012).

En México instituciones como el Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas y

Pecuarias (INIFAP) y la fundación Salvador Sánchez vienen seleccionando portainjertos

tolerantes a P. cinnamomi, para lo cual han usado germoplasma de las tres razas de

aguacate de diferentes regiones del país. En el caso de la Universidad Autónoma de

Introducción 5

Chapingo están seleccionando portainjertos resistentes a P. cinnamomi y la base genética

utilizada para tal fin es la raza mexicana (Bellon et al., 2009).

En Colombia la identificación de materiales promisorios de aguacate por resistencia a este

patógeno inició en 2009, en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) con la

evaluación de 42 accesiones de aguacate (común o criollo) infectados con dos cepas

altamente patogénicas mediante la técnica de inoculación de micelio con herida al tallo,

identificando cinco accesiones con potencial de resistencia a esta enfermedad (Jaramillo

et al., 2009).

1. Planteamiento del problema

Mediante mandato del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia se puso en

funcionamiento el portal de internet denominado SIEMBRA (SIEMBRA, 2014), en el cual

se puede consultar las demandas y ofertas para las diferentes cadenas productivas

registradas ante el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural.

El sector productor de aguacate en Colombia, con el fin de aprovechar el potencial

creciente de este frutal e implementar la política de competitividad, creó la cadena

productiva del aguacate (Parra-Peña et al., 2012), la cual en 2008 estableció el Consejo

Nacional de Aguacate como órgano consultivo del Gobierno Nacional, mediante el cual se

crearon mesas de trabajo para obrar en torno a la competitividad del sector (SIEMBRA,

2014). Es así como se creó un consolidado de las diferentes demandas que la cadena de

aguacate priorizó para el quinquenio 2013 al 2017, las cuales se pueden visitar en la

plataforma virtual SIEMBRA a través del portal virtual de CORPOICA. Entre las demandas

actuales se encuentran las siguientes relacionadas con el presente trabajo de investigación

como aporte a la demanda de este sector:

Oferta de materiales de siembra con calidad genética, fisiológica y sanitaria

garantizada. Para lo cual las regiones productoras solicitan el establecimiento de

viveros prototipos como despensa de material limpio y de calidad.

Definir programas de manejo de plagas y enfermedades.

Dentro de esta última demanda el sector productor de aguacate expresa la necesidad de

desarrollar programas para el manejo de plagas cuarentenarias (perforadores de fruta,

trips, pasadores de tallos y ramas) y para las de mayor importancia económica (cucarrón

marceño, mosca del ovario y escama B. colombianus). Para las enfermedades de la raíz

(Phytophthora, Armillaria, Verticillium, Fusarium, Rosellinia y Ceratocystis) y del fruto

(antracnosis, pudrición de pedúnculo, roña y cercospora) en pre y poscosecha.

8 Planteamiento del problema

Debido a que el mejor método de control de la pudrición de raíces causada por P.

cinnamomi, identificada como la principal enfermedad del aguacate, es la búsqueda de

portainjertos resistentes al patógeno (Menge, 2011; Violi et al., 2006), surgió la propuesta

de evaluar el germoplasma de aguacate por resistencia a P. cinnamomi presente en el

Centro de Investigación Palmira de CORPOICA, para lo cual se hace necesario también

realizar la caracterización morfológica del germoplasma y seleccionar individuos con

características morfológicas contrastantes para iniciar el proceso de selección del material

vegetal a evaluar, enfatizando en accesiones de diferente origen geográfico según

resultados obtenidos por Cañas et al. (2015).

2. Objetivos

2.1 Objetivo general

Identificar accesiones de aguacate criollo del Centro de Investigación Palmira de

CORPOICA con posible resistencia a Phytophthora cinnamomi Rands mediante la técnica

de inoculación de herida al tallo.

2.2 Objetivos específicos

Caracterizar morfológicamente el banco de germoplasma de aguacate criollo Persea

americana Mill. de CORPOICA C.I. Palmira.

Seleccionar materiales de aguacate criollos según agrupamiento de similitud genética para

evaluación de resistencia a P. cinnamomi, con base en la caracterización morfológica.

Evaluar la resistencia a P. cinnamomi Rands en 21 accesiones de Aguacate Persea

americana Mill. utilizando métodos indirectos mediante la técnica de herida al tallo.

Identificar materiales criollos de aguacate promisorios por resistencia a P. cinnamomi para

ser incluidos en la selección de portainjertos resistentes a la pudrición radical ocasionada

por Phytophthora cinnamomi Rands.

3. Marco teórico y estado del arte

3.1 Taxonomía del aguacate

Reino: Vegetal

División: Spermatophyta

Subdivisión: Angiospermae

Clase: Dicotyledoneae

Subclase: Dipétala

Orden: Ranales

Familia: Lauraceae

Género: Persea

Especie: Persea americana Miller.

El aguacate pertenece a la familia de las Lauráceas, la cual está formada por 52 géneros

y cerca de 3.500 especies; esta es una de las familias más primitivas de las dicotiledóneas

(Garbanzo, 2010; Sánchez, 1999).

3.1.1 Sinonimia

Persea gratissima Gaerth.

Persea caerulea Mez, aguacate cimarrón, aguacate morado, aguacatillo.

Persea drymifolia Blake, aguacate de anís.

Persea nubigena.

Se conocen otras especies de Persea como aguacatillos en diversas regiones, algunas de

las cuales pueden ser usados como patrones para el aguacate, por su resistencia a

enfermedades y a otros factores adversos; entre ellas están: Persea cinerascens, Persea

longipes, Persea chamissonis, Persea flocossa, Persea schiedeana (Bernal et al., 2008).

12 Caracterización morfológica y evaluación de la resistencia de materiales criollos de aguacate Persea americana Mill. A la pudrición radical del aguacate Phytophthora cinnamomi Rands en el centro de investigación Palmira de CORPOICA.

3.2 Centro de origen del aguacate

El centro de origen del aguacate es América. Su nombre etimológico deriva del náhuatl

Ahuaca Cuahuitl: ahuacatl (testículo) y cuahuitl (árbol) “árbol de testículos”; Su nombre en

inglés, avocado, deriva de la palabra en español abogado, una adaptación de la palabra

azteca ahuacatl, que se convirtió en avocat en francés y advokaat en holandés. El nombre

Inca de Palta aún se utiliza en Perú, Ecuador y Chile (Bernal et al., 2008). Se considera

que la especie que dio origen al aguacate proviene de la zona montañosa del occidente

de México y Guatemala. Se distribuye naturalmente desde México hasta Perú, pasando

por Centro América, Colombia, Venezuela y Ecuador. Se dice que varios cientos de años

antes que los conquistadores europeos llegaran a México ya este frutal había sido

domesticado según registro de fósiles encontrados que datan de hace más de 8.000 años.

De acuerdo a pruebas arqueológicas encontradas en Puebla, México de hace 12.000 años

se determinó que esta región es el centro de origen del aguacate (Bernal et al., 2008;

Sánchez, 1999).

El aguacate se dispersó desde México hasta Perú en el periodo precolombino y fue

domesticado por los Aztecas, en Sur América solo se conocía en la región oriental de la

Sierra Nevada de Santa Marta hasta el Norte de Chile. Ya en el periodo colonial fue llevado

a las Antillas, Brasil y al Sur de Europa entre los siglos XVI y XVII; a Hawái, La Florida y

California. Fue introducida en el siglo XIX en Suráfrica, Argentina e Israel, se iniciaron

cultivos comerciales en la primera mitad del siglo XX (Bernal et al., 2008).

3.3 Importancia económica del aguacate

El aguacate es la quinta fruta tropical más importante en el mundo, por volumen y área

cultivada (Yabrudy, 2012). Se produce en casi todos los países de clima cálido y templado,

aunque sus mayores cultivos se encuentran en países latinoamericanos, dentro de los que

se destaca México como principal productor a nivel mundial, República Dominicana,

Colombia, Perú, Chile, y Brasil, según cifras estadísticas de la FAO del 2015. La superficie

mundial sembrada con aguacate se estima en 516.485 ha (FAOSTAT, 2015) que se

distribuyen en más de 50 países, el 90% del área sembrada con aguacate se encuentra

en América y el 10% restante en los demás continentes (Alcántar, 2008). Se cultiva en

Marco teórico y estado del arte 13

Nueva Zelanda, Australia, Filipinas, Costa de Marfil, Kenia, Suráfrica, Marruecos, Israel,

Italia y España (las Islas Canarias y en el territorio continental), Estados Unidos (California

y La Florida), entre otros. A nivel mundial, los países que reportan mayores niveles de

importación de este frutal en orden de cantidad son: Inglaterra, Francia, Alemania, Italia,

Bélgica, Países Bajos, Dinamarca, Suecia, Japón y Noruega (Bernal et al., 2008). El

consumo mundial de aguacate entre 2001 y 2011, pasó de 482 a 675 gramos por

habitante/año, lo que significó un crecimiento del 39,9%, convirtiéndolo en uno de los

mercados del sector de alimentos con mayor dinámica (Yabrudy, 2012).

Actualmente Colombia se ubica como el tercer país productor de aguacate a nivel mundial,

donde se cultiva desde el nivel el mar hasta los 2.500 .m.s.n.m., en el cual se produce en

los departamentos de: Antioquia, Bolívar, Caldas, Cesar, Cundinamarca, La Guajira, Meta,

Quindío, Risaralda, Santander, Sucre, Tolima, Valle del Cauca entre otros, con un área de

32.066 hectáreas, siendo los de mayor producción: Tolima, Antioquia, Bolívar, Caldas y

Santander (AGRONET, 2015). La diversidad en pisos térmicos presentes en el territorio

colombiano, condicionada por la franja altitudinal con que se cuenta, permite una amplia

adaptación de las tres variedades botánicas o razas, la raza antillana es usada

principalmente como portainjerto para las razas mexicana, guatemalteca e híbridos de

mexicanas por guatemaltecas e híbridos de guatemaltecas por antillanas, siendo estas

últimas las variedades comerciales de mayor siembra en Colombia (Bernal et al., 2008).

El consumo del fruto de aguacate ha aumentado a nivel mundial especialmente en Estados

Unidos, Francia, Alemania y España, lo cual ha incidido en el incremento de las áreas

cultivadas y por ende la producción. Su alta demanda se debe a las cualidades de sabor,

nutritivas y amplios usos que se le puede dar a esta fruta como las culinarias, industriales,

farmacéuticas y cosméticas. A pesar del gran potencial que tiene el aguacate como

producto exportable en Colombia, el país no ha podido consolidarse como un exportador

neto, debido a la alta demanda interna que obliga a la importación en ciertas temporadas

del año, especialmente desde Ecuador y Venezuela, también se debe a la falta de prácticas

agrícolas apropiadas que dificultan el acceso a los mercados internacionales, en especial

de Estados Unidos y los países de la Unión Europea, que son los mayores demandantes

en el mercado mundial (Yabrudy, 2012).


El aguacate colombiano cada vez gana más terreno en los consumidores de la Unión

Europea y Estados Unidos, siendo el cultivar Hass de origen mexicano 10% y

guatemalteco 90% (Bernal et al., 2009), una de las frutas reconocida por expertos como

una de las más exóticas, nutritivas y de buen sabor que se producen en Colombia, lo cual

hace de este frutal un exquisito manjar para los europeos y los norteamericanos quienes

son los mayores consumidores de aguacate en el mundo y por lo tanto es el cultivar que

más se exporta por su alto contenido vitamínico ya que posee 11 de las 13 vitaminas

conocidas, 8 minerales y factores Omega 3 y 6 (Anacafé, 2004).

El cultivo del aguacate es una excelente opción de empleo porque se utiliza mucha mano

de obra y da una rentabilidad excelente que se estabiliza en el sexto año de producción y

puede continuar produciendo hasta por 30 años si se da un buen manejo agronómico

(Guarín, 2011). De acuerdo con Rodríguez et al. (2009) en el año 2008 se generaron

54.925 empleos directos e indirectos, con una tasa interna de retorno (TIR) del 36% con

un área familiar mínima rentable de 1,26 ha, un producto interno bruto (PIB) de 93.355

millones de pesos anuales que produjeron un flujo de caja permanente y beneficio a 26.048

productores que tienen 7.077 m2 cada uno.

3.4 Caracterización morfológica

La totalidad de las variantes que presenta una misma especie se conoce como variabilidad

genética, la cual puede expresarse fenotípicamente (visiblemente) y características

genotípicas (no visibles) (Franco e Hidalgo, 2003), variabilidad genética originada por la

continua interacción dinámica de adaptación con los factores bióticos y abióticos en los

que crece cada individuo. Esta interacción adaptativa genera diversidad en la información

genética de los individuos de una determinada población o especie, la cual se va

trasmitiendo a las generaciones futuras a través del tiempo (Hernandez Villarreal, 2013).

Los descriptores de caracterización permiten una discriminación fácil y rápida entre

fenotipos. Generalmente son caracteres altamente heredables, que pueden ser fácilmente

detectados a simple vista y se expresan igualmente en todos los ambientes. Además,

pueden incluir un número limitado de caracteres adicionales que son deseables según el

consenso de los usuarios de un cultivo en particular (IPGRI, 1995). Permiten identificar la


variabilidad genética de una población y determinar los mejores descriptores

(discriminantes) para evaluar las plantas (Hernandez Villarreal, 2013).

3.5 Importancia económica de Phytophthora cinnamomi

Phytophthora cinnamomi Rands está distribuido globalmente y puede infectar cerca de

3.000 especies vegetales, causando un grave problema en la agricultura (Hardham, 2005),

este oomiceto es el agente causal de la enfermedad conocida como pudrición radical de

raíces en el cultivo del aguacate Persea americana Mill. y es la enfermedad más grave de

este cultivo a nivel mundial (Zenmyer, 1980) se considera el principal factor limitante en la

producción de países como: Australia, México, Sudáfrica y los Estados Unidos, además de

otros setenta países (Sánchez, 2001). Esta enfermedad ha causado la muerte de muchas

explotaciones comerciales en zonas de América Latina y es el mayor limitante de la

producción de aguacate en Australia, Sur África y California (Ploetz et al., 2002). En

California la pudrición radical por Phytophthora ha generado pérdidas del 60 a 75% de los

cultivos de aguacate, un estimado en pérdidas de 40 millones de dólares anuales (Coffey,

1987; Gabor et al., 1990) y 44 millones en 1989 (REDFRUT, 2000). Las mayores pérdidas

en plantaciones de aguacate se presentan en zonas con suelos mal drenados y con

problemas de inundaciones prolongadas (Ploetz y Schaffer, 1989). En California ha

afectado un estimado de 2.428 ha (Zentmyer y Ohr, 1981 apud, Kurtz, 1988). Vidales y

Alcantar (1999) reportan 1.300 ha afectadas en California y daños del 20% en los árboles

de aguacate de Sudáfrica.

En México en el estado de Puebla se han observado incidencias del 75% de los árboles.

En Querétaro ocasionó la desaparición del cultivo. En Michoacan en 1979 se encontraron

trece mil árboles afectados, 13 años después en 1994 se encontraron cien mil árboles

afectados, posteriormente en 1999 la severidad subió a 550 mil árboles afectados,

causando una pérdida de 640 millones de pesos mexicanos (40 millones de dólares

americanos) evidenciando un creciente incremento de la enfermedad (Vidales y Alcantar,

1999).

La pudrición radical por Phytophthora también ha diezmado de manera significativa

importantes repositorios de germoplasma en la región, tales como los de la USDA-ARS


estación de Isabella, Puerto Rico, y en la escuela Panamericana de Agricultura en

Zamorano, Honduras (Violi et al., 2006).

En Colombia, la especie P. cinnamomi ha sido claramente identificada como la causante

de pudrición de raíces del aguacate en las zonas productoras de este frutal, causando

pérdidas que oscilan entre un 30 y un 50% de los árboles en la etapa de vivero y durante

los dos primeros años de establecimiento del cultivo (Tamayo, 2007).

3.6 Taxonomía de Phytophthora cinnamomi Rands

Según el Departamento de Conservación y Manejo de la Tierra de Australia (2003), P.

cinnamomi y otros miembros del grupo del genero Phytophthora no son parte del reino de

los hongos, pertenecen a los mohos acuáticos u Oomycota (Clase Oomycetes), ubicados

en el reino Chromista o Stramenopila. P. cinnamomi tiene un parecido superficial con los

hongos, pero son diferentes en sus paredes celulares, las cuales están formadas por

celulosa en vez de quitina como los hongos. Este patógeno consume la planta huésped

causando áreas con apariencia de podredumbre, esto debilita la planta al reducir el

movimiento de agua y nutrientes dentro de la planta. Una vez atacados huéspedes

susceptibles raramente logran recuperarse.

El reino Stramenopila está formado por los Phylum: Oomycota, Hyphochytridiomicota y

Labyrinthulomycota. Constituye un grupo muy variable, el cual incluye microorganismos

que no forman zoosporas como algas de color café. Según la última reclasificación

taxonómica P. cinnamomi quedo ubicada de la siguiente manera (Hardham, 2005,

Alexopoulos et al., 1996).

Dominio: Eukaryota

Reino: Stramenopila

Phyllum: Oomycota

Clase: Oomycetes

Orden: Pythiales

Familia: Pythiacea

Género: Phytophthora


3.7 Características morfológicas de Phytophtora cinnamomi

El micelio de P. cinnamomi es cenocítico (sin septos) con hifas moderadamente

ramificadas y con hinchamientos vesiculares, el diámetro de las hifas varia de 8 a 25

micras. El aspecto de la colonia en medio de cultivo es tipo roseta o camelia debido al

crecimiento deprimido y algodonoso del micelio que tiene lugar a intervalos irregulares. Los

esporangioforos son simples y sobre ellos se forman esporangios ovales u oval alargados,

grandes con medidas de 23 y 63 micras de largo por 15 a 30 micras de ancho sin papila.

Forma abundantes clamidosporas esféricas, terminales e intercalares. Las esporas son

heterotálicas (Coria, 2009).

La principal característica que existe para diferenciar P. cinnamomi de otras especies de

Phytophthora es el hinchamiento que presentan las hifas, las cuales adquieren un aspecto

coraliforme y son formadas más profusamente que en la mayoría de las otras especies

(Erwin y Ribeiro, 1996 apud, Acosta, 2008).

P. cinnamomi es un oomiceto heterotálico con dos tipos de apareamiento, A1 y A2 donde

cada tipo corresponde a una cepa de apareamiento, la cual produce células sexuales

masculinas o femeninas (Oogonio o anteridio) (Ko, 1978), el tipo de apareamiento

predominante a nivel mundial es el tipo A2 (Ribeiro et al., 1975), lo cual indica que hay una

limitada reproducción sexual dentro de esta especie (Pagliaccia et al., 2013), pero algunos

aislados de aguacate han demostrado que bajo ciertas condiciones (especialmente en

ambientes de laboratorio) puede ser homotálico (la misma cepa produce oogonios y

anteridios) y producir diversidad genética dentro de la especie (Zentmyer, 1952 apud,

Pagliaccia et al., 2013).

El estado sexual de P. cinnamomi se forma cuando los tipos de compatibilidad A1 y A2 se

presentan, los cuales se aparean para generar diversidad genética dentro de la especie,

donde cada tipo corresponde a una cepa diferente, cada cepa de apareamiento presenta

una condición de producción de células sexuales diferentes a la otra, así la cepa con

anteridios se une a la cepa con oogonios y se forma la oosfera. Los oogonios miden en

promedio 40 μm de diámetro, con anteridios anfígenos (18 μm de ancho a 20 μm de largo),


algunos anteridios pueden ser bicelulares, y muchas de las oosporas son pleróticas (llena

la cavidad del oogonio) de 35 μm (Andrade-Hoyos, 2012).

P. cinnamomi se distingue por su micelio tipo coraloide con abundantes hifas hinchadas.

Vesículas hinchadas sésiles terminales o laterales, protuberancias producidas en forma

simple o en racimo. P. cinnamomi forma tres tipos de esporas diferentes, los esporangios

y clamidosporas que dan origen a la reproducción vegetativa o asexual sin variación

genética las oosporas dan origen a la reproducción sexual. Los esporangios germinan

directamente a través de tubos germinales o indirectamente produciendo zoosporas

móviles biflageladas, generalmente son elipsoides u ovoides, sin papilas y persistentes,

redondeadas en la base y terminales

3.8 Ciclo biológico de Phytophthora cinnamomi

P. cinnamomi tiene reproducción sexual y asexual, en la Figura 1 (Lemus, 2009) se

observan los procesos que presenta este oomiceto en su ciclo biológico de infección, tiene

la capacidad de sobrevivir por mucho tiempo, incluso años sobre el tejido de las raíces en

la rizosfera del cultivo en forma de clamidosporas, aun en ausencia de plantas que

hospeden la enfermedad. Cuando las condiciones son óptimas para la infección, las

clamidosporas reinfectan la planta. Estas condiciones se presentan con excesiva humedad

en el suelo por efecto de abundantes lluvias o suelos con mal drenaje y temperaturas

ideales para la manifestación de la enfermedad, las cuales se encuentran en un rango de

24 a 28°C, ya que se presenta mayor producción de esporangios y mejores condiciones

para la liberación y movimiento de las zoosporas hacia las raíces de las plantas. Las

clamidosporas germinan y dan origen al micelio el cual reinicia el ciclo de la infección. El

micelio pude formar clamidosporas como estructuras de resistencia y también esporangios

donde se encuentran las zoosporas biflageladas que dan inicio a la infección (Andrade-

Hoyos, 2012). Este patógeno puede afectar plantas de aguacate sin importar la variedad

ni estado de desarrollo de las plantas (Ramírez, 2013).


Figura: 1 Ciclo de infección de Phytophthora cinnamomi Rands. Tomado de Lemus, 2009)

Las

zoosporas alcanzan y se adhieren a la raíz del hospedero en las cuales se enquistan y

germinan sobre ellas. Al enquistarse las zoosporas pierden los flagelos. Pasados 20 a 30

minutos del enquistamiento los tubos germinativos inician su crecimiento durante una hora

aproximadamente e inician la penetración de las células radicales. La penetración ocurre

dentro de las 24 horas después de la infección y pasadas seis horas de la penetración el

tejido de la raíz alimentadora muere y sobre este tejido necrótico el oomiceto crece por

algunos días (Ramírez, 2013). Las zoosporas son atraídas por los exudados de las raíces,

los cuales están constituidos por los aminoácidos asparagina y glutamina (Pegg et al.,

2002).

Las temperaturas óptimas para la infección de P. cinnamomi fluctúan entre 21 y 30°C,

mientras que hay poca o nula infección a temperaturas mayores de 33°C, o entre 9 y 12°C,

estas temperaturas coinciden con la curva de crecimiento del patogeno. La respuesta de

crecimiento de plántulas de aguacate a temperaturas de suelo, es casi similar a aquellas

del desarrollo y crecimiento de la enfermedad, con la excepción de los cultivares de

aguacate que crecen bien a 33°C. La humedad es un factor ambiental primario que influye


en el desarrollo de la pudrición de raíces causada por P. cinnamomi, en cuanto a:

crecimiento, esporulación y proceso de infección resultante. La alta humedad (mayor a

90%) aumenta la infección, principalmente, debido al incremento de la formación de

esporangios y las condiciones apropiadas para la liberación de zoosporas, movilidad y

movimiento al sitio de infección (Zentmyer, Menge y Ohr, 1994 apud, Rojas, 2004)

3.9 Sintomatología

El daño causado por P. cinnamomi en el aguacate se inicia en las raíces absorbentes de

la planta, las cuales se necrosan y mueren por la colonización del patógeno. Normalmente

en árboles con un estado avanzado de la enfermedad las raíces absorbentes desaparecen

por la degradación causada por el patógeno, por lo cual en estos árboles se incrementa la

cantidad de agua en el suelo por la incapacidad de absorberla. Debido a la relación

negativa que se presenta entre el agua transpirada y la absorbida por las raíces, la planta

manifiesta síntomas de marchitamiento en las hojas, razón por la cual en algunos sitios del

mundo se le denomina a esta enfermedad tristeza del aguacatero. El escaso contenido de

agua en la planta hace que esta no logre formar la suficiente clorofila, lo que confiere el

color verde a las hojas, y por ende la planta empieza a tornarse de color amarillo o clorótico

(Pegg et al., 2007). Cuando la enfermedad es muy severa, el patógeno se disemina a la

base del tronco de la planta, causando una podredumbre en forma de manchas oscuras

con exudaciones azucaradas y apariencia blanquecina (Mora et al., 2007 apud, Lemus,

2009).

Los síntomas incluyen la muerte progresiva de las ramas de los árboles en diferentes

etapas de desarrollo, marchitez y amarillamiento de las hojas hasta llegar a una defoliación

completa. Las hojas muertas quedan adheridas durante algunos días al tronco del árbol.

Los síntomas presentados en las ramas y hojas son evidencia de que las raíces

alimentadoras fueron atacadas y destruidas por P. cinnamomi, frecuentemente los árboles

afectados producen cosechas incipientes con frutos de baja calidad y tamaño (Faber y

Marais, 2010).


3.10 Portainjertos de aguacate resistentes a Phytophthora cinnamomi

Una de las opciones más viables para el control del problema de pudrición radical causada

por P. cinnamomi es el uso de portainjerto resistentes a este patógeno (Coffey, 1987;

Ploetz et al., 2002; Gallo-Llobet et al., 1999). Con el objetivo de encontrar estos materiales

en la década de 1950 se inició el programa de búsqueda de portainjertos en California,

Estados Unidos por parte del Dr. George Zentmyer de la Universidad de Riverside de

California, tras el descubrimiento de P. cinnamomi como causante de este desorden

fisiológico en la década de 1940. Durante la búsqueda el Dr. Zentmyer encontró resistencia

moderada en el cultivar mexicano Duke en 1951 mediante el uso de estacas sobre suelo

infestado (Zentmyer, 1963), el cual fue introducido como semilla a California, Estados

Unidos, en 1912 (Andrade-Hoyos, 2012). Hasta el momento se han logrado identificar

diferentes materiales de P. americana con resistencia parcial a P. cinnamomi como

Thomas, Martin grande (llamado también G755), Barr Duke, Duke 7 y D9 (Gabor et al.,

1990), G6 (Zentmyer, 1987), recientemente tres selecciones de Martin grande (G755 a, b

y c) de la raza guatemalteca (Coffey, 1987). Durante muchos años el material Duke 7 ha

sido usado como portainjerto para la producción de aguacate en muchos países del

mundo, en Sudáfrica se utilizó desde 1970 hasta 2002 cuando se lanzó el portainjerto Dusa

por parte de Westfalia Servicios Tecnológicos, el cual brindo a los productores de aguacate

mayor resistencia a P. cinnamomi pero también mejores rendimientos de fruta (Mahomed

y Van den Berg, 2011). En evaluación reportada por Smith et al. (2011) se encontraron los

materiales SHSR-02 y SHSR-04 con alta resistencia a P. cinnamomi, mayor a la de Duke

7, de origen Guatemalteco y Mexicano. Los genotipos Duke 6, Duke 7 y G6 presentan

resistencia intermedia a P. cinnamomi, mientras que los cultivares D9, Thomas, Martin

grande y Toro Canyon presentan alta resistencia (Cortéz et al., 2010).

Otros materiales obtenidos por selección y mejoramiento por resistencia a P. cinnamomi

han sido P1, Toro Canyon, G61, P, P3, P6, G 1008, Duke S, Duke Grace, G22 y Parida

(Téliz et al., 2007 apud, Andrade-Hoyos, 2012).

Douhan (2011) de la Universidad de California Riverside reporta nuevos materiales

seleccionados por resistencia probada en invernadero para hacer posteriores evaluaciones


en campo, las cuales incluyen los materiales codificados PP29, PP36, PP40, PP52, PP57,

PP80, PP81, VC7, VC66, VC256 y VC801.

En la última década en Colombia se inició la clonación de Duke 7 como portainjerto

ofertado para el país como material con fuente de resistencia genética a la enfermedad de

la pudrición radical en el vivero Profrutales Ltda (Profrutales, 2013).

3.11 Métodos de evaluación de la resistencia a Phytophthora cinnamomi en Persea americana

En la búsqueda de resistencia a P. cinnamomi en el cultivo de aguacate se han probado

diferentes métodos de evaluación directos e indirectos, probados con los cultivares más

conocidos dentro del germoplasma que presenta resistencia a este oomyceto. Los

métodos empleados para determinar la resistencia de portainjertos de P. americana a P.

cinnamomi se han venido desarrollando desde la década de 1950 con las investigaciones

del Dr. Zentmyer y su grupo de trabajo en la Universidad de California Riverside, con

materiales colectadas en diferentes países de América Latina, entre estos Argentina,

Brasil, Chile, Colombia, Costa Rica, Cuba, Ecuador, El Salvador, Guatemala, Haití,

Honduras, Jamaica, México, Perú, Puerto Rico, St. Croix (Islas Vírgenes), Trinidad y

Venezuela (Zentmyer y Schieber, 1987, 1992).

La resistencia de diferentes colecciones de germoplasma de aguacate a P. cinnamomi ha

sido determinada mediante el uso de diferentes métodos entre los cuales se encuentran el

uso de soluciones nutritivas con material de infección, igualmente en macetas, camas

germinadoras con suelo infestado del patógeno, callos de tejido inoculado y en

plantaciones infestadas en campo (Salgado y Fucikovsky, 1996).

Una de las evaluaciones indirectas realizadas se conoce como el método de la raíz

individual descrito por Dolan y Coffey en 1986, replicado por Zilberstein y Pinkas en 1987

y modificado por Botha et al. en 1989, el cual consiste en inocular trozos de raíz en

laboratorio, sumergidas en suspensión de micelio del patógeno durante tres días y

posterior medición del avance de la enfermedad (Van der Merwe et al., 1992). Otro método

indirecto fue evaluado por los Drs. Dollan y Coffey (1986) mediante la inoculación en tallo


de cuatro portainjertos con zoosporas a nivel de laboratorio, en explantes de tallos de 15

cm de longitud provenientes de clonación mediante la técnica de etiolación como

procedimiento recomendado para una evaluación rápida y sencilla de gran cantidad de

materiales de aguacate.

Otro método usado para la evaluación de la resistencia de diferentes materiales de

aguacate a P. cinnamomi fue descrito por Zentmyer y Mircetich (1965) mediante el cual se

evalúan muchas plantas sumergiendo el sistema radical en una solución nutritiva inoculada

con el patógeno (Salgado y Fucikovsky, 1996).

Otro método de evaluación fue trabajado por Zilberstein y Pinkas (1987) en el cual se

determinó el nivel de resistencia en arboles de aguacate mediante la medición de la

perdida de electrolitos de las raíces, método rápido y no destructivo de las plantas.

La inoculación del patógeno sobre hojas y raíces también ha sido usada para la detección

de la resistencia de P. americana al oomyceto, tal como lo demuestra el trabajo realizado

por Botha et al. (1989), en el cual posterior a la inoculación de zoosporas en raíces y hojas

jóvenes separadas de la planta madre midieron el desarrollo de la lesión, encontrando

similar respuesta en las partes evaluadas de la planta. Esta técnica se presenta como

prometedora según los autores del trabajo ya que es fácil y rápida para el cribado de

árboles en campo no injertados así como para la evaluación de plantas de semilleros de

multiplicación vegetativa, sin realizar intervención de raíces.

El método de la raíz individual de Dolan y Coffey (1986) fue modificado usando esquejes

de diferentes materiales de aguacate enraizados con la técnica de etiolación de Frolich y

Platt (1971) inoculando micelio de P. cinnamomi por Van der Merwe et al. (1992), Van der

Merwe (1992b) en el cual se logró verificar que el uso de micelio como inoculo del patógeno

es muy eficiente para la detección de portainjertos con resistencia a la enfermedad de la

pudrición radical por Phytophthora, tanto como la realizada con zoosporas.

Ruiz-Rosado et al. (1992) evaluaron la respuesta de los materiales Duke 7 y Semil 34 a P.

cinnamomi midiendo el crecimiento de micelio sobre callos de cada material, presentando

Semill 34 una colonización completa por parte del micelio y efectos inhibitorios de

crecimiento en el material Duke 7,corroborando su resistencia al patógeno. López et al.


(2007) evaluaron la resistencia a P. cinnamomi en germoplasma de aguacate inoculando

micelio en plantas in vitro como método efectivo para generar la infección y para determinar

niveles de resistencia al patógeno.

Inoculación directamente en tallos jóvenes de aguacate fue realizada por Dolan y Coffey

(1986) usando fragmentos de tallos etiolados, a nivel de laboratorio en cajas Petri con

zoosporas como fuente de inoculo. Los resultados presentados muestran el potencial de

la técnica para evaluar la resistencia a la pudrición radical en germoplasma de aguacate

en futuras selecciones de portanjertos.

Gabor y Coffey (1991) realizaron la comparación de diferentes métodos de inoculación

para la determinación rápida de resistencia a P. cinnamomi en portainjertos de aguacate,

en la cual se encontró que la inoculación en brotes etiolados a nivel de laboratorio en cajas

Petri y la inoculación en sistema radicular intacto es similar para portainjertos de Persea

schiedeana y portainjertos híbridos de P. schiedeana con Persea americana como es el

caso de Martin Grande, UCR 2022 y UCR 2023. Según los autores del trabajo, la

inoculación indirecta (inoculación de tejido diferente a la raíz) puede proporcionar un

método de detección conveniente y rápido para la detección de resistencia a P. cinnamomi

en germoplasma de P. schiedeana e híbridos de P. schiedeana con P. americana. En el

mismo trabajo se encontró que germoplasma de P. americana conocido por tener un

moderado nivel de resistencia como Thomas, Barr Duke y Duke 7 presentaron

susceptibilidad mediante el método de inoculación en tallo, lo cual permite indicar que este

método es más riguroso y preciso para evaluar la resistencia a P. cinnamomi en

germoplasma de P. americana.

La técnica de inoculación por herida al tallo ha sido probada como método alternativo para

la evaluación de resistencia a P. cinnamomi, Dixon et al, (1984) evaluaron la relación entre

la respuesta presentada en Banksia spp. a P. cinnamomi mediante la inoculación directa

a la raíz y la inoculación por herida al tallo y encontraron que es directamente proporcional,

por lo cual fue presentada como una técnica con alto potencial para determinar la

resistencia a P. cinnamomi. Además, esta técnica es presentada como una de las opciones

existentes para realizar pruebas de inoculación de plantas con especies de Phytophthora


(Drenth y Sendal, 2001) por el Centro de Investigación Cooperativa para la Protección de

las Plantas Tropicales de Brisbane, Australia. Entre las técnicas propuestas se encuentran:

1. Inoculación de esporangios en tejido de la hoja o fruta.

2. Inserción de micelio en los tallos de las plántulas jóvenes.

3. La inserción de piezas de agar con micelio en agujeros en el tallo adulto (leñoso) de las

plantas.

4. La inoculación de suelo y siembra de plantas jóvenes en esta tierra infectada.

Según Robin y Desprez (1998) la técnica de inoculación en tallo permite evaluar la

virulencia de muchos aislamientos de P. cinnamomi ya que permite discriminar de forma

estable y consistente los aislamientos del patógeno, además de ser una técnica más

conveniente de realizar que las técnica de inoculación en el suelo.

4. Materiales y métodos

4.1 Localización

El trabajo de investigación se desarrolló en el Centro de Investigación Palmira de

CORPOICA ubicado en Palmira, Valle del Cauca, Colombia, en las coordenadas

03°30’43,6’’N, 76°18’53,5’’O a una altura de 1.001 m.s.n.m. temperatura promedio anual

de 23°C, precipitación promedio anual de 1.100 mm y humedad relativa promedio anual

del 75% (CVC, 2007). Se seleccionó y adecuó un invernadero el cual cumplía con las

condiciones ambientales de temperatura y humedad relativa adecuadas para el desarrollo

de las plantas de aguacate, que deben estar comprendidas entre 18 y 26ºC (Bernal et al.,

2008) y entre 75 y 80% de humedad relativa (Bartoli, 2008). De acuerdo con Medina,

(2000), las condiciones adecuadas para el desarrollo de la enfermedad pudrición radical

del aguacate reporta ambientes similares al del cultivo de aguacate y afecta con mayor

intensidad en ambientes con alta humedad relativa.

4.2 Caracterización morfológica del Banco de Germoplasma de Aguacate de CORPOICA C.I. Palmira

Para realizar la caracterización morfológica del germoplasma de aguacate presente en

CORPOICA Centro de Investigación Palmira conformado por 187 accesiones, se tomó

como referente los descriptores del International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI,

1995). Se seleccionaron variables que describen caracteres contrastantes y de alta

heredabilidad (caracteres cualitativos). De 112 descriptores que componen el descriptor

del IPGRI, para aguacate P. americana se seleccionaron para la caracterización los 15

descriptores contrastantes que permitieron ser evaluados para las condiciones de

conservación del germoplasma (materas) del C.I. Palmira. Variables morfológicas

vegetativas, principalmente, fueron evaluadas debido a que las condiciones de


conservación en materas no permite evaluar descriptores reproductivos (floración y

fructificación).

Las variables caracterizadas fueron: superficie del tronco (SDT), color de las lenticelas del

vástago joven (CLVJ), color de la rama joven (CRJ), superficie de la rama joven (SRJ),

pubescencia de la superficie inferior de la hoja (PSIH), pubescencia de la superficie

superior de la hoja (PSSH), peciolo acanalado (PA), ángulo de inserción del peciolo foliar

(AIPF), numero de venas primarias de la hoja (NVPH), divergencia de las venas primarias

(DVP), forma de la hoja (FH), margen de la hoja (MH), forma de la base de la hoja (FBH),

forma del ápice de la hoja (FAH) y olor a anís (OA).

Cada una de las variables caracterizadas se encuentra categorizada de acuerdo al

descriptor IPGRI para aguacate (Tabla 1).

Con la información obtenida en campo de la caracterización de los 15 descriptores

morfológicos se realizó el análisis de correspondencia múltiple (ACM). Con el análisis de

la información anterior se determinó la similitud genética del germoplasma de aguacate

caracterizado, empleando el método de análisis clúster de mínima inercia de Ward con la

distancia de similaridad euclideana.

Materiales y métodos 29

4.3 Selección del material vegetal

Para la selección de las accesiones de P. americana del Banco de Germoplasma (B.G.)

de aguacate presente en CORPOICA, C.I. Palmira, se tuvo como criterio principal el origen

geográfico del material vegetal, y el análisis de agrupamiento de similitud genética

originado a partir del análisis de correspondencia múltiple (ACM) de la caracterización

morfológica del B.G. de aguacate, el cual generó grupos de accesiones por variables

morfológicas similares.

4.4 Selección de cepas de Phytophthora cinnamomi

Para el montaje del ensayo se seleccionaron dos cepas de P. cinnamomi, reportadas por

Rodriguez et al. (2013) como las más patogénicos de 22 aislamientos evaluados sobre

aguacate Hass utilizando la técnica de inoculación con micelio por herida al tallo.

Asilamientos colectados en diferentes zonas del país donde se evidenció muerte de

árboles de aguacate presumiblemente por Phytophthora spp. El estudio que permitió la

identificación de las dos cepas de P. cinnamomi tuvo como criterio la caracterización

morfológica macroscópica de crecimiento de la colonia (forma de roseta y tipo petaloide) y

Variable Escala

Superficie del tronco 3=Lisa, 7=Rugosa, 9=Muy rugosa

Color de las lenticelas del vástago joven. 1=Marfil, 2=Verde, 3=Marrón, 4=Rojo, 5=Purpura, 6=Otro

Color de la Rama Joven (hojas jóvenes de la punta de la rama)

1=Amarillo, 2=Verde, 3=Rojo, 4=Otro

Superficie de la rama joven. 1=Glabra, 2=Pubescente

Pubescencia de la superficie inferior de la hoja. 0=Ausente, 3=Escasa, 5=Intermedia, 7=Densa

Pubescencia de la superficie superior de la hoja. 0=Ausente, 3=Escasa, 5=Intermedia, 7=Densa

Peciolo Acanalado 0=Ausente, 1=Presente

Angulo de inserción del peciolo foliar. 1=Agudo, 2=Obtuso

Numero de venas primarias de la hoja. 1=1, escala asignada por no haber variabilidad

Divergencia de las venas primarias medida en ángulos.

1=45°, escala asignada por no haber variabilidad

Forma de la hoja. 1=Ovada, 2=Obovada-angosta, 3=Obovada, 4=Oval, 5=Redondeada, 6=Coediforme, 7=Lanceolada, 8=Oblonga, 9=Oblonga-lanceolada, 10=Otra

Margen de la hoja. 1=Entero, 2=Ondulado

Forma de la base de la hoja. 1=Aguda, 2=Obtusa, 3=Truncada

Forma del ápice de la hoja. 1=Muy agudo, 3=Agudo, 5=Intermedio, 7=Obtuso, 9=Muy obtuso

Olor a anís. 3=Tenue, 5=Intermedio, 7=Intenso

Tabla: 1 Variables seleccionadas para la caracterización morfológica del Banco de Germoplasma de aguacate y sus respectivas escalas de medición (IPGRI, 1995).


microscópica de las estructuras vegetativas y reproductivas (hifas coraloide,

clamidiosporas globosas) (Rodríguez et al., 2013).

Las cepas seleccionadas fueron Ag A-041 proveniente de Tribunas Córcega, Risaralda

(donada por la Universidad Nacional se Colombia Sede Palmira) y la cepa Ag A-003 de

Rionegro Antioquia colectada por CORPOICA (Rodríguez et al., 2013), en su respectivo

orden de acuerdo al grado de patogenicidad. La purificación e incremento de las cepas de

P. cinnamomi seleccionadas por patogenicidad para el ensayo se realizó en el laboratorio

de Fitopatología de CORPOICA C.I. Palmira en medio selectivo PDA+antibióticos y

fungicidas (39 g PDA, Ampicillin 5000 μg/L, Penicillin 8000 μg/L, Rifampicin 200 μg/L,

PCNB 4000 μg/L, Benlate 400 μg/L, Hymexazol 5000 μg/L, Vancomicin 5000 μg /L,

Polimicin 5000 μg/L, Merteck 300 μl) (Rodríguez et al., 2013).

4.5 Producción del material vegetal

4.5.1 Manejo agronómico

El manejo agronómico realizado al banco de germoplasma de aguacate del C.I. Palmira

corresponde a protocolos preestablecidos para la conservación y manejo preventivo

fitosanitario de las accesiones del banco. Para promover el crecimiento de yemas jóvenes,

en cantidad suficiente para clonar los materiales seleccionados y realizar el ensayo de

inoculación con P. cinnamomi, se enfatizó en el siguiente protocolo de manejo del

programa de bancos de germoplasma del CI Palmira.

Desde el mes de mayo hasta el mes de septiembre del 2013, se realizó el siguiente

protocolo:

• Riego

Se realizó riego suplementario periódicamente tres veces por semana aplicando cuatro

horas diarias con goteros de dos litros por hora, para un riego de 24 litros por semana,

mediante sistema de riego por goteo, sobre materos de 24 litros de volumen. En épocas

de mucha lluvia se redujo el riego a una vez por semana, ocho litros por semana por planta.


• Fertilización

La fertilización se realizó dos veces por mes, una cada 15 días rotando fertilización edáfica

y foliar. La edáfica se realizó con 3 gramos de Remital (17–6–18–2) y un gramo de

Nutrimenores (0–0–3–16) (CaO) – 6 (MgO) – 4,9 (S) – 1 (B) – 0,05 (Cu) – 0,05 (Fe) – 0,05

(Mn) – (Zn), disuelto en un litro de agua por planta. La fertilización foliar se realizó cada 15

días con Tottal (18–10–4–0,021 (CaO) – 1,25 (MgO) – 3,3 (S) – 0,135 (B) – 0,0033 (Co) –

0,27 (Cu) – 0,032 (Fe) – 0,23 (Mn) – 0,009 (Mo) – 0,78 (Zn), a razón de 5 g/l y 300 cm3 por

planta distribuidos uniformemente en el follaje de la planta.

• Poda

Se realizó poda a las plantas para promover el crecimiento de yemas vegetativas (Figura

2). La conservación del germoplasma en materos tiene como finalidad reducir el desarrollo

foliar y radical de la planta. Igual situación se presenta con los bancos de germoplasma de

cítricos, guanábana y piña para las condiciones del CI Palmira. Para plantas en materos

se realiza, protocolariamente, poda de formación y crecimiento para reducir el desarrollo

vegetativo exuberante y conservar arboles de porte bajo. Los cortes fueron desinfectados

con pasta de Carboxín mas Captan y la tijera podadora con hipoclorito de sodio para

prevenir la diseminación de enfermedades.

Figura: 2 Materiales de aguacate conservados en materas en el B.G. de CORPOICA C.I. Palmira y poda para incentivar el crecimiento de yemas.


Posteriormente se realizó la colecta de yemas de 20 accesiones de aguacate y se

trasladaron al vivero Frutales del Eje Cafetero (vivero con registro ICA) ubicado en el

municipio de Calarcá en el departamento de Quindío en las coordenadas 4º28'46,3"̎N y

75º41'57,0"O̎ a una altitud de 1.377 m.s.n.m. (Anexo A), para la injertación por personal

especializado, permitiendo asegurar el mayor porcentaje de prendimiento de yemas por

escases en las plantas donadoras del banco de germoplasma.

4.6 Clonación del material vegetal

Para la colecta de las yemas se tuvo en cuenta el estado óptimo para su injertación (Figura

3), siguiendo la siguiente metodología descrita por Jaramillo et al. (2009):

• Selección de ramas jóvenes, con crecimiento activo y de mediana flexibilidad.

• Selección de varetas con yema terminal, de aproximadamente 15 cm de longitud

con presencia de un punto de corcho en el centro del tallo de aproximadamente 1 mm. Se

descartaron varetas que presentaron corcho, mayor al indicado, permitiendo de esta

manera asegurar mayor rendimiento al injertarla.

• Desinfección de varetas sumergiendo las yemas en una solución de Mancozeb o

Benomyl a una concentración de 1,5 g/l durante cinco minutos.

• Colocación de varetas en papel craft, con cinta de enmascarar identificando

claramente la accesión del banco de germoplasma del C.I. Palmira para garantizar la

identidad genética.

• Inmersión en agua para garantizar el humedecimiento rápido de las varetas, evitar

transpiración excesiva y posteriormente poder embalar en termo de poliestireno expandido

refrigerante para su transporte.

Se injertaron las 20 accesiones de aguacate sobre patrón nativo o común, 12 injertos por

cada accesión con el fin de garantizar nueve plantas por accesión requeridas para el

ensayo de infección, para un total de 240 plantas injertadas en el vivero seleccionado. En

el vivero las plantas se identificaron con un código que correspondió a un número

consecutivo para el aseguramiento de la identidad genética del material injertado (Figura

4).


Figura: 3 Colecta, marcación y embalaje de las yemas.

La injertación se realizó el 03 de Octubre del 2013, las plantas permanecieron durante tres

meses en vivero antes de ser trasladas al C.I. Palmira. El manejo agronómico desde

injertación hasta el traslado fue el siguiente:

La semilla usada como portainjerto procedió de huerto básico de árboles nativos o

comunes procedentes de Alvarado, Tolima. El protocolo que realiza el vivero Frutales del

Eje Cafetero para la obtención de los patrones es el siguiente: 1. La semilla se selecciona

por tamaño y sanidad y es pre-germinada en arena durante 25 días previa desinfección

con Metalaxil y Clorpirifos. 2. Las plantas portainjerto son sembradas en bolsas de seis

litros de capacidad con medidas de 46 cm de larga por 23 cm de ancha, 3. Se utiliza como

sustrato una mezcla de tierra negra, arena y cisco de arroz, en proporción 3:1:1

respectivamente. 4. El sustrato es previamente desinfectado con Dazomet. 5. A cada bolsa

se le adiciona 5g de tierra inoculada con micorrizas como material biológico simbiótico. 6.

La injertación se realiza a 25 cm de altura del portainjerto, por el método de púa terminal y

Figura: 4 Proceso de injertación: corte para injerto en púa terminal (A), encinte (B) y planta injertada (C).


se cubre con bolsa plástica para conservar la humedad, con sobre-cubierta de bolsa de

papel para impedir el paso de luz y estimular un rápido crecimiento de la yema. 7. Cada

semana se realizan controles preventivos de plagas y enfermedades rotando Metalaxil,

Fosetil de aluminio, Carbendazim, Sulfitos de potasio y Clorpirifos.

Adicionalmente se injertó el cultivar Hass como testigo susceptible al patógeno,

procedentes del vivero PROFRUTALES LTDA (vivero con registro ICA) ubicado en el

municipio de Villa Gorgona, Valle del Cauca en las coordenadas 3°24'N 76°22'O a 950

m.s.n.m. Vivero que disponía de plántulas injertadas sobre patrón tipo antillano conforme

a la procedencia de la semilla utilizada para patronaje.

4.7 Clonación del material vegetal

Las plantas fueron trasladas al C.I. Palmira y ubicadas en vivero bajo cobertura plástica

para controlar la cantidad de agua suministrada, aisladas del suelo a 70cm de altura sobre

mesas de cemento y como soporte una matera de plástico de 6 litros (sin retirarlas de la

bolsa o contenedor de polietileno), distanciadas a 30cm una de otra para impedir el

contacto entre ellas a través del agua de percolación de riego y evitar posible

contaminación con zoosporas del patógeno a evaluar, y prevenir posibles disturbios

fitosanitarios entre una planta y otra (Figura 5). Las plantas permanecieron durante 20 días

en proceso de adaptación en estas condiciones de vivero antes de la inoculación del

patógeno por la técnica de herida al tallo.

Para mantener una alta humedad relativa, se llenaron tanques de cemento ubicados bajo

las mesas del vivero, con una capacidad de 190 litros cada tanque, ocho tanques para un

total de 1,52 m3. Se adicionó agua cada dos días según necesidades para mantener una

lámina de agua de 10 cm. El riego suplementario se realizó cada dos días para mantener

las plantas a capacidad de campo evitando el salpique entre plantas y mantener las

condiciones óptimas de humedad.


4.8 Monitoreo climatológico

Se instaló una estación meteorológica portátil WatchDog serie 2009 para monitorear las

condiciones ambientales adecuadas para las plantas y para la expresión del patógeno

(Figura 6). La estación meteorológica se programó para registrar las variables de

temperatura y humedad relativa cada 30 minutos durante todo el tiempo de duración del

ensayo. Una vez terminado el periodo de evaluación la información fue descargada a un

ordenador y la información se analizó mediante gráficos de dispersión XY con los valores

registrados y las fechas de registro.

Figura: 5 Acondicionamiento de plantas en vivero, aisladas del suelo, en soporte de materas plásticas de 6 litros.

Figura: 6 Estación meteorológica portátil para monitoreo de condiciones ambientales.


4.9 Diseño experimental

Las plantas se distribuyeron de acuerdo al diseño experimental en bloques completos al

azar (BCA) con arreglo factorial en parcelas divididas (PD) asignando a las cepa de P.

cinnamomi la parcela principal, a las accesiones de P. americana la subparcela (Anexo B).

Se evaluaron dos cepas (Ag A-041, Ag A-003) y un tratamiento testigo denominado cepa

cero “0” o testigo inoculado con agar-agua, 21 genotipos de aguacate (19 accesiones

criollas, adicionalmente el cultivar Hass como testigo susceptible y el portainjerto Topa-

Topa usado en California por su resistencia a suelos salinos pero registrado como

susceptible a P. cinnamomi de acuerdo a Bernal et al. 2008; Zilberstein y Pinkas 1987), en

un arreglo factorial de 3 x 21 para un total de 63 tratamientos con tres repeticiones por

tratamiento y 189 plantas. Las evaluaciones se realizaron cada dos días a partir del quinto

día de inoculación durante 16 días, se analizó como parcelas subdivididas siendo la

subsubparcela el tiempo de evaluación con ocho fechas de lectura. Dada las altas

variaciones presentadas, los datos se transformaron con la raíz cuadrada para cada

observación.

4.10 Variable de respuesta

De las observaciones en campo se obtuvieron registros de largo y ancho de la lesión por

espacio de ocho días de lecturas, los cuales se multiplicaron para obtener el área de la

lesión con la cual se determinó el Área Bajo la Curva del Progreso de la Enfermedad

(ABCPE) de tres (3) cepas, 21 genotipos de aguacate en 3 bloques para un total de 1.512

datos de ABCPE.

4.11 Inoculación

Se usó la metodología descrita por Jaramillo et al. (2009), de inoculación con micelio en

herida al tallo a cada planta, para evaluar la resistencia de los 21 genotipos de aguacate a

las dos cepas de P. cinnamomi seleccionadas por patogenicidad. El método se basa en

realizar una herida al tallo, a una altura de 5cm por encima del punto de injertación. La

herida se realizó de arriba hacia abajo con una hoja de bisturí sin afectar el leño de la

planta, retirando parcialmente una lengüeta de la corteza del tallo de aproximadamente


2mm de profundidad. Al interior de la lengüeta se colocó un disco de agar de 6mm de

diámetro con micelio de P. cinnamomi. Posteriormente se cubrió la herida con parafilm

para evitar la caída del agar con micelio, regular la humedad, evitar la contaminación y

asegurar la colonización del patógeno. Las plantas testigo fueron inoculadas con la misma

metodología, por herida al tallo, con un disco de 6mm de diámetro de agar y agua sin

micelio (Anexo C).

5. Resultados y discusión

La interacción entre materiales criollos de aguacate y las dos cepas patogénicas de P.

cinnamomi Rands, para las condiciones del C.I. Palmira bajo los procedimientos y

protocolos enunciados en el capítulo anterior, se esbozan a continuación:

5.1 Caracterización morfológica del banco de germoplasma de aguacate del C.I. Palmira

De las 15 características morfológicas cualitativas medidas, cinco mostraron más de tres

clases fenotípicas, siendo forma de la hoja la de mayor clases fenotípicas presentes con

siete clases (obovada-angosta, obovada, oval, redondeada, coediforme, lanceolada y

oblongo-lanceolada) seguido de forma del ápice de la hoja con cinco clases fenotípicas

(muy agudo, agudo, intermedio, obtuso y muy obtuso); con cuatro clases fenotípicas: color

de la rama joven (amarillo, verde, rojo y otros colores), pubescencia de la superficie inferior

(ausente, escasa, intermedia y densa) y pubescencia de la superior de la hoja (ausente,

escasa, intermedia y densa); con tres clases fenotípicas: superficie del tronco (lisa, rugosa

y muy rugosa), forma de la base de la hoja (aguda, obtusa y truncada) y olor a anís (tenue,

intermedio e intenso); con dos clases fenotípicas: color de las lenticelas del vástago joven

(marrón y rojo), peciolo acanalado (presente y ausente) y margen de la hoja (entero y

ondulado). Las características: ángulo de inserción en el peciolo foliar, número de venas

primarias de las hojas y divergencia de las venas primarias presentaron una sola clase

fenotípica, por lo cual se consideran como características poco útiles para discriminar la

variabilidad entre accesiones de aguacate (Tabla 2).


Tabla: 2 Resumen de las características cualitativas registradas en 187 accesiones de aguacate

Variable Clase fenotípica y No. de individuos que la

presentaron.

Superficie del tronco 3(7), 7(123), 9(57) Color de las lenticelas del vástago joven. 3(183), 4(4) Color de la rama joven (hojas jóvenes de la punta de la rama) 1(4), 2(131), 3(50), 4(2) Superficie de la rama joven. 1(34), 2(153) Pubescencia de la superficie inferior de la hoja. 0(100), 3(47), 5(32), 7(8) Pubescencia de la superficie superior de la hoja. 0(101), 3(48), 5(24), 7(14) Peciolo acanalado 0(111), 1(76) Angulo de inserción del peciolo foliar. 1(187) Numero de venas primarias de la hoja. 1(187) Divergencia de las venas primarias medida en ángulos. 1(187) Forma de la hoja. 2(26), 3(2), 4(51), 5(59), 6(5), 7(13), 9(31) Margen de la hoja. 1(139), 2(48) Forma de la base de la hoja. 1(122), 2(60), 3(5) Forma del ápice de la hoja. 1(11), 3(67), 5(74), 7(33), 9(2) Olor a anís. 3(174), 5(8), 7(5)

El ACM para las 15 variables cualitativas caracterizadas permitió identificar las dos

primeras dimensiones como las de mayor aporte a la variabilidad observada con 11,14%

la primera dimensión y 10,56% la segunda para un total de 21,70% de variabilidad

explicada en el germoplasma de aguacate de Corpoica C.I. Palmira (Tabla 3). La primera

dimensión está definida por forma de la hoja (FH) con una contribución del 28,79%, forma

de la base de la hoja (FBH) con un porte de 22,53% y la segunda dimensión estuvo definida

por la pubescencia de la superficie superior de la hoja (PSSH) con un aporte de 12,3% y

pubescencia de la superficie inferior de la hoja (PSIH) con un 8,81%.

Tabla: 3 Análisis de correspondencia múltiple para variables cualitativas en 187 accesiones de Persea americana presentes en el banco de germoplasma de Corpoica C.I. Palmira.

Número Valor propio Porcentaje Porcentaje acumulado

1 0,4133 11,14 11,14

2 0,4023 10,56 21,70

De acuerdo con el análisis de clasificación jerárquica con base en el ACM se identificaron

cinco grupos a una distancia de 30 unidades (Anexo D), en los cuales los agrupamientos

responden a materiales con atributos cualitativos similares.

Resultados y discusión 41

El agrupamiento no permitió discriminar entre accesiones por centro de origen (estructura

genética). Dentro del germoplasma se encuentra accesiones reconocidas comercialmente

cuyo origen (previo a conservarse en el C.I. Palmira) es CORPOICA centro de

investigación La Selva donde se encontraba inicialmente el Banco de Germoplasma de

Aguacate (33,7% del germoplasma) y accesiones colectadas en Colombia entre 2007 y

2008 por CIAT-CORPOICA-PROFRUTALES (66,3% del germoplasma).

El primer grupo está constituido por las accesiones 1607, 135-15, 135-20, 135-21, 135-27,

Booth-7, Booth-8, Choquette, Collin-Red, Costa-Rica, Duke-7, Fuerte, Gripiña, Hulumana,

Ibague, Kanola, La-Selva, Lula, Marcus, Mayapan, Oriente, Santana, Sardi, Trappica,

Trinidad, Waldin, Winslowson, 20, 07-1336, Anca-010, Boca-015, Boca-022, Capi-032,

Capi-035, Hual-017, Maci-017, Maci-018, Masa-026, Nacha-003, Quibu-011, Quico-009,

Quiqui-029, Quite-027, Ripe-002, Saca-017, Sari-021, Sasa-003, Sasa-006, Tofre-019,

Toib-030, Toib-050, Topa topa, Vabu-010, Vapa-026, Vapa-066 y Vayo-098 el cual

representa el 29,9% de la población estudiada. La variable más discriminante de este

grupo corresponde al tipo de hoja oval y peciolo acanalado.

El segundo grupo está constituido por las accesiones Ecuatoriano, Zutano, 15, 67-136, 97-

1315, Antu-015, Boca-018, Boca-021, Cabo-007, Cacaj-036, Cano-012, Caro-018, Cavi-

030, Cela-006, Cepu-008, Hual-018, Husu-004, Maci-010, Maci-021, Maci-022, Maci-024,

Maci-025, Mafu-016, Mele-007, Natu-009, Natu-011, Percaerulea, Quico-006, Quiqui-030,

Saca-019, Caco-047, Toal-005, Tocha-025, Vabu-016, Vabu-022, Vabu-024, Vapa-021,

Vapa-060, Vapa-062, Vapa-063 y Varo-003 el cual representa el 21,9% de la población

estudiada. La variable más discriminante de este agrupo corresponde al tipo de hoja

redondeada y escasa pubescencia en la parte superior e inferior de la hoja.

El tercer grupo conformado por las accesiones Esther, Gwent, Hass, Simonds, Cacaj-042,

Caro-020, Huga-012, Maci-023, Mevi-002, Nacha-002, Natu-002, Natu-010, Pumo-001,

Quipi-001, Quipi-003, Sala-031, Sasa-005, Urbano-002 y Vapa-020 el cual representa el

10,2% de la población estudiada. La variable más discriminante de este agrupo

corresponde al tipo de hoja obovada-angosta.

El cuarto grupo conformado por las accesiones 143-61, Booth-5, Fairchild, Itzamma, Jim,

Linda, Los-Silos, Monroe, Nabelico, Nativo-2011, Oculta-1, Oculta-2, Papelillo, Ruelhe,


Trapp, 07-1942, 67-1378, Cacaj-037, Cacaj-044, Cano-008, Casi-013, Casu-002, Cavi-

033, Masa-001, Mele-003, Nacha-004, Natu-001, Natu-003, Quiar-022, Quico-015, Ripe-

006, Riqui-009, Saca-013, Sala-028, Sala-030, Santa cruz, Sari-023, Sari-027, Sasa-004,

Toma-003, Varo-001 y Varo-020 el cual representa el 22,5% de la población estudiada. La

variable más discriminante de este agrupo corresponde al tipo de hoja oblonga-lanceolada

con forma del ápice de la hoja muy agudo.

El quinto grupo conformado de las accesiones 143-77, Bacon, Booth-1, G-755, Gottfrizd,

Hayes, HX-48, Lorena, Pollock, PT-37, Pùebla, Semill-44, Tumaco, Caro-019, Cavi-041,

Maci-005, Mafu-048, Masa-002, Masa-031, Nariño 1, Quico-005, Ripe-003, Saca-014,

Sasa-009, Toal-004, Vabu-014, Vabu-021, Varo-002 y Varo-006 el cual representa el

15,5% de la población estudiada. La variable más discriminante de este agrupo

corresponde al tipo de hoja redondeada con forma de la base de la hoja obtusa, forma del

ápice agudo, presencia del peciolo acanalado y superficie del tronco muy rugosa.

5.2 Selección del material vegetal

Dieciocho Accesiones de aguacate antillano se seleccionaron por zonas de colecta con el

objetivo de evaluar germoplasma de todo el territorio nacional teniendo en cuenta que la

variable de mayor discriminación morfológica, forma de la hoja, estuviese presente en cada

zona en sus diferentes formas. Como testigo resistente se eligió el clon CANO-008 de

Norcasia, Caldas identificado como material muy resistente a P. cinnamomi en evaluación

realizada en CIAT 2009, y como testigos susceptibles el cultivar Hass (Jaramillo et al.,

2009) y el portainjerto Topa-Topa (Gabor et al., 1990; Gabor y Coffey, 1991; Kellam y

Coffey, 1985), este último usado como patrón por presentar resistencia a algunas

enfermedades fungosas del suelo (Bernal et al., 2008) pero susceptible a P. cinnamomi

(Tabla 4).


Tabla: 4 Accesiones de aguacate seleccionados para el estudio y su respectiva procedencia

Genotipo de aguacate

Procedencia Coordenadas de colecta

Boca-021 1 Carmen de Bolívar-Bolívar 09°44′43,4″N, 75°16′28,2″O Caro-019 1 Rosas-Cauca 02°14′10,0″N, 76°44′32,6″O Cavi-041 1 La Victoria-Caldas 05°20′36,1″N, 74°54′20,2″O Cepu-008 1 Pueblo bello-Cesar 10°24′57,8″N, 73°38′54,8″O Husu-004 1 La Suaza-Huila 01°55′16,5″N, 75°49′14,7″O Masa-031 1 Santa Marta-Magdalena 11°12′90,7″N, 74°02′68,8″O Mevi-001 1 Villavicencio-Meta 04°01′17,3″N, 73°14′28,8″O Natu-001 1 Tumaco-Nariño 01°32′54,4″N, 78°41′49,8″O Natu-002 1 Tumaco-Nariño 01°34′24,4″N, 78°42′02,0″O Quiqui-030 1 Quimbaya-Quindío 04°37′37,1″N, 75°44′59,0″O Quite-027 1 La Tebaida-Quindío 04°27′50,3″N, 75°48′22,0″O Saca-014 1 Carmen del chucuri-Santander 06°39′03,2″N, 73°35′51,7″O Saca-017 1 Carmen del chucuri-Santander 06°44′23,8″N, 73°35′40,6″O Toma-003 1 Mariquita-Tolima 04°40′14,2″N, 74°59′07,5″O Vabu-014 1 Buga-Valle del Cauca 03°52′40,6″N, 77°00′44,7″O Vapa-062 1 Palmira-valle 03°30′37,9″N, 76°19′33,9″O Varo-002 1 Rozo-Valle del Cauca 03°36′39,0″N, 76°25′29,0″O Varo-006 1 Rozo-Valle del Cauca 03°36′39,0″N, 76°25′29,0″O Cano-008 2 Norcasia-Caldas 05°36′38,9″N, 74°52′35,9″O Topa-topa 3 Ojai-California 03°36′43,6″N, 76°18′53,5″O Hass 4 Vivero PROFRUTALES 03°36′43,6″N, 76°18′53,5″O

Tipo de selección: 1 Distancia genética (ACM), 2 Accesión resistente (Jaramillo et al., 2009), 3 Portainjerto susceptible (Gabor et al., 1990; Kellam y Coffey, 1985) y 4 Cultivar susceptible (Jaramillo et al., 2009).

5.3 Monitoreo climatológico en el área de estudio

La información colectada de temperatura y humedad relativa de la estación meteorológica

portátil durante los 25 días de observación permitió establecer que las condiciones

estuvieron dentro de los rangos óptimos para la expresión de la enfermedad según Rojas

(2004). La temperatura promedio diaria durante el ensayo fue de 26,6°C ± 1,77°C y la

humedad relativa promedio diaria fue de 64,3% ± 9,1%. Se presentaron variaciones diarias

promedio de 6,34°C y 24,58% de humedad relativa (Figura 7 y 8; Anexo E y F). Las

temperaturas más bajas se registraron entre las 04:00 y 08:30 de la mañana llegando a

20,3°C, y las temperaturas más altas entre las 02:00 y 03:30 de la tarde con el mayor valor

de 31,9°C. La humedad relativa ambiental más baja registrada durante el ensayo se

presentó entre la 01:00 y 04:00 de la tarde con un valor mínimo de 51% y los valores más

altos entre las 06:00 y 10:00 de la mañana presentando un valor máximo de 93,8% de

humedad relativa ambiental.


Figura: 7 Temperatura (ºC) registrada durante el periodo de las evaluaciones.

Figura: 8 Humedad relativa máxima, mínima y promedio (%) registrada durante el periodo de las evaluaciones.


5.4 Síntomas y niveles de expresión de la enfermedad por cepa evaluada

Al día siguiente de la inoculación la cepa Ag A-041 de P. cinnamomi presentó los síntomas

de la enfermedad en la zona de inoculación en el material criollo Quiqui-030 de Quimbaya,

Quindío, la cual fue la accesión más susceptible en el ensayo. La necrosis observada

presentaba color café oscuro y de consistencia húmeda. La enfermedad evidenció

síntomas de progreso durante todo el tiempo del ensayo, necrosando el tallo hacia arriba

y hacia abajo de la lesión. La celeridad del avance de la necrosis se dio en mayor

proporción hacia el ápice del tallo (copa) en sentido ascendente. (Figura 9).

La cepa Ag A-003 tardó cinco días en expresar los síntomas de la enfermedad en la zona

de inoculación en el material criollo Quiqui-030. El área necrosada no presentó un

desarrollo visual significativo de la enfermedad en el tallo de las plantas inoculadas, con

excepción del cultivar Hass donde se evidenció un necrosamiento continuo del área

afectada, pero menos pronunciado que el causado por la cepa Ag A-041. El avance de la

enfermedad medida a través del área necrosada fue poca, evidenciando en campo que la

cepa Ag A-003 es de menor nivel de patogenicidad que la cepa Ag A-041, debido al tiempo

tardío en presentar la infección y por la mínima infección que causó durante el tiempo que

se desarrolló el ensayo (Figura 10).

Cinta parafilm cubriendo

zona de inoculación.

Zona necrosada cinco días

después de la inoculación de la

cepa Ag A-041.

Yema terminal de la planta

doblada por muerte parcial de

tejido del tallo soporte.

Figura: 9 Necrosamiento del tallo de planta de aguacate causado por la cepa Ag A-041 de Phytophthora cinnamomi cinco días después de la inoculación en la accesión de aguacate Quiqui-030.


Las plantas inoculadas con el tratamiento testigo agar más agua sin micelio del patógeno

no presentaron ningún síntoma de la enfermedad. En estas plantas solo se presentó una

oxidación del tejido en el área del corte realizado para simular la inoculación, durante todo

el ensayo (Figura 11). El secamiento del tejido, sin un evidente necrosamiento patogénico,

registrado en todas las unidades experimentales que fueron sometidas a este tratamiento,

demuestra la confiabilidad que el proceso de inoculación ha logrado, permitiendo

garantizar los resultados obtenidos. Además de esto se pudo determinar que la infección

expresada por el necrosamiento húmedo del tejido del tallo en el área intervenida fue

ocasionado por las estructuras invasivas de las cepas de P. cinnamomi y no por un

disturbio aislado en la planta, observable en todos los tratamientos y repeticiones del

ensayo con presencia del patógeno.

Cicatriz de hoja.

Yema axilar.

Zona afectada por P. cinnamomi en

punto de injertación, cubierta por cinta

parafilm.

Cicatriz de la injertación en púa

terminal.

Figura: 10 Necrosamiento reducido del tallo de planta de aguacate causado por la cepa Ag A-003 de Phytophthora cinnamomi 20 días después de la inoculación en la accesión de aguacate Quiqui-030.


Las accesiones de aguacate susceptibles a P. cinnamomi (cepas: Ag A-041 y Ag A-003),

presentaron un avance progresivo de la enfermedad desde los primeros días de la

inoculación del patógeno, causando necrosamiento rápido y ascendente en el tallo de la

planta. Lo anterior generó secamiento de las hojas defoliándose pocos días después de la

inoculación. La afección en las plantas susceptibles causó la muerte rápida del material

injertado (copa), sin llegar a alcanzar la cicatriz del injerto.

Diez días después de la inoculación, en todos los tratamientos con cepas del patógeno, se

registró un sobre-crecimiento blanquecino sobre el área de inoculación (Figura 12),

característica que presentan las plantas cuando son severamente afectadas por este

patógeno (Mora et al., 2007 apud, Lemus, 2009). Las plantas con tratamiento testigo

inoculadas con agar más agua no registraron el sobrecrecimiento blanquecino. El

crecimiento blanquecino fue sembrado en PDA+ y se obtuvo crecimiento de micelio en

forma tipo roseta característico de P. cinnamomi.

Herida cicatrizada sin

presencia de necrosamiento.

Figura: 11 Oxidación del tejido afectado por el corte con inoculación de agar más agua, sin expresión de síntoma de necrosis causado por Phytophthora cinnamomi 20 días después de la inoculación en la accesión de aguacate Quiqui-030.


Con el fin de confirmar que los síntomas de necrosamiento eran causados por el patógeno

inoculado, se realizó re-aislamiento del patógeno en el laboratorio de Fitopatología de

CORPOICA C.I. Palmira. Se tomaron trozos de tallos con los síntomas de la enfermedad,

que fueron cortados en proporción de 50% tejido afectado y 50% tejido no afectado,

tomando tejido interno del tallo y parte de la corteza del mismo. Se desinfectó con

hipoclorito al 1% y alcohol al 96%, para posteriormente ser sembrados en cajas Petri con

medio selectivo de PDA+antibióticos y fungicidas para garantizar el aislamiento de P.

cinnamomi. Todo el proceso se realizó en cabina de flujo laminar garantizando la asepsia

del proceso. Se observó crecimiento de micelio 3 días después de la siembra el cual fue

trasladado a PDA donde se observó crecimiento de la colonia de micelio tipo roseta o

Sobre-crecimiento presentado en

las plantas inoculadas con P.

cinnamomi.

Figura: 12 Plantas de aguacate con crecimiento blanquecino sobre el área afectada por la inoculación con Phytophthora cinnamomi.


petaloide característico de P. cinnamomi (Figura 13). Se realizaron montajes de placa para

identificar el patógeno presente. Las estructuras observadas corresponden a las descritas

para P. cinnamomi con micelio tipo coraloide (hifas protuberantes) y clamidosporas

globosas (Figura 14). El micelio tipo coraloide es la principal característica que diferencia

a P. cinnamomi de otras especies de Phytophthora, ya que es la única especie de este

género que posee esta peculiar característica de poseer nodos (vesículas hinchadas) en

sus hifas.

Figura: 13 Crecimiento de colonia de micelio tipo petaloide de reaislamiento de material vegetal de aguacate inoculado con cepas de Phytophthora cinnamomi.


Las plantas más susceptibles al patógeno presentaron un rápido avance de la lesión,

llegando a ocasionar la muerte de la parte superior de la planta (copa). Las plantas que

presentaron menor necrosamiento del tallo cercano a la zona de inoculación presentaron

diferentes niveles de infección. Cabe resaltar que las plantas que presentaron menor

avance de la enfermedad, si presentaron infección causada por la alta concentración del

micelio inoculado, mínima en comparación con las plantas que presentaron crecimiento

rápido del área afectada y necrosada (Figura 15). Además de la mayor área afectada,

también se observaron síntomas de afección por el patógeno, tales como amarillamiento

de las hojas y pérdida de vigor de las plantas.

5.5 Síntomas de la enfermedad en las plantas inoculadas

Los síntomas observados en las plantas por afección del patógeno, fueron inicialmente la

pudrición de color marrón a negro en la zona de la inoculación del patógeno, la cual se

incrementó ascendentemente invadiendo tejido sano de tallos y ocasionando la caída de

hojas en las zonas de necrosis del tallo. La parte superior de la planta, por encima de la

zona de inoculación presentó decaimiento o pérdida de vigorosidad, clorosis general de

ramas y hojas, marchitamiento y defoliación. Las plantas detuvieron su crecimiento en

Figura: 14 Micelio tipo coraloide (micelio con protuberancias o nodos) de la cepa Ag A-041 de Phytophthora cinnamomi.


comparación con las plantas inoculadas con cepa testigo que presentaron un mayor

desarrollo y se inició un proceso de emisión de yemas axilares por debajo de la zona de

infección como respuesta al desorden fisiológico presentado.

5.6 Análisis de varianza (ANDEVA) para la interacción cultivar criollo vs. Cepa de P. cinnamomi Rands

El análisis de varianza (ANDEVA) de los resultados del ensayo para el ABCPE presentó

diferencias estadísticas altamente significativas (P ≤ 0,01) entre las dos cepas de P.

cinnamomi, entre las 21 accesiones de aguacate, entre las fechas de lectura (tiempo). Así

mismo se registraron diferencias altamente significativas para las interacciones de cepa

por genotipo, cepa por tiempo, genotipo por tiempo y cepa por genotipo por tiempo (Tabla

5). Lo anterior indica que por lo menos una de las cepas registró mayor severidad, las

accesiones de aguacate presentan un progreso variable de la enfermedad, en el tiempo

las cepas presentan diferentes niveles de infección y que las cepas afectaron de manera

diferente las accesiones de aguacate (Figura 16).

Figura: 15 Planta con alta resistencia (izquierda), planta con resistencia intermedia (centro) y planta susceptible (derecha).


Tabla: 5 Análisis de Varianza del ABCPE de la inoculación de 21 clones de aguacate con dos aislamientos de Phytophthora cinnamomi.

Fuente de variación GL CM P valor b

Bloque 2 1,69 0,0002 ** Cepa 2 2389,43 <,0001 **

Bloque x cepa. E(a) 4 0,64

Genotipo 20 13,18 <,0001 **

Cepa x genotipo 40 12,47 <,0001 **

Bloque x genotipo (cepa). E(b) 120 5,32

Tiempo 7 174,19 <,0001 **

Cepa x tiempo 14 77,68 <,0001 **

Genotipo x tiempo 140 0,53 <,0001 **

Cepa x genotipo x tiempo 280 0,46 <,0001 **

Error (c) 882 0,20 Total 1.511

C.V: 21,28%.

GL: grados de libertad. P valor b: probabilidad de encontrar valores mayores de F. CM: cuadrado medio. ** Diferencia latamente significativa

Figura: 16 Avance de la enfermedad para dos cepa de Phytophthora cinnamomi (Ag A-041 muy patogénica, Ag A-003 poco patogénica y Ag A-000 testigo agar más agua) sobre tres accesiones de aguacate: Quiqui-030 muy susceptible, Cepu-008 medianamente resistente y Natu-001 muy resistente.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Ag A-041 Ag A-003 Ag A-000Are

a b

ajo

la c

urv

a d

el pro

gre

so d

e la

enfe

rmedad (

AB

CP

E)

Cepa

Avance de la enfermedad para tres accesiones de aguacate (Muy susceptible, medianamente resistente y muy resistente) vs. tres cepas de

Phytophthora cinnamomi.

QUIQUI-030

VARO-006

NATU-001


Los valores de F para cada una de las fuentes de variación, reportan diferencias altamente

significativas para todas las fuentes de variación. Fueron estimadas según el error

asociado a cada una de ellas, diferenciándose tres tipos de error: Error tipo (a) para la

interacción Bloque*Cepa, Error tipo (b) para la interacción Bloque*Genotipo (Cepa), y Error

tipo (c) para la interacción Cepa*Genotipo*Tiempo (Tabla 5).

A partir del análisis de varianza y la separación de medias mediante el test de comparación

múltiple de promedios de Tukey, se identificó la cepa Ag A-041 de Tribunas Córcega,

Risaralda como la más patogénica al obtener el mayor valor promedio de ABCPE sobre

las diferentes accesiones de aguacate. La cepa Ag A-003 de Rionegro, Antioquia presentó

diferencia estadística respecto a la cepa testigo Ag A-000 indicando que si tuvo un nivel

de patogenicidad pero con un valor menor de ABCPE frente a la cepa Ag A-041 (Tabla 6).

Este resultado comprobó las observaciones realizadas del ensayo donde se evidenció que

la cepa Ag A-003 no registró una alta patogenicidad sobre las accesiones de aguacate

evaluadas.

Tabla: 6 Niveles de patogenicidad de 2 cepas de Phytophthora cinnamomi sobre aguacate y cepa testigo (agar más agua).

Agrupamiento Tukey Promedio Cepa

A 4,086 Ag A-041 B 0,741 Ag A-003 C 0,000 Ag A-000

La diferencia significativa estadística presentada entre accesiones de aguacate indica que

los genotipos expresaron diferentes respuestas al patógeno representada por valores

promedios de ABCPE.

5.7 Respuesta de las accesiones criollas de aguacate a las cepas de P. cinnamomi

De acuerdo con el análisis de comparación de medias de Tukey, de las 21 accesiones de

aguacate evaluadas, 5% presentaron un alto nivel de resistencia. La accesión NATU-001

del departamento de Nariño, municipio de Tumaco, fue la que mostró los valores de

ABCPE más bajos entre las accesiones a las cepas de P. cinnamomi evaluadas. Cinco por


ciento (5%) de las accesiones mostraron resistencia, 23% con resistencia intermedia, 57%

presentaron baja resistencia, 5% mostraron ser susceptibles y 5% muy susceptibles,

siendo la accesión de aguacate QUIQUI-030 de Quimbaya, Quindío, la más afectada,

registrando los más altos valores de ABCPE (Tabla 7). El cultivar Hass reportado como

susceptible al patógeno en Colombia, presentó el segundo promedio más alto de ABCPE

seguido de la accesión CARO-019 de Rosas, Cauca, seguido del portainjerto Topa-topa

reportado en EE.UU. como susceptible. Lo anterior ha permitido demostrar que la

metodología de infección con herida al tallo en aguacate es un procedimiento de

evaluación indirecta válido para caracterizar la respuesta genética a P. cinnamomi.

El material que registró la mayor resistencia, NATU-001, fue colectado en el municipio de

Tumaco, Nariño (Tabla 4), en la costa pacífica de Colombia a 25 m.s.n.m. con una

temperatura promedio de 29ºC con oscilaciones entre 16 y 33ºC, humedad relativa

promedio de 83,86%, precipitación de 2.792mm por año, topografía relativamente plana

favoreciendo sobresaturación e inundaciones del terreno. El municipio se caracteriza por

un clima cálido húmedo característico del bosque húmedo tropical (BHT), condiciones

ideales para el desarrollo y posible infección de plantas de aguacate por P. cinnamomi.

Esta condición ambiental descrita, la convierte en un área con potencial para colectar

plantas resistentes al problema de la pudrición radical. La condición alógama de la planta

de aguacate genera mayor variabilidad genética que propicia la aparición de individuos con

diferentes niveles de resistencia. Esto se evidencia con la accesión NATU-002 que a pesar

de haber sido colectada en la misma zona agroecológica que la accesión NATU-001

presento una baja resistencia en el presente ensayo.

La accesión CANO-008 reportada por Jaramillo et al. (2009) como material resistente fue

utilizada en el presente ensayo como testigo resistente registrando el segundo valor más

bajo de ABCPE confirmando así los resultados previos. Esta accesión fue colectada en el

municipio de Norcasia, Caldas a 551 m.s.n.m. con una temperatura media anual de 25ºC,

precipitación promedio anual de 3.675mm, humedad relativa ambiental promedio de

76,76%. Norcasia registra clima cálido que se caracteriza por fuertes lluvias en cortos

tiempo, generando un ambiente óptimo para la aparición de P. cinnamomi en cultivos de

aguacate, ambiente que favorece la diversidad biológica del patógeno así como la


interacción con los individuos de la población de aguacate y toda la variabilidad posible en

la región. Dichas condiciones ambientales son ideales para una alta producción de

esporangios y liberación y movimiento de las zoosporas por las altas precipitaciones de

estas zonas que favorecen el traslado de las propágulos del patógeno entre raíces de

árboles infectados a raíces de plantas sanas a través de medio liquido (exceso de agua de

lluvia) (Andrade-Hoyos, 2012). De acuerdo a lo anterior los materiales NATU-001 y CANO-

008 fueron colectados de zonas de alta humedad con temperaturas promedios entre 25 y

29ºC. El anterior escenario abre la posibilidad de identificar portainjertos de aguacate

criollos resistentes al problema de pudrición radical para cada zona agroclimática

productora en Colombia, debido al proceso de adaptación al cual se han sometido las

plantas en cada región o zona agroclimática.

Es importante destacar que la colecta y evaluación de plantas escapes (plantas

sobrevivientes a muertes por pudrición radical en zonas de BHT) son consideradas

potenciales como estrategia que permite identificar portainjertos promisorios al manejo de

la pudrición radical por presión de cepas severas de P. cinnamomi diferentes a las

estudiadas.


Tabla: 7 Niveles de resistencia de 21 accesiones de aguacate del Banco de Germoplasma de CORPOICA C.I. Palmira a 2 cepas de Phytophthora cinnamomi.

NIVEL DE RESISTENCIA

GENOTIPO DE AGUACATE

ABCPE MEDIA

AGRUPAMIENTO TUKEY

Muy susceptible QUIQUI-030 2,802 A

Susceptible HASS 2,200 AB

Baja resistencia

CARO-019 2,057 ABC TOPA-TOPA 1,971 ABC BOCA-021 1,884 ABC CEPU-008 1,786 ABC NATU-002 1,716 ABC SACA-017 1,684 ABC MASA-031 1,603 ABC TOMA-003 1,593 ABC HUSO-004 1,535 ABC VARO-002 1,498 ABC VARO-006 1,428 ABC SACA-014 1,420 ABC

Resistencia intermedia

QUITE-027 1,398 BC CAVI-041 1,394 BC VAPA-062 1,371 BC MEVI-002 1,316 BC VABU-014 1,312 BC

Resistente CANO-008 1,057 BC

Alta resistencia NATU-001 0,760 C

La interacción cepa por genotipo fue altamente significativa, lo cual según Vallejo y Estrada

(2013) se identifica como resistencia vertical, donde la interacción diferencial entre las

variedades del hospedero (accesiones de aguacate para este caso) y las razas del

patógeno (cepas de P. cinnamomi) determinan la resistencia vertical controlada por un solo

gen (resistencia monogénica). La infección negativa de la cepa testigo indica que el método

de inoculación se realizó adecuadamente ya que no se presentó sintomatología

fitopatológica en las plantas testigo.

La diferencia altamente significativa en el tiempo para ABCPE indica que el avance de la

enfermedad fue creciente en el tiempo según los resultados. Así como se presentó

interacción Cepa*Genotipo, también se registró interacción de Cepa*Tiempo,

Genotipo*Tiempo y Cepa*Genotipo*Tiempo. Lo anterior demuestra que el avance de la


enfermedad depende de la cepa y es progresivo a medida que avanza el tiempo. Tanto

para cepa como para genotipo se observó avance de la enfermedad de forma variable en

función del tiempo.

Al evaluar la cepa Ag A-041, el genotipo NATU-001 registró el menor valor de ABCPE,

mientras que QUIQUI-030 el de mayor valor (Figura 17, Anexo G). Por otra parte, la cepa

Ag A-003 registró valores de ABCPE 90% menores que la cepa Ag A-041 demostrando

que el genotipo con mayor avance de la enfermedad fue el cultivar Hass, evaluado como

testigo susceptible en este ensayo (Figura 18, Anexo I) y la accesión NATU-001 con el

menor valor de ABCPE. La cepa Ag A-000, testigo sin patógeno, no presentó ABCPE para

ninguno de los genotipos de aguacate, evidenciando que la inoculación se realizó con

todas las medidas asépticas necesarias para garantizar un adecuado ensayo

disminuyendo el error experimental (Figura 17 Y 18, Anexo H).

Figura: 17 Niveles de resistencia de 6 accesiones de aguacate a la cepa Ag A-041 de Phytophthora cinnamomi según el ABCPE y respuesta de tratamiento testigo con la cepa Ag A-000.




Ag A-000.

Debido a la alta variabilidad genética en P. americana, acentuado por su comportamiento

dicogámico se sugiere colectar la mayor diversidad posible de plantas con atributos

superiores de resistencia a la enfermedad pudrición radical del aguacate para ser

evaluados con cepas agresivas de P. cinnamomi.

Es importante analizar y discutir la importancia de los materiales criollos antillano, que se

desarrollan bajo condiciones ambientales de BHT con temperaturas entre 18 y 26ºC, de 0

a 800 m.s.n.m., alta humedad relativa y precipitación por encima de los 1.000mm anuales

(Bernal et al., 2008). Las condiciones anteriores favorecen la infección por P. cinnamomi y

a su vez la selección natural de materiales resistentes a la enfermedad causada por este

oomyceto.

Según Girard (1986) apud. Sandoval et al. (2010) y algunos autores Bernal et al. (2008),

la raza antillana tiene su origen en las mesetas bajas de la costa norte Colombiana en


estribaciones de la Sierra Nevada de Santa Marta desde donde fue llevada a las Antillas,

sitios que fueron visitados en la colecta. Con los avances suministrados en este estudio se

logró demostrar la importancia de las colectas de individuos “escapes” que permita en el

mediano plazo contar con portainjertos con resistencia a la enfermedad pudrición radical

del aguacate y así contribuir al desarrollo competitivo del sector aguacatero del país.

6. Conclusiones y recomendaciones

6.1 Conclusiones

• Existe amplia diversidad genética en el Banco de Germoplasma de aguacate de

CORPOICA C.I. Palmira, caracterizada a través de descriptores morfológicos cualitativos

para 187 accesiones de este banco.

• La técnica de infección de Phytophthora cinnamomi mediante la inoculación de

micelio con herida al tallo en plántulas injertadas (clones criollos) de aguacate, es replicable

siguiendo la metodología del presente trabajo, tomada de Jaramillo et al. (2009).

• Basados en los resultados obtenidos, el genotipo NATU-001 fue caracterizado

como muy resistente para las dos cepas del patógeno evaluadas.

• En la presente caracterización se encontraron diferentes niveles de resistencia a la

pudrición radical por Phytophthora spp. en aguacate, mediante la técnica de herida al tallo

del injerto clonado.

• Con base en los resultados obtenidos, se concluye que en el banco de

germoplasma de aguacate del C.I. Palmira, existen diferentes niveles de resistencia

genética al patógeno causante de la pudrición radical por P. cinnamomi.

• Los cultivares criollos NATU-001 y CANO-008 se destacan como muy resistente y

resistente a las dos cepas de P. cinnamomi evaluadas, posiblemente a la naturaleza

endógena o genética, al demostrarse mediante diseño experimental el avance de la

enfermedad medida como área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE), con

un nivel estadístico de significancia alto.


6.2 Recomendaciones

• Continuar las caracterizaciones del banco de germoplasma de aguacate criollo de

CORPOICA C.I. Palmira, con el fin de establecer una colección núcleo de materiales

altamente promisorios para evaluar en campo la resistencia a Phytophthora cinnamomi

Rands.

• Confrontar estos resultados mediante protocolos de infección directa a la raíz con

el fin de establecer correlaciones entre los dos métodos y evaluar la eficiencia y eficacia

de estos protocolos de infección y caracterización de genotipos de aguacate.

• Realizar este tipo de investigación con portainjertos clonados por la técnica de

etiolación con doble injertación para evaluar el posible efecto del portainjerto de origen

sexual sobre la expresión de síntomas de la enfermedad pudrición radical del aguacate.

• Evaluar nuevos cultivares de aguacate, con énfasis en razas antillanas del Banco

de Germoplasma del C.I. Palmira, conocidos como criollos, como posibles fuentes de

resistencia a P. cinnamomi.

• Estructurar un plan de colecta que permita acceder a nuevas accesiones de

aguacate, posible raza antillana, que se encuentran aún dispersas, con características

sobresalientes por su resistencia a P. cinnamomi.

• Evaluar en campo y bajo diferentes condiciones el comportamiento de los cultivares

evaluados en la presente investigación a fin de corroborar la expresión de síntomas y el

desarrollo de la copa y patrón.

• Evaluar métodos directos de inoculación por infección a la raíz, con las mismas

cepas, a fin de correlacionar los protocolos de infección.

• Se sugiere clonar los genotipos de aguacate mediante la técnica de etiolación con

doble injertación (EDI), que permitan garantizar la identidad genética de los materiales.

Conclusiones y recomendaciones 63

• Incluir las cepas de P. cinnamomi colectadas para trabajos relacionados al banco

de germoplasma de microorganismos de CORPOICA para garantizar una adecuada

conservación.

Anexos:

Anexo: A Ubicación de la procedencia de los genotipos de aguacate y vivero de injertación y desarrollo de la evaluación.


Anexo: B Distribución de las 21 accesiones de aguacate de acuerdo al diseño experimental en BCA con arreglo factorial en Parcelas Subdivididas.

Anexos 67

a) Implementos: punta, bisturí,

mechero, toallas papel,

alcohol.

c) Corte en bisel.

Herida superficial.

c) Cortar discos

de agar con

micelio de

6mm.

d) Inocular disco de

agar con micelio

en herida del tallo.

f) Cubrir herida con disco

de agar y micelio con

cinta parafilm.

h) Monitoreo de

avance de la

enfermedad cada

2 días.

j) Medición de largo

y ancho del

progreso de la

enfermedad.

Anexo: C Diagrama del proceso de infección con micelio mediante la técnica de herida al tallo.


Conglomerado(1) Conglomerado(2) Conglomerado(3) Conglomerado(4) Conglomerado(5)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Distancia

42

70200010

70200087

70200145

70200188

70200080

70200122

70200124

70200130

70200144

70200006

70200036

70200055

70200031

70200046

70200030

70200040

70200041

43

70200019

70200034

70200044

70200067

70200090

70200149

70200120

70200135

70200050

70200115

70200111

70200152

70200168

70200064

70200150

70200154

70200077

70200079

70200088

70200143

70200155

70200157

70200184

70200001

70200005

70200059

70200167

70200071

70200074

70200189

70200020

70200094

70200171

70200052

70200134

70200138

70200141

70200063

70200069

70200083

70200179

70200002

70200016

70200003

70200065

70200004

70200032

70200169

70200183

70200011

70200153

70200166

70200082

70200147

70200057

70200101

70200119

70200056

70200100

70200113

70200159

70200156

70200165

70200012

70200015

70200029

70200033

70200037

70200014

70200013

70200027

70200045

70200023

70200038

70200039

70200060

70200140

70200131

70200051

70200018

70200126

70200129

70200024

70200078

70200117

70200170

70200025

70200105

70200086

70200118

70200054

70200158

70200177

70200096

70200123

70200136

70200137

70200151

70200017

70200070

70200116

70200107

70200072

70200109

70200125

70200061

70200106

70200068

70200075

70200180

70200097

70200127

70200066

70200099

70200161

70200104

70200084

70200092

70200095

70200062

70200186

70200103

70200073

70200173

70200093

70200163

70200176

70200175

70200139

70200182

70200076

70200081

70200181

70200133

70200089

70200148

70200178

70200128

70200164

70200007

70200110

70200185

70200091

70200112

70200172

70200142

70200146

70200160

70200162

70200009

70200132

70200187

70200098

70200121

70200008

70200049

70200114

70200021

70200085

70200026

70200048

70200035

70200047

70200058

70200022

70200174

70200053

70200028

Accesión

Ward

Distancia: (Euclidea)

Conglomerado(1) Conglomerado(2) Conglomerado(3) Conglomerado(4) Conglomerado(5)

Anexo: D Clasificación jerárquica de 187 accesiones de aguacate del Banco de Germoplasma de CORPOICA C.I. Palmira obtenido a partir de análisis de correspondencia múltiple (ACM).

Anexos 69

20

22

24

26

28

30

32

Te

me

ratu

ra (

°C)

Fechas de evalaución del ABCPE

Temperatura (°C) registradá durante la evaluación del ABCPE

Anexo: E Registro de Temperatura (cada 30 minutos) durante el periodo de las evaluaciones.

Anexo: F de Humedad relativa (cada 30 minutos) durante el periodo de las

evaluaciones.


Anexo: G Niveles de resistencia de 21 accesiones de aguacate a la cepa Ag A-041 de

Phytophthora cinnamomi según el ABCPE.

Anexo: H Niveles de resistencia de 21 accesiones de aguacate a la cepa Ag A-003 de Phytophthora cinnamomi según el ABCPE.

Anexos 71

Anexo: I Niveles de resistencia de 21 accesiones de aguacate a la cepa Ag A-000 de Phytophthora cinnamomi según el ABCPE (cepa testigo agar más agua).

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