Universit de Constantine III Facult de Mdecine PR Bensmail Dpartement de PharmacieLaboratoire de Chimie Analytique 6me Anne

DEMARCHE METHODOLOGIQUEEN ANALYSE PHARMACEUTIQUE

Constantine les 5 et 7 Mars 2013 Dr B.ACHOUR-BOUAKKAZI) INTRODUCTION

II) RAPPEL DES METHODES ANALYTIQUE 1) Mthodes danalyses chimiques 2) Mthodes danalyses instrumentales

III) CHOIX DUNE METHODE ANALYTIQUE

III1) METHODES DIDENTIFICATION a) Matire premire b) Milieux biologiques

III2) METHODES DE DOSAGE a) Matire premire b) Formes pharmaceutiques (produit fini) c) Milieux biologiques

I-INTRODUCTION -La chimie analytique est une science fondamentale, elle regroupe les mthodes en analyse chimique qualitative et quantitative. Lanalyse chimique a fait preuve de beaucoup dinnovations, avec lautomatisation des mthodes analytiques utilisant des instruments trs puissants et trs performants en sensibilit et spcificit. Pour conseiller la meilleure mthode afin de rsoudre le problme danalyse, il existe une science appele chimiomtrie.La chimiomtrie regroupe lensemble des mthodes dexploitation (statistiques) pour rsoudre le problme pos en sappuyant sur loutil informatique.Elle cherche a apport une rponse correcte par exploitation des rsultats afin de rduire le nombre dessais pour les analyses longues et couteuses.La chimie analytique englobe donc lanalyse chimique et la chimiomtrie.En effet des mthodes danalyses fiables sont requises pour assurer la conformit avec la rglementation nationale et internationale dans tous les domaines danalyse et celui du domaine pharmaceutique. Le laboratoire danalyse doit prendre les dispositions appropries pour sassurer quil est en mesure de fournir les donnes de niveau de qualit requis par lutilisation de mthodes valides en respectant les critres de validation. Rptabilit Reproductibilit Spcificit Linarit Robustesse Limite de dtection et de quantification

I) Rappel des mthodes analytiques:

Mthodes chimiques danalyse Mthodes instrumentales danalyse

1) Mthodes chimiques danalyse: Elles sont caractrises par leur simplicit, leur rapidit de mise en uvre et un faible cot du matriel. Elles sont dcrites dans la pharmacope et appliques aussi bien pour les matires premires que pour les formes pharmaceutiques simples. On distingue:

Mthodes protomtriques Mthodes doxydorductions Mthodes complxomtriques Mthodes par prcipitations Mthodes de dosage par paires dions Ces techniques manquent de spcificit et sont difficilement applicables aux mlanges complexes sans extractions pralables des constituants doser. Mais elles ont toujours leur place parmi les mthodes actuelles des diffrentes pharmacopes.

a) Protomtrie en milieu aqueux et non aqueux: - Il sagit de ractions acide/base selon la dfinition de Bronsted mettant en jeux des protons do le nom de protomtrie.La protomtrie est une mthode bien adapte aux matires premires, et adaptable dans certains cas au produit fini (forme pharmaceutique). Elle reste actuellement une mthode de base pour le contrle de la matire premire dans lindustrie pharmaceutique.La mthode est dcrite dans la pharmacope franaise, dans la pharmacope europenne et dans dautres pharmacopes. On distingue deux grands types de protomtrie: Protomtrie en milieu aqueux = sapplique essentiellement aux acides et bases minraux (gnralement forts en milieux aqueux). Peu de molcules organiques dintrt pharmaceutique peuvent tre doses par ces mthodes (acide/base organiques faibles).Le point de fin de titrage est dtermin soit par les indicateurs colors, soit par potentiomtrie. Protomtrie en milieux non aqueux = met en jeux des ractions acide/base dans des solvants autres que leau. Elle sera mise en uvre quand: le compos doser est insoluble dans leau la force de lacide ou de la base est trop faible pour tre dos en milieu aqueux. Mlange de polyacides ou polybases Elle ncessite un bon choix du solvant (solvants peu toxiques et peu chers) Exemple: le benzne permet le dosage des bases organiques mais il est peu employ cause de sa toxicit

b) La complxomtrie = est une des mthodes volumtriques les plus utilises, en particulier pour le dosage des matires premires pharmaceutiques. Elle est largement dcrite dans la pharmacope pour la dtermination du titre des sels de mtaux bivalents ou trivalents soit par mthode directe, soit par retour.

En analyse qualitativeelle est utilise pour:

Lidentification de ligands dans les essais limites des matires premires (recherche dimpurets). Comme ractions didentification dune matire premire

En analyse quantitative: la formation de complexes peut donner lieu de trs nombreuses exploitations quantitatives.

dosages complxomtriques ou complxonomtriques utilisant E.D.TA, Na2 ou complexon III dans les mthodes volumtriques pour la dtermination des sels de mtaux bivalents ou trivalents, soit par mthodes direct ou par mthodes en retour. Dosages spectroscopiques: lorsquun complexe est fortement color, il peut tre exploit dans un dosage colorimtrique Exemple dosage du Fer (Fe2+) Les mthodes complexomtriques sont aussi prcises que la spectroscopie dabsorption atomique S.A.A, mais beaucoup moins spcifique et sensible.La complxomtrie est prfre parfois la S.A.A pour des raisons de simplicit et du cot du matriel.c) Mthodes doxydorduction = un grand nombre dapplications simples, prcises et dont la mise en uvre est gnralement peu couteuse. Les diffrentes techniques couramment utilises sont: La manganimtrie utilisant le pouvoir oxydant du permanganate du potassium KMnO4. Exemples dapplications: Dosage des sels ferreux et sels ferriques Dosage de leau oxygne Dosage des sucres rducteurs (mthode de Bertrand) trs utilise en bromatologie

La chromimtrie = utilisant le pouvoir oxydant du bichromate de potassium K2Cr2O7 cest une technique connue pour le dosage de lthanol (Mthode de Cordebard)

Lhalognomtrie : comprend lensemble des mthodes qui utilisent les proprits oxydorductrices des principaux halognes (chlore, iode, brome, ) chloromtrie, iodomtrie, bromomtrie

Periodimtrie. Comprend lensemble des mthodes de dosage utilisant les proprits oxydantes du systme oxydorducteur I+7/ I+5

Ces techniques sont peu spcifiques, ce qui limite leur emploi au contrle des matires premires. En effet dans le cas dun mlange de constituants (produit fini, milieu biologique), il est prfrable dutiliser une mthode danalyse plus spcifique.

2) Mthodes instrumentales danalyse:

a) Mthodes chromatographiques: ce sont des mthodes de sparation, didentification, et de dosage.Principe gnral: il est bas sur la rpartition des substances du mlange analyser entre deux phases, lune mobile et lautre stationnaireLa phase mobile peut tre: liquide et on parle de chromatographie en phase liquide. un gaz et on parle de chromatographie en phase gazeuse. Un fluide supercritique et on parle de chromatographie en phase supercritique. Couple des systmes de dtection trs puissants, la chromatographie est trs utilise en analyse pharmaceutique: Matires premires Produits finis Surtout le dosage des mdicaments dans les milieux biologique (sang et urine)

Les diffrentes techniques de chromatographie:

La chromatographie sur couche mince (C.C.M) ou appele aussi chromatographie planaire. Utilisant des plaques sur laquelle est dpose la phase stationnaire en une couche trs mince.La rvlation ou la dtection des substances se fait sur la plaque, il sagit dune chromatographie par dveloppement.Chaque substance est caractrise par son facteur de retardement ou facteur de rtention Rf mesur directement sur la plaqueLidentification dune substance se fait en comparant son Rf avec le Rf dune substance de rfrence (talon).

La C.C.M est trs utilise pour lidentification et la dtermination de la puret de la matire premire.( mthode pharmacope)Utilise aussi pour la dtection des mdicaments dans les milieux biologiques (toxicologie)

La chromatographie en phase gazeuse C.P.G: Cest une mthode de sparation sur colonne, utilise pour les substances volatiles ou volatilisables vhicules par un gaz inerte appel gaz vecteur.Les applications de la C.P.G sont nombreuses. Dans le domaine pharmaceutique elle est utilise en analyse qualitative et quantitative

En analyse qualitative: les grandeurs de rtention volume ou temps de rtention sont caractristiques dune substance; elles peuvent tre utilises dans un but didentification. - pour vrifier la puret de certaines matires premires.-Sparation des mdicaments dune mme famille en toxicologie. En analyse quantitative: lanalyse quantitative est base sur la mesure de la surface du pic enregistr puisquelle est proportionnelle la quantit de substance lue.Du fait de sa sensibilit, la C.P.G a permet le dveloppement des dosages des mdicaments surtout dans les milieux biologiques

Plusieurs types de dtecteurs peuvent tre utiliss, de sensibilit et spcificit variables.On peut citer comme dtecteurs: Lionisation de flamme (FID: flamme ionisation detector) le plus utilis Le catharomtre Capture dlectrons Dtecteur thermoonique Avec lutilisation des colonnes capillaires trs performantes, et le couplage avec dautres mthodes danalyse comme: La spectromtrie de masse C.PG/Masse La spectromtrie Infrarouge C.P.G/IR A permet les identifications complexes. La chromatographie en phase liquide = cest la plus ancienne des mthodes chromatographiques. ( exprience de Mickael Tswest = sparation des pigments colors par lther de ptrole utilis comme phase mobile sur une colonne remplie de carbonate de calcium qui constitue la phase stationnaire) do le nom de chromatographie: chroma du grec signifie couleur.

Avec lutilisation de phases stationnaires de fine granulomtrie diamtre des grains environ 3um, et les pompes puissantes. La chromatographie liquide a chang de nom est devenu: Chromatographie liquide haute pression ou haute performance C.L.H.P (en Franais), High performance liquid chromatography H.P.L.C (en Anglais)

Les systmes de sparation les plus courants qui sont mis en uvre sont: Adsorption: la phase stationnaire est solide Partage classique ou mode normale: utilisant une phase stationnaire liquide polaire et une phase mobile apolaire. Polarit de phase inverse ou reversed phase(R.P) : dans ce cas la phase stationnaire liquide est apolaire et la phase mobile est polaire. 75% des sparations sont ralises en mode inverse utilisant des colonnes R.P contenant des phases stationnaires greffes formes de longues chaines de carbone. EX: colonne R.P C8 et R.P C18 Les dtecteurs utiliss en chromatographie liquide:

Spectrophotomtre UV/Visible= aprs les dtecteurs longueur donde fixe (254 ou 280 nm), lapparition sur le march de spectrophotomtres longueur donde variable (de 190 700 nm) a considrablement tendu leur domaine dapplication; ils restent cependant des dtecteurs spcifiques dont la rponse dpend essentiellement de labsorptivit du solut (application de la loi de Beer-Lambert)

Spectrofluorimtre= destin au dpart aux composs fluorescents, le champ dapplication de ce dtecteur sest dvelopp grce aux ractions chimiques de drivation pr ou post colonne laide de marqueurs fluorescents.

Dtecteur lectrochimique= ce type de dtection, qui ne sapplique quaux substances oxydables ou rductibles sest extrmement popularis ces dernires annes. On peut citer le dosage des catcholamines.

-La chromatographie en phase supercritique CPS: Complmentaire des chromatographies en phase liquide et gazeuse: La CPG exige la volatilit et la stabilit thermique des soluts; LHPLC labsence de dtecteur aussi universel et sensible que le dtecteur ionisation de flamme Phase mobile(CO2):peu couteux, atoxique, ininflammable, bon pouvoir solvant, sans odeur -La chromatographie ionique: est lvolution moderne de la chromatographie par change dions. Son principe est fond sur les proprits des rsines changeuses dions qui permettent une fixation slective des anions ou des cations prsents dans une solution. La chromatographie ionique est considre comme la mthode de rfrence en matire de dosage des espces ionique. Cette mthode sapplique aussi bien aux anions quaux cations conjugus des protolytes forts mais elle est cependant, actuellement surtout utilise pour doser les anions minraux difficiles dterminer par les autres procds chromatographiques:Chlorures, nitrates, phosphates et sulfates en hydrologie par exemple. b) Mthodes lectrochimiques: Les mthodes lectrochimiques mettent en jeu des ractions lectrochimiques, c'est--dire des ractions o il existe un change dlectrons entre un conducteur ionique (la solution) et un conducteur lectronique (une lectrode). Les mthodes lectrochimiques sont utilises pour le contrle de la matire premire (protomtrie en milieu aqueux et non aqueux) et dans les mesures prcises de pH. La mesure du pH: paramtre trs important qui caractrise la puret dune substance, une valeur anormale du pH est lindice de la prsence dune impuret. On distingue: les mthodes indicatrices = Polarographie Ampromtrie Potentiomtrie Coulomtrie

Les lectrodes slectives = elles permettent la mesure dune espce dans un mlange sans prparation. La dtection peut tre ampromtrique ou potentiomtriquec) Mthodes instrumentales spectrales: de nombreuses mthodes analytiques sont fondes sur les interactions entre la matire et une radiation lectromagntique. Le phnomne exploit en analyse datomes ou de molcules, est labsorption de la radiation ou la restitution sous forme de lumire de lnergie absorbe.Les mesures sont ralises aussi bien sur un liquide que sur un solide (spectromtrie dabsorption ou dmission molculaire) ou sur une vapeur atomique produite dans une flamme ou dans un four (spectromtrie dabsorption ou dmission atomique).

-Spectrophotomtrie UV/VISIBLE: -Son domaine spectral est compris entre 50 800nmZone comprise entre 50 200nm (UV lointain) ce domaine nest pas utilis en pratique car lnergie est trop importante. Zone comprise entre 200 400nm (UV proche). Lnergie reste leve, on observe soit des transitions lectroniques, soit des ractions photochimiques.Zone comprise entre 400 800nm (visible).

La Spectrophotomtrie UV/VISIBLE est utilise en analyse qualitative et quantitative Application qualitative: identification dune matire premire par la dtermination de labsorbance spcifique dune substance.Elle nest pas parfaite comme mthode didentification

Application quantitative = dosage bas sur la loi de Beer- Lambert qui relie labsorbance la concentration de la substance doser une longueur donde donn

Utilisation de la technique UV/VISIBLE comme dtecteur aprs sparation par chromatographie liquide H.P.L.C H.P.L.C/UV/Visible classique H.P.L.C/UV/Visible barrettes de diodes H.P.L.C/D.AD qui est la plus utilise actuellement en raison de sa puissance de dtection. Toutes les longueurs dondes de 200 800 nm peuvent tre analyses simultanment en quelques secondes. Nouvelles applications de la spectroscopie UV/VISIBLE Analyse multi composants Spectromtrie drive

-Spectrophotomtrie Infrarouge: On distingue habituellementtrois rgions: Linfrarouge lointain, allant approximativement de 420 20 cm-1Linfrarouge moyen, allant approximativement de 4300 420 cm-1Le proche infrarouge plus nergtique allant approximativement de 12800 4300 cm-1 La Spectrophotomtrie infrarouge est inscrite la pharmacope, Les applications de linfrarouge sont quotidiennes dans les laboratoires de recherche qui doivent identifier des substances organiques de synthse. Cest une mthode intressante qui sajoute lUV, la R.M.N et la spectromtrie de masse. En analyse qualitative elle permet lidentification des matires premires ou dun toxiqueElle est base sur la comparaison du spectre de la substance avec celui dcrit dans les tables de spectre. Les appareils rcents comportent en mmoires une bibliothque de spectre de produits les plus courants et la comparaison entre la substance et le produit talon est ralise sur cran cathodique. De nouveaux dveloppements de la technologie dans le domaine de lindustrie pharmaceutique permettent daugmenter considrablement le rle de linfrarouge pour lidentification des matires premires.

- Spectrophotomtrie dmission atomique S.E.A = photomtrie de flamme

S.A.A flamme- Spectrophotomtrie dabsorption atomique S.A.A S.A.A four Ces mthodes sont bases sur lexploitation des spectres de raies mis par les atomes ayant subi une excitation suffisamment nergtique pour obtenir une variation de lnergie des lectrons et essentiellement de ceux qui se trouvent sur les couches les plus extrieures (lectrons de valence). La S.E.A, qui sintresse aux atomes ltat E1 sera utilise pour doser les alcalins dans une flamme qui na pas besoin dtre trs nergique. La S.A.A, qui concerne les atomes ltat E0, sera de porte plus gnrale. Elle permet de doser tous les lments dont la radiation de rsonance > 180 nmCes mthodes intressent de nombreux domaines: lindustrie chimique pharmaceutique et lagro-alimentaire ainsi que la biologie. Les dosages sont donc raliss dans diffrentes matrices, ce qui ncessite une mise au point adapte chaque cas.

-La Spectrophotomtrie dmission plasma

Les plasmas sont des gaz plus ou moins ionis: G G+ + e- Ils sont crs et entretenus par apport dnergie un gaz dit plasmagne au moyen dun gnrateur. Ce gaz est en gnral de largon. Les chantillons analyser sont introduits dans le plasma par lintermdiaire dune torche (torche plasma) I.C.P (inductively coupled plasma) et sont transforms en vapeur atomique ou ventuellement ionique et excits par les constituants du plasma: G, G+, e-Les tempratures atteintes dans le plasma sont leves: de lordre de 4500K 8000KII) Choix dune mthode analytique: Le dosage et lidentification de toute molcule mdicamenteuse font appel des procds analytiques trs divers dont le choix nest pas toujours facile. Il ya donc lieu avant de mettre au point ou dadapter une technique analytique plus ou moins complexe et onreuse en temps et en matriel, de bien positionner le problme rsoudre.Sagit-il dun contrle pharmaceutique? Matire premire ou produit fini Dun dosage de mdicament dans un milieu biologique (sang, urine etc) En effet la mthode sera fonction de:

1) De la composition du milieu (matrice) Dans une matire premire le principe actif est le constituant essentiel Dans une forme pharmaceutique ou produit fini (comprim, suppositoire, ou autres). Le ou les principes actifs coexistent avec des excipients et des conservateurs. Dans les milieux biologiques la matrice est plus complexe, dans ce cas le principe actif doit tre spar dabord des protines est des autres composs endogne, do la ncessit dun prtraitement de lchantillon

2) Des caractristiques des mthodes analytiques: Certaines mthodes sont plus ou moins sensibles ou spcifiques Ainsi les mthodes titrimtriques ou spectrophotomtriques seront utilisables sur des milieux limpides en labsence dinterfrences importantes. A linverse, les mthodes chromatographiques (mthodes sparatives) seront utilisables lorsquil ya lieu de sparer le principe actif P.A des substances endognes ou dautres molcules proprits voisines.

3) Des caractristiques de la molcule

Les caractres organoleptiques (aspect, couleur, odeur) de la molcule permettront dans certains cas simples son identification. Les caractres physicochimiques tels que le point de fusion, le pouvoir rotatoire, les longueurs donde dabsorption UV ou IR peuvent aider lidentification dune substance. Le caractre acide /base, la volatilit, la solubilit, la stabilit, la polarit permettent de mettre au point lextraction et le dosage de la molcule Connatre les caractristiques pharmacocintiques de la molcule va nous permettre de mettre au point son dosage dans liquides biologiques. En effet selon les mdicaments, les concentrations dans le plasma, les urines, les tissus sont trs variables.

III1) les mthodes didentificationa) Matire premire: la premire srie doprations de contrle consiste vrifier Lidentit de la matire premire rceptionne Lexamen des caractres organoleptiques qui sont dfinis par la pharmacope

Ensuite en fonction de la matire premire il faudra choisir une ou plusieurs des techniques suivantes bases sur la dtermination dune constante physique ou dune proprit chimique tel que: Le point de fusion = la temprature de fusion dune espce chimique est une constante caractristique de chaque compos dont la dtermination permet de vrifier labsence dimpurets

Le pouvoir rotatoire: cest la proprit que reprsente certaines substances de dvier le plan de polarisation de la lumire polarise en utilisant un polarimtre la pharmacope dfinit langle de rotation optique, le pouvoir rotatoire spcifique dun liquide, dune substance ou dune solution. Le pouvoir rotatoire est particulirement intressant pour lidentification des acides amins, des sucres, des composs carbone asymtrique

Lindice de rfraction: mesur laide dun rfractomtre, il permet lidentification des huiles et de nombreux liquides purs.

La densit relative: mesure grce un pycnomtre solide ou liquide.

Les indices chimiques: comme lindice dacide, de peroxyde.

Enfin, deux groupes de mthodes sont facilement ralisables pour lidentification dune matire premire mais ncessitent un chantillon pur comme talon Mthodes spectrales:En UV/Visible = dtermination du maximum dabsorption qui doit correspondre la longueur donde indiqu dans la monographie de la pharmacope.En IR on doit vrifier la superposition des bandes du spectre de la substance analyser et dune substance de rfrenceLIR ne peut pas servir de critre de puret mais cest une mthode didentification rapide et fiable

Mthodes chromatographiques:La C.C.M est une mthode spcifique et trs sensible largement utilise pour lidentification des molcules (comparaison des Rf substance et talon)

-A ct de ces techniques physiques didentification des matires premires, la pharmacope dcrit des ractions didentit des ions et des groupements fonctionnels. Le principal inconvnient rside en la prparation des nombreux ractifs ncessaires et en la complexit de certaines ractions. Il existe diffrents documents couramment utiliss pour connatre les caractres Physico-chimiques dune matire premire, on peut citer: Les pharmacopes franaises et europennes Lindex Merck Les fiches SFSTP (socit Franaise des sciences et techniques pharmaceutiques) Les fiches techniques et les dossiers techniques fournis par les laboratoires fabricants.

Critres de puret dune matire premire Aprs lidentification de la matire premire, il est ncessaire de sassurer que celle-ci nest pas contamine (rsidus de synthse en cas de purification insuffisante, produit de dgradation en cas de mauvaise conservation). Des mthodes plus ou moins spcifiques sont utilisables:

C.CM: un corps pur ne donne quune seule tche aprs rvlation. Cette mthode trs facile mettre en uvre, permet la mise en vidence dimpurets ou de produits de dgradation.

Spectrophotomtrie UV le coefficient dabsorbance spcifique est caractristique de la substance dans un solvant dtermin. On se place la longueur donde maximale dabsorption. Labsorption mesure doit tre comprise entre deux limites dfinies par la monographie ou la fiche technique de la matire premire.

Perte de masse par dessiccation: cet essai permet de connaitre le degr dhydratation. Cest un critre important connaitre puisque la prsence deau abaisse le titre de la matire premire. Elle peut tre dtermine par diffrentes mthodes selon les indications de chaque monographie.

Essai limites des mtaux lourds: recherche des mtaux lourds en fonction de chaque matire premire. Chaque monographie indiquera le procd utiliser.

Recherche dimpurets particulires: certaines impurets particulires chaque matire premire peuvent tre recherches. Une impuret de fabrication, de dgradation. b) Mdicaments dans les liquides biologiques: dpistage toxicologique Lidentification des mdicaments dans les liquides biologiques aprs intoxication aigu est souvent complexe en effet la gamme des mdicaments identifier est vaste.Les ractions didentification doivent tre spcifiques des mdicaments et non des substances endognes. Les concentrations peuvent tre infrieures au seuil de dtection.Dans la pratique le mdicament est recherch dans le liquide de lavage gastrique, le plasma et les urines. Mais cest dans le liquide de lavage quil sera plus facile didentifier un mdicament et ce dautant que le mdicament subit des biotransformations importantes.Les mthodes utilises sont:

Identification par ractions colors: ces ractions sont spcifiques dun groupement chimique, elles seffectuent directement sur le liquide de lavage gastrique ou lurine.

Identification aprs sparation: cest la mthode la plus employeElle consiste identifier les mdicaments aprs sparation par chromatographie sur couche mince C.C.M

Identification par les mthodes immunologiques: ces mthodes dveloppes pour le dosage des mdicaments ont t appliques aux recherches toxicologiques

Dans certains cas difficiles, on fait appel dautres mthodes comme la spectromtrie de masse couple la C.P.G ou L H.P.L.C

III2 Les mthodes de dosage On dfinit les critres analytiques fondamentaux des techniques de dosage dans les trois milieux: matire premire, produit fini, milieux biologiques Pour les matires premires: le point fondamental est la prcision: une puret doit pouvoir tre dtermine 0,1% prs.

Pour les formes pharmaceutiques: le titre du P.A doit pouvoir tre assur 5% selon la lgislation europenne en vigueur, sinon il conviendra de justifier un dpassement de ces normes Le point le plus important est la spcificit (interfrences des excipients) ainsi que la sensibilit dans certains cas.

Pour les milieux biologiques: les deux critres essentiels sont la sensibilit et la spcificit, la prcision de la mthode tant acceptable jusqu 10% environ

a) Matire premire1) Dosage des lments minraux 1,1) Cations Les alcalins: Na, K, Li, Ce, Fr, Rb Ce sont des mtaux qui, combins loxygne, forment des alcalis.Leur potentiel dionisation relativement bas, permet de les doser facilement par spectrophotomtrie dmission atomique (S.A.E) encore appele photomtrie de flammeCest la mthode la plus simple et la plus spcifique (utilisation de la raie de rsonance de llment doser). Les alcalino-terreux: Ba, Mg, Ca, Sr, RdLeur potentiel dionisation plus lev que les alcalins ne permet pratiquement pas dutiliser la S.A.E, cest pourquoi on utilise la spectrophotomtrie dabsorption atomique (S.A.A) en raison de sa prcision et de sa spcificit.On utilise aussi les mthodes complxomtriques qui sont aussi prcises que la S.A.A, mais beaucoup moins spcifiques et sensibles.La complxomtrie ncessite une bonne matrise de lapprciation du virage et le contrle du PH en utilisant des solutions tampons.Le dosage peut tre direct ou en retour. Les mtaux de transition et certains non mtauxIls correspondent dans le domaine mdical aux oligolments et certains minraux (mtaux lourds) Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ag, Cd, Sn, Bi, Pb, leur dtermination se fait slectivement par absorption atomique (S.A.A)Il ne faut pas oublier que la S.A.A dose llment et non pas ltat dionisation possible de llment (Fe2+ et Fe3+ ne peuvent tre distingus). Il faudra utiliser dautres mthodes comme (polarographie, lectrode spcifique) pour obtenir une information plus prcise sur ltat de valence. Une autre alternative pour les lments de transition est la titrimtrie soit par formation de chlate (complxomtrie), soit par oxydorduction chimique ou lectrochimique.

1,2) Anions: Dans les pharmacopes le dosage dun sel minral est soit le dosage du cation, soit le dosage de lanion.

les halognures (F-, Cl-, Br-, I-)Pour le dosage de ces anions, on utilise comme techniques: largentimtrie -Argentimtrie directe: Cl- , Br- , I- ont des produits de solubilit suffisamment faible sous forme de sels dargent pour tre doss par argentimtrie directe en utilisant le nitrate dargent 0,1N comme ractif titrant et en utilisant une dtection potentiomtrique en utilisant une lectrode dargent. -Technique de Mohr en milieu neutre pour les chlorures Cl- -Technique de Charpentier-Vohlard en milieu acide Les mthodes de Charpentier- Vohlard et Mohr permettent de doser en principe nimporte quel anion chlorure dans nimporte quel matire premire. La simplicit de la mthode de Mohr en fait la mthode de choix alors quelle nest pas toujours utilisable pour les formes pharmaceutiques (pH acide). Dans ce cas il faudra avoir recours la technique de charpentier Volhard. Dosage par lectrode spcifique: dans le cas des halognures on utilise tout particulirement llectrode spcifique fluorure pour les prparations pharmaceutiques et les milieux biologiques.

Mthodes complxomtriques: avec le nitrate de thorium pour le dosage des fluorures F-Cest la mthode de choix pour le dosage des sels fluors: simple, rapide, spcifique

Mthodes doxydorduction = simple et prcise, mais comme toutes les techniques doxydorduction, sa spcificit est trs mauvaise (interfrences des autres couples dans le dosage).

1,3) Les anions complexes: On dfinira les anions complexes par la combinaison de deux lments chargs ngativement: SO42-, NO2-, NO3-, CN-, PO43- Il est rare, en fait que ces anions soient doss lors du contrle dune matire premire. On prfre dterminer le cation correspondant (sodium, potassium) dont le dosage est souvent plus simple et plus prcis2) Dosage des molcules organiques: Les substances organiques peuvent tre dfinies comme des combinaisons molculaires formes des atomes de C,H, N, S, O et ventuellement dautres lments. Il peut sagir dacides, de bases, de molcules sans pK, de sels. Pour doser une molcule organique en tant que matire premire, lanalyste doit slectionner dans la molcule considre un groupement fonctionnel susceptible dtre mis en jeu dans une mthode de dosage rapide, simple, trs prcise. 2,1) Acides Lacidimtrie en milieux aqueux: les acides organiques suffisamment forts pour tre doss directement ou en retour en milieu aqueux sont relativement peu nombreux en pharmacie. lacidimtrie en milieu non aqueux: lutilisation dun solvant non aqueux permettant une meilleure dissolution du principe actif, Exemple Actone, thanol pralablement neutraliss.Dans ce cas le ractif titrant est une solution alcoolique ex: KOH alcoolique 0,5N 2,2) Bases Dosage en milieu aqueux: rserv aux bases fortes

Dosage en milieu non aqueux: rserv aux bases faibles on peut citer comme exemple la mthode classique de Pifer et Wollish dveloppe dans les annes 1950; sa simplicit, sa rapidit, sa trs grande prcision lon fait adopter de faon universelle et elle figure dans de trs nombreuses pharmacopes. Le principe de la mthode est le suivant: la basicit de la molcule doser est exalte par dissolution dans lacide actique; ce dernier par solvatation va librer un ion actate qui va pouvoir tre dos par un acide fort comme HClO4 0,1N. Il sagit dun dosage indirect. 2,3) Les molcules carbonyles: Aldhydes et ctones peuvent ragir de faon quantitative avec lhydroxylamineR C = O + H2NOH R C = N - OH + H2OCest une technique volumtrique simple applicable de nombreux composs carbonyls ne possdant pas dautres fonctions organiques caractristiques. 2,4) Les polyols simples: sucres, drivs du glycrol etc.. La mthode de choix cest la priodimtrie: elle est prcise, simple, reproductible, elle figure dans de trs nombreuses monographies de la pharmacope. Lorsque la priodimtrie nest pas utilisable, il reste deux solutions: Soit exploiter le pouvoir rducteur dun aldose ou dun ctose (rduction de la liqueur de Fehling) Soit dterminer le titre par polarimtrie pour les sucres possdant un pouvoir rotatoire spcifique. 2,5) Les molcules oxydorductibles: Manque de spcificit des techniques doxydorduction. Ce type de dosage est pratiqu que sil nya pas dautres mthodes disponibles. 2,6) Molcules comportant des groupements fonctionnels basiques et acides.Le meilleur exemple est lacide amin Dosage de la fonction acide: cest la mthode de Sorensen par formol-titration Dosage de la fonction basique: dosage en milieu non aqueux

2,7) Dosage des sels de molcules organiques: Beaucoup de mdicaments organiques sont salifis pour faciliter la dissolution du principe actif en milieu aqueux

Dosage des sels de bases organiques: les principaux sels de bases utilises en pharmacie sont:Les chlorhydrates, les bromhydrates, les sulfates, les msylatesLe dosage se fait par protomtrie en milieu non aqueux

Dosage des sels dacides organiques: ex actate de Zinc, gluconate de sodium dosage du cation correspondant par complxomtrie ou par absorption atomique S.A.A pour cation ( bi ou trivalent), quand le cation est monovalent il peut tre dos par photomtrie de flamme.On peut aussi doser lanion par protomtrie en milieu actique par lacide perchlorique 0,1N

3) Les formes pharmaceutiques: Dosage des minraux dans les mdicaments

1) Cations: les mthodes voques pour les matires premires (photomtrie de flamme, absorption atomique, colorimtrie, oxydorductimtrie) sont globalement applicables aux formes pharmaceutiques

1,1) Association minrales strictes, ex oligolments et certains soluts massifs Le dosage se fait par:

Complxonomtrie: lorsque les circonstances le permettent (forte concentrations, un seul cation doser) les techniques titrimtriques deviennent intressantes en raison de leur simplicit et de leur faible cot.

Dosage spectrophotomtrique: Formation de complexes colors

mission ou absorption atomique: lorsque lanalyste doit rsoudre le problme de dosage multilments dans une prparation pharmaceutique, il se tournera vers une mthode physique dmission (photomtrie de flamme) pour les alcalins et dabsorption atomique (S.A.A) pour les autres lments. Lmission atomique par plasma induit ICP = (inductive coupled plasma) 1,2) Association avec des molcules organiques = ces associations posent moins de problmes quun mlange complexe strictement poly ionique.

2) Anions Les mthodes volumtriques sont trs pratiques partir du moment o une seule espce anionique est en cause.

Les lectrodes spcifiques: peuvent tre utiles (F-, CN-, SCN-, NO2-, NO3-) mais ncessite un entretien trs rigoureux

Les mthodes doxydorduction sont dun emploi limit du fait de leur manque de spcificit. Sont utilises dans les dosages classiques des soluts dhypochlorite (Dakin, leau de javel)

La chromatographique ionique: tous les anions ainsi que les anions complexes peuvent dans certaines conditions tre doss simultanment par cette mthode La colonne utilise est une rsine changeuse danions

3) Dosage des molcules organiquesCest le problme le plus couramment rencontr lors du contrle du produit fini, la grande majorit des mdicaments relevant de la chimie organique. Lanalyste est appel dvelopper une mthode parfaitement spcifique du produit doser toutes les interfrences avec dautres principe actifs associs, excipients doivent tre vites, ceci nest pas toujours ralisable et seules les mthodes chromatographiques permettent datteindre ce but. 3,1) Les mdicaments acides = les techniques qui sont utilisessont : La protomtrie ne peut tre utilise quen milieu neutre ou quand le PH nest pas ajust pour une raison de stabilit des principes actifs. Absorptiomtrie dans lUV. La chromatographie en phase gazeuse (C.P.G) La chromatographie en phase liquide (H.P.L.C) 3,2) Les mdicaments basiques = Ce groupe constitue la majorit des mdicaments (sous forme de base et de sel de base). Les mdicaments basiques (et leur sels) peuvent tre titrs plus commodment par trois groupes de mthodes: Volumtrie en phase htrogne avec appariement de paire dions Absorptiomtrie directe dans lUV Mthode chromatographique: C.P.G ou plus souvent H.P.L.C

3,3) Les polyols (sucre)Ils peuvent tre doss: Par voies enzymatiques (glucose) Par priodimtrie Par H.P.L.C- rfractomtrie et polarimtrie

4) Liquide biologique Le dosage des mdicaments dans les milieux biologiques est le plus complexe, puisquil faut sparer le mdicament doser des substances endognes susceptibles dinterfrer et ventuellement de mtabolites. Les principaux facteurs prendre en compte sont bien sr la spcificit et la sensibilit de la mthode. Les mthodes utilises lheure actuelle pour le dosage des mdicaments sont de deux types:

Mthodes immunologiques: immunoenzymologie et immunofluorescence

Mthodes chromatographiques: La C.C.M se prte difficilement des ractions de quantification, mais possible par HPTLC (CCM haute performance) . La C.P.G et lH.P.L.C sappliquent au dosage de trs nombreux mdicaments ainsi qu leurs mtabolites. La slection entre C.P.G et H.P.L.C se fera en premier lieu en fonction des caractristiques physicochimique de la molcule doser.

BIBILIOGRAPHIE

1) Analyse pratique du mdicament D. Pradeau

2) Chimie analytique et quilibres ionique Jean-Louis Burgot

3) Mthodes de sparation (tome 2) M. Hamon

4) Chimie des solutions (tome 1) M.Hamon

5) Pharmacope Europenne 6me Edition

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