Contrôle de la Qualité des Produits de Thérapie Produits de Thérapie Cellulaire

Delphine DesjardinsService de Biothérapies

Unité de Contrôle Qualité et Diagnostic BiologiqueUPMC CNRS UMR7211-INSERM U959

GH Pitié-Salpétrière - Paris - Francedelphine.desjardins@psl.aphp.fr

Introduction

La thérapie cellulaire

� Définition : article L 1211-1 du CSP« Concerne les produits biologiques à effet thérapeutique issus depréparation de cellules vivantes humaines ou animales »

� En pratique :

3

� En pratique :« Consiste en l’injection de cellules humaines dans le but de prévenir, traiterou atténuer une maladie »

� Objectif :Greffer des cellules plus ou moins purifiées, bien caractérisées, dans unorgane ou dans un tissu cible, en quantité suffisante et dont la qualitéfonctionnelle, contrôlée au préalable, permet aux cellules de restaurer unefonction déficiente

Les Bonnes Pratiques

� Les règles de bonnes pratiques sont élaborées par l’AFSSAPS etapprouvées par arrêté du ministre chargé de la santé

� Nouvelles règles de bonnes pratiques applicables aux tissus et aux cellulesutilisés à des fins thérapeutiques :

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� Décision du 27 octobre 2010 définissant les règles de bonnes pratiquesrelatives à la préparation, à la conservation, au transport, à ladistribution et à la cessation des tissus, des cellules et des préparationsde thérapie cellulaire, Bulletin Officiel du 15 décembre 2010

� L’AFSSAPS inspecte et donne les autorisations d’activités aux Unités deThérapie Cellulaire

Présentation du service de BiothérapiesGH Pitié-Salpêtrière

Services cliniques

Unité de prélèvement et de cytaphérèse

As

Service de Biothérapies

2 unités de production

5

de cytaphérèse

Activités de l’UCQDB :

� Contrôle Qualité des produitsde thérapie cellulaire et génique

� Activité indépendante de cellede préparation

� Immunomonitoring des patientsinclus dans des protocolesthérapeutiques ou de rechercheclinique

ssurance

Qualité

UTCHRT UTCG

2 unités de production

UCQDB

1 laboratoire de Contrôle Qualité

UCQDB : Unité de Contrôle Qualité et Diagnostic Biologique

Les Produits de Thérapie Cellulaire

� Définition : règles de Bonnes Pratiques des PTC (BO 15 décembre 2010)« Cellules humaines prêtes à être utilisées à des fins thérapeutiquesautologues ou allogéniques, quel que soit leur niveau de préparation, ycompris leur dérivés, qui ne sont ni des spécialités pharmaceutiques, nid’autres médicaments fabriqués industriellement »

6

� Prépondérance des produits hématopoïétiques : les greffons de cellulessouches hématopoïétiques (CSH)

� Inclus les produits composés en tout ou partie de cellules génétiquementmodifiées (PTC-GM)

� Correspond à un produit thérapeutique fini :Produit « destiné à être greffé ou administré après une étape de validationfinale » � Préparation qualifiée (caractéristiques définies)

Activités de préparation

� Transformation physiqueRéduction de volume, désérythrocytation (incompatibilité ABO majeure),déplasmatisation (anticorps irréguliers contre les antigènes érythrocytairesdu receveur), congélation …

7

� SélectionSélection immunomagnétique

� Expansion ex vivo , différenciation

� Préparation de produits de thérapie cellulaire génétiquem ent modifiés(PTC-GM)

Le contrôle de la qualité des produits

� Objectifs :

� Caractériser la nature cellulaire du produit final

� Assurer que le produit est conforme aux spécifications attendues pour

8

� Assurer que le produit est conforme aux spécifications attendues pourrépondre aux indications thérapeutiques

� Assurer que les procédés utilisés ne modifient pas les propriétés desproduits thérapeutiques finis

� Assurer la sécurité microbiologique des produits préparés

Les PTC hématopoïétiqueshématopoïétiques

Les cellules souches hématopoïétiquesCSH

10

La greffe de CSH

� Types de greffes :� Greffes autologues � Reconstitution hématopoïétique mais pas d’effet

thérapeutique

� Greffes allogéniques � Reconstitution hématopoïétique avec effetthérapeutique dû aux cellules immunocompétentes présentes dans le

11

thérapeutique dû aux cellules immunocompétentes présentes dans legreffon

� Indications :� Déficits constitutionnels ou acquis du tissu hématopoïétique : aplasie

médullaire, hémoglobinopathies…

� Hémopathies malignes du tissu hématopoïétique : leucémies,lymphomes, myélomes…

� Tumeurs malignes solides

Prélèvement de CSH

� Sources de CSH :� Moelle osseuse

� Cellules souches du sang périphérique (CSSP) après mobilisation pardes facteurs de croissance hématopoïétiques (G-CSF)

� Sang placentaire

12

� Sang placentaire

Le contenu en cellules d’intérêt varie selon différents paramètres (origine,recueil…) : une dose minimale à atteindre a été définie selon les produits

Préparation de CSH issues du sang périphérique

13

Contrôles de qualité réalisés sur les produits hématopoïétiques

� Numération des cellules nucléées totales (CNT)

� Viabilité

14

� Numération des progéniteurs CD34+ viables

� Tests fonctionnels par culture des progéniteurs CFU-GM

� Contrôle bactériologique

A compléter par différentes analyses en fonction du contexte :� Estimation de la fraction granuleuse par marquage CD15� Marqueurs lymphocytaires T, B et NK (CD3, CD19, CD56)

Méthodes utilisées pour les contrôles de qualité

� Numération des CNT : Compteur d’hématologie

� Viabilité : Bleu Trypan et marquage par incorporation du 7-AAD dans les cellulesmortes

15

� Numération des CD34+ : Analyse en cytométrie de flux après marquage enprésence d’un étalon interne (VA directe) et de 7-AAD (CD34+ viables)

� Test CFU-GM : Sur milieu semi-solide. Incubation à 37°C en atmosphère hum ide à5% CO2 pendant 14 jours

� Contrôle bactériologique : Ensemencement en milieu d’hémoculture sur 10 jours

Viabilité cellulaire

� Méthode manuelle par exclusion au bleu Trypan

� Méthode en cytométrie de flux : marquage 7-AAD

� Principe : Marqueur de viabilité s’intercalant entre les paires de basesde l’ADN cellulaire. Molécule présentant des propriétés spectrales

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de l’ADN cellulaire. Molécule présentant des propriétés spectralesadaptées à l’analyse en cytométrie (émission de fluorescence dans lerouge profond). Les cellules viables ne sont pas marquées. Les cellulesnon viables peuvent être identifiées et exclues à partir d’un marquage 7-AAD positif.

� Intérêt : Identification de la population de cellules CD34+ viables.

Numération des cellules CD34+ (1)

� Principe : Technique de quantification simple plateau avec la trousse de numération Stem-Kit (Beckman Coulter)

� Marquage des antigènes membranaires CD45 et CD34 par immunofluorescencedirecte avec ajout de billles fluorescentes calibrées

� Association à un marqueur de viabilité (7-AAD)

� Analyse en cytométrie de flux en utilisant une méthode semi-automatisée de fenêtrage

17

� Analyse en cytométrie de flux en utilisant une méthode semi-automatisée de fenêtrageet de calcul grâce au logiciel StemCXP (Beckman Coulter)

« Les cellules CD34+ vraies expriment l’antigène CD34, exprimentfaiblement l’antigène CD45 et ont un faible SS (Side-Scatter) avec unfaible à intermédiaire FS (Forward-Scatter) caractéristiques descellules progénitrices ». D’après « The ISHAGE guidelines for CD34+cell determination by flow cytometry » Sutherland et al., J.Hematotherapy, 5 : 213-226

Région contenant les cellules CD34+ vraies

Numération des cellules CD34+ (2)

� Mode opératoire :

2. Marquage : 20’

1. Préparation de l’échantillon cellulaire100 µl d’une suspension à 20000 cellules/µl

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6. Analyse au cytomètre de flux :Acquisition de 75000 cellules CD45+

Incubation avec les anticorps couplés à un fluorochrome2 tubes essais : CD45-FITC, CD34-PE1 tube contrôle : CD45-FITC, Iso-PE

3. Lyse des hématies : 10’

4. Ajout du marqueur de viabilité 7-AAD

5. Ajout des billes fluorescentes calibrées : 100 µl

Exemple d’analyse CD34 d’une cytaphérèse fraîche (1)

[NOT ( BEADS ) AND VIABLE] Name % Gate Number Cells/µLCD34+ HPC 0.54 414 84.98

LYMPHS 13.17 10108 2074.93LEUKS 97.04 74473 15287.53

[BEADS] LegendColor Name Number

CAL 4852

19

Billes pour le calcul de la VA

Région CD34+ HPC

Cbilles = 996/µL

Logiciel automatiséCalcul la VA

Nombre de cellules CD34+ comptéesCD34/µl = x Cbilles

Nombre de billes comptées

CD34/µl = 84.88/µL

Exemple d’analyse CD34 d’une cytaphérèse fraîche (2)

� Expression des résultats : Expression en valeurs absolues et en pourcentage parmi les cellules CD45+

Numération absolue des CD34+ (cellules/µl ) =

Valeurs absolues

20

Numération absolue des CD34+ (cellules/µl ) = Résultat fourni pour la numération x facteur de dilution

Nombre de CD34+ par kilogramme de masse corporelle du patient (cellules/kg ) = Numération absolue des CD34+ (cellules/µl) x Volume de la poche (ml) x 1000

Poids du patient (kg)

Numération absolue des CD34+ (cellules/µl)% de CD34+ = x 100

Numération absolue des CD45+ (cellules/µl)

� Rendus des résultats :

Exemple d’analyse CD34 d’une cytaphérèse fraîche (3)

21

� CSSP autologue avec 2160 CD34+ viables/µl (0,52%), viabilité 7-AAD à 97%.

La dose de CD34 obtenu est de 3,37x106/kg.

2160/µl x Volume de la poche (113,8 ml) x 1000CD34/kg =

Poids du patient (73 kg)

Test fonctionnel CFU -GM (1)

� Principe : Mise en évidence indirecte des progéniteurs hématopoïétiques présentsdans l’échantillon par leur capacité à former des colonies sur milieu semi-solidecontenant différents facteurs de croissance.

� Ces facteurs permettent la prolifération et la différenciation des cellulesimmatures en divers types de cellules matures. Les colonies sont identifiées

22

immatures en divers types de cellules matures. Les colonies sont identifiéesd’après leur morphologie et leur taille et dénombrées après 14 jours d’incubation,à 37°C, en atmosphère humide à 5% CO 2.

� Le nombre de colonies CFU-GM permet d’estimer le nombre total desprogéniteurs et ainsi de définir le potentiel hématopoïétique du greffon.

Test fonctionnel CFU -GM (2)

� Mode opératoire :

Boite de pétri 35 mm

200CD34/boite/ml

23

MethoCult

H4435

Milieu de culture 3.5 ml

Dilution adaptée des cellules

(IMDM, Sigma)

350 µl IMDM + cellules

Milieu + cellules

Milieu + cellules

Milieu + cellules

Eau stérile

Boite de pétri X mm

Clonogénicité obtenue pour les différents types de greffons hématopoïétqiues

CSSP CSSP Moelle

� Résultats pour les cultures fraîches

� Clonogénicité CFU-GM = (nombre de CFU-GM/ nombre de CD34)

24

CSSP autologue

CSSP allogénique

Moelle

Moyenne 14 19 19

Écart type 7 8 7

n 400 136 42

Spécifications Rapport CFU/CD34

CSSP autologue

> 8

CSSP allogénique

> 10

Moelle > 16

Spécifications GH Pitié-Salpetrière

Évaluation des cellules granuleuses CD15+ et gestion des produits à gestion des produits à risque

Quantification des cellules granuleuses CD15+

� Quantification systématique des granuleux dans les CSP en cytométrie deflux :� CD45/SS� Marquage CD15/CD14

26

� Mise en évidence de produits de mauvaise qualité à la décongélation :� Mauvaise viabilité� Mauvais rendements en CD45 et CD34

� Corrélation avec le % de granuleux?

60

70

80

90

100% de granuleux à la congélation

Viabilité à la décongélation

Impact des granuleux sur la viabilité des greffons à la décongélation?

27

0

10

20

30

40

50

C1 C2 C3

� Le % de Granuleux est-il prédictif d’un problème à la décongélation� Les résultats obtenus sur une ampoule décongelée représentative du produit ont-ils

une valeur prédictive?

Résultats des décongélation d’ampoules

� Décongélation systématique d’une ampoule « représentative » duproduit quand granuleux >50%?� Analyse : viabilité, cytométrie , CFU

28

Viabilité

40 50 60 70 80 900

20

40

60

80

100

% granuleux

Am

poul

e dé

cong

elée

Viabilité

40 50 60 70 80 900

20

40

60

80

granuleux

Gre

ffon

déco

ngel

é

� Intérêt de décongeler systématiquement une ampoule représentative duproduit quand granuleux >50%?� Pas de corrélation entre le % CD15 et le résultat de l’ampoule

décongelée sauf quand % >70%

Impact des granuleux sur la viabilité des greffons à la décongélation?

29

� Mais un mauvais résultat sur ampoule est prédictif d’une mauvaisedécongélation (surtout si CFU=0)

� Y a-t-il d’autres paramètres qui entre en jeux dans la qualité des greffonsriches en granuleux ?

60

80

***

*

Impact du délai de traitement des CSSP riches en granuleux

30Ens

emble

des G

reffo

nsGre

ffons

PN >

5 0% J0

Greffo

ns P

N >50

% J+

1

0

20

40V

iabi

lité

Gestion des prélèvements à risque

� Définition d’un prélèvement à risque :� Granuleux >50% et délai à la congélation

� Conduites à tenir :� Décongélation systématique d’une ampoule

31

� Décongélation systématique d’une ampoule

� Si mauvaise viabilité/cytométrie et clonogénicité nulle: demande de re-prélever le patient si possible→ Le but étant d’anticiper la perte en CD34 à la décongélation

� Si elles ne peuvent pas être écartées et quand c’est possible, cespoches très riches en granuleux sont décongelées et injectéesséparément des autres poches

Validation du système analytique pour la numération des CD34+numération des CD34+

Contrôles de qualité du cytomètre avant analyse

� Vérification quotidienne de l’alignement des lasers et de la fluidique du cytomètre àl’aide des billes fluorescentes Flow-Check (Beckman Coulter)

� Calibration automatique : Assure la reproductibilité, la stabilité et la fiabilité del’analyse

Standardisation des détecteurs du cytomètre à l’aide des billes fluorescentes

33

� Standardisation des détecteurs du cytomètre à l’aide des billes fluorescentesFlow-Set (Beckman Coulter)

� Réglage des compensations des fluorescences à l’aide des cellules Cyto-Trolmarquées (préparation lyophilisée de lymphocytes ; Beckman Coulter)

� Vérification du système analytique à l’aide d’une préparation d’érythrocytes, deleucocytes et de cellules CD34+ stabilisée (BD Stem Cell Control Kit, BDBiosciences) :

� Les concentrations exactes en cellules CD34+ sont connues� Il s’agit de comparer les résultats obtenus aux valeurs cibles données par le

fournisseur = Contrôle de Qualité Interne (CQI)

Le CQI : suivi des valeurs au cours du temps

50

60

70

CD

34/µ

l

34

0

10

20

30

40

10/01

/11

24/01

/11

07/02

/11

21/02

/11

07/03

/11

21/03

/11

04/04

/11

18/04

/11

02/05

/11

16/05

/11

30/05

/11

13/06

/11

27/06

/11

11/07

/11

25/07

/11

08/08

/11

22/08

/11

05/09

/11

CD

34/µ

l

� Stabilité des réglages et fiabilité des mesures

Validation de la méthode de numération des cellules CD34 (1)

Étude de la justesse

� Répétabilité : Expression quantitative de la précision de manière intra sériel sur le même spécimen� Exemple : CSSP produit frais

� Reproductibilité : Expression quantitative de la précision de manière inter sériel sur des aliquotesd’un même spécimen � Exemple : CQI du laboratoire (BD Stem Cell Control Kit, BD Biosciences)

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d’un même spécimen � Exemple : CQI du laboratoire (BD Stem Cell Control Kit, BD Biosciences)

-11.90-8.02-2.704.723.952.40Reproductibilité (n=7)

4.902.153.52Répétabilité(n=10)

CD34/µl% CD34CD45/µlCD34/µl% CD34CD45/µl

BiaisCV en %

-11.90-8.02-2.704.723.952.40Reproductibilité (n=7)

4.902.153.52Répétabilité(n=10)

CD34/µl% CD34CD45/µlCD34/µl% CD34CD45/µl

BiaisCV en % en %

Validation de la méthode de numération des cellules CD34 (2)

Étude de la linéarité

Définition : Aptitude à fournir des valeurs mesurées qui sont directement proportionnelles à la valeurde substance dans l’échantillon

� Évaluation après dilutions successives d’un échantillon de concentration très élevée � Lignée CD34+KG-1a à 2000 CD34/µl

36

KG-1a à 2000 CD34/µl

� Les résultats obtenus permettent de vérifier la linéarité entre les dilutions effectuées et lesconcentrations calculées et de définir le domaine de mesure de la méthode

y = 1,2363x - 27,719

R2 = 0,9987

0

500

1000

1500

2000

0 500 1000 1500 2000

Valeur mesurée (CD34/µl)

Va

leu

r th

éo

riq

ue

(C

D3

4/

µl)

Contrôle externe de qualité

� Envoi d’échantillons de produits hématopoïétiques à la Direction desLaboratoires et Contrôles (DLC) de l’AFSSAPS (2 à 3 opérations decontrôle/an)

� Analyses effectuées en parallèle entre le centre producteur et l’AFSSAPS

37

� Analyses effectuées en parallèle entre le centre producteur et l’AFSSAPSet envoi des résultats à l’AFSSAPS pour comparaison :

� Détermination d’écarts éventuels entre le producteur et l’AFSSAPS

� Réalisation d’un classement à l’échelle nationale entre les laboratoiresde contrôle qualité

Objectifs du contrôle externe de qualité

� Vérifier la qualité et la sécurité microbiologique des produits

� Vérifier la validité des résultats rendus pour la méthode analytiqueutilisée et assurer la fiabilité des analyses

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utilisée et assurer la fiabilité des analyses

� Évaluer la reproductibilité inter-site et définir des repères de qualité

� Améliorer la standardisation des méthodes en vue d’élaborer desrecommandations nationales et des référentiels pour les CSH

Suivi des écarts CD34 Producteurs-AFSSAPS de 2005 à 2008

� Corrélation observée entre les résultats Producteurs/AFSSAPS : R2 = 0.96

39

Source : « Bilan 2007-2008 du contrôle externe des cellules souches hématopoïétqiues » AFSSAPS

Les PTC-GM

Ex. Modification génétique des lymphocytes T

Injection de lymphocytes T du donneur génétiquement modifiés (par transduction du gène HSV-TK) pour le traitement de la rechute d’une hémopathie maligne

après allogreffe de CSH

41

Essai thérapeutique de phase I-II

http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01086735

Le greffon de CSH : un tissu immunocompétent

42

Effets bénéfiques

Effets délétères

� La déplétion en lymphocytes T du greffon diminue le risque de GVH mais……limite aussi les effets bénéfiques des lymphocytes T ce qui peut compromettre lesuccès de la greffe

Stratégie du gène suicide : système thymidine kinase/ganciclovir

43

Analogue de la guanosine

Transduction des lymphocytes T avec le vecteur rétroviral HSV -1/TK

44

La stratégie du gène suicide pour le contrôle de la GVH

45

Runs pré-cliniques et contrôle qualité du PTC -GM

• Leukapheresis sample • J0-J4 : T -cell expansion

Production process

46

Leukapheresis Healthy donor

• Leukapheresis sample reception• Platelet removal

Cell count

Immunophenotyping: T, B, NK cell quantification

Cell count

Viability

Immunophenotyping: CD3+, CD4+, CD8+, CD25+…

• J0-J4 : T -cell expansion with CD3 + IL-2• J4 : T-cell transduction with Thy-1/TK retroviral vector• J4-J15 : T-cell expansion with IL-2

J15 : Clinical selection of Thy-1+ T cells

Cell count

Viability

Immunophenotyping: CD3+, CD4+, CD8+, CD90+ (Thy-1+)

Microbiologic control

DLI-TK cell therapy product

• Viability ≥≥≥≥ 85%• % CD3+CD90+ cell ≥≥≥≥ 96 %• Number of infused CD3+ cells ≥≥≥≥ 5x106 –5x107 cells/kg

Quality control

Transduction rétrovirale et sélection des lymphocytes T transduits CD90+

47

Run

Avant sélection Après sélection

Nbre total de cellules

(x109)

% de cellules

CD3+CD90+

Nbre total de cellules

CD3+CD90+

(x109)

Nbre total de cellules

(x109)

% de cellules

CD3+CD90+

Nbre total de cellules CD3+CD90+

(x109)

Nbre total de cellules non transduits

CD3+CD90- (x106)

1 4,42 56 2,47 1,48 99,0 1,46 10,0

2 5,60 52 2,91 1,58 99,5 1,57 7,9

3 2,54 49 1,24 0,59 99,3 0,58 4,0

Moyenne± écart type

4,2±1,5 52,3±3.5 2,2±0,9 1,2±0,5 99,3±0,3 1,2±0,5 7,3±3

Test de sensibilité au GCV des lymphocytes T transduits

Cellules Transduites

Test d'inhibition de la prolifération (thymidine) en %

Test de mortalité (Trypan) en %

Cytométrie après test de mortalité

en %

RUN 1 94 88 94

48

⇒⇒⇒⇒ Validation des runs pré-cliniques, demande d’autori sation à l’AFSSAPS

RUN 1 94 88 94

RUN 2 95 88 95

RUN 3 96 90 97

Moyenne± écart type

95±1 89±1,2 95±1,5

Caractéristiques de l’essai clinique

� Plan expérimental : Étude de phase I-II, ouverte, non contrôlée� Durée prévisionnelle : 36 mois� Suivi : 12 mois après l’injection des lymphocytes T transduits� Nombre de patients à inclure : 12

Schéma globale de l’étude

49

Schéma globale de l’étude

Critères d’inclusion

Patients atteints d’hémopathies malignes, en

rechute, ayant eu une allogreffe

antérieure

Critères d’évaluation principal :

Évaluer la faisabilité et la tolérance de l’injection de

lymphocytes T transduits

Schéma Immunomonitoring essai ILD-TK 01

Chimiothérapielymphopéniante

Prélèvement de 400 ml de sang

total du donneur

Transduction HSV-Tk

Expansion deslymphocytes T transduits

Sélection et injection des lymphocytes T

transduits5x106 à 5x107/kg

Sortie d’aplasie

JJ--1515 J-12 J-6 JJ--22 J0J0 J1J1 JxJx J15J15 M1M1 M3M3 M6M6 M9M9 M12M12

Immunomonitoring

Bilan de référence

Immunothérapies/essais cliniques à La Pitié-Salpêtrière

Treg depletionILDTREG � hematological relapseStartrek � colorectal cancer

Dendritic cell vaccinationCDREIN� cancer

50

Gene TherapyAllogreffe :GVH/GVL

Haplo-TKDLI-TK

Treg infusion or boostAuto-immune diseases

UVEREG� uveitisMYOREG�myositis