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UNIVERSITE CADI AYYAD, FACULTE DES SCIENCES SEMLALIA DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

BIOLOGIE MOLECULAIRE COURS S4 (PREMIERE PARTIE)

CONSTANCE ET VARIATION DU DNA

[ REPLICATION ET MAINTIEN ]

PROFESSEUR A. A. BENSLIMANE

2006

CONSTANCE ET VARIATION DU DNA [ REPLICATION ET MAINTIEN ]

SOMMAIRE

A. CONSTANCE DU DNA 2 I. LA REPLICATION 2

1. LA REPLICATION CHEZ LES PROCARYOTES 2 α- EXPERIENCE DE MESELSON ET STAHL 3 β- SYNTHESE DE DNA IN VITRO 6 γ-REPLICATION IN VITRO 8 δ- OBSERVATIONS DE CAIRNS 10 ε- MECANISMES GENERAUX DE LA REPLICATION 11

INITIATION 12 DEROULEMENT DU DNA PARENTAL 14 ELONGATION 15 FINITION DU BRIN RETARDE 20 TERMINAISON 20

2. LA REPLICATION CHEZ LES EUCARYOTES 21 α- CYCLE CELLULAIRE 21 β- MULTIPLES POINTS D’INITIATION 22 γ- ORIGINES ET INITIATIONS 23 δ- VERS UN MODELE DE LA REPLICATION CHEZ LES

EUCARYOTES 24

ε- REPLICATION DES TELOMERES 27 ζ- MODIFICATION POST-REPLICATION DU DNA.

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II. MAINTIEN DE L’INTEGRITE DU DNA ET REPARATION 30 1. LE MAINTIEN DE L’INTEGRITE DU DNA EST ASSURE PAR DES

SYSTEMES DE SAUVEGARDE 33

α- FIDELITE DE LA REPLICATION 33 β- SYSTEMES PREVENTIFS 34

2. LA REPARATION DU DNA EN DEHORS DE LA REPLICATION MET EN JEU DES SYSTEMES MULTIPLES

34

α- REVERSION DIRECTE DU DOMMAGE 34 β- REVERSION EN DEUX PHASES 35

PHASE 1 : Détection, suppression de l’altération 35 PHASE 2 : Remplacement du DNA altéré 36

3. ANOMALIES DES SYSTEMES DE REPARATION CHEZ L’HOMME

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CONSTANCE ET VARIATION DU DNA

A. CONSTANCE DU DNA La constance du DNA résulte de deux processus : la réplication et la réparation. Les structures, propriétés et localisations des acides désoxyribonucléiques ont été décrites en SV3. Dans ce chapitre, nous étudierons d’abord la biosynthèse du DNA, appelée aussi « réplication ». Puisque ce processus est beaucoup mieux connu chez les procaryotes que chez les eucaryotes, nous commencerons par l’étudier chez les premiers, puis le développerons chez les seconds. Nous envisagerons ensuite les phénomènes de réparation des molécules de DNA. Celles-ci doivent en effet durer aussi longtemps que les cellules qui les contiennent. Elles doivent par conséquent être réparées lorsqu’elles sont abîmées.

I. LA REPLICATION La réplication perpétue l’information génétique : Au cours de la vie de la cellule, d’une division mitotique à la suivante, le DNA doit être dédoublé pour que chaque cellule fille reçoive un génome complet identique à celui de la cellule mère de départ. Les mécanismes qui conduisent à la réplication du DNA ont d’abord été élucidés chez les procaryotes. La caractérisation de nombreux mutants conditionnels a permis de démontrer presque parfaitement la totalité du mécanisme. Le système est moins bien connu chez les eucaryotes. Cependant les résultats accumulés montrent que les mécanismes y sont très semblables.

1. LA REPLICATION CHEZ LES PROCARYOTES En même temps que leur modèle, Watson et Crick [1953] proposaient des implications fondamentales à la structure secondaire du DNA. Cette structure secondaire montre clairement qu'il existe deux "copies" de l’information génétique codée : l'une en positif, l'autre en négatif découlant l'une de l'autre par complémentarité des bases. On verra plus tard par quels mécanismes le DNA stocke toute l'information nécessaire au développement de l'organisme et par quels mécanismes cette information est exploitée pour la synthèse de l’ensemble des protéines cellulaires. Un modèle de synthèse "semi conservatif" du DNA reposant sur cette observation a été proposé et s'est avéré exact. Lorsque l'information est transmise, d'une cellule mère à deux cellules filles, les copies (positif et négatif) doivent être représentées dans les deux nouvelles cellules :

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le modèle propose que chaque copie conserve un des deux éléments du modèle (d'où l'expression semi conservative associée à cette duplication), le négatif ancien et un positif nouvellement synthétisé va être hérité par une cellule fille, le positif ancien et un négatif nouvellement synthétisé étant hérité par l'autre cellule fille.

En moins d'un an, Meselson et Stahl concevaient une expérience restée célèbre pour vérifier ces prédictions. α- EXPERIENCE DE MESELSON ET STAHL Introduction : Cette expérience date de [1958]. Elle permet de démontrer le caractère semi-conservatif de la duplication de la molécule de DNA chez les bactéries. Cette expérience a pu être réalisée grâce à plusieurs mises aux points techniques :

1 - Meselson et Stahl mettent au point une technique d'obtention de gradient de densité par centrifugation (centrifugation isopycnique). En utilisant du chlorure de Césium de densité moyenne 1,72, ils obtiennent après 24h de centrifugation à grande vitesse (ultracentrifugation) un gradient de densité (de 1,70 à 1,75), gamme qui englobe la densité moyenne du DNA (1,710). Les densités "ρ" sont exprimées en g/cm3. 2 - Ils cultivent les bactéries dans un milieu dans lequel les substances organiques utilisées comme source d'azote contiennent de l'azote lourd (15N). Au cours de la culture, toutes les molécules azotées et en particulier le DNA contiennent une forte proportion d'azote 15N. Le DNA "lourd" a une densité de 1,724 et peut être distingué du DNA "léger" (1,710). Le DNA "léger" provient de bactéries cultivées dans un milieu contenant de l’azote 14N. 3 - Ils mettent également au point une méthode qui permet de synchroniser la division des bactéries pendant quelques générations.

Le problème à résoudre :

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Depuis Watson et Crick [1953], on sait que le DNA est une molécule formée de deux brins antiparallèles, formant une double hélice. Dès leur publication originale sur la structure du DNA, Watson et Crick ont proposé que cette double hélice puisse s'ouvrir, permettant ainsi la synthèse de nouveaux brins, complémentaires des brins originaux. Le DNA peut ainsi servir de matrice à sa propre réplication, étape essentielle du cycle cellulaire. Cette duplication du DNA permet de passer de chromosomes à une chromatide à des chromosomes possédant deux chromatides identiques portant la même information génétique. Lors de la mitose, ces deux chromatides sont séparées : chaque cellule-fille héritant d'une chromatide de chaque chromosome. On obtient ainsi deux cellules possédant la même

information génétique que la cellule-mère. Le problème qui se posait à Meselson et Stahl était alors de comprendre comment se réalisait cette réplication : selon quelles modalités passe-t-on d'une molécule de DNA formée de deux brins à deux molécules de DNA bicaténaires identiques ? Les hypothèses Pour expliquer la duplication d'un DNA bicaténaire, trois modèles (a, b et c) ont été proposés. Ces modèles se basent tous sur l'utilisation de la molécule de DNA "mère" comme matrice pour sa réplication, mais selon des modalités différentes :

a- On dissocie les deux brins de la molécule de DNA biacténaire "mère". Chaque brin sert donc de matrice à la synthèse d'un brin complémentaire, l'ensemble reformant une molécule de DNA bicaténaire. Chaque nouvelle molécule "fille" ne conserve donc que la moitié de la molécule "mère".

b- A partir d'une molécule de DNA

bicaténaire "mère", on forme une nouvelle molécule de DNA bicaténaire. On garde donc ici une molécule "mère", non modifiée (elle est donc conservée), tout en "créant" une nouvelle molécule ("fille").

c- On ne conserve aucun brin intact. La

copie se réalise par fragments dispersés dans l'ensemble du DNA, permettant de former les deux molécules de DNA bicaténaires "filles".

Matériel biologique Le matériel expérimental est une cellule procaryote : Escherichia coli. Les bactéries sont en effet les cellules présentant le plus haut rendement synthétique et dans des conditions standard se divisent environ toutes les trente minutes ce qui va permettre d'accéder à plusieurs générations et donc à plusieurs cycles de réplication de l'ADN en un temps raisonnable. Expérience et résultats observés Des bactéries cultivées depuis longtemps en présence de molécules azotées 15N sont repiquées sur un milieu permettant la synchronisation des divisions et contenant des molécules azotées 14N. Des fractions sont prélevées après différents temps correspondant à 1, 2, 3, ... divisions. Le DNA est extrait, placé dans la solution de chlorure de Césium et centrifugé à 100.000 g pendant 24h. La position des DNA est repérée par une mesure de la densité optique

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Position des

différentes bandes de DNA au cours du

temps. DNA14N DNA hybride DNA15N Les chiffres donnent le

nombre de divisions (ou générations)

Après 1 génération : tout le DNA est hybride (du point de vue de sa densité). Il n'y a plus de DNA 15N. Ensuite, le DNA hybride disparaît progressivement au profit de DNA "léger" (14N). L'expérience de Meselson et Stahl montre donc la présence d'un DNA hybride au bout d'une génération cellulaire. Or, qu'attend-on pour les trois modèles proposés ?

(a) Modèle semi-conservatif (b) Modèle conservatif (c) Modèle dispersif

DNA hybride (molécules formées

d'un brin lourd et d'un brin léger)

DNA lourd (15N)et

DNA léger (14N)

DNA hybride (dispersif)

On peut donc, dès cette première observation, rejeter le modèle conservatif (b). Après deux générations cellulaires : Meselson et Stahl observent la présence de DNA hybride et de DNA léger. Ceci permet de conclure quant aux deux modèles restants :

(a) Modèle semi-conservatif (c) Modèle dispersif

DNA hybride Et

DNA léger

DNA hybride

En conclusion : Seul le modèle semi-conservatif permet d'aboutir expérimentalement aux résultats. L'expérience de Meselson et Stahl permet donc de mettre en évidence le fait que la réplication se réalise selon un mode semi-conservatif. Cette conclusion a été depuis confirmée par des études plus précises, pour aboutir au modèle actuel de fonctionnement de la réplication.

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DNA parental

Brins néosynthétisés

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Représentation schématique de la population de fragments de DNA au cours des générations.

0 1 2

Après 1 génération tout le DNA est "hybride" et constitué d'un brin "lourd" 15N et d'un brin "léger" 14N.

Quelques points importants de cette expérience sont à noter : Tout d'abord le fait qu'il est nécessaire de séparer les DNA sur un gradient permettant de mettre en évidence leurs très faibles différences de densités; une "simple" centrifugation ne suffit pas. L'utilisation d'un gradient de Chlorure de Césium est donc un point fondamental du protocole. De même, ces observations n'ont été possibles que parce que Meselson et Stahl avaient réussi à obtenir des populations de bactéries synchrones (pendant quelques générations). Très rapidement, plusieurs travaux remarquables confirment le mode de réplication du DNA et laissent entrevoir la complexité du contrôle génétique de cette biosynthèse. Dans les années [1958 à 1968], Kornberg réalise une première synthèse d'ADN in vitro et Cairns "visualise" la réplication en microscopie électronique. β- SYNTHESE DE DNA IN VITRO Les séries d'expériences réalisées par Kornberg et son groupe [1958] préfigurent la génétique moléculaire moderne et méritent que l'on s'y arrête.

Le mode semi-conservatif de la synthèse du DNA implique les éléments suivants :

• - une molécule de DNA double brin capable de servir de modèle ou de matrice, • - des désoxyribonucléotides précurseurs de la chaîne nouvelle, • - une enzyme : DNA-polymérase, capable de relier ces précurseurs, cette enzyme

(hypothétique pour l'instant) est fondamentale car non seulement elle devra assurer la liaison covalente (5'-3' phosphodiester) entre les nucléotides mais elle devra aussi être capable de "choisir" ceux-ci en fonction du modèle présent selon la règle d'appariement des bases.

Pour purifier et étudier cette enzyme, Kornberg a mis au point un système de synthèse in vitro à partir d'extraits d'abord assez grossiers d'E. coli. Comment évaluer de tels systèmes ? Comment prouver qu'une synthèse a bien lieu in vitro ? Comment distinguer le DNA néosynthétisé de celui qui est obligatoirement présent dans l'extrait comme modèle ? Kornberg va lui aussi faire appel à des marqueurs isotopiques : des nucléotides comportant des phosphores 32 radioactifs (32P), si une synthèse a lieu, elle fera appel à ces précurseurs radioactifs et le polymère résultant sera "marqué", sera radioactif et facilement repérable. D'après l'analyse des nucléotides libres présents dans le cytoplasme, Kornberg décide de choisir des nucléotides triphosphorylés en 5' alors que les constituants du DNA sont monophosphorylés et que bien souvent, l'hydrolyse de polynucléotides produit des mononucléotides phosphorylés en 3' ! On verra que sans cette décision, l'expérience était vouée à l'échec : la cellule utilise effectivement des nucléotides 5' triphosphorylés et l'énergie fournie par la libération du pyrophosphate. Dans son mélange réactionnel, Kornberg dispose de DNA modèle, de précurseurs naturels, de DNA polymérase active (il l'espère), auquel il ajoute des précurseurs radioactifs. Après la réaction, la radioactivité se trouvera partagée entre le DNA éventuellement synthétisé in vitro (en incorporant des monomères marqués) et l'excédent de précurseurs qui n'ont pas été incorporés. Il est donc essentiel d'éliminer tous ces précurseurs libres pour attribuer de la radioactivité à une macromolécule. En pratique, les macromolécules sont précipitées par adjonction d'un acide organique et les petites molécules "acido-solubles" (y compris les précurseurs radioactifs) sont éliminées par centrifugation. Le culot, après plusieurs lavages, contient les macromolécules (y compris le DNA) débarrassées de tout précurseur non incorporé dans la chaîne. En suivant la stratégie exposée et ses contraintes, Kornberg fut capable de trouver quelque radioactivité dans des fractions acido-précipitables. Radioactivité qui, à l'époque ne dépassait guère le seuil de confiance des compteurs, mais Kornberg y croyait ! Plusieurs équipes, partant de kilogrammes de pâte d'E. coli, à l'aide de méthodes d'analyse biochimique classiques de nos jours mais que l'on découvrait à l'époque, ont peu à peu concentré l'activité de la DNA polymérase jusqu'à purifier cette enzyme qui fut nommée "polymérase de Kornberg", plus connue de nos jours sous en tant que DNA polymérase I. Le bilan (provisoire) de ces expériences est le suivant :

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DNA DNA +

DNA

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Par la suite, l’isolement de mutants conditionnels thermosensibles chez E. coli a permis d’identifier les protéines jouant un rôle primordial dans la réplication. C’est ainsi que l’on a pu montrer que l’enzyme « réplicative » n’était pas la DNA polymérase I, mais la DNA polymérase III. γ-REPLICATION IN VITRO L'expérience décrite ci dessus prouve qu'une synthèse de polydésoxyribonucléotide est réalisable in vitro mais ne prouve pas que le DNA synthétisé soit conforme au modèle de départ ni que la synthèse soit une réplication semi-conservative. La suite du travail va consister à tenter la synthèse in vitro d'un DNA "biologiquement actif", l'activité biologique la plus facile à détecter étant, à l'époque, la capacité d'infection d'un DNA de bactériophageФΧ 174. Les bactériophages utilisent essentiellement, pour leur réplication, les protéines de la machinerie de leur hôte (E. coli dans notre cas) Le modèle choisi (phage ФΧ 174) correspond à une molécule circulaire d'environ 5000 nucléotides seulement ; Nucléotides et non pas paires de nucléotides car il s'agit, pour la particule phagique d'un DNA simple brin que nous appellerons le brin +. Le changement d'un seul de ces nucléotides rend la molécule inactive (non infectieuse). La réalisation d'une copie infectieuse in vitro va préfigurer la technologie du DNA recombinant : [1968 :Goulian, Kornberg et Sinsheimer].

• - In vivo, la première étape de l'infection par ce bactériophage simple brin est la synthèse d'un brin complémentaire pour réaliser une forme circulaire double brin à partir de laquelle seront reproduits des brins + qui assureront la descendance phagique.

• - Un premier problème se posa pour la synthèse in vitro d'un brin - : la DNA

polymérase purifiée ne peut qu'attacher l'extrémité 5' d'un nucléotide à l'extrémité 3' d'une chaîne en cours de synthèse, elle ne peut relier des polynucléotides et donc ne peut pas réaliser la liaison phosphodiester qui permet de circulariser un brin de DNA. Le problème a été résolu par la purification d'une enzyme qui, in vivo, remplit cette fonction : c’est la DNA ligase dont nous aurons souvent l'occasion de parler.

• Le système de réplication in vitro va donc comprendre :

o des molécules de DNA purifiées de ФΧ 174 (brin +) o les 4 désoxyribonucléotides o DNA polymérase (extraits de E. coli) o la ligase

• Problème 2 : en principe, ce système ne peut assurer que la synthèse de brins moins

circulaires complémentaires du brin plus. le brin - synthétisé in vitro n'est pas infectieux, seul un brin + peut l'être. Il va donc falloir recommencer une synthèse in vitro en utilisant les brins - comme modèles

• - Problème 3: comment séparer les brins - des brins + ? Ce problème a été surmonté

par l'utilisation d'un précurseur particulier à la synthèse du DNA : la 5-bromodésoxy uridine, cet analogue de nucléotide est utilisé par la cellule comme de la thymidine (il sera apparié aux résidus A de la matrice) mais le brome va "alourdir" la molécule de DNA qui utilise ce précurseur. La différence de densité est suffisante pour permettre la

séparation de brins + (comportant de la thymidine) de brins - (comportant de la bromodésoxyuridine) par ultracentrifugation sur un gradient de densité de CsCl.

Cette stratégie a permis de synthétiser des molécules qui vont s'avérer infectieuses : aucune erreur sur 5000 nucléotides assemblés in vitro ! Remarque 1 : Il est important d’observer que la réplication dans cette expérience est menée à bien en deux étapes successives et non pas simultannées, si bien qu’il n’est pas possible de la considérer comme un modèle du mécanisme biologique de la réplication du DNA. Remarque 2 : en fait, ce genre d’études a également permis de mettre en évidence l’intervention d’autres éléments cellulaires dans le processus de la réplication tels que la DNA polymérase III et la primase, responsable de la synthèse non seulement de l’amorce RNA à l’origine de la réplication du phage, mais aussi des fragments d’Okazaki qui seront abordés et décrits un peu plus loin.

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δ- OBSERVATIONS DE CAIRNS Cairns [1962] a été le premier à observer un chromosome entier d'E. coli en cours de réplication. Il a associé des techniques de marquages isotopiques et d'autoradiographie suivis d'observation en microscopie électronique. Après avoir cultivé des bactéries dans un milieu contenant de la thymidine tritiée à faible activité spécifique, pendant un temps dépassant la durée du cycle, il met au point une méthode de lyse de la cellule permettant de libérer le DNA directement sur une grille de microscopie électronique, en minimisant les risques de cassures mécaniques de la molécule. La préparation est recouverte d'une émulsion photographique et après exposition et développement, l'examen révèle des grains d'argent le long de la molécule de DNA. Ces premières observations ont montré la circularité du chromosome d'E.coli, forme qui s'avérera très répandue chez les procaryotes, les virus et le DNA des organites (mitochondries et chloroplastes) des cellules eucaryotes. Dans un second temps, Cairns a effectué des marquages plus courts et a déduit des images obtenues que la réplication commence en un seul point du chromosome bactérien à partir duquel se forme un « œil » qui ne cessera de grandir jusqu’à ce que deux chromosomes bactériens soient obtenus.

Origine de réplication

Fourches de réplication bidirectionnelle

Deux copies du chromosome bactérien original

Point de départ de la réplication

Fourches de réplication

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Un peu plus tard, d'autres chercheurs ont ajouté à un marquage long par la thymidine tritiée à faible activité spécifique un marquage très bref par de la thymidine tritiée à forte activité spécifique. Après autoradiographie, l'intensité des grains permet de distinguer les deux marquages. On observe alors, des sortes de "bulles". Les figures matérialisées par les grains d'argent seront appelées « fourches de réplication ».

FOURCHES

L'interprétation de ces figures va avoir un impact considérable :

• D'après l'observation de ces "fourches", il est clair que la réplication se fait simultanément à partir des deux brins anciens.

• Puisque l'on observe deux de ces fourches, c'est que la réplication est bidirectionnelle.

• Si la réplication est bidirectionnelle c'est qu'il existe une "origine de réplication".

Cette notion n'est pas que topographique, on verra qu'effectivement, seule une séquence précise de ces molécules circulaires permet le démarrage de la réplication.

Un élément quelconque d'un génome, naturel ou obtenu par génie génétique, ne pourra être répliqué (et donc transmis à une descendance) que s'il possède une origine de réplication, il sera alors considéré comme un "réplicon". Le système enzymatique responsable de la réplication fonctionne donc à partir du point d’initiation ou « origine de réplication » au niveau de deux fourches migrant en sens inverse et se rejoignant en un point opposé du site d’initiation appelé « terminus ». ε- MECANISMES GENERAUX DE LA REPLICATION Tout modèle de système de réplication doit apporter une solution à deux types de problèmes :

1- Des problèmes d’ordre topologiques, car les structures de condensation du DNA (boucles ou domaines surenroulés du chromosome bactérien) ont introduit des supertours négatifs dans le DNA. D’autre part les deux brins du DNA sont enroulés en double hélice. Il est donc impératif pour que la totalité du DNA soit répliquée, que les brins soient progressivement séparés.

2- Des problèmes de synthèse semi-conservative posés par l’orientation antiparallèle des

deux brins.

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Très rapidement, les études génétiques et biochimiques de la réplication ont montré que le mécanisme est beaucoup plus complexe que ne l'évoque la prédiction de Watson et Crick et que ne le laissent supposer les expériences de Meselson et Stahl (qui ne rendent compte de l'état du DNA qu'avant et après la réplication), de Kornberg (qui isole la réplication de son contexte cellulaire) ou de Cairns (qui fixe une image instantanée).

Tous les transferts d'information que nous allons étudier comportent trois étapes dans la synthèse de molécules informatives : le début, la suite et la fin que l'on préfère appeler les étapes d'initiation, d'élongation (de la macromolécule en cours de synthèse) et de terminaison. Des mutants pour chacune de ces étapes ont permis de les étudier en détail, c'est l'initiation qui représente certainement l'étape clé de la réplication.

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INITIATION La réplication d’un chromosome bactérien est étroitement liée au cycle de croissance. Chez E. coli, l’origine de réplication se situe à l’intérieur du locus génétique « oriC » et elle est fixée à la membrane cytoplasmique. L’oriC contient quatre sites de fixation (9 paires de bases chacun) pour la protéine initiatrice « Dna A ». La synthèse de cette protéine est liée à la vitesse de croissance.

Une fois le niveau critique de croissance atteint, la protéine Dna A forme un complexe, de 30 à 40 molécules, autour duquel le DNA oriC est enroulé. Chacune des 30 à 40 molécules se fixe à une molécule d’ATP. L’ensemble de ce processus requiert le surenroulement négatif du DNA ce qui facilite la fusion "désappariement" de trois séquences répétées de 13 pb riches en AT qui s’ouvrent pour permettre la fixation de la protéine « Dna B ». La Dna B est une DNA hélicase (appelée également déroulase) qui casse les liaisons hydrogènes qui unissent les 2 brins du DNA. Pour effectuer ce travail, de l’énergie est nécessaire, elle est fournie par l’hydrolyse d’ATP. En fait, il existe plusieurs types d’hélicases agissant de concert (Rep protéines, hélicases II et III). Les brins du DNA ainsi séparés sont stabilisés sous forme simple brin grâce à la fixation des « protéines SSB » (ou ‘single strand DNA binding’). Ces protéines sont des tétramères d’une masse moléculaire de 74 kDa. Leur fixation à la molécule de DNA est un phénomène coopératif : la fixation d’un premier tétramère sur le DNA favorise

la fixation de la protéine suivante par augmentation de l’affinité apparente, et ainsi de suite jusqu’à ce que tout le DNA passé sous forme simple brin soit recouvert de protéines SSB qui forment une sorte de manchon. Cette association rigidifie les deux brins du DNA, les empêche de se réassocier et les protège des cassures.

La synthèse de DNA par les DNA polymérases ne peut se faire que par élongation d’une amorce (primer). Cette amorce, comme l’a montré Okazaki [1968], est synthétisée par un complexe protéique appelé « primosome ». Il est constitué d’une RNA polymérase appelée « primase » codée par le gène « dnaG » et de plusieurs autres protéines qui assurent entre autres la reconnaissance des sites ou doit être synthétisée l’amorce RNA.

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DEROULEMENT DU DNA PARENTAL Pour que la réplication procède de l’origine, les DNA hélicases doivent se déplacer le long des brins matrices pour ouvrir la double hélice (500 à 1000 nucléotides par seconde ; le DNA parental doit tourner à raison de 50 à 100 tours par seconde). Cependant, dans une molécule de DNA circulaire fermée, l’enlèvement de tours hélicoïdaux au niveau de la fourche de réplication conduit à l’introduction de tours supplémentaires dans le reste de la molécule sous forme de surenroulements positifs. Bien que le surenroulement négatif naturel du DNA compense partiellement ce fait, il reste cependant insuffisant pour permettre la progression de la fourche de réplication. Le surenroulement positif, conséquent à l’avancement des DNA hélicases, doit être relaxé continuellement par l’introduction permanente de surenroulements négatifs. Ceci est assuré par des topoisomérases de typeI et II appelées aussi « DNA gyrases ».

Molécule parentale

Topoisomérase

Hélicase

SSB

SSB

Primosome

Les inhibiteurs de la DNA gyrase, tels que l’acide oxolinique et la novobiocine, sont des inhibiteurs efficaces de la réplication bactérienne et possèdent par conséquent une activité antibiotique.

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ELONGATION L’élongation d’un nouveau brin de DNA au niveau de la fourche de réplication est catalysée par la « DNA polymérase III ». Celle-ci synthétise un brin complémentaire à partir de l’extrémité 3’OH libre de l’amorce RNA en utilisant le DNA comme matrice. La synthèse se fait donc dans le sens 5’→3’. Les protéines SSB sont chassées au fur et à mesure de l’utilisation du brin matrice. Les deux brins complémentaires au DNA parental doivent être synthétisés dans le sens 5’→3’. Par conséquent, la synthèse ne peut être continue que sur l’un des deux brins : « le brin direct », « brin principal », « brin précoce » ou « brin avancé » par opposition au « brin indirect », « brin secondaire », « brin tardif » ou « brin retardé » dont la synthèse se fait de manière discontinue.

La DNA polymérase III est une enzyme très complexe composée de plusieurs sous unités codées chacune par des gènes de structure.

Il semble que deux molécules de polymérase soient associées au niveau du point de réplication, chacune répliquant son brin, ce qui implique un repliement d’un des brins sur lui-même. L’enzyme sur le brin matrice 3’→5’ (brin direct) synthétise en continu au fur et à mesure du déroulement des brins du DNA parental. L’enzyme située sur l’autre brin (brin retardé) synthétise du DNA de manière discontinue sous forme de petits fragments (1000 à 2000 pb) appelés fragments d’Okazaki. Le DNA est ensuite ouvert sur une nouvelle longueur par les hélicases, une nouvelle amorce est synthétisée sur le brin 5’→3’, les synthèses reprennent et ainsi de suite jusqu’à ce que la totalité du réplicon soit dupliquée.

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Le fait qu’il y ait deux polymérases dans un seul complexe confirme que les deux brins sont synthétisés à la même vitesse. Les deux moitiés du dimère contiennent une « sous-unité α », la vraie polymérase et une « sous-unité ε » qui est une exonucléase correctrice de 3’→5’. La correction permet le maintien d’une haute fidélité de réplication. Les « sous-unités β » servent à clamper la DNA polymérase. Les sous-unités restantes dans chaque moitié sont différentes (structure dissymétrique).

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Lorsque la DNA polymérase III introduit un nouveau nucléotide, le taux d’erreur est d’environ 10-4 à 10-5 (1x erreur sur 104 à 105 nouveaux nucléotides insérés). Or le taux d’erreur au niveau du DNA néosynthétisé n’est que de 10-9. Cette divergence vient du fait que les DNA polymérases sont capables de détecter les erreurs qu’elles ont commises et de les corriger immédiatement. Cette activité de contrôle-correction d’épreuve « proofreading » des polymérases résulte d’une activité 3’ exonucléasique que possèdent en plus ces polymérases. On pense actuellement que le processus est le suivant : la polymérase en action entoure le DNA comme un gros manchon. Si la base qui vient d’être ajouté n’est pas la bonne, la structure dans l’espace du DNA est modifiée. Cette modification augmente le volume du DNA et bloque la DNA polymérase. Cet arrêt permettrait à l’activité exonucléasique de s’exercer, d’où excision de la base indûment incorporée, permettant ainsi la correction de l’erreur et le redémarrage de la polymérase.

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FINITION DU BRIN RETARDE Les amorces sont détruites par la « RNase H » qui a pour propriété de détruire spécifiquement le RNA des hybrides RNA-DNA. La lacune engendrée par l’action de cette enzyme est comblée par l’action de la « DNA polymérase I ». Enfin, une « DNA ligase » effectuera la soudure du brin discontinu ; les DNA polymérases n’étant pas capables de créer une liaison phosphodiester qu’entre une extrémité 3’OH libre et un nucléoside triphosphate libre. La DNA ligase de E. coli utilise le cofacteur NAD+ comme source inhabituelle d’énergie.

TERMINAISON Les deux fourches de réplication se rencontrent au terminus approximativement à 180° de l’oriC. Les deux cercles résultants restent interliés. Ils sont dissociés par la « topoisomérase IV », une DNA topoisomérase de type II qui joue ici un rôle de démêlage.

Modèle d’action d’une topoisomérase type II

2. LA REPLICATION CHEZ LES EUCARYOTES Les données sont encore insuffisantes pour pouvoir proposer un modèle définitif. Peut-être n’est-il pas le même chez tous les eucaryotes ? Les données actuelles permettent cependant de proposer le modèle suivant : α- CYCLE CELLULAIRE Le DNA est répliqué uniquement pendant le phase (S : synthèse). Celle-ci est précédée par (G1 : gap 1) et suivie par (G2 : gap 2). La mitose (M) suit (G2). Les cellules peuvent également interrompre le cycle cellulaire : elles entrent en (G0). Certaines cellules comme les cellules nerveuses différenciées y resteront toute la vie de l’individu.

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Quelques heures à quelques jours

Division ~ 1 heure

G0

~ 3 heures

Synthèse du DNA et des histones

7 à 8 heures (40 minutes chez la levure)

POINT T (transition)

POINT R (restriction) Point de non retour (division ou suicide

par apoptose)

Il existe dans le cycle cellulaire, deux points cruciaux de contrôle (2 check points) : R et T. R : Le passage de la phase (G1) à (S) est régulé par des « cyclines» et des « protéines kinases cycline dépendantes » (Cdk-2 et Cdk-4). T : Le passage de la phase (G2) à (M) est régulé par la « cycline B », la (Cdk-1) et l’intervention de « kinase-kinase » tels que CAK et (wee-1) et de phsphatase (cdc-25). Les divers enzymes seront activés ou inactivés par phosphorylation ou déphosphorylation. β- MULTIPLES POINTS D’INITIATION Le mécanisme global de réplication chez les eucaryotes est comparable à celui des procaryotes. Elle se fait de manière :

Bidirectionnelle Complémentaire Antiparallèle Dans le sens 5’ → 3’ Avec des amorces RNA, fragments d’Okazaki, brin retardé et brin avancé

Dans la cellule Eucaryote, les chromosomes comportent des molécules linéaires d'ADN très longues et il existe plusieurs origines de réplication par chromosome, également caractérisées par des séquences précises. En raison de la complexité de la structure chromatinienne, les fourches de réplication eucaryotes se déplacent à environ 50 pb/seconde (10 à 20 fois moins vite que chez E. coli). A cette vitesse, en utilisant seulement deux fourches, la réplication d’une molécule de 105 kb (taille moyenne d’un chromosome de mammifère) prendrait environ un mois. En fait, au lieu de n’avoir qu’un seul point d’initiation (un seul réplicon), comme c’était le cas chez les procaryotes, la réplication chez les eucaryotes débute simultanément en plusieurs points d’un même chromosome (50 000 à 100 000 réplicons dans une cellule de mammifère ; 400 chez la levure Saccharomyces cerivisiae).

Oeil de réplication

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- ORIGINES ET INITIATIONS ’un génome ne se fait pas d’un seul bloc. Des groupes

réplication chez les mammifères n’ont pas

s de réplication chez la levure (Saccharomyces cerivisiae) ont été

γChez les eucaryotes, la réplication dd’environ 20 à 50 réplicons (répartis en tandem) se lancent simultanément à des moments définis de la phase S. Ceux qui répliquent au début de la phase S abondent en euchromatine alors que ceux activés en fin de phase S contiennent essentiellement de l’hétérochromatine. Le DNA centromérique et le DNA télomérique se répliquent à la fin.

Réplication décalée

(Brèves incorporations du BrdU à

dans le temps et dans l’espace :

Les séquences correspondant aux origines de encore été bien définies.

es origines individuelleLclonés en plasmides procaryotes. Puisqu’ils permettent à ces mêmes plasmides de se répliquer dans la levure (un eucaryote), ils ont donc été appelé « ARS » : « séquence de réplication autonome ». La longueur minimale du DNA qui supportera la réplication est uniquement de 11 pb bien que des copies supplémentaires de cette même séquence soient requises pour une efficacité optimale. La séquence consensus des « ARS » est la suivante :

[A/T]TTTA[T/C][A/G]TTT[A/T]

euchromatine d’abord puis hétérochromatine.

différents stades de la phase S)

Orig e ines de réplication chez S.cerevisia

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ette séquence est liée par un complexe de reconnaissance de l’origine « ORC » ou « origin Crecognition complex » qui, une fois activé par les Cdk, permet l’ouverture du DNA pour la réplication.

S. cerevisiaepetit chrom osom e : 180 gènes ; 9 origines de réplication

Contrairement aux procaryotes, les réplicons eucaryotes peuvent se répliquer seulement une fois par cycle cellulaire. Une protéine appelée « facteur d’habilité », indispensable pour l’initiation, est inactivée après son utilisation. Cette protéine ne peut avoir accès au DNA que lorsque l’enveloppe nucléaire est dissociée à la mitose. δ- VERS UN MODELE DE LA REPLICATION CHEZ LES EUCARYOTES

ivant : Une comparaison succincte avec le modèle procaryote est présentée sur le tableau su

Le DNA est déroulé au niveau de l’origine de réplication grâce à au moins une topoisomérase,

es nucléosomes sont déroulés en amont des fourches de réplication puis reconstitués en aval.

une hélicase et au facteur « RF-A ». LDe nouveaux nucléosomes sont également assemblés exclusivement à partir de nouvelles

molécules d’histone. Les nucléosomes, nouveaux et préexistants sont vraisemblablement répartis équitablement entre les deux DNA-fils. Durant la phase S, le doublement du DNA est parallèlement accompagné du doublement du contenu en histones de la cellule.

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ur le brin retardé

S , la « polymérase

a polymérase α libérée est transloquée avec ses protéines accessoires sur le brin direct

α-primase » interagit avec le facteur RF-A et synthétise une amorce RNA d’une longueur d’une dizaine de nucléotides. Cette amorce est ensuite allongée grâce à l’activité DNA-polymérasique de polymérase α associée au « facteur RF-C » (une vingtaine de désoxynucléotides). Le fragment d’Okazaki est ainsi amorcé. L’association du « PCNA » (Proliferating Cell Nuclear Antigen) et d’ATP provoque l’arrêt de la polymérase α et permet la fixation de la « polymérase δ » qui reconnaît l’extrémité 3’OH néosynthétisée et démarre alors la réplication.

Addition de nouvelles histones en arrière de la fourche de réplication CAF : facteurs d’assemblage de la

chromatine

L où la

e brin direct est répliqué en continu alors que la synthèse s’arrête sur le brin retardé environ

a « polymérase β » et « ligases » se chargent de la finition du brin retardé après excision des

n ne sait pas le rôle joué par la « polymérase ε ». Il a été proposé que le brin direct soit

réplication est amorcée suivant le même principe. L250 nucléotides plus loin. Un nouveau fragment d’Okazaki est ensuite initié et ainsi de suite. LRNA amorces. Osynthétisé par cette polymérase mais ceci reste l’objet de controverses.

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RF-A

ε- REPLICATION DES TELOMERES

t des amorces RNA par du DNA ne pose pas de Dans un DNA circulaire, le remplacemen

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n’en est pas de même avec les molécules de DNA linéaire où le retrait du RNA aux

hez certains virus, comme l’adénovirus, la solution est apportée par une protéine qui se

hez les eucaryotes, pour surmonter cet obstacle, les extrémités des chromosomes ou

problème : le mécanisme de type réparation suffit (RNaseH, DNA polymérase I, ligase chez les procaryotes). Ilextrémités des brins directs laisserait un trou qui ne peut être comblé : les DNA polymérases ne fonctionnent que dans le sens 5’→3’. Ceci implique que si aucun mécanisme spécifique n’avait été mis en place, la taille du génome ne cesserait de diminuer à chaque réplication. Cfixe à l’extrémité du DNA lors de l’initiation de la réplication. Dans ces cas très particulier, il n’est pas synthétisé de RNA amorce aux extrémités, c’est l’hydroxyle d’une sérine ou d’une thréonine qui fait fonction de 3’OH et qui permet l’initiation de la réplication. C« télomères » sont constituées de centaines de séquences riches en G, non codantes, répétées en tandem (250 à 1500 copies) avec l’extrémité en 3’ surplombant l’extrémité 5’.

ne enzyme appelée « télomérase » contient une petite molécule de RNA (c’est une Uribonucléoprotéine) dont une partie est complémentaire à l’unité de répétition télomérique. Cet RNA agit comme un moule pour l’ajout de ces répétitions à l’extrémité 3’ par des cycles répétés d’élongation et de translocation. Le brin complémentaire est synthétisé par le mécanisme déjà décrit du brin retardé. L’amorce RNA à l’extrémité 5’ du brin riche en C est

hydrolysée, si bien que le brin riche en G dépassera un peu par rapport au brin riche en C.

n plus, les télomères sont en fait une combinaison entre le DNA télomérique et des protéines Espécifiques constituant des structures appelées « capuchons télomériques »

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« CAPUCHONS TELOMERIQUES

Dans les cellules somatiques et les cellules normales en culture, la télomérase est inactive (sa production ou son activité est réprimée). Les télomères présents se raccourcissent, « s’usent », au fur et à mesure des réplications. Les chromosomes finissent donc par perdre leurs télomères, ce qui les rend instables lorsque ce raccourcissement atteint le DNA codant : les cellules deviennent sénescentes et meurent. Par contre, dans les cellules germinales et dans les cellules cancéreuses, la télomérase est active. Les cellules cancéreuses peuvent ainsi se multiplier indéfiniment sans que leurs chromosomes se raccourcissent. C’est pourquoi, il existe plusieurs travaux de recherche orientés vers la recherche d’inhibiteurs de la télomérase comme agents antitumoraux. ζ- MODIFICATION POST-REPLICATION DU DNA. Lors de la réplication, chez les eucaryotes, la cytosine est toujours incorporée non méthylée. Après une première réplication d’un DNA méthylé sur ses deux brins, il apparaît donc un DNA où un brin contient des cytosines méthylées tandis que l’autre brin contient des cytosines non méthylées. Il existe des enzymes appelées « maintenance méthylases ». Ces enzymes méthylent les cytosines sur le nouveau brin de façon à maintenir l’information contenue dans la molécule mère.

II. MAINTIEN DE L’INTEGRITE DU DNA ET REPARATION

Toute cellule subit à tout moment des agressions physiques et chimiques de l’environnement susceptibles d’altérer différentes molécules cibles. Les altérations de la molécule de DNA seront les plus sérieuses puisqu’elles peuvent être pérennisées. Face à ces agressions, une série de systèmes cellulaires assurent la maintien de l’intégrité du DNA et la réparation de la majeure partie des altérations. Les altérations se produisent principalement entre les mitoses et entraînent l’apparition de mutations, de délétions et d’insertions. Les lésions responsables de ces altérations peuvent correspondre à des dépurination, désamination, oxydation, etc.

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Altérations possibles des molécules de DNA

Dans le cas des altérations provoquées par désamination, les bases modifiées obtenues correspondent à des bases azotées inhabituelles au niveau du DNA (à l’exception du 5-méthyl cytosine remplacé par de la thymine après désamination).

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Altérations d’origine physique : Les « rayons cosmiques » et la « radioactivité », des rayonnements très énergétiques, peuvent produire des lésions :

- Directes par modification des bases, rupture de brins, etc.

- Indirectes en provoquant l’apparition d’ « ions superoxydes » (O2-) chimiquement très réactifs.

Les rayons ultraviolets solaires (UV), moins énergétiques, induiront principalement des dimérisations de thymines adjacentes en créant un cycle cyclobutane entre les carbones 5 et 6 de chacune des thymines. Un bain de soleil d’une heure peut induire ainsi jusqu’à 80 000 dimères de thymines par cellule.

1

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Altérations d’origine chimique : Elles sont très diverses et peuvent même résulter simplement du métabolisme normal de la cellule. Ainsi, les ions H+ cellulaires conjugués à l’agitation thermique peuvent retirer jusqu’à 104 bases puriques par jour et par cellule chez l’homme. Effet des altérations : Les altérations, quand elles ne sont pas immédiatement corrigées, peuvent entraîner des modifications au cycle de réplication suivant.

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1. LE MAINTIEN DE L’INTEGRITE DU DNA EST ASSURE PAR DES SYSTEMES DE SAUVEGARDE

α- FIDELITE DE LA REPLICATION Nous l’avons déjà évoqué, la fidélité de la réplication n’est pas absolue. Nous avons vu que le produit formé immédiatement après le passage de la polymérase comporte un taux d’erreurs de 10-9. Malgré la propriété de correction d’épreuves des polymérases impliquées « proofreading », certaines erreurs peuvent donc subsister. Cependant, le taux d’erreurs réellement observé après réplication se situe en fait aux environs de 10-11. Il existe par conséquent un système supplémentaire qui a pour fonction de :

- Détecter le mauvais appariement, - Reconnaître le nouveau brin (et non pas le brin parental) où l’erreur a été commise et

le couper près de la mauvaise base pour procéder ensuite à la réparation. Ce système, non encore complètement élucidé, semble faire intervenir une « recombinaison post réplicative » entre brins fils et brins parentaux. Chez les procaryotes, la discrimination entre le nouveau brin l’ancien repose sur le fait que la méthylation du nouveau brin sur l’adénine des sites ‘GATC’ n’ont pas encore eu le temps d’être effectués par la méthylase spécifique, alors que le brin qui a servi de matrice pour la réplication est méthylé. Chez les eucaryotes, où la méthylation s’effectue sur les cytosines des motifs ‘CG’, il est vraisemblable que la reconnaissance du brin néosynthétisé utilise le même principe.

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β- SYSTEMES PREVENTIFS Les cellules possèdent des systèmes de protection contre les agents susceptibles de provoquer des altérations. Par exemple :

- Les ions superoxydes (02-) sont détruits par la « superoxyde dismutase ».

- Les ions H+ sont pris en charge par les systèmes de régulation de l’équilibre acido-basique intracellulaire.

- Les oxydations sont réduites par différents systèmes plus ou moins spécifiques : « NADPH2 », « glutathion », « vitamine E », etc.

En plus, chez les eucaryotes supérieurs, le rein et le foie assurent une fonction essentielle de détoxification et d’élimination des substances chimiques néfastes.

2. LA REPARATION DU DNA EN DEHORS DE LA REPLICATION MET EN JEU DES SYSTEMES MULTIPLES

α- REVERSION DIRECTE DU DOMMAGE Les processus de réversions directes sont spécifiques de chaque type d’altération. Par exemple :

- - Les « photolyases » sont des enzymes qui éliminent par photoréactivité les dimères de thymine.

- Les guanines modifiées (6-O-méthyl-guanine) peuvent être déméthylées grâce à des

« 6-O-méthyl-guanine transférases ». Remarque : La 6-O-méthyl-guanine s’apparie à la thymine dans le DNA

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β- REVERSION EN DEUX PHASES

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PHASE 1 : Détection, suppression de l’altération La première phase est la reconnaissance de l’altération. Chaque type d’altération possède un système de reconnaissance qui lui est propre. Le résultat de cette phase est l’excision de la base altérée ou d’une partie du brin de DNA où elle se trouve.

- Les glycosylases

L’action de ces enzymes (DNA glycosylases) va se traduire par l’excision de la base azotée altérée libérant un DNA ponctuellement dépuriné ou dépyrimidiné. (Le même résultat peut être produit directement par certains agents comme les ions H+). Ensuite, il y a intervention des « AP endonucléases » qui ont pour propriété d’effectuer une coupure endonucléasique simple brin là où le DNA est glycosylé. REMARQUE : Dans le cas des 5-méthyl cytosines désaminées (→ thymine), il s’agit d’une base ‘modifiée’ qui ne peut être reconnue par aucune des glycosylases ; de ce fait la réparation ne sera jamais assurée. L’impuissance des systèmes de réparation dans ce cas

précis fait que ce type de mutation a une fréquence apparente très supérieure à celle de la plupart des autres mutations. Il s’agit de ce qu’on appelle un « point chaud de mutation » ou « hot spot ».

- Système UVR La réparation peut également faire appel au système « UVR A, B, C ». Un complexe moléculaire reconnaît la lésion. Ce complexe est constitué de deux molécules de type A « UVRA » associées à une molécule de type B « UVRB ». Sa fixation au DNA au niveau de la lésion nécessite une molécule d’ATP. Le dimère de molécules A est libéré et il est remplacé par une molécule de type C « UVRC ». Le complexe BC effectue une coupure endonucléolytique de part et d’autre de la lésion puis se libère du DNA. Une hélicase se charge alors de détacher le segment de DNA simple brin qui se trouve entre les deux coupures. La brèche obtenue s’étend sur une trentaine de nucléotides.

PHASE 2 : Remplacement du DNA al

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téré

Cette phase consiste à remplacer les nucléotides manquant sous l’action conjuguée d’une polymérase qui se sert du brin intact comme matrice et d’une ligase. Chez les bactéries, la plupart des gènes codant pour les enzymes de réparation font partie d’un système de sauvegarde complexe et hautement inter-régulé appelé le « système SOS ». Ce système est composé d’une vingtaine de gènes dont les produits participent aux mécanismes de réparation et de recombinaison. Deux gènes jouent un rôle central dans ce système : les gènes recA et lexA.

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3. ANOMALIES DES SYSTEMES DE REPARATION CHEZ L’HOMME Plus ent des

ieurs maladies héréditaires ont été liées chez l’homme à un dysfonctionnemsystèmes de réparation du DNA.