Université de Bretagne Occidentale Microbiologie Fondamentale et Appliquée Master 2 recherche

Compte-rendu de stage méthodologique

Clarisse LEMONNIER

COMPARAISON DE TROIS TECHNIQUES D’EXTRACTION D’ADN APPLIQUÉES À L’ÉTUDE DES MICROORGANISMES

MARINS

Laboratoire d’accueil : Laboratoire de Microbiologie des Environnements Extrêmes

Encadré par Loïs Maignien

UE Méthodologie Année 2014-2015

  2  

Table des matières      Introduction   3  

I.  Le  choix  des  protocoles  d’extraction   4  

Extraction  au  phénol-­‐chloroforme  :   4  Kit  MO-­‐Bio  PowerSoil®  :   5  

II.  Matériels  et  méthodes   5  Prélèvement   5  Extractions   6  Quantité  et  Qualité  de  l’ADN  extrait   6  Diversité  microbienne   7  

III.  Résultats  et  Discussion   7  Quantité  d’ADN   7  Amplification  des  ITS   8  Diversité  microbienne   9  

IV.  Conclusion   12  

Bibliographie   13  

ANNEXES   14  

                  Table  des  illustrations      Figure  1  :  Organisation des gènes ribosomiques chez les prokaryotes.   7  

Figure  2: Photo du gel de migration des différentes PCR des ITS.   8  

Figure  3  :  Richesse spécifique obtenue pour les différentes extractions et les deux témoins négatifs.   10  

Figure  4: a. Proportions relative des différentes tailles d’ITS obtenues avec la technique ARISA

b. Comparaison des électrophorégrammes de S3a (rouge) S3b (bleu) et S3c (vert).   11

 

Tableau  1  :    Résultats du dosage au Nanodrop et Picogreen   8  

 

  3  

Introduction

Depuis le milieu des années 80 le développement des techniques cultures-

indépendantes a permit une grande avancée dans l’étude de la diversité des microorganismes

de nombreux environnements (Head et al., 1998) En effet, on estime que moins d’1% des

microorganismes peuvent être approchés par les techniques de culture. Les outils moléculaires

sont particulièrement essentiels dans l’étude des procaryotes marins, qui ne livrent les

mystères de leur diversité depuis 10-20 ans seulement. Les Archées pélagiques, par exemple

ont été mises en évidence grâce au séquençage de leur ADNr 16S dans les océans au début

des années 1990, alors qu’elles peuvent représenter selon certaines estimations, jusqu’à 40%

du bactérioplancton total. De plus, des lignées phylogéniques entières de bactéries ou archées

pélagiques ne sont décrites exclusivement par approches moléculaires, sans représentants

cultivés pour l’ors.

Les analyses culture-indépendante varient en fonction de la problématique posée. Pour

étudier la diversité d’un échantillon, classiquement elles débutent par une étape d’extraction

des acides nucléiques suivi d’une amplification de certaines régions particulières de l’ADN ou

ARN par PCR, puis la diversité est observée via utilisation de techniques d’empreintes

moléculaires ou encore séquençage.

Parmi toutes ces étapes, l’extraction d’ADN est la plus critique. En effet, de base, on ne

connaît pas la diversité totale de l’échantillon, il est donc complexe de déterminer le

rendement ou l’efficacité d’une extraction. (Head et al., 1998)

Une bonne extraction repose sur une lyse efficace des cellules, pour pouvoir accéder,

idéalement, à la totalité des acides nucléiques. Cependant ces derniers ne sont pas extraits

avec la même efficacité selon le type d’échantillon ou le microorganisme. Il est ainsi plus

complexe de lyser une spore ou une bactérie GRAM (+) qu’une bactérie GRAM (-).

Différentes stratégies de lyse existent, qui peuvent être combinées : celles reposant sur

l’utilisation de détergents, dite lyse chimique, celles utilisant des enzymes (Lysozyme,

Protéinase K) dite lyse enzymatique, et enfin celles qui détruisent les cellules par application

de forces les lyses mécaniques : chocs thermiques, ou encore le « bead beating » qui vise à

casser les cellules à l’aide de microbilles agitées fortement.

Un point important également, est la reproductibilité de l’extraction, qui sera moindre si l’on

utilise des billes de différentes tailles dans le bead beating par exemple

  4  

L’objectif de ce travail va être de comparer trois techniques d’extraction, appliquées à l’étude

des microorganismes marins, récupérés par filtration d’eau de mer sur des filtres Sterivex® de

0,22µm : deux extractions phénol-chloroforme, l’une avec une lyse chimique-enzymatique,

l’autre une lyse chimique-mécanique et une extraction utilisant un kit commercialisé : le kit

MoBio PowerSoil®. Différents aspects de l’extraction seront étudiés et comparés : la quantité

et la qualité de l’ADN extrait ainsi que la diversité obtenue.

I. Le choix des protocoles d’extraction

Extraction au phénol-chloroforme :  

L’extraction au phénol-chloroforme a été choisie car c’est une technique de référence

dans l’extraction des acides nucléiques, largement utilisée depuis le début des années 1950.

De plus, le protocole s’applique à des cellules déjà lysées, ce qui va permettre de tester

différentes techniques de lyse.

L’extraction au phénol-chloroforme se base sur les différences de solubilité des

molécules dans un mélange de deux solutions de densité différente : une solution aqueuse (où

l’on retrouve les cellules lysées) et une solution de phénol-chloroforme. Ces deux solutions

sont mises à volume égal, mélangées doucement et séparées par centrifugation. Le phénol,

plus dense que l’eau va se retrouver au fond du tube. L’ADN de part sa charge négative va

être plus soluble dans l’eau et donc rester dans la phase acqueuse. A l’inverse, les protéines

vont être plus soluble dans le phénol. Cette étape peut être réalisée plusieurs fois afin

d’optimiser le rendement de l’extraction. A la fin, l’ADN va être précipité avec de l’éthanol,

ou de l’isopropanol, puis être re-suspendu dans un tampon ou de l’eau stérile.

Pour l’extraction d’ADN de cellules retenues sur des filtres, on retrouve

principalement l’utilisation du bead beating, qui permet de casser les cellules en même temps

que de les détacher du filtre. Afin de voir l’efficacité de ce type de lyse particulier, deux

extractions au phénol chloroforme ont été réalisées selon différentes lyses : une comprenant

une étape de bead-beating (extraction S3), l’autre comprenant une étape avec de la protéinase

K (extraction S2). Les deux techniques de lyse utiliseront des détergents (Sarkosyl et SDS)

en même quantité.

  5  

L’extraction au phenol-chloroforme est très longue en temps. Se sont développés ces

dernières années des kits d’extraction standardisés.

Kit MO-Bio PowerSoil® :

Parmi les kits standardisés, le Kit MO-Bio PowerSoil est couramment utilisé dans les

laboratoires, et notamment dans les recherches en microbiologie marine car il présente une

étape de bead-beating (Jacobs et al., 2009; Portillo et al., 2012) Contrairement à l’extraction

au phenol-chloroforme, l’ADN va être isolé et récupéré sur une colonne de silice.

Dans ce travail, les extractions ont été faites en respectant les instructions du fabricant

(extraction S1).

Ce protocole stipule 5-10min de bead-beating, c’est ce temps qui a également été choisi dans

la lyse mécanique pour l’extraction phénole-chloroforme S3.

II. Matériels et méthodes

Afin de pouvoir comparer strictement les différentes techniques d’extraction, la même eau a

été filtrée sur différents filtres, et en triplicat. Un triplicat correspond à un demi filtre.

Prélèvement  Le prélèvement a été effectué à la station SOMLIT en baie de Ste Anne, Plouzané

(48°21’32.17’’ N, 4°33’07.21’’ O). L’eau a été prélevée à 2m de profondeur sous la surface, à

l’aide d’une bouteille Niskin, et directement reversée dans un bidon Nalgen® stérile de 10L.

La filtration a été faite en laboratoire, avec un système de filtration en série, relié à une pompe

péristaltique. L’eau a été pré-filtrée sur des filtres de 10µm, 3 µm (filtres membrane PC,

Whatman) et les microorganismes ont été récupérés sur des filtres de 0,22 µm (Sterivex®

Millipore). 1 litre d’eau au total a été filtré sur chaque sterivex. Un blanc de filtration a été

effectué également, en filtrant de l’eau stérile.

A la fin de le filtration, les Sterivex sont refermés avec des bouchons stériles et mis à -80°C,

jusqu’à extraction.

  6  

Extractions

Les protocoles détaillés de toutes les extractions sont donnés en annexe (Annexes 1&2)

Les filtres à l’intérieur des Sterivex ont été récupérés en découpant la coque en plastique avec

un scalpel chauffé à la flamme. Puis précautionneusement découpés en 2 dans une boite de

pétri stérile et insérés dans des tubes numérotés pour les différentes extractions : des tubes de

2mL classiques (numérotés S2a, S2b et S2c) pour la lyse chimique, des tubes matrix B pour

la lyse mécanique et chimique (numérotés S3a, S3b et S3c) et enfin les tubes PowerBead

fournis avec le kit MO-bio PowerSoil (numérotés S1a, S1b et S1c).

En plus, un témoin négatif pour chaque extraction a été effectué (nommés S1-, S2- et S3-) ,

ainsi qu’une extraction à partir d’un filtre sterivex stérile (non utilisé).

Pour l’extraction au phénol-chloroforme avec une lyse chimique, dans le tube contenant le

filtre a été ajouté 1 mL de tampon de lyse (Tris-HCl – EDTA – NaCl), 100 µL de SDS 10%,

100µL de Sarkosyl 10% et 50 µL de Protéinase K. Les tubes ont ensuite été mis au bain-marie

à 55°C pendant 1h afin de permettre l’activité de la protéinase K. A la fin de cette étape, 1 mL

de solution a été transférée dans un nouveau tube de 2mL.

Pour l’extraction phénol-chloroforme par lyse mécanique-chimique, 1 mL de tampon de lyse

(Tris-HCl – EDTA – NaCl), 100µL de SDS 10% et 100µL de Sarkosyl 10% ont été ajoutés

dans les tubes matrix B, avant d’être mis à vortexer à puissance maximale pendant 5-10min. 1

mL de solution a ensuite été récupérée dans un nouveau tube de 2mL.

L’extraction au phénol-chloroforme proprement dite a commencé par une étape de séparation

au Phenol-Chloroforme-Isoamyl alcool (25 :24 :1), suivi d’une autre étape de séparation au

Chloroforme. L’ADN a été tout d’abord été précipité en ajoutant 40µL d’Acétate de Sodium

3M (pH 5,2) et 0,7 volumes (~700µL) d’isopropanol glacé (-20°C), puis à l’éthanol froid

75%. L’ADN extrait a été repris dans 100µL d’eau miliQ stérile.

Les extractions avec le kit MO-Bio PowerSoil ont été réalisées selon les instructions du

commercant. C’est également avec ce kit qu’ont été effectuées les extractions du Témoin

négatif de filtration et du Sterivex.

Quantité et Qualité de l’ADN extrait  La quantité et qualité d’ADN extrait ont été mesurées par spectrophotométrie sur le

Nanodrop1000.

Pour une mesure plus précise de la quantité d’ADN, il a été effectué un dosage au Picogreen

(kit Quant-iTTM PicoGreen®), en suivant les instructions du fabricant (Annexe 3).

  7  

Diversité microbienne  Pour estimer la diversité obtenue avec chaque extraction, une technique d’empreinte

moléculaire a été utilisée : Automatic rRNA Intergenic Spacer Analysis (ARISA).

L’ARISA se base sur la grande variabilité de taille des séquences inter-ribosomiques (ITS),

qui migrerons plus ou moins loin par électrophorèse.

Figure    :  Organisation des gènes ribosomiques chez les prokaryotes.

Une PCR sur les ITS a donc été réalisée, en utilisant les amorces bactériennes ITSF (GTC-

GTA-ACA-AGG-TAG-CCG-TA) et ITSR (GTC-GTA-ACA-AGG-TAG-CCG-TA). (Annexe

4) La migration sur gel a été effectuée sur biopuce provenant du kit Agilent 7500 et les

bandes ont été analysées par des capteurs dans un bioanalyseur (Annexe 5). Les données ont

été traitées avec le logiciel 2100 Expert. Tous les pics supérieurs à 5 RU ont été pris en

compte et comptés comme étant 1 OTU.

III. Résultats et Discussion

Quantité d’ADN  Les résultats obtenus entre le Nanodrop et le Picogreen sont très contradictoires (Tableau 1).

Le Nanodrop donne des estimations 10 à 100 fois plus élevées que le Picogreen et présente

des valeurs de résultats positives, voir supérieures que d’autres extractions pour les témoins

négatif de l’extraction S1, le Sterivex et le témoin négatif de filtration. Ces résultats

aléatoires peuvent s’expliquer par le fait que le Nanodrop présente un seuil de détection

d’ADN de 2 ng/µL. Si l’on suit les résultats –plus précis– du Picogreen, la concentration

d’ADN extrait n’excède pas 0,62 ng/µL. Le Nanodrop ne peut donc être utilisé sur ces

échantillons, d’un point de vue quantitatif, mais également qualitatif.

  8  

Tableau  1  :    Résultats du dosage au Nanodrop et Picogreen

*ND : correspond aux valeurs en dessous du seuil minimal de dosage du kit Quant-iTTM PicoGreen® : 25.10-3 ng/µL. *S1= Kit MO-Bio PowerSoil, S2= Phénol-chloroforme lyse chimique/enzymatique S3= Phénol-chloroforme lyse

chimique/mécanique.

Les résultats obtenus avec le Picogreen nous montrent que selon les extractions, il a été extrait

entre 0,07 et 0,62 ng/µL d’ADN. L’extraction qui a permit d’extraire le plus d’ADN est le kit

MO-Bio PowerSoil. Bizarrement, l’extraction S3 au phenol-chloroforme avec une étape de

bead-beating a produit une quantité d’ADN très faible, voire nulle.

Amplification des ITS  Avant analyse par ARISA, les résultats des différentes PCR d’ITS ont été mis à migrer sur gel

d’agarose. (Figure 1)

Figure  1: Photo du gel de migration des différentes PCR des ITS.

La PCR nous montre dans un premier temps que de l’ADN était présent dans tous les tubes

d’extraction, et pas dans les témoins négatifs d’extraction, sauf pour le Sterivex et le Témoin

négatif de filtration (des bandes très légères sont visibles). L’absence d’amplification pour le

réplica a de l’extraction S1 est probablement due à une erreur de manipulation lors de la PCR,

car de l’ADN a bien été quantifié au Picogreen.

De l’ADN a bien été extrait dans l’extraction S3, en très faible quantité, mais suffisante pour

pouvoir être amplifié. Il ne s’agit pas d’une contamination de PCR, ni d’extraction, car le

témoin négatif n’a pas montré d’amplification.

  9  

Il faut donc regarder au niveau de l’extraction, pour tenter de savoir pourquoi un aussi faible

taux d’ADN a été extrait. La technique d’extraction S3 ne variait par rapport à S2 que par

l’étape de bead-beating. Une hypothèse alors serait que une partie de l’ADN aurait été

dégradé durant la lyse des cellules. Le temps de bead-beating (5-10min), combiné à des

détergents en forte concentration aurait pu être responsable de cette dégradation de l’ADN. Ce

temps a été basé sur celui donné dans le kit MO-Bio PowerSoil mais ce dernier présentait

surement une solution de lyse moins puissante. Cela reste hypothétique, car la composition

des solutions du kit n’est pas transmise.

Cependant, dans la littérature les temps de bead-beating sur des filtres pour des extractions au

phénol-chloroforme similaires à la notre sont de 30-40s, soit 10 fois plus court que celui

utilisé dans notre étude (Urakawa et al., 2010). De plus, Fujimoto et son équipe ont montré

l’impact du temps de bead-beating sur le taux d’ADN extrait à partir cultures de

Staphylococcus aureus. Le rendement était meilleur pour un temps de 30s et était diminué de

moitié pour un temps de 3min (Fujimoto et al., 2004).

La migration sur gel nous montre la présence de bandes de différentes tailles aux alentours

des 500-1000 pb, et qui correspondent aux différents ITS amplifiés.

Une légère contamination est présente, qui peut avoir multiples origines : le système de

stérilisation des bidons et circuits de filtration n’est pas entièrement performant, lors de

manipulation près de la flamme pour la récupérer et découper les filtres ou possiblement une

contamination des Sterivex eux même.

Diversité microbienne

Les électrophorégrammes obtenus à l’issue de l’ARISA sont mis en annexe (Annexe 6).

Malheureusement, suite à deux erreurs survenues lors de la PCR (pour S1a) et durant

l’ARISA (pour S2b), seule l’extraction S3 présente des résultats de diversité pour tous ses

triplicats, c’est pourquoi les résultats sont à considérer avec précaution, et ne peuvent être

confortés par des calculs statistiques, de type NMDS.

L’ARISA nous donne des profils d’électrophorèses, à l’issue de l’analyse. Ces profils

permettent d’identifier les différents fragments présents dans les échantillons, mais également

  10  

de les quantifier en mesurant l’aire sous la courbe des pics et en se référent à un marqueur

interne.

Théoriquement, le nombre de pics obtenus correspond au nombre d’« espèces » présentes

dans l’échantillon. C’est ainsi que l’on peut mesurer la richesse spécifique pour chaque

extraction. Il faut tout de même considérer que des espèces, voire des genres bactériens

différents peuvent présenter la même taille d’ITS.

Etrangement, l’extraction qui présente la plus grande richesse spécifique est

l’extraction S3, au phénol-chloroforme avec lyse chimique-mécanique, alors que c’est celle

qui présente la plus faible quantité d’ADN extrait (Figure 3).

Ainsi la technique d’extraction au phénol-chloroforme avec du bead-beating est la plus

performante en terme d’extraction et de lyse des cellules pour notre type d’échantillon. On

peut même émettre l’hypothèse qu’avec un temps de bead-beating plus approprié, cette

diversité aurait été encore augmentée.

Figure   2  :   Richesse spécifique obtenue pour les différentes extractions et les deux témoins négatifs. Elle est exprimée en nombre de pics obtenus sur l’électrophorégramme.

L’extraction qui aurait le moins marché en terme de diversité serait l’extraction S2, cependant

sans triplicat, il est délicat de conclure.

La diversité obtenue nous permet également de réfléchir sur la reproductibilité entre et dans

les différentes extractions.

La graphique de la figure 4 représente les différentes tailles d’ITS obtenues en fonction des

échantillons, une taille correspondant théoriquement à une espèce. La répartition de ces tailles

  11  

est variable selon les extractions, et même au sein des triplicats, pour l’extraction S1 et S2.

L’extraction S3 quand à elle montre des profils relativement similaires entre les différents

triplicats. Ce résultat se retrouve si l’on superpose les électrophorégrammes. Il y a cependant

une mauvaise reproductibilité au niveau de la quantité des différents fragments.

a.

Echelle (en pb)

b.

Figure  3: a. Proportions relative des différentes tailles d’ITS obtenues avec la technique ARISA b. Comparaison des électrophorégrammes de S3a (rouge) S3b (bleu) et S3c (vert).

Pourtant il a été montré que la technique d’ARISA appliquée à des environnements

aquatiques est très reproductible (Fisher and Triplett, 1999) Le décalage que l’on obtient est

peut-être lié à la quantité d’ADN initiale variable, qui n’aurait donc pas donné les mêmes

amplifications.

  12  

IV. Conclusion

Dans cette étude ont été testées trois techniques d’extraction différentes sur des

microorganismes pélagiques récupérés par filtration sur des filtres Sterivex de 0,22µm : deux

extractions phénol-chloroforme avec des techniques de lyse différentes, bead-beating et

enzymatique, et un kit d’extraction le MO-Bio PowerSoil.

La technique qui donne les meilleurs résultats serait l’extraction au phénol-

chloroforme avec une lyse chimique-physique, en effet c’est celle qui permet d’extraire une

plus grande diversité de bactéries. Cependant cette extraction devrait être refaite, en jouant sur

les temps de bead-beating pour vérifier lequel serait le plus optimal, car celui utilisé pour cette

étude était inadapté, et aurait considérablement réduit le taux d’ADN extrait.

De plus, dans cette étude, la qualité de l’ADN n’a pas pu être investie, car les

concentrations d’ADN extrait étaient trop faibles pour le Nanodrop1000. Il serait intéressant

de refaire cette expérience en filtrant des volumes d’eau plus importants et en se basant sur

des filtres entiers plutôt que des demi-filtres pour l’extraction afin d’obtenir plus d’ADN.

Un autre élément qui a beaucoup limité les analyses de cette expérience est le manque de

triplicat. Pour pouvoir affermir les résultats il serait intéressant à l’avenir de partir de 5, ou

plus, réplicats.

Enfin une légère contamination a été détectée sur le témoin négatif, mais également sur le

filtre sterivex témoin. Un des biais peut-être du au moment d’extraire le filtre de sa coque

plastique. Pour valider ou infirmer l’origine de cette contamination, il serait intéressant

d’éviter cette étape en utilisant le kit spécial Sterivex ou des protocoles d’extraction où les

premières étapes d’extraction ont lieu directement dans le Sterivex. (Somerville et al., 1989)

Les techniques d’extraction sont donc très complexes et demandent un ajustement précis pour

chaque environnement, avec une expérience de mise au point nécessaire. Il faut se poser la

question de quelle exigence on veut avoir, une économie de temps, d’argent ou encore le plus

de diversité possible, une reproductibilité dans les résultats.

  13  

Bibliographie    Fisher  M.M.,  Triplett  E.W.,  1999.  Automated  approach  for  ribosomal  intergenic  spacer  analysis  of  microbial   diversity   and   its   application   to   freshwater   bacterial   communities.   Appl.   Environ.  Microbiol.  65,  4630–4636.    Fujimoto   S.,  Nakagami  Y.,  Kojima  F.,  2004.  Optimal  bacterial  DNA   isolation  method  using  bead-­‐beating  technique.  Mem.  Kyushu  Univ  Dep  Health  Scis  Med.  Sch  3,  33–38.  Head   I.M.,   Saunders   J.R.,   Pickup   R.W.,   1998.   Microbial   Evolution,   Diversity,   and   Ecology:   A  Decade  of  Ribosomal  RNA  Analysis  of  Uncultivated  Microorganisms.  Microb.  Ecol.  35,  1–21.      Jacobs   J.,   Rhodes   M.,   Sturgis   B.,   Wood   B.,   2009.   Influence   of   environmental   gradients   on   the  abundance   and   distribution   of  Mycobacterium   spp.   in   a   coastal   lagoon   estuary.  Appl.  Environ.  Microbiol.  75,  7378–7384.    Portillo  M.C.,  Anderson  S.P.,  Fierer  N.,  2012.  Temporal  variability  in  the  diversity  and  composition  of  stream  bacterioplankton  communities.  Environ.  Microbiol.  14,  2417–2428.    Somerville   C.C.,   Knight   I.T.,   Straube   W.L.,   Colwell   R.R.,   1989.   Simple,   rapid   method   for   direct  isolation  of  nucleic  acids  from  aquatic  environments.  Appl.  Environ.  Microbiol.  55,  548–554.    Urakawa   H.,   Martens-­‐Habbena   W.,   Stahl   D.A.,   2010.   High   abundance   of   ammonia-­‐oxidizing  Archaea   in  coastal  waters,  determined  using  a  modified  DNA  extraction  method.  Appl.  Environ.  Microbiol.  76,  2129–2135.              

  14  

ANNEXES    ANNEXE  1  :                      Protocole  extraction  phénol-­‐chloroforme      Lyse  cellulaire    Extraction  S3  :  lyse  cellulaire  Bead-­‐Beating  +  SDS  +  Sarkosyl      -­‐ Séparer  le  filtre  de  sa  coque  plastique  à  l’aide  d’un  scalpel  chauffé  à  la  flamme  -­‐ Avec  un  scalpel  stérile,  séparer  le  filtre  de  son  socle  et  le  découper  précautionneusement  en  deux.  A  

l’aide  d’une  pince  stérile,   les  mettre  dans  deux  tubes  de  2mL  remplis  de  billes  de  verre  0,1mm  et  de  1mL  de  tampon  de  lyse  (Tris-­‐HCl  –  EDTA-­‐  NaCl)  

-­‐ Ajouter  100µL  de  SDS  10%  et  100µL  de  Sarkosyl  10%.  -­‐ Mettre  au  Bead-­‐Beating  pendant  10-­‐15min.  -­‐ Récupérer  1  mL  de  solution  dans  un  nouveau  tube  de  2mL,  en  prenant  garde  à  récupérer  le  moindre  

de  billes  possibles.  -­‐ Centrifuger  rapidement  et  reprendre  1  mL  dans  un  nouveau  tube  de  2mL    Extraction  S2  :  lyse  cellulaire  Protéinase  K  +  SDS  +  Sarkosyl    -­‐ Séparer  le  filtre  S2  1  de  sa  coque  plastique  à  l’aide  d’un  scalpel  chauffé  à  la  flamme.  -­‐ Avec  un  scalpel  stérile,  séparer  le  filtre  de  son  socle  et  le  découper  précautionneusement  le  filtre  en  

deux.  A  l’aide  d’une  pince  stérile,  les  mettre  deux  tubes  de  2mL  stériles.    -­‐ Faire  de  même  avec  le  sterivex  S2  2,  mais  ne  récupérer  qu’une  moitié.  -­‐ Prévoire  un  blanc  de  l’extraction  =  tube  vide  noté  S2  -­‐  -­‐ Ajouter  1  mL  de  tampon  de  lyse  (Tris-­‐HCl  –  EDTA-­‐  NaCl)  dans  chaque  tube  -­‐ Ajouter  100  µL  de  SDS  10%,  100  µL  de  Sarkosyl  10%  et  50  µL  de  Protéinase  K.  -­‐ Mélanger  doucement  et  incuber  au  bain  marie  à  55°C  pendant  1h  agiter  lentement  de  temps  en  temps.  -­‐ A  la  fin  récupérer  1  mL  et  le  transférer  dans  des  nouveau  tube  de  2mL    Extraction  de  l’ADN    -­‐ Ajouter  1  mL  de  PCI,  puis  agiter  sans  vortexer  pendant  45  secondes.  -­‐ Centrifuger  à  14000  rpm  pendant  15min  à  4°C.  -­‐ Récupérer  la  phase  aqueuse  supérieure  dans  un  nouveau  tube  de  2mL.                      Répéter  cette  extraction  au  PCI  si  il  y  a  beaucoup  de  débris  au  niveau  de  l’interface      -­‐ Ajouter  1  mL  de  Chloroforme,  puis  agiter  sans  vortexer  pendant  45  secondes.  -­‐ Centrifuger  à  14000  rpm  pendant  15min  à  4°C.  -­‐ Récupérer  la  phase  acqueuse  supérieure.    Précipitation  de  l’ADN    -­‐ Ajouter  40  µL  de  solution  d’Acétate  de  sodium  3M,  pH  5,2.  -­‐ Ajouter  0,7  volumes  d’isopropanol  glacé  (-­‐20°C)  -­‐ Placer  les  tubes  1h  minimum  à  -­‐20°C  (possibilité  de  laisser  overnight)  -­‐ Centrifuger  pour  récupérer  le  culot  d’ADN  14000  rpm  pendant  20min  à  4°C.  -­‐ Re-­‐suspendre  le  culot  avec  0,5  mL  d’ethanol  froid  à  75%.  -­‐ Centrifuger  à  14000  rpm  pendant  5  minutes  à  4°C.  -­‐ Laisser  sécher  le  culot  à  l’air  libre,  ou  au  speed  vac  pendant  10min  à  température  moyenne.  -­‐ L’ADN  est  repris  dans  100-­‐200µL  de  TE  (1X)  -­‐ L’ADN  peut  être  conservée  à  4°C.      

  15  

 ANNEXE  2  :                                Protocole  kit  MO-­‐Bio  PowerSoil®      (selon  les  instructions  du  fabricant)    Récupération  du  filtre  et  lyse  cellulaire      -­‐ Séparer  le  filtre  de  sa  coque  plastique  à  l’aide  d’un  scalpel  chauffé  à  la  flamme  -­‐ Avec  un  scalpel  stérile,  séparer  le  filtre  de  son  socle  et  le  découper  précautionneusement  en  deux.  A  

l’aide  d’une  pince  stérile,  les  mettre  dans  deux  tubes  PowerBead    -­‐ Vortexer  rapidement  et  doucement  pour  mélanger  -­‐ Ajouter  60µL  de  solution  C1  et  vortexer  brièvement.  -­‐ Placer  les  tubes  sur  un  vortex  horizontal  de  type  «  bead  beat  ».  Vérifier  qu’ils  sont  bien  accrochés,  et  

vortexer  à  puissance  maximale  pendant  10-­‐15min.  -­‐ Centrifuger  les  tubes  à  10000g  pendant  30s.  T°C  ambiante.    Extraction  d’ADN    -­‐ Transférer   le   surnageant  dans  un  nouveau   tube  de  2mL,   rempli  de  250  µL  de  solution  C2.  Vortexer  

rapidement  pendant  5s  puis  laisser  5min  à  4°C.  -­‐ Centrifuger  les  tubes  à  température  ambiante  pendant  1  min  à  10000g  -­‐ Transférer   le  surnageant  (600µL  max)  dans  un  nouveau  tube  de  2  mL,  rempli  de  200µL  de  solution  

C3.  Vortexer  brièvement  puis  laisser  5min  à  4°C.  -­‐ Centrifuger  les  tubes  à  température  ambiante  pendant  1  min  à  10000g  -­‐ Transférer   le   surnageant   (750µL  max)   dans   un   nouveau   tube   rempli   de   1200µL   de   solution   C4   (  !  

Agiter  la  bouteille  avant  de  prélever).  Vortexer  brièvement    

Rétention  de  l’ADN  sur  colonne  et  précipitation    -­‐ Transférer  environ  675  µL  de  surnageant  dans  un  tube  avec  colonne  Spin  Filter  et  centrifuger  pendant  

1  min  à  10000  g  à  température  ambiante.  -­‐ Eliminer  le  surnageant,  et  remettre  675  µL  re  centrifuger  etc…  x2  -­‐ Ajouter  500  µL  de  la  solution  C5  et  centrifuge  à  température  ambiante  pendant  30s  à  10000g  -­‐ Eliminer  le  liquide  passé.  Re-­‐centrifuger  à  température  ambiante  pendant  1  min  à  10000g  -­‐ Déplacer   le   filtre   dans   un   nouveau   tube   de   2   mL.   Ajouter   100µL   de   la   solution   C6.   Centrifuger   à  

température  ambiante  pendant  30s  à  10000g.                                      

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Extraction  3  :                                                Protocole  Picogreen  kit  Quant-iTTM PicoGreen®   1.  Préparation  des  réactifs  :  .      -­‐  Préparation  du  tampon  TE  :  Dans  un  tube  Falcon  50ml,  diluer  20  fois  la  solution  mère  de  TE  20X,  stérilement  pour  ainsi  obtenir  du  tampon  TE  1X.  Ajuster  le  volume  à  préparer  en  fonction  de  la  manipulation  à  réaliser.  Cas  n°1   :  Pour  un  volume  final  de  40  ml   :  2  ml  de  TE  20X  +  38ml  d’eau  milliQ  stérile.  Cas  n°2   :  Pour  un  volume  final  de  20  ml  :  1  ml  de  TE  20X  +  19ml  d’eau  milliQ  stérile.    -­‐  Préparer  la  gamme  étalon  :  À  partir  du  tube  de  Lambda  DNA  à  100  μg/ml  fourni  dans  le  kit,  préparer  une  1ère  dilution  à  2  μg/ml  (soit  une  dilution  de  la  solution  mère  au  1/50ème)  dans  un  microtube  1,5ml.  Cas  n°1  :  Pour  un  vol.  final  de  500μl,  prélever  490μl  de  TE1X  et  10μl  de  lambda  DNA  100μg/ml.  Cas  n°2  :  Pour  un  vol.  final  de  250μl,  prélever  245μl  de  TE1X  et  5μl  de  lambda  DNA  100μg/ml.  À  partir  de   ce   tube  à  2  μg/ml,   réaliser   les  7  points  de  gamme,  en   série  de  dilution  en   cascade  au  demi.  Penser  à  annoter  vos  microtubes  1,5ml  et  à  bien  vortexer  entre  chaque  dilution.  Cas  n°1  :  250μl  TE1X  +  250μl  ADN  Cas  n°2  :  125μl  TE1X  +  125μl  ADN    -­‐  Préparation  des  échantillons   :  il  est  important  que  les  échantillons  mesurés  se  situent  dans  la  gamme  étalon.  Diluer  vos  échantillons  à  quantifier  par  exemple,  au  1/100ème  dans  du  TE  1X.  Si   les  échantillons  sont  très  peu  concentrés,  il  est  évident  que  la  dilution  est  inutile.  Cas   n°1   :   100μl   d’échantillon/puits   sont   nécessaires.   Soit   pour   des  mesures   en   dupliquat,   préparer   un  volume  d’échantillon  dilué  minimum  de  250μl  :  2,5μl  d’ADN  pur  dans  247,5μl  de  TE  1X.  Cas   n°2   :   50μl   d’échantillon   /puits   sont   nécessaires.   Soit   pour   des   mesures   en   dupliquat,   préparer   un  volume  d’échantillon  dilué  minimum  de  125μl  :  1,25μl  d’ADN  pur  dans  123,75μl  de  TE  1X.    -­‐  Préparation  de  la  solution  de  Picogreen  :  Diluer  la  solution  mère  fourni  dans  le  kit,  au  1/200ème  dans  du  TE  1X.  Attention,  protéger  le  tube  de  la  lumière,  et  le  recouvrir  avec  de  l’aluminium.  Cas  n°1  :  Préparer  un  volume  de  10ml,  soit  50μl  de  picogreen  pur  dans  10ml  de  TE1X.  Cas  n°2  :  Préparer  un  volume  de  5ml,  soit  25μl  de  picogreen  pur  dans  5ml  de  TE1X.    2.  Préparation  de  la  plaque  :  1  vol.  de  solution  de  picogreen*  pour  1  vol.  d’ADN.    -­‐   Verser   la   solution   de   picogreen   diluée   fraîchement   préparée,   dans   une   boite   de   pétri   stérile   (ou   un  réservoir  pour  multicanaux)  -­‐  Distribuer  dans  un  premier  temps,  le  picogreen  avec  une  pipette  P200  multicanaux,  dans  tous  les  puits  de  la  microplaque,  à  hauteur  de  :  100  μl  de  picogreen  pour  une  plaque  à  puits  classiques  50μl  de  picogreen  pour  une  plaque  demi-­‐puits  -­‐  Déposer  ensuite,   la  gamme  étalon  en  duplicat   (au  minimum)  à   l’aide  d’une  pipette  P200  simple,   selon  votre  plan  de  plaque  :  100  μl  d’ADN  pour  une  plaque  à  puits  classiques  50μl  d’ADN  pour  une  plaque  demi-­‐puits  -­‐  Penser  à  faire  des  témoins  négatifs  «  Blanc  »  exempt  d’ADN.  -­‐   Déposer   vos   échantillons   dilués   ou   non,   selon   votre   plan   de   plaque   :  100   μl   d’échantillon   pour   une  plaque  à  puits  classiques  50μl  d’échantillon  pour  une  plaque  demi-­‐puits  -­‐  Recouvrir  la  plaque  avec  un  film  adhésif  en  aluminium.  -­‐  Homogénéiser  au  vortex  brièvement  la  plaque,  puis  centrifuger  quelques  secondes  afin  de  faire  redescendre  les  éventuelles  gouttelettes.    3.  Lecture  au  lecteur  de  microplaques  TECAN  Infinite200Pro    -­‐    Allumer  l’ordinateur,  puis  le  lecteur  de  microplaques  (interrupteur  à  l’arrière  de  l’appareil)    -­‐    Ouvrir  le  logiciel  IControl  (icône  sur  le  bureau)    -­‐    Ouvrir  la  méthode  désirée  «  Quantification  picogreen  -­‐  puits  classiques  »  ou  «  Quantification  picogreen  -­‐  demi  puits  »    Paramètres  de  la  méthode  définir  :  seul  le  type  de  plaque  change  dans  ces  2  méthodes  ;  Plan  de  plaque  =  sélection  des  puits  à  mesurer  Agitation  «  shaking  »  5sec.  mode  orbital,  amplitude  1mm  -­‐  Pause  «  wait  »  5sec.  Fluo.  excitation  485nm/  émission  535nm,  gain  fixe  91,  nbre  de  flash  25,  z-­‐position  A1    -­‐    Charger   votre   plaque   à   l’intérieur   de   l’appareil   :   pour   ouvrir   (et   refermer)   le   clapet,   appuyer   sur   le  bouton  situé  dans  le  coin  en  haut  à  droite,  de  l’appareil.      

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-­‐  Cliquer  sur  «  Start  »  représenté  par   l’icône   flèche  verte.  La  mesure  démarre  et  une  page  Excel  s’ouvre  automatiquement  pour  afficher  les  résultats.      -­‐  Mettre  en  forme  si  besoin  vos  résultats  de  mesure  (document  Excel  :  mise  en  page,  calcul  de  moyenne,  écart  type,  etc  ...)  et  enregistrer  le  fichier  sur  l’ordinateur  (dossier  personnel  à  créer)  ou  sur  une  clé  USB.        4.  Analyse  des  résultats        -­‐  Soustraire  la  valeur  de  fluorescence  des  témoins  «  Blanc  »  à  tous  les  échantillons.      -­‐   A   partir   des   valeurs   des   différents   points   de   gamme,   générer   la   droite   étalon   (graphique   «   nuage   de  points  »,  puis  ajouter  une  courbe  de  tendance)  :  intensité  de  fluorescence  Picogreen  (RFU)  en  fonction  de  la  concentration  d’ADN  (μg/ml).    -­‐  Déterminer  la  concentration  des  échantillons  avec  l’équation  de  la  droite  étalon.  Attention,  ne  pas  oublier  les  facteurs  dilutions  !              Annexe  4  :                                      Protocole  de  la  PCR      Composition  du  Master  Mix                          -­‐  Préparer  le  mélange  réactionnel  dans  un  tube  eppendorf  de  1,5  ml.    -­‐  Ajouter  la  Taq  polymérase  en  dernier.    -­‐  Répartir  24μl  de  mélange  réactionnel  dans  chaque  tube  de  PCR  de  0,2ml.    -­‐  Ajouter  1μl  d’ADN.      Le  témoin  positif  de  PCR  est  de  l’ADN  extrait  d’une  souche  de  Thermosipho  sp.  Le  témoin  négatif  est  de  l’eau  mQ  stérile.    Le  programme  de  PCR  était  de  36  cycles,  avec  une  température  d’hybridation  de  56°C.    Marqueur  de  taille  utilisé  :  Ladder  100bp  G5711  Promega                      

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Annexe  5:                                                                                                            Protocole  kit  Agilent  7500      Préparation  du  «  Gel-­‐Dye  Mix  »  :      -­‐  Laisser  le  DNA  Dye  Concentrate  (Bleu)  et  le  DNA  gel  matrix  (Rouge)  s’équilibrer  à  température  ambiante  pendant  30  min.    -­‐  Mettre  25μl  de  DNA  Dye  Concentrate  (Bleu)  dans  le  tube  de  DNA  gel  matrix  (Rouge).    -­‐  Bien  vortexer  la  solution  et  centrifuger  pour  faire  descendre  les  gouttes  au  fond  du  tube.  Transférer  dans  un  tube  à  filtre  «  spin  filter  ».    -­‐   Centrifuger   à   1500   g   +-­‐   20%   (soit   environ   jusqu’à   6000   rpm   sur   la   centrifugeuse   ayant   un   rayon  horizontal   effectif   de   4   cm   depuis   le   centre   du   rotor   jusqu’au   bout   inférieur   du   tube)   pendant   15min.  Protéger  la  solution  de  la  lumière  (aluminium  autour  du  tube)  et  stocker  à  +4°C.        Nettoyage  de  la  machine  (avant  et  après  chaque  analyse)      -­‐  Déposer  350μl  d’eau  Milli-­‐Q  dans  le  puit  marqué  de  la  puce  de  nettoyage  (electrode  cleaner).    -­‐  Placer  cette  puce  dans  le  bionalyser  Agilent  2100  pendant  5min.    -­‐  Retirer  cette  puce  et  laisser  sécher  2min  les  électrodes  avant  l’analyse.      Dépôt  du  Gel-­‐Dye  Mix    -­‐   Laisser   le  Gel-­‐Dye  Mix,   les   échantillons   et   les  Markers   à   température   ambiante  pendant  30min   avant  utilisation.    -­‐  Mettre  une  nouvelle  puce  à  ADN  (DNA  Chip)  dans  la  station  d’amorçage  de  la  puce.    -­‐  Déposer  9μl  de  Gel-­‐Dye  Mix  dans  le  puits  marqué   .    -­‐  Mettre  la  seringue  dans  son  support  et  tirer  sur  le  piston  de  la  seringue  jusqu’à    1ml.    -­‐  Visser  la  seringue  dans  le  support  de  la  puce  (  !  ne  pas  oublier  de  mettre  le    chronomètre  sur  30  sec).    -­‐  Enfoncer  le  piston  de  la  seringue  jusqu’au  clip  (le  piston  reste  enfoncé  grâce  au  clip).    -­‐  Attendre  exactement  30  sec  et  relâcher  le  clip  (en  appuyant  sur  la  gâchette  du  clip).    -­‐  Attendre  5  sec  et  tirer  doucement  le  piston  à  la  position  1ml.    -­‐  Ouvrir  la  station  d’amorçage  et  déposer  9μl  de  Gel-­‐Dye  Mix  dans  le  puits  marqué    G.      Dépôt  des  Markers    -­‐  Déposer  5μl  de  Markers   (Vert)  dans   les  puits  de  12  échantillons  et  dans   le  puits  «  échelle  ».  Tous   les  puits  doivent  être  remplis.    Dépôt  du  marqueur  (Ladder)  et  des  échantillons    -­‐  Déposer  1μl  de  DNA  Ladder  (jaune)  dans  le  puits  marqué    -­‐  Dans  chacun  des  12  puits  destinés  aux  échantillons,  déposer  1μl   d’échantillons    (déposer   1μl   d’eau  Milli-­‐Q  dans  les  puits  qui  ne  seront  pas  utilisés).    -­‐  Vortexer  la  puce  1min  à  2400rpm  (vortex  adapté  aux  puces  Agilent).    -­‐  Placer  la  puce  dans  le  bionalyser  Agilent  2100  et  lancer  l’analyse  dans  les  5min.                          

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ANNEXE  6  :                                    Résultats  ARISA        Electrophorégrammes                                                  Gel  image                    L              S1a          S1b          S1c          S2a          S2b        S2c        S3a          S3b          S3c      Sterivex    ES          T  -­‐    

 

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 ANNEXE  7  :                   Coût  des  consommables        

       

 

                             

EXPERIENCES CONSOMMABLES REFERENCE FOURNISSEUR QUANTITE PRIX COÛT3TOTALSterivex((15) SVGV01015 Milipore( 7 147,00(€ 68,60(€

filtre(10(µm((100) 511P101 ipPORE( 3 100(€ 3(€

filtre(3(µm((100) 111112 Whatman( 3 100(€ 3(€

Bouchon(luer(lock((200) 394075 BD 7 16,90(€ 0,60(€

Total 75,20(€

Tubes("bead(beating" 118585N MP(Bio( 4 3,96(€(le(tube 15,84(€

Tampon(de(lyse

Tris)HCl T3253 Sigma(Aldrich( 3,025(g 36,20€/100g 1,09(€

EDTA E6758 Sigma(Aldrich( 10(mL 32,80/100g 3,20(€

NaCl 71382 Sigma(Aldrich( 4,38(g 73,71/1Kg 0,33(€

Proteinase(K 11578916 Invitrogen( 500(µL 120€/100mg 0,60(€

SDS( 7920 Sigma(Aldrich( 800(µLZ(0,1(g 0,62€/g 0,06(€

Sarkosyl LZ5777 Sigma(Aldrich( 800(µLZ(0,1(g 112€/100g 0,11(€

PCI 77617 Sigma(Aldrich 8(mL 0,43/ml 3,44(€

Chloroforme 438601 Carlo(Erba 8(mL 5,5€(le(litre 0,04(€

Acétate(de(Sodium S2889( Sigma(Aldrich 20,4g 78,40€(le(kg 1,60(€

Isopropanol I9516 Sigma(Aldrich 5,6(mL 21,90/100mL 1,18(€

Ethanol 529152 Carlo(Erba 4mL 46,25€(les(25L 0,01(€

Total 27,50(€

Kit3MoBio3PowerSoil Z 6(extractions 266€(/(50(extractions 31,92(€

Total 31,92(€

dNTP U1511 Promega 10,5(µL 25€(200µL 1,31(€

Tampon(Z(MgCl2 M7911 Promega 105(µL 35€(20(mL 0,17(€

Primer(ITSR Z EuroGenTec 2,1(µL 0,058 1,33(€

Primer(ITSF Z EuroGenTec 2,1(µL 0,043 0,98(€

Taq M7806 Promega( 2,52(µL 600€/2500u 3,40(€

Barettes(de(PCR I1402Z3500 Starlab 2 42,5/125(barettes 0,68(€

Caps(de(barettes(PCR I1400Z0810 Starlab 2 10,9/125(caps 0,17(€

Total 39,96(€

ladder(100bp G5711 Promega( 3(µL 0,56(€

Agarose A9539 Sigma(Aldrich ~(1g 79,80€/100g 0,80(€

tampon(TAE GEPTAE00(09 EuroBio 200mL 130€/10L 0,26(€

Total 1,62(€

QuantZiT(PicoGreen®(

dsDNA(Assay(Kit 10535213 Fisher 28 536€/200 75,04(€

plaque(noire(96(puits 137502 Sigma(Aldrich 1 89€/100 0,89(€

Total 75,93(€

ARISA Z Agilent 1 24,96 24,96(€

24,96(€

tubes(2mL E1420Z2000 Starlab 28 11€/500 0,62(€

Pointes(à(filtre(1000µL S1122Z1830 Starlab ~(20 144€/960 3(€

Pointes(à(filtre(200µL S1120Z8810 Starlab ~(50 47€/960 2,35(€

Pointes(à(filtre(10µL S1120Z3810 Starlab ~(100 47€/960 4,70(€

Gants(nitrile(taille(Small 112Z2371 VWR( 1/2(boîte 9,10/boîte 4,55(€

Total 15,22(€

TOTAL 292,31(€

Migration3sur3gel

Filtrations

Picogreen

PCR

Extraction3d'ADN3phénol/chloroforme

Matériel3de3routine

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 ANNEXE  8  :                      Exemple  de  devis      

 

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   ANNEXE  9  :                              Cahier  de  laboratoire    

 

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