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Chapitre III

PROTIDES

______________________________________________________________________________________________________ Cours de Biochimie structurale RM MAAROUFI

LES PROTIDES

Les acides aminés Formule générale

Classification :

selon la structure de la chaîne latérale ou radical R : �� aliphatique (16) hydrocarbonée (5) : linéaire (glycine, alanine), ramifiée (valine, leucine et isoleucine), à fonction alcool (2) : sérine et thréonine, à fonction soufrée (2) : cystéine et méthionine, à fonction acide (et amide correspondante) (4) : acide aspartique et asparagine, acide glutamique et glutamine, à fonction basique (3) : lysine, arginine et histidine

�� cyclique (4) aromatique (3) : phénylalanine, tyrosine et tryptophane hétérocyclique (1) : proline.

selon la polarité de la chaîne latérale ou radical R : �� polaire (11) non ionisable (6) : sérine, thréonine, asparagine, glutamine, cystéine, tyrosine ionisable (5) : acide aspartique, acide glutamique, lysine, arginine, histidine

�� non polaire (9) : glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine,

méthionine, phénylalanine, tryptophane, proline

R - C - COO -

NH3+

H Ici l’acide aminé est représenté sous la forme

ionique qui prévaut à pH 7, dit pH physiologique. radical R

carbone αααα

groupement α−α−α−α−aminé

groupement α−α−α−α−carboxylate


Les 20 acides

aminés naturels


Les 20 acides aminés naturels

(suite)


Propriétés physiques

Aspect : solides blancs cristallisés se décomposant avant de

fondre

Solubilité : Solubilité aqueuse : en rapport avec leur structure polaire, la nature de la chaîne latérale, le pH de la solution, nature des ions et leur concentration Solubilité dans les solvants organiques : faible mais variable selon la nature de la chaîne latérale R

Pouvoir rotatoire : Aminoacides naturels (sauf glycine) → carbone α asymétrique

Certains acides aminés → 2ème

carbone asymétrique

Pouvoir rotatoire variable en

fonction de la nature du solvant

et du pH

R - C - COO -

NH3+

H

carbone αααα

*


Pouvoir rotatoire (suite)

Absorption ultraviolette

C

COOH

R

H NH2

forme D

C

COOH

R

H2N H

forme L

Spectres d’absorption dans l’ultraviolet


Propriétés chimiques

Ionisation :

En fonction du pH :

NH3+- CH - COOH NH3

+- CH - COO- NH2 - CH - COO-

R R R

forme cation = A+ ion mixte = A±±±± forme anion = A- (zone de pH acide) ion dipolaire ou zwitterion (zone de pH alcalin) charge nette = +1 charge nette = 0 charge nette = -1

point isoionique pI : pH auquel la forme ion dipolaire est prédominante

A+ →→→→ A±±±± + H+ avec K1 = [A

±±±±] [H+] / [A+] (1) où K1 est la constante de dissociation du carboxyle.

A±±±± →→→→ A- + H+ avec K2 = [A

-] [H+] / [A±±±±] (2) où K2 est la constante de dissociation du groupe aminé.

De (1) on tire : [A+] = [A±±±±] [H+] / K1 De (2) on tire : [A-] = [A±±±±] K2 / [H

+] Au point isoionique [A+] = [A-] D’où les équations suivantes : [A±±±±] [H+] / K1 = [A

±±±±] K2 / [H+]

[H+]2 = K1 K2 ce qui donne [H

+] = K1 K2

et log [H+] = ½ log K1 + ½ log K2

or pH = - log [H+] d’où pI = pH = ½ pK1 + ½ pK2

+ H+ - H+


Cas d’un acide aminé neutre : la glycine. glycine (R = H) : acide monoaminé et monocarboxylé.

NH3+- CH2-COOH NH3

+-CH2-COO- NH2–CH2-COO-

forme cation = A+ ion mixte = A±±±± forme anion = A-

(zone de pH acide) (zone de pH alcalin) charge nette = +1 charge nette = 0 charge nette = -1

Le point isoionique de la glycine sera : pI = ½ pK1 + ½ pK2 = ½ (2,4) + ½ (9,6) = 6

Cas d’un diacide aminé: l’acide aspartique. acide aspartique : un acide aminé possédant une 2ème fonction carboxylique apportée par son radical R (R = - CH2 – COO-).

NH3+-CH-COOH NH3

+-CH-COO- NH3+-CH-COO- NH2-CH-COO-

CH2 CH2 CH2 CH2

COOH COOH COO- COO-

forme cation = A+ ion mixte = A±±±± forme anion 1 = A±±±±- forme anion 2 = A= (zone de pH acide) (zone de pH alcalin) (zone de pH alcalin) charge nette = +1 charge nette = 0 charge nette = -1 charge nette = -2

Le point isoionique de l’acide aspartique sera : pI = ½ pK1 + ½ pKR = ½ (2,1) + ½ (3,9) = 3

pK1 2,1

+ H+ - H+

pK1 2,4

pK2 9,6

PKR 3,9

PK2 9,8


Cas d’un acide aminé dibasique: l’histidine. Histidine : acide aminé possédant une 2ème fonction aminée apportée par son radical R (R = - CH2 – Imidazole). NH3

+-CH-COOH NH3+-CH-COO- NH3

+-CH-COO- NH2-CH-COO-

CH2 CH2 CH2 CH2

CH = C CH = C CH = C CH = C

NH+ NH NH+ NH N NH N NH

CH CH CH CH

A+ A±±±±+ A±±±± A- ion dipolaire

Le point isoionique de l’histidine sera : pI = ½ pKR + ½ pK2 = ½ (6,3) + ½ (9,35) = 7,82

Cas d’un autre acide aminé dibasique: la lysine. lysine : acide aminé possédant une 2ème fonction aminée apportée par son radical R (R = - (CH2)4 - NH3

+). NH3

+-CH-COOH NH3+-CH-COO- NH2-CH-COO- NH2-CH-COO-

(CH2)4 (CH2)4 (CH2)4 (CH2)4

NH3+ NH3

+ NH3+ NH2

A+ A±±±±+ A±±±± A- ion dipolaire

Le point isoionique de la lysine sera donc de : pI = ½ pKR + ½ pK2 = ½ (9) + ½ (10,5) = 9,75

pK1 2,2

PKR 6,3

PK2 9,35

groupement imidazole

pK1 3,2

PK2 9

PKR 10,5


Courbe de neutralisation de la glycine

Courbe de neutralisation de l’acide glutamique


Courbe de neutralisation de la lysine


Décarboxylation, désamination :

Perte de chacune des fonctions caractéristique séparément ou

simultanément

Décarboxylation : →→→→ amines primaires R – CH – NH2 →→→→ R – CH2 – NH2 + CO2 COOH Certaines amines formées →→→→ propriétés biologiques importantes (histidine →→→→ histamine, sérine →→→→ éthanolamine, …)

Désamination : �� chimique : par action de l’acide nitreux →→→→ formation d’un dérivé diazoïque instable qui se décompose avec libération d’azote et formation d’un acide-alcool (dosage gazométrique de Van Slyke). �� enzymatique : deux types de mécanisme (désamination oxydative et transamination).

Désamination et décarboxylation simultanées: Action de la ninhydrine : �� 1er temps : formation de ninhydrine réduite ou hydrindantine �� 2ème temps : formation d’un composé coloré en bleu violet intense


Amidification :

Le carboxyle comme l’amine peuvent être amidifiés individuellement �� asparagine et glutamine sont des amides �� liaison amide substituée – CO – NH – entre deux aminoacides

Autres dérivés :

�� Condensation du groupement aminé avec divers dérivés aromatiques comme le 1-fluoro, 2-4-dinitrobenzène (DNFB) (réactif de Sanger) : DNFB + aminoacide →→→→ DNP-aminoacide (coloration jaune) + HF comme le phénylthioisocyanate (PTC) (réactif d’Edman) : PTC + aminoacide →→→→ PTH-aminoacide comme le chlorure de dansyle : Chlorure de dansyle + aminoacide →→→→ dansyl-aminoacide

�� Condensation avec le formol en excès →→→→dérivés N-dihydroxyméthylés plus acides (pK2 plus faible) titrables par une base forte (formoltitration de Sörensen).

Propriétés des chaînes latérales :

�� Estérification des hydroxyles alcooliques (esters acétiques, phosphoriques) �� Oxydation des groupements thiols en présence d’oxygène

Cys-SH + Cys-SH →→→→ H2O + Cys-S-S-Cys

Dosage :

Chimique : réaction à la ninhydrine (voir ci-dessus) : la densité optique du produit est proportionnelle à la quantité d’acide aminé Enzymatique : action d’aminoacide-oxydases →→→→ libération d’ammoniac et d’αααα-cétoacides correspondants pouvant être facilement dosés, décarboxylases →→→→ amines aisément identifiables


Les protéines

Peptide →→→→ enchaînement de quelques à plusieurs acides aminés (n ≥≥≥≥ 2) (oligopeptides, polypeptides) Liaison peptidique :

Par convention :

- le groupement aminé – NH2 libre s’écrit à gauche

- les résidus d’acides aminés sont numérotés à partir de ce même

groupement

n = 2 →→→→ dipeptide

n = 3 →→→→ tripeptide

………

polypeptide (~ n > 100) →→→→ protéine

NH2 - CH - COOH

R1

NH2 - CH - COOH

R2

+

H2O

NH2 - CH – CO -

R1

NH - CH - COOH

R2

liaison peptidique

H2N - CH – CO -

R1

NH - CH – CO -

R2

NH - CH – CO - - - - - - - - - - -

R3

NH - CH – COOH

Rn

H2N COOH

R1 R2 R3 Rn


Les différents niveaux de structure :

�� différents types de liaisons : �� Structure primaire : Séquence des acides aminés : enchaînement linéaire de résidus

d’acides aminés unis par des liaisons peptidiques

�� Structure secondaire : due à des liaisons hydrogène intra- et extra-moléculaires entre

C = O et H - N

Hélice α : Liaisons H parallèles à

l’axe de la chaîne et

intramoléculaires


Feuillet plissé β : Liaisons Hydrogène

perpendiculaires à

l’axe de la chaîne et

intermoléculaires

�� Structure tertiaire : due à l’existence de liaisons

secondaires (hydrophobes, ioniques,

hydrogène, covalentes (ponts

disulfures) entre chaînes latérales

de résidus d’acides aminés : état

replié des protéines.

�� Structure quaternaire : due à une association de plusieurs chaînes polypeptidiques dans le

cadre d’une seule molécule protéique (ex : hémoglobine formée de

quatre chaînes polypeptidiques : 2α + 2β, immunoglobulines

(anticorps) formées de quatre chaînes polypeptidiques : 2 H + 2 L)

NH2

COOH

Fig 4.14 Biochimie structurale


α α α α 1 α α α α 2

β β β β 1 β β β β 2

L’hémoglobine : 4 sous-unités protéiques identiques 2 à 2 (α α α α 1 et α α α α 2, β β β β 1 et β β β β 2 ) Chaque sous-unité est liée à une molécule organique non-protéique (hème : )

L L H H

Immunoglobuline : 4 chaînes

polypeptidiques identiques 2 à 2

(2H + 2 L) reliées par des ponts disulfure ( : - S – S - )


Classification des protéines :

- selon leur composition :

�� holoprotéines : uniquement composées d’acides aminés

�� hétéroprotéines : acides aminés + groupement prosthétique

(partie non protéique : glucides, lipides, acides nucléiques, ions

métalliques).

- selon leur forme globale :

�� protéines globulaires (globulines) : sphéroïdes (rapport axial

< 10), solubles dans l’eau, rôle fonctionnel, ex : enzymes,

hormones, anticorps, …

�� protéines fibreuses : filiformes (rapport axial > 10),

insolubles dans l’eau, rôle structural ou protecteur, ex :

kératine, collagène ...

Représentation d’une protéine fibreuse (fibre de laine) : a) structure moléculaire de l’αααα kératine de la laine : 3 chaînes en hélice αααα imbriquées (protofibrille) b) arrangement de 11 protofibrilles : microfibrille de laine


Propriétés physiques

Aspect : substances solides, le plus souvent sous forme de poudres

amorphes, de nombreuses protéines obtenues sous forme cristallisée.

Solubilité : - protéines globulaires en général solubles dans l’eau, pratiquement insolubles dans les solvants organiques

- protéines fibreuses(scléroprotéines) insolubles

- solubilité variable - facteurs de la solubilité : pH, t°C, force ionique (concentration en électrolytes), solvants organiques, présence de certains cations (Zn++, Hg++), interactions diverses, …

Influence de la concentration en sel (force ionique µµµµ, I)

Fig. 4.18 Biochimie structurale


Influence du pH A µµµµ et t°C constantes : pH ≈≈≈≈ pHi →→→→ minimum de solubilité (charge électrique globale nulle, maximum d’interactions électrostatiques)

Influence des solvants organiques

Solvants organiques miscibles à l’eau (éthanol, acétone) →→→→ baisse de la cste diélectrique du milieu et de l’hydratation des groupements polaires, insolubilisation des protéines (t°C < 0 →→→→ pas de dénaturation)

Influence de la température

Le plus souvent augmente la solubilité ( pour t°C < t°C de dénaturation)

Dénaturation �� Désorganisation de la structure interne (structures secondaire, tertiaire, quaternaire) par rupture des liaisons secondaires (ex : thermocoagulation de l’ovalbumine du blanc d’œuf) �� Dénaturation douce réversible : la suppression de l’agent dénaturant permet la renaturation de la protéine par rétablissement de liaisons secondaires spécifiques �� Dénaturation brutale, irréversible : passage de l’état déployé à un état dénaturé par établissement de liaisons secondaires non spécifiques

Fig. 4.17 Biochimie structurale


Propriétés des solutions protéiques

Viscosité : dépend de la taille et de la concentration

Propriétés optiques : en rapport avec : - la concentration de la solution (indice de réfraction, absorption, diffusion - la taille et la forme des particules (diffusion de la lumière) - la structure chimique de la protéine (absorption UV à 280 nm due aux résidus aromatiques, pouvoir rotatoire)

Propriétés chimiques des protéines �� Propriétés ioniques (amphotérie des protéines) : charges électriques, portées en particulier par les chaînes latérales des acides aminés, variables en fonction du pH

Chaque protéine possède un pHi pour lequel la mobilité dans un champ électrique est nulle : charge électrique globale nulle En général pHi < 7 : dans la matière vivante, les protéines se comportent comme des anions �� Réactions des protéines : combinaison avec le DNFB, oxydation et réduction des groupes thiol ou disulfure, rupture des liaisons peptidiques par hydrolyse chimique ou enzymatique, réactions colorées (réaction du biuret), …


Méthodes d’analyse des protéines Préparation :

�� extraction : à partir de matériel frais ou délipidé, basée sur les propriétés de solubilité �� purification et fractionnement :

�� élimination des petites molécules (ultrafiltration, dialyse) �� séparation des macromolécules (précipitations fractionnées, chromatographie d’exclusion stérique, chromatographie échangeuse d’ions, électrophorèse) �� vérification de la pureté et de l’intégrité de la protéine : mise en œuvre de critères physiologiques (activité hormonale), immunologiques (réaction antigène-anticorps) biochimiques (activité enzymatique spécifique) et physico-chimiques (cristallisation, courbe de solubilité, ultracentrifugation, électrophorèse)

Méthodes de dosage :

�� méthodes physiques : dosage par pesée : insolubilisation, précipité lavé, séché puis pesé. dosage réfractométrique : variation de l’indice de réfraction en fonction de la concentration dosage par spectrophotométrie UV

�� méthodes chimiques : dosage de l’azote selon Kjeldahl : minéralisation de l’azote protéique à l’état d’ammoniac dosable par acidimétrie ou colorimétrie

dosage colorimétrique : réaction du biuret, réactif de Folin, … dosage immunologique : fondée sur la réaction antigène-anticorps


Structure primaire : détermination de la séquence des acides aminés

Méthodes d’étude : �� composition totale en acides aminés : hydrolyse chimique totale HCl 6M, 48 H, 110°C) ; séparation et analyse quantitative �� détermination des séquences :

- détermination des acides aminés N-terminaux : réactif d’Edman (PTC), chlorure de dansyle utilisation d’exopeptidases : leucine aminopeptidase - détermination des acides aminés C-terminaux : hydrazinolyse utilisation d’exopeptidases : carboxypeptidase - coupure de la chaîne peptidique : utilisation d’enzymes : endopeptidases

NB La séquence est toujours la même pour une protéine d’une espèce donnée Tous les acides aminés sont en général présents Absence de périodicité Existence d’un contrôle héréditaire de la séquence des acides aminés Tous les acides aminés n’ont pas le même rôle La séquence conditionne la configuration spatiale

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