140

Chapitre 7

Modélisation

Les formes de modèles présentées dans la littérature pour les cellules de plantes sont non

structurés et ne sont aucunement prédictifs. De plus, ils ne donnent aucune appréciation des

états métaboliques des cellules. Le modèle développé ici poursuit les travaux de Bouchard-

Marchand (2000) et Jolicoeur (1998), qui s’étaient limités au métabolisme primaire. Les

résultats générés lors des cultures de racines transformées deC. roseusprésentées aux cha-

pitres précédents ont fournit les bases biologiques du modèle présenté ici. Leur exploitation

permettra de déterminer certains paramètres du modèle.

Le modèle proposé dans ce chapitre pose la structure d’un modèle prédictif dont le but est

de prévoir le comportement métabolique d’une culture de racines transformées deC. roseus

en mode cuvée et semi-continu. L’originalité de ce modèle est qu’il tient compte de nom-

breuses voies métaboliques primaires pour décrire la croissance et la production de TIA. Il

informera sur le statut de voies métaboliques activées ou inhibées selon le statut nutritionnel

des racines.

Un tel modèle est cependant ambitieux, car il vise à constituer un outil utile de valida-

tion d’hypothèses basées sur la physiologie des racines. Au moment de la rédaction de ce

mémoire, ce modèle est stable numériquement, mais n’est pas optimisé pour décrire les mé-

tabolismes primaires et secondaires deC. roseus. Aussi, la structure du modèle est présentée

comme base de travail ultérieur. Des hypothèses de modélisation sont posées et nombre im-

141

portant de paramètres devront être déterminés lors de travaux futurs. L’objet principal de ce

travail est d’apporter une nouvelle structure de modèle qui pourra être facilement ajustée

par la suite. Les différents paramètres (lois cinétiques, constantes) seront aussi adaptables à

d’autres espèces de plantes.

7.1 Objectifs et synoptique du modèle

Les objectifs du modèle sont relativement simples, mais dans cette simplicité se cache

une grande complexité. Le modèle doit être capable d’estimer l’orientation du métabolisme

de la cellule selon l’état physiologique de la cellule et certains signaux. Cette capacité doit

l’amener a prédire les dynamiques extra et intracellulaire des espèces chimiques étudiées.

Afin de remplir cet objectif, il est nécessaire de comprendre le fonctionnement de la cel-

lule vivante. La revue de littérature et les chapitres précédents apportent beaucoup d’infor-

mations à ce sujet. Selon une vision purement physique, la cellule vivante est un bioréacteur

dans lequel se produit un nombre extraordinaire de réactions biochimiques simultanément et

qui est capable d’évoluer selon son environnement. Ceci est thermodynamiquement possible

grâce à l’utilisation d’énergie externe apportée sous la forme de photons ou de matières orga-

niques. Sans cette énergie, la cellule meurt. Vu la complexité et notre connaissance limitée du

réseau métabolique impliqué, modéliser l’ensemble de ces réactions biochimiques de manière

exhaustive ne se produira probablement pas avant longtemps. En revanche, il est possible de

faire une synthèse simplifiée des phénomènes régissant la vie d’une cellule.

Le modèle doit être capable de prédire l’évolution d’un système en culture cuvée. Ce

genre de système n’est jamais en état stationnaire. Le modèle doit donc intégrer des notions

de cinétique afin de rendre compte de l’évolution du système. Il doit aussi intégrer la connais-

sance des mécanismes cellulaires et de leur régulation, ceci afin de donner à la cellule simulée

un pouvoir de décision. Ceci implique nécessairement l’écriture d’un réseau de réactions chi-

miques décrivant le fonctionnement de la cellule. Ce réseau est appelé réseau métabolique.

142

Les voies métaboliques primaires sont nombreuses et partagent de nombreux intermé-

diaires. Aussi, le réseau métabolique décrivant toutes ces réactions est relativement complexe.

Pourtant, d’un point de vue mécanistique, plusieurs voies métaboliques clefs ont été isolées

(section 2.1): la glycolyse, la voie des pentoses phosphates, le TCA, etc. Si on souhaite don-

ner au modèle un pouvoir décisionnel sur le choix des voies métaboliques à privilégier, il

faut obtenir un moyen de réguler ces voies simplement. Cette tâche serait probablement dif-

ficile à réaliser avec un modèle purement cinétique. En effet, il faudrait incorporer dans les

lois cinétiques de chaque réaction des paramètres décrivant la participation de chaque voie

métabolique dans le flux total de la réaction.

Le fait de supposer que certains intermédiaires réactionnels sont à l’état stationnaire per-

met de simplifier une partie des calculs du réseau métabolique. Cette hypothèse est justifiée

par le maintient de l’homéostasie de la plupart des intermédiaires réactionnels impliqués dans

le métabolisme primaire. Les calculs utilisés dans l’analyse de flux métaboliques (MFA) sont

en effet suffisamment puissants pour déterminer les flux de sortie d’un système à l’état sta-

tionnaire en fonction des flux d’entrée (Stephanopoulos et al., 1998). La technique d’analyse

de la structure des réseaux métaboliques1 (ASRM) développée par le même auteur permet de

trouver les voies métaboliques indépendantes dans un réseau métabolique.

Le modèle proposé utilise les nécessités d’une description cinétique et les avantages du

calcul par la technique du ASRM pour simplifier une partie du réseau métabolique. La mo-

délisation est divisée en deux parties.

La première partie est chargée de décrire la cinétique de transport des nutriments dans

la cellule, la cinétique de stockage de ces nutriments, la cinétique de stockage des macro

molécules créées par la cellule et la cinétique de croissance liée a l’utilisation de ces macro-

molécules. L’ensemble des réactions décrivant ces dynamiques nutritionnelles est appelé le

sous-réseau métabolique transitoire primaire (SMTP). Dans le cas présent deC. roseus, le

métabolisme secondaire est décrit également par des lois cinétiques à partir de deux précur-

1. Analysis of structure of metabolic networks.

143

seurs : la tryptamine et la sécologanine. Les réactions du métabolisme secondaire forment ce

qu’on appelle par la suite le sous-réseau métabolique transitoire secondaire (SMTS).

La seconde partie est chargée de décrire la synthèse de macro molécules, de précurseurs

de métabolites secondaires et la génération d’énergie à partir des nutriments disponibles dans

le cytosol. Cette partie est décrite par un réseau de flux métaboliques considérés comme étant

à l’état stationnaire. Ce réseau est nommé sous-réseau métabolique stationnaire (SMS). Il est

simplifié en voies métaboliques indépendantes par la technique de ASRM.

Les navettes énergétiques définies à la section 2.1 (ATP, NADH et NADPH) ne sont pas

considérées comme des métabolites dont la concentration est à l’état stationnaire. Ils forment

le bassin des navettes énergétiques, dont le contenu est dynamique.

Ainsi, le modèle fonctionne de cette manière : le SMS est réduit en voies métaboliques

indépendantes pour lesquelles des lois cinétiques sont assignées. L’ensemble de ces voies

indépendantes et des voies du SMTP et du SMTS forment le réseau métabolique complet,

décrit par des lois cinétiques. Les espèces chimiques du réseau complet sont représentées par

un vecteurX dont la variation par rapport au temps s’exprime simplement par:

dXdt

= F(X)−µX

La fonctionF calcule les variations des bassins de nutriments, macro-molécules et méta-

bolites secondaires en fonction du contenu de ces bassins. Comme la plupart des cinétiques

utilisées sont de type Monod,F est non linéaire. Le terme−µX représente la dilution des

espèces intracellulaires à cause de la croissanceµ. Un schéma résumant le fonctionnement du

modèle est présenté sur la figure 7.1.

Le fait d’avoir réduit en chemins métaboliques indépendants les réactions du SRS présente

deux avantages:

1. le nombre de réactions cinétiques est réduit,

144

Figure 7.1 –Synoptique du modèle cinétique.

145

2. le modèle peut choisir en temps réel quel chemin métabolique privilégier selon le statut

nutritionnel de la cellule. Ces décisions sont appuyées sur des connaissances acquises

lors de l’expérimentation et fournies dans la littérature.

Dans un premier temps, les hypothèses du modèle en entier sont présentées. Ensuite, les

voies métaboliques indépendantes du SMS sont déterminées. Enfin, le STMP et le SMTS sont

décrits, ainsi que l’intégration des voies métaboliques indépendantes du SMS dans le modèle

cinétique.

7.2 Hypothèses de modélisation

7.2.1 État quasi-stationnaire

On suppose que les réactions du métabolisme primaire sont à l’état stationnaire. Les bas-

sins de nutriments alimentant ces réactions ne sont en revanche pas à l’état stationnaire.

7.2.2 Bassins de nutriments

Le trois nutriments utilisés sont le Pi, l’azote sous forme de nitrate (NO3) ou d’ammonium

(NH4), et les glucides sous forme de saccharose (SAC), glucose (GLU) et fructose (FRU).

Dans la cellule, ces nutriments existent dans le cytosol et dans le vacuole (Pi (VPi), saccharose

(VSAC) et nitrate (VNO3)). Ce choix est basé sur les résultats présentés dans les chapitres

précédents et ceux sur les racines transformées de carotte (Bouchard-Marchand , 2000).

7.2.3 Bassins des métabolites

Les métabolites produits par les réaction biochimiques sont stockés dans des bassins. Ce

sont les acides aminés (AA), les lipides (LIP), les phosphates organiques (nucléotides, etc.)

(OP), la paroi cellulaire (STH), les acides organiques (ORA), et l’amidon (STA). Ils sont

utilisés pour la croissance ou en cas de limitation nutritionnelle, comme source de nutriments

via des réactions de catabolisme explicitées. L’amidon fait exception dans le sens où il n’est

146

pas utilisé directement pour la croissance. Il est synthétisé et stocké dans les plastides. Il est

considéré comme réserve de glucides en cas de carence de saccharose, glucose ou fructose.

La tryptamine (TRY) et la sécologanine (SEC) représentent aussi deux bassins de méta-

bolites alimentés par le métabolisme primaire et utilisé par le métabolisme secondaire.

7.2.4 Croissance

La croissance est modélisée de manière exponentielle où le taux spécifique de croissance

suit une forme de Teissier (Bouchard-Marchand , 2000; Jolicoeur, 1998):

µ= µmax.∏i

(1−e−Ki([Métabolitei ]−[Seuili ])

)

où i est un élément de l’ensemble {acides aminés, lipides, phosphates organiques, paroi cel-

lulaire, navettes énergétiques}.

7.2.5 Lois cinétiques

Les vitesses de réactions suivent pour la plupart des cinétiques de Monod, à une ou deux

affinités. En effet, les réactions de transport ou de conversion chimiques sont toutes enzyma-

tiques et ce type de réactions est bien décrit par une cinétique de Monod.

Les problèmes surviennent lorsqu’on désire tenir compte des navettes énergétiques dans

les lois cinétiques. En effet, la plupart des transports de nutriments sont actifs et font donc

intervenir de l’ATP. Beaucoup de réactions enzymatiques nécessitent des cofacteurs tels que

le NAD+/NADH ou le NADP+/NADPH. De même, le Pi est utilisé dans la plupart des ré-

actions mettant en jeu de l’ATP. Si ces navettes énergétiques ne sont plus disponibles, les

réactions qui les utilisent doivent avoir une vitesse de réaction nulle.

Plusieurs options sont possibles. Si une réaction utilise un substrat S et par exemple du

NADH, les cinétiques enzymatiques à 2 substrats peuvent être utilisées. Si des réactions mo-

léculaire d’ordre 1 pour chaque substrat et pour l’enzyme sont utilisées, selon le mécanisme

147

réactionnel, trois types de cinétiques sont obtenues: adsorption séquentielle ordonnée des 2

substrats sur l’enzyme, adsorption séquentielle aléatoire des 2 substrats sur l’enzyme, et mé-

canisme ping-pong qui nécessite la formation d’au moins 2 produits. Par exemple, la cinétique

du premier mécanisme s’écrit pour deux substrats A et B (Michal, 1999):

1v0

=1

vmax+

KAM

vmax× [A]+

KBM

vmax× [B]+

KABM

vmax× [A]× [B]

Ce genre de cinétiques n’est pas adaptés aux réactions décrites dans le modèle développé

dans ce chapitre. En effet, ce ne sont pas des réactions élémentaires. Les réactions du modèle

intègrent la plupart du temps un transport ou des réactions enzymatiques successives, associés

à une consommation énergétique.

Afin de pouvoir tester le modèle avec des simulations, deux formes de cinétiques peuvent

être envisagées. La première est basée sur un mécanisme dans lequel la réaction chimique

est élémentaire et tous les substrats se fixent en même temps sur l’enzyme. Il est facile de

montrer que la vitesse de réaction s’écrit:

v = vmax

∏i

[Si ]

Km +∏i

[Si ]

D’un point de vue mathématique, ce genre de relation risque de causer des problèmes de

précision en calcul flottant et de stabilité numérique si on utilise beaucoup de substrats. De

plus, cela défini un seulKm pour l’ensemble de la réaction. Or les réactions modélisées ne

sont pas élémentaires. Aussi la cinétique suivante est proposée:

v = vmax ∏i

[Si ]K i

m +[Si ]

Cette forme de cinétique permet d’ajuster individuellement l’influence de la concentration

de chaque produit sur la vitesse de réaction. Le désavantage principal de cette forme de loi

cinétique est qu’il introduit beaucoup de paramètres.

Certaines réactions ont des coefficients stœchiométriques élevés pour les navettes éner-

148

gétiques. Pour tenir compte de l’ordre partielνi des réactifs, on peut améliorer la relation

précédente:

v = vmax ∏i

[Si ]νi

(K im)νi +[Si ]νi

Ainsi, le modèle utilise pour la majorité des lois cinétiques ce type de loi.

7.2.6 Fonctions de décisions

Le modèle doit décider quelle voie métabolique il privilégie selon le statut nutritionnel

de la cellule et en cas d’élicitation. Ces décisions dépendent des concentrations des bassins

nutritionnels. La manière la plus simple de modéliser une décision est d’utiliser une condition

du genre :

δ(S,Ss) =

0 si S< Ss,

1 si S> Ss.

où Ss est la concentration seuil de la décision. On multiplie alors la vitesse d’un flux par

δ(S,Ss).

Cette approche n’est pas très satisfaisante pour des phénomènes biologiques et les fonc-

tions sigmoïdes sont plus appropriées pour décrire une réponse continue au lieu d’un réponse

discrète (Thornley et Johnson, 1990):

σ(S,Ss,n) =Sn

Sns +Sn

oùn est l’ordre de la sigmoïde. Cette fonction est une généralisation de la fonctionδ puisque

limn→+∞

σ(S,Ss,n) = δ(S,Ss)

Pour une valeur den = 1, on retrouve un fonction de Monod classique. Dans la suite du

149

chapitre, on fera appel aux fonctions de Monod par la notationσ(S,Ss,1). Pourn > 2, ces

fonctions ont une tangente horizontale à l’origine et un point d’inflexionSi tel que:

Si = Ss

(n−1n+1

) 1n

Ces fonctions sont utilisées chaque fois que le modèle doit prendre une décision pour

calculer la répartition des flux métaboliques dans les voies métaboliques.

7.2.7 Expression des concentrations

Les concentrations extracellulaire sont exprimées en mM. En effet, les vitesses de trans-

port des nutriments sont décrites par des cinétiques de Monod qui dépendent de la concen-

tration en mM des nutriments. Les concentrations intracellulaires sont exprimées en mmol.g

DW−1. L’utilisation de concentrations exprimées en mmol.g FW−1 pourrait être envisagée si

on pouvait déterminer les concentrations des différents métabolites en mM en utilisant des

techniques comme la RMN. Les mesures effectuées dans ce projet ne tiennent pas compte de

la compartimentation des différents métabolites dans la vacuole, les plastides, les mitochon-

dries, etc. Il est nécessaire d’exprimer les concentrations par unité de biomasse, afin de rester

consistant avec l’écriture de la loi de conservation de la matière.

7.2.8 Navettes énergétiques

Les navettes énergétiques utilisées sont le NADH, le NADPH et le NTP, nom générique

englobant tous les nucléotides trisphosphatés (ATP, GTP, CTP et UTP). Ces trois navettes

énergétiques ont leur partenaire : NAD+, NADP+et NDP respectivement. Les bassins de na-

vettes énergétiques sont dynamiques.

On suppose que les sommes (NDP+NTP), (NAD++NADH) et (NADP++NADPH) restent

constantes dans le temps et sont négligeables devant les concentrations des nutriments et des

métabolites. On néglige donc la formation et la dégradation de ces navettes. Cette hypothèse

est très contestable, notamment pour le NTP dont les concentrations cellulaires ont été repor-

150

tée comme étant assez élevées : de l’ordre de 10 mmol/g DW dans les cellules mammifère

CHO (Chinese Hamster Ovary) (Nyberg et al., 1999).

7.2.9 Simplification des voies métaboliques

Les voies métaboliques primaires sont simplifiées. Cette hypothèse se justifie par le nombre

très élevé de réactions impliquées. Pour les objectifs du modèle, il est peu probable que tenir

compte de toutes les réactions de biosynthèse soit requise.

On considère notamment que tous les acides aminés sont synthétisés à partir de l’oxoglu-

tarate (voir figure 2.3). En réalité, l’oxoglutarate est la molécule où se fixe l’ammonium pré-

sent dans tous les acides aminés. Mais le squelette carboné des différents acides aminés pro-

vient non seulement de l’oxoglutarate, mais aussi de l’oxaloacétate, du ribosyl-5-phosphate,

et de l’érythrose-5-phosphate + glycéraldéhyde. Ces squelettes carbonés sont aminés par une

transamination à partir du glutamate ou de la glutamine (Michal, 1999). La synthèse du tryp-

tophane est explicité sous une forme simple dans le SMS, car cet acide aminé intervient

explicitement dans la formation des précurseurs des TIA.

La synthèse des nucléotides est différente selon le type du nucléotide. Cette synthèse est

modélisée par une réaction chimique dont le bilan est la moyenne des bilans de production

des quatre nucléotides.

La synthèse de la paroi cellulaire fait intervenir également beaucoup de réactions car sa

structure chimique est très complexe (Reid, 1997). La réaction bilan de cette synthèse est

une moyenne des différentes réactions impliquées dans la synthèse de la paroi cellulaire, en

considérant qu’un précurseur (le glucose-6-phosphate) est convertit en une certaine unité de

paroi cellulaire.

La synthèse et la dégradation des lipides ont été simplifiées en considérant qu’un acétyl-

coenzyme A qui est normalement intégré dans un lipide vient augmenter le bassin des lipides

(réactions biochimiques explicitées par Harwood (1997)).

151

Les voies anaplérotiques sont simplifiées en une seule voie : phosphoénolpyruvate−→oxaloacétate.

7.2.10 Voies alternatives de la glycolyse

Les voies alternatives de la glycolyse (Plaxton, 1998) sont prises en compte au niveau de

la conversion du glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3 disphosphoglycérate et phosphoénolpy-

ruvate en pyruvate.

7.3 Sous-réseau métabolique stationnaire

7.3.1 Schéma métabolique proposé

Le schéma métabolique du SMS a été établi à partir de l’étude du métabolisme primaire

des cellules de plantes (section 2.1). Il est présenté sur la figure 7.2. Les nutriments utilisés

par le métabolisme primaire sont le glucose, le fructose, le saccharose et l’ammonium. Les

produits du réseau métabolique sont l’amidon, les hexoses structuraux (constituants de la pa-

roi cellulaire), les molécules organiques phosphatés (nucléotides, phospholipides et acides

nucléiques), les acides aminés, les acides organiques, la tryptamine et la sécologanine. Les

concentrations de ces espèces ne sont pas à l’état stationnaire. Enfin, les navettes énergé-

tiques, l’ammonium et le Pi sont utilisées par le SMS. Toutes ces espèces chimiques ont une

concentration dépendante du temps.

Les intermédiaires du SMS dont la concentration est considérée comme indépendante

du temps sont le glucose-6-phosphate, le phosphoénolpyruvate (glycolyse), le fructose-6-

phosphate, le glycéraldéhyde-3-phosphate (glycolyse et voie des pentoses phosphates), le

ribulose-5-phosphate, l’érythrose-5-phosphate (voie des pentoses phosphates), l’acétyl-co-

enzyme A, l’oxaloacétate, l’oxoglutarate (TCA), et le chorismate (voie de l’acide shiki-

mique). Les différentes voies métaboliques primaires ont été simplifiées (figure 7.2). Les

bilans métaboliques de ces voies sont présentés sur le tableau 7.1. Ils ont été établis à partir

152

Figure 7.2 – Sous-réseau métabolique. AA: acides aminés, A-CoA: acetyl-coenzymeA, CHO: chorismate, E4P: érythrose-4-P, F6P: fructose-6-P, FRU: fructose, G3P:glycéraldéhyde-3-P, G6P: glucose-6-P, GLU: glucose, GST: structural glucides; SEC: sé-cologanine, LIP: lipides, PEP: phosphoénolpyruvate, PYR: pyruvate, OAA: oxaloacétate,OP: molécules organiques phosphatées, ORA: acides organiques, OXO: oxoglutarate, R5P:ribulose-5-P, STA: amidon, STH: hexoses structuraux, SAC: saccharose, TRY: tryptamine.

des ouvrages de références (Michal, 1999; Taiz et Zeiger, 1998).

153

Tableau 7.1 –Réactions du SMS.Réaction Réaction Référence

1 GLU + NTP −→ G6P + NDP 1,2,62 FRU + NTP −→ F6P + NDP 1,2,63 G6P + 2 NADP −→ R5P + 2 NADH 14 3 R5P −→ 2 F6P + G3P 15 E4P + 2 PEP + NTP + NADH −→ CHO + 4 Pi + NDP + NAD 26 CHO + 2 AA + 2 NTP + R5P −→ PYR + 2 NDP + PPi + G3P + TRY 27 PEP −→ OAA + Pi 1,68 OXO+2 NAD + NDP + Pi −→ OAA + 2 NADH + NTP 19 PYR + NAD −→ NADH + ACOA 110 OXO + NH4 + 3 NADPH + 3 NTP −→ AA + 3 NADP + 3 NDP + 3 Pi 211 ACOA + NTP + 2 NADPH −→ LIP + NDP + Pi + 2 NADP 112 2 R5P −→ F6P + E4P 113 3 ACOA + 2 NADPH + 3 NTP −→ SEC + 2 NADP + 3 NDP + 3 Pi 114 G6P −→ F6P 1,2,615 ACOA + OAA + NAD −→ OXO + NADH 116 PEP + NDP −→ PYR + NTP 1,2,617 PEP −→ PYR + Pi 3,618 G3P + Pi + NDP + NAD −→ PEP + NTP + NADH 1,2,619 G3P + NADP −→ PEP + NADPH 3,620 F6P + NTP −→ 2 G3P + NDP 1,2,621 R5P+PYR + NTP −→ SEC + NDP + 2 Pi 422 R5P + 3.75 AA + 7 NTP + 0.25 NAD −→

7 NDP + 3.5 Pi + 1.75 PPi + 0.25 NADH + OP 223 G6P + 2 NTP + NADPH −→ STH + 2 NDP + NADP + Pi + PPi 224 STA + Pi −→ G6P 125 G6P + NTP −→ STA + NDP + PPi 226 LIP + 2 NTP + NAD −→ 2 NDP + PPi + NADH 527 ACOA −→ ORA28 ORA −→ ACOA29 F6P + PPi −→ 2 G3P + Pi 330 SAC + 2 NTP −→ G6P + F6P + 2 NDP 131 SAC + PPi −→ G6P + F6P 3

1 Taiz et Zeiger (1998)2 Michal (1999)3 Plaxton (1998)4 Contin et al. (1998)5 Harwood (1997)6 Brownleader et al. (1997)

7.3.2 Réduction du sous-réseau métabolique stationnaire en voies indé-

pendantes

Méthode. Pour réduire le SMS en voies indépendantes, on écrit la matrice des coefficients

stœchiométriques des réactions du réseau en ne tenant compte que des intermédiaires réac-

tionnels pour lesquels on a supposé un état stationnaire. Cette matrice est appelée matrice

SIMS (Stephanopoulos et al., 1998; Simpson et al., 1999). C’est une matricen×m écrite de

cette manière :

154

no. réaction

︷ ︸︸ ︷

N =

ν11 · · · ν1m...

.. ....

νn1 · · · νnm

no. métabolite

Ainsi νi j est le coefficient stœchiométrique du métabolitei dans la réactionj.

Dans notre cas, il y 31 réactions et 11 métabolites. La matrice SIMS est donc une matrice

11×31.

La détermination des voies métaboliques nécessite le calcul de la matrice noyauK qui est

une matricen×m:

no. voie métabolique

︷ ︸︸ ︷

K =

ν11 · · · ν1p...

.. ....

νm1 · · · νmp

no. réaction

La matriceK décrit chaque voie indépendante comme une combinaison linéaire des 31

réactions du SMS. Elle est une solution non triviale de l’équation (Stephanopoulos et al.,

1998):

N.K = 0

Comme cette équation admet une infinité de solutions, il est nécessaire de fixer arbitraire-

ment une partie de la matriceK. On peut ensuite calculer le reste de la matrice. Pour trouver

K, on procède comme suit. On décompose N en deux matrices:

N =(

N1 N2

)

155

tel queN1 soit une matrice carrée inversible (ceci peut nécessiter le changement des numéros

de réaction dans le réseau métabolique).

On décomposeK en 2 matrices:

K =

K1

K2

tel queK2 soit une matrice carrée de dimension le nombre de colonnes deN2. C’est cette

matrice qui constitue la partie du noyau qu’on fixe arbitrairement.

On a alors la relation :

(N1 N2

).

K1

K2

= 0

qu’on peut écrire :

N1.K1 +N2.K2 = 0

Dans cette équation, la seule inconnue estK1. CommeN1 est inversible, il vient:

K1 =−(N1)−1.N2.K2

De manière pratique, on peut commencer par poserK2 = I (I étant la matrice identité). Le

calcul deK1 permet ensuite de voir quels chemins métaboliques indépendants sont obtenus.

Souvent, les chemins obtenus sont physiquement non réalistes (par exemple le pyruvate donne

du ribose-5-phosphate). Cependant, ces chemins indépendants forment une base des chemins

métaboliques du système. En calculant des combinaisons linéairement indépendantes de ces

chemins, il est possible d’obtenir une nouvelle base de chemins indépendants qui ont une

signification physique.

156

(1) Biosynthèse duTryptophane

(2) chemin de l’acidemévalonique + synthèse de la

sécologanine

(3) Conversionglucose-fructose

(4) Voie des pentose phosphateet TCA

(5) Biosynthèse des acidesaminés

(6) Régulation de la pyruvatekinase

(7) Biosynthèse des lipides (8) Régulation de la conversiondu glycéraldéhyde-3-P

Figure 7.3 –Voies indépendantes du sous-réseau métabolique stationnaire (1 à 8).

Résultats. Les matricesN1, N2, etK du système sont données en annexe. Les 31 réactions

chimiques faisant intervenir 11 intermédiaires se simplifient en 20 voies métaboliques indé-

pendantes présentées sur les figures 7.3 et 7.4.

157

(9) Glycolyse + TCA (10) Biosynthèse de lasécologanine par les triosesphosphatés et le pyruvate

(11) Biosynthèse desphosphates organiques

(12) Biosynthèse de la paroicellulaire (hexoses structuraux)

(13) Dégradation de l’amidon (14) Biosynthèse de l’amidon (15) Dégradation des lipides (16) Biosynthèse des acidesorganiques

(17) Dégradation des acidesorganiques

(18) Régulation de laphosphofructokinase

(19) Voie de l’invertase (20) Voie de la saccharosesynthétase

Figure 7.4 –Voies indépendantes du sous-réseau métabolique stationnaire (9 à 20).

158

Ces voies sont représentatives des chemins métaboliques primaires qui sont importants

pour le système étudié. On retrouve la glycolyse + TCA et la voie des pentoses phosphates

+ TCA. On trouve la biosynthèse des acides aminés, de la paroi cellulaire, des phosphates

organiques, des lipides, des acides organiques, de la tryptamine (via le tryptophane), et de

la sécologanine selon les deux voies reportées dans la littérature (Contin et al., 1998; Taiz et

Zeiger, 1998).

L’ensemble de ces biosynthèses utilisent le glucose comme précurseur. Quatre voies in-

dépendantes permettent de moduler la source des glucides. Ces voies, telles qu’elles sont

écrites, ne sont pas physiquement acceptables (flux négatifs): fructose−→ glucose (voie

3), saccharose−→ 2 glucose (voies 19 et 20 selon l’état phosphaté de la cellule) et ami-

don −→ glucose (voie 13). Néanmoins, comme ces voies métaboliques sont indépendantes,

la superposition de la voie 3 sur une voie de biosynthèse permet d’obtenir la même voie de

biosynthèse dont le squelette carboné ne provient plus du glucose, mais du fructose.

Dans le même ordre d’idées, les voies 8 et 18 ont apparemment un bilan nul (glycéral-

déhyde-3-phosphate−→ glycéraldéhyde-3-phosphate par exemple). Ces deux voies per-

mettent de décrire les mécanisme adaptatifs de la cellule à une carence de phosphate (Plaxton,

1998). La superposition de ces voies sur une voie de biosynthèse utilisant une partie de la gly-

colyse permet par exemple de modéliser le fait que le phosphoénolpyruvate n’est pas convertit

en pyruvate par la pyruvate kinase, mais par une voie faisant intervenir la malate déshydro-

génase et la phosphoénolpyruvate décarboxylase. Les conséquences sur la consommation des

navettes énergétiques sont différentes.

On retrouve ces mécanismes avec les voies 15 et 17 qui décrivent la dégradation des

lipides et des acides organiques en acétyl-coenzyme A elle même utilisée pour le TCA.

Ainsi, on dispose de 11 voies de biosynthèse (y compris la glycolyse et la voie des pen-

toses). On peut partager la source de glucides pour ces voies entre le saccharose, le glucose et

le fructose. Enfin, on peut simuler une adaptation de la cellule à une carence en phosphate en

utilisant deux voies métaboliques alternatives. L’originalité de ce modèle réside dans les pro-

159

priétés d’indépendance linéaire grâce à l’obtention d’une base (au sens des espaces vectoriels)

de voies métaboliques.

7.3.3 Détermination des équations bilans des voies indépendantes

Le calcul précédent a permis de caractériser 20 voies indépendantes, combinaisons li-

néaires des 31 réactions du SMS. Dans le réseau métabolique complet, ces 20 voies sont

considérées comme 20 réactions ayant comme réactifs et produits toutes les espèces chi-

miques entrant en jeu dans les 31 réactions et dont la concentration n’est pas supposée

constante dans le temps. Il s’agit donc des produits et des réactifs du métabolisme primaire,

ainsi que des navettes énergétiques et du Pi. De manière plus explicite, le vecteurX1 :

X1 =

AA

FRU

GLU

SEC

LIP

NAD

NADH

NADP

NADPH

NDP

NH4

NTP

ORA

Pi

PPi

SAC

STA

STH

TRY

OP

décrit les 20 espèces2 qui entrent en jeu dans les 20 voies métaboliques et dont la concentra-

tion est dépendante du temps.

Pour connaître le bilan des voies indépendantes sur ces espèces, il faut d’abord écrire la

matrice stœchiométriqueN3 des 31 réactions du SMS en fonction de ces 20 espèces. Dans

notre cas, c’est une matrice20×31. Ensuite, la matriceR tel que :

2. Le fait qu’il y ait 20 espèces n’a strictement rien à voir avec le fait qu’il y ait 20 voies métaboliques. C’estun pur hasard.

160

Tableau 7.2 –Bilan des voies métaboliques indépendantes du SMS.

Reaction # Reaction

1 2 AA + 3 GLU + 10 NAD + 6 NADP + NTP + Pi −→ 10 NADH + 6 NADPH + NDP + PPi + TRP2 1,5GLU + 6 NAD + 2NADP −→ 6 NADH + 2 NADPH + SEC3 GLU −→ FRU4 GLU + 5 NAD + 6NADP + 2 NDP + 2 Pi −→ 5 NADH + 6 NADPH + 2 NTP5 GLU + 4 NAD + 3 NADPH + 2 NTP + NH4 −→ AA + 4 NADH + 3 NADP + 2 NDP + 2 Pi6 NTP −→ NDP + Pi7 0,5GLU + 2 NAD + 2 NADPH −→ LIP + 2 NADH + 2 NADP8 NADH + NADP + NTP −→ NAD + NADPH + NDP + Pi9 GLU + 10 NAD + 4 NDP + 4 Pi −→ 10NADH + 4 NTP10 1,5GLU + 2 NADP + NTP + NAD −→ SEC + 2 NADPH + NDP + Pi + NADH11 3,75 AA + GLU + 0,25 NAD + 2 NADP + 8 NTP

−→ 0.25 NADH + 2 NADPH + 8 NDP + 3,5 Pi + 1,75 PPi + OP12 GLU + NADP + 3 NTP −→ NADPH + 3 NDP + Pi + PPi + STH13 NDP + Pi + STA −→ GLU + NTP14 GLU + 2 NTP −→ 2 NDP + PPi + STA15 LIP + 4 NAD + NTP + Pi −→ 4 NADH + NDP + PPi16 0.5GLU + 2 NAD + NDP + Pi −→ 2 NADH + NTP + ORA17 3 NAD + NDP + ORA + Pi −→ 3 NADH + NTP18 NDP + PPi −→ NTP + Pi19 SAC −→ 2GLU20 SAC + PPi + 2 NDP −→ 2GLU + 2 NTP

R= N3.K

représente la matrice stœchiométrique des 20 voies métaboliques indépendantes en fonction

des 20 espèces considérées.

Cette matrice permet d’écrire les 20 voies métaboliques indépendantes du SMS comme 20

réactions individuelles auxquelles on assigne une loi cinétique. Ces réactions sont présentées

dans le tableau 7.2

7.4 Sous-réseaux métaboliques transitoires

7.4.1 Sous-réseau métabolique transitoire primaire

Le schéma 7.5 propose la structure générale du sous-réseau métabolique transitoire pri-

maire et ses interactions avec le sous-réseau métabolique stationnaire et le sous-réseau mé-

tabolique transitoire secondaire. La numérotation des réactions commence à 21, les 20 pre-

mières réactions étant les 20 voies indépendantes identifiées dans la section précédente.

161

Figure 7.5 – Sous-réseau métabolique transitoire primaire. AA: acide aminés, EFRU:fructose extracellulaire, EGLU: glucose extracellulaire; ENH4: ammonium extracellulaire;ENO3: nitrate extracellulaire; EPi: phosphate extracellulaire; ESAC: saccharose extracel-lulaire, FRU: fructose cytosolique, GLU: glucose cytosolique; LIP: lipides; NAD: NAD+;NADH: NADH; NADP: NADP+; NADPH: NADPH; NDP: nucléoside diphosphate; NH4:ammonium cytosolique; NO3: nitrate cytosolique; NTP: nucléoside triphosphate; O2: dioxy-gène; ORA: acides organiques; Pi: phosphate cytosolique; PPi: pyrophosphate cytosolique;SEC: sécologanine; SFRU: fructose apporté; SGLU: glucose apporté; SNH4: ammonium ap-porté; SNO3: nitrate apporté; SPi: phosphate apporté; SSAC: saccharose apporté; STA: ami-don; STH: hexoses structuraux; TRY: tryptamine, X: biomasse, VNO3; nitrate vacuolaire;VPi: phosphate vacuolaire.

162

Les nutriments présents dans le milieu de culture sont transportés dans la cellule. Il

s’agit du saccharose (ESAC), glucose (EGLU), fructose (EFRU), ammonium (ENH4), ni-

trate (ENO3) et du Pi (EPi). Ces nutriments peuvent être ajoutés au milieu par un système

externe, afin de modéliser un mode semi-continu. Les six nutriments contenus dans ce sys-

tème d’alimentation sont respectivement notés SSAC, SGLU, SFRU, SNH4, SNO4 et SPi.

Le saccharose peut-être hydrolysé en glucose + fructose dans le milieu de culture à l’aide

des invertases apoplastiques (réaction 35) ou dans le cytosol. Dans ce dernier cas, c’est le

SMS qui prends en charge l’hydrolyse du saccharose.

Le saccharose, le nitrate et le Pi peuvent être stockés dans la vacuole pour une utilisation

ultérieure. Le pyrophosphate est converti en Pi. La dégradation des phosphates organiques est

modélisée par la réaction 23 qui libère du Pi. On néglige le recyclage du squelette carboné

lors de cette réaction.

La réaction 69 est responsable de la formation de la biomasse. Sa vitesse de réaction est

précisémentµ. Elle consomme les bassins d’acides aminés, de phosphates organiques, de

lipides et de paroi cellulaire.

La respiration, qui régénère l’ATP et le NAD+est représentée par la réaction 37. La perte

d’énergie associée à la maintenance et autres réactions dont on ne tient pas compte est comp-

tabilisée dans la réaction 36.

Le tableau 7.3 rassemble les lois cinétiques des réactions du SMTP. Dans ce tableau, les

dépendances en navettes énergétiques ne sont pas indiquées pour plus de lisibilité car elle

suivent la loi cinétique définie dans la section 7.2.5

7.4.2 Sous-réseau métabolique transitoire secondaire

Le sous réseau métabolique transitoire secondaire décrit l’accumulation des alkaloides

dans la cellule. La figure 7.6 présente ce réseau. Bien que les alkaloides soient intracellu-

laires, l’utilisation de l’huile de silicone a permis l’extraction de la tabersonine et de la löch-

nericine hors du cytosol. Il est possible que dans un avenir proche il soit réaliste d’extraire

163

Tableau 7.3 –Lois cinétiques des réactions du SMTP.

Réaction # Vitesse de réaction Mécanisme et référence

21 v21 = vmax21

EGLUEGLU+Km

H+-symport (Tanner et Caspari, 1996)

22 v22 = vmax22

EFRUEFRU+Km

H+-symport (Tanner et Caspari, 1996)

23 v23 = vmax23

OPOP+Km

(1−σ(Pi,Pis,1))

24 v24 = vmax24

ESACESAC+Km

H+-symport (Tanner et Caspari, 1996)

25 v25 = vmax25

ENH4ENH4+Km

uniport (Howitt et Udvardi , 2000)

26 v26 = vmax26

NO3NO3+Km

Monod

27 v27 = vmax27

NO3NO3+Km

H+-symport (Williams et Miller , 2001)

28 v28 = vmax28

VNO3VNO3+Km

uniport (Williams et Miller , 2001)

29 v29 = vmax29

PiPi+Km

actif (non caractérisé) (Raghothama, 1999)

30 v30 = vmax30

VPiVPi+Km

uniport (non caractérisé) (Raghothama, 1999)

31 v31 = vmax31

PPiPi+Km

Monod

32 v32 = vmax32

Nh4Nh4+Km

uniport (Williams et Miller , 2001)

33 v33 = vmax33

NO3NO3+Km

diffusion facilité (Williams et Miller , 2001)

34 v34 = vmax134

ENO3ENO3+Km1

+vmax234

ENO3ENO3+Km2

H+ symport à haute et basse affinité (Crawford et Glass,1998)

35 v35 = vmax35

ESACESAC+Km

Monod

36 v36 = vmax36

NTPNTP+Km

Monod

37 v37 = vmax37

NDP×NADHNDP×NADH +Km

Monod

38 v38 = vmax138

EPiEPi+Km1

+vmax238

EPiEPi+Km2

H+-symport à haute et basse affinité (Raghothama, 1999)

39 v39 = vmax39

PiPi+Km

uniport (non caractérisé) (Raghothama, 1999)

40 v40 = vmax40

SACSAC+Km

Monod

41 v41 = vmax41

VSACVSAC+Km

Monod

164

Figure 7.6 – Sous-réseau métabolique transitoire secondaire. AJM: ajmalicine, CAT: ca-tharanthine, EAJM: ajmalicine extracellulaire, ECAT: cathranthine extracellulaire, EHOR:hörhammericine extracellulaire, ELOC: löchnericine extracellulaire, ETAB: tabersonine ex-tracellulaire, EVBL: vinblastine extracellulaire, EVCR: vincristine extracellulaire, EVIN:vindoline extracellulaire, HOR: hörhammericine, LOC: löchnericine, TAB: tabersonine,VBL: vinblastine, VCR: vincristine, VIN: vindoline.

les autres alkaloides. Aussi le modèle prévoit des bassins extracellulaires pour les alkaloides.

Les cinétiques d’accumulation des alkaloides extracellulaires ne sont probablement pas en-

zymatiques.

De nombreuses recherches sont orientés vers le déblocage de la voie tabersonine−→vindoline (DeLuca et Laflamme , 2001). Aussi, les bassins de vindoline, vinblastine et vin-

cristine ont été prévu, même si à l’heure actuelle ils restent vides dans les cultures de racines

transformées deC. roseus.

On connaît mal la dépendance des réactions du métabolisme secondaire en terme de na-

vettes énergétiques. Dans l’état actuel des travaux, les réactions du métabolisme secondaire

165

ne sont pas complètement caractérisées.

Il est prévu d’intégrer dans les cinétiques de ces réaction l’effet d’un ajout d’acide jasmo-

nique exogène.

7.5 Fonctionnement du modèle

7.5.1 Système différentiel du système.

Le système est décrit par les concentrations en nutriments, métabolites primaires et se-

condaires en utilisant le vecteurX tel que:

X =

X1

X2

X3

où chaque sous vecteur décrit respectivement les espèces impliquées dans le SMS, le SMTP

et le SMTS, les espèces impliquées uniquement dans le SMTP et les espèces impliquées

uniquement dans le STMS:

X1 =

AA

FRU

GLU

SEC

LIP

NAD

NADH

NADP

NADPH

NDP

NH4

NTP

ORA

Pi

PPi

SAC

STA

STH

TRY

OP

X2 =

VNO3

VPi

VSAC

EFRU

EGLU

ENH4

ENO3

EPi

ESAC

NO3

X3 =

STR

AJM

SER

CAT

TAB

LOC

HOR

VIN

VBL

VCR

EAJM

ESER

ECAT

ETAB

ELOC

EHOR

EVIN

EVBL

EVIN

L’évolution du système est géré par la fonctionF tel que:

166

dXdt

= F(X)−µX

La fonction F est chargée de calculer les variation des concentrations de toutes les espèces.

7.5.2 FonctionF d’évolution

Brièvement, si on connaît la matrice stœchiométrique d’un sous-réseau métabolique et

la valeur des flux de chaque réaction du réseau, la variations dans le temps des espèces chi-

miques du réseau se calcule ainsi:

dXdt

= S.Φ

où S est la matrice stœchiométrique du réseau (présentée en annexe) etΦ est un vecteur

contenant les valeurs des flux de chaque réaction.

Le SMS a permis de décrire 20 voies indépendantes métaboliques. Parmi celles-ci figurent

9 voies de biosynthèse, la glycolyse et la voies de pentoses phosphates, et 9 réactions de

régulation de la source de glucide et des mécanismes adaptatifs de la cellule face à une carence

en Pi. La stratégie cellulaire pour calculer tous les flux est proposée sur le schéma 7.7.

La première étape consiste à calculer la distribution des différentes sources de glucides

dans le flux total des réactions de biosynthèses. On vérifie si la somme des concentrations

intracellulaires cytoplasmiques de glucose, fructose et saccharose est inférieure à un seuilHs.

Si c’est le cas, l’amidon stocké dans les plastides est utilisé comme source de glucides, en

plus des autres sucres intracellulaires. Sinon, seuls le glucose, le fructose et le saccharose sont

utilisés.

L’étape suivante consiste à calculer les flux des réactions de biosynthèse, de glysolyse

et de la voie des pentoses phosphates. On a déjà mentionné que toutes les réactions de bio-

synthèse font appel au glucose comme précurseur carboné, mais qu’en superposant les voies

167

Figure 7.7 –Stratégies du modèle pour l’orientation du métabolisme.

168

3, 14, 19 et 20 on obtient une voie de biosynthèse qui utilise le fructose, l’amidon ou le

saccharose (par deux mécanismes).

Chaque réaction de biosynthèse peut utiliser comme source de glucide le glucose, fruc-

tose et saccharose. Le flux total de chaque réaction de biosynthèse est la somme des flux de

la réaction à partir de ces trois nutriments, chacun de ces flux ayant une dépendance pour sa

source de glucide en une fonction de Monod. Ces flux individuels associés à chaque source

de glucide ont la même dépendance en navettes énergétiques. Ainsi, chaque réaction de bio-

synthèse est écrite de cette manière :

v = vmax.

(∑

C∈{GLU, FRU, SAC}σ(C,KmC,1)

)∏

N∈{navettes énergétiqes}σ(N,KmN ,νN)

Pour chaque source de glucide, le modèle calcule tous les flux de biosynthèse dépendant

de cette source et faisant varierX1. Si la source de glucide n’est pas le glucose, il assigne aux

flux du glucide la valeur du flux de glucose puis remplace la valeur du flux du glucose par

0. Finalement, il additionne pour chaque espèces du vecteurX1 les flux calculés pour chaque

source de glucide et calcul la variation deX1 en multipliant le vecteur des flux obtenus par la

matrice stœchiométriqueR du SMS.

Le reste de l’algorithme est simple. On test s’il y a suffisamment de NADH ou non pour

la chaîne respiratoire. Si ce n’est pas le cas, le modèle décide de dégrader des lipides qui

alimentent le TCA (réaction 15). Le test suivant détermine si il faut mettre en œuvre les voies

alternatives de la glycolyse ou non. La décision est modélisée par des fonction sigmoïdes telle

que définies dans la section 7.2.6. Le calcul des autres flux se fait ensuite par produit matriciel

comme expliqué précédemment.

169

7.6 Conclusion

Le code source est donné en annexe et est constitué des quatre programmes:modele.m ,

kernel.m , matrix.m et sigma.m . Le programmemodele.m démarre la modélisation et af-

fiche les résultats. Le programmesigma.m est la fonction sigmoïde utilisée par les lois ciné-

tiques et les décisions du modèle. Les matrices stœchiométriques sont calculés (pour le SMS)

et stockées (pour tous les sous-réseaux) dansmatrix.m . Enfin, la fonctionF est calculé dans

kernel.m .

L’état d’avancement des travaux a permis de faire fonctionner les modèle écrit en code

MatlabR©. Le modèle est stable numériquement, mais de nombreux paramètre restent à être

déterminés (Kmi et vmaxi ). Ceci est très encourageant pour l’optimisation future du modèle.