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l'avantaged'etre exempte desmicro-organismes pathogenes et il a desconcentrations elevees enphosphore et en potassium contrairement aUK residus urbains. Chapitre 1.3 : Production du carburant ethanol par la fermentation de la biomasse lignocellulosique (xylose) Introduction L'activite de notre societe actuelleentraine une consommation colossale des energies fossiles, par consequent ces ressources energetiques doivent etre adequatement gereesafin d'assurer une part de cesrichesses pour les generations futures. L ' ethanol biologique est con9u pour etre utilise comme un substituantdes sources d'energie fossiles(gaz, essence et diesel).11 pourrait etre utilise egalement commeune source 21

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l'avantage d'etre exempte des micro-organismes pathogenes et il a des concentrations elevees

en phosphore et en potassium contrairement aUK residus urbains.

Chapitre 1.3 : Production du carburant ethanol par la

fermentation de la biomasse lignocellulosique (xylose)

Introduction

L 'activite de notre societe actuelle entraine une consommation colossale des energies

fossiles, par consequent ces ressources energetiques doivent etre adequatement gerees afin

d'assurer une part de ces richesses pour les generations futures.

L ' ethanol biologique est con9u pour etre utilise comme un substituant des sources

d'energie fossiles (gaz, essence et diesel). 11 pourrait etre utilise egalement comme une source

21

pour la production de l'ethylene, ethyle, acrylate, et I' acetaldehyde. Cette nouvelle source

d'energie pourrait etre produite a partir de biomasse lignocellulosique qui est consideree

comme la matiere renouvelable la plus abondante dans la nature. C'est ainsi que la biomasse

lignocellulosique peut etre utili see comme un substrat pour une fermentation microbienne en

ethanol et par consequent pourrait reduire notre dependance du petrole importe. En outre, et

avec la conscience environnementale universelle, I' ethanol est considere tres ami avec

I' environnement puisque sa combustion ne contribue pas a I' effet de serre. Cet argument est

base sur Ie fait Ie CO2 forme durant la combustion d' ethanol est consomme par la renaissance

de biomasse dans un laps de temps tres convenable.

Sachant que Ie cout de production d' ethanol est plus eleve que celui des energies

fossiles, une decision politique doit etre prise pour rendre I' ethanol tres competitif avec les

autres types d'energies surtout fossiles.

Une production importante d'ethanol a partir de la biomasse lignocellulosique,

demande une utilisation complete de tOllS leg sucres de cette demiere et un temps de

fermentation tIes rapide. Le xylose est un pentose parmi leg differents sucres formant la

matiere lignocellulosique. II est considere comme Ie sucre Ie plus abondant apres Ie glucose

dans la nature. Quelques bacteries, levures ainsi que leg champignons filamenteux peuvent

fermenter Ie xylose en ethanol (Skoog et Hahn-Hagerdal, 1988 ; Schneider, 1989 ; Jeffries,

1990; Hahn-Hagerdal et al., 1993; Hahn-Hagerdal et al ; 1994a, b). Le xylose peut aussi ctre

reduit en xylitol par des micro-organismes (Merial et al., 1991; Ojamo, 1994) ainsi que par

des procedes purement chimiques (Hyvonen et koi vistoinen, 1993). A cause de leur faible

tolerance envers l' ethanol, leg inhibiteurs de fermentation et de la demande continue en

oxygene, leg micro-organismes qui fermentent Ie xylose d 'une maniere naturelle ne sont pas

adequats pour la fermentation industrielle. Saccharomyces cerevisiae ne fermente pas Ie

xylose, toutefois son rendement de productivite d' ethanol a partir de d 'hexoses est reconnu

comme Ie plus eleve (Kolot, 1980). Avec Ie developpement des techniques modemes dans Ie

domaine de biotechnologie, beaucoup d'interct a ete porte sur la possibilite de modifier

genetiquement leg micro-organismes pour l'inrerct de l'humanite. Cela pourrait ctre accompli

en introduisant des genes heterologues, destruction des genes, surexpression des genes innes,

l'ingenierie des proreines De nos jours, leg genes humains sont clones dans des micro-

organismes pour la production pharmaceutique avec des prix tIes bas.

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1.3.1. Production d'ethanol a partir de biomasse lignocellulosique

La production d' ethanol it partir du materiel lignocellulosique se passe selon leg

etapes suivantes: pre-traitement et hydrolyse de la biomasse lignocellulosique en produits

fermentescibles, suivi d 'une fermentation et d 'une distillation pour obtenir I' ethanol.

1.3.1.1. Le materiel brut

La biomasse lignocellulosique tels que leg residus agricoles (pailles de cereales, tiges

de mais...), certains sous-produits de l'industrie agro-alimentaire (pulpe, bagasses...) et Ie

bois non exploite, est constituee par trois constituants principaux : la cellulose,

I 'hemicellulose et la lignine. La composition en sucres de la biomasse lignocelluosique, est

rapportee dans Ie tableau 1.3.1.

La cellulose est un polyrnere lineaire et insoluble dans l' eau. Les unites de glucose sont

attachees par des liaisons glycosidiques de type 13-1,4. C'est l'hydrolyse de la cellulose qui

constitue l'objectif essentiel de tout procede d'hydrolyse de biomasse lignocelluosique.

L 'hemicellulose est un hereropolysaccharide court, branches et facilement

hydrolysable. Le pentose Ie plus abondant des les hemicelluloses est Ie xylose. L 'hydrolyse

des hemicelluloses produit essentiellement des pentoses pen ou pas fermentescibles en

ethanol.

Tableau 1.3.1 : Composition de la biomasse lignocellulosique

42,4 20,5 (PuIs, 1993)41.9 21.6 ..(Hayn et a/., 1993)

I Le bois tendre

"38,2 19,7 etal.,1993 IHetre 50,4 23,1 et al., 1993)

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(I) Les valeurs indiquees sur Ie tableau sont des pourcentages bases sur la matiere seche. Lescendres ne sont pas inclues dans ce tableau.

Les lignifies sont des polymeres d' origines phenoliques, synthetises par

deshydrogenation radicalaire de trois alcools: l'alcool coumarylique, l'alcool coniferylique et

l'alcool sinapylique. Les produits de degradation des lignifies ne sont pratiquement pas

fermentescibles. Pour produire de l'ethanol par fermentation, la biomasse cellulosique doit

etre degradee en produits fermentescibles. La composition des produits fermentescibles

depend non seulement de la composition de la matiere brute mais aussi du type de pre-

traitement et hydrolyse.

1.3.1.2. Pretraitement et hydrolyse

La degradation de la biomasse lignocellulosique en produits fermentescibles est

realisee en deux etapes:

-Ie pretraitement peut etre realise par la voie chimique et par la voie physique, tel que Ie

pretraitement a la vapeur, Ie pretraitement acide (HCI, HF, HzSO4,H3PO4), et Ie

pretraitement alcalin (NaOH, NH3) (Vallander et Eriksson, 1990; Saddler et a/., 1993).:.

Pendant Ie pretraitement, presque toute I 'hemicellulose est degradee en sucres.

-L 'hydrolyse de la cellulose est norma1ement realisee par la voie enzymatique ou par de

l'acide dilue (Parisi, 1989; Vallander et Eriksson, 1990; Convere, 1993; Hayn et a/.,

1993)._Les produits resultants de cette etape de pretraitement et d'hydrolyse contiennent

non seulement les sucres fermentescibles mais aussi plusieurs constituants qui peuvent

avoir un effet inhibiteur sur les micro-organismes.

1.3.1.3.

Fermentation

Pour produire de I' ethanol, de maniere rentable, it partir de la fermentation de la

biomasse lignocellulosique, cette demiere doit etre utilisee efficacement. Ainsi, leg micro-

organismes utilises dans cette fermentation doivent avoir leg qualites suivantes : (i) utilisation

de tOllS leg sucres presents dans la biomasse lignocellulosique, (ii) stabilite et tolerance

envers des constituants presents dans Ie lysat ( inhibiteurs de fermentation et par consequent

eviter Ie prix d'elimination de ces demiers), (iii) pouvoir de fermentation it bas pH, ce qui

peut eviter une contamination et l'ajustement de pH, (iv) tolerance aux concentrations

d'ethanol tres elevees et (v) production d'ethanol.

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Les hexoses sont facilement fennentes en ethanol par S. cerevisiae. Toutefois, cette

levure ne peut pas fennenter Ie xylose et l'arabinose. La fraction des sucres en cinq carbones

est donc tIes difficile a fennenter puisque les micro-organismes qui fennentent les pentoses

ne possedent pas toutes les qualites deja discutees.

1.3.1.4. Les composants chimiques inhibiteurs du Iysat lignocellulosic

Pendant la phase de pretraitement et d'hydrolyse de la biomasse lignocellulosique,

une tres grande variete de produits de degradation des sucres (tels que furfural,

hydroxymethyl furfural), acide acetique (produit de la degradation de 1 'hemicellulose),

produits de degradation de lignine (tels que l'acide p-hydroxybenzoique, Ie vanillin, Ie

syringaldehyde et l' acide syringique) extractives (tels que l'acide palmitique, l'acide

caproique, l'acide caprylique et l' acide pelargonique), et metaux ioniques (corrosion des

equipements) sont generes. Ces composants chimiques peuvent inhiber la fermentation

alcoolique a partir de la biomasse lignocellulosique (Watson et at., 1984b.;. Clark et mackie,

1984; Ando et at., 1986; Tran et Chambers, 1986; Sanchez et bautista, 1988 ; Nishikawa et

at., 1988; van Zyl et at., 1988; Beall et at., 1991; Palmqvist et at., 1993). En outre, leg

composants comme SOl ajoutes pendant Ie pretraitement se retrouvent dans Ie lysat et

peuvent aussi inhiber la fermentation alcoolique. La quantite et la nature des produits

inhibiteurs varient selon la biomasse lignocellulosique, Ie pretraitement et leg conditions de

1 'hydrolyse. En plus des inhibiteurs deja cites, autre produits de la fermentation alcoolique tel

que l'ethanol, l'acide acetique et autres acides organiques peuvent inhiber la fermentation en

question (Maiorella et at., 1983; Jones, 1989).

La fermentation du lysat de la biomasse lignocellulosique est normalement tres lente,

incomplete et produit une concentration d' ethanol tres faible avec un pauvre rendement par

rapport a une fermentation en laboratoire. Plusieurs methodes de detoxication ont ete

developpees pour augmenter la fermentescibilite du lysat lignocellulosique, tel que

l'extraction par un solvant organique (Clark et Mackie, 1984 ; Fein et at. , 1984; Frazer et

McCaskey, 1989), Ie traitement a la vapeur (Yu et at., 1987), l'echange ionique (Fein et at.,

1984; Watson et at., 1984b; Tran et Chambers, 1986; Frazer et McCaskey, 1989; van Zyl et

at., 1991), l'exclusion ionique (Buchert et at., 1990), Ie tamisage moleculaire (Tran et

Chambers, 1986), et chaulage van Zyl et al., 1988; Frazer et McCaskey, 1989; Olsson et al.,

1995) et Ie traitement par Ie charbon actif (Frazer et McCaskey, 1989; Roberto et al., 1991).

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A cote de la detoxication, des tentations d'acclimatation et d'adaptation des micro-

organismes ont ete egalement realisees., la fermentation du lysat lignocellulosique a ete

augmentee par acclimatation de plusieurs souches de levures capables de fermenter Ie xylose

(Fein et al., 1984). Les levure ont ete transferees graduellement de lysats tres diluesa des

lysats plus concentres. Pichia stipitis CBS 5776 et Candida shehatea ATCC 22984 ont ete

adapte au lysat du bois "aspen" par un repassage dans Ie lysat 12 a 72 fois plus concentre,

respectivement (Parekh et al., 1986). Avec les micro-organismes adaptes, Ie rendement de

production d'ethanol augmente de 0.41 g g-) de sucre consomme a 0.47 g g-) pour P. stiptis

et de 0.39 g g-) de sucre consomme a 0.45 g g-) for C. shehatae

1.3.2. Les micro-organismes qui fermentent Ie xylose naturellement

Chez les bacteries, Ie xylose une fois transfere dans Ie cytoplasme, il sera isomerise

en xylulose par la xylose isomerase XI (Hahn-Hagerdal et ai., 1993). Le Teste du metabolisme

du xylose est presque Ie meme que chez les levures (Fig. 1.3.1). Les bacteries sont capables

d'utiliser differents autres sucres mais I'inconvenient majeur c'est qu'elles forment des

produits autres que I'ethanol ce qui se traduitpar un rendement tres raible, de I'ordre deO.15 it

0.24 g go! (Tableau 1.3.2) .En outre, les bacteries demandent un pH optimal neutre pour la

fermentation et la croissance, ce qui augmente Ie risque de contamination. Seton les micro-

organismes et les conditions de fermentation utilisees, differentes quantites de produits tels

que I'ethanol, Ie 2,3-bunediol, I'acide acetique, I'acide lactique, I'acide formique acide, Ie

gaz carbonique et I'hydrogene sont formees (Prescott et ai. , 1993).

Les bacteries thennophiles comme Thermoanaeorobacter ethanolicus, ont Ie pouvoir

de realiser une fennentation a temperature elevee, ce qui peut reduire Ie risque de

contamination. Te.thanolicus produit de I'ethanol avec un rendement de 0.42 g g-l, mais, en

augmentant la concentration initiate de xylose de 3,6 g I-I a 19,5 g I-I .Ce rendement diminue

a 0.24 g g-1 a cause de I'augmentation de co-produits de fennentation (Lac is Lawford, 1991)

Figure 1.3.1 : Metabolisme du xylose, xy1itol, xylulose, et glucose chez les levures

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Xylose_NADH. NADPH

XRI' "'-HAD+. HADP+

Glucosec~ 2liADPH I

--:~ ~ --" G6PRibulose SP

/""'" "oJXylitol .SP Ribose SP " FDPf:HAD+ XYIUlose " """""'1--;~~" "" _A- . XDH IiAD

";/ I .~~ G3P DHAPhTKL --""" 1 ~+ -"" Xylulose S7P + G3P -" " Glycerol-3P~ "" t"" TAL ,"" I, ,,' \ \ Glycerol

E4P + F6P"

~ I"""

Fc

,F6P + G~P ,

11lPEP

~c~ N.A

PYR ~ .AcetaldehydePDC I

COa

.-_NADII

-Caz

F.:::::.NADII~Caz

Acetyl-CoA ---OA ~. Crt"NADH~MDH -

MAL

tFUM

\~

Generalement, les levures ont un faible pH optimal de fermentation, un grand

rendement d'ethanol et une grande productivite d'ethanol. Plusieurs especes de levure ont ere

identifiees comme des micro-organismes capables de fermenter Ie xylose en ethanol (Tableau

1.3.2). Les meilleures souches de levures qui fermentent Ie xylose sont P. stipitis et Candida

shehatae.

La productivite specifique de la fermentation du xylose par ces levures est huit fois plus

faible que la productivite de la fermentation du glucose par S. cerevisiae (Ligthelm et al.,

1988a). La fermentation du xylose par les levures en question est influencee par Ie niveau

d'aeration (Tableau 1.3.3). Un faible et controlable niveau d'oxygenation est obligatoire pour

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une production optimale d'ethanol et un grand rendement de production d'ethanol (Schneider

et al., 1981 ; Watsonet al. , 1984a; Ligthelm et al., 1988a; Grootjen et al., 1990 ; Skoog et

Hahn-Hagerdal, 1990). Sous leg conditions anaerobies, on assiste a la formation d'un sous-

produit appele xylitol, ce qui peut diminuer Ie rendement d' ethanol et la vitesse de

fermentation (Ligthe1m et al., 1988a). Une augmentation de l'aeration peut conduire a une

chute de rendement d' ethanol, qui est due a une augmentation de la formation de biomasse et

une re-assimi1ation d'ethanol (Skoog et al. , 1992).

Tableau 1.3.3: Effet de l'oxygene sur la production de l'ethanol et la formation de xylitolpar les levures

X, xylose; G, glucoseNA, non applicableb gig, sucre consomme

Tableau 1.3.2: La perforntance des micro-organismes qui ferntentent Ie xylose dans unmilieu de culture de laboratoire

I Souches Ethanol Referen~esBacteries naturelles

J~

i_6.S I~

J~

I Bacteraides palypragmatusGP4

J~J~

jE~' I 0.17Thermoanaerobacter ethano/icus A TCC 31938 cis etLawford, 1991T. ethano/icus ATCC 31938 cis etLaw ford, 1991

I Bacteries, recombinantesI Erwinia chrysanlhemi B 374 (Pdc)

II~

Escherichia coli ATCC 11303 pLOI297 (plic, adhB) 0.52 0.6E. coli KOII (plic. adhB.frd-) 0.53 1.3

, E. coli SL 28 andSL 40 (pdc, adhB,frd-) I~ I 60 .0.50 .0.97, Klebsiella aXYloca M5Al(PLO1555)(Pdc. adhB)

.~Ianticola (~c)(Zhang et al., 1995).

Fusarium avenaceum VIT-D-80146 0.24 0.07 Suihko etEnari, 1981

28

0.030.63

6.6

(Chanetal., 1989)

Chapitre 1.4 : Systematique moleculaire et phylogenie

Introduction

La systematique est la science de classifications des organismes vivants et fossiles.

Ses objectifs sont l'inventaire et la description des especes et plus generalement des groupes

naturels d'organismes ou taxons, la construction de classifications traduisant l'histoire de la

vie, predictives des proprietes des organismes, la gestion et la diffusion de l'information ainsi

constituee.

On pense qu'actuellement taus les organismes vivants sur la terre derivent d'une seule

cellule primitive, nee il y a quelques milliards d'annees. Cette cellule prit la tete du processus

d'evolution qui aurait en definitive fait verdir la terre, et fait d'elle Ie siege de la vie. Un29