Chapitre 10 L'Hémoglobine: Relations structure-fonction

1.Fonction de l'hémoglobine

A. L'hèmeB. Liaison d'O2

C. Transport de CO2 et effet BohrD. Influence du BPG sur la liaison d'O2

2. Structure et mécanismeA. Structure de la myoglobineB. Structure de l'hémoglobineC. Mécanisme coopératif de la liaison

de l'O2

D. Base structurale de la liaison du BPG

3. Hémoglobines anormales

4. Régulation allostérique et modèles de coopérativité

L'hémoglobine

Sa couleur, son abondance et sa facilité d'isolement en ont fait un objet de recherche depuis les temps anciens

•Observation de cristaux pour la première fois en 1840 par Friedrich Hünefeld

•Une des premières protéines dont la masse moléculaire a été déterminée avec précision

•Première protéine à être caractérisée par ultracentrifugation

•Première protéine a être associée à une fonction

•Première protéine qui permet de démontrer qu'une mutation ponctuelle provoque une maladie

•Une des premières protéines dont la structure a été déterminée par rayons X (Max Perutz, 1968)

A. L'hème

La Mb et chacune des 4 sous-unités de l'Hb lient un seul groupement hème de façon non-covalenteL'hème dérive d'une porphyrine formée de 4 noyaux pyrrole reliées par des ponts méthène

1 FONCTION DE L'HEMOGLOBINE

L'hémoglobine (Hb) est un héterotétramère, (dimère de protomères ). Les sous-unités et sont apparentée à la myoglobine (Mb)L'Hb transporte l'O2 des poumons vers le tissus pour leur respiration. La Mb facilite le transport d'O2 dans les muscles

La porphyrine de l'hème avec 4 méthyles, 2 propionates, et 2 vinyls substitués, est appelée protoporphyrine IX

Dans l'Hb et la Mb, l'atome de fer reste Fe2+ (ferreux) que l'hème soit oxygéné ou non

L'atome de Fe établit 5 liaisons de coordinance avec des atomes N disposés en pyramide carrée: 4 N de la porphyrine et 1 N de l'His F8 proximale. Après oxygénation, le Fe se trouve coordiné au centre d'un octèdre. L'oxygénation modifie l'état électronique du complexe Fe(II)-hème, comme l'indique le changement de couleur du sang:

CO, NO et H2S se lient également à la sixième position de coordinence au Fe avec une affinité supérieure à celle de l'O2

NO + MbO2 NO3- +

metMb

B. Liaison de l'O2

La liaison de l'O2 à la Mb est une simple réaction d'équilibre:

Mb + O2 MbO2

][MbO

][Mb][O K

2

2d =

][OKd

][O

][MbO [Mb]

][MbO Y

2

2

2

2O2 +

=+

=

où Kd est une constante de dissociation

La dissociation de l'O2 de la Mb peur être caractérisée par sa saturation partielle, YO2, définie comme la fraction des sites de liaison d'oxygène occupés par l'O2:

L'O2 étant un gaz, on exprime sa concentration par sa pression partielle, p02 (aussi appelée la tension en oxygène):

2d

2O pO K

pO Y

2 +=

250

2O pO P

pO Y

2 +=

P50 est la valeur de p02 pour laquelle YO2 = 50%, ce qui signifie que la moitié des sites de liaison de l'O2 de la Mb sont occupés

a. L'Hb lie l'O2 de manière coopérativeLa courbe de saturation de la Mb suit une hyperbole; sa P50 est égale à 2,8 torr (760 torr = 1 atm). La Mb est donc presque saturée pour les valeurs physiologiques de p02 dans le sang artériel (100 torr) et le sang veineux (30 torr). Par contre la courbe de dissociation de l'Hb est sigmoïdale et sa P50 est égale à 26 torr. Par conséquent, la Hb libère une partie de son O2 à la Mb à la pression veineuse de 30 torr dans des tissus:

Courbes de saturation de MbO2 et de HbO2 par l'O2 dans le sang complet

Une courbe de dissociation sigmoïdale est une indication d'interaction coopérative entre les sites de liaison d'une protéine pour un ligand. La liaison de l'O2 augmente l'affinité de l'Hb pour la liaison de molécules d'O2 supplémentaires (coopérativité positive de fixation d'O2) b. L'équation de HillA.V. Hill a caractérisé le comportement coopératif des enzymes oligomériques en 1910

E + nS ESn

E = enzyme, S = ligand, n= n° sous-unités

ESn][

[E][S] K

n

=

( )[ESn] [E]n

n[ESn] Ys

+=

n

n

[S]K

[S]Ys

+= L'équation de Hill

La valeur de n, la constante de Hill, augmente avec le degré de coopérativité de fixation du ligand

Si n = 1, la liaison du ligand est non coopérative, et la courbe de saturation est celle d'une hyperbole comme pour la Mb

Quand n > 1, la liaison est à coopérativité positive

Représentation de Hill

v = Vmax [S]n

S0.5n + [S]n

log v Vmax- v

= n.log [S] - n.log S0.5

log[S]

Pente = nlog v

Vmax- v

0

Pour l'Hb humaine normale, n = 3 et la 4ème molécule d' O2 se lie avec une affinité 100x supérieure à la 1ère

c. La globine empêche l'oxyhème de s'auto-oxyderL'hème-Fe(II) seul est incapable de lier l'O2 de façon réversible et s'auto-oxyde irréversiblement

Cette oxydation peut être inhibée en dérivatisant l'hème avec des groupements encombrants dans des "complexes clôturés"

C. Transport du dioxyde de carbone et effet Bohr

a. L'effet Bohr facilite le transport de l'O2

CO2 + H2O H+ + HCO3-

Dans les tissus où la p02 est basse, les H+ issus de la formation du bicarbonate sont captés par l'Hb qui libère son O2. Ces protons captés facilitent le transport du CO2 en stimulant la formation du bicarbonate. Dans les poumons, où la p02 est élevée, la liaison de l'O2 par l'Hb libère les protons captés précédemment, ce qui provoque le départ du CO2

L'effet Bohr assure un apport d' O2 supplémentaire à des muscles en activité intense. De tels muscles s'acidifient et abaissent le pH du sang de 7,4 à 7,2. Par conséquent, l'Hb libère environ 10% d' O2 de plus qu'à pH 7,4

b. Une quantité de CO2 est transporté par l'Hb et le CO2 module l'affinité de l'Hb pour l'O2

Le CO2 module la liaison de l'O2 et se combine réversiblement aux groupements N-terminaux libres des protéines sanguines pour former des carbamates:

Prot-NH2 + CO2 Prot-NH-COO- + H+

La désoxyHb fixe davantage de CO2 sous forme de carbamate que l'oxyHb

D. Influence du BPG sur la liaison d'O2

L'Hb purifiée (nue) a une affinité plus grande pour l'O2 que l'Hb du sang complet. La présence du D-2,3-bisphosphoglycérate (BPG) diminue l'affinité de l'Hb pour l'O2

Le BPG diminue l'affinité de l'Hb pour l'O2 en la maintenant dans la conformation désoxy. La p50 de l'Hb nue augmente de 12 à 22 Torr en présence de BPG 4,7 mM, sa concentration normale dans des érythrocytes et identique à celle de l'Hb (complexe 1:1)

En absence de BPG, seule une faible quantité d'O2 est libérée dans les tissus

Le CO2 et le BPG modulent de façon indépendante l'affinité de Hb pour l'O2

a. L'augmentation des teneurs en BPG est en partie responsable de l'adaptation en haut altitude

L'adaptation en haute altitude-

1) implique une augmentation du nombre d'érythrocytes et de la teneur en Hb

2) est due à une augmentation rapide de la concentration en BPG érythrocytaire

L'augmentation de p50 de 26 à 31 Torr par une concentration de BPG augmentée permet l'Hb de libérer la même quantité d'O2 (37%) à une altitude de 4500 m (pO2 artérielle de 55 Torr) que l'Hb normale au niveau de la mer

b. L'Hb foetale a une faible affinité pour le BPG

-le BPG se lie avec moins d'affinité a la désoxy HbF (22) que à la désoxy HbA maternelle

2 STRUCTURE ET MECANISME

Les déterminations des premières structures de protéines par rayons X, celles de la Mb de cachalot (John Kendrew, 1959) et de l'Hb de cheval (Max Perutz, 1968) a provoqué une révolution dans la manière de penser biochimique qui a rénové notre compréhension de la chimie de la vie

Première structure de protéines par rayons X• Myoglobine de cachalot par John Kendrew en 1959• Pli 75% hélice

- 155 acides aminés, ~ 17 kDa

Premier complexe protéique• Hémoglobine• Deux copies de chaque sous-unité & • Déterminé par Max Perutz en 1968

A. Structure de la myoglobine

Myoglobine

- Protéine de 157 acides aminés

- De ≈ 4,5 x 4,5 x 2,5 nm

- Comportant 8 hélices alpha (désignées A-H) reliées entre elles par des boucles (résidus désignés en fonction de leur position dans hélices oudans boucles)

- Comportant un groupement prosthétique : hème, - pris en sandwich entre hélices E et F- Fer lié à His F8 (histidine proximale)- groupements propionates affleurant à la surface

- O2 (si présent) - lié à Fe et à His E7 (histidine distale)- modifie distribution électronique de l’hème (coloration rouge vif)

Structure de la myoglobine de cachalot

Représentation stéréo du complexe hème dans l'oxyMb

Tétramère constitués de 2 sous-unités alpha + 2 sous-unité ß (quasi homotétramère)

Sous-unités alpha et ß = homologues de la myoglobine - 18 % d’identités- présence de résidus invariants (par ex. HisE7, HisF8, PheCD1)

Chaque sous-unité possède un hème et est donc capable de fixer un O2

(4 O2 au total)

Arrangement des sous-unités: dimères de dimèrescontacts : 1-ß1 ou 2-ß2: 35 résidus

1-ß2 ou 2-ß1: 19 résidus1-2 ou ß1-B: guère d’interactions

1

1 2

2

B. Structure de l'hémoglobine

Structures de (a) la désoxyHb (a) et (b) l'oxyHb

Etat T (désoxy) Etat R (oxy)

Bold T-désoxy

pointillé R-oxy

L'oxygénation fait pivoter le dimère de 15° par rapport au dimère , ce qui provoque le déplacement de certains atomes de l'interface jusqu'à 0.6 nm

La conformation quaternaire de la désoxyHb est appelée l'état T ("tendu"). Celle de l'oxyHb est appelée l'état R ("relâché")

C. Mécanisme coopératif de la liaison de l'O2

a. Le déplacement du Fe(II) dans le plan de l'hème déclenche le changement de conformation T-R

La différence entre les conformations R et T concerne essentiellement l'interface qui comporte l'hélice C et le segment FG de 1 en contact avec le segment FG et l'hélice C de 2. Lors de la transition T-R suite au mouvement de l'hélice F, les liaisons hydrogène de contact 1C-2FG passent directement d'une position à l'autre et ces contacts agissent comme un interrupteur binaire qui ne permet que deux positions stables des sous unités:

Liaison hydrogène Tyr C71-Asp G1 2

Changement de liaison hydrogène suite à la liaison de l'O2 à l'hème

HbT-state deoxy

Hb R-state - oxy

b. L'état T est stabilisé par un réseau de ponts salinsLes changements de structure qui accompagnent la transition T-R détruisent le réseau de ponts salins et de liaisons hydrogène qui stabilisent la désoxyHbc. La courbe sigmoïde de liaison de l'O2 à l'Hb est la résultante de ses courbes hyperboliques à 'état R et l'état T

D. Base structurale de la liaison du BPG

3 HEMOGLOBINES ANORMALESChangements de residus de surface - par exemple dans l'HbS de l'anémie falciformeChangements de résidus internes par exemple mutations qui stabilisent la methémoglobine (forme oxydée FeIII):Hb Boston His E7(58) - Tyr (histidine distale)Hb Milwaukee Val E11(67) - Glu

Allos: autre; stereos: solide (forme dans l’espace)

Régulation (principalement d’activités enzymatiques) - faisant intervenir des modifications de conformation d’une protéine et - permettant de rendre compte de l’effet d’effecteurs allostériques - et de phénomènes de coopérativité

Effecteur allostérique: molécule se liant à distance du site catalytique(au niveau d’un site allostérique), agissant comme activateur ou comme inhibiteur

Coopérativité positive ou négative: effet d’un ligand d’une protéine de faciliter ou de défavoriser la fixation d’un autre ligand

Effet homotrope: effet coopératif d’un ligand sur sa propre fixationEffet hétérotrope: effet coopératif d’un ligand sur la fixation d’un autre ligand

4 REGULATION ALLOSTERIQUE

Modèles de coopérativité

Modèle Monod, Wyman et Changeux 1965. Modèle "CONCERTE" ou "SYMETRIQUE" - le ligand peut se lier à un protomère quelle que soit sa conformation. Seul le changement conformationnel modifie l'affinité

État T

État R

Régulation allostérique : modèle symétrique

Conformation “T”Peu d’affinité pour SPeu d’affinité pour AHaute affinité pour I

Conformation “R”Affinité élevée pour SAffinité élevée pour APeu d’affinité pour I

Equilibre en faveur de T en l’absence de ligand

S

S La liaison de S augmente l’abondance de la forme R, favorisant dès lors la liaison de nouvelles molécules de S

Régulation allostérique : modèle symétrique

S

S

S

S

S

Régulation allostérique : modèle symétrique

Régulation allostérique

v Vmax

+ Inhibiteur

+ Activateur

Substrat

Modèle Koshland 1966 Modèle "SEQUENTIEL" - la liaison du ligand induit progressivement des changements conformationnels dans les sous-unités

Modèles de coopérativité