La chromatographie

IV.1. Gnralits sur la chromatographie

Le concept de Chromatographie en phase gaz a t introduit par Archer Martin et Richard

Synge en 1941. La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est comme toutes les techniques

de chromatographie, une technique qui permet de sparer des molcules d'un mlange

ventuellement trs complexe de nature trs diverses. Elle s'applique principalement aux

composs gazeux ou susceptibles d'tre vaporiss par chauffage sans dcomposition. Elle est

de plus en plus utilise dans les principaux domaines de la chimie.

IV.1.1. Dfinition :

La chromatographie est une mthode physique de sparation base sur les diffrences

d'affinits des substances analyser l'gard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre

mobile. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la sparation des composants

entrans par la phase mobile, rsulte soit de leur adsorption et de leur dsorption successive

sur la phase stationnaire, soit de leur solubilit diffrente dans chaque phase.

On dfinit un coefficient de partition K : =

C S : concentration dans la phase stationnaire.

Cm : concentration dans la phase mobile.

IV.1.2. Classification des techniques chromatographiques

Les techniques chromatographique peuvent reparties suivant plusieurs critres : en fonction

de la nature des deux phases en prsence, ou du procd utilis, ou du phnomne physico-

chimique responsable du coefficient de distribution k.

Classification selon la nature physique des phases :

La phase mobile : fluide (liquide ou gaz).

La phase stationnaire : solide ou liquide.

La combinaison de ces diffrentes possibilits permet de distinguer :

Chromatographie liquide-liquide.

Chromatographie liquide-solide.

Chromatographie gaz-liquide.

Chromatographie gaz-solide.

informatiqueNoteAlain TCHAPL evolution de la Chromatographie en Phase Gazeuse Paris 2005

informatiqueNoteEdith ANTONOT Robert MARCHAL.CHROMATOGRAPHIE 1998

informatiqueNoteVronique JACOB Principes gnraux de la chromatographie 2009 PARIS

Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

IV .2. Dfinition de la CPG :

Technique de sparation applicable aux composs gazeux ou susceptibles dtre volatiliss

par lvation de chauffage sans dcomposition.

Elle permet lanalyse de mlange ventuellement trs complexe de nature et de volatilit

trs diverses. Manuel pratique de la CPG P.ARPINO, A.VEROGNOL,P.WITIER /4eme

dition PARIS MILAN 1995

IV .2.1. Principe :

La chromatographie gaz-liquide (partage). La phase stationnaire est un liquide non

volatil fix par imbibition d'un support inerte. Le solut se partage entre le gaz vecteur

et le liquide stationnaire.

La chromatographie gaz-solide (adsorption). La phase stationnaire est un solide adsorbant (gel de silice, alumine). Plus l'adsorption d'un solut sur la phase

stationnaire est leve.

Figure : appareil de CPG

informatiqueNoteManuel pratique de la CPG P.ARPINO, A.VEROGNOL,P.WITIER /4eme dition PARIS MILAN 1995

IV .3. Matriels

Description d'un chromatographe

Figure : schma dun chromatographe en phase gazeuse

Le chromatographe comprend schmatiquement 5 parties : une source de gaz, une chambre

dinjection, un four dans lequel se trouve plac une colonne, un dtecteur coupl un

enregistreur.

IV .3.1. Source de gaz

La source de gaz (gaz porteur ou vecteur) constitue la phase mobile. Conserv sous pression

dans des bonbonnes mtalliques, le gaz passe dans des dtendeurs permettant dobtenir

des pressions allant de 0.2 4 bars.

Ils existent des rgulateurs permettent de choisir et de contrler la vitesse de passage dsire

de cette phase mobile. Elle variera selon les dimensions de la colonne.

Les principaux gaz utiliss sont : N2, Ar, He, H2.

Ils doivent rpondre un certain nombre de critres :

trs grande puret.

inertie vis--vis des substances chromatographie.

trs faible viscosit.

compatibles avec le systme de dtection. 05 chromato gaz

informatiqueNoteEdith ANTONOT Robert MARCHAL.CHROMATOGRAPHIE 1998

IV .3.2. Injecteur :

Il permet d'introduire un liquide qui doit tre vaporis instantanment avant d'tre transfr

dans la colonne. Sa temprature doit tre suprieure d'environ 20C la temprature du

produit le moins volatil.

Le gaz porteur est de prfrence prchauff, entre dans une chambre chauffe, obture par une

pastille dlastomre, le septum, qui assure ltanchit travers lequel Les gaz sont introduits

soit par une seringue soit par un systme de vanne et de boucles. La boucle est un tube qui est

alternativement balay par le mlange analyser, ou par le gaz vecteur. Ce systme permet

l'injection de volumes constants pour des analyses multiples reproductibles.

Il existe deux types d'injecteurs. Ceux pour les colonnes remplies (peu nombreux actuellement) et

ceux pour les colonnes capillaires (le plus frquent ...)

Dans le cas des colonnes capillaires, 3 modes d'injections peuvent se prsenter :

injection avec division (split) : le mlange est divis en deux parties. La plus petite

partie arrive sur la colonne alors que la plus importante est vacue.

injection sans division (splitless) : le mlange n'est pas divis en deux parties.

injection dans la colonne (on-column) : il n'y a pas d'tape de vaporisation

l'chantillon .

Figure injecteur programmable split/splitless

IV .3.3. Colonne :

C'est l'organe principal. Elle est constitue d'un tube gnralement mtallique de diamtre

intrieur de l'ordre du millimtre. Ce tube contient la phase stationnaire constitue par un

substance active ; solide, liquide .la colonne est balaye en permanence par un gaz appel gaz

vecteur (porteur).

Les constituants de lchantillon partis en mme tempe de linjection vont se dtache les uns

des autres a traverse la colonne, selon leur affinit pour la phase stationnaire. Manuel pratique

Figure : vue en dtail dun PSS et on colonne

informatiqueNote. Claudine Buess-Herman /Josette Dauchot/Weymeers Et Freddy Dumont 1997 /paris /chimie analytique SKOOG.WEST.HOLLER 7eme dition p (660-686).

informatiqueNoteFranck DENAT Av. Alain Savary Franc Chromatographie++ pharmacope international 3eme edition V1 mthode gnrale danalyse GENEVE 1980

Il existe deux types de colonnes avec des variantes :

colonnes remplies ou garnissage (packed)

colonnes capillaires (open tubular).

Les grains jouent le rle du support de la phase stationnaire, elles sont base de diatomite qui

peut tre selon la phase stationnaire :

des grains macroporeux pour si la phase est liquide.

des grains de petits taille si la phase est solide.

A. Caractristiques des colonnes remplies ou garnissage

diamtre interne : 3,2 mm ou 6,4 mm

longueur : 0,5 3 mtres

tube :

acier inoxydable : inerte et bon conducteur de chaleur.

Verre : inerte mais mauvais conducteur de chaleur.

B-Caractristiques des colonnes capillaires

diamtre interne longueur : 15 100 mtres tube : silice fondue recouvert dune mince couche de polyimide.

Figure : colonnes remplies Figure : schma dune colonne remplies

Figure : colonnes capillaires Figure : schma dune colonne capillaire

informatiqueNote+ pharmacope international 3eme edition V1 mthode gnrale danalyse GENEVE 1980

IV .3.4. Le four

Cest un four bain dair, pourvu de rsistances

chauffantes et dun systme de ventilation et de

brassage pour lhomognisation de la temprature.

La rgulation est assure par un thermocouple,

grce auquel la variation nexcde pas 0,2C,

pour un intervalle de fonctionnement allant de la

temprature ambiante jusqu 400C. Sa

temprature est en gnral de 20C infrieure

celle du solut de plus bas point dbullition.

Cette partie de l'quipement doit pouvoir fonctionner suivant deux modes :

isotherme entre 20 et 400C

en programmation de temprature avec des squences plus ou moins complexes.

IV .3.5. Dtecteur :

Les dtecteurs dclent la prsence des substances chromatographies dans le gaz vecteur au

fur et mesure de leur lution. Ils sont toujours placs en sortie de colonne. Ces substances

modifient une proprit chimique ou physique du gaz et ces variations sont transformes par

le dtecteur en signaux lectrique qui sont amplifies et transcrit sous forme dun graphique.

A- Un Dtecteur conductibilit thermique (TCD) ou catharomtre :

Il est fond sur une comparaison continuelle entre le flux de chaleur

emport par le gaz vecteur pur et le flux de chaleur emport par le gaz

vecteur charg des molcules de solut. Nous obtiendrons un signal

chaque fois que l'un des constituants se prsentera dans la cellule car la

conductibilit thermique du gaz vecteur (qui traverse le dtecteur)

varie quand le constituant X traverse le dtecteur.

B- Un dtecteur ionisation de flamme (FID) : Une tension de l'ordre de la centaine de volts est maintenue entre la

buse de la flamme et une lectrode entourant cette dernire. Lorsque les

molcules traversent la flamme, elles sont ionises ce qui provoque

entre les lectrodes un courant lectrique qui est ensuite amplifi. Il a

aussi linconvnient, contrairement au catharomtre, de dtruire le solut

qui le traverse, car son principe est de brler, dans une flamme dhydrogne.

Figure : Dtecteur TCD

Figure : Dtecteur FID

Figure : four de CPG

informatiqueNotechromatographie en phase gazeuse PATRICK ARPINO 1996 PARIS P1485-1

informatiqueNoteChromatographie en phase gazeuse (CPG): 2011 Professeur SAALAOUI Ennouamane

informatiqueNoteChromatographie en phase gazeuse (CPG): 2011 Professeur SAALAOUI Ennouamane

C-Un dtecteur absorption lectronique (ECD) : des lectrons sont mis que le tritium (H3)

ou le (Ni63), en gnral par une source radioactive (rayonnement bta), et traversent le gaz,

lorsqu'un lectron rencontre une molcule de gaz, il peut tre captur, ce qui fait varier

l'intensit du courant d'lectrons, cette intensit tant mesure en continu.

D- Un dtecteur thermoonique (NPD).

E- Un spectromtre de masse (MS) : utilisant principalement l'impact lectronique ou

l'ionisation chimique comme modes d'ionisation.

IV .3.6. Le chromatogramme :

C'est la courbe donnant la concentration des produits sortant de la colonne (effluents) en

fonction du temps ou du volume de gaz vecteur dbit. Gnralement cette courbe est une

courbe de type gaussien (pic). Le premier pic est, uniquement avec un dtecteur

catharomtre, le pic de l'air, invitablement inject avec le mlange inconnu. Il correspond au

volume de gaz de la colonne car l'air n'est pas retenu par la phase stationnaire.

Le pic d'un compos quelconque se caractrise par :

t0: dbut de l'injection

tr : Le temps de rtention.

tr' : temps de rtention rduit.

h : La hauteur.

tm : temps mort.

Wb : largeur du pic la base ().

Wh : largeur du pic mi-hauteur ().

Vm : volume mort de la colonne.

Figure : CHROMATOGRAMME

figure : reprsentation dun chromatogramme

informatiqueNote Claudine Buess-Herman /Josette Dauchot/Weymeers Et Freddy Dumont 1997 /paris /chimie analytique SKOOG.WEST.HOLLER 7eme dition p (660-686).

informatiqueNoteChromatographie en phase gazeuse (CPG): 2011 Professeur SAALAOUI Ennouamane

Le temps de rtention rduit est gal la diffrence d'abscisses entre le compos et l'air, il est directement li au cfficient de partage du compos entre les phases mobile et stationnaire.

IV .4. Optimisation de la sparation : Lobjectif du chromatographie est triple : obtenir des pics chromatographiques les plus fins

possibles (grande efficacit), les mieux spars possible (bonne rsolution), en un temps

danalyse minimum. Dans cet but La plupart des utilisateurs travaillent en "programmation ",

ses mthodes dits les mthodes doptimisation par les plans dexpriences (PE) .

IV .4.1. Paramtres influenant les sparations :

Sur quels paramtres peut-on jouer en GC ?

choix de la temprature de sparation :

choix de type de colonne :

choix de la phase stationnaire :

choix de Dbit du gaz vecteur :

choix de systme(s) dinjection :

A-Choix de Temprature :

L'ensemble des organes dcrits ci-dessus sont placs dans des enceintes thermostates

des tempratures programmes selon la disposition des organes et la nature de

l'chantillon analyser.

Linjecteur : une temprature de 20 30 C au-dessus de celle de la colonne.

la colonne : La temprature de la colonne est en gnral infrieure de 20C celle du

point d'bullition du solut le plus volatil. Plus la temprature de colonne est basse,

meilleure est la sparation, mais cela risque d'allonger le temps d'analyse.

Le four : la temprature doit tre lgrement suprieure la temprature d'bullition

des composs de manire ce que les composs ne sortent pas trop tt. On peut

travailler en isotherme, cest--dire avec une temprature fixe durant toute l'analyse ou

avec un programme de temprature qui varie.

dtecteurs : Il est galement ncessaire que ces dtecteurs puissent tre ports des

tempratures aussi leves que les colonnes pour viter qu leur contact les vapeurs

se condensent.

Figure :Paramtres influenant les sparations

informatiqueNoteFranck DENAT Av. Alain Savary Franc Chromatographie

informatiqueNoteLe couplage chromatographie en phasegazeuse-spectromtrie de masse Stphane Bouchonnet1, Danielle Libong

Le facteur de capacit dpend de la temprature.

RM : Souvent, on trouve dans un mlange complexe des espces bas et haut point

dbullition. Si la temprature est rgle de manire obtenir une bonne rsolution pour le

compos bas PE, il faudra un temps relativement long pour luer celui haut PE. Au

contraire, si les conditions sont fixes pour le compos haut PE, les espces bas PE

apparatront pour ainsi dire spontanment et leur sparation sera mauvaise. On propose,

alors, une programmation de la temprature rgulirement tout au long du processus de la

sparation.

B-Choix du gaz vecteur

Contrairement lHPLC, le Gaz Vecteur nintervient pas dans le mcanisme de

sparation.

Plus le gaz est pur, plus la dure de vie de la colonne est prolonge et plus la

sensibilit sen trouve augmente.

Pratique : afin de garantir une excellente puret, il est conseill dintercaler des filtres

(piges) entre lalimentation de gaz vecteur et le GC.

Des piges et des filtres doivent tre installs en amont du Chromatographe.

A- type de gaz vecteur ( mobile) en fonction de :

Ses proprits obligatoires : inertie, faible diffusion, puret, peu coteux, compatible

avec le dtecteur

Example: N2, He, H2, Ar/CH4, ...

il est donc ncessaire quil y ait la plus grande diffrence possible entre la conductivit de ce

solut et celle du gaz porteur. A cet effet, on utilise pratiquement toujours lhydrogne

(danger dexplosion) ou lhlium comme gaz vecteur.

B-le vitesse linaire du gaz :

il faut un dbit de gaz dans la colonne stable, reproductible et contrl

Dbit recommand pour le gaz vecteur :

Colonnes remplies 20-60 mL/min

Colonnes capillaires 0.5-2 mL/min

C-Systme(s) dinjection :

Combien injecter ?

Comment injecter ?

A la main ?

autosampler

Gaz : Introduction laide dune chambre ou dune seringue gaz

Liquide : Introduction laide de micro seringues

Solide : Introduction laide de micro seringues aprs dissolution de lchantillon dans un

solvant appropri Volume dInjection.

D-Choix de type de colonne :

Une augmentation de la longueur de la colonne augmente les temps de rtention mais

s'accompagne souvent d'un largissement des pics.

E-Choix de la phase stationnaire :

Le choix de la phase stationnaire conditionne la bonne sparation des constituants .Il faudra la

choisir polaire ou apolaire en fonction de la nature des substances sparer .On distingue :

les phases apolaires sont base dhydrocarbures aliphatiques saturs ou de silicones

(squalane, apiezon,...). dans la phase apolaire la force de dispersion (interaction) joue

un rle primordial, donc la diffrence dans ces forces refltes dans les points

dbullition

les phases polaires sont des polymres possdant des fonctions polaires : polyols,

polyesters, polyamides. dans la phase polaire on trouve linteraction diple-diple en

plus des forces de dispersion

IV .4.2. Couplage de CPG :

Lidentification de composants dun mlange, ncessit ou non de coupler la

chromatographie avec une mthode spectroscopique ou avec las pectromtrie de masse

(CPG/SM ou GC/MS), contrle de puret, purification de produits (colonnes prparatives),

suivi de raction en continu pour optimiser des paramtres, dosages (quantification)

Les limites de la GC-MS sont celles de la chromatographie en phase gazeuse. Le facteur

limitant tant la volatilit des soluts, cette technique est rserve lanalyse de molcules

aisment vaporisables et thermiquement stables, cest dire, en premire approximation, de

composs de poids molculaire faible moyen. Ces limites admises, la GC-MS est un

formidable outil danalyse. La diversit des modes dinjection et des colonnes capillaires

(gomtrie, nature de la phase stationnaire) autorise la sparation de mlanges extrmement

complexes (huiles essentielles, mtabolites, hydrocarbures). Contrairement aux autres

dtecteurs,

Le spectromtre de masse fournit des informations structurales sur les analytes tudis et peut

permettre leur identification instantane si ceux-ci sont rpertoris dans des bibliothques de

spectres. Le spectromtre de masse permet galement de quantifier les analytes , mme co-

lus, des concentrations infrieures au ng/L. Cest sa capacit dtecter spcifiquement

une ou plusieurs molcules au sein dun chantillon trs complexe qui en fait un dtecteur

idal pour lanalyse de traces en toxicologie, pharmacologie et mdecine, environnement,

ptrochimie, et de synthse organique. Le couplage chromatographie en phasegazeuse-

spectromtrie de masse Stphane Bouchonnet1, Danielle Libong

Figure : schma dun appareil de couplage GC-MS