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CENTRE INTERNATIONAL D’ETUDES SUPERIEURES EN SCIENCES AGRONOMIQUES

(Montpellier SupAgro)

ECOLE DOCTORALE Systèmes Intégrés en Biologie, Agronomie, Géosciences, Hydrosciences et Environnement

(SIBAGHE)

DOCTORAT

Spécialité : Ecosystèmes

Matthieu Nicolas BRAVIN

PROCESSUS RHIZOSPHERIQUES DETERMINANT LA BIODISPONIBILITE DU CUIVRE

POUR LE BLE DUR CULTIVE EN SOLS A ANTECEDENT VITICOLE

Thèse dirigée par Philippe HINSINGER

Soutenue le 6 novembre 2008

Devant le jury composé de : Jean-Claude DAVIDIAN Professeur, Montpellier SupAgro Président du jury Marc BENEDETTI Professeur, Université Paris VII Rapporteur Catherine KELLER Professeur, Université Aix-Marseille III Rapporteur Antonio BISPO Ingénieur, ADEME Examinateur Rodolphe GILBIN Ingénieur, IRSN Cadarache Examinateur Philippe HINSINGER Directeur de Recherche, INRA Directeur de Thèse

Résumé La rhizosphère, volume de sol soumis à l’influence des racines, est le siège d’intenses processus physico-chimiques induits par l’activité racinaire qui sont capables d’influencer le transfert sol-plante des métaux. Dans le contexte de la contamination en cuivre (Cu) des sols à antécédent viticole du Languedoc-Roussillon, mes travaux ont visé à identifier les principaux processus rhizosphériques déterminant la biodisponibilité de Cu pour le blé dur (Triticum turgidum durum L.). Une première expérimentation menée in situ sur une large gamme de sols a permis de montrer que la biodisponibilité de Cu était indépendante du pH du sol et principalement déterminée par le niveau de contamination du sol. Ces résultats ont pu être reliés à l’alcalinisation de plus de une unité pH observée dans la rhizosphère en sols très acides (pH < 5), qui a induit une forte diminution de la disponibilité de Cu. La comparaison ex situ des flux de prélèvement de Cu par le blé dur et de réapprovisionnement de Cu par le sol a montré que le réapprovisionnement de Cu en solution n’était pas systématiquement limitant, notamment dans les sols les plus contaminés. L’ampleur de l’alcalinisation de la rhizosphère est apparue linéairement corrélée au pH initial du sol, diminuant lorsque le pH augmente. Il a été confirmé que la faible biodisponibilité de Cu en sols très acides était la résultante de ce phénomène d’alcalinisation. L’activité racinaire a également induit des modifications de la concentration et des propriétés de complexation des matières organiques dissoutes (MOD) dans la rhizosphère. Ces modifications ont été responsables de l’augmentation de la disponibilité de Cu et, vraisemblablement, de sa biodisponibilité dans les sols neutres à alcalins. La biodisponibilité de Cu pour le blé dur apparaît donc principalement déterminée par les modifications de pH et de MOD induites par les racines dans la rhizosphère. Mots clés : Alcalinisation, Blé dur (Triticum turgidum durum L.), Cuivre, Labilité, Phytodisponibilité, Rhizosphère, Spéciation. Thèse réalisée à : INRA-Montpellier SupAgro UMR 1222 Biogéochimie du Sol et de la Rhizosphère 2 place Viala, bâtiment 12 34060 Montpellier Cedex 01

Rhizosphere processes controlling the bioavailability of copper to durum wheat cultivated in former vineyard soils

Abstract

The rhizosphere, the volume of soil influenced by root activities, is the site of intense, root-induced physical-chemical processes that can alter the soil-plant transfer of metals. In the context of copper (Cu) contamination of former vineyard soils in the Languedoc-Roussillon region, my work aimed at identifying the major rhizosphere processes which control Cu bioavailability to durum wheat (Triticum turgidum durum L.). The first experiment was performed in situ and highlighted over a broad range of soils the inadequacy of soil pH and, conversely, the ability of total soil Cu to explain the changes in Cu bioavailability. These results were the consequence of root-induced alkalisation by up to above one pH unit in the rhizosphere of strongly acidic soils (pH < 5), which resulted in a drastic decrease in Cu availability. The comparison under controlled conditions of the uptake flux of Cu into durum wheat and the re-supply flux of Cu from soil showed that the re-supply of Cu in the soil solution was not systematically the rate-limiting process, especially in the most contaminated soils. The extent of the rhizosphere alkalisation was linearly correlated to bulk soil pH, decreasing with increasing bulk soil pH. The role of rhizosphere alkalisation in substantially restricting Cu bioavailability in strongly acidic soils was further confirmed in this experiment. Roots also induced changes in the concentration and the metal binding properties of the dissolved organic matter (DOM) in the rhizosphere. Such changes induced an increase in Cu availability and, likely, Cu bioavailability in neutral to alkaline soils. Therefore, the bioavailability of Cu to durum wheat was mainly controlled by the root-induced changes of pH and DOM in the rhizosphere. Keywords: Alkalisation, Copper, Durum wheat (Triticum turgidum durum L.), Lability, Phytoavailability, Rhizosphere, Speciation.

Remerciements La thèse, bien au-delà du diplôme, est une expérience professionnelle très enrichissante et plus que formatrice. Son aboutissement n’aurait pas été possible, ou en tout cas pas tel qu’il a été, sans l’implication et le soutien de très nombreuses personnes que je souhaiterais remercier ici. Je tiens en premier lieu à remercier la maison des écoles doctorales (MED), l’école doctorale SIBAGHE ainsi que l’association des doctorants de l’université de Montpellier (ADUM) pour l’organisation de formations telles que les « Doctoriales® » ou le « Nouveau Chapitre de la Thèse® » qui aident les doctorants à entrevoir la thèse comme le début de la vie professionnelle et non seulement comme l’achèvement des études. Je souhaiterais également remercier l’ensemble des personnes avec qui j’ai eu la chance de collaborer pendant la thèse et qui ont apporté une valeur ajoutée certaine à mes travaux. Je pense notamment à : André Schneider et Laurence Denaix (INRA TCEM), Cédric Garnier, Véronique Lenoble et Yoann Louis (Université du Sud Toulon-Var), Jean-Marie Garnier et Jérôme Rose (CEREGE), Pierre Czernic (Université Montpellier II), Bruno Buatois (CEFE) ainsi que Jean-Pierre Barthès. Je remercie l’ensemble des membres de mon jury, Marc Benedetti (Université Paris VII), Antonio Bispo (ADEME), Jean-Claude Davidian (Montpellier SupAgro), Rodolphe Gilbin (IRSN) et Catherine Keller (Université Aix-Marseille III), pour le temps qu’ils ont passé sur mon « gros pavé » ainsi que pour leurs remarques pertinentes et constructives. Je ne pourrais évidemment pas oublier de remercier le personnel de l’unité « Biogéochimie du Sol et de la Rhizosphère » dans son ensemble pour la qualité du suivi accordé à chaque étudiant ainsi que pour la bonne humeur et la disponibilité que j’ai toujours pu trouver auprès de chacun d’entre vous. Je remercie plus particulièrement parmi les chercheurs : Benoît qui est tout simplement la personne à l’origine de ma venue dans l’unité, Yves et Frédéric pour votre participation active dans mon comité de pilotage et vos conseils éclairés ainsi qu’Edith pour m’avoir donné la chance de goûter à l’enseignement et plus largement pour ta complicité. Philippe, merci pout tout ce que j’ai appris de toi… Je te dois beaucoup dans la réussite qui est venue souligner cette fin de thèse. Je souhaiterais également remercier les personnes avec qui j’ai travaillé au quotidien, et notamment : Nicole, Didier et Gérard pour votre aide précieuse lors du « bricolage » des dispositifs expérimentaux, des longues phases de récolte ou encore des sorties rafraîchissantes sur le terrain, Michaël pour ton aide et tout ce que j’ai appris avec toi en chimie analytique (bon courage pour la thèse, profitez au mieux de l’Italie), Corinne et Farid pour votre infaillible patience dans toutes les démarches administratives que j’ai dues effectuer ainsi que Lucien pour tes conseils bienveillants sur la sécurité dans les labos. Un grand merci également à tous les étudiants que j’ai pu encadrer et qui, au-delà de leur aide, m’ont beaucoup appris : Mauricio aussi talentueux au football qu’à récupérer la rhizosphère sur les racines de plantes prélevées au

champ, Bourane qui doit encore cauchemarder des quelques 250 dispositifs « RHIZOtest » qu’elle a dus monter durant son stage, Jean-Philippe qui m’a fait découvrir les joies de l’escalade in vivo, Bastien qui m’a définitivement convaincu des limites réelles de la Bretagne ( !) ainsi qu’Ana pour ton insatiable bonne humeur, toi qui a eu la chance et la malchance de travailler avec un thésard en dernière année… La thèse est également l’occasion de collaborer sur des sujets parallèles au sien et donc d’enrichir sa cultue scientifique. Ne serait-ce que pour ça, merci Peter, Delphine et Florian. Many thanks Manju for the piece of work that we shared as well as for the discovery of some indian food that I hope to taste further in India in the future ! Que serait la recherche sans la présence des « quasi-permanents » du labo, je veux dire des doctorants ?! Merci notamment à mes deux collègues de bureau, Aurélia qui est maintenant plus qu’une simple collègue et Nicolas (attention, l’abus de modélisation est dangereux pour la santé !!), à Claire-Sophie, Nordine, Julien (il faudra quand même qu’on se voit le prochain Marseille-Lyon ensemble !) et Arif. Je souhaiterais également remercier les personnes de l’unité SEQBIO avec qui j’ai pu échanger, je pense notament à Jean-Luc et Joëlle (merci pour les longues heures passées sur le TOC pour moi, cela n’aura pas été vein…). Dans la foulée de la dynamique qui anime la fusion entre BSR et SEQBIO, je souhaite une longue et belle vie à la future unité ECO&SOLS. L’achèvement de cette thèse vient couronner un cursus de neuf ans au cours duquel mes parents m’ont laissé une entière liberté d’orientation. Merci donc pour votre largesse d’esprit et votre confiance. Cette thèse n’aurait pas pu avoir un tel aboutissement sans toi, sans ton soutien, ta présence et ta capacité à me (re-)mobiliser. Elle t’aura demandé, à toi aussi, beaucoup de sacrifices. La science est ingrate avec le thésard, mais certainement encore plus avec son conjoint qui ne l’a pas vraiment choisie. A charge de revanche… Enfin, quelques citations qui ont jalonné ces trois dernières années :

« J’aime l’image d’un être qui se nourrit par ses racines et s’enrichit de la lumière qui vient d’ailleurs. » Nicolas

Hulot

« I predict that one of the major leitmotifs of soil chemistry in the 21st century will be the study of biological effects on soil chemical reactions and processes. » Donald L. Sparks

« Then you’ll find your servant is your master » The Police

Sommaire

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Sommaire

INTRODUCTION GENERALE ................................................................................... 4 CONTAMINATION EN CUIVRE DES SOLS A ANTECEDENT VITICOLE - CONTEXTE ET ENJEUX

REGIONAUX

CHAPITRE 1. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ...................................................... 7 BIODISPONIBILITE DU CUIVRE A L'INTERFACE SOL-PLANTE - CONCEPTS, PROCESSUS ET OUTILS

D'EVALUATION

I. Concepts de disponibilité et de biodisponibilité des métaux dans les sols ....................... 7 I.1. Disponibilité environnementale ....................................................................................... 7 I.2. Biodisponibilité environnementale .................................................................................. 8 I.3. Biodisponibilité toxicologique......................................................................................... 9

II. Disponibilité environnementale du cuivre dans les sols................................................. 11 II.1. Niveau de contamination en cuivre des sols, cas particulier des sols viticoles ............ 11 II.2. Spéciation du cuivre : une vision à l’équilibre du système sol..................................... 13 II.3. Spéciation dynamique du cuivre : vers une vision cinétique du système sol ............... 21

III. Biodisponibilité environnementale du cuivre pour les plantes.................................... 27 III.1. Prélèvement et distribution du cuivre dans la plante................................................... 27 III.2. Evaluation de la biodisponibilité environnementale à partir de la disponibilité du cuivre dans le bulk soil......................................................................................................... 32 III.3. Modifications chimiques dans la rhizosphère ............................................................. 37 III.4. Modélisation numérique de la biodisponiblité : approche Barber-Cushman.............. 42

IV. Biodisponibilité toxicologique du cuivre pour les végétaux supérieurs ...................... 45 IV.1. Rhizotoxicité ............................................................................................................... 45 IV.2. Stress oxydatifs et génotoxicité................................................................................... 47 IV.3. Phytotoxicité au niveau des parties aériennes : induction de déficiences................... 47

V. Méthodes et outils pour l’évaluation de la biodisponibilité des métaux pour les plantes.................................................................................................................................................. 49

V.1. Mesures chimiques basées sur la disponibilité environnementale des métaux ............ 49 V.2. Mesures biologiques basées sur la biodisponibilité des métaux .................................. 50

VI. Objectifs et stratégie de recherche ................................................................................. 52 VI.1. Hypothèse de base....................................................................................................... 52 VI.2. Objectifs ...................................................................................................................... 52 VI.3. Approche expérimentale ............................................................................................. 53

CHAPITRE 2 ............................................................................................................ 63 BIODISPONIBILITE DU CUIVRE POUR LE BLE DUR - EVALUATIONS IN SITU ET EX SITU

I. Copper uptake and phytotoxicity as assessed in situ for durum wheat (Triticum turgidum durum L .) cultivated in Cu-contaminated, former vineyard soils ..................... 65

I.1. Introduction.................................................................................................................... 66

Sommaire

2

I.2. Material and methods..................................................................................................... 67 I.3. Results............................................................................................................................ 68 I.4. Discussion ...................................................................................................................... 75 I.5. Acknowledgements........................................................................................................ 79 I.6. Literature........................................................................................................................ 79

II. RHIZOtest: a plant-based biotest to account for rhizosphere processes to assess metal bioavailability ......................................................................................................................... 82

II.1. Introduction .................................................................................................................. 83 II.2. Material and Methods................................................................................................... 84 II.3. Results .......................................................................................................................... 86 II.4. Discussion..................................................................................................................... 90 II.5. Conclusion .................................................................................................................... 92 II.6. Acknowledgements ...................................................................................................... 92 II.7. Supplementary data ...................................................................................................... 93 II.8. Literature ...................................................................................................................... 96

CHAPITRE 3 ............................................................................................................ 98 PRELEVEMENT DU CUIVRE PAR LE BLE DUR ET LIEN AVEC LE REAPPROVISIONNEMENT DU CUIVRE

EN SOLUTION PAR LE SOL

I. Copper uptake kinetic in hydroponically-grown durum wheat as compared with soil’s ability to supply Cu .............................................................................................................. 100

I.1. Introduction.................................................................................................................. 101 I.2. Material and Methods .................................................................................................. 101 I.3. Results.......................................................................................................................... 104 I.4. Discussion .................................................................................................................... 108 I.5. Acknowledgements...................................................................................................... 112 I.6. Appendix...................................................................................................................... 112 I.7. Literature...................................................................................................................... 113

CHAPITRE 4 .......................................................................................................... 115 BIODISPONIBILITE DU CUIVRE POUR LE BLE DUR EN FONCTION DE L'APPORT DE MATIERES

ORGANIQUES ET DU PH DU SOL

I. Copper speciation and bioavailability as affected by rhizosphere processes and organic amendments in two copper-contaminated soils...................................................117

I.1. Introduction.................................................................................................................. 118 I.2. Material and Methods .................................................................................................. 119 I.3. Results.......................................................................................................................... 122 I.4. Discussion .................................................................................................................... 126 I.5. Conclusion ................................................................................................................... 128 I.6. Acknowledgements...................................................................................................... 128 I.7. Appendix...................................................................................................................... 129 I.8. Literature...................................................................................................................... 133

II. Rhizosphere alkalisation – a major driver of copper bioavailability over a wide range of pH in an acidic, copper-contaminated soil .................................................................... 135

II.1. Introduction ................................................................................................................ 136 II.2. Material and Methods................................................................................................. 137

Sommaire

3

II.3. Results ........................................................................................................................ 141 II.4. Discussion................................................................................................................... 144 II.5. Acknowledgements .................................................................................................... 149 II.6. Literature .................................................................................................................... 149

CHAPITRE 5 .......................................................................................................... 152 DISPONIBILITE DU CUIVRE DANS LA RHIZOSPHERE - ROLE MAJEUR DU PH ET DES MATIERES

ORGANIQUES DISSOUTES

I. Copper speciation and lability in durum wheat rhizosphere as affected by dissolved organic matter and root-induced alkalisation ................................................................... 154

I.1. Introduction.................................................................................................................. 155 I.2. Material and Methods .................................................................................................. 156 I.3. Results.......................................................................................................................... 160 I.4. Discussion .................................................................................................................... 165 I.5. Conclusion ................................................................................................................... 171 I.6. Acknowledgements...................................................................................................... 172 I.7. Literature...................................................................................................................... 172

II. Root-induced alkalisation of an acidic, copper-contaminated soil controls copper depletion in durum wheat rhizosphere............................................................................... 175

II.1. Introduction ................................................................................................................ 176 II.2. Material and Methods................................................................................................. 176 II.3. Results ........................................................................................................................ 180 II.4. Discussion................................................................................................................... 183 II.5. Acknowledgements .................................................................................................... 187 II.6. Supporting Information .............................................................................................. 187 II.7. Literature .................................................................................................................... 189

CONCLUSION GENERALE................................................................................... 191 VERS UNE VISION DYNAMIQUE T INTEGRATIVE DES PROCESSUS RHIZOSPHERIQUES IMPLIQUES

DANS LE TRANSFERT SOL-PLANTE DES METAUX

I. Biodisponibilité du cuivre pour le blé dur cultivé en sols à antécédent viticole.......... 191

II. Perspectives pour une meilleure compréhension du transfert sol-plante des métaux................................................................................................................................................ 194

II.1. Prise en compte des modifications chimiques dans la rhizosphère ............................ 195 II.2. Caractérisation fonctionnelle du prélèvement des métaux par les plantes ................. 196 II.3. Caractérisation du réapprovisionnement du métal libre en solution .......................... 197

III. Potentialités et limites du RHIZOtest comme outil opérationnel d’évaluation de la biodisponibilité des métaux pour les plantes ..................................................................... 200

ANNEXE................................................................................................................. 204 NOUVEAU CHAPITRE DE LA THESE®

Introduction Générale

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INTRODUCTION GENERALE Contamination en cuivre des sols à antécédent viticole

– Contexte et enjeux régionaux – Les activités anthropiques, i.e. activités industrielles et agricoles, peuvent être à l’origine d’une accumulation de métaux dans l’environnement et en particulier dans les sols, au-delà des concentrations naturellement observées. L’Union Européenne a recensé près de 3,5 millions de sites où les sols seraient potentiellement contaminés (CCE 2006). La contamination des sols par les métaux est une des principales menaces identifiées dans le cadre du projet de directive européenne sur la protection et la préservation des sols (Rat 2007). L’apport des métaux au sol se fait généralement soit par retombées atmosphériques, soit par l’application directe au sol, ou indirecte via la végétation, de matériaux (fertilisants, phytosanitaires, amendements organiques, boues de station d’épuration notamment,…) concentrés en métaux (Alloway 1995 ; Adriano 2001). La contamination des sols par les métaux peut avoir deux conséquences majeures. D’une part, elle peut favoriser la dispersion des métaux dans l’environnement vers les eaux de surface par érosion, vers les eaux souterraines et les nappes par lixiviation-lessivage et, enfin, par transferts dans la chaîne alimentaire par l’intermédiaire des animaux (vers de terre, escargots…) et plus encore des végétaux (Adriano 2001). D’autre part, la contamination des sols par les métaux peut affecter les différentes fonctions du sol, i.e. celles contribuant aux services écosystémiques, et en particulier sa fonction de production en zones agricoles. Parmi les contaminations dues aux activités agricoles, la contamination des sols viticoles ou à antécédent viticole par le cuivre (Cu) est une problématique particulièrement préoccupante à l’échelle mondiale. Alors que les sols non contaminés contiennent entre 5 et 30 mg Cu kg-1, les sols peuvent présenter en zones viticoles des concentrations jusqu’à 100 à 200 fois supérieures (Baker Senft 1995 ; Mirlean et al. 2007). Ce type de contamination diffuse affectant de larges surfaces est lié à l’utilisation en viticulture de fongicides à base de sels cupriques (type « bouillie bordelaise », CuSO4 + Ca(OH)2) pour protéger la vigne (Vitis vinifera L. ssp. vinifera) contre un champignon phytopathogène, le mildiou (Plasmopara viticola). Le pouvoir fongicide de Cu a été découvert à la fin du XIXème siècle. Les sels cupriques sont restés les seuls anti-mildious connus jusqu’à la fin de la seconde guerre mondiale, ce qui a entraîné une application massive de Cu sur les vignobles. Par la suite, des fongicides organiques de synthèse ont été découverts et ont partiellement remplacé Cu. Ces produits phytosanitaires de synthèse montrent cependant une efficacité et une persistance d’action moindre que Cu et induisent l’apparition de phénomène de résistance du champignon pathogène Plasmopara viticola, contrairement aux sels de Cu. Les fongicides cupriques sont donc à l’heure actuelle encore utilisés en viticulture. Il faut noter que ce sont les seuls anti-mildiou autorisés en agriculture biologique, qui représente cependant une faible part des surfaces dédiées à la viticulture (Rousseau 1995 ; Chaignon 2001). Leur utilisation est cependant réglementée au niveau européen et limitée à 6 kg Cu métal ha-1 an-1 (Constant 2006). Bien qu’aucune étude réellement exhaustive n’ait été menée sur la contamination en Cu des sols français, toutes les régions viticoles recensent de nombreux sols pour lesquels les concentrations en Cu sont supérieures au fond pédo-géochimique naturel (Baize et al. 2007). Malgré une pression du mildiou plus faible en climat méditerranéen, les concentrations en Cu dans les sols viticoles languedociens peuvent atteindre jusqu’à 400, voire 1000 mg Cu kg-1 (Brun et al. 1998 ; Chaignon 2001 ; Michaud et al. 2007). En Languedoc-Roussillon, le


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vignoble occupe environ 300 000 ha, soit 35 % des surfaces viticoles françaises (Autran 2001 ; Agreste 2006b). La crise économique, qui touche le vignoble languedocien depuis les années 70, a provoqué l’arrachage définitif de plus de 150 000 ha de vignes qui ont été remplacés par des cultures annuelles. Le blé dur (Triticum turgidum durum L.) occupe actuellement une surface d’environ 80 000 ha (50 % des surfaces dédiées aux cultures céréalières et d’oléoprotéagineux) en Languedoc-Roussilon et se pose donc comme la principale culture annuelle de la région (Autran 2001). Cette production est donc un maillon centrale de l’économie agricole régionale et représente au niveau national près de 20 % des surfaces cultivées en blé dur (Agreste 2006a). La question des conséquences de la contamination par Cu des sols à antécédent viticole sur les grandes cultures qui sont plantées après conversion, notamment la culture du blé dur est donc de première importance dans une région telle que le Languedoc-Roussillon. En tant qu’oligo-élement, le transfert de Cu dans les différents tissus végétaux est fortement régulé, en lien avec de multiples processus physiologiques participant à l’homéostasie de Cu dans la plante (Marschner 1995). La concentration en Cu dans les grains de blé est donc généralement inférieure au seuil réglementaire, même en situation de sols pollués (Botté et al. 2005), de sorte que le risque de contamination en Cu de la chaîne alimentaire, dont l’Homme est l’ultime maillon, est faible dans le cas de ce métal, contrairement à d’autres métaux tels que le cadmium (Sadhra et al. 2007). En revanche, Cu est un métal qui peut devenir toxique pour la plante, i.e. phytotoxique, à d’assez faibles niveaux de contamination. En Languedoc-Roussillon, l’apparition de symptômes de chlorose ferrique imputables à Cu est ainsi fréquement observée. Ces sypmtômes sont considérés comme l’une des causes majeures des faibles rendements du blé dur lorsqu’il est cultivé en sols à antécédent viticole (Braun et al. 2002). Il s’avère donc nécessaire de mieux comprendre les processus régulant le transfert sol-plante de Cu afin de pouvoir déterminer la biodisponibilité de Cu et son éventuelle phytotoxicité pour le blé dur cultivé en sol à antécédent viticole. De nombreuses études ont précédemment permis de comprendre les processus majeurs contrôlant le comportement de Cu dans le sol et ont tenté de relier ces processus au prélèvement de Cu par les plantes (Kabata-Pendias A 1992 ; Baker and Senft 1995). En parallèle, des travaux focalisés sur l’interface sol-racine ont montré que l’activité racinaire était capable de profondément modifier la physico-chimie du sol au voisinage des racines, i.e. dans la rhizosphère (Hinsinger 1998). Il apparaît donc pertinent, dans la continuité des travaux de Chaignon (2001) et Michaud (2007), de se concentrer sur l’identification des processus rhizosphériques majeurs impliqués dans le déterminisme de la biodisponibilité de Cu pour des plantes cultivées telles que le blé dur. A terme, ces recherches devront, d’une part, permettre d’identifier les sols ou types de sol favorables à l’apparition d’une phytotoxicité de Cu sur le blé dur et, d’autre part, déboucher sur des outils opérationnels permettant l’évaluation de la biodisponibilité des métaux pour les plantes, applicables par exemple dans le cadre de la future directive européenne sur les sols.


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Bibliographie Adriano D C 2001 Copper. In Trace elements in terrestrial environments, biogeochemistry, bioavailability, and

risks of metal, Ed D C Adriano. pp 499-546. Agreste 2006a Céréales - Oléagineux - Protéagineux, évolution 2005-2006. In Statistique agricole annuelle

définitive 2005, semi définitive 2006, Ed Agreste. Agreste 2006b Productions du vignoble, productions de vins, jus et moûts - évolution 2005-2006. In Statistique

agricole annuelle définitive 2005, semi définitive 2006, Ed Agreste. Alloway B J 1995 Heavy metals in soils. Blackie academic and professional, London. 368 p. Autran F 2001 Les prémices de la crise agricole. In L'année économique et sociale 2000 en Languedoc-

Roussillon, Ed INSEE. pp 59-63. Baize D, Saby N and Deslais W 2007 Teneurs en huits éléments traces (Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb, Se, Zn) dans les

sols agricoles en France - Résultats d'un collecte de données à l'échelon national. ADEME - Gis Sol - INRA. 86 p.

Baker D E and Senft J P 1995 Copper. In Heavy metals in soils, Ed B J Alloway. pp 179-205. Blackie A&P, London.

Botté B, Barrier-Guillot B, Gravoueille J-M and Raimbault J-M 2005 Blé, pois et pomme de terre: des teneurs rassurantes en éléments traces métalliques. Perspectives Agricoles 308, 24-26.

Braun P, Gilbert E and Mura V 2002 En région méditerranéenne: Diagnostic des accidents du blé dur. Perspectives Agricoles 285, 78-81.

Brun L A, Maillet J, Richarte J, Herrmann P and Rémy J-C 1998 Relationships between extractable copper, soil properties and copper uptake by wild plants in vineyard soils. Environmental Pollution 102, 151-161.

Chaignon V 2001 Biodisponibilité du cuivre dans la rhizosphère de différentes plantes cultivées - cas de sols viticoles contaminés par des fongicides. Université Aix-Marseille III, Montpellier. 183 p.

Constant N 2006 Réduction des doses de cuivre pour lutter contre le mildiou en viticulture biologique: synthèse des essais 2001-2005 du groupe de travail de l'ITAB. Alter Agri 80, 25-30.

CEE Commission des Communautés Européennes 2006 Communication de la comission au conseil, au parlement européen, au comité économique et social européen et au comité des régions - Stratégie thématique en faveur de la protection de sols, Bruxelles. 13 p.

Hinsinger P 1998 How do plants to acquire mineral nutrients? Chemical processes involved in the rhizosphere. Advances in Agronomy 64, 225-265.

Kabata-Pendias A P H 1992 Trace elements in soils and plants. CRC Press, London. 365 p. Marschner H 1995 Mineral nutrition of higher plants. Academic Press, London. 889 p. Michaud A M 2007 Interaction entre biodisponibilité, phytotoxicité du cuivre et nutrition en fer de graminées -

mécanismes physiologiques et rhizosphériques. In Science du sol. pp 191. Montpellier SupAgro, Montpellier.

Michaud A M, Bravin M N, Galleguillos M and Hinsinger P 2007 Copper uptake and phytotoxicity as assessed in situ for durum wheat (Triticum turgidum durum L.) cultivated in Cu-contaminated, former vineyard soils. Plant and Soil 298, 99-111.

Mirlean N, Roisenberg A and Chies J O 2007 Metal contamination of vineyard soils in wet subtropics (southern Brazil). Environmental Pollution 149, 10-17.

Rat D 2007 La stratégie thématique européenne pour la protection des sols: éléments d'histoire. La lettre du Gis-Sol 11, 1.

Rousseau J 1995 Utilisation du cuivre en agriculture biologique, impact sur l'environnement et perspectives de diminution des doses employées. pp 63. ITAB, Paris.

Sadhra S S, Wheatley A D and Cross H J 2007 Dietary exposure to copper in the European Union and its assessment for EU regulatory risk assessment. Science of the Total Environment 374, 223-234.

Chapitre 1. Synthèse Bibliographique

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CHAPITRE 1. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Biodisponibilité du cuivre à l’interface sol-plante

– Concepts, processus et outils d’évaluation – Dans le contexte de la contamination des sols par les métaux, ce travail de synthèse a pour but de résumer les connaissances actuelles concernant la biodisponibilité des métaux et en particulier du cuivre (Cu) pour les plantes. Bien que la contamination des parties aériennes par voie atmosphérique puisse significativement participer à l’exposition des plantes aux métaux (Kabata-Pendias et Pendias 1992 ; Alloway 1995), la présente synthèse restera focalisée sur l’exposition des plantes par l’intermédiaire de leur système racinaire et s’intéressera donc exclusivement aux interactions sol-racine. I. Concepts de disponibilité et de biodisponibilité des métaux dans les sols L’évaluation des conséquences de la contamination des sols par les métaux vis-à-vis des organismes vivants du sol et notamment des plantes nécessite le recours aux concepts de disponibilité et de biodisponibilité des métaux dans les sols. Ces concepts sont très couramment utilisés et parfois même confondus (Lebourg et al. 1998 ; Zhang et al. 2001 ; Geebelen et al. 2003). Récemment, le groupe de travail de l’ISO (Organisation Internationale de Standardisation) « ISO/TC 190 » a mené une réflexion permettant de clarifier et de rendre plus opérationnelle les concepts de disponibilité et de biodisponibilité des contaminants dans les sols (ISO 2006). Au sens large, le concept de biodisponibilité peut être subdivisé en trois composantes (Peijnenburg et al. 1997 ; ISO 2006) : la « disponibilité environnementale », la « biodisponibilité environnementale » et la « biodisponibilité toxicologique » (Figure 1). I.1. Disponibilité environnementale

Il est actuellement reconnu que la biodisponbilité des métaux pour les plantes est rarement reliée à la concentration totale en métaux dans les sols. La disponibilité environnementale, ci-après dénommée disponibilité, est donc généralement considérée comme une fraction du métal total du sol (Harmsen et al. 2005 ; Hough et al. 2005) (Figure 1). Juste (1988) a relié les concepts de disponibilité et de mobilité chimique des métaux qu’il a définie comme la capacité d’un métal à passer de compartiments du sol où il est fortement retenu vers ceux où il est moins énergiquement retenu, le compartiment ultime étant la solution du sol. Plus récemment, la norme portant sur le concept de biodisponibilité a définit la disponibilité comme « la fraction du contaminant potentiellement disponible pour des organismes et qui résulte de processus physico-chimiques de désorption » (ISO 2006). Ces définitions restent cependant très conceptuelles et limitent la notion de disponibilité à l’interaction entre la phase solide du sol et la solution. Allen (1993), Thornton (1999) et Peijnenburg et Jager (2003) ont proposé d’étudier la disponibilité des métaux par l’intermédiaire de leur « spéciation » dans les sols, i.e. les différentes formes chimiques sous lesquelles les métaux sont présents et interagissent avec les divers constituants du sol. Cette approche présente le double avantage, d’une part, de tenir compte explicitement de la spéciation des métaux dans la solution du sol et non plus seulement de la spéciation en phase solide et, d’autre part, de rendre opérationnelle l’évaluation de la disponibilité au travers de l’utilisation de différentes techniques de mesure de la spéciation des métaux (Ure et Davidson 1995 ; Young et al. 2006 ; Zhang et Young 2006). Dans le cadre des interactions sol-plante, la disponibilité des métaux pourrait donc être re-définie comme le niveau d’exposition des racines aux métaux qui dépendrait principalement de la spéciation des métaux dans le sol.


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Figure 1. Biodisponibilité des métaux pour les plantes à trois composantes: disponibilité environnementale, biodisponibilité environnementale et biodisponibilité toxicologique (CBR = Critical Body Residue). Mesures « chimiques » et « biologiques » permettant d’évaluer la biodisponibilité (D’après Lanno et al. 2004; ISO 2006). Cependant, la plupart des auteurs s’accorde sur le fait que les racines peuvent interagir avec le sol environnant et en modifier les propriétés physico-chimiques (concentration en solution des métaux, pH, concentration en molécules organiques… voir partie III), créant ainsi une zone de sol « bio-influencée » au contact de la racine, i.e. la rhizosphère1 (Peijnenburg et al. 1997 ; Harmsen et al. 2005 ; ISO 2006) (Figure 1). Au sein de la rhizosphère, la spéciation et donc la disponibilité des métaux peuvent être fortement modifiées en fonction de l’espèce végétale, du sol et du temps d’exposition (Peijnenburg et Jager 2003 ; Harmsen et al. 2005). I.2. Biodisponibilité environnementale

La biodisponibilité environnementale, également nommée biodisponibilité « externe » (Rensing et Maier, 2003), est généralement définie comme la fraction disponible d’un métal qui est prélevée par la plante par des processus physiologiques d’absorption (Thornton 1999 ; ISO 2006) (Figure 1). Cette définition convient à une approche conceptuelle de la biodisponibilité environnementale mais nécessite d’être rendue plus opérationnelle.

1 La rhizosphère est définie comme le volume de sol autour des racines vivantes qui est soumis à leurs activités (Hinsinger 1998)


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Harmsen et al. (2005) ont remarqué à juste titre que la biodisponibilité environnementale était dépendante du temps d’exposition des racines au sol contaminé mais également spécifique de l’organisme cible, i.e. de l’espèce végétale et même du génotype au sein d’une même espèce (Chaignon 2001 ; Michaud 2007), voire de l’écotype. Dans le cas des plantes exposées aux métaux dans les sols, une définition plus opérationnelle de la biodisponibilité peut donc être proposée : il s’agit du flux de métal vers la surface du système racinaire d’une plante cible pendant une durée d’exposition définie (Harsem et al. 2005). Dans la pratique, il est cependant difficile de mesurer un tel flux. Le flux moyen de métal doit donc être estimé à partir de l’accumulation de métal dans la plante pendant la durée de la phase d’exposition au sol contaminé (Harmsen et al. 2005 ; ISO 2006). Exprimée de cette façon, la biodisponibilité environnementale apparaît donc clairement comme un concept dynamique qui nécessitera d’intégrer les interactions sol-racine et leur impact sur la modification de la disponibilité dans la rhizosphère. I.3. Biodisponibilité toxicologique

La dernière composante du concept de biodisponibilité concerne l’accumulation dans la plante des métaux et l’induction d’effets toxiques éventuels, i.e. phytotoxicité (ISO 2006) (Figure 1). Il s’agit de la biodisponibilité toxicologique ou « interne » (Rensing et Maier, 2003). Les effets toxiques interviennent à partir d’un certain seuil d’accumulation du métal dans l’organisme, i.e. la charge critique du corps en résidu (Critical Body Residue) (Figure 2).

Figure 2. Mesures de la disponibilité environnementale (1) à l’aide d’essais chimiques et des biodisponibilités environnementale (2) et toxicologique (3) à l’aide d’essais biologiques. En dessous d’une concentration A en métal total dans le sol, le métal est détectable chimiquement mais non détectable biologiquement. A partir d’une concentration A, la biodisponibilité environnementale devient mesurable. A partir d’un certain niveau d’accumulation du métal dans l’organisme (CBR = Critical Body Residue), un effet du métal sur l’organisme (biodisponibilité toxicologique) devient mesurable. Entre les concentrations A et B, la mesure de disponibilité environnementale est corrélée à celles de biodisponibilités environnementale et toxicologique. Au-delà d’une concentration B, il n’y a plus de corrélation entre disponibilité et biodisponibilités du métal (Adapté d’après Alexander et al. 2003; ISO 2006). Chez la plante, la phytotoxicité peut s’exprimer au niveau racinaire (rhizotoxicité) et/ou au niveau des parties aériennes (ISO 1993, 1995) et se caractérise par des réponses moléculaire, métabolique et/ou à différents niveaux d’organisation de la plante entière (ISO 2006) (voir partie IV). Les Figures 1 et 2 suggèrent qu’un métal ne peut être biodisponible d’un point de vue toxicologique que s’il est auparavant biodisponible d’un point de vue environnemental. Dans le cas des métaux et de Cu en particulier, une fraction importante est généralement adsorbée (et non encore absorbée) au niveau de l’apoplasme racinaire (Iwasaki et al. 1990).


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Nous verrons dans la partie IV de ce chapitre que cette fraction peut induire des phénomènes de rhizotoxicité (Koppitke et al. 2007). Les métaux adsorbés dans l’apoplasme racinaire devraient donc être considérés comme biodisponibles d’un point de vue environnemental. Il est donc préférable de considérer la biodisponibilité environnementale comme le flux de métal vers la racine et non pas uniquement comme la fraction absorbée. Les réflexions menées sur le concept de biodisponibilité ont conduit certains auteurs à conclure qu’il n’est pas possible de définir une biodisponibilité, au sens générique, mais qu’il faudrait plutôt définir et mesurer des biodisponibilités spécifiques pour chaque organisme cible (Harsem et al. 2005). Nous verrons l’intérêt de cette vision de la biodisponibilité des métaux dans le cas des plantes (parties III et IV) ainsi que les conséquences pour la mise au point d’outils permettant d’évaluer la biodisponibilité des métaux pour les plantes (partie V).


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II. Disponibilité environnementale du cuivre dans les sols Dans le cadre de l’étude des interactions sol-plante, la disponibilité des métaux dans le sol a été définie comme l’exposition des racines aux métaux. La disponibilité peut être caractérisée au travers de l’étude de la spéciation des métaux et des facteurs édaphiques qui la contrôlent. Il est important de noter que l’effet des modifications du potentiel d’oxydo-réduction sur la disponibilité de Cu ne sera pas aborder dans cette synthèse. Nous nous intéresserons exclusivement aux sols en conditions oxydantes dans lesquels la réduction de Cu(II) en Cu(I) peut être négligée (Lindsay 1979). II.1. Niveau de contamination en cuivre des sols, cas particulier des sols viticoles

II.1.1. Sources et niveau de contamination en cuivre des sols Bien que la fraction disponible des métaux soit généralement très inférieure à la concentration totale dans le sol, cette dernière reste le premier indicateur de la contamination des sols par les métaux. Le cuivre est un élément ubiquiste sur Terre, présent dans le fond pédo-géochimique à des concentrations généralement comprises entre 15 et 30 mg Cu kg-1 sol (Baker et Senft 1995 ; Kabata-Pendias et Pendias 1992 ; Adriano 2001). En France, les travaux de Baize (1997, cité par Cetois et al. 2003) ont montré sur 557 sols français choisis en évitant les sols viticoles que 90% des teneurs en Cu étaient comprises entre 5 et 28 mg Cu kg-1 sol, avec une valeur médiane de 14 mg Cu kg-1 sol. Les activités anthropiques peuvent entraîner ponctuellement un enrichissement des sols en Cu jusqu’à des concentrations près de 150 fois supérieures au fond pédo-géochimique (Vulkan et al. 2000). Les activités industrielles sont généralement à l’origine des niveaux de contamination les plus élevés mais qui restent en principe localisée, i.e. dans des situations de pollution « concentrée ». Des concentrations de 1000 à 8700 mg Cu kg-1 ont été couramment rapportées dans des sols situés à proximité de sites d’exploitation minière et d’industries métallurgiques (Kabata-Pendias et Pendias 1992 ; Vulkan et al. 2000). Des niveaux de contamination plus faibles mais s’étendant sur plusieurs dizaines de kilomètres, i.e. dans des situations de pollution « diffuse », ont également été répertoriés en périphérie des sites de fonderies (Adriano 2001 ; Legrand et al. 2005). Les activités agricoles sont également à l’origine de la contamination en Cu des sols, principalement de façon diffuse. L’apport d’amendements organiques (boues de station d’épuration, fumiers et lisiers de porc en particulier) peuvent engendrer un accroissement des concentrations en Cu dans les sols jusqu’à des valeurs de l’ordre de 600 mg kg-1 (Baker et Senft 1995 ; Adriano 2001). Cependant, la source de contamination diffuse des sols agricoles la plus répandue est liée à l’application de fongicides à base de Cu sur les cultures, principalement en viticulture et en arboriculture (Loué 1993). II.1.2. Contamination en cuivre des sols viticoles La plupart des pays producteurs de vins sont touchés par la contamination en Cu des sols viticoles et arboricoles, avec des concentrations maximales rapportées pouvant atteindre : Allemagne 1280 mg kg-1, Australie 250 mg kg-1, Brésil 3200 mg kg-1, Chine 210 mg kg-1, Espagne 550 mg kg-1, France 845 mg kg-1, Italie 545 mg kg-1 et Etats-Unis 280 mg kg-1 (Delas 1963 ; Pietrzak et McPhail 2004 ; Arias et al. 2005 ; Li et al. 2005 ; Mirlean et al. 2007). De même, des niveaux de contamination plus de 10 fois supérieurs au fond pédo-géochimique ont été rapportés dans la majorité des régions viticoles françaises (Figure 3) (Baize et al. 2007) : Alsace 400 mg kg-1, Bourgogne 330 mg kg-1, Bordeaux 845 mg kg-1, languedoc-Roussillon 400 mg kg-1, Vallée de la Loire 280 mg kg-1, Champagne 520 mg kg-1 et Vallée du Rhône 320 mg kg-1 (Delas 1963 ; Flores-Vélez et al. 1996 ; Besnard et al. 2001 ; Parat et al. 2002 ; Chaignon et al. 2003). Le niveau de contamination des sols viticoles semble


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dépendre de l’ancienneté de l’activité viticole et de l’humidité du climat (Brun et al. 1998 ; Adriano 2001). Au Brésil, en climat subtropical humide (≈ 2000 mm précipitations an-1), Mirlean et al. (2007) ont ainsi mesuré des concentrations de l’ordre de 3000 mg Cu kg-1 dans les dix premiers centimètres d’un sol utilisé pour la viticulture depuis un siècle.

Figure 3. Nombre d’analyses de sol par département présentant des concentrations totales en cuivre supérieures à la limite réglementaire pour l’épandage de boues de stations d’épuration (Cu > 100 mg kg-1). Les résultats ont été obtenus lors d’une collecte nationale (n = 11 118 échantillons pour les analyses de Cu) sur des échantillons issus de l’horizon de surface de sols agricoles (D’après Baize et al. 2007). A l’inverse de la distribution homogène de Cu dans les profils de sols non ou faiblement contaminés (Figure 4.a), Cu se localise principalement en surface dans les sols contaminés (Figure 4.c) du fait de sa forte affinité pour la phase solide du sol (Delas 1963 ; Flores-Vélez 1996 ; Besnard et al. 2001). Cependant, les labours et autres travaux du sol profonds parfois pratiqués lors de l’arrachage ou avant replantation de la vigne ainsi que les phénomènes de lixiviation-lessivage dans certains sols sableux exposés à de fortes précipitations semblent pouvoir engendrer une redistribution et une accumulation de Cu dans les horizons plus profonds (Figure 4.b) (Brun et al. 1998 ; Mirlean et al. 2007). La distribution horizontale de Cu dans l’horizon de surface des sols viticoles contaminés est également affectée. Pietrzak et McPhail (2004) et Mirlean et al. (2007) ont noté une accumulation jusqu’à 2,8 fois supérieure dans le sol de surface situé dans le rang de plantation par rapport à l’inter-rang.


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Figure 4. Profils de cuivre total en fonction de la profondeur dans trois sols viticoles: non contaminé (a) et contaminés ayant subi (b) ou non (c) un charruage (D’après Brun et al. 1998). II.2. Spéciation du cuivre : une vision à l’équilibre du système sol

La spéciation des métaux dans le sol peut être définie au sens large comme la distribution quantitative sous différentes formes chimiques sous lesquelles se trouvent les métaux, en association à la phase solide ou en solution (Ure and Davidson 1995). La spéciation des métaux dans les sols a principalement été étudiée au travers de l’affinité des métaux pour les différentes phases porteuses du sol, caractérisée par des constantes thermodynamiques de stabilité (KM). Cette approche de la spéciation impose cependant que les phénomènes se déroulent à l’équilibre thermodynamique.

Figure 5. Spéciation du cuivre dans le sol. Le cuivre libre en solution (Cu2+) peut se complexer avec des ligands inorganiques (Linorg) et organiques (Lorg) et également interagir avec les différents constituants de la phase solide par des phénomènes d’adsorption ou de précipitation. II.2.1. Spéciation en phase solide et partitionnement solide-solution L’ensemble des métaux et en particulier Cu présentent une très forte affinité pour la phase solide du sol avec laquelle ils s’associent par des phénomènes d’adsorption, de précipitation et de co-précipitation (McBride 1989 ; Harter et Naidu 1995 ; Carrillo-González et al. 2006). La concentration résultante de Cu dans la solution de sols non contaminés et de pH neutre est donc particulièrement faible, comprise entre 0.01 et 1 nM (Amery et al. 2007). Cependant, dans les sols contaminés et acides, la concentration de Cu en solution peut atteindre 26 µM, voire 270 µM dans les cas de contaminations extrêmes (8500 mg Cu kg-1) (Sauvé et al. 1997 ; Vulkan et al. 2000). Différents constituants du sol sont impliqués dans la rétention des


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métaux : les argiles (minéralogiques), les oxyhydroxydes2 de fer (Fe), d’aluminium (Al) et de manganèse (Mn), les matières organiques du sol (MOS) et les carbonates (Figure 5) (McBride 1989 ; Carrillo-González et al. 2006). Le cuivre montre des degrés d’affinité variables pour chacun de ces constituants (Figure 6) (McLaren et Crawford 1973). L’adsorption de Cu sur les minéraux argileux s’effectue principalement de manière non spécifique, i.e. par la formation de complexes en sphère externe impliquant des liaisons électrostatiques de basse énergie (McBride 1989). La fraction de Cu associée aux argiles reste généralement assez facilement remobilisable par échange d’ions, avec le calcium (Ca) par exemple qui est le cation majoritaire en solution dans la plupart des sols. Comparativement aux argiles, les métaux présentent une affinité plus importante pour les oxyhydroxydes de Fe, Al et Mn sur lesquels ils sont retenus principalement par des phénomènes d’adsorption spécifique, i.e. par la formation de complexes en sphère interne impliquant la formation de liaisons covalentes et/ou de coordination de plus forte énergie (McBride 1989). Parmi les métaux, Cu présente une affinité particulièrement forte pour les oxyhydroxydes comme le montrent ces séries d’affinités (Kinniburgh et al. 1976 ; McKenzie 1980) : Oxyhydroxydes Fe amorphes Pb2+ > Cu2+ > Zn2+ > Ni2+ > Cd2+ > Mg2+ Oxyhydroxydes Al Cu2+ > Pb2+ > Zn2+ > Ni2+ > Cd2+ > Mg2+ Oxyhydroxydes Mn Pb2+ > Cu2+ > Mn2+ > Zn2+ > Ni2+

Figure 6. Rétention du cuivre par les différents constituants du sol (oxydes Mn et Fe de synthèse, matières organiques extraites d’une tourbe, montmorillonite saturée avec Ca) et un sol (Argile = 235 mg kg-1, Corg = 29 mg kg-1) en fonction du pH (D’après McLaren et Crawford 1973). L’affinité des métaux est particulièrement forte pour les oxyhydroxydes de Mn (birnessite) qui sont capables d’adsorber des quantités de métal 100 fois supérieures à celles adsorbées par des oxyhydroxydes de Fe tels que l’hématite et la goethite (McKenzie 1980). Les métaux présentent également une affinité très forte pour les MOS, sur lesquelles ils s’adsorbent spécifiquement en coordination avec des groupements carboxyles, phénols (– O), amines (– N) et sulfhydryles (– S) (McBride 1989). Dans le cas de Cu, la préférence va aux groupements sulfhydryles, puis amines et enfin de types – O. Cependant, l’adsorption sur les différents groupements fonctionnels des MOS est également dépendante de leur quantité respective et donc généralement en faveur des groupements carboxylique et phénolique. Schnitzer et Skinner (1966, 1967) ont défini la série d’affinités des métaux divalents vis à vis des MOS (pH = 5) comme suit : Cu2+ > Ni2+ > Pb2+ > Ca2+ > Zn2+ > Mn2+ > Mg2+

2 Le terme « oxyhydroxides » est ici utilisé comme un terme générique pour recouvrir à la fois les oxydes, hydroxydes et oxyhydroxydes (stricto sensu), ainsi que proposé par Cornell et Schwertmann (2003).


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Cependant, cette série d’affinités n’est donnée qu’à titre indicatif car les affinités des métaux pour les MOS varient fortement en fonction de la nature des MOS, du pH auquel sont mesurées ces affinités ainsi que des méthodes de mesure utilisées (McBride 1989). L’affinité importante de Cu pour les MOS a également été démontrée in situ. Besnard et al. (2001) ont observé en pratiquant la technique de fractionnement granulo-densitométrique sur des sols viticoles calcaires contenant de 250 à 525 mg Cu kg-1 que les matières organiques particulaires du sol (50-2000 µm) pouvaient présenter des concentrations en Cu de l’ordre de 2500 mg kg-1, très nettement supérieures aux concentrations mesurées dans les fractions minérales (< 250 mg Cu kg-1). Lorsque la rétention de Cu est étudiée directement sur des échantillons de sol et non des constituants isolés, l’affinité de Cu pour la phase solide présente un comportement intermédiaire aux divers constituants se rapprochant de l’affinité de Cu pour les oxyhydroxydes de Fe et les MOS (Figure 6). Cette observation a été attribuée aux quantités respectives des différents constituants du sol, principalement dominés par les oxyhydroxydes de Fe et les MOS (McLaren et Crawford 1973), ainsi qu’à leur réactivité. Le partitionnement entre phase solide et solution des métaux dans le sol peut également être contrôlé par les phénomènes de précipitation. Dans le cas de Cu, la précipitation sous forme de carbonates (CuCO3) ou d’oxyhydroxydes (Cu(OH)2) ne semble pouvoir significativement contrôler sa solubilité que dans les cas de contaminations extrêmes du sol (> 10 000 mg Cu kg-1) et/ou lorsque le pH est élevé, en sols calcaires notamment, y compris lorsque la pression partielle en CO2 prise en compte dans le sol est supérieure à celle de l’atmosphère ambiante (McBride et Blasiak 1979 ; McBride 1989 ; Carrillo-González et al. 2006). Toutefois, Ma et al. (2006) ont suggéré que la précipitation de Cu sous forme de malachite (Cu2(OH)2CO3) et d’oxyhydroxydes (Cu(OH)2) était le facteur prépondérant de la chute de Cu isotopiquement échangeable dans une large gamme de sols européens présentant un pH > 6. McBride (1989) a également souligné la possible confusion entre l’adsorption et la co-précipitation des métaux en tant qu’impuretés à la surface des oxyhydroxydes de Fe, Al et Mn. Cet auteur précise cependant que la majorité de Cu co-précipité reste accessible pour réagir avec d’autres ligands potentiels en phase solide et en solution. La rétention de Cu par la phase solide du sol étant principalement lié à la réactivité des oxyhydroxydes et des MOS, elle est donc fortement dépendante du pH (Figure 6) (McLaren et Crawford 1973). En effet, lorsque le pH du sol augmente, la charge nette de surface des phases adsorbantes devient de moins en moins positive (oxyhydroxydes Fe et Al) ou de plus en plus négative (oxyhydroxydes Mn et MOS), ce qui accroît leur affinité pour les cations métalliques (Alloway 1995). Le pH du sol apparaît d’ailleurs comme le principal facteur contrôlant le partitionnement solide-solution (Kd) des métaux, bien que dans le cas de Cu, le pH ne parvienne à expliquer que 29 % de la variabilité du Kd (Figure 7) (Sauvé et al. 2000 ; Carrillo-González et al. 2006). Combinant 350 données expérimentales, Sauvé et al. (2000) ont montré que 42 % de la variabilité du Kd pour Cu pouvaient être décrits en déterminant uniquement le pH du sol et la concentration en MOS. La concentration totale en Cu dans la solution du sol semble largement dépendre de la concentration totale en Cu dans le sol. Dans une première étude sur un lot de 66 échantillons de sol provenant d’Amérique du Nord et d’Europe du Nord, Sauvé et al. (1997) ont montré que Cu en solution pouvait être raisonnablement bien prédit (R2 = 0,90*** ) à partir d’une régression linéaire tenant simplement compte du niveau total de contamination.


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Sur un lot plus complet d’échantillons, Sauvé et al. (2000) ont relié Cu en solution au pH, au niveau de contamination et à la concentration en MOS à l’aide de la régression linéaire multiple suivante : log10(CuSolution) = -0,21 pH + 0,93 log10(CuTotal) - 0,21 log10(MOS) + 1,4 R2 = 0,61*** n = 353 (1)

Figure 7. Coefficient de partitionnement solide-solution (Kd) du cadmium (Cd), du cuivre (Cu), du nickel (Ni), du plomb (Pb) et du zinc (Zn) dans les sols en fonction du pH (D’après Sauvé et al. 2000). Les lignes représentent la droite de régression et l’intervalle de confiance à 95 %. L’élévation du niveau de contamination d’un sol semble, au-delà de l’augmentation de Cu en solution, pouvoir également modifier l’effet du pH sur la concentration de Cu en solution (Figure 8). Jeffery et Uren (1983) ont ainsi montré que dans un sol non contaminé Cu en solution ne présentait pas de dépendance claire vis-à-vis du pH et que les concentrations de Cu en solution les plus importantes étaient observées aux pH les plus élevés (Figure 8.a), en accord avec d’autres études menées sur des sols non contaminés (Tyler et Olsson 2001 ; Impellitteri et al. 2002). En revanche, lorsque le même sol était amendé avec 100 mg Cu kg-1, la concentration de Cu en solution devenait maximale aux pH les plus faibles (Figure 8.b). Les métaux présentent également une forte affinité pour les matières organiques dissoutes (MOD) avec lesquelles ils sont complexés par la mise en jeu de liaisons électrostatiques ou covalentes, en fonction de la nature des sites réactifs (groupements sulfhydryles, amines, carboxyliques et phénoliques) et de la concentration en métaux dans la solution du sol (McBride et Blasiak 1979 ; Carrillo-González et al. 2006). Les MOD, comme les MOS d’ailleurs, sont capables de former des chélates avec les métaux, i.e. de se complexer à un atome métallique par l’intermédiaire de plusieurs liaisons covalentes (McBride 1989). Parmi


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les différents métaux divalents, Cu présentent les plus fortes constantes de stabilité vis-à-vis des MOD comme les acides humiques ou divers anions organiques (Figure 9) (Bloom 1978).

Figure 8. Concentration total en cuivre dans la solution d’un sol non contaminé (a) et amendé avec 100 mg Cu kg-1 (b) en fonction du pH (D’après Jeffery et Uren 1983). Les MOD se composent d’un mélange de molécules de nature et de réactivité variées qui regroupent, d’une part, des substances dites « non humiques » principalement représentées par des carbohydrates, des acides aminés, des peptides ou protéines, des lipides et diverses anions organiques et, d’autre part, des substances humiques représentées par les acides fulviques et humiques (Sposito 1989 ; Stevenson 1994). La concentration des MOD dans la solution du sol, déterminée à partir de la concentration en carbone organique dissous (COD), peut varier d’environ 10 à 1000 mg C dm-3 (Malcolm 1993). Les MOD se comportent comme les MOS, puisque leur charge nette de surface devient de plus en plus négative quand le pH de la solution du sol augmente. La solubilité des MOD est ainsi généralement considérée comme principalement dépendante du pH et tend à augmenter avec le pH lorsque celui-ci devient supérieur à pH 4-6 (Figure 10) (Lofts et al. 2001 ; Tyler et Olsson 2001).

Figure 9. Affinité des métaux divalents pour la complexation avec un acide humique, l’acide acétique et l’acide citrique relativement à l’affinité du calcium pour ces mêmes ligands (D’après Bloom 1978). Cependant, Temminghoff et al. (1998) et Oste et al. (2002) ont montré que la concentration totale ou libre en calcium (Ca) dans la solution du sol était le principal facteur déterminant de la solubilité des MOD, ce qui a été attribué à l’effet coagulant de Ca (Brigante et al. 2007). La concentration et la réactivité élevées des MOD aux pH élevés, associées à l’affinité


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particulièrement forte des MOD vis-à-vis de Cu, permettent d’expliquer la stabilité, voire l’augmentation de la concentration en Cu dans la solution du sol et l’allure en forme de U de la courbe en fonction du pH (Figures 8 et 11) (McBride et Blasiak 1979 ; Carrillo-González et al. 2006). Réciproquement, les MOD sont également capables de diminuer la concentration en Cu dans la solution du sol aux pH les plus faibles. Pour pH < 5-5,5, la rétention des métaux sur la phase solide du sol peut devenir significative du fait de l’adsorption des MOD sur les surfaces minérales (McBride 1989 ; Harter et Naidu 1995).

Figure 10. Evolution de la concentration en carbone organique dissous (COD) en fonction du pH de la solution du sol. Les mesures ont été faites sur un seul sol de pH initial 5.2 et chaulé avec 20 ajouts différents de CaCO3 (D’après Tyler et Olsson 2001). L’adsorption des MOD, et notamment des substances humiques, sur les oxyhydroxydes dépend fortement de la concentration en MOD et tend à diminuer à un pH donné lorsque la concentration en MOD augmente (Filius et al. 2000). Dans le cas de Cu, la fraction adsorbée sur la goethite augmente fortement en présence d’oxalate à pH 4.5 tant que le ratio oxalate/Cu reste inférieur à 2 environ (Violante et al. 2005). Le rapport métal/ligand apparaît donc comme déterminant pour l’adsorption des métaux sur les surfaces minérales par l’intermédiaire des MOS, l’adsorption des métaux tendant à diminuer en présence d’un large excès de MOD (McBride 1989).

Figure 11. Concentration total en cuivre et activité du cuivre libre dans la solution d’un sol amendé avec 40 mg Cu kg-1 en fonction du pH (D’après McBride et Blasiak 1979).


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II.2.2. Spéciation en solution Les plantes prélèvent les éléments minéraux dans la solution du sol (voir partie III). Dans cette dernière, les métaux se présentent sous diverses formes chimiques : sous forme d’aquacomplexe ou métal libre (Cu(H2O)6 ou Cu2+) et de complexes inorganiques (CuSO4 par exemple) ou organiques (Cu-MOD) (Figure 5) (Ure et Davidson 1995). Le cuivre s’associe aux ligands inorganiques principalement par des complexes en sphère externe facilement dissociables alors que Cu s’associe aux MOD principalement par des complexes en sphère interne plus stables (Carrillo-González et al. 2006). Etant donné l’affinité de Cu pour les MOD, les complexes organiques dominent généralement la spéciation de Cu dans la solution du sol (Sauvé et al. 1997 ; Ma et al. 2006). Peu d’auteurs ont étudié le rôle des complexes inorganiques dans la spéciation de Cu et il est généralement considéré que l’ion libre Cu2+ est l’espèce majoritaire de Cu après les formes organiques pour pH < 7 (Lindsay 1979 ; McBride 1989). Dans les sols de pH > 7, les équilibres chimiques suggèrent que le complexe Cu(OH)2 pourrait devenir la forme inorganique de Cu majoritaire dans la solution du sol (Lindsay 1979). L’activité de Cu2+ libre en solution est très largement contrôlée par le pH, auquel elle est linéairement reliée (Figure 11) (McBride et Blasiak 1979 ; Cavallaro et McBride 1980 ; Sauvé et al. 1997 ; Salam et Helmke 1998 Ma et al. 2006). La pente de la relation pCu2+ – pH est comprise entre 0,6 et 2 mais reste généralement inférieure à 2, ce qui renforce l’idée que l’activité de Cu2+ en solution est principalement contrôlée par des phénomènes d’adsorption et de complexation et non pas par des phénomènes de précipitation comme cela est le cas pour Fe3+ et Mn2+ (Lindsay 1979 ; McBride 1989 ; Ma et al. 2006). La concentration totale en Cu des sols influence également l’activité de Cu2+ en solution (Sauvé et al. 1997 ; Vulkan et al. 2000). Sauvé et al. (1997) a d’ailleurs proposé une régression linéaire multiple basée sur 66 données expérimentales, permettant la prédiction de l’activité de Cu2+ dans la solution du sol à partir du pH et du niveau de contamination des sols :

pCu2+ = -1,7 log10(CuTotal) +1,40 pH +3,4 R2 = 0,85*** n = 66 (2)

Figure 12. Concentration en cuivre libre en fonction du pH dans deux solutions de sol présentant des concentrations en carbone organique dissous (COD) différentes (D’après Salam et Helmke 1998). Enfin, les MOD peuvent influencer l’activité de Cu2+ en fonction du pH de la solution du sol (Salam et Helmke 1998). Aux faibles valeurs de pH (pH < 5-5,5), l’augmentation de la concentration en MOD tend à augmenter l’activité de Cu2+ en solution du fait de l’accroissement de la compétition entre les protons et Cu2+ pour les sites de complexation portés par les MOD (Figure 12). A l’inverse, lorsque le pH dépasse le seuil pH 5-5,5, les MOD présentent une charge nette de surface de plus en plus négative qui favorise la


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complexation de Cu2+ libre et, par conséquent, la diminution de son activité en solution lorsque que la concentration en MOD augmente (Figure 12). La résultante des différentes interactions entre Cu et les divers constituants du sol impliqués dans sa rétention induit une activité de Cu2+ libre dans la solution du sol généralement comprise entre 1 pM dans les sols neutres non contaminés et 1 à 10 µM dans les sol acides contaminés, avec des valeurs pouvant atteindre 100 µM dans les cas de contamination extrême (8500 mg Cu kg-1) (Sauvé et al. 1997 ; Vulkan et al. 2000). II.2.3. Modélisation de la spéciation Etant donné l’accumulation de connaissances sur le partitionnement solide-solution et la spéciation des métaux dans les sols, de nombreuses études se concentrent à l’heure actuelle sur la modélisation des équilibres chimiques qui contrôlent la spéciation des métaux à la fois en phase solide et dans la solution du sol. Dans le cas des métaux et en particulier de Cu, la réactivité des MOD a été très étudiée, notamment dans le but de prédire l’activité du métal libre en solution (Lumsdon et Evans 1993). De façon générale, les modèles de spéciation sont basés, soit sur des molécules organiques dont la structure et la réactivité sont relativement bien connues (principalement les anions organiques), soit sur l’idée que la spéciation en solution des métaux est principalement contrôlée par des molécules dont la structure est trop complexe pour être définie précisément (e.g. substances humiques) et dont l’hétérogénéité est alors considérée au travers d’une densité de sites réactifs portés par ces MOD (Dudal et Gérard 2004). Etant donné la difficulté de connaître systématiquement la composition précise des MOD (Dudal et Gérard 2004) et l’importance quantitative et qualitative des substances humiques dans la réactivité des MOD (Benedetti et al. 1996), l’approche basée sur la distribution de sites réactifs au niveau des substances humiques est actuellement privilégiée. Deux modèles semi-mécanistiques ont été développés et ont montré leur capacité à décrire raisonnablement bien l’interaction entre les substances humiques et les métaux (Dudal et Gérard 2004 ; Merdy et al. 2006) : NICA-Donnan (NICA pour Non-Ideal Competitive Adsorption) (Benedetti et al. 1995, 1996 ; Kinniburgh et al. 1996, 1999) et model VI inclu dans WHAM (Windermere Humic Aqueous Model) (Tipping 1994, 1998). Ces deux modèles considèrent que la réactivité des acides fulvique et humique est majoritairement déterminée par celle des groupements carboxyliques et phénoliques qu’ils portent (Kinniburgh et al. 1999). Les deux modèles décrivent de façon équivalente la réactivité des acides fulvique et humique en tenant compte de l’hétérogénéité des sites réactifs, de la stoechiométrie des associations métal/ligand (monodentate, bidentate et tridentate), de la compétition entre les protons et les métaux pour l’adsorption spécifique sur les sites réactifs et, enfin, des effets électrostatiques dus à la force ionique de la solution (Tipping 1998 ; Kinniburgh et al. 1999). La principale différence entre les deux modèles est liée à la prise en compte de l’hétérogénéité des sites réactifs dont la distribution est décrite de façon continue (NICA-Donnan) ou discrète (WHAM) (Weng et al. 2002). En dépit des nombreuses hypothèses inhérentes à ces deux modèles, ils ont été utilisés avec succès (erreur inférieure à 0,5 unité pCu2+ pour la majorité des mesures) pour estimer l’activité de Cu2+ dans la solution de sols d’origine géographique variée couvrant une large gamme de pH (3,7-7,9) et de niveau de contamination (6-8645 mg Cu kg-1), en comparaison avec la mesure de l’activité de Cu2+ obtenue avec différentes techniques (électrode sélective et Donnan membrane technique) (Vulkan et al. 2000 ; Weng et al. 2001, 2002). Pour obtenir une représentation fidèle des mesures, les modèles ont été calibrés en ajustant le pourcentage de sites effectivement réactifs. Les meilleures calibrations ont été obtenues en considérant que l’ensemble des MOD réagissait comme un acide fulvique dont 65 à 69 % des sites étaient effectivement réactifs, le reste étant considéré comme inerte (Figure 13) (Vulkan et al. 2000 ; Weng et al. 2002). Malgré la bonne adéquation entre activité mesurée et modélisée, Weng et al. (2002) ont montré que le


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pourcentage de Cu en solution sous forme libre restait encore difficilement prédictible avec une erreur moyenne de l’ordre de 15 à 20 %. Cloutier-Hurteau et al. (2007) ont pour leur part montré que WHAM (version 6) sous-estimait l’activité de Cu2+, mesurée dans des solutions de sols rhizosphérique et non rhizosphérique forestiers, de 1 unité pCu2+ en moyenne même après optimisation du pourcentage de MOD inertes. Ce dernier résultat souligne donc la difficulté de déterminer des propriétés génériques de complexation des métaux par les MOD et invite à prolonger l’évaluation de la performance de ces modèles par la confrontation des résultats de simulations numériques à ceux issus de mesures.

Figure 13. Activité du cuivre libre modélisée en fonction de l’activité mesurée avec une électrode sélective. La modélisation a été effectuée avec WHAM VI en considérant que la réactivité des matières organiques dissoutes était égale à celle d’un acide fulvique dont 69 % des sites étaient réactifs (D’après Vulkan et al. 2000). Les codes numériques ont également été utilisés pour estimer la concentration totale en Cu et l’activité de Cu2+ dans la solution en tenant compte des différents constituants du sol. Weng et al. (2001, 2002) ont utilisé le code de calcul ECOSAT (Equilibrium Calculation Of Speciation And Transport) en intégrant NICA-Donnan pour l’adsorption sur les MOD et les MOS, les constantes de stabilité de complexation avec les ligands inorganiques en solution, un modèle de Donnan pour l’échange non spécifique des ions sur les argiles, la constante de solubilité de la gibbsite pour la solubilité de Al, un modèle de complexation en double couche diffuse à deux sites pour l’adsorption sur les oxyhydroxydes amorphes de Fe et le modèle CD-MUSIC (Charge Distribution MUlti-SIte Complexation) pour l’adsorption sur les oxyhydroxydes cristallisés de Fe. Ce formalisme a permis d’estimer la concentration totale en Cu ainsi que l’activité de Cu2+ avec une erreur généralement inférieure à 0,5 unité pCu pour des variations de concentration ou d’activité de plus de trois ordres de grandeur (Weng et al. 2001, 2002). La distribution de Cu entre les différentes phases solides du sol a également pu être étudiée et s’est montrée très largement dépendante de la réactivité des MOS, avec plus de 97 % de Cu adsorbé de manière spécifique sur les MOS. II.3. Spéciation dynamique du cuivre : vers une vision cinétique du système sol

Par définition, l’évaluation de la spéciation des métaux par l’étude des équilibres chimiques ne permet pas de tenir compte des contraintes cinétiques qui peuvent pourtant intervenir de façon importante dans le contrôle des phénomènes chimiques aux interfaces, e.g. dans la rhizosphère (voir partie III) (Sparks 2001 ; Carrillo-González et al. 2006).


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D’un point de vue opérationnel, la réaction de complexation entre le métal libre, Mn+, et un constituant du sol en solution ou en phase solide, S, peut-être représentée de la manière suivante : Mn+ + Sm– MSn – m (3) avec: KM = ka / kd (4) KM, étant la constante de stabilité thermodynamique de la réaction de complexation définie à l’équilibre, ka et kd, les constantes cinétiques d’association et de dissociation du complexe MS. La prise en compte des phénomènes cinétiques nécessite donc de caractériser la labilité du (ou des) complexe(s) impliqué(s) dans le contrôle de l’activité du métal libre en solution. Ce concept de labilité est emprunté à la chimie des milieux aquatiques qui définit la labilité comme la capacité d’un complexe en solution à maintenir l’équilibre avec le métal libre, i.e. un complexe sera dit « labile » s’il est capable de se dissocier « rapidement » dans les conditions (temps d’exposition et dimension de l’interface) imposées au système (Jeffery et Uren 1983 ; van Leeuwen et al. 2005). Le concept de labilité a donc été premièrement appliquée à la solution du sol puis élargi au sol dans son ensemble en intégrant la réactivité des constituants de la phase solide. II.3.1. Labilité du cuivre dans la solution du sol De façon générale, très peu d’études ont évalué la labilité des complexes métalliques dans la solution du sol dans le but d’évaluer la capacité de réapprovisionnement du métal libre et le maintien de son activité en solution. Jeffery et Uren (1983) ont utilisé des résines échangeuses d’ions (type Chelex) ainsi que des techniques voltammétriques (ASV, Anodic Stripping Voltammetry) qu’ils ont appliquées à des solutions de sol issues d’un sol chaulé avec différents niveaux de CaCO3. Ces auteurs ont montré que, contrairement à la labilité de Zn qui diminue linéairement avec l’augmentation du pH de la solution, la labilité de Cu est influencée à la fois par le pH et la réactivité des MOD. La labilité de Cu tend à diminuer linéairement avec l’augmentation du pH pour des pH inférieurs à 5-5,5, puis la diminution tend à s’infléchir pour les pH supérieurs, mettant donc en évidence la participation des MOD dans le réapprovisionnement de Cu2+. Jeffery et Uren (1983) ont également observé que, si les deux techniques montraient les mêmes tendances, les concentrations de complexes labiles étaient différentes. Ce dernier résultat indique donc que la labilité est dépendante de la force du puits de métal appliquée à l’interface. II.3.2. Labilité du cuivre dans le sol Etant donné l’importance de la phase solide dans la spéciation des métaux, les chimistes du sol se sont principalement appliqués à développer des méthodes d’estimation de la labilité des métaux dans le sol, i.e. incluant solution et phase solide. La labilité des métaux peut-être étudiée par le biais de l’échange isotopique qui consiste à ajouter une quantité connue de métal radioactif au sol puis, après un certain temps d’équilibration, à mesurer l’activité radioactive du métal dans une fraction considérée comme reflétant la disponibilité du métal (extraction avec une suspension de sol, une résine échangeuse d’ions ou même une plante) (Young et al. 2006).

kd

ka


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Figure 14. Cuivre isotopiquement échangeable (E) dans un sol chaulé ou non en fonction du temps d’équilibration après l’ajout de cuivre. La détermination du paramètre E est basée sur l’ajout à l’échantillon de sol d’une solution enrichie en isotope stable 65Cu. Après équilibration, le ratio 63Cu/65Cu et la concentration totale en cuivre sont mesurés sur un extrait à l’eau (D’après Oliver et al. 2006). Dans le cas de Cu, l’échange isotopique est difficilement utilisable pour caractériser la labilité sur des échelles de temps suffisamment longues pour être pertinentes, du fait que l’isotope le plus accessible, 64Cu, possède un temps de demi-vie très court (12,4 h) (Oliver et al. 2006). Nolan et al. (2004) ont donc développé pour Cu une technique d’échange isotopique basée sur l’ajout d’une solution enrichie en isotope stable 65Cu au sol, associée à la mesure sur un extrait de solution de sol (extraction à l’eau, rapport sol:solution 1:10) du ratio isotopique 63Cu/65Cu. La fraction isotopiquement échangeable est alors exprimée sous la forme du paramètre E (mg kg-1) : E = R × MA (63Cu + 65Cu) / (MA 65Cu) × (RIaj - RImes) / (RImes - RInat) × (RInat + 1) (5) avec, R, 65Cu ajouté au sol (mg kg-1), MA, masse atomique de l’isotope, RIaj, ratio isotopique 63Cu/65Cu dans la solution de Cu ajoutée, RImes, ratio isotopique 63Cu/65Cu dans la solution extraite après le temps d’équilibration sur le sol ayant reçu un ajout de Cu, RInat, ratio isotopique 63Cu/65Cu naturel dans la solution extraite après le temps d’équilibration sans ajout préalable de Cu au sol. Oliver et al. (2006) ont montré, d’une part, que le paramètre E était dépendant du temps d’équilibration et, d’autre part, que la cinétique de E variait en fonction des propriétés du sol comme le pH (Figure 14). Cependant, cette technique reste délicate à mettre en œuvre, eu égard au dosage des isotopes stables de Cu en ICP-MS (Inductively Coupled Plasma Mass Spectroscopy), et ne peut être envisagée que dans le cadre de la compréhension des mécanismes contrôlant la labilité de Cu dans le sol. D’autre part, son intérêt par rapport à l’exposition des racines à Cu reste limité puisque cette technique entrevoit la labilité au travers du processus d’adsorption, alors qu’il s’agit plutôt du réapprovisionnement de Cu en solution par désorption qu’il paraît pertinent d’étudier (voir partie III). Une des techniques couramment utilisées pour simuler l’effet puits des racines vis-à-vis des métaux est l’extraction des métaux contenus dans le sol à l’aide de réactifs plus ou moins sélectifs (Young et al. 2006). Ces techniques d’extraction ont été longtemps utilisées pour évaluer la spéciation à l’équilibre des métaux dans le sol. Cependant, plus récemment, certains auteurs se sont intéressés à l’effet du temps d’extraction sur la concentration de métal dans l’extrait final (Tuin et Tels 1990 ; Bermond et Eustache 1993 ; Darmawan et Wada 1999 ; Manoucherhi et al. 2006). Les cinétiques d’extraction de Cu (et des autres métaux


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également) présentent généralement une allure hyperbolique (Figure 15) qui peut être raisonnablement bien simulée en décrivant la réactivité du sol vis-à-vis du cuivre simplement par des cinétiques d’ordre 1 associées à un pool « labile » (CL) et un pool « faiblement labile » (CFL) (Bermond et Varrault 2004 ; Fangueiro et al. 2005). Il est alors possible de simuler les données expérimentales de la manière suivante : C(t) = CL × (1 - e- Lk × t) + CFL × (1 - e- FLk × t) (6) avec, C(t), la concentration (mg kg-1) de Cu extrait au temps t, kL et kFL, les constantes cinétiques de dissociation (s-1) des pools labile et faiblement labile et, t, le temps d’extraction (s). Cette méthode permet donc de déterminer la concentration en Cu dans chacun des pools. Cependant, comme dans le cas des extractions réalisées à l’équilibre, cette méthode cinétique pose la question du réactif à choisir pour mimer convenablement l’effet puits des racines qui semble par ailleurs être très variable d’une espèce végétale à l’autre (Young et al. 2006).

Figure 15. Pool de cuivre extrait à l’EDTA en fonction du temps d’extraction dans trois sols non contaminés. Les courbes représentent les simulations numériques calculées à partir des données expérimentales, en décrivant la réactivité du sol vis-à-vis du cuivre par un pool labile et un pool faiblement labile. Chacun des pools est décrit par une cinétique du premier ordre (D’après Bermond et Varrault 2004). L’effet puits des racines se traduit par le prélèvement dans la solution du sol de l’ion Cu2+ libre uniquement (voir partie III) et implique donc le réapprovisionnement de ce pool par les pools labiles de Cu en solution et en phase solide (Sauvé et al. 1996). En considérant que ce réapprovisionnement peut être limité par des contraintes cinétiques, il semble alors pertinent d’évaluer la disponibilité de Cu comme la capacité du sol à réapprovisionner Cu2+ en solution sous l’effet d’un puits. Davison et Zhang (1994) et Zhang et al. (1998) ont développé une technique relativement simple, la DGT (Diffusive Gradients in Thin films), constituée d’une résine échangeuse d’ions jouant le rôle de puits de Cu2+ et séparée du sol par un gel de diffusion dans lequel l’ion libre et les complexes se déplacent par diffusion comme dans l’eau. L’affinité de la résine (type Chelex) pour les métaux est suffisamment forte (log10K > 12) pour induire une concentration quasiment nulle à sa surface et, en conséquence, un gradient de diffusion dans le gel et dans le sol à la surface du système DGT (Ernstberger et al. 2002). Par rapport à la concentration du métal dans la solution du sol loin de l’interface sol-DGT (Csoln), la concentration à la surface du système DGT (CDGT) est nécessairement inférieure ou égale à Csoln et dépendante de la capacité du sol à réapprovisionner le pool de métal en solution.


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Cette concentration CDGT peut être calculée simplement de la manière suivante : CDGT = m × ∆g / (Dg × A × t) (7) avec, m, la masse (g) de métal adsorbé sur la résine, ∆g, l’épaisseur (m) du gel de diffusion, Dg, le coefficient de diffusion (m2 s-1) du métal dans le gel de diffusion, A, la surface (m2) de contact sol-DGT, t, le temps (s) de contact sol-DGT. La capacité du sol à réapprovisionner le métal en solution peut alors être exprimée comme le rapport, R, des concentrations en solution à l’interface sol-DGT et dans le sol (Figure 16) (Zhang et al. 2001) : R = CDGT / Csoln (8) Cette mesure de labilité peut également être exprimée sous la forme d’un flux, FDGT, de métal vers la résine et constitue donc une grandeur comparable à la biodisponibilité environnementale, s’exprimant dans les mêmes unités (voir partie I) : FDGT = m / (A × t) (9)

Figure 16. Capacité du sol à réapprovisionner le cuivre en solution mesurée in situ (a) et au laboratoire après homogénéisation (c) ou non (b) avec la méthode DGT (Diffusive Gradients in Thin films). La capacité de réapprovisionnement est exprimée comme le rapport entre la concentration en cuivre à l’interface sol-système DGT (CDGT) et la concentration dans la solution du sol (Csoln). Les symboles représentent les différentes répétitions (D’après Nowack et al. 2004).


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La mesure DGT de la labilité des métaux dans le sol a été couplée à un modèle numérique, DIFS (DGT Induced Flux in Soils and sediments), qui simule le flux de métal vers la résine DGT (Harper et al. 2000). Ce modèle considère que, sous l’effet du puits, la baisse de la concentration du métal en solution est limitée par la désorption du métal depuis les pools labiles et sa diffusion dans la porosité du sol. Le phénomène de diffusion est simulé à partir de la loi de Fick en tenant compte de la porosité du sol, de sa teneur en eau et du coefficient de diffusion du métal dans le sol. Le phénomène de désorption est quant à lui décrit, d’une part, par la taille du pool labile de métal associé à la phase solide du sol et exprimé sous la forme d’un coefficient de distribution (Kdl, cm3 g-1) et, d’autre part, par la cinétique de désorption du métal exprimée sous la forme du temps de réponse du pool labile (Tc) (Harper et al. 2000) : Kdl = Cls / Csoln = ka / (kd × Pc) (10) avec, Cls et Csoln, les concentrations de métal labile en phase solide (µg g-1) et de métal en solution (µg cm-3) et, Pc, la concentration de particules solides (g cm-3) dans le sol, et : Tc = 1 / (ka + kd) (11) La mesure DGT réalisée pour différents temps d’exposition et couplée au modèle DIFS permet donc de caractériser de manière simple la capacité de réapprovisionnement du métal en solution par la phase solide et donc la disponibilité des métaux dans le sol. Cependant, malgré ces nombreux avantages, cette technique a été mise au point pour des systèmes fonctionnant à saturation, e.g. pour l’étude de la labilité des métaux dans les sédiments. Hooda et al. (1999) ont ainsi montré la forte sensibilité de la mesure DGT à la teneur en eau du sol, ce dernier étant rarement saturé dans les conditions naturelles. D’autre part, si la mesure DGT peut être en principe effectuée sur des échantillons de sols non remaniés, voire directement in situ, elle montre une très forte sensibilité à l’hétérogénéité des propriétés du sol (Figure 16).


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III. Biodisponibilité environnementale du cuivre pour les plantes L’interface sol-racine est le siège d’intenses processus physiques, chimiques et biologiques qui participent au contrôle du prélèvement des métaux par les plantes (Figure 17) (Hinsinger 2001 ; Hinsinger et al. 2005). Dans cette partie, nous nous focaliserons principalement sur les processus biologiques et chimiques intégrant l’ensemble des fonctions rhizosphériques directement (e.g. excrétion racinaire de protons) ou indirectement (e.g. exsudation de ligands organiques par les micro-organismes dont l’activité est stimulée dans la rhizosphère) induites par l’activité racinaire. Les processus physiques ne seront pas traités dans cette partie et le lecteur est invité à se reporter à d’autres revues de synthèse (Gregory et Hinsinger 1999 ; Hinsinger et al. 2005 ; Gregory 2006). Une des principales fonctions de la racine concerne le prélèvement de l’eau et des éléments minéraux (dont les oligo-éléments comme Cu). Cette fonction induit un flux d’eau (convection) et de métal vers la racine par le jeu de processus d’advection (mass-flow) et de diffusion (Figure 17). La respiration des racines et des micro-organismes présents dans la rhizosphère est également responsable d’un influx de O2 et d’un efflux de CO2 qui peuvent modifier les équilibres chimiques, notamment par l’intermédiaire du pH, mais aussi de la pO2 et de la concentration en ion bicarbonate (HCO3

-). En lien avec l’absorption des éléments minéraux majeurs et son statut nutritionnel, la racine excrète des protons (H+) et des ions hydroxyl (OH-) ou bicarbonate qui peuvent engendrer des modifications importantes de pH dans la rhizosphère. Enfin, la racine exsude une grande diversité de composés organiques qui enrichissent les MOD dans la rhizosphère. L’ensemble de ces flux participent au contrôle de la disponibilité des métaux dans la rhizosphère et donc à leur biodisponibilité environnementale pour les plantes (Figure 17).

Figure 17. Processus biologiques et chimiques induits par les activités racinaires et leur implication sur la dynamique des métaux (M) à l’interface sol-solution-racine (Adapté d’après Hinsinger 2001 ; Hinsinger et al. 2005). III.1. Prélèvement et distribution du cuivre dans la plante

Le flux de prélèvement des métaux par les plantes, i.e. la biodisponibilité environnementale, intègrent deux processus distincts, et les flux correspondants : (i) l’adsorption des métaux dans l’apoplasme racinaire et à la surface des membranes plasmiques et (ii) l’absorption des métaux au travers des membranes plasmiques.


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III.1.1. Adsorption du cuivre dans l’apoplasme racinaire La matrice intercellulaire dans la racine, i.e. le compartiment apoplasmique, se subdivise en trois couches successives : la lamelle moyenne, le premier manteau cellulaire et le second manteau cellulaire, ce dernier étant en contact avec la membrane plasmique (Sattelmacher 2001). Cette matrice est principalement constituée de cellulose, d’hémicellulose, de pectines et de protéines. L’apoplasme racinaire présente la particularité d’être chargé négativement, ce qui est principalement dû à la prédominance des fonctions carboxyliques dans la lamelle moyenne et le premier manteau cellulaire (Marschner 1995). Le compartiment apoplasmique présente une constante d’acidité (pKa) de 3-3,6 et, en conséquence, plus de 80 % des groupements fonctionnels sont dissociés pour des pH supérieurs à 4-4,5 (Allan et Jarrell 1989). Cette propriété confère à l’apoplasme racinaire la capacité d’adsorber les cations métalliques, soit sous forme d’interactions électrostatiques (Dufey et al. 2001), soit sous forme d’adsorption spécifique comme cela peut être le cas pour Cu (Allan et Jarrell 1989 ; Sattelmacher 2001). Indépendamment de la forme d’adsorption, la capacité de rétention des métaux par l’apoplasme racinaire est caractérisée par le paramètre de « capacité d’échange cationique racinaire » (CECR). La composition de l’apoplasme et donc la CECR varient suivant l’espèce, la variété et l’âge du végétal (Marschner 1995 ; Dufey et al. 2001). Généralement, les dicotylédones présentent des CECR plus élevées (20 à 50 cmolc kg-1) que les monocotylédones (10 à 20 cmolc kg-1), ce qui est attribué à une concentration plus importante en acides uroniques dans l’apoplasme (Dufey et al. 2001). De plus, Allan et Jarrell (1989) ont observé que le pourcentage de sites réactifs dissociés était plus important chez le soja (Glycine max L.) que chez le maïs (Zea mays L.) pour des pH inférieurs à 4,5. Par conséquent, les concentrations de Cu adsorbé dans l’apoplasme sont généralement supérieures chez les dicotylédones (Cathala et Salsac 1975 ; Allan et Jarrell 1989 ; Iwasaki et al. 1990). De façon similaire à la réactivité des MOS, les sites réactifs de l’apoplasme racinaire présentent une capacité d’adsorption croissante quand le pH du milieu augmente et/ou lorsque la force ionique diminue, du fait d’une diminution de l’effet d’écran dû aux cations majeurs en solution (Iwasaki et al. 1990). A l’échelle du système racinaire, Iwasaki et al. (1990) ont estimé qu’environ 60 % de Cu contenu dans les racines étaient localisés dans l’apoplasme. III.1.2. Mécanismes et cinétique d’absorption du cuivre L’absorption proprement dite des métaux correspond à leur transport au travers de la membrane plasmique des cellules du cortex racinaire. Il est couramment admis que seule la forme libre (Mn+) d’un métal M est transportée ainsi. Le cuivre est un oligo-élément, i.e. essentiel à la plante, qui peut devenir phytotoxique en cas de trop forte accumulation dans les tissus (Marschner 1995 ; Mengel et Kirkby 2001). La plante doit donc réguler finement l’absorption de Cu au niveau racinaire pour maintenir son homéostasie (Sancenón et al. 2004). Pour autant, les mécanismes d’absorption de Cu restent à l’heure actuelle encore mal identifiés et ont été essentiellement caractérisés chez Arabidopsis thaliana L. (Sancenón et al. 2004 ; Puig et al. 2007). L’absorption racinaire de Cu semble principalement dépendre de transporteurs à haute affinité spécifique de Cu+ appartenant à la famille CTR (Copper TRansporter) et en particulier COPT1 (Figure 18.a) (Puig et al. 2007). Il semble essentiellement localisé au niveau des apex des racines primaires et secondaires bien que certaines expérimentations le localisent en quantité équivalente au niveau de la zone d’élongation et des poils racinaires. Le cuivre libre étant majoritairement présent sous forme Cu2+ dans la solutions du sol en conditions oxydantes (Lindsay 1979), Cu doit être réduit sous forme de Cu+ avant son absorption par COPT1. Cette étape de réduction pourrait être assurée par l’intermédiaire de protéines réductases insérées dans la membrane plasmique, FRO 2 et/ou 3 (Ferric Reductase Oxidase) (Figure 18.a), également impliquées dans la réduction de Fe3+ chez les plantes de stratégie I (Cohen et al. 1997 ; Puig et al. 2007). Le rôle des


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réductases de type FRO reste malgré tout à vérifier in vivo dans le cas de Cu. Zheng et al. (2005) ont observé que l’augmentation de l’activité réductase induite par une déficience en Cu était perceptible au niveau de l’ensemble du système racinaire du trèfle violet (Trifolium pratense L.), contrairement à l’augmentation induite par une déficience en Fe qui était uniquement localisée au niveau des apex racinaires. Ces résultats ont suggéré que les réductases induites sous déficience en Cu seraient différentes de celles induites sous déficience en Fe. Cohen et al. (1997) ont observé qu’une déficience en Cu induisait également un efflux de protons chez le pois (Pisum sativum L.), comme cela est couramment observé lors d’une déficience en Fe (Figure 18.a). Zheng et al. (2005) n’ont en revanche pas observé d’acidification du milieu extracellulaire sous déficience en Cu chez le trèfle violet. D’autre part, Cu pourrait également être absorbé par les racines sous forme Cu2+ par l’intermédiaire de protéines de transport de la famille ZIP (ZRT, IRT-like Proteins), ZIP 2 et 4 (Figure 18.a) bien que les données de la littérature soient assez contradictoires sur ce point (Puig et al. 2007).

Figure 18. Mécanismes probablement impliqués dans l’absorption du cuivre (Cu) au niveau de la membrane plasmique des cellules racinaires chez les plantes supérieures (mono- et dicotylédones) (a). Les graminées pourraient également absorber Cu sous forme complexée avec les phytosidérophores (PS) (b). Les points d’interrogation représentent des mécanismes de transport ou des transporteurs hypothétiques ou encore mal identifiés (D’après Ma et Nomoto 1996 ; Zheng et al. 2005 ; Puig et al. 2007). Chez les graminées qui sont des plantes de stratégie II, Fe est absorbé par un mécanisme spécifique impliquant la synthèse intracellulaire d’acides aminés non protéinogéniques, les phytosidérophores (PS), leur exsudation dans l’apoplasme racinaire et la rhizosphère permettant la chélation de Fe3+ et enfin l’absorption du complexe Fe-PS par un transporteur spécifique, YS1 (Yellow Stripe 1) (Figure 18.b) (Marschner 1995 ; Ma et Nomoto 1996). Gries et al. (1998) ont montré qu’une déficience en Cu pouvait induire une augmentation semblable de l’exsudation de PS chez Hordelymus europaeus L., suggérant un mécanisme similaire d’absorption de Fe et Cu chez les graminées. Cependant ce résultat n’a pas été confirmé depuis chez d’autres graminées. S’il a été effectivement montré que Cu était capable de prendre la place de Fe au niveau des complexes métal-PS (Ma et Nomoto 1993), l’absorption du complexe Cu-PS par l’intermédiaire de transporteurs de Fe-PS identifiés, de la famille YS1 n’a pas été clairement démontrée (Gries et al. 1995 ; Roberts et al. 2004 ; Schaaf et al. 2004 ; Harada et al. 2007) : alors que ZmYS1 semble pourvoir transporter Cu chez le maïs, le transporteur HvYS1 plus récemment identifié chez l’orge (Hordeum vulgare L.) discrimine nettement ces deux métaux, absorbant peu de Cu (et de Zn) comparativement à Fe,


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du moins lorsqu’il est exprimé en système hétérologue (Murata et al. 2006). En conséquence et en l’état des connaissances actuelles, il semble que l’on puisse conclure que Cu est absorbé majoritairement sous forme libre en solution, Cu+ et Cu2+. D’un point de vue fonctionnel, l’activité métabolique des transporteurs, i.e. l’absorption « active », se traduit généralement par une relation hyperbolique entre le flux d’absorption (FM) et l’activité du métal libre en solution (Figure 19), suivant la loi cinétique de Michaelis-Menten (Marschner 1995) : FM = Fmax × (CMn+ - Cmin) / (KM + (CMn+ - Cmin)) (12) avec, Fmax, le flux maximal de métal libre dans la plante, CMn+, la concentration ou l’activité du métal libre en solution, Cmin, la concentration ou l’activité du métal libre en solution à partir de laquelle le flux d’absorption devient nul, KM, l’activité du métal libre induisant un flux d’absorption égal à Fmax / 2 et qui représente l’affinité de Cu pour le(s) transporteur(s). Au-delà d’une certaine activité de métal libre, le flux d’absorption devient directement proportionnel à l’activité de métal libre en solution, traduisant une diffusion passive des ions à travers la membrane plasmique (Figure 19) (Marschner 1995).

Figure 19. Flux d’absorption des métaux en fonction de leur activité sous forme libre (Mn+) en solution. La relation est caractérisée par une première phase (1) d’absorption active suivant une cinétique michaëlienne, puis d’une deuxième phase (2) d’absorption passive où le flux est proportionnel à l’activité en solution. La signification des paramètres Fmax, KM et Cmin est donnée dans le texte (D’après Marschner 1995). Les flux d’absorption sont classiquement mesurés sur des échelles de temps de quelques minutes à quelques heures et correspondent donc à des flux nets intégrant l’influx et l’efflux de métal (Veltrup 1976 ; Hart et al. 1998 ; Lombi et al. 2001). Dans le cas de Cu, une seule étude a véritablement mesuré l’absorption de Cu sensu stricto, i.e. en désorbant le Cu apoplasmique avant la mesure de Cu racinaire, chez le riz (Oryza sativa L.) et la tomate (Lycopersicum esculentum L.) (Bowen 1987). Cependant, dans cette étude, les plantes ont été exposées à une gamme de concentrations de Cu2+ libre (10-500 µM) bien supérieures à l’exposition réelle des plantes dans la solution du sol, y compris dans les sols contaminés les plus acides (voir partie II). Ces auteurs ont malgré tout obtenu une cinétique de prélèvement de type michaelienne, suggérant une absorption active de Cu. Veltrup (1976) a également étudié le prélèvement, i.e. adsorption et absorption, de Cu chez Hordeum distichum L. sur une gamme de concentrations élevées en Cu2+ (1-300 µM). Cet auteur a observé l’enchaînement de deux cinétiques michaeliennes successives pour lesquelles il était à chaque fois possible de déterminer un couple (Fmax ; KM) différents. Ce résultat a suggéré la présence de systèmes de transport différents selon le niveau d’exposition des racines. D’autre part, Veltrup (1976) a également montré que l’augmentation du temps de mesure des flux d’absorption de 20 min à


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24 h diminuait de près de 40 fois Fmax, indiquant une possible adaptation physiologique des plantes au cours du temps (Briat et Lebrun 1999 ; Reid et Liu 2004). D’autres expérimentations ont également été réalisées avec des niveaux d’exposition des racines plus pertinents d’un point de vue environnemental (Nielsen 1976 ; Lidon et Henriques 1992). Cependant, ces auteurs ont relié le flux de prélèvement à la concentration totale de Cu en solution et non à la concentration en Cu2+ libre. Il est donc dans ce cas très difficile d’extrapoler les paramètres cinétiques obtenus à d’autres conditions expérimentales. Pour avoir une idée des paramètres cinétiques de prélèvement de Cu par les plantes dans des conditions réalistes d’exposition, il n’est possible à l’heure actuelle que d’extrapoler les résultats obtenus pour d’autres métaux absorbés à des niveaux similaires tels que pourrait l’être Cd par exemple. Hart et al. (1998, 2002) ont étudié l’absorption de Cd chez le blé dur (Triticum turgidum durum L.) exposé à des activités de Cd2+ comprises entre 0.05 et 1.5 µM et ont mesuré les paramètres cinétiques suivants : Fmax = 30-40 nmol (g racines fraîches)-1 h-1 et KM = 40-70 nM. A partir de ces données expérimentales, nous pouvons donc supposer que le flux d’absorption de Cu par les plantes est beaucoup plus faible que les flux rapportés dans la littérature jusqu’à présent, ce qui serait principalement dû à des gammes d’exposition inappropriées. Cependant, des données expérimentales supplémentaires sont nécessaires pour confirmer cette hypothèse et pour permettre d’évaluer plus précisément le flux d’absorption de Cu par les racines. Les protéines permettant le transport transmembranaire des métaux sont rarement spécifiques à un seul métal, ce qui entraîne des effets de compétitions pour l’absorption en fonction de l’activité des autres métaux en solution. Reid et Liu (2004) ont montré que le flux d’absorption du cobalt (Co) était peu modifié par Fe3+, Fe2+ ou Pb2+ et en revanche fortement diminué par Cu2+, Ag+ ou Cd2+. Le pH et la force ionique de la solution perturbent également le phénomène d’absorption, en modifiant l’activité du métal considéré dans le compartiment apoplasmique qui détermine le niveau d’exposition des membranes plasmiques et donc la cinétique de prélèvement (Reid et Liu 2004). Zhang et al. (2001) ont notamment observé une diminution du flux d’absorption de nickel (Ni) suite à l’augmentation de l’activité de Ca2+ ou à la diminution du pH en solution, ce qui a été expliquée par une diminution de l’activité de Ni dans le compartiment apoplasmique. En revanche, l’absorption de Co par Vigna radiata L. tend à augmenter quand le pH de la solution diminue, suggérant un transport de Co chez cette plante par un symport H+/Co2+ (Reid et Liu 2004). Ces résultats indiquent donc que l’absorption racinaire des métaux est fortement dépendante à la fois de l’espèce végétale, des mécanismes de transport impliqués et des conditions physico-chimiques du milieu environnant. Pour toutes ces raisons, les mesures de flux d’absorption des métaux par les plantes obtenues en conditions contrôlées très artificielles doivent donc être extrapolées avec précaution. III.1.3. Translocation et distribution du cuivre dans la plante Une fois prélevés, les métaux se redistribuent dans la plante par l’intermédiaire de transporteurs plus ou moins spécifiques, de manière à maintenir l’homéostasie et un fonctionnement physiologique adéquat de la plante (Puig et al. 2007). Dans le cas de Cu, son affinité importante pour l’apoplasme racinaire se traduit par une accumulation de Cu préférentielle dans les racines (Marschner 1995). Le rapport des concentrations totales de Cu entre les racines et les parties aériennes peut considérablement varier et être compris entre 2,5 et 166 en fonction du niveau d’exposition des plantes (Brun et al. 2001 ; Santibañez et al. 2008). Lorsque seule la fraction symplasmique de Cu racinaire est considérée, le rapport entre Cu dans les racines et Cu dans les parties aériennes diminue, bien que le pool racinaire reste 2 à 20 fois supérieur (Michaud et al. 2008). Cette localisation préférentielle de Cu dans les


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racines rend le pool racinaire beaucoup plus sensible que les parties aériennes aux variations de la disponibilité de Cu dans le sol. La concentration en Cu dans les racines est donc généralement le meilleur indicateur de la biodisponibilité environnementale en l’absence de mesures du flux de prélèvement (Chaignon et al. 2003). Du moins, elle constitue un indicateur plus sensible que la concentration en Cu dans les parties aériennes. III.2. Evaluation de la biodisponibilité environnementale à partir de la disponibilité du cuivre dans le bulk soil

A l’instar de la disponibilité des métaux dans le sol, la biodisponibilité environnementale des métaux pour les plantes est étudiée en s’intéressant, d’une part, aux équilibres chimiques qui régissent l’activité du métal libre en solution et, d’autre part, aux contraintes cinétiques qui perturbent ces équilibres. III.2.1. Effets des propriétés physico-chimiques du sol La disponibilité des métaux étant fortement influencée par les paramètres du sol tels que le niveau de contamination, les MOS et le pH, de nombreux auteurs ont cherché à relier la concentration de métal dans la plante aux paramètres physico-chimiques du sol (Peijnenburg et al. 1997). Il est généralement accepté que la concentration totale en métal dans le sol ne soit pas un bon indicateur de la biodisponibilité du métal pour la plante (Harmsen et al. 2005). Hough et al. (2005) ont en effet observé que les concentrations en Cd et Zn dans les parties aériennes du ray-grass (Lolium perenne L.) n’étaient pas corrélées au niveau de contamination de 40 sols plus ou moins contaminés. Nolan et al. (2005) ont fait les mêmes observations pour les concentrations en Cd, Pb et Zn dans les parties aériennes du blé tendre (Triticum aestivum L.) cultivé sur 12 sols de niveaux de contamination variés. A l’inverse, ces mêmes auteurs ont remarqué que la concentration en Cu dans le blé était principalement corrélée à la concentration totale en Cu des sols (Figure 20.a). Des conclusions similaires ont été rapportées par Chaignon et al. (2003) qui ont étudié le prélèvement de Cu chez la tomate cultivée en sols calcaires à antécédent viticole (Figure 20.b). Ces résultats sont soutenus par les corrélations qui ont été établies entre la concentration totale en Cu du sol et les concentrations en Cu total ou Cu2+ libre dans la solution du sol (voir partie II ; Sauvé et al. 1997 ; Sauvé et al. 2000).

Figure 20. Concentration en cuivre (Cu) dans les parties aériennes du blé tendre (Triticum aestivum L.) (a) et les parties aériennes et racinaires de la tomate (Lycopersicum esculentum L.) (b) en fonction de la concentration totale en Cu dans les sols (D’après Chaignon et al. 2003 et Nolan et al. 2005). Les MOS semblent également jouer un rôle prépondérant dans le déterminisme de la biodisponibilité de Cu pour les plantes. Le rôle des MOS semble cependant dépendre de la quantité de Cu qu’elles contiennent et qu’elles apportent donc au sol. Kornegay et al. (1976) ont en effet observé que l’apport répété au sol de fumier de porc faiblement concentré en Cu (60-90 mg Cu kg-1 MS) ne modifiait pas significativement la concentration en Cu chez le


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maïs (Figure 21). En revanche, l’apport au sol de fumier de porc concentré en Cu (1300-2400 mg Cu kg-1 MS) a induit une augmentation des concentrations en Cu dans les parties aériennes et surtout les racines du maïs, en lien avec l’élévation significative de la concentration totale en Cu dans le sol (Figure 21). En sols contaminés (100-400 mg Cu kg-1), l’apport de MOS faiblement concentrées en Cu s’est traduit par une diminution de la disponibilité de Cu et, en conséquence, de la concentration en Cu dans les parties aériennes de Brassica juncea L. (Bolan et al. 2003).

Figure 21. Concentration en cuivre (Cu) dans les racines et les parties aériennes du maïs (Zea mays L.) cultivé in situ sur un sol amendé (+MO) ou non (-MO) pendant deux ans avec des fumiers de porc riches en Cu (+MO / +Cu, 1300-2400 mg Cu kg-1 MS) ou non (+MO / -Cu, 60-90 mg Cu kg-1 MS). La concentration totale en Cu du sol a augmenté de 14 mg kg-1 dans le sol non amendé à 22 mg Cu kg-1 dans le sol amendé avec les fumiers riches en Cu. Les symboles * et ** représentent une différence significative à P ≤ 0,05 et P ≤ 0,01, respectivement (D’après Kornegay et al. 1976). La disponibilité de Cu est également fortement dépendante du pH du sol et tend à être maximale dans les sols les plus acides (voir partie II). En lien avec l’effet du pH du sol sur la disponibilité de Cu, Lexmond (1980) a observé une diminution des concentrations en Cu dans les parties aériennes du maïs en sol contaminé (100 mg Cu kg-1) suite à la remontée du pH du sol par chaulage (Figure 22). Cet auteur a également remarqué que l’effet du pH était dépendant du niveau de contamination du sol, l’augmentation de la concentration en Cu dans la plante étant d’autant plus forte en sol très acide que le niveau de contamination du sol est élevé (Figure 22). Cependant, l’effet du pH n’est pas toujours aussi évident lorsque la biodisponibilité environnementale des métaux est évaluée dans des sols présentant des propriétés physico-chimiques contrastées (Zhao et al. 2006). Hough et al. (2005) ont notamment observé que le pH ne pouvait expliquer, à lui seul, que 50 à 60 % de la variabilité des concentrations en Cd et Zn dans le ray-grass cultivé dans 40 sols contaminés. Bien que la biodisponibilité environnementale puisse être corrélée à un certain nombre de paramètres physico-chimiques du sol, les paramètres prépondérants varient fortement en fonction des sols sélectionnés. Des indicateurs intégrant l’effet des différents paramètres du sol et basés sur des hypothèses de mécanismes prépondérants dans le déterminisme de la biodisponibilité environnementale ont donc été recherchés.


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Figure 22. Concentration en cuivre (Cu) dans les parties aériennes du maïs (Zea mays L.) en fonction du pH du sol. Les plantes ont été cultivées sur des parcelles expérimentales chaulées et amendées en Cu pour couvrir une large gamme de pH (3,9-6,2) et de niveau de contamination en Cu (10-100 mg kg-1) du sol (Adapté d’après Lexmond 1980). III.2.2. Formalisation de la biodisponiblité : hypothèses FIAM et TBLM Il est généralement accepté que les plantes prélèvent les métaux, par adsorption et absorption, dans la solution du sol sous leur forme libre (Mn+). En conséquence, le modèle de l’activité de l’ion libre, FIAM (Free Ionic Activity Model), a été développé sur l’hypothèse que les concentrations en métaux dans les plantes devaient être corrélées à l’activité des métaux libres dans la solution du sol (Figure 23.a) (Sauvé et al. 1996 ; Hough et al. 2005 ; Zhao et al. 2006). Lexmond (1980), Minnich et al. (1987) et Datta et Young (2005) ont ainsi obtenu des relations significatives, bien que non linéaires, entre la concentration en Cd, Cu et Zn dans les parties aériennes du maïs, du haricot (Phaseolus vulgaris L.) et de la betterave (Beta vulgaris L.) et l’activité de Cd2+, Cu2+ et Zn2+ libres dans la solution de divers sols contaminés (Figure 24). Sauvé et al. (1996) a également montré que l’activité de Cu2+ libre en solution expliquait une plus grande part de la variabilité des concentrations en Cu dans les parties aériennes du ray-grass, de la laitue (Lactuca sativa L.) et du radis (Raphanus sativus L.) que la concentration totale de Cu en solution ou dans le sol.

Figure 23. Modèles conceptuels décrivant les interactions sol-racines pour l’évaluation des biodisponibilités environnementale et toxicologique : « Free Ion Activity Model » (FIAM) (a) et « Terrestrial Biotic Ligand Model » (TBLM). Dans les deux cas, les modèles sont basés sur la caractérisation des équilibres chimiques régulant l’activité du métal libre (Mn+) en solution (Adapté d’après Thakali et al. 2006).


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Cependant, les résultats de Lexmond (1980) montrent que, si l’hypothèse FIAM est validée pour des activités de Cu2+ libre supérieures ou égales à 1 µM, les concentrations en Cu dans la plante sont restées stables malgré la diminution de l’activité de Cu2+ libre lorsque cette dernière est inférieure à 1 µM (Figure 24). Cette observation peut être expliquée par l’effet du pH sur l’adsorption des métaux dans l’apoplasme racinaire qui augmente lorsque le pH augmente, à une activité du métal libre donnée (Lexmond et van der Vorm 1981 ; Iwasaki et al. 1990). Hough et al. (2005) ont confirmé ces résultats en montrant que le rapport entre la concentration en Cd et Zn dans la plante et l’activité de Cd2+ et Zn2+ libres en solution augmentait avec le pH (Figure 25). Le phénomène de compétition entre les métaux et les protons pour l’adsorption dans l’apoplasme racinaire a été étendu à d’autres cations compétiteurs comme Ca2+ et Mg2+ notamment (Kinraide et al. 1992 ; Kinraide et al. 2004). Thakali et al. (2006) et Antunes et al. (2006) ont formalisé cette extension du FIAM sous la forme d’un modèle de ligand biotique appliqué au sol, le TBLM (Terrestrial Biotic Ligand Model). Le TBLM se caractérise par le calcul des constantes de stabilité des complexes métaux-ligand biotique et proton-ligand biotique ainsi que par la prise en compte des interactions entre les métaux et les différents constituants du sol qui rentrent en compétition avec le ligand biotique pour l’adsorption des métaux (Figure 23.b).

Figure 24. Concentration en cuivre dans les parties aériennes du maïs (Zea mays L.) en fonction de l’activité du cuivre (Cu) libre mesurée dans des extraits CaCl2 0,01 M. Les plantes ont été cultivées sur des parcelles expérimentales chaulées et amendées en Cu pour couvrir une large gamme de pH (3,9-6,2) et de niveau de contamination en Cu (10-100 mg kg-1) du sol (Adapté d’après Lexmond 1980).

Figure 25. Facteur de transfert sol-plante du zinc (Zn) en fonction du pH dans 40 sols plus ou moins contaminés (145-2000 mg Zn kg-1). Le facteur de transfert sol-plante correspond au logarithme à base 10 du rapport entre la concentration en Zn dans les parties aériennes du ray-grass (Lolium perenne L.) et l’activité de Zn2+ libre en solution (D’après Hough et al. 2005).


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III.2.3. Prise en compte des contraintes cinétiques En accord avec le TBLM, l’ajout du paramètre pH du sol dans la régression linéaire entre l’activité de Cu2+ libre en solution et les concentrations en Cu dans les parties aériennes ou les racines de la tomate a permis d’améliorer significativement l’explication de la variabilité de la biodisponibilité environnementale de Cu (Zhao et al. 2006). Cependant, même en tenant compte du pH, seulement 40 à 50 % de la variabilité de la biodisponibilité environnementale de Cu étaient expliqués. Dans cette étude, la mesure à l’aide de la méthode DGT de la concentration effective de Cu (CE), combinant la concentration mesurée de Cu totale en solution et la concentration théorique de Cu en solution due à la désorption de Cu depuis la phase solide du sol, a été le paramètre intégrateur le mieux corrélé à la concentration en Cu dans la plante (Figure 26.a). Zhang et al. (2001) ont également observé une excellente corrélation entre CE et la concentration en Cu dans les parties aériennes de l’hyperaccumulatrice, Lepidium heterophyllum L., cultivée dans 20 sols présentant une large gamme de pH (5,5-8) et de niveau de contamination (CuTotal = 20-8650 mg kg-1) (Figure 26.b).

Figure 26. Concentration en cuivre (Cu) dans les parties aériennes de Lepidium heterophyllum L. ainsi que dans les parties aériennes et racinaires de la tomate (Lycopersicum esculentum L.) en fonction de la concentration effective de Cu en solution (CE) estimée à partir de mesures en DGT (voir le texte) (D’après Zhang et al. 2001 et Zhao et al. 2006). Ces résultats suggèrent que le prélèvement de Cu par les plantes induit un appauvrissement de Cu en solution et donc que le prélèvement est principalement limité par la cinétique de ré-approvisionnement de Cu en solution par la phase solide du sol. Antunes et Hale (2006) et Degryse et al. (2006a, 2006b) ont approfondi ce concept en démontrant chez le blé dur (Triticum turgidum durum L.), l’épinard (Spinacia oleracea L.) et la tomate cultivés en hydroponie que le prélèvement de Cd, Cu et Zn par les plantes était limité par le taux de dissociation (kd) des complexes organiques des métaux en solution (Figure 27). Cependant, ce concept de limitation cinétique du réapprovisionnement du métal en solution ne semble pas forcément valable pour toutes les espèces végétales dans le cas de Cu, en particulier lorsque ces dernières ont un effet de puits modéré et/ou qu’elles sont cultivées sur des sols contaminés. Nolan et al. (2005) ont en effet observé que la concentration en Cu dans les parties aériennes du blé tendre était mieux expliquée par le niveau de contamination du sol que par CE, suggérant que la biodisponibilité de Cu pour le blé était principalement limitée par la quantité totale de Cu dans le sol et non pas par sa cinétique de réapprovisionnement en solution.


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III.3. Modifications chimiques dans la rhizosphère

Dans les différentes approches précédemment présentées, il est implicitement considéré que les conditions physico-chimiques et donc la disponibilité des métaux dans le bulk soil sont également celles qui règnent à l’interface sol-racines (Peijnenburg et al. 1997 ; Antunes et al. 2006). Pourtant, la Figure 17 suggère la présence de processus chimiques induits par l’activité racinaire dans la rhizosphère qui sont susceptibles d’altérer à la fois les équilibres chimiques et les contraintes cinétiques contrôlant la disponibilité des métaux. Il est donc nécessaire de savoir dans quelles mesures ces modifications chimiques, et en particulier les modifications de pH, de la quantité et de la nature des MOD, peuvent influencer la disponibilité des métaux dans la rhizosphère et, in fine, leur biodisponibilité pour les plantes.

Figure 27. Prélèvement de cadmium (Cd) chez l’épinard (Spinacia oleracea L.) en fonction de la concentration en Cd en solution, pour une activité de Cd2+ libre fixée à 1 nM et en présence de complexes organiques de Cd se différenciant par leur constante cinétique de dissociation (kd). Le modèle de l’ion libre (FIAM) est symbolisé par la droite en pointillés et prédit un prélèvement équivalent quelle que soit la concentration totale en Cd. L’écart au FIAM est le plus faible pour la solution contenant le complexe de Cd présentant le plus faible kd (Cd-CDTA, kd = 10-5 s-1) et, au contraire, est le plus important pour les solutions contenant les complexes de Cd présentant les plus forts kd (Cd-EDDA et Cd-NTA, kd > 10-2 s-1). Les courbes pleines correspondent aux simulations du prélèvement de Cd pour des solutions contenant des complexes de Cd présentant différents kd (D’après Degryse et al. 2006a). III.3.1. Modifications du pH L’origine des modifications de pH dans la rhizosphère est principalement attribuée à l’excrétion de H+ ou de OH- par les racines pour contrebalancer le prélèvement excédentaire de cations ou d’anions et ainsi maintenir l’électroneutralité dans le milieu intracellulaire (Haynes 1990 ; Marschner 1995 ; Hinsinger et al. 2003). Ces modifications de pH sont donc contrôlées par l’absorption des cations (Ca2+, K+, Mg2+, Na+ et NH4

+) et anions (Cl-, H2PO4-,

NO3-, SO4

2-) majoritaires (Haynes 1990). L’absorption de l’azote sous forme NH4+ ou NO3

- semble particulièrement déterminante dans le bilan cations-anions. Riley et Barber (1971) ont ainsi mis en évidence une acidification de la rhizosphère du soja cultivé en sol fertilisé avec NH4

+ et, inversement, une alcalinisation de la rhizosphère en sol fertilisé avec NO3-. Pour

maintenir le pH cytosolique à 7,2-7,4, les cellules végétales synthétisent des acides organiques portant des groupements carboxyliques (e.g. les acides malique, oxalique, citrique…) (Marschner 1995). Il a d’abord été considéré qu’un excès de cations absorbés, accompagnés d’un efflux de H+, se traduisait par la synthèse d’acides organiques, leur dissociation sous forme d’anions carboxylates et leur exsudation dans la rhizosphère. Cependant, l’assimilation de l’azote dans les cellules est également liée à la synthèse des acides organiques. Il a donc été montré que l’excès d’anions absorbés dû au prélèvement de NO3

- pouvait également se traduire par l’exsudation d’anions carboxylates dans la rhizosphère


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(Haynes 1990). Les acides organiques étant exsudés sous forme dissociée, i.e. anions carboxylates, du fait du pH neutre du cytosol, ils peuvent donc essentiellement participer à l’alcalinisation de la rhizosphère en consommant des H+ par protonation de leur groupement carboxylique (Hinsinger et al. 2001). Cependant, l’exsudation des anions organiques est accompagnée, pour maintenir l’électroneutralité, de l’excrétion de H+ ou de K+ (Ryan et al. 2001). L’exsudation des anions organiques peut ainsi également participer à l’acidification de la rhizosphère (Hinsinger et al. 2001). La respiration des cellules racinaires et des micro-organismes dont l’activité est particulièrement importante dans la rhizosphère provoque une augmentation localisée de la pression partielle en CO2 dans le sol. Ce processus n’est toutefois en mesure d’acidifier significativement la rhizosphère des plantes cultivées qu’en sols modérément acides à alcalins puisque l’acide carbonique est un acide faible, de pK = 6,36 (Hinsinger et al. 2003). Le pH de la rhizosphère peut également varier en fonction du statut nutritionnel particulier de la plante en certains éléments minéraux (Haynes 1990 ; Marschner 1995 ; Hinsinger et al. 2003 ; Mengel et Kirkby 2001). Sous déficience en Fe et P, de nombreuses espèces végétales exsudent plus d’anions organiques et de protons et tendent donc à acidifier leur rhizosphère. A l’inverse, dans les sols très acides présentant des risques de toxicité de Al, Mn ou de déficience en P, certaines espèces végétales tendent à alcaliniser leur rhizosphère (Haynes 1990 ; Marschner 1991 ; Kochian et al. 2004). Les mécanismes impliqués dans l’alcalinisation de la rhizosphère sont encore mal connus à l’heure actuelle. Degenhardt et al. (1998) ont fourni la première évidence d’une alcalinisation de la solution en contact avec des apex racinaires induite par la présence de Al et responsable de la résistance à Al du mutant alr-104 chez Arabidopsis. Taylor et Foy (1985) ont également montré que des variétés de blé tendre tolérantes à Al présentaient une cinétique de prélèvement de NH4

+ plus faible et, inversement, une cinétique de prélèvement de NO3

- plus importante que des variétés non tolérantes, ce qui conférait aux variétés tolérantes une meilleure capacité à alcaliniser leur rhizosphère. Au-delà de leur statut nutritionnel, les plantes sont capables de modifier le pH de leur rhizosphère en fonction de leur physiologie propre et du pH initial du sol (Youssef et Chino 1989a, pH). Loosemore et al. (2004) ont mesuré une acidification systématique dans la rhizosphère du tabac (Nicotiana tabacum L.) cultivé sur un sol amené à différents pH (5-6,8) et quelle que soit la forme d’azote apportée (NO3

- ou NH4+). En exposant du colza à un sol

contaminé en Cu (CuTotal = 170 mg kg-1) et amené à différents pH (3,7-6,1), Chaignon et al. (2008) ont observé un influx net de H+ dans la rhizosphère pour les sols présentant des pH initialement inférieurs à 4,8 et, inversement, un efflux net de H+ dans la rhizosphère pour les sols présentant des pH initialement supérieurs à 4,8, alors que l’azote était systématiquement apporté sous forme de NO3

- (Figure 28.a).

Figure 28. Flux net de protons (a) excrétés par les racines du colza (Brassica napus L.) en fonction du pH initial du sol (bulk soil). Cuivre (Cu) extrait au CaCl2 (b) dans le bulk soil et la rhizosphère en fonction de leur pH. Les


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échantillons de sol de pH différents ont été obtenus à partir d’un échantillon de sol acide (pHH20 = 4,3) et contaminé en Cu (CuTotal = 173 mg kg-1) ayant reçu des apports croissants de Ca(OH)2 (D’après Chaignon et al. 2008). Ces modifications de pH ont pu être reliées à la modification de la disponibilité de Cu dans la rhizosphère. L’alcalinisation dans les sols les plus acides a été responsable de la réduction de la gamme d’exposition des racines à Cu (Figure 28.b). L’affinité de Cu pour l’apoplasme racinaire augmentant avec le pH, aucune différence nette de biodisponibilité de Cu n’a pu être mise en évidence sur la large gamme de pH étudiée (Chaignon et al. 2008). A l’inverse, Chaignon et al. (2002a) ont rapporté des concentrations en Cu chez la tomate et le colza supérieures dans un sol très acide (pHH2O = 4,3) par rapport à un sol calcaire de même niveau de contamination, malgré l’alcalinisation du sol acide et l’acidification du sol calcaire. L’effet du pH du sol sur la biodisponibilité environnementale serait donc dépendant du pH initial des sols et de l’ampleur du phénomène d’alcalinisation en sol acide. L’impact de telles modifications de pH dans la rhizosphère sur la disponibilité et la biodisponibilité environnementale des métaux n’a été que peu validé in situ. Seul Bagayoko et al. (2000) ont mesuré in situ des alcalinisations de 0,7 à 2 unités pH dans la rhizosphère de céréales et de légumineuses cultivées en sols très acides (pHKCl = 3,9-5,3). Ce phénomène d’alcalinisation a pu être corrélé à une diminution de Al échangeable et une augmentation de P extractible dans la rhizosphère par rapport au bulk soil. Certains auteurs se sont également intéressés à l’extension spatiale du gradient de pH dans la rhizosphère. Youssef et Chino (1989a) et Gahoonia (1993) ont ainsi observé des gradients de pH, acidification ou alcalinisation, s’étendant sur plus de 1 à 5 mm dans le sol au contact des racines d’orge, de soja et de ray-grass. Couplant mesures de pH et de Cu extractible à l’acide, Youssef et Chino (1989b) ont mis en évidence une diminution de l’extractabilité de Cu sur 2 à 3 mm dans la rhizosphère en lien avec l’alcalinisation observée sur près de 5 mm. Ces auteurs ont conclu que l’augmentation de pH dans la rhizosphère tendait à diminuer la disponibilité de Cu. Cependant, le flux de prélèvement de Cu par la plante pourrait également avoir contribué à la mise en place du gradient de Cu dans la rhizosphère si la cinétique de réapprovisionnement de Cu par le sol était lente par rapport au flux de prélèvement (Barber 1995 ; Zhang et al. 2001). L’impact respectif des différents processus rhizosphériques, i.e. prélèvement et modifications de pH, sur la disponibilité des métaux dans la rhizosphère n’a pas été évalué. III.3.2. Exsudation de ligands organiques La rhizodéposition correspond au flux de C issu des racines qui est libéré dans la rhizosphère et intègre les cellules de la coiffe ainsi que les exsudats de masses moléculaires élevée et faible (Marschner 1995 ; Nguyen 2003). La rhizodéposition est un flux important de C vers le sol puisqu’elle implique en moyenne près de 20 % du C net fixé par la plante lors de la photosynthèse (Nguyen 2003). Les exsudats racinaires de masse moléculaire élevée se composent principalement des mucilages et des ectoenzymes. Les mucilages sont principalement constitués de polysaccharides et peuvent contenir de 20 à 50 % d’acides polyuroniques qui confèrent aux mucilages leur affinité pour les cations métalliques (Morel et al. 1986 ; Marschner 1995). Morel et al. (1986) et Mench et al. (1987) ont estimé que les constantes d’affinité de Cd2+, Cu2+, Pb2+ et Zn2+ pour les mucilages et les exsudats de masse moléculaire élevée, i.e. > 1000 Da, étaient comprises entre log10K 3,2 et 5,6, suivant le métal considéré et la composition des exsudats. Les exsudats racinaires de faible masse moléculaire sont principalement composés d’anions organiques, de sucres, d’acides aminés (y compris les phytosidérophores chez les graminées) et de composés phénoliques (Marschner 1995). A l’exception des sucres et de certains acides organiques ou aminés, toutes ces molécules


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présentent des propriétés de complexation vis-à-vis des métaux qui peuvent être connues précisément lorsque la nature des composés est identifiée. Jones (1998) a par exemple recensé l’affinité de divers cations métalliques pour les anions organiques les plus fréquemment retrouvés dans la rhizosphère, i.e. le malate, le citrate et l’oxalate. Le cuivre libre présente des constantes de stabilité avec ces ligands qui peuvent varier de log10K 3,3 à 13,2, en fonction du nombre et de la proximité des groupements carboxyliques portés par les anions organiques ainsi que des concentrations de métal et de ligands en solution. La quantité d’anions organiques exsudés dans la rhizosphère est liée au statut nutritionnel de la plante et en particulier à l’occurrence d’une déficience en Fe (plante de stratégie I), en P ou d’une toxicité de Al ou de Cu (Jones et al. 1998 ; Murphy et al. 1999 ; Ryan et al. 2001 ; Nian et al. 2002 ; Kochian et al. 2004). Dans ce dernier cas, la complexation de Cu par les anions organiques permettrait de limiter l’adsorption de Cu dans l’apoplasme racinaire et tendrait donc à diminuer sa biodisponibilité. Jung et al. (2003) ont également suggéré que les composés phénoliques exsudés chez le lupin blanc (Lupinus albus L.) pourraient jouer un rôle similaire. Enfin, Cu semble présenter une affinité particulièrement élevée pour les phytosidérophores exsudés par les plantes de stratégie II, i.e. les graminées (Table 1). Tableau 1. Constantes de stabilité des complexes métaux-phytosidérophore. Le phytosidérophore (DMA, acide déoxymuginéique) a été isolé et purifié à partir du lavage de racines d’orge (Hordeum vulgare L.) (D’après Murakami et al. 1989).

Ca2+ Mn2+ Fe2+ Zn2+ Ni2+ Fe3+ Cu2+

3,34 8,29 10,45 12,84 14,78 18,38 18,70

Bien que ces composés soient spécifiquement exsudés pour permettre aux graminées de satisfaire leur besoin en Fe (et également en Zn), les constantes de stabilité des complexes entre phytosidérophores et Cu sont légèrement supérieures à celles des complexes formés avec Fe. Reichman et Parker (2005) ont ainsi montré à l’aide d’un modèle géochimique qu’au-dessus de pH 5, les phytosidérophores étaient très majoritairement complexés à Cu et non à Fe. Mench et Martin (1991) ont également observé que les exsudats racinaires du maïs étaient capables de mobiliser beaucoup plus fortement Cu dans le sol que les exsudats racinaires du tabac. L’augmentation significative de l’exsudation chez le blé tendre déficient en Fe a pu être reliée à l’accroissement des concentrations en Cu dans les racines et les parties aériennes (Figure 29) (Chaignon et al. 2002b).

Figure 29. Exsudation de ligands organiques (a) (probablement de phytosidérophores) chez le blé tendre (Triticum aestivum L.) cultivé en hydroponie en présence (+Fe, 100 µM FeEDTA) ou en absence de fer (-Fe). A l’issue de cette phase d’hydroponie, le blé a été transféré sur un sol calcaire contaminé en cuivre (Cu) (CuTotal = 144 mg kg-1) et, après 8 jours de contact, les concentrations en Cu (b) dans les parties aériennes et racinaires du blé tendre ont été mesurées. Les pourcentages (b) indiquent la proportion de Cu racinaire contenue dans la fraction apoplasmique (D’après Chaignon et al. 2002b).


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Le rôle exact joué par les complexes Cu-phytosidérophore dans la biodisponibilité de Cu pour les graminées reste cependant à élucider. Comme il n’est pas démontré que les graminées soient capables d’absorber Cu sous sa forme complexée avec les phytosidérophores (Figure 18.b), ces résultats peuvent découler d’une augmentation de la labilité de Cu dans le sol. La capacité des exsudats racinaires à diminuer les limitations cinétiques du réapprovisionnement du métal libre en solution à la surface de la racine a été abordée par Degryse et al. (2008). Ces auteurs ont montré que les exsudats racinaires de la tomate cultivée en hydroponie augmentait la labilité de Cu en solution et en conséquence la concentration de Cu dans la plante par rapport à une solution présentant la même activité de Cu2+ libre mais sans la présence de complexes organiques labiles (Figure 30). L’exsudation racinaire tendrait donc à modifier qualitativement les MOD et leur propriété de complexation vis-à-vis des métaux. Bien que cela soit encore débattu, un certain nombre d’auteurs ont également mis en évidence une augmentation de la concentration en MOD dans la rhizosphère, attribuée au flux d’exsudation (Puschenreiter et al. 2005 ; Cattani et al. 2006 ; Khalid et al. 2007). Cattani et al. (2006) ont ainsi observé une augmentation d’un facteur 2,6 de la concentration en MOD dans la rhizosphère du maïs cultivé dans un sol calcaire, qui s’est accompagnée de l’augmentation de la concentration de Cu en solution et de Cu labile du sol d’un facteur 6,1 et 4,5, respectivement (Figure 31). Les modifications chimiques induites par les racines dans la rhizosphère semblent donc pouvoir avoir un effet considérable sur la disponibilité des métaux. Cette dernière pourrait être très différente de la disponibilité mesurée dans le bulk soil, sur laquelle sont basés la plupart des concepts et des méthodes d’évaluation de la biodisponibilité des métaux pour les plantes (Peijnenburg et al. 1997 ; Harmsen et al. 2005).

Figure 30. Concentrations observées (points expérimentaux) et simulées (droites) du cuivre (Cu) dans les parties aériennes de la tomate (Lycopersicum esculentum L.) cultivée en hydroponie en fonction de l’activité en Cu libre (pCu2+) tamponnée avec une résine. La droite pleine représente la simulation tenant compte d’une limitation du prélèvement par le flux diffusif auquel seul Cu2+ libre contribue. La droite en pointillés représente la simulation tenant compte d’une contribution au flux diffusif de Cu2+ libre et de 0,4 % des complexes organiques de Cu présents en solution. Les ligands organiques proviennent de l’exsudation racinaire (D’après Degryse et al. 2008).


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Figure 31. pH (a), concentration en carbone organique dissous (COD) (b), cuivre (Cu) total en solution (c) et Cu à l’interface sol-DGT (CDGT) (d) dans le bulk soil et la rhizosphere du maïs (Zea mays L.). La mesure DGT a été réalisée sur 24 h (D’après Cattani et al. 2006). III.4. Modélisation numérique de la biodisponiblité : approche Barber-Cushman

La modélisation numérique (semi-) mécaniste est la démarche la plus aboutie dans la formalisation des phénomènes majeurs impliqués dans le déterminisme de la biodisponibilité environnementale des métaux pour les plantes. Il s’agit également de la démarche la plus complexe et, à ce jour, seulement quatre études ont cherché à modéliser le prélèvement des métaux par des plantes cultivées en sols contaminés (Mullins et al. 1986 ; Sterckeman et al. 2004 ; Seuntjens et al. 2004 ; Puschenreiter et al. 2005). Cette démarche de modélisation est généralement basée sur l’approche Barber-Cushman qui se caractérise par trois modules : (i) un module de croissance racinaire intégrant le calcul du prélèvement d’eau pour l’évaluation du flux d’advection (mass-flow) du métal en solution vers la racine, (ii) un module de prélèvement du métal par la plante basé sur la loi cinétique de Michaelis-Menten et (iii) un module simulant le réapprovisionnement du métal en solution par désorption depuis la phase solide et sa diffusion à travers la porosité du sol (Barber 1995). L’interconnexion de ces trois modules permet d’évaluer les contributions respectives des flux d’advection, de prélèvement et de réapprovisionnement du métal et donc de déterminer les processus limitant la biodisponibilité environnementale du métal. Trois cas de figures sont envisageables et ont pour conséquence des profils différents de concentration de métal en solution en fonction de la distance à la surface des racines (Figure 32) (Jaillard et al. 2000). Lorsque le flux de prélèvement est du même ordre de grandeur que la somme des flux d’advection et de réapprovisionnement, la concentration de métal en solution reste identique à l’état initial, i.e. constante depuis le bulk soil jusqu’à la surface racinaire (Figure 32, cas a). Ce cas de figure correspond à l’hypothèse majeure faite dans le cadre du FIAM et du TBLM, qui considère le système sol-plante comme étant à l’équilibre. Lorsque le flux de prélèvement est nettement inférieur au flux d’advection, une accumulation du métal en solution est alors observée (Figure 32, cas b). Dans ce cas de figure, la biodisponibilité environnementale est limitée par la cinétique de prélèvement du métal par la plante. Enfin, lorsque le flux de prélèvement est nettement supérieur à la somme des flux d’advection et de réapprovisionnement, un profil d’appauvrissement de la concentration de métal en solution est observé (Figure 32, cas c). Dans ce cas de figure, la biodisponibilité environnementale est limitée par la capacité du sol à réapprovisionner le métal en solution à la surface de la racine.


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Figure 32. Profils de concentration totale en métal ou d’activité de métal libre dans la solution du sol en fonction de la distance à la surface racinaire. Dans le cas a, la concentration reste invariante entre le bulk soil et la rhizosphère, i.e. le flux de prélèvement est égal au flux de métal vers la racine par advection et diffusion. Dans le cas b, l’accumulation de métal en solution à la surface de la racine est due au flux d’advection qui est supérieur au flux de prélèvement par la plante. Dans le cas c, la concentration en métal diminue à la surface racinaire car le flux de prélèvement est supérieur au réapprovisionnement par advection-diffusion dans le sol (D’après Jaillard et al. 2000). Cette approche a été appliquée au prélèvement de Cd et Zn par une plante cultivée, le maïs, et une plante hyperaccumulatrice, Thlaspi caerulescens L., cultivées en sols contaminés (Mullins et al. 1986 ; Sterckeman et al. 2004). Dans ces deux études, les prélèvements mesurés au cours d’expériences en vase de végétation ont pu être reproduits raisonnablement bien par le modèle, en l’absence de phénomène de phytotoxicité et moyennant l’ajustement de certains paramètres majeurs comme le pouvoir tampon du sol (Figure 33.a). La surestimation importante du flux de prélèvement par le modèle pour les plantes présentant des symptômes de phytotoxicité a suggéré la mise en place d’une régulation physiologique du prélèvement du métal par la plante dans les sols les plus contaminés (Sterckeman et al. 2004). L’analyse de sensibilité des paramètres d’entrées du modèle a permis d’estimer les paramètres prépondérants dans la biodisponibilité environnementale (Figure 33.b). Mullins et al. (1986) ont montré que le prélèvement simulé était particulièrement sensible à la croissance racinaire, au prélèvement d’eau et à la concentration initiale de Zn et Cd en solution, suggérant une participation importante du flux d’advection du métal au flux de prélèvement. Cependant, la très faible sensibilité du prélèvement simulé aux paramètres cinétiques de prélèvement (Fmax, KM) a suggéré un profil d’appauvrissement de la concentration de métal en solution dans la rhizosphère. L’analyse de sensibilité réalisée sur les données de Sterckeman et al. (2004) a montré que le prélèvement simulé de Cd était très largement dépendant des paramètres de réapprovisionnement de Cd en solution (concentration initiale en solution Cli, pouvoir tampon b et coefficient de diffusion effectif De), suggérant un appauvrissement marqué de la concentration de Cd en solution à la surface des racines. Ainsi, dans ces deux études, la biodisponibilité du métal semble principalement dépendre des contraintes cinétiques du réapprovisionnement du métal en solution par le sol. Cependant, aucune vérification expérimentale de la mise en place de tels gradients de concentration dans la rhizosphère n’a été réalisée par ces auteurs. D’autre part, cette approche est fondée sur de nombreuses hypothèses simplificatrices et en particulier : (i) elle ne tient pas compte de la spéciation des métaux dans la solution du sol et décrit l’interaction phase solide-solution par un simple coefficient de partitionnnement, (ii) elle ne considère pas les processus rhizosphèriques tels que l’excrétion de H+/OH- ou l’exsudation de ligands organiques et (iii) le prélèvement de


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métal par la plante est calculé en fonction de la concentration totale de métal en solution, sans prendre en compte la spéciation et notamment l’activité du métal libre (Jaillard et al. 2000). Puschenreiter et al. (2005) ont présenté la seule étude comparant la mesure et la simulation basée sur l’approche Barber-Cushman du gradient de concentration de Ni en solution dans la rhizosphère d’une plante hyperaccumulatrice (Thlaspi goesingense L.). Ils ont intégré dans l’approche numérique un calcul de la spéciation de Ni en solution et ont relié la cinétique de prélèvement de Ni à l’activité de Ni2+ libre en solution. Alors que le modèle a prédit un appauvrissement systématique de Ni en solution en dépit de l’ajustement des paramètres d’entrée, l’approche expérimentale a pour sa part révélé une accumulation de Ni en solution à la surface de la racine d’un facteur 2 par rapport au bulk soil. Cette différence a été attribuée à l’exsudation d’anions organiques dans la rhizosphère qui aurait réduit la capacité de la phase solide du sol à adsorber Ni.

Figure 33. Modélisation du prélèvement de cadmium (Cd) chez le maïs (Zea mays L.) par l’approche Barber-Cushman. Prélèvement simulé en fonction du prélèvement mesuré (a) sur des plantes cultivées pendant 24 jours en sols contaminés. Les données exclues de la régression correspondent aux plantes présentant des symptômes de phytotoxicité. Analyse de sensibilité (b) du prélèvement simulé en fonction des paramètres d’entrée du modèle : Cli , concentration totale initiale de Cd en solution, L, longueur du système racinaire à la récolte, b, capacité de la phase solide du sol à réapprovisionner Cd en solution (pouvoir tampon), r0, rayon racinaire moyen, De, coefficient effectif de diffusion de Cd dans le sol, Imax, flux maximal de prélèvement de Cd par la plante, v0, flux de prélèvement d’eau par la plante et, Km, concentration de Cd en solution correspondant à Imax / 2. La courbe De – Cli – b représente la réponse du modèle à la modification d’un de ces trois paramètres qui sont inter-reliés (D’après Sterckeman et al. 2004). L’importance d’une meilleure caractérisation de la spéciation des métaux dans le sol ainsi que des modifications chimiques induites par la plante dans la rhizosphère a également été soulignée par Seuntjens et al. (2004). Ces auteurs ont montré, sans confirmation expérimentale cependant, que l’introduction dans le sol de ligand organique à fort pouvoir complexant tel que l’EDTA ou d’exsudats racinaires comme l’oxalate est capable de fortement modifier la disponibilité de Cu et sa mobilité dans le sol ainsi que sa biodisponibilité pour la plante.


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IV. Biodisponibilité toxicologique du cuivre pour les végétaux supérieurs Le cuivre est un oligo-élément pour la plante dont la principale fonction physiologique est de permettre les transferts d’électrons en tant que cofacteur au niveau d’enzymes de types oxydases (Marschner 1995). Cependant, lorsqu’il est présent en concentration élevée dans le sol et que sa biodisponibilité environnementale devient importante, Cu peut devenir phytotoxique, i.e. biodisponible d’un point de vue toxicologique. Nous allons voir que la phytotoxicité de Cu peut se manifester dans différents organes de la plante et qu’elle est également dépendante de la disponiblité de Cu dans le milieu. IV.1. Rhizotoxicité

Une des principales voies d’exposition des plantes dans les sols contaminés par les métaux correspond au contact des racines avec la solution du sol : les racines sont ainsi le premier organe du végétal exposé aux métaux. Nous avons vu dans la partie précédente que les métaux, et en particulier Cu, présentaient une très forte affinité pour les groupements carboxyliques portés par l’apoplasme racinaire et qu’ils avaient donc tendance à s’accumuler dans ce compartiment (Iwasaki et al. 1990). L’accumulation racinaire des métaux est favorable à l’apparition de phénomènes de rhizotoxicité qui se traduisent par une coloration brunâtre et un épaississement des racines, une diminution de l’élongation racinaire ainsi qu’une augmentation de la ramification (Figure 34.a) (Lexmond et van der Vorm 1981 ; Panou-Filotheou et Bosabadilis 2004 ; Kopittke et Menzies 2006, Kopittke et al. 2007a, b). Ces symptômes sont principalement attribués à la rigidification des parois cellulaires par l’adsorption massive des métaux qui prennent la place de Ca dans l’apoplasme, en particulier au niveau de la zone d’élongation. Cette rigidité de l’apoplasme freine l’élongation racinaire et peut provoquer des ruptures au niveau des cellules du rhizoderme et du cortex externe qui seraient dues à des vitesses de croissance différentes entre les cellules des cortex internes et externes (Figure 34.d, e) (Kopittke et al. 2008). Bien qu’une augmentation de la ramification soit observée, ces nouvelles racines s’allongent peu, voire avortent avant d’avoir percé le rhizoderme en formant des zones de renflement principalement localisées au niveau sub-apical (Figure 34.b, c) (Kopittke et al. 2007a, Pb).

Figure 34. Rhizotoxocité de l’aluminium (Al), du cuivre (Cu) et du plomb (Pb) sur des racines du niébé (Vigna unguiculata L.) cultivé en solution nutritive : (a) système racinaire exposé pendant 14 jours à 2,7 µM de Cu2+ à pH 4,5, (b) apex d’une racine latérale de (a), (c) détail du renflement au niveau de la zone sub-apicale d’une racine primaire exposée pendant 13 jours à 1,6 µM de Pb2+, (d) surface d’une racine exposée pendant 24 h à 1,1 µM Cu à pH 5,6 et (e) détail du rhizoderme et du cortex externe d’une racine exposée pendant 7 jours à 68 µM Al. Les observations ont été réalisées en microscopie optique (b, c) après coloration au cristal violet (b) ou au bleu de toluidine (c) et en microscopie haute résolution SEM (d, e) (D’après Kopittke et Menzies 2006, Kopittke et al. 2007a, b, 2008).


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Ces symptômes ont été observés pour de nombreux métaux et sont similaires à la rhizotoxicité provoquée par Al, telle qu’elle se manifeste naturellement en sols acides (Kopittke et al. 2008). Du fait de son affinité particulièrement importante pour les ligands organiques, Cu s’accumule très fortement dans l’apoplasme racinaire et semble être l’un des cations métalliques les plus rhizotoxiques (Kinraide et al. 2004). De surcroît, une exposition prolongée à Cu affecte la formation des poils racinaires, ce qui pourrait expliquer la très forte sensibilité de la nodulation à Cu chez les légumineuses (Sheldon et Menzies 2005 ; Kopittke et al. 2007b). Certains auteurs attribuent également la rhizotoxocité de Cu à une perturbation de la division et de l’élongation des cellules au niveau intracellulaire (Panou-Filotheou et Bosabadilis 2004).

Figure 35. Longueur racinaire relative (LRR) du blé tendre (Triticum aestivum L.) cultivé en hydroponie en fonction de l’exposition des racines au cuivre (Cu), exprimée comme la concentration de Cu2+ libre en solution (a), l’activité de Cu2+ libre en solution (b), l’activité de Cu2+ à la surface des membranes plasmiques des cellules racinaires (c) ou la quantité de Cu adsorbé sur les membranes plasmiques des cellules racinaires par unité de surface (d) (D’après Kinraide et al. 2004). L’importance de l’effet rhizotoxique des métaux a conduit à utiliser le critère d’élongation racinaire comme un indicateur de phytotoxicité ou biodisponibilité toxicologique (Parker 1995 ; Thakali et al. 2006 ; Zhao et al. 2006). Tout comme l’accumulation des métaux dans le compartiment apoplasmique, l’élongation racinaire dépend de l’exposition des racines à Cu, i.e. de l’activité de Cu2+ en solution, et également des différents cations présents en solution, en particulier H+, Al3+, Ca2+ et Mg2+, qui peuvent rentrer en compétition avec Cu2+ pour l’adsorption dans l’apoplasme (Figure 35) (Fortunati et al. 2005 ; Thakali et al. 2006 ; Luo et al. 2008). Ainsi, Kinraide et al. (2004) ont montré que la quantité de Cu adsorbé à la surface des membranes plasmiques des cellules racinaires était un paramètre beaucoup plus pertinent que l’activité de Cu2+ en solution pour expliquer les variations d’élongation racinaire chez le blé tendre exposé à Cu en hydroponie, car ce paramètre tient compte des interactions entre cations compétiteurs en accord avec le TBLM. La prise en compte des cations compétiteurs, en particulier de H+, a permis à Thakali et al. (2006) d’améliorer la prédiction de l’élongation racinaire de l’orge cultivée dans des sols contaminés en Cu et de propriétés physico-chimiques variées par rapport aux prédictions basées sur la concentration totale en Cu dans le sol ou l’activité de Cu2+ libre dans la solution du sol (FIAM) (Figure 36). La rhizotoxicité potentielle de Cu, exprimée au travers de l’activité de Cu2+ libre dans la solution du sol entraînant une diminution d’un pourcentage x de l’élongation racinaire (concentration effective x, ECx), est ainsi apparue comme linéairement et positivement corrélée au pH du sol (Thakali et al. 2006 ; Zhao et al. 2006). Quelques auteurs ont également tenté d’évaluer la biodisponibilité toxicologique associée à des phénomènes de rhizotoxicité au travers des concentrations en Cu dans les racines. Michaud et al. (2008) ont déterminé un seuil de 100-150 mg Cu kg-1 dans les racines, en incluant le compartiment apoplasmique, pour une rhizotoxicité modérée (EC10) et un seuil de


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250-300 mg Cu kg-1 pour une rhizotoxicité importante (EC50). Cependant, ces auteurs ont également souligné la difficulté d’évaluer les concentrations en Cu dans les racines de plantes prélevées in situ.

Figure 36. Elongation racinaire relative (ERR) prédite en fonction du ERR mesurée chez l’orge (Hordeum vulgare L.) exposée à des sols présentant des niveaux de contaminations en cuivre (Cu) et des propriétés physico-chimiques variés. Les prédictions du ERR sont basées sur la concentration totale en Cu des sols (a), l’activité de Cu2+ libre dans le solution du sol (FIAM) (b) et l’adsorption de Cu2+ dans l’apoplasme racinaire pondérée par le pH du sol (TBLM) (c) (D’après Thakali et al. 2006). IV.2. Stress oxydatifs et génotoxicité

La phytotoxicité de Cu peut également intervenir dans l’ensemble des tissus végétaux au niveau intracellulaire. Les concentrations de Cu2+ ou Cu+ libre dans le milieu intracellulaire sont normalement maintenues à des niveaux très bas par chélation avec des ligands organiques (Clemens 2001). Cependant, lorsque ces concentrations augmentent du fait d’un influx trop important, le métal libre peut activer la formation de radicaux libres produits à partir de O2 (Briat et Lebrun 1999 ; Yruela 2005 ; Puig et al. 2007). Lorsque ces radicaux libres s’accumulent dans les cellules, ils engendrent des stress oxydatifs conduisant notamment à la peroxydation des membranes lipidiques et par suite d’une perte de l’intégrité membranaire, à la dégradation de certaines protéines et à l’altération de l’ADN (Briat et Lebrun 1999). Les métaux peuvent également provoquer des phénomènes de génotoxicité en modifiant la structure des bases azotées de l’ADN. IV.3. Phytotoxicité au niveau des parties aériennes : induction de déficiences

Comme dans le cas de la rhizotoxicité, la phytotoxicité de Cu au niveau des parties aériennes des plantes peut provoquer une diminution globale de la biomasse. La phytotoxicité de Cu semble également se traduire par l’apparition de déficiences en cas d’exposition à des niveaux très élevés de Cu2+ libre (> 1 µM). Sheldom et Menzies (2005), Kopittke et Menzies (2006) et Kopittke et al. (2007b) ont rapporté des diminutions significatives des concentrations en Ca, Fe, K, Mg, Mn et Zn dans les parties aériennes d’une plante pourtant tolérante à Cu, Chloris gayana Knuth., et du niébé. Des décolorations internervaires, synonymes de chlorose ferrique, ont également été observées. L’origine exacte de ces phénomènes de déficiences n’est pas connue précisément. Cependant, l’apparition simultanée de déficiences multiples laisse penser qu’il s’agit d’une conséquence de l’altération de la croissance et des structures du système racinaire, i.e. de la rhizotoxicité (Panou-Filotheou et Bosabadilis 2004 ; Sheldom et Menzies 2005 ; Kopittke et Menzies 2006 ; Kopittke et al. 2007b). Dans le cas particulier des plantes de stratégie II, l’induction d’une déficience en Fe lors d’une forte exposition à Cu pourrait être due à un mécanisme plus spécifique, impliquant la perturbation par Cu2+ du rôle complexant des phytosidérophores vis-à-vis de Fe3+ ou un antagonisme Fe-Cu au niveau des transporteurs des complexes formés par les phytosidérophores avec ces deux métaux (Ma et Nomoto 1993 ; Michaud et al. 2008). McBride (2001) a observé l’apparition de symptômes de chlorose ferrique associés à une diminution de la concentration en Fe et une augmentation de


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la concentration en Cu dans les parties aériennes du maïs cultivé sur une tourbe amendée avec des doses croissantes de sels de Cu. Ces résultats suggèrent un possible antagonisme Fe-Cu au niveau de l’absorption racinaire et/ou de la translocation des racines vers les parties aériennes (Figure 37).

Figure 37. Variation des concentrations en cuivre (Cu) et en fer (Fe) dans les parties aériennes du maïs (Zea mays L.) cultivé dans une tourbe ayant reçu des apports croissants de CuSO4 (D’après McBride 2001). De nombreux auteurs ont proposé d’évaluer la biodisponibilité toxicologique de Cu au travers des concentrations en Cu dans les parties aériennes des plantes. Le seuil de 15 à 25 mg Cu kg-

1 semble pourvoir être considéré comme correspondant à l’apparition de symptômes de phytotoxicité (décoloration internervaire, diminution de biomasse) (Davis et Beckett 1978 ; Michaud et al. 2008). Cependant, ce seuil est peu différent des concentrations en Cu permettant une croissance et un développement adéquats des plantes et semble donc être un indicateur peu sensible pour évaluer la biodisponibilité toxicologique. D’autres indicateurs comme des réponses biochimiques induites par l’activité phytotoxique de Cu dans les parties aériennes des plantes, e.g. quantification des stress oxydatifs, pourraient être plus adaptés (e.g. Mocquot et al. 1996).


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V. Méthodes et outils pour l’évaluation de la biodisponibilité des métaux pour les plantes Au-delà de la compréhension des mécanismes physico-chimiques et physiologiques qui contrôlent le prélèvement des métaux par les plantes, des outils opérationnels doivent être mis au point pour permettre l’évaluation des biodisponibilités environnementale et toxicologique. Deux types d’approche sont généralement utilisés : (i) une approche chimique basée sur l’évaluation de la disponibilité des métaux dans le sol et (ii) une approche biologique basée sur l’évaluation de la biodisponibilité environnementale ou toxicologique (Figure 1) (Lanno et al. 2004 ; ISO 2006). Quelle que soit l’approche utilisée, les outils développés doivent répondre aux critères suivants : (i) être basés sur des hypothèses mécanistes permettant d’en déterminer les limites d’application et (ii) être à la fois simples d’utilisation et économiques. V.1. Mesures chimiques basées sur la disponibilité environnementale des métaux

La démarche la plus classique consiste à corréler l’accumulation des métaux dans la plante ou leur effet phytotoxique à la quantité des différents constituants et aux principales propriétés physico-chimiques du sol, à l’aide de régressions linéaires multiples (Peijnenbrug et al. 1997) : log10(M plante) = α pH + β log10(Total M) + γ log10(MOS) + λ log10(Oxydes) + δ (13) Cette approche nécessite cependant la détermination systématique de nombreux paramètres du sol qui, par ailleurs, doivent être linéairement corrélés à la variable écotoxicologique. De nombreux auteurs ont donc cherché à développer des paramètres plus intégrateurs. En accord avec le FIAM, l’activité du métal libre peut-être corrélée à une réponse phytotoxique telle que le pourcentage de réduction de l’élongation racinaire (Sauvé et al. 1998a ; McBride 2001). Les compétitions entre cations pour l’adsorption dans l’apoplasme racinaire et leur conséquence écotoxicologique peuvent être prises en compte par l’effet du pH du sol dans le cadre du TBLM (Lofts et al. 2004 ; Thakali et al. 2006 ; Zhao et al. 2006). Cette approche nécessite la mesure ou l’estimation de l’activité du métal libre en solution. Une mesure simple de l’activité de métal libre ne semble être possible que pour Cu, métal pour lequel il existe des électrodes sélectives suffisamment spécifiques (Sauvé et al. 1995 ; Vulkan et al. 2000). Pour les autres métaux, l’activité de la forme libre en solution peut être estimée à partir de régressions linéaires multiples reliant l’activité du métal libre à divers paramètres du sol prépondérants dans le déterminisme de la spéciation du métal en solution (Sauvé et al. 1997 ; Sauvé et al. 1998b ; Sauvé et al. 2000). Dans ce dernier cas, la capacité des équations à prédire l’activité du métal libre dans des sols présentant des propriétés physico-chimiques variées doit être vérifiée. Des extractions chimiques « sélectives » pratiquées seules ou en séquence peuvent également être utilisées. Certains auteurs ont ainsi réussi à relier les concentrations de métal extrait aux concentrations de métal dans la plante. Les extractions à base de sels neutres non tamponnés, e.g. CaCl2, ou basées sur le pouvoir complexant de ligands organiques synthétiques, e.g. EDTA, semblent permettre une évaluation raisonnable de la biodisponibilité environnementale des métaux (Gupta et Aten 1993 ; Chaignon et al. 2003 ; Fang et al. 2007 ; Menzies et al. 2007). Cependant, ces méthodes d’extractions ne reposent pas toujours sur des hypothèses mécanistes claires et leur domaine d’application est en conséquence rarement délimité.


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En accord avec l’hypothèse d’une contrainte cinétique au réapprovisionnement du métal en solution, différentes techniques ont été mises au point. La méthode des extractions cinétiques permettant de déterminer le pool labile de métal dans le sol a été utilisée avec un relatif succès pour estimer la concentration en Pb dans les parties aériennes du blé, mais n’a pas permis d’évaluer la biodisponibilité de Cd (Bermond et al. 2005). De plus, cette méthode nécessite de réaliser plusieurs extractions sur un même échantillon de sol et semble donc peu pratique pour des mesures de routine. La mesure DGT a, quant à elle, montré sa capacité à prédire les concentrations en Cu et Zn dans différents types de plantes (cultivées, tolérantes, hyperaccumulatrices) (Figure 26) (Zhang et al. 2001, 2004 ; Zhao et al. 2006). D’autre part, son fondement mécaniste devrait permettre d’en limiter l’utilisation aux plantes pour lesquelles la biodisponibilité est majoritairement limitée par la cinétique de réapprovisionnement du métal en solution. Quelles que soient les méthodes choisies, celles-ci restent des mesures de la disponibilité des métaux dans le sol. Leur lien avec la biodisponibilité environnementale ou toxicologique des métaux pour les plantes doit donc être clairement établi à la fois par validations ex- et in-situ, ce qui est cependant rarement le cas (ISO 2006). V.2. Mesures biologiques basées sur la biodisponibilité des métaux

Cette approche présente l’avantage d’être basée sur des mesures biologiques qui sont donc, dans une certaine mesure, capables d’intégrer les processus physico-chimiques et métaboliques régulant la biodisponibilité des métaux pour les plantes. Ces méthodes utilisant l’organisme vivant comme senseur de la contamination de l’environnement, i.e. biosenseur, regroupent des mesures pratiquées depuis l’échelle moléculaire jusqu’à celle de la communauté (Bontidean et al. 2004 ; ISO 2006). V.2.1. Tests biochimiques aux échelles moléculaire et cellulaire Les tests biochimiques sont basés sur des réponses spécifiques du métabolisme des organismes vivants. A l’échelle moléculaire, des changements dans l’activité de certaines enzymes peuvent être détectés et reliés au niveau de contamination du milieu (Bontidean et al. 2004). Ces mesures d’activités enzymatiques, e.g. peroxydase, peuvent être directement réalisées sur le matériel végétal (van Assche et al. 1998 ; Bontidean et al. 2004). Dans ce cas, ces tests présentent l’avantage de pouvoir être pratiqués sur les plantes directement récoltées in situ. D’autres tests biochimiques, réalisés ex situ, sont basés sur l’activité d’enzymes produites et exsudées par des bactéries, e.g. la β-galactosidase chez Escherichia coli (Bitton et al. 1994, 1996). Boularbah et al. (1996) ont mesuré l’inhibition de l’activité de cette enzyme qui a pu être reliée à la concentration en Cd et Zn dans les parties aériennes du ray-grass. Des biosenseurs microbiens ont également été mis au point. Ces tests sont basés sur l’activation par les métaux de gènes bactériens induisant, par construction génétique (organismes génétiquement modifiés) la production de molécules fluorescentes (Rensing et Maier 2003). La réponse de ces bactéries bioluminescentes a par exemple pu être reliée au niveau de contamination des sols en mercure (Bontidean et al. 2004), au coefficient de partitionnement solide-solution de Cu et Zn (Dawson et al. 2006) ou encore à l’activité de Cu2+ libre en solution (Vulkan et al. 2000). La validation de ces tests biochimiques reste malgré tout limitée dans la plupart des cas. Par ailleurs, il semble difficile de pouvoir rendre compte de la diversité des mécanismes mis en jeu par les plantes pour réguler les biodisponibilités environnementale et toxicologique des métaux à travers l’activité de quelques enzymes ou la bioluminescence de quelques bactéries.


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V.2.2. Tests sur plantes entières Plusieurs tests biologiques, i.e. biotests, basés sur la plante entière ont été mis au point et, dans certains cas, normalisés (ISO 1993 ; ISO 1995 ; An 2004). Les plantes sont cultivées en pot en présence de sol. Les paramètres mesurés concernent généralement la diminution du pourcentage de germination des graines, de l’élongation racinaire, des biomasses des parties aériennes et racinaires ainsi que la concentration en métal dans les parties végétales. Les protocoles sont généralement simplifiés au maximum et adaptés pour faciliter la réalisation des mesures. Les mesures d’élongation racinaire et de biomasses des parties aériennes ont été reliées à des concepts mécanistes (TBLM) qui ont permis de formaliser les principaux déterminants de la biodisponibilité toxicologique (Thakali et al. 2006 ; Zhao et al. 2006). Lorsque la germination et/ou l’élongation racinaire sont étudiées, les mesures sont effectuées sur des temps d’exposition de seulement quelques jours (An 2004, 2006 ; Rooney et al. 2006, 2007 ; Zhao et al. 2006). Dans ce cas, le résultat obtenu ne peut refléter que la biodisponibilité toxicologique des métaux à court terme pour de jeunes plantules de quelques jours. Lorsque le temps de culture est de plusieurs semaines, la récupération propre et complète du système racinaire devient laborieuse, en particulier pour un test devant être réalisé en routine. La mesure des concentrations en métaux dans les plantes entières, système racinaire compris, nécessite un lavage soigné des racines pour éviter leur contamination par des particules de sol (Brun et al. 2001). En incluant une procédure de lavage, certains auteurs ont malgré tout suspecté une contamination des racines cultivées en pot par des particules de sol (Ginocchio et al. 2002). D’autre part, même lorsque les concentrations en métal sont mesurées dans les parties aériennes et racinaires, la biodisponiblité environnementale est rarement exprimée sous forme de flux, qui est pourtant la seule mesure intégrant explicitement le facteur temps (Harmsen et al. 2005). La plupart des données disponibles dans ce domaines sont issues d’expérimentations réalisées à partir de sols contaminés artificiellement au laboratoire (An 2004, 2006 ; Rooney et al. 2006, 2007 ; Zhao et al. 2006). Bien que cette procédure permette d’évaluer l’effet du niveau de contamination des sols en maintenant les autres propriétés physico-chimiques constantes, elle induit généralement une surestimation des biodisponibilités environnementale et toxicologique par rapport à leur évaluation sur des sols historiquement contaminés (Smolders et al. 2003 ; Ali et al. 2004 ; Zhang et al. 2004 ; Rooney et al. 2007). Enfin, bien que ces biotests soient en principe adaptables à de nombreuses espèces végétales, ils sont généralement appliqués sur quelques espèces cibles, sans même préciser la variété utilisée, y compris dans les processus standardisées de l’ISO (1993, 1995). Il convient de se demander si le comportement de ces quelques espèces-cibles est représentatif de la diversité rencontrée chez les végétaux supérieurs, ou au contraire spécifique des mécanismes mis en jeu dans la régulation de la biodisponibilité des métaux par les espèces considérées (Harmsen et al. 2005).


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VI. Objectifs et stratégie de recherche VI.1. Hypothèse de base

L’analyse de l’état de l’art montre que les différents équilibres chimiques qui régulent le partitionnement solide-solution et la spéciation des métaux dans le sol sont relativement bien connus. Les propriétés physico-chimiques du sol telles que le niveau de contamination, le pH et les matières organiques du sol sont apparus comme des déterminants majeurs de la disponibilité des métaux dans les sols. En revanche, la capacité du sol à réapprovisionner le métal libre en solution, notamment du point de vue cinétique, est moins bien identifiée et le nombre de méthodes disponibles pour l’étudier plus limité. De fait, la biodisponibilité des métaux pour les plantes a principalement été évaluée à travers la description des équilibres chimiques dans le sol. Pourtant, de nombreux résultats suggèrent que le prélèvement des métaux pouvait être contraint par un réapprovisionnement limité des métaux en solution par le sol. Pour évaluer la pertinence de cette hypothèse, une première approche consiste à comparer le flux de prélèvement potentiel du métal par la plante et le flux potentiel de réapprovisionnement du métal par le sol. Cependant, si des méthodes sont disponibles pour étudier le réapprovisionnement de Cu dans le sol sous l’effet d’un puits (e.g. méthode DGT), il n’existe à l’heure actuelle aucune mesure fiable du flux de prélèvement de Cu par les plantes. De plus, il semble vraisemblable que l’efflux de H+/OH- ou de ligands organiques dans la rhizosphère sous l’effet des activités racinaires soit en mesure de profondément modifier les conditions physico-chimiques à l’interface sol-racine et, en conséquence, la disponibilité de Cu. Dans ce contexte, l’hypothèse centrale de mes travaux est donc la suivante : les processus rhizosphériques, i.e. le flux de prélèvement, le réapprovisionnement de Cu en solution et les modifications chimiques dans la rhizosphère, sont des déterminants majeurs de la biodisponibilité de Cu pour les plantes. VI.2. Objectifs

L’objectif général de la thèse est donc de mettre en évidence le ou les processus rhizosphérique(s) majeur(s) qui contrôle(nt) la disponiblité de Cu dans la rhizosphère et sa biodisponibilité environnementale pour le blé dur. Mes travaux étant principalement focalisés sur l’étude de la biodisponibilité environnementale, celle-ci sera dénommée par simplification « biodisponibilité » dans la suite du manuscrit. D’une part, il s’agit d’évaluer les conséquences d’une limitation du réapprovisionnement de Cu en solution sur la biodisponiblité de Cu. Pour cela, il va s’avérer nécessaire de : (i) caractériser fonctionnellement le prélèvement de Cu en déterminant les paramètres cinétiques Fmax et KM spécifiques au blé dur, (ii) estimer le flux de réapprovisionnement de Cu en solution sous l’effet d’un puits, (iii) déterminer les conditions physico-chimiques du sol (niveau de contamination et pH notamment) favorables à l’apparition d’une limitation du flux de prélèvement par le réapprovisionnement de Cu en solution.


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D’autre part, il s’agit également d’identifier les modifications chimiques potentiellement induites par les racines dans la rhizosphère et de caractériser leur rôle dans le déterminisme de la biodisponibilité de Cu pour le blé dur. Je m’intéresserai donc principalement : (i) aux modifications du pH dans la rhizosphère, i.e. alcalinisation et acidification, (ii) aux modifications quantitative et qualitative des MOD dans la rhizosphère, i.e. concentration, propriétés de complexation vis-à-vis de Cu et labilité des complexes organiques de Cu ainsi formés en solution, (iii) à l’identification des modifications chimiques prépondérantes en fonction des propriétés physico-chimique du sol et en particulier du pH du bulk soil. VI.3. Approche expérimentale

L’analyse de la littérature montre que les résultats obtenus en conditions contrôlées sont rarement validés par des études in situ. Il est donc difficile d’évaluer la pertinence des processus identifiés comme prépondérants dans le déterminisme de la biodisponibilité des métaux pour les plantes. Dans le cadre de cette étude, la biodisponibilité sera premièrement évaluée au terrain sur une large gamme de sols présentant des propriétés physico-chimiques (pH et niveau de contamination en particulier) variées (chapitre 2.I). La suite des expérimentations sera menée au laboratoire en conditions contrôlées, en utilisant principalement le biotest précédemment développé par Chaignon et Hinsinger (2003) puis Michaud (2007). Ce dispositif présente l’avantage de permettre une récolte facilitée à la fois des racines et de la rhizosphère qui sont séparées physiquement. Il permet donc une meilleure caractérisation de la biodisponibilité et des processus rhizosphériques impliqués. Dans un premier temps, ce biotest sera confronté aux résultats obtenus in situ pour en valider son utilisation (chapitre 2.II). Le prélèvement de Cu par le blé dur sera étudié au travers d’une expérimentation en hydroponie, puis sera comparé aux flux de réapprovisionnement de Cu en solution mesurés à l’aide de la technique DGT (chapitre 3). Ensuite, le biotest sera utilisé pour caractériser la biodisponibilité de Cu pour le blé dur en fonction de l’apport de matières organiques (chapitre 4.I) et du pH du sol, manipulé par chaulage (chapitre 4.II). Dans ces deux expérimentations, les éventuelles modifications de pH et de concentration en MOD dans la rhizosphère seront mesurées de manière à caractériser l’impact de ces modifications chimiques induites par les racines sur la biodisponibilité de Cu pour le blé dur, en lien avec les propriétés physico-chimiques du bulk soil. Dans le dernier chapitre, la disponibilité de Cu dans la rhizosphère sera plus particulièrement étudiée à l’aide de différentes techniques de spéciation appliquées à la rhizosphère et au bulk soil (dispositif sans plante) (chapitre 5.I). Pour permettre l’étude de la spéciation et de la labilité en solution dans la rhizosphère, j’ai fait le choix de collecter la solution du sol par extraction à l’aide d’une solution saline non tamponnée, et de mettre en œuvre des techniques potentiométrique et voltammétrique de caractérisation de la spéciation et de la labilité de Cu. Enfin, l’extension spatiale des gradients de concentration de Cu dans la rhizosphère sera étudiée à l’aide d’un dispositif adapté du biotest classique (chapitre 5.II), dans le but de hiérarchiser le rôle respectif des modifications chimiques induites par les racines et de la limitation du réapprovisionnement de Cu en solution dans le déterminisme de la biodisponibilité de Cu pour le blé dur.


54

Bibliographie Adriano D C 2001 Copper. In Trace elements in terrestrial environments, biogeochemistry, bioavailability, and

risks of metal, Ed D C Adriano. pp 499-546. Alexander M, Chaney R, Cunningham S J, Hughes J B and Harmsen J 2003 Chemical measures of

bioavailability. In Contaminated soils: from soil-chemical interaction to ecosystem management, Ed R Lanno. pp 345-362. SETAC-Publication.

Ali N A, Ater M, Sunahara G I and Robidoux P Y 2004 Phytotoxicity and bioaccumulation of copper and chromium using barley (Hordeum vulgare L.) in spiked artificial and natural forest soils. Ecotoxicology and Environmental Safety 57, 374-363.

Allan D L and Jarrell W M 1989 Proton and copper adsorption to maize and soybean root cell walls. Plant Physiology 89, 823-832.

Allen H E 1993 The significance of trace metal speciation for water, sediment and soil quality criteria and standards. Science of the Total Environment N°sup/93, 23-45.

Alloway B J 1995 Heavy metals in soils. Blackie academic and professional, London. 368 p. Amery F, Degryse F, Degeling W, Smolders E and Merckx R 2007 The copper-mobilizing-potential of dissolved

organic matter in soils varies 10-fold depending on soil incubation and extraction procedures. Environmental Science & Technology 41, 2277-2281.

An Y J 2006 Assessment of comparative toxicities of lead and copper using plant assay. Chemosphere 62, 1359-1365.

An Y J 2004 Soil ecotoxicity assessment using cadmium sensitive plants. Environmental Pollution 127, 21-26. Antunes P M C, Berkelaar E J, Boyle D, Hale B A, Hendershot W and Voigt A 2006 The biotic ligand model for

plants and metals: technical challenges for field application. Environmental Toxicology and Chemistry 25, 875-882.

Antunes P M C and Hale B A 2006 The effect of metal diffusion and supply limitations on conditional stability constants determined for durum wheat roots. Plant and Soil 284, 229-241.

Arias M, Pérez-Novo C, Osorio F, Lopez E and Soto B 2005 Adsorption and desorption of copper and zinc in the surface layer of acid soils. Journal of Colloid and Interface Science 288, 21-29.

Bagayoko M, Alvey S, Neumann G and Buerkert A 2000 Root-induced increases in soil pH and nutrient availability to field-grown cereals and legumes on acid sandy soils of Sudano-Sahelien West Africa. Plant and Soil 225, 117-127.

Baize D, Saby N and Deslais W 2007 Teneurs en huits éléments traces (Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb, Se, Zn) dans les sols agricoles en France - Résultats d'un collecte de données à l'échelon national. ADEME - Gis Sol - INRA. 86 p.

Baker D E and Senft J P 1995 Copper. In Heavy metals in soils, Ed B J Alloway. pp 179-205. Blackie A&P, London.

Barber S A 1995 Soil nutrient bioavailability: A mechanistic approach. John Wiley & Sons. 398 p. Benedetti M F, Milne C J, Kinniburgh D G, Van Riemsdijk W H and Koopal L K 1995 Metal-ion binding to

humic substances - application of the nonideal competitive adsorption model. Environmental Science & Technology 29, 446-457.

Benedetti M F, van Riemsdijk W H and Koopal L K 1996 Humic substances considered as a heterogeneous Donan gel pahse. Environmental Science & Technology 30, 1805-1813.

Bermond A and Varrault G 2004 Application of a kinetic fractionation of trace elements (Cd, Cu & Pb) in polluted soil samples. Environmental Technology 25, 293-300.

Bermond A, Varrault G, Sappin-Didier V and Mench M 2005 A kinetic approach to predict soil trace metal bioavailability: preliminary results. Plant and Soil 275, 21-29.

Bermond A P and Eustache S 1993 Hydroxylamine extraction of trace-metals in soils; kinetic aspects. Environmental Technology 14, 359-365.

Besnard E, Chenu C and Robert M 2001 Influence of organic amendments on copper distribution among particle-size and density fractions in Champagne vineyard soils. Environmental Pollution 112, 329-337.

Bitton G, Garland E, Kong I C, Morel J L and Koopman B 1996 A direct solid-phase assay specific for heavy metal toxicity. I. Methodology. Journal of Soil Contamination 5, 385-394.

Bitton G, Jung K and Koopman B 1994 Evaluation of a microplate assay specific for heavy metal toxicity. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 27, 25-28.

Bloom P R 1978 Exchange of hydrogen, aluminium and other metal ions in soil organic matter and acid soils. Ph.D diss. Cornell University.

Bolan N, Adriano D, Mani S and Khan A 2003 Adsorption, complexation, and phytoavailability of copper as infuenced by organic manure. Environmental Toxicology and Chemistry 22, 450-456.


55

Bontidean I, Mortari A, Leth S, Brown N L, Karlson U, Larsen M M, Vangronsveld J, Corbisier P and Csöregi E 2004 Biosensors for detection of mercury in contaminated soils. Environmental Pollution 131, 255-262.

Boularbah A, Morel J L, Bitton G and Mench M 1996 A direct solid-phase assay specific for heavy-metal toxicity. II. Assessment of heavy-metal immobilization in soils and bioavailability to plants. Journal of Soil Contamination 5, 395-404.

Bowen J E 1987 Physiology of genotypic differences in zinc and copper uptake in rice and tomato. Plant and Soil 99, 115-125.

Briat J F and Lebrun M 1999 Plant responses to metal toxicity. Compte-Rendu de l'Académie des Sciences 322, 43-54.

Brigante M, Zanini G and Avena M 2007 On the dissolution kinetics of humic acid particles - Effects of pH, temperature and Ca2+ concentration. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 294, 64-70.

Brun L, Maillet J, Hinsinger P and Pépin M 2001 Evaluation of copper availability to plants in copper-contaminated vineyard soils. Environmental Pollution 111, 293-302.

Brun L A, Maillet J, Richarte J, Herrmann P and Rémy J-C 1998 Relationships between extractable copper, soil properties and copper uptake by wild plants in vineyard soils. Environmental Pollution 102, 151-161.

Carrillo-Gonzalez R, Simunek J, Sauvé S and Adriano D 2006 Mechanisms and pathways of trace element mobility in soils. Advances in Agronomy 91, 111-178.

Cathala N and Salsac L 1975 Absorption du cuivre par les racines de maïs (Zea mays L.) et le tournesol (Helianthus annuus L.). Plant and Soil 42, 65-83.

Cattani I, Fragoulis G, Boccelli R and Capri E 2006 Copper bioavailability in the rhizosphere of maize (Zea mays L.) grown in two Italian soils. Chemosphere 64, 1972-1979.

Cavallaro N and McBride M B 1980 Activities of Cu2+ and Cd2+ in soil solutions as affected by pH. Soil Science Society of America Journal 44, 729-732.

Cetois A, Quesnoit M and Hinsinger P 2003 Soil copper mobility and bioavailability - a review. pp 110. INRA - Agro M.


Chaignon V, Bedin F and Hinsinger P 2002a Copper bioavailability and rhizosphere pH changes as affected by nitrogen supply for tomato and oil seed rape cropped on an acidic and a calcareous soil. Plant and Soil 243, 219-228.

Chaignon V, Di Malta D and Hinsinger P 2002b Fe-deficiency increases Cu acquisition by wheat cropped in a Cu-contaminated vineyard soil. New Phytologist 154, 121-130.

Chaignon V and Hinsinger P 2003 A biotest for evaluating copper bioavailability to plants in a contaminated soil. Journal of Environmental Quality, 32, 824-833.

Chaignon V, Quesnoit M and Hinsinger P 2008 Rhizosphere pH, bioavailability and extractability of Cu in an acidic Cu-contaminated soil as affected by liming. Environmental Pollution submitted.

Chaignon V, Sanchez-Neira I, Herrmann P, Jaillard B and Hinsinger P 2003 Copper bioavailability and extractability as related to chemical properties of contaminated soils from a vine-growing area. Environmental Pollution 123.

Clemens S 2001 Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis. Planta 212, 475-486. Cloutier-Hurteau B, Sauvé S and Courchesne F 2007 Comparing WHAM6 and MINEQL+4.5 for the chemical

speciation of Cu2+ in the rhizosphere of forest soils. Environmental Science & Technology 41, 8104-8110.

Cohen C K, Norvell W A and Kochian L V 1997 Induction of the root cell plasma membrane ferric reductase. An exclusive role for Fe and Cu. Plant Physiology 114, 1061-1069.

Cornell R M and Schwertmann U 2003 The iron oxides. Wiley, Weinheim. Darmawan and Wada S-I 1999 Kinetics of speciation of copper, lead, and zinc loeaded to soils that differ in

cation exchanger composition at low moisture content. Communications in Soil Science and Plant Analysis 30, 2363-2375.

Datta S P and Young D 2005 Predicting metal uptake and risk to the human food chain from leaf vegetables grown on soils amended by long-term application of sewage sludge. Water Air and Soil Pollution 163, 119-136.

Davis R D and Beckett P H T 1978 Upper critical levels of toxic elements in plants - II. Critical levels of copper in young barley, wheat, rape, lettuce and ryegrass, and of nickel and zinc in young barley and ryegrass. New Phytologist 80, 23-32.

Davison W and Zhang H 1994 In situ speciation measurements of trace components in natural waters using thin-film gels. Nature 367, 546-548.

Dawson J J C, Campbell C D, Towers W, Cameron C M and Paton G I 2006 Linking biosensor responses to Cd, Cu and Zn partitioning in soils. Environmental Pollution 142.


56

Degenhardt J, Larsen P B, Howell S H and Kochian L V 1998 Aluminium resistance in the Arabidopsis mutant alr-104 is caused by an aluminium-induced increase in rhizosphere pH. Plant Physiology 117, 19-27.

Degryse F, Smolders E and Merckx R 2006a Labile Cd complexes increase Cd availability to plants. Environmental Science & Technology 40, 830-836.

Degryse F, Smolders E and Parker D R 2006b Metal complexes increase uptake of Zn and Cu by plants: implications for uptake and deficiency studies in chelator-buffered solutions. Plant and Soil 289, 171-185.

Degryse F, Verma V K and Smolders E 2008 Mobilization of Cu and Zn by root exudates of dicotyledonous plants in resin-buffered solutions and in soil. Plant and Soil 306, 69-84.

Delas J 1963 La toxicité du cuivre accumulé dans les sols. Agrochimica 7, 258-288. Dudal Y and Gérard F 2004 Accounting for natural organic matter in aqueous chemical equilibrium models: a

review of the theories and applications. Earth-Science Reviews 66, 199-216. Dufey J E, Genon J G, Jaillard B, Calba H, Rufyikiri G and Delvaux B 2001 Cation exchange on plant roots

involving aluminium: experimental data and modelling. In Trace elements in the rhizosphere, Eds G R Gobran, W W Wenzel and E Lombi. pp 227-252. CRC Press, Baca Raton.

Ernstberger H, Davison W, Zhang H, Tye A and Young S 2002 Measurement and dynamic modeling of trace metal mobilization in soils using DGT and DIFS. Environmental Science & Technology 36, 349-354.

Fang J, Wen B, Shan X Q, Lin J M and Owens G 2007 Is an adjusted rhizosphere based-method valid for field assessment of metal phytoavailability? Application to non-contaminated soils. Environmental Pollution 150, 209-217.

Fangueiro D, Bermond A, Santos E, Carapuça H and Duarte A 2005 Kinetic approach to heavy metal mobilization assessment in sediments: choose of kinetic equations and models to achieve maximum information. Talanta 66, 844-857.

Filius J D, Lumsdon D G, Meeussen J C L, Hiemstra T and van Riemsdijk W H 2000 Adsorption of fulvic acid on goethite. Geochimica et Cosmochimica Acta 64, 51-60.

Flores-Velez L M, Ducaroir J, Jaunet A M and Robert M 1996 Study of the distribution of copper in an acid sandy vinyard soil by three different methods. European Journal of Soil Science 47, 523-532.

Fortunati P, Lombi E, Hamon R E, Nolan A L and McLaughlin M J 2005 Effect of toxic cations on copper rhizotoxicity in wheat seedlings. Environmental Toxicology and Chemistry 24, 372-378.

Gahoonia T S 1993 Influence of root-induced pH on the solubility of soil aluminium in the rhizosphere. Plant and Soil 149, 289-291.

Geebelen W, Adriano D C, van der Lelie D, Mench M, Carleer R, Clijsters H and Vangronsveld J 2003 Selected bioavailability assays to test the efficacy of amendment-induced immobilization of lead in soils. Plant and Soil 249, 217-228.

Ginocchio R, Rodriguez P H, Badilla-Ohlbaum R, Allen H E and Lagos G E 2002 Effect of soil copper content and pH on copper uptake of selected vegetables grown under controlled conditions. Environmental Toxicology and Chemistry 21, 1736-1744.

Gregory P J and Hinsinger P 1999 New approaches to studying chemical and physical changes in the rhizosphere: an overview. Plant and Soil 211, 1-9.

Gries D, Brunn S, Crowley D E and Parker D R 1995 Phytosiderophore release in relation to micronutrient metal deficiencies in barley. Plant and Soil 172, 299-308.

Gries D, Klatt S and Runge M 1998 Copper-deficiency-induced phytosiderophore release in the calcicole grass Hordelymus europaeus. New Phytologist 140, 95-101.

Gupta S K and Aten C 1993 Comparison and evaluation of extraction media and their suitability in a simple model to predict the biological relevance of heavy metal concentrations in contaminated soils. International Journal of Environmental Analytical Chemistry 51, 25-46.

Harada E, Sugase K, Namba K, Iwashita T and Murata Y 2007 Structural element responsible for the Fe(III)-phytosiderophore specific transport by HvYS1 transporter in barley. FEBS Letters 581, 4298-4302.

Harmsen J, Rulkens W and Eijsackers H 2005 Bioavailability: concept for understanding or tool for prediciting? Land Contamination & Reclamation 13, 161-171.

Harper M P, Davison W and Tych W 2000 DIFS - a modelling and simulation tool for DGT induced trace metal remobilisation in sediments and soils. Environmental Modelling & Software 15, 55-66.

Hart J J, Welch R M, Norwell W A and Kochian L V 2002 Transport interactions between cadmium and zinc in roots of bread and durum wheat seedlings. Physiologia Plantarum 116, 73-78.

Hart J J, Welch R M, Norwell W A, Sullivan L A and Kochian L V 1998 Characterization of cadmium binding, uptake, and translocation in intact seedlings of bread and durum wheat cultivars. Plant Physiology 116, 1413-1420.

Harter R D and Naidu R 1995 Role of metal-organic complexation in metal sorption by soils. Advances in Agronomy 55, 219-263.


57

Haynes R J 1990 Active ion uptake and maintenance of cation-anion balance: A critical examination of their role in regulating rhizosphere pH. Plant and Soil 126, 247-264.

Hinsinger P 2001 Bioavailability of trace elements as related to root-induced chemical changes in the rhizosphere. In Trace elements in the rhizosphere, Eds G R Gobran, W W Wenzel and E Lombi. pp 25-41. CRC Press, Boca Raton.

Hinsinger P, Gobran G R, Gregory P J and Wenzel W W 2005 Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytologist 168, 293-303.

Hinsinger P, Plassard C, Tang C and Jaillard B 2003 Origins of root-mediated pH changes in the rhizosphere and their responses to environmental constraints: A review. Plant and Soil 248, 43-59.

Hooda P S, Zhang H, Davison W and Edwards A C 1999 Measuring bioavailable trace metals by diffusive gradients in thin films (DGT): soil mosture effects on its performance in soils. European Journal of Soil Science 50, 285-294.

Hough R L, Tye A M, Crout N M J, McGrath S P and Young S D 2005 Evaluating a 'Free Ion Activity Model' applied to metal uptake by Lolium perenne L. grown in contaminated soils. Plant and Soil 270, 1-12.

Impellitteri C A, Lu Y, Saxe J K, Allen H E and Peijnenburg W J G M 2002 Correlation of the partitionning of dissolved organic matter fractions with the desorption of Cd, Cu, Ni, Pb and Zn from18 Dutch soils. Environment International 28, 401-410.

ISO 1993 Soil quality - Determination of the effects of pollutants on soil flora - Part 1: Method for the measurement of inhibition of root growth. N°11269-1.

ISO 1995 Soil quality - Determination of the effects of pollutants on soil flora - Part 2: effects of pollutants on the emergence and growth of higher plants. N°11269-2.

ISO 2006 Soil quality - Guidance for the selection and application of methods for the assessment of bioavailability in soil and soil materials. ISO/DIS 17402 Geneva, Switzerland.

Jaillard B, Schneider A, Mollier A and Pellerin S 2000 Modélisation du prélèvement minéral par les plantes fondée sur le fonctionnement bio-physico-chimique de la rhizosphère. In Fonctionnement des peuplements végétaux sous contraintes environnementales. pp 253-287. INRA, Paris.

Jeffery J J and Uren N C 1983 Copper and zinc species in the soil solution and the effects of soil pH. Australian Journal of Soil Research 21, 479-488.

Jones D L 1998 Organic acids in the rhizosphere - a critical review. Plant and Soil 205, 25-44. Jung C, Maeder V, Funk F, Frey B, Sticher H and Frossard E 2003 Release of phenols from Lupinus albus L.

roots exposed to Cu and their possible role in Cu detoxification. Plant and Soil 252. Juste C 1988 Appréciation de la mobilité et de la biodisponibilité des éléments traces du sol. Science du sol 26,

103-112. Kabata-Pendias A P H 1992 Trace elements in soils and plants. CRC Press, London. 365 p. Khalid M, Soleman N and Jones D L 2007 Grassland plants affect dissolved organic carbon and nitrogen

dynamics in soil. Soil Biology & Biochemistry 39, 378-381. Kinniburgh D G, Jackson M L and Syers J K 1976 Adsorption of alkaline earth, transition, and heavy metals

cations by hydrous oxide gels of iron and aluminium. Soil Science Society of America Journal 40, 796-799.

Kinniburgh D G, Milne C J, Benedetti M F, Pinheiro J P, Filius J, Koopal L K and van Riemsdijk W H 1996 Metal ion binding by humic acid: Application of the NICA-Donnan Model. Environmental Science & Technology 30, 1687-1698.

Kinniburgh D G, van Riemsdijk W H, Koopal L K, Borkovec M, Benedetti M F and Avena M J 1999 Ion binding to natural organic matter: competition, heterogeneity, stoichiometry and thermodynamic consistency. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 151, 147-166.

Kinraide T B, Pedler J F and Parker D R 2004 Relative effectiveness of calcium and magnesium in the alleviation of rhizotoxicity in wheat induced by copper, zinc, aluminium, sodium and low pH. Plant and Soil 259, 201-208.

Kinraide T B, Ryan P R and Kochian L V 1992 Interactive effects of Al3+, H+, and other cations on root elongation considered in terms of cell-surface electrical potential. Plant Physiology 99, 1461-1468.

Kochian L V, Hoekenga O A and Pineros M A 2004 How do crop plants tolerate acid soils? Mechanisms of aluminium tolerance and phosphorus efficiency. Annual Review of Plant Biology 55, 459-493.

Kopittke P M, Asher C J, Kopittke R A and Menzies N W 2007a Toxic effects of Pb2+ on growth of cowpea (Vigna unguiculata). Environmental Pollution 150, 280-287.

Kopittke P M, Blamey F P C and Menzies N W 2008 Toxicities of soluble Al, Cu, and La include ruptures to rhizodermal and root cortical cells of cowpea. Plant and Soil 303, 217-227.

Kopittke P M, J. D P and Menzies N W 2007b Toxic effects of low concentrations of Cu on nodulation of cowpea (Vigna unguiculata). Environmental Pollution 145, 309-315.

Kopittke P M and Menzies N W 2006 Effect of Cu toxicity on growth of cowpea (Vigna unguiculata). Plant and Soil 279, 287-296.


58

Kornegay E T, Hedges J D, Martens D C and Kramer C Y 1976 Effect on soil and plant mineral levels following application of manures of different copper contents. Plant and Soil 45, 151-162.

Lebourg A, Sterckeman T, Ciesielski H and Proix N 1998 Trace metal speciation in three unbuffered salt solutions used to assess their bioavailability in soil. Journal of Environmental Quality 27, 584-590.

Legrand P, Turmel M-C, Sauvé S and Courchesne F 2005 Speciation and bioavailability of trace metals (Cd, Cu, Ni, Pb, Zn) in the rhizosphere of contaminated soils. In Biogeochemistry of trace elements in the rhizosphere, Eds P M Huang and G R Gobran. pp 261-299. Elsevier, Amsterdam.

Lexmond T M 1980 The effect of soil pH on copper toxicity to forage maize grown under field conditions. Netherlands Journal of Agricultural Science 28, 164-183.

Lexmond T M and van der Vorm P D J 1981 The effect of pH on copper toxicity to hydroponically grown maize. Netherlands Journal of Agricultural Science 29, 217-238.

Li W, Zhang M and Shu H 2005 Distribution and fractionation of copper in soils of apple orchards. Environmental Science & Pollution Research 12, 168-172.

Lidon F C and Henriques F S 1992 Effects of increasing concentrations of Cu on metal uptake kinetics and biomass yields. Soil Science 154, 44-49.

Lindsay WL 1979 Chemical equilibria in soils. John Wiley and Sons. 449 p. Lofts S, Simon B M, Tipping E and Woof C 2001 Modelling the solid-solution partioning of organic matter in

European forest soils. European Journal of Soil Science 52, 215-226. Lofts S, Spurgeon D J, Svendsen C and Tipping E 2004 Deriving soil critical limits for Cu, Zn, Cd and Pb: A

method based on free ion concentrations. Environmental Science & Technology 38, 3623-3631. Lombi E, Zhao F J, McGrath S P, Young S D and Sacchi G A 2001 Physiological evidence for high-affinity

cadmium transporter highly expressed in a Thlaspi caerulescens ecotype. New Phytologist 149, 53-60. Loosemore N, Straczek A, Hinsinger P and Jaillard B 2004 Zinc mobilisation from a contaminated soil by three

genotypes of tobacco as affected by soil and rhizosphere pH. Plant and Soil 260, 19-32. Lumsdon D G and Evans L J 1993 predicting chemical speciation and computer simulation. In Chemical

speciation in the environment, Eds A M Ure and C M Davidson. pp 86-134. Blackie A&P, London. Luo X-S, Li L-Z and Zhou D-M 2008 Effect of cations on copper toxicity to wheat root: implications for the

biotic ligand model. Chemosphere 73, 401-406. Ma J F and Nomoto K 1996 Effective regulation of iron acquisition in gramineous plants. The role of mugineic

acids as phytosiderophores. Physiologia Plantarum 97, 609-617. Ma J F and Nomoto K 1993 Inhibition of mugineic acid-ferric complex uptake in barley by copper, zinc and

cobalt. Physiologia Plantarum 89, 331-334. Ma Y B, Lombi E, Oliver I W, Nolan A L and McLaughlin M J 2006 Long-term aging of copper added to soils.

Environmental Science & Technology 40, 6310-6317. Malcolm R L 1993 Concentration and composition of dissolved organic carbon in soils, streams, and

groudwaters. In Organic substances in soil and waters: Natural constituents and their influences on contaminant behaviour, Eds A J Beck, K C Jones, M H B Hayes and U Mingelgrin. pp 19-30. The Royal Society of Chemistry.

Manouchehri N, Besancon S and Bermond A 2006 Major trace metal extraction from soil by EDTA: Equilibrium and kinetic studies. Analytica Chimica Acta 559, 105-112.

Marschner H 1995 Mineral nutrition of higher plants. Academic Press, London. 889 p. McBride M B 2001 Cupric ion activity in peat soil as a toxicity indicator for maize. Journal of Environmental

Quality 30, 78-84. McBride M B 1989 Reactions controlling heavy metals solubility in soils. Advances in Soil Science 10, 1-56. McBride M B and Blasiak J J 1979 Zinc and copper solubility as a function of pH in an acid soil. Soil Science

Society of America Journal 43, 866-870. McKenzie R M 1980 The adsorption of lead and other heavy metals on oxides of manganese and iron. Australian

Journal of Soil Research 18, 61-73. McLaren R G and Crawford D V 1973 Studies on soil copper. II. the specific adsorption of copper by soils.

Journal of Soil Science 24, 443-452. Mench M and Martin E 1991 Mobilization of cadmium and other metals from two soils by root exudates of Zea

mays L., Nicotiona tabacum L. and Nicotiana rustica L. Plant and Soil 132, 187-196. Mench M, Morel J L and Guckert A 1987 Metal binding properties of high molecular weight soluble exudates

from maize (Zea mays L.) roots. Biology and Fertility of Soils 3, 165-169. Mengel K and Kirkby E A 2001 Principles of plant nutrition. Kluwer academic publishers, Dordrecht. 849 p. Menzies N W, Donn M J and Kopittke P M 2007 Evaluation of extractants for estimation of the phytoavailable

trace metals in soils. Environmental Pollution 145, 121-130. Merdy P, Huclier S and Koopal L K 2006 Modeling metal-particle interactions with an emphasis on natural

organic matter. Environmental Science & Technology 40, 7459-7466.


59

Michaud A M 2007 Interaction entre biodisponibilité, phytotoxicité du cuivre et nutrition en fer de graminées - mécanismes physiologiques et rhizosphériques. In Science du sol. pp 191. Montpellier SupAgro, Montpellier.

Michaud A M, Chappellaz C and Hinsinger P 2008 Copper phytotoxicity affects root elongation and iron nutrition in durum wheat (Triticum turgidum durum L.). Plant and Soil 310, 151-165.

Minnich M M, McBride M B and Chaney R L 1987 Copper activity in soil solution: II. Relation to copper accumulation in young snapbeans. Soil science Society of America Journal 51, 573-578.

Mirlean N, Roisenberg A and Chies J O 2007 Metal contamination of vineyard soils in wet subtropics (southern Brazil). Environmental Pollution 149, 10-17.

Mocquot B, Vangronsveld J, Clijsters H and Mench M 1996 Copper toxicity in young maize (Zea mays L.) plants : effect on growth, mineral and chlorophyll contents, and enzyme activities. Plant and Soil, 182, 287-300.

Morel J L, Mench M and Guckert A 1986 Measurement of Pb2+, Cu2+ and Cd2+ binding with mucilage exudates from maize (Zea mays L.) roots. Biology and Fertility of Soils 2, 29-34.

Mullins G L, Sommers L E and Barber S A 1986 Modeling the plant uptake of cadmium and zinc from soils treated with sewage sludge. Soil Science Society of America Journal 50, 1245-1250.

Murakami T, Ise K, Hayakawa M, Kamei S and Takagi S I 1989 Stabilities of metal complexes of mugineic acids and their specific affinities for iron(III). Chemistry Letters 12, 2137-2140.

Murata Y, Ma J F, Yamaji N, Ueno D, Nomoto K and Iwashita T 2006 A specific transporter for iron(III)-phytosiderophore in barley roots. Plant Journal 46, 563-572.

Murphy A S, Eisinger W R, Shaff J E, Kochian L V and Taiz L 1999 Early copper-induced leakage of K+ from Arabidopsis seedlings is mediated by ion channels and coupled to citrate efflux. Plant Physiology 127, 1375-1382.

Nguyen C 2003 Rhizodeposition of organic C by plants: mechanisms and controls. Agronomie 23, 375-396. Nian H, Yang Z M, Ahn S J, Cheng Z J and Matsumoto H 2002 A comparative study on the aluminium- and

copper-induced organic acid exudation from wheat roots. Physiologia Plantarum 116, 328-335. Nielsen N E 1976 A transport kinetic concept for ion uptake by plants: III. Test of the concept by results from

water culture and pot experiments. Plant and Soil 45, 659-677. Nolan A L, Ma Y, Lombi E and McLaughlin M J 2004 Measurement of labile Cu in soil using stable isotope

dilution and isotope ratio analysis by ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry 380, 789-797. Nolan A L, Zhang H and McLaughlin M J 2005 Prediction of zinc, cadmium, lead, and copper availability to

wheat in contaminated soils using chemical speciation, diffusive gradients in thin films, extraction, and isotopic dilution techniques. Journal of Environmental Quality 34, 496-507.

Oliver I W, Ma Y, Lombi E, Nolan A L and McLaughlin M J 2006 Stable isotope techniques for assessing labile Cu in soils: Development of an L-value procedure, its application, and reconciliation with E values. Environmental Science & Technology 40, 3342-3348.

Oste L A, Temminghoff E J M and Van Riemsdijk W H 2002 Solid-solution partitioning of organic matter in soils as influenced by an increase in pH and Ca concentration. Environmental Science & Technology 36, 208-214.

Panou-Filotheou H and Bosabadilis A M 2004 Root structural aspects associated with copper toxicity in oregano (Origanum vulgare L. subsp. hirtum). Plant Science 166, 1497-1504.

Parat C, Chaussod R, Lévêque J, Dousset S and Andreux F 2002 The relationship between copper accumulated in vineyard calcareous soils and soil organic mattre and iron. European Journal of Soil Science 53, 663-669.

Parker D R 1995 Root growth analysis: An underutilised approach to understanding aluminium rhizotoxicity. Plant and Soil 171, 151-157.

Peijnenburg W J G M and Jager T 2003 Monitoring approaches to assess bioaccessibility and bioavailability of metals: Matrix issues. Ecotoxicology and Environmental Safety 56, 63-77.

Peijnenburg W J G M, Posthuma L, Eijsackers H J P and Allen H E 1997 A conceptual framework for implementation of bioavailability of metals for environmental management purposes. Ecotoxicology and Environmental Safety 37, 163-172.

Pietrzak U and McPhail D C 2004 Copper accumulation, distribution and fractionation in vineyard soils of Victoria, Australia. Geoderma 122, 151-166.

Puig S, Andres-Colas N, Garcia-Molina A and Penarrubia L 2007 Copper and iron homeostasis in Arabidopsis: responses to metal deficiencies, interactions and biotechnological applications. Plant, Cell and Environment 30, 271-290.

Puschenreiter M, Schnepf A, Millan I M, Fitz W J, Horak O, Klepp J, Schrefl T, Lombi E and Wenzel W W 2005 Changes of Ni biogeochemistry in the rhizosphere of the hyperaccumulator Thlaspi goesingense. Plant and Soil 271, 205-218.


60

Reichman S M and Parker D R 2005 Metal complexation by phytosiderophores in the rhizosphere. In Biogeochemistry of trace elements in the rhizosphere, Eds P M Huang and G R Gobran. pp 129-156. Elsevier, Amsterdam.

Reid R and Liu J 2004 Measurement of trace metal influx in plants: a case study with Co. Functional Plant Biology 31, 941-947.

Rensing C and Maier R M 2003 Issues underlying use of biosensors to measure metal bioavailability. Ecotoxicology and Environmental Safety 56, 140-147.

Riley D and Barber S A 1971 Effect of ammonium and nitrate fertilization on phosphorus uptake as related to root-induced pH changes at the root-soil interface. Soil Science Society of America Proceedings 35, 301-306.

Roberts L A, Pierson A J, Panaviene Z and Walker E L 2004 Yellow stripe 1. Expanded roles for the maize Iron-Phytosiderophore transporter. Plant Physiology 135, 112-120.

Rooney C P, Zhao F J and McGrath S P 2007 Phytotoxicity of nickel in a range of european soils: influence of soil properties, Ni solubility and speciation. Environmental Pollution 145, 596-605.

Rooney C P, Zhao F J and McGrath S P 2006 Soil factors controlling the expression of copper toxicity to plants in a wide range of european soils. Environmental Toxicology and Chemistry 25, 726-732.

Ryan P R, Delhaize E and Jones D L 2001 Function and mechanism of organic anion exudation from plant roots. Annual Review of Plant Biology and Plant Molecular Biology 52, 527-560.

Salam A K and Helmke P A 1998 The pH dependence of free ionic activities and total dissolved concentrations of copper and cadmium in soil solution. Geoderma 83, 281-291.

Sancenon V, Puig S, Mateu-Andrés I, Dorcey E, Thiele D J and Penarrubia L 2004 The Arabidopsis copper transporter COPT1 functions in root elongation and pollen development. The Journal of Biological Chemistry 279, 15348-15355.

Santibanez C, Verdugo C and Ginocchio R 2008 Phytostabilization of copper mine tailings with biosolids: Implications for metal uptake and productivity of Lolium perenne. Science of the Total Environment 395, 1-10.

Sattelmacher B 2001 The apoplast and its significance for plant mineral nutrition. New Phytologist 149, 167-192.

Sauvé S, Cook N, Hendershot W H and McBride M B 1996 Linking plant tissue concentrations and soil copper pools in urban contaminated soils. Environmental Pollution 94, 153-157.

Sauvé S, Dumestre A, McBride M and Hendershot W 1998a Derivation of soil quality criteria using predicted chemical speciation of Pb2+ and Cu2+. Environmental Toxicology and Chemistry 17, 1481-1489.

Sauvé S, Hendershot W and Allen H E 2000 Solid-solution partitioning of metals in contaminated soils: Dependence on pH, total metal burden, and organic matter. Environmental Science & Technology 34, 1125-1131.

Sauvé S, McBride M and Hendershot W 1998b Soil solution speciation of lead(II): Effects of organic matter and pH. Soil Science Society of America Journal 62, 618-621.

Sauvé S, McBride M B and Hendershot W H 1995 Ion-selective electrode measurements of copper(II) activity in contaminated soils. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 29, 373-379.

Sauvé S, McBride M B, Norvell W A and Hendershot W H 1997 Copper solubility and speciation of in situ contaminated soils: Effects of copper level, pH and organic matter. Water Air and Soil Pollution 100, 133-149.

Schaaf G, Ludewig U, Erenoglu B E, Mori S, Kitahara T and von Wiren N 2004 ZmYS1 functions as a proton-coupled symporter for phytosiderophore- and nicotionamine-chelated metals. The Journal of Biological Chemistry 279, 9091-9096.

Schnitzer M and Skinner S I M 1966 Organo-metallic interactions in soils: 5. Stability constants of Cu2+, Fe2+, and Zn2+ fulvic acid. Soil Science 102, 361-365.

Schnitzer M and Skinner S I M 1967 Organo-metallic interactions in soils: 7. Stability constants of Pb2+, Ni2+, Mn2+, Co2+, Ca2+, and Mg2+ fulvic acid complexes. Soil Science 103, 247-252.

Seuntjens P, Nowack B and Schulin R 2004 Root-zone modeling of heavy metal uptake and leaching in the presence of organic ligands. Plant and Soil 265, 61-73.

Sheldon A R and Menzies N W 2005 The effect of copper toxicity on the growth and root morphology of Rhodes grass (Chloris gayana Knuth.) in resin buffered solution culture. Plant and Soil 278, 341-349.

Smolders E, McGrath S P, Lombi E, Karman C C, Bernhard R, Cools D, van den Brande K, van Os B and Walrave N 2003 Comparison of toxicity of zinc for soil microbial processes between laboratory-contaminated and polluted-field soils. Environmental Toxicology and Chemistry 22, 2592-2598.

Sparks D L 2001 Elucidating the fundamental chemistry of soils: past and recent achievements and future frontiers. Geoderma 100, 303-319.

Sposito G 1989 The chemistry of soils. Oxford University Press, New York.


61

Sterckeman T, Perriguey J, Cael M, Schwartz C and Morel J L 2004 Applying a mechanistic model to cadmium uptake by Zea mays and Thlaspi caerulescens: Consequences for the assessment of the soil quantity and capacity factors. Plant and Soil 262, 289-302.

Stevenson F J 1994 Humus chemistry: Genesis, composition, reactions. Wiley, New York. 512 p. Taylor G J and Foy C D 1985 Mechanisms of aluminium tolerance in Triticum aestivum (wheat). IV. The role of

ammonium and nitrate nutrition. Canadian Journal of Botany 63, 2181-2186. Temminghoff E J M, van Der Zee S E A T M and De Haan F A M 1998 Effects of dissolved organic matter on

the mobility of copper in a contaminated sandy soil. European Journal of Soil Science 49, 617-628. Thakali S, Allen H E, Di Toro D M, Ponizovsky A A, Rooney C P, Zhao F J and McGrath S P 2006 A

Terrestrial Biotic Ligand Model. 1. Development and application to Cu and Ni toxicities to barley root elongation in soils. Environmental Science & Technology 40, 7085-7093.

Thornton I 1999 Bioavailability of trace metals in the foodchain. In 5th international Conference on the Biogeochemistry of trace elements, Eds W W Wenzel, D C Adriano, B J Alloway, H E Doner, C Keller, N W Lepp, M Mench, R Naidu and G M Pierzynski. pp XI-XIV, Vienna, Austia.

Tipping E 1998 Humic ion-binding model VI: An improved description of the interactions of protons and metal ions with humic subtances. Aquatic Geochemistry 4, 3-48.

Tipping E 1994 WHAMC - A chemical equilibrium model and computer codes for waters, sediments, and soils incorporating a discrete site/electrostatic model of ion binding by humic substances. Computers & Geosciences 20, 973-1023.

Tuin B j M and Tels M 1990 Extraction kinetics of six heavy metals from contaminated clay soils. Environmental Technology 11, 541-554.

Tyler G and Olsson T 2001 Concentrations of 60 elements in the soil solution as related to the soil acidity. European Journal of Soil Science 52, 151-165.

Ure A M and Davidson C M 1995 Introduction to speciation. In Chemical speciation in the environment, Eds A M Ure and C M Davidson. pp 1-5. Blackie A&P, London.

van Assche F, Cardinaels C and Clijsters H 1998 Induction of enzyme capacity in plants as a result of heavy metal toxicity: dose-response relations in Phaseolus vulgaris L., treated with zinc and cadmium. Environmental Pollution 52, 103-115.

van Leeuwen H P, Town R M, Buffle J, Cleven R F M, Davison W, Puy J, van Riemsdijk W H and Sigg L 2005 Dynamic speciation analysis and bioavailability of metals in aquatic systems. Environmental Science & Technology 30, 8545-8556.

Veltrup W 1976 Concentration dependent uptake of copper by barley roots. Plant Physiology 36, 217-220. Violante A, Ricciardella M, Pigna M and Capasso R 2005 Effects of organic ligands on the adsorption of trace

elements onto metal oxides and organo-mineral complexes. In Biogeochemistry of trace elements in the rhizosphere, Eds P M Huang and G R Gobran. pp 157-182. Elsevier, Amsterdam.

Vulkan R, Zhao F J, Barbosa-Jefferson V, Preston S, Paton G I, Tipping E and McGrath S 2000 Copper speciation and impacts on bacterial biosensors in the pore water of copper-contaminated soils. Environmental Science & Technology 34, 5115-5121.

Weng L, Temminghoff E J M and Van Riemsdijk W H 2001 Contribution of individual sorbents to the control of heavy metal activity in sandy soil. Environmental Science & Technology 35, 4436-4443.

Weng L P, Temminghoff E J M, Lofts S, Tipping E and Van Riemsdijk W H 2002 Complexation with dissolved organic matter and solubility control of heavy metals in a sandy soil. Environmental Science & Technology 36, 4804-4810.

Young S D, Zhang H, Tye A M, Maxted A, Thums C and Thornton I 2006 Characterizing the availability of metals in contaminated soils. I. The solid phase: sequential extraction and isotopic dilution. Soil Use and Management 21, 450-458.

Youssef R A and Chino M 1989a Root-induced changes in the rhizosphere of plants. I. pH changes in relation to the bulk soil. Soil Science and Plant Nutrition 35, 461-468.

Youssef R A and Chino M 1989b Root-induced changes in the rhizosphere of plants. II. Distribution of heavy metals across the rhizosphere in soils. Soil Science and Plant Nutrition 35, 609-621.

Yruela I 2005 Copper in plants. Brazilian Journal of Plant Physiology 17, 145-156. Zhang H, Davison W, Knight B and McGrath S 1998 In situ measurements of solution concentrations and fluxes

of trace metals in soils using DGT. Environmental Science & Technology 32, 704-710. Zhang H, Lombi E, Smolders E and McGrath S 2004 Kinetics of Zn release in soils and prediction of Zn

concentration in plants using diffusive gradients in thin. Environmental Science & Technology 38, 3608-3613.

Zhang H and Young S D 2006 Characterizing the availability of metals in contaminated soils. II. The soil solution. Soil Use and Management 21, 459-467.


62

Zhang H, Zhao F J, Sun B, Davison W and McGrath S P 2001a A new method to measure effective soil solution concentration predicts copper availability to plants. Environmental Science & Technology 35, 2602-2607.

Zhang Q, Smith F, Sekimoto H and Reid R 2001b Effect of membrane surface charge on nickel uptake by purified mung bean root protoplasts. Planta 213, 788-793.

Zhao F J, Rooney C P, Zhang H and McGrath S P 2006 Comparison of soil solution speciation and diffusive gradients in thin-films measurement as an indicator of copper bioavailability to plants. Environmental Toxicology and Chemistry 25, 733-742.

Zheng S J, He Y F, Arakawa Y, Masaoka Y and Tang C 2005 A copper-deficiency-induced root reductase is different from the iron-deficiency-induced one in red clover (Trifolium pratense L.). Plant and Soil 273, 69-76.

Chapitre 2. Biodisponibilité Cu in situ et ex situ

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CHAPITRE 2 Biodisponibilité du cuivre pour le blé dur

– Evaluations in situ et ex situ – La protection du vignoble contre le mildou (Plasmopara viticola) par l’application de fongicides cupriques a engendré une contamination en cuivre (Cu) des horizons de surface des sols viticoles. Si la vigne (Vitis vinifera L. ssp. vinifera) apparaît peu sensible à la présence d’un excès de Cu du fait de son enracinement généralement profond, les cultures annuelles implantées en sols à antécédent viticole pourraient présenter une plus forte sensibilité à Cu (Braun et al. 2002). Dans le contexte du Languedoc-Roussillon où le blé dur (Triticum turgidum durum L) est la principale culture annuelle, il semble donc nécessaire d’évaluer le prélèvement de Cu, i.e. sa biodisponibilité, pour le blé dur cultivé dans des sols à antécédent viticole. La disponibilité de Cu dans le sol est principalement contrôlée par le niveau de contamination et le pH du sol (McBride 1989 ; Sauvé et al. 2000). La concentration totale de Cu et l’activité de Cu2+ libre en solution tendent ainsi à augmenter lorsque la concentration totale en Cu dans le sol augmente et que le pH diminue (Sauvé et al. 1997 ; Vulkan et al. 2000). La biodisponiblité de Cu étant directement dépendante de l’exposition des plantes à Cu, i.e. la disponibilité de Cu dans le sol, elle tend également à augmenter quand le niveau de contamination augmente et lorsque le pH diminue (Lexmond 1980 ; Hough et al. 2005). Pourtant, Braun et al. (2002) ont observé des symptômes de chlorose ferrique sur le blé dur imputables à une phytotoxicité de Cu principalement lorsque le blé dur est cultivé en sols calcaires. Chaignon et al. (2002a, b et 2008) ont rapporté, d’une part, une augmentation de la biodisponiblité de Cu pour des graminées cultivées en sols calcaires en lien avec l’exsudation de composés organiques complexants (phytosidérophores) et, d’autre part, une diminution de la biodisponibilité de Cu dans les sols très acides en lien avec une alcalinisation de la rhizosphère. Ces résultats suggèrent donc que des modifications chimiques induites par les racines dans la rhizophère pourraient participer au déterminisme de la biodisponibilité de Cu pour le blé dur. Cependant, ces hypothèses n’ont jamais été validées par des expérimentations in situ. Les objectifs de ce premier chapitre sont donc les suivants : (i) Evaluer in situ la biodisponibilité de Cu pour le blé dur, (ii) Valider l’utilisation d’un biotest, le RHIZOtest, pour l’évaluation ex situ de la biodisponibilité de Cu pour le blé dur, (iii) Mettre en évidence l’implication de modifications chimiques dans la rhizosphère dans le déterminisme de la biodisponiblité de Cu pour le blé dur. Le premier article intitulé : « Copper uptake and phytotoxicity as assessed in situ for durum wheat (Triticum turgidum durum L) cultivated in Cu-contaminated, former vineyard soils », aborde l’évaluation in situ de la biodisponibilité de Cu pour le blé dur dans une large gamme de sols présentant notamment des niveaux de contamination (30-1030 mg kg-1) et de pH (4,2-7,8) variés. Cet article a été publié en 2007 dans la revue Plant and Soil. Le second article, intitulé : « RHIZOtest : a plant-based biotest to account for rhizosphere processes to assess metal bioavailability to plants », concerne l’évaluation ex situ de la biodisponibilité de Cu pour le blé dur et compare un biotest, le RHIZOtest, à deux outils fondés sur une mesure


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chimique, la méthode DGT (Diffusive Gradients in Thin films) et l’électrode sélective de Cu2+ libre en solution. La comparaison de ces trois outils est fondée sur leur capacité à rendre compte de la biodisponibilité de Cu mesurée in situ, et d’intégrer les modifications chimiques induites par les racines dans la rhizosphère. Ce second article est soumis à la revue Environmental Pollution. Bibliographie Braun P, Gilbert E and Mura V 2002 En région méditerranéenne: Diagnostic des accidents du blé dur.

Perspectives Agricoles 285, 78-81. Chaignon V, Bedin F and Hinsinger P 2002a Copper bioavailability and rhizosphere pH changes as affected by

nitrogen supply for tomato and oil seed rape cropped on an acidic and a calcareous soil. Plant and Soil 243, 219-228.

Chaignon V, Di Malta D and Hinsinger P 2002b Fe-deficiency increases Cu acquisition by wheat cropped in a Cu-contaminated vineyard soil. New Phytologist 154, 121-130.




McBride M B 1989 Reactions controlling heavy metals solubility in soils. Advances in Soil Science 10, 1-56. Sauvé S, Hendershot W and Allen H E 2000 Solid-solution partitioning of metals in contaminated soils:

Dependence on pH, total metal burden, and organic matter. Environmental Science & Technology 34, 1125-1131.

Sauvé S, McBride M B, Norvell W A and Hendershot W H 1997 Copper solubility and speciation of in situ contaminated soils: Effects of copper level, pH and organic matter. Water Air and Soil Pollution 100, 133-149.

Vulkan R, Zhao F J, Barbosa-Jefferson V, Preston S, Paton G I, Tipping E and McGrath S 2000 Copper speciation and impacts on bacterial biosensors in the pore water of copper-contaminated soils. Environmental Science & Technology 34, 5115-5121.


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I. Copper uptake and phytotoxicity as assessed in situ for durum wheat (Triticum turgidum durum L .) cultivated in Cu-contaminated, former vineyard soils Authors : AM Michaud, M N Bravin, M Galleguillos and P Hinsinger*

Affiliations: INRA - SupAgro, UMR 1222 Biogéochimie du Sol et de la Rhizosphère, Place Viala, 34060 Montpellier cedex 1, France * Corresponding author: [email protected], Tel: +33 4 99 61 22 49, Fax: +33 4 99 61 30 88 Abstract This work assessed in situ, copper (Cu) uptake and phytotoxicity for durum wheat (Triticum turgidum durum L.) cropped in a range of Cu-contaminated, former vineyard soils (pH 4.2 – 7.8 and total Cu concentration 32 – 1030 mg Cu kg−1) and identified the underlying soil chemical properties and related root-induced chemical changes in the rhizosphere. Copper concentrations in plants were significantly and positively correlated to soil Cu concentration (total and EDTA). In addition, Cu concentration in roots which was positively correlated to soil pH tended to be larger in calcareous soils than in non calcareous soils. Symptoms of Cu phytotoxicity (interveinal chlorosis) were observed in some calcareous soils. Iron (Fe) – Cu antagonism was found in calcareous soils. Rhizosphere alkalisation in the most acidic soils was related to decreased CaCl2-extractable Cu. Conversely, water-extractable Cu increased in the rhizosphere of both non calcareous and calcareous soils. This work suggests that plant Cu uptake and risks of Cu phytotoxicity in situ might be greater in calcareous soils due to interaction with Fe nutrition. Larger water extractability of Cu in the rhizosphere might relate to greater Cu uptake in plants exhibiting Cu phytotoxic symptoms. Keywords: Copper, Iron, pH, Phytotoxicity, Rhizosphere, Triticum turgidum durum L.


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I.1. Introduction

The protective effect of copper (Cu) salts against the mildew of grape vine has been discovered at the end of the 19th century. Since then, the repeated use of Cu salts as fungicides sprayed on vines has caused Cu contamination of most vineyard soils in various countries (Brun et al. 2001; Chaignon et al. 2003; Pietrzak and McPhail 2004; Cattani et al. 2006). In the Languedoc region (Southern France), more than a third of the former vineyard surface area has been replaced by other crops, mainly durum wheat (Triticum turgidum durum L.). While problems of Cu phytotoxicity have been seldom reported in vine, such problems have been found especially in cereals grown in calcareous soils in this region (Braun 2006) as well as in Switzerland (Coullery 1997). These findings were rather surprising as the bioavailability and phytotoxicity of metals is often thought to be minimal at higher pH. In both soil solution and solid phase, Cu is mainly associated with organic matter by complexation or adsorption (Sauvé et al. 1997). Copper can also be adsorbed onto the surfaces of clays and Fe or Mn oxides, co-precipitated with carbonates and phosphates or present in the lattice of primary silicate minerals (McBride 1981). The distribution of Cu among these various soil components can be defined as the solid phase speciation of soil Cu. The chemically mobile fraction of an element is defined as the sum of the amount in soil solution and the amount retained by the solid phase that can be easily transferred into soil solution (Rieuwerts et al. 1998). The solid phase speciation of Cu will greatly influence the chemical mobility and hence, the amount of Cu potentially taken up by plants. This will thus depend on those soil chemical properties that govern the solid phase speciation of Cu. Actually, at acidic pH, dissolved Cu will increase because of its weaker adsorption and so will the free cupric ion activity (Sauvé et al. 1997). In addition, with increasing pH, competitive adsorption arises between organic matter in the solid phase and dissolved organic carbon (DOC), generally leading to an increase in Cu concentration in the soil solution due to increased DOC concentration (Carrillo-Gonzalez et al. 2006). However, upon increasing pH, the free cupric ion activity considerably decreases at the expense of organically-bound complex species in the soil solution (Sauvé et al. 1997). This is the reason why it is often considered that the phytotoxicity of Cu is minimal in calcareous soils, assuming that plants are only sensitive to the free cupric ion. The rhizosphere is the volume of soil around roots that is influenced by the activity of living plant roots (Hinsinger et al. 2005). In the rhizosphere, root and microbial activities can change the liquid and solid phase speciation and ultimately the mobility of metals as a consequence of alterations of chemical properties such as soil pH or DOC concentration (Hinsinger and Courchesne 2007). In the particular case of Graminaceous species, the increased root secretion of iron (Fe) chelating compounds under Fe deficiency, the so-called phytosiderophores, have been reported to increase Cu uptake in a calcareous soil (Chaignon et al. 2002b). In addition, root-mediated pH changes can influence the chemical mobility of nutrients and metals in the rhizosphere, and thereby their uptake by plants (Hinsinger et al. 2005). It has been shown that increasing the pH in the rhizosphere of plants grown in acidic soils can decrease aluminium (Al) concentration in the soil solution, and hence alleviate Al phytotoxicity (Marschner 1995; Kochian et al. 2004). Copper is an essential nutrient which is known to result in phytotoxic damages such as rhizotoxicity and induced Fe deficiency when present at elevated concentrations (Marschner 1995). Numerous former studies were carried out to identify relationships between plant Cu uptake (or Cu phytotoxicity) and soil chemical properties, such as pH and various indicators


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of Cu contamination (Sauvé et al. 1996; Brun et al. 2001; Chaignon et al. 2003; Nolan et al. 2005; Zhao et al. 2006). Those former studies were mainly carried out under controlled, artificial conditions, such as the use of sieved, air dried and sometimes spiked soils. In contrast, to our knowledge no study has been carried out in situ to evaluate the actual plant Cu concentration in roots and shoots and environmental risks of Cu phytotoxicity as related to soil chemical properties. In addition, soil chemical properties can differ between the bulk soil and the rhizosphere, so that considering soil chemical properties in the bulk soil might be a poor predictor of Cu uptake which actually depends on the peculiar chemical properties induced by roots in the rhizosphere. The aim of this work was thus to assess in situ the uptake and phytotoxicity of Cu in durum wheat cropped in Cu-contaminated, former vineyard soils and to identify the underlying soil chemical properties while taking account of root-induced chemical changes in the rhizosphere. I.2. Material and methods

I.2.1. In situ sampling of soils and plants Forty two samples of Cu-contaminated, former vineyard soils and durum wheat (Triticum turgidum durum L.) cultivated in these soils were collected between March and May 2006 at thirty kilometres around Béziers (Southern France, 60 km W of Montpellier). Soil samples comprised 20 calcareous and 22 non calcareous soils and covered a large range of pH and total Cu concentration (Table 1). Plants were harvested at the stage of 1 cm spike (end of tillering stage). The whole plants including the roots were collected by sampling 20x20x20 cm topsoil around a wheat row. Plants were extracted manually from the soil clods and the soil strongly adhering to the roots was operationally defined as the rhizosphere. This rhizosphere was collected by gently washing the roots in deionised water. A subsample of fresh bulk soil was washed in deionised water during 5 min in a soil:solution ratio close to the one used to recover the rhizosphere. An aliquot of the deionised water used for washing off the soil and the rhizosphere was filtered at 0.45 µm and frozen at –20°C prior to measuring its total Cu concentration (water extractable Cu). Soil samples (bulk, washed bulk and rhizosphere) were air-dried and sieved at 2 mm prior to being used for subsequent analysis. Roots and shoots of 8 plants were washed carefully with deionised water. Shoots were oven dried at 105°C and roots were frozen at –20°C.

I.2.2. Plant analyses

Copper bound to root cell walls (root apoplasmic Cu) was determined as described by Chaignon et al. (2002b). Briefly, after thawing, a subsample of 0.8 g of roots (on a fresh matter basis) was shaken end-over-end with 40 cm3 of 1 mM HCl for 3 min, then 360 mm3 of 1 M HCl were added to yield a final concentration of 10 mM HCl. After shaking for another 3 min, the suspensions were filtered through ashless filter paper (Whatman 541) and roots recovered and oven dried at 105°C. After extraction of root apoplasmic Cu, Cu remaining in roots was considered to be symplasmic Cu. The remaining portion of untreated roots was also oven dried at 105°C. The oven dried roots and shoots were digested separately in a microwave oven with hot concentrated HNO3. Concentrations of Cu and Fe in the root and shoot digests were determined by Flame Atomic Absorption Spectrometry (Varian SpectrAA-600, Australia) and reference plant materials (BCR 62, olive (Olea europaea L.) leaves BIPEA V463, maize (Zea mays L.) shoots) were used as standards. Root symplasmic Cu was determined by measuring Cu concentration in the root digests of roots recovered after extraction of root apoplasmic Cu.


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I.2.3. Soil analyses

All the soil analyses that are summarised in Table 1 were carried out by a routine soil testing laboratory (INRA LAS Arras, France) according to standardised French procedures (AFNOR 1999) or international procedures (ISO 1999). Soil pH was measured in 0.01 M CaCl2 using a 1:5 soil:solution ratio (ISO 10390ISO 1999). After calcium (Ca) carbonate dissolution, the soil samples were partitioned into five particle size fractions, 0−2, 2−20, 20−50, 50−200, 200−2000 µm. Cation exchange capacity (CEC) was determined by cobaltihexammine chloride extraction. Total Ca carbonate, total nitrogen and organic carbon concentrations were determined according to ISO (1999). Total Cu and Fe concentrations were determined by HF-HClO4 extraction. The fraction of soil Cu and Fe which was potentially available to the plant was determined by using a solution of 0.01 M Na2-EDTA (ethylene diaminotetraacetic acid)/ammonium acetate (pH 7). The Fe oxide concentrations were determined by Mehra-Jackson and Tamm (darkness) methods while the Mn oxide concentration was determined by the Deb method (Baize 2000). The pH, water- and CaCl2-extractable Cu were determined in the rhizosphere and bulk soil. Copper extracted by water was determined during the soil and root sampling process as described above. An aliquot of air-dried rhizosphere and bulk soil was shaken in a solution of 0.01 M CaCl2 for 2 h using a 1:10 soil:solution ratio (Lebourg et al. 1998). The suspension was then centrifuged at 10 000 g for 10 min. After measuring the pH, the supernatant was kept at 4°C before assaying Cu concentration. Copper concentration in water extracts was determined by Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry (Varian SpectrAA-600). Copper concentration in CaCl2 extracts was determined by Inductively Coupled Plasma – Atomic Emission Spectrometry (Varian Vistapro)

I.2.4. Statistical analyses

Linear regressions (Spearman R) and analyses of variance (Kruskal-Wallis analyses) with nonparametric tests were performed to identify significant differences with Statistica® (Statsoft Inc., version 6, Tulsa, OK, USA). I.3. Results

I.3.1. Soil Cu concentration

The amounts of total Cu in soil samples varied considerably, ranging from 32 mg kg−1 in sample 12, which is close to normal, geochemical background level in soils, to 184 mg kg−1 in sample 13, for 40 out of the 42 soil samples (Table 1). The amount of total Cu in soil samples 28 and 30 reached 540 and 1030 mg kg−1 respectively, which is fairly large compared with the other soil samples. The abnormally elevated Cu concentration in these 2 samples resulted from localized contamination as a result of repeated filling with Cu salts of the fungicide tank to spray vines. Copper extracted by EDTA also varied considerably from 11 to 488 mg kg−1 and amounted to 23-58% of total soil Cu. Soil pH varied considerably among the 42 samples, from 4.2 to 7.2 for the 22 non calcareous soils (samples 1 to 22) and from 7.5 to 7.8 for the 20 calcareous soils (samples 23 to 42), for which the CaCO3 concentration varied from 4 to 298 g kg−1.


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Table 1 Selected chemical and physical properties of soils Sample Cu

pH CaCl2 CaCO3 CEC Organic C Organic N Fe

Fe oxide

Mn oxide

clay silt sand

mg kg−1 soil g kg−1 cmolc+ kg−1 g kg−1 g kg−1 g kg−1 g kg−1 g kg−1 g kg−1 total EDTA total EDTA Mehra J Tamm Deb 0−2 µm 2−50 µm 50−2000 µm 1 117 41 4.2 nd 5.8 4.5 0.58 32 0.10 18.4 2.3 0.93 223 233 544 2 88 21 4.3 nd 11.6 10.5 1.00 32 0.08 19.7 0.8 0.33 373 186 441 3 100 42 4.6 nd 3.6 3.8 0.43 16 0.05 10.9 1.2 0.75 130 174 696 4 97 44 5.3 nd 9.8 17.0 1.51 23 0.09 13.1 0.7 0.28 253 284 463 5 82 29 5.4 nd 9.8 5.7 0.61 25 0.05 14.3 1.8 0.48 260 208 532 6 72 23 5.5 nd 14.7 6.0 0.69 36 0.04 20.5 1.7 0.42 363 209 428 7 79 23 5.5 nd 14.2 11.7 1.09 31 0.04 19.4 0.8 0.49 368 199 433 8 165 64 5.6 nd 14.8 15.1 1.56 36 0.07 19.7 1.4 0.27 383 250 367 9 53 21 5.8 nd 8.8 9.1 0.92 27 0.05 17.2 1.8 0.53 280 197 523 10 94 33 5.9 nd 15.8 9.1 1.00 31 0.03 16.0 1.3 0.44 383 220 397 11 89 36 5.9 nd 8.3 5.6 0.53 20 0.04 11.4 0.7 0.39 164 239 597 12 32 14 5.9 nd 10.8 7.8 0.75 19 0.04 10.7 1.2 0.30 241 170 589 13 184 77 6.0 nd 14.6 17.6 1.69 38 0.06 20.7 2.0 0.50 270 236 494 14 123 55 6.2 nd 14.1 8.9 0.81 23 0.04 12.7 0.9 0.32 263 275 462 15 150 63 6.3 nd 10.9 15.1 1.38 29 0.05 16.1 1.3 0.58 209 219 572 16 140 81 6.3 nd 10.4 11.9 0.92 12 0.07 5.7 1.0 0.20 152 214 634 17 87 34 6.3 nd 14.3 8.7 0.92 26 0.04 13.5 1.3 0.38 323 138 539 18 141 66 6.3 nd 14.5 8.8 0.83 24 0.04 13.9 0.9 0.35 270 295 435 19 158 72 6.4 nd 16.1 18.1 1.73 31 0.05 18.6 0.8 0.27 330 284 386 20 103 60 6.9 < 2 11.6 12.1 0.95 14 0.04 8.4 0.5 0.22 169 149 682 21 67 34 6.9 nd 10.9 11.1 1.05 17 0.03 9.6 0.6 0.23 200 208 592 22 152 61 7.2 nd 15.1 11.1 1.16 28 0.02 15.2 1.2 0.41 347 243 410 23 56 13 7.8 113 14.8 14.5 1.39 40 0.01 17.4 2.2 0.76 266 556 58 24 146 46 7.6 47 6.2 5.4 0.51 15 0.01 8.5 0.5 0.24 94 132 730 25 111 34 7.6 102 7.9 11.3 0.77 30 0.01 13.7 1.8 0.34 120 321 453 26 163 57 7.6 94 7.0 11.5 0.75 29 0.01 13.5 1.8 0.29 108 280 517 27 155 57 7.6 93 8.7 11.3 0.86 31 0.02 14.4 1.7 0.36 127 350 426 28 540 211 7.6 110 10.4 15.9 1.26 30 0.01 14.2 1.8 0.37 123 338 431 29 128 43 7.6 102 8.5 10.4 0.74 31 0.01 15.2 1.8 0.38 137 377 382 30 1030 488 7.5 87 11.7 23.6 1.65 29 0.01 13.7 1.9 0.35 131 380 384 31 59 20 7.6 25 13.1 3.5 0.40 19 0.01 10.1 0.9 0.42 205 180 593 32 70 29 7.7 278 8.7 7.0 0.62 12 0.01 6.9 0.4 0.10 133 184 402 33 84 37 7.6 154 13.1 13.8 0.92 16 0.01 4.8 0.4 0.20 152 218 475 34 117 51 7.7 204 11.8 11.2 0.70 17 0.01 4.8 0.4 0.21 152 212 421 35 120 62 7.6 261 9.6 14.2 0.94 15 0.01 4.2 0.4 0.22 99 192 429 36 150 74 7.6 207 11.5 15.0 1.04 16 0.01 4.5 0.4 0.23 118 228 430 37 114 49 7.6 279 10.4 8.2 0.76 11 0.01 3.5 0.4 0.16 133 145 454 38 78 34 7.7 298 10.6 8.9 0.97 10 0.01 3.5 0.5 0.18 135 140 415 39 43 11 7.5 6 16.7 5.4 0.53 24 0.01 12.4 0.7 0.50 292 145 557 40 106 33 7.7 154 16.3 8.4 0.77 23 0.00 12.1 0.4 0.30 290 193 356 41 103 37 7.5 4 16.8 7.3 0.65 28 0.02 17.7 0.5 0.13 332 189 475 42 147 56 7.5 75 15.1 12.8 1.13 19 0.01 10.1 0.9 0.26 207 232 493 nd: not determined because non calcareous soils


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I.3.2. Plant Cu and Fe concentration

The Cu concentration in shoots varied from 6 to 39 mg kg−1 DM (Table 2 and Fig. 1a). The total and symplasmic Cu concentrations in roots varied even more so, from 11 to 705 mg kg−1 DM (about 66-fold) and from 6 to 150 mg kg−1 DM (about 25-fold), respectively (Table 2 and Fig. 1c). The symplasmic Cu amounted to 16-57% of total Cu in roots. The shoot/root ratios of Cu concentration decreased with increasing Cu concentration in soils, ranging from 0.86 for one of the least Cu-contaminated soils (sample 39) to 0.06 for the most Cu-contaminated soil (sample 30). Moreover, root Cu concentration was significantly (at P<0.05) larger in calcareous soils than in non calcareous soils for the 42 soil samples (Fig. 1c). When excluding the two most Cu-contaminated samples (samples 28 and 30) in order to compare the two types of soils in the same range of soil Cu concentration (Fig. 1d), root Cu concentration was not significantly larger in calcareous soils than in non calcareous soils. For shoot Cu concentration, there was no significant difference between the calcareous and non calcareous soils (Fig. 1b). Interveinal chlorosis symptoms (yellow stripes) along the length of the leaves (Fig. 2a) were observed in durum wheat grown in 5 of the sampled calcareous soils, either in isolated spots (samples 28 and 30) (Fig. 2b) or diffuse spots (samples 24 and 26). These were also observed along rows across the field in sample 37 (Fig. 2c). These interveinal chlorosis symptoms were particularly pronounced in the most Cu-contaminated soil which contained 1030 mg Cu kg−1 (Fig. 2a). In these field plots, pairs of soil samples were collected where plants were exhibiting or not the interveinal chlorosis symptoms in order to test whether these were possibly linked with Cu phytotoxicity. Samples 27 and 29 were sampled in the field plot beside the spots corresponding to the 2 most Cu-contaminated soil samples, samples 28 and 30 respectively. Samples 37 and 38 were sampled in the same field plot, in one of the rows formed by durum wheat exhibiting the interveinal chlorosis symptoms and outside of these rows, respectively. The last pair of samples corresponded to samples 25 and 26 for which plants presented no symptoms and symptoms of interveinal chlorosis, respectively. In these pairs of samples, soil Cu concentration was larger in soils corresponding to plants exhibiting interveinal chlorosis symptoms (Table 1). The Cu concentrations in plants which exhibited such symptoms was larger than in plants which had no symptoms and reached 11-39 mg kg−1 DM in shoots (Table 2 and Fig. 2a) and 128-705 mg kg−1 DM in roots (Table 2 and Fig. 2c). In addition, the shoot/root Cu concentration ratios of plants exhibiting interveinal chlorosis symptoms were among the lowest, especially in samples 28, 30 and 37 (0.07, 0.06 and 0.05 respectively). The Fe concentration in shoots varied from 79 to 412 mg kg−1 DM and the Fe concentration in roots varied from 1078 to 7166 mg kg−1 DM (Table 2). Moreover, the root Fe concentration tended to decrease with increasing soil Cu concentration (Fig. 3a) and root Cu concentration (Fig. 3b), particularly in calcareous soils. In contrast, the Fe concentration in shoots did not show any relationship with either soil or shoot Cu concentrations. Noteworthy, plants exhibiting interveinal chlorosis symptoms exhibited the largest root Cu concentrations, among the lowest root Fe concentrations and among the largest shoot Fe concentrations.


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Table 2 Plant Cu and Fe concentration in shoots and roots, and shoot/root ratios of the Cu concentration in plant parts

sample Cu concentration Shoot/root ratios

Fe concentration

mg kg−1 DM mg kg−1 DM

shoots roots (total) roots (symplasmic)

Cu

shoots roots

1 11 85 29 0.31 79 1907 2 9 30 8 0.13 302 2854 3 24 74 27 0.33 149 2298 4 11 57 16 0.20 276 4201 5 7 20 11 0.32 135 2128 6 7 17 8 0.20 181 2126 7 8 26 14 0.42 266 7166 8 9 47 14 0.33 193 1943 9 7 23 12 0.31 326 5323 10 7 18 10 0.41 82 1509 11 9 36 13 0.26 134 4356 12 8 11 6 0.18 116 1078 13 11 78 16 0.32 127 1717 14 13 48 18 0.71 294 3956 15 10 55 22 0.24 364 2505 16 13 105 30 0.27 217 5444 17 9 27 13 0.14 112 2911 18 14 58 19 0.18 184 3289 19 13 53 14 0.24 169 3120 20 9 50 10 0.12 110 2961 21 13 85 21 0.15 189 6475 22 9 49 22 0.19 213 2620 23 14 29 8 0.49 271 6040 24 17 198 45 0.09 182 1531 25 11 65 14 0.17 255 4206 26 14 128 26 0.11 171 2619 27 8 56 12 0.15 277 2256 28 21 289 69 0.07 251 1217 29 7 39 10 0.19 168 2706 30 39 705 150 0.06 331 1358 31 8 26 8 0.30 119 4185 32 9 87 19 0.10 81 2715 33 8 53 9 0.15 173 1610 34 9 72 16 0.13 168 2580 35 12 80 13 0.14 156 1976 36 18 93 15 0.20 223 2103 37 11 213 57 0.05 166 2536 38 13 125 26 0.11 183 2280 39 15 17 7 0.86 193 4649 40 6 47 11 0.14 105 2404 41 10 54 14 0.19 412 3924 42 7 40 10 0.17 95 1632


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I.3.3. Relationships between plant Cu concentration and soil properties

Linear regressions were performed in order to define the relationships between Cu concentrations in plant parts (shoot Cu and root Cu), extractable soil Cu (total and EDTA-Cu) and other soil properties (pH, CEC, CaCO3, organic C, total N, Fe and Mn oxides and clay concentrations). As the two most Cu-contaminated samples (samples 28 and 30) were assumed to strongly influence some of the relationships, especially between soil Cu concentration and Cu concentrations in plants parts, linear regressions were also performed without samples 28 and 30. Relationships between root and shoot Cu concentrations and total soil Cu concentration are shown in Fig. 1.

Figure 1 Copper concentration in plant parts (mg kg−1 DM) as a function of Cu concentration in soil (mg kg−1

soil), measured in shoots (a)(b) and in roots (c)(d), for the 42 samples (a)(c) and for 40 samples (without the two most Cu-contaminated samples 28 and 30) (b)(d). Open circles stand for plants grown in calcareous soils and open triangles stand for plants grown in calcareous soils and exhibiting interveinal chlorosis symptoms while dark circles stand for plants grown in non calcareous soils.


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Shoot Cu concentration was correlated to total soil Cu concentration only when considering the 42 soils (Fig. 1a) (r = 0.32, P<0.05), not when excluding the two most contaminated soils (samples 28 and 30) (Fig. 1b). In contrast, a stronger relationship was found for root Cu concentration which increased with increasing total soil Cu concentration (r = 0.56, P<0.01) (Fig. 1c) even when excluding the two most contaminated soils (r = 0.49, P<0.01) (Fig. 1d). In addition, Cu concentration in shoots and roots were positively correlated to EDTA extractable Cu (r = 0.42 and 0.65, respectively, P<0.01) for the 42 samples, even when excluding the two most Cu-contaminated soils (r = 0.34, P<0.05 and 0.59, P<0.01, respectively), Soil pH was positively correlated to root Cu concentration (r = 0.33, P<0.05), even when excluding the two most Cu-contaminated soils (r = 0.32, P<0.05). Conversely, organic carbon concentration was not correlated to both shoot and root Cu concentrations. Nevertheless, it was positively correlated to total soil Cu concentration (r = 0.54, P<0.01) for the 42 soils and when excluding the two most Cu-contaminated soils (r = 0.47, P<0.01). Moreover, root Cu concentration appeared negatively correlated to clay content (P<0.01), CEC (P<0.01), Mehra-Fe oxides (P<0.05) and Mn oxides (P<0.01), while it appeared positively correlated to CaCO3 concentration (P<0.01), even when excluding the two most Cu-contaminated soils.

Figure 2 Interveinal chlorosis symptoms of alternate yellow and green stripes along the length of the leaf observed in durum wheat (a) cropped in the spot represented by the white circle where the tank for fungicide treatment of former vines was filled with Cu-salts (sample 30) (b) and such symptoms observed in durum wheat along rows across the field (sample 37) (c).


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Figure 3 Iron concentration in roots (mg kg−1 DM) as a function of Cu concentration in soil (mg kg−1 soil) (a) or Cu concentration in roots (mg kg−1 DM) (b) for the 42 samples. Open circles stand for plants grown in calcareous soils and open triangles stand for plants grown in calcareous soils and exhibiting interveinal chlorosis symptoms while dark circles stand for plants grown in non calcareous soils.

I.3.4. Chemical changes in the rhizosphere

Soil pH changes in the rhizosphere were negatively correlated to bulk soil pH (r = −0.83, P<0.01) (Fig. 4). In non calcareous soils, a significant (P<0.05) increase in rhizosphere pH was observed with decreasing soil pH. Rhizosphere alkalization was particularly pronounced in the most acidic soils (bulk soil pH equal or below 4.6 in samples 1-3) as it reached 0.8-1.1 pH units. In contrast, no significant change of rhizosphere pH was observed in the calcareous soils, as expected due to their large pH buffering capacity. The amount of Cu extracted by water varied from non detectable values (detection limit of 3 µg dm−3) to 1.2 mg kg−1 in the bulk soil and from non detectable values to 11.1 mg kg−1 in the rhizosphere (Fig. 5a). Amounts of Cu extracted by water were thus significantly (P<0.01) larger in the rhizosphere whatever the bulk soil pH. The largest amounts of Cu extracted by water were observed in the rhizosphere of either those plants growing in the most acidic soils (samples 1 and 3) or to those plants exhibiting interveinal chlorosis symptoms (samples 28, 30 and 37, triangles in Fig. 5a) combined with the largest root Cu concentrations. The amounts of Cu extracted by water in the rhizosphere presented the largest values and were significantly (P<0.01) larger than the amounts of Cu extracted by CaCl2. Indeed, the amounts of Cu extracted by CaCl2

varied from 0.06 to 3.1 mg kg−1 in the bulk soil and from 0.07 to 1.0 mg kg−1 in the rhizosphere (Fig. 5b). The amounts of Cu extracted by CaCl2 were slightly larger in the rhizosphere than in the bulk soil for 38 samples, but no significant difference was observed. In contrast, for 4 samples including the 3 most acidic soils (samples 1-3) the amounts of Cu extracted by CaCl2 were by far lower in the rhizosphere, compared with the bulk soil. Indeed, at bulk soil pH below 4.6, Cu extracted by CaCl2 reached 0.6-3.1 mg kg−1 in the bulk soil, while it amounted to only 0.1-0.2 mg kg−1 in the rhizosphere.


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Figure 4 Soil pH change (rhizosphere pH minus bulk soil pH) as a function of bulk soil pH (pH values measured in the CaCl2 extract). I.4. Discussion

I.4.1. Plant Cu uptake and Cu phytotoxicity in field-grown plants

In spite of the large range of total Cu concentration in the 42 investigated soils, Cu concentration in shoots varied within a narrow range, while root Cu concentration varied considerably (Table 2 and Fig. 1). The proportion of Cu actually absorbed by roots, i.e. symplasmic Cu, represented between 16-57% of total root Cu concentration. This confirmed for field-grown plants the results obtained in former studies conducted in the laboratory suggesting that the major part of root Cu was adsorbed onto root cell walls (Chaignon et al. 2002b), notably in calcareous soils as their high pH is prone to enhanced adsorption. With increasing soil Cu concentration, plants appeared capable of restricting Cu translocation towards their aerial parts, particularly in plants exhibiting interveinal chlorosis symptoms (shoot/root ratios in Table 2). As stressed in former studies, root Cu concentration was by far more sensitive to soil Cu contamination and thus appeared as a better indicator of Cu contamination than shoot Cu concentration presumably due to efficient control of Cu translocation from roots to shoots (Brun et al. 2001; McBride 2001; Chaignon and Hinsinger 2003; Chaignon et al. 2003). Copper concentrations in plants exhibiting interveinal chlorosis were larger, particularly in roots, than in plants which did not display such symptoms (Table 2 and Fig. 2). Such interveinal chlorosis symptoms in leaves of cereals are widely recognized as indicative of lime-induced Fe deficiency (Marschner 1995; Mengel and Kirkby 2001). When comparing pairs of samples of durum wheat exhibiting or not such interveinal chlorosis as collected in nearby locations in the same field plots, larger soil Cu concentration in samples 26, 28, 30 and 37 occurred to be related to larger plant Cu concentrations and Fe deficiency symptoms, compared with samples 25, 27, 29 and 38. Several studies with hydroponically-grown plants have reported that Cu phytotoxicity can result in chlorosis as a consequence of induced Fe deficiency (Lexmond and Van der Vorm 1981; Wheeler and Power 1995; Koppitke and Menzies 2006). In addition, McBride (2001) observed interveinal chlorosis symptoms in maize grown in Cu-spiked soils. Historical Cu contamination of vineyard soils seems to have resulted in Cu accumulation in plants, and hence in Fe deficiency chlorosis symptoms presumably related to Cu phytotoxicity.


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Figure 5 Copper extracted by water (mg kg−1 soil) (a) and Cu extracted by CaCl2 (mg kg−1 soil) (b) as a function of the pH measured in the bulk soil. Open diamonds stand for Cu extracted in the rhizosphere and open triangles stand for Cu extracted in the rhizosphere of plants exhibiting interveinal chlorosis symptoms while dark diamonds stand for Cu extracted in the bulk soil.

I.4.2. Interaction between Fe nutrition and Cu phytotoxicity

Root Fe concentration decreased with increasing soil Cu concentration (Fig. 3a) and with increasing root Cu concentration (Fig. 3b), especially for calcareous soils for which even when excluding the two most contaminated soils (samples 28 and 30) such decrease was still noticeable. Moreover, interveinal chlorosis symptoms coincided with low root Fe concentration, especially in the two most Cu-contaminated soils (Table 2). This suggested an antagonistic relation between Cu and Fe which may have led to impaired Fe uptake and to decreased Fe concentration in roots. In contrast, no such relationship was observed for shoot Fe concentration (Table 2). It has been reported that leaves exhibiting Fe deficiency symptoms may have larger total Fe concentrations than control leaves, probably because of Fe immobilization in the leaf apoplast (Sattelmacher 2001). Moreover, former studies showed that metabolically active Fe in leaves was better predictor of the Fe status compared with total Fe (Lang and Reed 1987). Determining active Fe in shoots may thus have led to ascertain whether interveinal chlorosis is due to low Fe activity as a result of Cu phytotoxicity. In addition, it has been shown in bread wheat that Cu uptake increased under Fe deficiency in a Cu-contaminated, calcareous soil as related to increased secretion of phytosiderophores (Chaignon et al. 2002b). In such soils, increased secretion of phytosiderophores might have increased the Cu uptake by plants at the expense of Fe uptake (Reichman and Parker 2005),


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so that symptoms of Cu phytotoxicity and induced Fe deficiency coincided, as shown by the interveinal chlorosis observed in situ.

I.4.3. Plant Cu concentration versus soil properties

Among soil chemical properties, soil pH, organic carbon concentration and soil Cu concentration are expected to influence the solid phase speciation of Cu (McBride 1981) and hence, Cu bioavailability. The EDTA extractable fraction of a metal is considered as the environmentally available fraction, i.e. the fraction which is potentially available for soil organisms (Harmsen et al. 2005). In the present work EDTA extractable Cu was indeed slightly better correlated to plant Cu concentration than total soil Cu. Our results, in spite of having been obtained in situ, are in line with those of Brun et al. (2001), Chaignon et al. (2003) and Nolan et al. (2005) who reported in pot experiments that total Cu concentration could surprisingly be an adequate predictor of plant Cu concentration, especially for root Cu concentration (Fig. 1). Nevertheless, poor linear correlation coefficients between plant Cu concentration and soil Cu concentration were obtained especially for mild soil Cu-contamination. This may be explained by sources of variations among the studied sites, and hence of factors influencing plant growth and Cu uptake which are manifold and include for instance variations in microclimate, agricultural practices and durum wheat cultivars. In addition, more evenly distributed soil Cu concentrations in the investigated range would have possibly improved the relationships between soil Cu concentration and plant Cu concentration, or at least help to ascertain these. Literature reported contradictory results concerning the effect of pH on Cu uptake by plants. In very acidic soils, plant Cu concentration increased compared to calcareous soils in rape (Brassica napus L.) and tomato (Lycopersicon esculentum L.) (Chaignon et al. 2002a, 2003; Cornu et al. 2007). Conversely, Cu accumulation in maize was as high in calcareous soils as in acid soils (Brun et al. 2001) and, according to Zhao et al. (2006) increasing soil pH may even increase Cu toxicity at a given free Cu2+ activity. The apparent paradox of increasing Cu toxicity with increasing pH, presumably due to decreased competition between proton and Cu for adsorption onto root cell walls, is partly explained by the Terrestrial Biotic Ligand Model (TBLM) which accounts for the effects of competing cations (proton, magnesium, calcium) at the biotic ligand sites and has been shown to adequately predict Cu toxicity (Thakali et al. 2006a, b). In the present study, no clear relationship between plant Cu uptake and soil pH was found. Nevertheless, root Cu concentration was positively correlated to soil pH and was significantly larger in calcareous soils than in non calcareous soils when considering the two most Cu-contaminated soils (samples 28 and 30), suggesting that root Cu concentration tended to increase with increasing pH. In addition, Fe chlorosis symptoms probably related to Cu phytotoxicity were observed only in calcareous soils. This suggests that plant Cu uptake and risks of Cu phytotoxicity might be greater in calcareous soils than in non calcareous soils. However, the investigated range of soil Cu concentration in non calcareous soils may have been too low to induce visible symptoms of Cu phytotoxicity. In addition to the abovementioned symptoms associated with induced Fe deficiency, it is well known that the primary symptom of Cu toxicity in plants is rhizotoxicity, which results in reduced root elongation (Koppitke and Menzies 2006). But, the sampling method employed in the present work was not suited to recover the whole root system and reliably measure root length.


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I.4.4. Root-induced changes in the rhizosphere of field-grown plants

Soil properties can differ between the bulk soil and the rhizosphere, so that chemical properties of the bulk soil might be poor predictor of Cu bioavailability which rather depends on the peculiar properties of the rhizosphere (Hinsinger and Courchesne 2007). Alkalization occurred at low pH in the rhizosphere compared with the bulk soil (Fig. 4). In non calcareous soils, such rhizosphere alkalization had been observed in pot experiment by Chaignon et al. (2002a), particularly at pH below 5.5. In the present work which reports on samples collected in field-grown plants, the large alkalization (0.8-1.1 pH unit) observed in the rhizosphere for the most acidic soils (samples 1-3) might have resulted from tolerance mechanism to low pH and resulting aluminium (Al) toxicity (Kochian et al. 2004). Such alkalization can affect rhizosphere chemistry, alleviate Al toxicity and similarly reduce Cu availability. Copper extractability was indeed altered in the rhizosphere (Fig. 5). Water extractable Cu is supposed to represent dissolved Cu in the soil solution (Courchesne et al. 2006) and CaCl2

extractable Cu represents exchangeable Cu (Chaignon et al. 2002a). Copper extracted by water was significantly larger in the rhizosphere than in the bulk soil whatever the soil pH (Fig. 5a). Conversely, amounts of Cu extracted by CaCl2 in the most acidic soils (samples 1-3) were by far larger in the bulk soil (about 4- to 18-fold larger). It has been shown that alkalization in the rhizosphere of tomato resulted in a reduction in the solubility of soil Cu (Cornu et al. 2007). In the present work, rhizosphere alkalization in the most acidic soils might have reduced CaCl2 extractability but not water extractability of Cu. The percentage of free Cu2+ has been shown to decrease with increasing pH and due to larger DOC (Vulkan et al. 2000). Actually, the major fraction of total soil solution Cu is usually present as a range of Cu-organic complexes, particularly at pH levels above 5 (Römkens et al. 1999). Former studies have reported larger DOC concentration in the rhizosphere compared with the bulk soil and have concomitantly observed larger amounts of dissolved Cu in the rhizosphere than in the bulk soil (Cattani et al. 2006; Courchesne et al. 2006). In addition, it has been observed that Ca-induced coagulation of organic matter might lead to underestimate Cu bound to organic matter in CaCl2 extracts (Sauvé et al. 1997). In the present study, greater water extractability of Cu in the rhizosphere, compared with CaCl2 extractability, could thus result from greater DOC concentration in the rhizosphere and presumably from larger concentration of dissolved organic substances able to mobilize Cu from the solid phase by complexation. Indeed, cereals release phytosiderophores (Reichman and Parker 2007), which have been shown to contribute to Zn and Cu mobilization in calcareous soils especially as a response to Fe deficiency (Treeby et al. 1989; Chaignon et al. 2002b). In calcareous soils which are prone to induce Fe deficiency, the release of phytosiderophores might thus explain the greater water extractability of Cu observed in the rhizosphere, compared with the bulk soil, which was particularly elevated in the rhizosphere of those plants which exhibited Fe deficiency symptoms (interveinal chlorosis) and the largest root Cu concentration (samples 28, 30 and 37). This may explain the increased uptake of Cu by plants found in these soils leading to Fe chlorosis. Degryse et al. (2006) observed that at a given free Cu2+ activity, Cu uptake was less in weakly buffered solutions than in solutions strongly buffered by soluble Cu complexes. In calcareous soils, larger amount of soluble organically bound Cu may serve as Cu buffer and lead to greater Cu uptake and phytotoxicity. Actually, the calcareous soils in which root Cu concentration and Cu phytotoxicity occurred had relatively high organic C contents (samples 26, 28 and 30). The buffering effect of DOC in the soil solution of calcareous soils may therefore be another reason for greater Cu phytotoxicity. Moreover, increased root exudation of organic anions as Cu- and Al-resistance mechanism was shown in various species, including wheat (Rengel 1996; Ma et al. 2001). In very acid soils, such


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increase in organic anion exudation could have resulted in Cu mobilization from the solid phase, leading to larger water extractability of Cu and to lower concentration of free Cu2+ species in soil solution due to complexation with organic anions, ultimately resulting in lower Cu uptake by plants despite the strong acidic pH of the bulk soil. In conclusion, our results showed that total soil Cu and EDTA extractable Cu could be reasonable predictors of Cu concentrations in field-grown plants, especially in elevated Cu-contaminated, former vineyard soils. This work revealed that plant Cu uptake and even risks of Cu phytotoxicity (interveinal chlorosis) as observed in situ might be larger in calcareous soils than in non calcareous soils due to a possible antagonism between Cu and Fe and larger DOC in soil solution. In addition, our results suggest the implication of root-induced changes of pH and DOC in the rhizosphere, leading to changes in solid phase speciation of Cu in the rhizosphere relative to the bulk soil, with potentially larger chemical mobility in the rhizosphere, as shown by the larger water extractability of Cu in the rhizosphere. In the most acidic soils, the large root-induced alkalisation may result in reduced Cu bioavailability. In the calcareous soils, the larger chemical mobility may be related to phytosiderophore secretion leading to greater Cu uptake in plants exhibiting Cu phytotoxic symptoms (interveinal chlorosis). Nevertheless, further experiments in controlled conditions are needed to demonstrate the implication of these root-induced chemical changes (e.g. pH, DOC) in the rhizosphere of cereals in Cu acquisition and phytotoxicity. I.5. Acknowledgements

We thank Jean-Pierre Barthès, Philippe Braun and Alain Alies for their technical support in this research and for identifying the soils to be sampled. The availability of farmers is gratefully acknowledged. We also thank Marc Benedetti, Laurence Denaix and André Schneider for their constructive comments. Financial support for this work was provided by the French Ministry of Ecology and Sustainable Development through its PNETOX programme, as well as an ECCO-ECODYN project. I.6. Literature

Afnor 1999 Recueil de Normes Françaises. Qualité des sols. Afnor, Paris Baize D 2000 Guide des analyses en pédologie, 2ème édition revue et augmentée. INRA, Paris Braun P 2006 Diagnostic des accidents du blé dur. ARVALIS - Institut du végétal, Paris Brun LA, Maillet J, Hinsinger P and Pépin M 2001 Evaluation of copper availability to plants in copper-

contaminated vineyard soils. Environ. Pollut. 111, 293−302 Carrillo-Gonzalez R, Simünek J, Sauvé S and Adriano D 2006 Mechanisms and pathways of trace element

mobility in soils. Adv. Agron. 91, 113−180 Cattani I, Fragoulis G, Boccelli R and Capri E 2006 Copper bioavailability in the rhizosphere of maize (Zea

mays L.) grown in two Italian soils. Chemosphere 64, 1972−1979 Chaignon V, Bedin F and Hinsinger P 2002a Copper bioavailability and rhizosphere pH changes as affected by

nitrogen supply for tomato and oilseed rape cropped on an acidic and a calcareous soil. Plant Soil 243, 219−228

Chaignon V, Di Malta D and Hinsinger P 2002b Fe-deficiency increases Cu acquisition by wheat cropped in a Cu-contaminated vineyard soil. New Phytol. 154,121−130

Chaignon V and Hinsinger P 2003 A biotest for evaluating copper bioavailability to plants in a contaminated soil. J. Environ. Qual. 32, 824−833

Chaignon V, Sanchez-Neira I, Herrmann P, Jaillard B and Hinsinger P 2003 Copper bioavailability and extractability as related to chemical properties of contaminated soils from a vine-growing area. Environ. Pollut. 123, 229−238

Cornu JY, Staunton S and Hinsinger P 2007 Copper concentration in plants and in the rhizosphere as influenced by the iron status of tomato (Lycopersicon esculentum L.). Plant Soil 292, 63–77

Coullery P 1997 Gestion des sols faiblement pollués par des métaux lourds. Revue Suisse d'Agriculture 29, 299−305


80

Courchesne F, Kruyts N and Legrand P 2006 Labile zinc concentration and free copper ion activity in the rhizosphere of forest soils. Environ. Toxicol. Chem. 25, 635−642

Degryse F, Smolders E and Parker DR 2006 Metal complexes increase uptake of Zn and Cu by plants: implications for uptake and deficiency studies in chelator-buffered solutions. Plant Soil 289, 171−185

Harmsen J, Rulkens W and Eijsackers H 2005 Bioavailability, concept for understanding or tool for predicting? Land Contam. Reclam. 13, 161−171

Hinsinger P and Courchesne F 2007 Mobility and bioavailability of heavy metals and metalloids at soil-root interface. In Biophysico-Chemical Processes of Heavy Metals and Metalloids in Soil Environments. Eds. A Violante, PM Huang and GM Gadd. John Wiley and Sons (in press)

Hinsinger P, Gobran GR, Gregory PJ and Wenzel WW 2005 Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytol. 168, 293−303

ISO 1999 Soil Quality. Guidance on the ecotoxicological characterisation of soils and soil materials. Guidelines no ISO TC 190/SC 7 ISO/DIS 15799. ISO, Geneva, Switzerland

Kochian LV, Hoekenga OA and Pineros MA 2004 How do crop plants tolerate acid soils? - Mechanisms of aluminium tolerance and phosphorous efficiency. Annu. Rev. Plant Biol. 55, 459−493

Kopittke PM and Menzies NW 2006 Effect of Cu toxicity on growth of cowpea (Vigna unguiculata). Plant Soil 279, 287−296

Lang HJ and Reed DW 1987 Comparison of HCl extraction versus total iron analysis for iron tissue analysis. J. Plant Nutr. 10, 795−804

Lebourg A, Sterckeman T, Ciesielshi H and Proix N 1998 Trace metal speciation in three unbuffered salt solutions used to assess their bioavailability in soil. J. Environ. Qual. 27, 584−590

Lexmond TM and Van der Vorm PDJ 1981 The effect of pH on copper toxicity to hydroponically grown maize. Neth. J. Agr. Sci. 29, 217−238

Ma JF, Ryan PR and Delhaize E 2001 Aluminium tolerance in plants and the complexing role of organic acids. Trends Plant Sci. 6, 273−278

Marschner H 1995 Mineral Nutrition of Higher Plants, 2nd edn. London, UK, Academic Press. 889 pp McBride MB 1981 Forms and distribution of copper in solid and solution phase of soil. In Copper in soils and

plants. Eds. Lorenagan JF, Robson AD and Graham RD. pp 25−45. Academic Press McBride MB 2001 Cupric ion activity in peat soil as a toxicity indicator for maize. J. Environ. Qual. 30, 78−84 Mengel K and Kirkby EA 2001 Principles of Plant Nutrition, 5th edn. Kluwer Academic Publishers Nolan AL, Zhang H and McLaughlin MJ 2005 Prediction of zinc, cadmium, lead, and copper availability to

wheat in contaminated soils using chemical speciation, diffuse gradients in thin films, extraction, and isotopic dilution techniques. J. Environ. Qual. 34, 496−507

Pietrzak U and McPhail DC 2004 Copper accumulation, distribution and fractionation in vineyard soils of Victoria, Australia. Geoderma 122, 151−166

Reichman SM and Parker DR 2005 Metal complexation by phytosiderophores in the rhizosphere. In Biogeochemistry of trace elements in the rhizosphere. Eds. Huang PM and Bobran GR. pp 129−156. Elsevier

Reichman SM and Parker DR 2007 Probing the effects of light and temperature on diurnal rhythms of phytosiderophore release in wheat. New Phytol. 174, 101−108

Rengel Z 1996 Tansley review no 89 - Uptake of aluminium by plant cells. New Phytol. 134, 389−406 Rieuwerts JS, Thornton I, Farago ME and Ashmore MR 1998 Factors influencing metal bioavailability in soils,

preliminary investigations for the development of a critical loads approach for metals. Chem. Spec. Bioavailab. 10, 61−75

Römkens PFAM, Bouwman LA and Boon GT 1999 Effect of plant growth on copper solubility and speciation in soil solution samples. Environ. Pollut. 106, 315−321

Sattelmacher B 2001 The apoplast and its significance for plant mineral nutrition. Tansley review, 22. New Phytol. 149: 167−192

Sauvé S, Cook N, Hendershot WH and McBride MB 1996 Linking plant tissue concentrations and soil copper pools in urban contaminated soils. Environ. Pollut. 94, 153−157

Sauvé S, McBride MB, Norvell WA and Hendershot WH 1997 Copper solubility and speciation of in situ contaminated soils, Effects of copper level, pH and organic matter. Water Air Soil Poll. 100, 133−149

Thakali S, Allen HE, di Toro D, Ponizovsky AA, Rooney CP, Zhao FJ and McGrath SP 2006a A Terrestrial Biotic Ligand Model. 1. Development and application to Cu and Ni toxicities to barley root elongation in soils. Environ. Sci. Technol. 40, 7085−7093

Thakali S, Allan HE, di Toro DM, Ponizovsky AA, Rooney CP, Zhao FJ, McGrath SP, Criel P, van Eeckhout H, Janssen CR, Oorts K, Smolders E 2006b Terrestrial Biotic Ligand Model. 2. Application to Ni and Cu toxicities to plants, invertebrates, and microbes in soil. Environ. Sci. Technol. 40, 7094−7100

Treeby M, Marschner H and Römheld V 1989 Mobilization of iron and other micronutrient cations from a calcareous soil by plant-borne, microbial, and synthetic metal chelators. Plant Soil 114, 217−226


81

Vulkan R, Zhao FJ, Barbosa-Jefferson V, Preston S, Paton GI and McGrath SP 2000 Copper speciation and impacts on bacterial biosensors in the pore water of copper-contaminated soils. Environ. Sci. Technol. 34, 5115−5121

Wheeler DM and Power IL 1995 Comparison of plant uptake and plant toxicity of various ions in wheat. Plant Soil 172, 167−173

Zhao FJ, Rooney CP, Zhang H and McGrath SP 2006 Comparison of soil solution speciation and diffusive gradients in thin-films measurement as an indicator of copper bioavailability to plants. Environ. Toxicol. Chem. 25, 733−742


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II. RHIZOtest: a plant-based biotest to account for rhizosphere processes to assess metal bioavailability Authors: M. N. Bravin, A. M. Michaud, B. Larabi and P. Hinsinger* Affiliation: INRA, UMR 1222 Biogéochimie du Sol et de la Rhizosphère (INRA-SupAgro), Place Viala, 34060 Montpellier, France * Corresponding author: [email protected], Tel: +33 4 99 61 22 49, Fax: +33 4 99 61 30 88 Capsule Compared with free Cu2+ and DGT-Cu flux, RHIZOtest-Cu flux accounted for those rhizosphere processes driving Cu bioavailability to wheat that had been observed in situ. Abstract The ability of a plant-based biotest, the RHIZOtest, the free ionic copper (Cu) selective electrode and the diffusive gradients in thin films (DGT) technique to estimate in situ root Cu concentration of durum wheat (Triticum turgidum durum L.) was assessed on 44 vineyard soils varying in pH (3.9-7.8) and total Cu (32-184 mg kg-1). In situ root Cu concentration was mainly correlated with total soil Cu. None of the tested indicators adequately predicted in situ root Cu concentration. DGT-Cu flux and even more so free Cu2+ activity were negatively correlated with soil pH and hence overestimated Cu bioavailability in acidic soils. In the RHIZOtest, rhizosphere alkalisation occurred as observed in situ and plant-Cu flux was therefore mainly driven by total soil Cu. The RHIZOtest appeared more relevant than chemical tests for assessing metal bioavailability to plants as it accounted for the root-induced chemical changes in the rhizosphere. Keywords: Bioassay, Bioavailability, DGT, Free ion selective electrode, RHIZOtest.


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II.1. Introduction

Innovative tools need to be developed and validated for evaluating metal bioavailability to plants cropped in contaminated soils. The environmental bioavailability of metals in soil, hereafter called metal bioavailability, can be operationally defined as the flux of metals across a given root surface-area of a target plant species for a fixed period of time (Harmsen et al. 2005; ISO 2006). The determination of metal bioavailability is a prerequisite for the assessment of food chain contamination and phytotoxicity, i.e. toxicological bioavailability (Peijnenburg et al. 1997). The metal bioavailability is usually assessed by chemical methods that actually measure the environmental availability (Peijnenburg et al. 1997). These methods can be divided in two approaches. In thermodynamically-driven approaches, metal availability is assessed by chemical extractions performed at/near equilibrium and the various extracted pools of soil metals are correlated with metal concentration in plants (Gupta and Aten 1993; Menzies et al. 2007). Some studies have related metal speciation in soil solution or in soil extracts with metal concentration in plants, following the free ion activity model (FIAM) which assumes plants take up free metal ions proportionaly to their activity in solution. For instance, some reasonably good correlations were found between the activity of free copper (Cu), cadmium (Cd) and zinc (Zn) in soil solution and plant metal concentration (Sauvé et al. 1996; Hough et al. 2005). The FIAM was recently challenged by the terrestrial biotic ligand model (TBLM), which accounts for the competition between the metal of interest and major cations and protons for binding sites onto plant roots (Lofts et al. 2004; Thakali et al. 2006). Further challenging those thermodynamically-driven approaches, Zhang et al. (2001) argued that metal bioavailability to plants was mainly driven by the kinetic limitations of the re-supply of free metal in solution from soluble and solid-phase labile pools. These authors suggested the use of the diffusive gradients in thin films (DGT) technique as a surrogate of metal acquisition by plants and observed a better correlation between shoot Cu concentration and DGT measurements than for free Cu2+ acitivity and other extraction procedures. This was the case for a hyperaccumulator plant (Zhang et al. 2001) but Nolan et al. (2005) later showed for wheat that DGT was not performing better than thermodynamically-driven methods (e.g. soil solution Cu concentration). Whatever their quality, none of the above-mentioned approaches accounted for the range of root activities that occur in the rhizosphere (McLaughlin et al. 1998; Hinsinger and Courchesne 2008), as they are usually deployed on bulk soils. However, many studies stressed the impact of rhizosphere processes, such as root-induced pH changes and exudation of complexing compounds, on metal bioavailability to plants (e.g. Chaignon et al. 2002a; Tao et al. 2003; Tao et al. 2004; Séguin et al. 2004; Cornu et al. 2007). Recently, Michaud et al. (2007, chapter 2.I) reported for field-grown durum wheat (Triticum turgidum durum L.) a higher root Cu concentration in some contaminated calcareous soils than in fairly acidic soils of equivalent total Cu concentration. This result was attributed to both an increase in Cu availability in the rhizosphere of calcareous soils due to the exudation of chelating compounds and a large decrease in Cu availability in the rhizosphere of the most acidic soils due to a drastic root-induced alkalisation. To account for such rhizosphere processes, Chaignon and Hinsinger (2003) developed a plant-based biotest, hereafter called RHIZOtest. Carrying on the in situ investigation of plant Cu contamination of Michaud et al. (2007, chapter 2.I), the present study aimed at showing the added-value of the RHIZOtest to account for rhizosphere processes when assessing Cu bioavailability to durum wheat compared with two chemical techniques, the determination of the free Cu2+ activity in soil extracts and DGT.


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II.2. Material and Methods

II.2.1. Soil properties and in situ experiment

Sampling sites (N = 44) were selected in former vineyard soils in Southern France to cover a broad range of total Cu concentration (32-184 mg kg-1) and pHCaCl2 (3.9-7.8). Amongst these soil samples, eighteen were calcareous (see supplementary data, Table SD-1). Forty sites cultivated with eleven different cultivars of durum wheat were taken into account in the in situ experiment. Four additional soil samples, including the most contaminated and strongly acidic soils, were only used for laboratory experiments (Table SD-2). Soil samples were air-dried and sieved to < 2 mm before analyses. Soil analyses were performed by a routine soil-testing laboratory (INRA LAS, Arras, France) according to standardised French (AFNOR 1999) or international (ISO 1999) procedures. The main soil properties are provided in supplementary data (Table SD-1) and were reported earlier by Michaud et al. (2007, chapter 2.I). At forty sites, durum wheat plants were sampled as previously detailed by Michaud et al. (2007, chapter 2.I). Briefly, plant roots were manually separated from soil clods and gently brushed in deionised water to remove adhering soil particles. Shoots and roots were oven-dried at 105°C, then digested in HNO3 in a microwave oven (Ethos Touch Control, Milestone, Italy) at 180°C for 10 min at 2 106 Pa pressure. Copper and iron concentration in the plant digests were measured by flame atomic absorption spectrometry (F-AAS, Varian SpectraAA-600, Australia).

II.2.2. ISE measurements of free ionic Cu activity

The forty four soils were extracted in 0.01 M CaCl2 using a 1:10 soil:solution ratio. CaCl2-extractable Cu was considered as a reasonable surrogate of soil solution Cu (Sauvé et al. 1997; Degryse et al. 2003). After CaCl2 addition, soil samples were shaken end-over-end for 2 h, then centrifuged at 10 000 g for 10 min before filtration (0.45 µm, cellulose acetate membrane). Free ionic Cu activity (pCu2+) was measured in CaCl2 extracts (on the day of extraction) with a Cu ion-selective electrode (ISE; DX264, Mettler Toledo, USA) and a double-junction reference electrode (InLab, Mettler Toledo, USA). Immediately after pCu2+ measurement, pH was determined with a combined glass-electrode (6.0234.110, Metrohm, Switzerland). Total Cu concentration of the extract was then determined by graphite furnace atomic absorption spectrometry (GF-AAS, Varian SpectraAA-600, Australia). The ISE was calibrated between pCu2+ 9.3-5.1 in 10-4 M Cu solutions buffered with iminodiacetic adic and potassium phthalate according to Sauvé et al. (1995). The pCu2+ was firstly calculated from the pCu2+ vs pH relationship described by Sauvé et al. (1997). The calibration curve was then described by a linear relationship between the ISE potential (E, mV) and pCu2+. The calibration showed a slope efficiency of 95 % compared to the theoretical Nerstian slope:

E = –28.2 pCu2+ + 230.7 R2 = 0.997 n = 34 (1) Single measurement (no replicate) was carried out for each soil, as some replicated measurements showed pCu2+ deviations lower than 5 %.


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II.2.3. DGT measurements

The DGT technique was used according to Zhang et al. (2001). The forty four soils (70 g per sample) were incubated in triplicate at 25°C for 24 h at around 70 and 100 % of the maximum water holding capacity for non-calcareous and calcareous soils, respectively. Then, cylindrical DGT units with an active surface area of 3.14 cm2 and a diffusive gel layer thickness of 0.093 cm were deployed at 25°C for 17 h onto the surface of each incubated soil. After the contact phase, each resin gel was eluted in 1.2 cm3 of 1 M HNO3 for 24 h. The concentration of eluted Cu was determined by GF-AAS. According to the bioavailability concept defined above, DGT measurements were computed as a flux (FDGT):

FDGT = m / (A t) (2) where m is the mass of Cu (ng) accumulated in the resin, A, the active surface area (m2) of DGT unit and, t, the deployment time (s).

II.2.4. RHIZOtest measurements

Chaignon and Hinsinger (2003) and Michaud (2007) designed the RHIZOtest which consisted in separating plant roots from soil with a 30-µm polyamide mesh to facilitate the collection of roots and rhizosphere (Figure SD-1). Briefly, durum wheat (cv. Acalou) was grown for three weeks in hydroponics and, at the same time, soils were incubated for 2 weeks in the growth chamber at about 70 and 100 % of the maximum water holding capacity for non-calcareous and calcareous soils, respectively. Three-week-old seedlings with a dense, planar root mat were then transferred onto a thin layer of soil (1.5-mm thick, 3 g dry soil) and connected to 1-dm3 nutrient solution of following composition (µM): Ca(NO3)2 2000, KNO3 2000, MgSO4 1000, KH2PO4 50, H3BO3 10, MnCl2 2, ZnSO4 1 and Na2MoO4 0.05. After 8 days of contact, the soil was considered as rhizosphere soil. The root-induced changes in the rhizosphere were measured relative to control soil samples incubated in similar devices without plant (bulk-soil controls). Devices with and without plants were replicated five times for each of the 44 soils. At harvest, shoots and roots were oven-dried and digested as described above for field-grown plants. Copper concentration in shoot and root digests were measured by F-AAS. RHIZOtest measurements were computed as a flux (FRHIZ) according to equation (2) where m is the mass of Cu (ng) accumulated in the whole plants during the 8-day soil stage, A, the surface area (m2) of soil-root contact and, t the duration (s) of soil stage. At harvest, rhizosphere and bulk soil were oven-dried at 60°C. Soil Cu was extracted with 0.01 M CaCl2 as described above for ISE measurements. Copper concentration and pH were measured in each soil extract by F-AAS (or GF-AAS when necessary) and with a combined glass-electrode, respectively.

II.2.5. Statistics

Plant and soil parameters were Log10-transformed before stepwise and multi-linear regression analyses. Analyses of variance (HSD Tuckey’s test), simple, stepwise and multi-linear regressions were performed with Statistica (version 6, StatSoft). The level of statistical significance was represented by * and ** for P ≤ 0.05 and P ≤ 0.001, respectively.


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II.3. Results

II.3.1. In situ root Cu concentration in field-grown plants

As it was not possible to estimate in situ Cu bioavailability as a flux, we chose root Cu concentration as the in situ indicator of Cu bioavailability. Indeed, shoot Cu concentration was far less sensitive to soil Cu contamination than root Cu concentration, due to a highly regulated translocation of Cu from roots to shoots (Michaud et al. 2007, chapter 2.I). Root Cu concentration of field-grown plants was mainly correlated with total soil Cu (R2 = 0.36) and clay concentration (R2 = 0.43). In contrast, root Fe concentration was neither correlated with total nor EDTA extractable Fe in soil (Michaud 2007) which suggested that washing step properly cleaned the roots and that the remaining soil particles did not bias the measurement of root Cu concentration. Stepwise linear regression yielded the following relationship between root Cu concentration and soil properties:

Log10(Root Cu) = 1.0 (± 0.1) Log10(Total Cu) – 0.6 (± 0.1) Log10(Fe oxides) – 0.6 (± 0.1) Log10(CEC) + 1.0 (± 0.4) R2 = 0.73** n = 40 (3)

A significant multi-linear regression could also be found with total soil Cu and pH alone (Table 1). Root Cu concentration was actually positively correlated with soil pH, because of the larger concentration found in plants growing in some calcareous soils (soil samples 28, 30, 39 and 40; Table SD-2). In addition, a correlation matrix between the major soil properties was shown in supplementary data (Table SD-3).

II.3.2. ISE-Cu measurements

Root Cu concentration was not significantly correlated with pCu2+, neither in non-calcareous soils, nor in calcareous soils (Figure 1.a). In calcareous soils, pCu2+ was greater than 8, while root Cu concentration varied from 17 to 213 mg kg-1. In non-calcareous soils, pCu2+ varied over three orders of magnitude, from 5.4 to 8.5, while root Cu concentration varied much less (11-105 mg kg-1). The percentage of free Cu2+ relative to total CaCl2-extractable Cu (Cu-CaCl2) ranged between 0.7 and 11.4 % in calcareous soils, while it increased with decreasing pH in non-calcareous soils, up to 90 % in the most acidic soils (Table SD-2). pCu2+ was mostly determined by pH, particularly in non-calcareous soils (Figure 2.a, Table 1). No other soil parameter suitably improved pCu2+ prediction.

II.3.3. DGT-Cu measurements

DGT-Cu flux was significantly correlated with in situ root Cu concentration when distinguishing calcareous (exponential relationship) and non-calcareous soils (logarithmic relationship) (Figure 1.b). Stepwise linear regression yielded the following relationship between DGT values and soil properties:

Log10(FDGT) = 1.9 (± 0.3) Log10(Clay) + 1.9 (± 0.2) Log10(Total Cu) – 1.9 (± 0.3) Log10(CEC) – 1.2 (± 0.2) Log10(Fe oxides) – 3.8 (± 0.6) R2 = 0.80** n = 44 (4)

DGT-Cu flux was also significantly correlated to both total soil Cu and pH according to a multi-linear regression but, contrary to in situ root Cu concentration, DGT-Cu flux was negatively correlated with pH (Table 1). The largest values of DGT were found in the most contaminated and acidic soils (Figure 2.b, c). For the most contaminated soils


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(> 100 mg Cu kg-1), DGT-Cu fluxes were significantly greater (P < 0.001) in the most acidic soils (pH < 5) than in calcareous soils.

Figure 1. Relationships between in situ (root Cu concentration) and laboratory assessments (ISE, a; DGT, b; RHIZOtest, c) of Cu bioavailability to durum wheat (n = 40).


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Table 1. Linear regressions of in situ (root Cu concentration), ISE (pCu2+), DGT (FDGT) and RHIZOtest (FRhiz) measurements against total Cu concentration and/or pH of soils.

Bioavailability indicators

Soil parameters Constants n R2

Log10(Root Cu) = 1.0 (± 0.2) Log10(Total Cu) + 0.08 (± 0.03) pHα – 0.8 (± 0.5) 40 0.44**

pCu2+ = 0.81 (± 0.04) pHβ + 2.5 (± 0.3) 40 0.92** pCu2+ = 0.89 (± 0.03) pHβ + 1.9 (± 0.2) 44 0.95**

Log10(FDGT) = 1.6 (± 0.2) Log10(Total Cu) – 0.08 (± 0.03) pHα – 1.6 (± 0.5) 40 0.61**

Log10(FDGT) = 1.6 (± 0.2) Log10(Total Cu) – 0.11 (± 0.03) pHα – 1.3 (± 0.5) 44 0.64**

Log10(FRhiz) = 0.6 (± 0.1) Log10(Total Cu) – 0.09 (± 0.19) 40 0.53**

Log10(FRhiz) = 0.63 (± 0.09) Log10(Total Cu) – 0.08 (± 0.19) 44 0.52** α pH determined in CaCl2 (ratio 1:5) according to NF-ISO 10390 β pH measured in CaCl2 extracts (ratio 1:10) in which pCu2+ were also determined

II.3.4. RHIZOtest-Cu measurements

RHIZOtest-Cu flux was loosely but significantly correlated with in situ root Cu concentration in non-calcareous soils and in the whole set of soils (R2 = 0.22* and 0.13*, respectively), while in calcareous soils, no significant correlation was found (Figure 1.c). Stepwise linear regression yielded the following relationship between RHIZOtest and soil properties:

Log10(FRhiz) = 0.74 (± 0.09) Log10(Total Cu) + 0.6 (± 0.1) Log10(CEC) – 0.3 (± 0.1) Log10(Clay) – 0.33 (± 0.09) Log10(Corg) + 0.1 (± 0.3) R2 = 0.72** n = 40 (5)

Figure 2. ISE (pCu2+) (a), DGT (FDGT) (b and c) and RHIZOtest (FRHIZ) (d) measurements against total Cu and/or pH of soils (n = 44). Symbols with a white cross stand for the four additional, most acidic soil samples. pHISE was directly determined in CaCl2 extracts during ISE measurements.


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When the four additional strongly acidic soils (for which no in situ root Cu values were available) were taken into account, RHIZOtest-Cu flux was significantly driven by total soil Cu alone (Table 1, Figure 2.d). Thus, in contrast with ISE and DGT, RHIZOtest-Cu flux was not correlated with soil pH. No significant difference could be found between non-calcareous and calcareous soils, even when the most contaminated (> 100 mg Cu kg-1) strongly acidic soils (pH < 5) were compared with calcareous soils. Durum wheat substantially increased rhizosphere pH relative to bulk-soil pH, up to +1.8 pH unit in the most acidic soils (Figure 3.a). This rhizosphere alkalisation was strongly, negatively correlated with bulk-soil pH in non-calcareous soils. In contrast, rhizosphere pH change in calcareous soils was small (–0.14 to +0.06 pH unit) and often insignificant.

Figure 3. Root-induced alkalisation and impact on Cu availability in the Rhizotest experiment: pH (a) and CaCl2-extracted Cu (b) changes between rhizosphere (RZ) and bulk soils (BS) (n = 44). Symbols with a white cross stand for the four additional, most acidic soil samples. Regression line and equation in (a) stand for non calcareous soils only. In bulk soils, Cu-CaCl2 concentration increased logarithmically up to 464 µg dm-3 as pH was reduced below 5 (Figure 3.b). In line with rhizosphere alkalisation, Cu-CaCl2 concentration in the rhizosphere of the most acidic soils was much lower than in bulk soils. Consequently, Cu-CaCl2 concentration in the rhizosphere of the 44 soils ranged between 10 and 77 µg dm-3 and was independent of pH. RHIZOtest and DGT Cu fluxes were in the same order of magnitude ranking between 5-27 and 1-64 ng Cu m-2 s-1, respectively (Figure 4, Table SD-2). In calcareous soils and non-calcareous soils with pH > 5, RHIZOtest-Cu flux was either slightly larger or slightly smaller than DGT-Cu flux. DGT-Cu flux was significantly (P < 0.05) larger than RHIZOtest-Cu flux in the most acidic soils (pH < 5).


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II.4. Discussion

Despite the wide range of soil pH, in situ root Cu concentration was poorly correlated to pH and even tended to be higher in some contaminated, calcareous soils as already stressed by Michaud et al. (2007, chapter 2.I). They suggested the implication of root-induced processes such as rhizosphere alkalisation and exudation of Cu-chelating compounds. In comparison with in situ measurements, ISE, DGT and RHIZOtest measurements showed distinct patterns according to their sensitivity to total soil Cu and pH.

Figure 4. Comparison of RHIZOtest (FRHIZ) and DGT (FDGT) fluxes (n = 44). Symbols with a white cross stand for the four additional, most acidic soil samples. ISE measurements carried out on bulk soil predicted a much larger bioavailability of Cu in the most acidic soils, in which pCu2+ reached 5.3, and a minimal bioavailability of Cu in calcareous soils. Free Cu2+ activity was strongly pH dependent as previously reported (Sauvé et al. 1997; Vulkan et al. 2000). The absence of a strong pH dependence of in situ root Cu concentration fully discounted free Cu2+ activity measured on bulk soil as an indicator of Cu bioavailability. This discrepancy could be partly explained by the competing interaction between Cu2+ and protons for binding in root apoplasm as accounting for by the TBLM (Thakali et al. 2006). However, in contrast with Zhao et al. (2006), the relationship between in situ root Cu concentration and free Cu2+ activity was only poorly improved by soil pH (R2 = 0.17*, n = 40, results not shown). When accounting for the rhizosphere alkalisation reported in situ (Michaud et al. 2007, chapter 2.I), the new computation of pCu2+ in the rhizosphere, based on the pCu2+-pH relationship determined in CaCl2 extracts (Figure 2.a), ranged between 6.5-8.5 instead of 5.3-8.5 but remained substantially greater in strongly acidic soils than in alkaline soils. The remaining discrepancy could be explained by the TBLM applied to the rhizosphere soil. Therefore, metal bioavailability to plants would not be determined by soil solution metal speciation, especially when determined on bulk soil. Zhao et al. (2006) suggested that the re-supply of free Cu2+ from labile pools of soil Cu would participate to the control of Cu bioavailability to plants. Among the measurements performed in this study, DGT exhibited the best correlation coefficients with in situ root Cu concentration, especially in calcareous soils (Figure 1.b). This suggests that some Cu depletion occurred in the rhizosphere of durum wheat, which was reasonably mimicked by DGT. This conclusion especially stands for calcareous soils where the labile pool of organically-bound Cu in solution may have played a prominent role in the


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re-supply of free Cu2+. Zhang et al. (2001) found highly significant correlation between DGT measurements and shoot Cu concentration for a hyperaccumulator plant. With agricultural plants, subsequent results were rather contradictory. While shoot and root Cu concentrations of tomato have been reported to correlate fairly well with DGT measurements (Zhao et al. 2006), Nolan et al. (2005) found a better correlation with total soil Cu for bread wheat. However in the present case, in contrast with in situ measurements, DGT-Cu flux was significantly larger in the most acidic soils (pH < 5) than in calcareous soils. This result could be explained by the pH sensitivity of DGT (Figure 2.c), which was previously reported for Cd and Zn (Rachou et al. 2004; Zhang et al. 2004; Cornu and Denaix 2006). The opposite conclusions drawn from in situ and DGT measurements for calcareous and strongly acidic soils could be due to the implication of rhizosphere processes in the control of Cu bioavailability, as reported in situ by Michaud et al. (2007, chapter 2.I). As DGT is unable to account for such processes when deployed onto bulk soils, DGT might be a good surrogate of metal bioavailability to plants for those plant species which do not induce other processes than metal depletion in the rhizosphere, or when deployed onto rhizosphere rather than bulk soil (Fitz et al. 2003). However, the latter would be difficult to achieve in practice (Feng et al. 2005; Fang et al. 2007). In comparison with DGT, the RHIZOtest was designed to account for all the chemical processes occurring in the rhizosphere. The RHIZOtest reproduced fairly well the alkalisation previously observed in the rhizosphere of field-grown durum wheat cropped in the most acidic soils and its strong dependency with bulk-soil pH (Michaud et al. 2007, chapter 2.I; Figure 3.a). Such rhizosphere alkalisation of acidic soils had been already observed in former RHIZOtest experiments with oilseed rape and tomato (Chaignon et al. 2002a; Cornu et al. 2007) as well as in the rhizosphere of field-grown cereals and legumes (Bagayoko et al. 2000). Rhizosphere alkalisation in the most acidic soils greatly decreased the availability of Cu in soil solution, as underlined by the decrease in CaCl2-Cu concentration (Figure 3.b), and the consequent exposure of roots to Cu. It was such that Cu bioavailability was ultimately not related to pH but mainly to total soil Cu (Figure 2.d). This result points out the need to account for rhizosphere processes when assessing metal bioavailability and thus to develop biological tools such as the RHIZOtest. The sink effect induced by the RHIZOtest was in the same order of magnitude as for DGT, which suggests a kinetic limitation in plant Cu acquisition. Major differences between DGT and RHIZOtest were found in the most contaminated and acidic soils, in which fluxes were substantially larger for DGT than RHIZOtest (Figure 4). This can be explained by the DGT not being able to account for the rhizosphere alkalisation which occurred in such soils. In contrast, RHIZOtest flux was larger than DGT flux in some other soils, especially among calcareous soils. However, this is surprising if one considers that Cu is supplied only by diffusion. DGT induces a zero-sink effect at the surface of the resin, which consequently corresponds to the maximal flux of Cu which can be achieved by diffusion for a given soil and a given diffusive gel layer thickness. This result suggests a possible implication of root-induced increase in Cu availability in the rhizosphere, possibly via exudation of Cu-chelating compounds that DGT is unable to account for when deployed onto bulk soil. Cattani et al. (2006) reported an increase in Cu availability measured by DGT in the rhizosphere of maize (Zea mays L.) cropped in a calcareous soil compared with bulk soil, and a concurrent increase in the concentration of dissolved organic carbon. The ability of the RHIZOtest to account for root exudation was already reported by Chaignon et al. (2002b), who observed a larger exudation rate of Cu-chelating compounds for Fe-deficient wheat and a consequent larger Cu concentration in roots. Surprisingly, although the RHIZOtest seemed able to account for rhizosphere processes, the corresponding fluxes showed only poor correlations with in situ measurements


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(Figure 1.c). This discrepancy could be partly explained by the use of only one cultivar of durum wheat in the RHIZOtest compared with a range of cultivars in situ. Michaud (2007) observed a large range of sensitivity to Cu phytotoxicity (induction of Fe chlorosis) among twelve cultivars of durum wheat cropped in two Cu-contaminated, calcareous soils. More importantly, concentration of Cu in field-grown plants were probably subject to considerable variations from a soil to another as a consequence of the varying farmers’ practices and differences in soil fertility. In contrast, the RHIZOtest resulted in standardised growth among the tested soils. II.5. Conclusion

None of the tested indicators (ISE, DGT and RHIZOtest) was a reasonable surrogate of in situ root Cu concentration which underlines the difficulty to predict in situ metal bioavailability to plants. The DGT measurements exhibited the best fit with in situ measurements when distinguishing acidic and calcareous soils. This suggests that the creation of a depletion zone in the rhizosphere could be a prominent process driving plant Cu acquisition, as accounted for by DGT. However, DGT was operationally deployed onto bulk soil, where chemistry often greatly differs from the rhizosphere, and led to large overestimates of Cu bioavailability in acidic soils compared with in situ metal concentration in plants. The RHIZOtest was the only method accounting for those root-induced changes in the rhizosphere, as observed in situ, while also accounting for the kinetic limitation of Cu diffusion in soil. It therefore appears as a promising tool which should be integrated in the procedure of risk-based assessment of metal bioavailability to plants. Its application to other metals now needs to be further addressed. We should stress that bioavailability may vary with plant species/cultivars, which requires testing different plant species for proper risk assessment of contaminated sites. II.6. Acknowledgements

We gratefully acknowledge Benoît Cloutier-Hurteau and Laurence Denaix for introduction to ISE and DGT measurements, respectively. We thank Antonio Bispo, Pierre Czernic, Yves Dudal, Frédéric Gérard, Jérôme Rose and André Schneider for their constructive comments. Financial support was provided by an ECCO-ECODYN project and the PNETOX programme of the French Ministry of Ecology and Sustainable Development.


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II.7. Supplementary data

Selected soil properties (Table SD-1), results from in situ, ISE, DGT and RHIZOtest experiments (Table SD-2), RHIZOtest experimental device (Figure SD-1) and a correlation matrix of soil properties (Table SD-3) are shown in supplementary data. This material is available online alongside the electronic version of the article. Table SD-1. Selected soil properties.

Sand Silt Clay Corg CEC Al oxidesββββ Fe oxidesββββ Total Cu Soil samples

Michaud et al. (2007)αααα g kg-1

pH CaCl2 cmol+ kg-1 g kg-1 mg kg-1

1* 487 166 347 7.0 3.9 9.3 3.1 19.9 112 2* 578 176 246 15.5 4.1 7.7 2.7 14.2 184 3* 688 116 196 6.3 4.2 5.6 2.2 12.9 89 4* 388 145 467 13.6 4.2 15.5 3.5 19.7 126 5 1 544 233 223 4.5 4.2 5.8 2.6 18.4 117 6 2 441 186 373 10.5 4.3 11.6 2.9 19.7 88 7 3 696 174 130 3.8 4.6 3.6 1.9 10.9 100 8 4 463 284 253 17.0 5.3 9.8 1.7 13.1 97 9 5 532 208 260 5.7 5.4 9.8 2.5 14.3 82 10 6 428 209 363 6.0 5.5 14.7 3.2 20.5 72 11 7 433 199 368 11.7 5.5 14.2 2.4 19.4 79 12 8 367 250 383 15.1 5.6 14.8 2.5 19.7 165 13 9 523 197 280 9.1 5.8 8.8 2.7 17.2 53 14 10 397 220 383 9.1 5.9 15.8 2.3 16.0 94 15 11 597 239 164 5.6 5.9 8.3 1.6 11.4 89 16 12 589 170 241 7.8 5.9 10.8 1.9 10.7 32 17 13 494 236 270 17.6 6.0 14.6 3.1 20.7 184 18 14 462 275 263 8.9 6.2 14.1 1.8 12.7 123 19 15 572 219 209 15.1 6.3 10.9 2.1 16.1 150 20 16 634 214 152 11.9 6.3 10.4 1.3 5.7 140 21 17 539 138 323 8.7 6.3 14.3 2.4 13.5 87 22 18 435 295 270 8.8 6.3 14.5 1.8 13.9 141 23 19 386 284 330 18.1 6.4 16.1 2.1 18.6 158 24 20 682 149 169 12.1 6.9 11.6 1.5 8.4 103 25 21 592 208 200 11.1 6.9 10.9 1.3 9.6 67 26 22 410 243 347 11.1 7.2 15.1 2.1 15.2 152 27c 23 58 556 266 14.5 7.8 14.8 1.9 17.4 56 28c 24 730 132 94 5.4 7.6 6.2 1.0 8.5 146 29c 25 453 321 120 11.3 7.6 7.9 1.4 13.7 111 30c 26 517 280 108 11.5 7.6 7.0 1.3 13.5 163 31c 27 426 350 127 11.3 7.6 8.7 1.4 14.4 155 32c 29 382 377 137 10.4 7.6 8.5 1.4 15.2 128 33c 31 593 180 205 3.5 7.6 13.1 1.6 10.1 59 34c 32 402 184 133 7.0 7.7 8.7 0.4 6.9 70 35c 33 475 218 152 13.8 7.6 13.1 0.8 4.8 84 36c 34 421 212 152 11.2 7.7 11.8 0.8 4.8 117 37c 35 429 192 99 14.2 7.6 9.6 0.6 4.2 120 38c 36 430 228 118 15.0 7.6 11.5 0.8 4.5 150 39c 37 454 145 133 8.2 7.6 10.4 0.7 3.5 114 40c 38 415 140 135 8.9 7.7 10.6 0.8 3.5 78 41c 39 557 145 292 5.4 7.5 16.7 1.9 12.4 43 42c 40 356 193 290 8.4 7.7 16.3 1.6 12.1 106 43c 41 475 189 332 7.3 7.5 16.8 2.2 17.7 103 44c 42 493 232 207 12.8 7.5 15.1 1.5 10.1 147

* Additional soil samples used for ISE. DGT and RHIZOtest measurements c Calcareous soil samples α Correspondence with soil samples reported by Michaud et al. (2007) β Extracted according to Mehra-Jackson procedure


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Table SD-2. In situ (root Cu concentration; n = 40) and laboratory (ISE, DGT and RHIZOtest; n = 44) assessment of Cu bioavailability to durum wheat. Values in brackets stand for standard error.

In situ ISE DGT RHIZOtest Root Cu

content FDGT FRHIZ

Soil samples

mg kg-1

pCu2+ % Cu2+

αααα pHββββ

ng m-2 s-1 1* 5.3 89.8 4.0 53.1 (22.7) 18 (3) 2* 5.3 57.6 4.1 63.8 (17.1) 25 (6) 3* 5.5 65.5 4.3 50.8 (6.2) 22 (5) 4* 5.6 57.9 4.2 24.9 (6.6) 15 (3) 5 85.4 5.4 80.7 4.3 31.8 (5.8) 18 (5) 6 29.5 6.2 85.8 4.4 7.9 (3.0) 11 (4) 7 73.8 5.8 57.7 4.7 31.1 (4.8) 13 (4) 8 56.6 7.3 12.5 5.5 24.2 (6.7) 13 (5) 9 20.3 7.1 61.9 5.6 5.4 (2.9) 15 (7) 10 17.2 7.4 18.8 5.7 4.1 (1.1) 17 (5) 11 26.1 7.4 7.9 6.0 12.2 (1.1) 12 (6) 12 47.1 7.5 23.5 5.9 43.4 (13.9) 18 (4) 13 23.4 7.5 29.5 6.3 5.5 (0.5) 5 (1) 14 18.2 7.7 12.1 6.3 18.5 (6.3) 11 (7) 15 35.7 7.4 17.6 6.0 10.0 (6.2) 11 (3) 16 10.7 7.8 20.2 6.3 3.4 (0.5) 7 (3) 17 78.4 7.6 11.2 6.6 29.4 (11.9) 27 (16) 18 47.8 7.5 19.1 6.2 11.3 (2.2) 18 (5) 19 55.2 7.9 29.0 6.5 29.0 (4.2) 14 (5) 20 104.6 7.7 5.4 6.4 24.7 (7.0) 20 (2) 21 27.3 7.7 3.1 6.3 6.7 (2.9) 13 (4) 22 57.8 7.6 5.0 6.2 12.2 (1.7) 19 (9) 23 52.9 8.3 0.9 6.9 14.7 (1.9) 20 (6) 24 50.0 8.3 1.9 6.9 20.3 (3.4) 21 (3) 25 85.1 8.4 0.8 7.0 9.2 (1.6) 8 (2) 26 48.7 8.5 1.0 7.4 16.0 (5.6) 20 (3) 27c 28.9 8.3 4.7 7.2 2.0 (2.3) 10 (6) 28c 197.9 8.3 1.0 7.3 23.3 (5.6) 18 (7) 29c 65.1 8.3 2.4 7.3 8.3 (3.2) 11 (5) 30c 128.0 8.3 0.7 7.2 22.4 (1.7) 20 (5) 31c 55.7 8.3 1.8 7.3 10.5 (8.7) 25 (5) 32c 38.5 8.4 2.3 7.3 6.7 (4.7) 17 (2) 33c 25.8 8.1 11.4 7.3 1.8 (0.5) 16 (4) 34c 86.7 8.2 5.1 7.3 13.1 (8.3) 14 (2) 35c 52.5 8.5 1.0 7.4 12.4 (3.2) 19 (4) 36c 71.5 8.4 1.1 7.3 22.0 (8.5) 25 (8) 37c 80.5 8.4 1.0 7.2 12.1 (3.9) 15 (2) 38c 92.7 8.2 1.8 7.1 24.0 (4.7) 19 (2) 39c 213.2 8.3 1.8 7.2 24.9 (17.1) 22 (4) 40c 124.9 8.4 1.1 7.3 18.7 (4.2) 14 (3) 41c 17.4 8.2 5.8 7.2 1.4 (1.0) 13 (5) 42c 46.5 8.2 3.4 7.2 9.0 (4.4) 16 (5) 43c 53.8 8.2 4.4 7.2 12.4 (1.7) 18 (5) 44c 39.7 8.0 6.6 7.2 19.0 (7.1) 24 (3) * Additional soil samples used for ISE. DGT and RHIZOtest measurements c Calcareous soil samples α Ratio of free Cu2+ concentration to total Cu concentration in CaCl2 extracts. Free Cu2+ concentrations were calculated from Cu2+ activities and the activity coefficient. The latter was calculated using the extended Debye-Hückel equation. β pH measured in CaCl2 extracts (ratio 1:10) in which pCu2+ were also determined


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Figure SD-1. RHIZOtest experimental device. Table SD-3. Correlation matrix of soil properties (n = 44). *, ** and *** stand for a significant correlation at P ≤ 0.05, P ≤ 0.01 and P ≤ 0.001, respectively. Sand Silt Clay Corg pHCaCl2 CEC Al oxides Fe Total Cu Sand 1.00 -0.66*** -0.31 -0.25 -0.40* -0.44** -0.02 -0.25 -0.01 Silt 1.00 0.01 0.14 0.40** 0.05 0.06 0.35* 0.19 Clay 1.00 -0.48** 0.06 0.70*** 0.80*** 0.74*** -0.16 Corg 1.00 0.12 0.16 -0.71*** -0.53*** 0.09 pHCaCl2 1.00 0.27 -0.04 0.10 0.49** CEC 1.00 0.32* 0.29 -0.03 Al oxides 1.00 0.89*** -0.05 Fe oxides 1.00 0.09 Total Cu 1.00


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II.8. Literature

AFNOR 1999 Recueil de normes françaises. Qualité des sols, Paris. Bagayoko M, Alvey S, Neumann G and Buerkert A 2000 Root-induced increases in soil pH and nutrient

availability to field-grown cereals and legumes on acid sandy soils of Sudano-Sahelien West Africa. Plant Soil 225, 117-127.


Chaignon V, Bedin F and Hinsinger P 2002a Copper bioavailability and rhizosphere pH changes as affected by nitrogen supply for tomato and oil seed rape cropped on an acidic and a calcareous soil. Plant Soil 243, 219-228.

Chaignon V, Di Malta D and Hinsinger P 2002b Fe-deficiency increases Cu acquisition by wheat cropped in a Cu-contaminated vineyard soil. New Phytol. 154, 121-130.

Chaignon V and Hinsinger P 2003 A biotest for evaluating copper bioavailability to plants in a contaminated soil. J. Environ. Qual. 32, 824-833.

Cornu J Y and Denaix L 2006 Prediction of zinc and cadmium phytoavailability within a contaminated agricultural site using DGT. Environ. Chem. 3, 61-64.

Cornu J Y, Staunton S and Hinsinger P 2007 Copper concentration in plants and in the rhizosphere as influenced by the iron status of tomato (Lycopersicum esculentum L.). Plant Soil 292, 63-77.

Degryse F, Broos K, Smolders E and Merckx R 2003 Soil solution concentration of Cd and Zn can be predicited with a CaCl2 soil extract. Eur. J. Soil Sci. 54, 149-157.

Fang J, Wen B, Shan X-Q, Lin J-M and Owens G 2007 Is an adjusted rhizosphere-based method valid for field assessment of metal phytoavailability? Application to non-contaminated soils. Environ. Pollut. 150, 209-217.

Feng M H, Shan X Q, Zhang S and Wen B 2005 A comparison of the rhizosphere-based method with DPTA, EDPA, CaCl2, and NaNO3 extraction methods for prediction of bioavailability of metals in soil to barley. Environ. Pollut. 137, 231-240.

Fitz W J, Wenzel W W, Zhang H, Nurmi J, Stipek K, Fischerova Z, Schweiger P, Köllensperger G, Ma L Q and Stingeder G 2003 Rhizosphere characteristics of the arsenic hyperaccumulator Pteris vittata L. and monitoring of phytoremoval efficiency. Environ. Sci. Technol. 37, 5008-5014.

Gupta S K and Aten C 1993 Comparison and evaluation of extraction media and their suitability in a simple model to predict the biological relevance of heavy metal concentrations in contaminated soils. Int. J. Environ. Anal. Chem. 51, 25-46.

Harmsen J, Rulkens W and Eijsackers H 2005 Bioavailability: concept for understanding or tool for prediciting? Land Contam. Recl. 13, 161-171.

Hinsinger P and Courchesne F 2008 Biogeochemistry of metals and metalloids at the soil-root interface. In Biophysic-Chemical Processes of Heavy Metals and Metalloids in Soil Environments, Eds A Violante, P M Huang and G M Gadd. pp 267-311. John Wiley & Sons, Hoboken, USA.

Hough R L, Tye A M, Crout N M J, McGrath S P and Young S D 2005 Evaluating a 'Free Ion Activity Model' applied to metal uptake by Lolium perenne L. grown in contaminated soils. Plant Soil 270, 1-12.


ISO 1999 Soil quality. Guidance on the ecotoxicological characterisation of soils and soil materials. ISO/DIS 15799 Geneva, Switzerland.

Lofts S, Spurgeon D J, Svendsen C and Tipping E 2004 Deriving soil critical limits for Cu, Zn, Cd and Pb: A method based on free ion concentrations. Environ. Sci. Technol. 38, 3623-3631.

McLaughlin M J, Smolders E and Merckx R 1998 Soil-root interface: Physicochemical processes. In Soil Chemistry and Ecosystem Health, Eds P M Huang, D C Adriano, T J Logan and R T Checkai. pp 233-277. Soil Science Society of America, Madison, Wisconsin, USA.

Menzies N W, Donn M J and Kopittke P M 2007 Evaluation of extractants for estimation of the phytoavailable trace metals in soils. Environ. Pollut. 145, 121-130.

Michaud A M 2007 Interaction entre biodisponibilité, phytotoxicité du cuivre et nutrition en fer de graminées - mécanismes physiologiques et rhizosphériques. In Science du sol. pp 191. Montpellier SupAgro, Montpellier.

Michaud A M, Bravin M N, Galleguillos M and Hinsinger P 2007 Copper uptake and phytotoxicity as assessed in situ for durum wheat (Triticum turgidum durum L.) cultivated in Cu-contaminated, former vineyard soils. Plant Soil 298, 99-111.

Nolan A L, Zhang H and McLaughlin M J 2005 Prediction of zinc, cadmium, lead, and copper availability to wheat in contaminated soils using chemical speciation, diffusive gradients in thin films, extraction, and isotopic dilution techniques. J. Environ. Qual. 34, 496-507.


97

Peijnenburg W J G M, Posthuma L, Eijsackers H J P and Allen H E 1997 A conceptual framework for implementation of bioavailability of metals for environmental management purposes. Ecotox. Environ. Safe. 37, 163-172.

Rachou J, Hendershot W and Sauve S 2004 Effects of pH on fluxes of cadmium in soils measured by using diffusive gradients in thin films. Commun. Soil Sci. Plant Anal. 35, 2655-2673.

Sauvé S, McBride M B and Hendershot W H 1995 Ion-selective electrode measurements of copper(II) activity in contaminated soils. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29, 373-379.

Sauvé S, Cook N, Hendershot W H and McBride M B 1996 Linking plant tissue concentrations and soil copper pools in urban contaminated soils. Environ. Pollut. 94, 153-157.

Sauvé S, McBride M B, Norvell W A and Hendershot W H 1997 Copper solubility and speciation of in situ contaminated soils: Effects of copper level, pH and organic matter. Water Air Soil Pollut. 100, 133-149.

Séguin V, Gagnon C and Courchesne F 2004 Changes in water extractable metals, pH and organic carbon concentrations at the soil-root interface of forested soils. Plant Soil 260, 1-17.

Tao S, Chen Y J, Xu F L, Cao J and Li B G 2003 Changes of copper speciation in maize rhizosphere soil. Environ. Pollut. 122, 447-454.

Tao S, Liu W X, Chen Y J, Xu F L, Dawson R W, Li B G, Cao J, Wang W J, Hu J Y and Fand J Y 2004 Evaluations of factors influencing root-induced changes of copper fractionation in rhizosphere of a calcareous soil. Environ. Pollut. 129, 5-12.

Thakali S, Allen H E, Di Toro D M, Ponizovsky A A, Rooney C P, Zhao F J and McGrath S P 2006 A Terrestrial Biotic Ligand Model. 1. Development and application to Cu and Ni toxicities to barley root elongation in soils. Environ. Sci. Technol. 40, 7085-7093.

Vulkan R, Zhao F J, Barbosa-Jefferson V, Preston S, Paton G I, Tipping E and McGrath S 2000 Copper speciation and impacts on bacterial biosensors in the pore water of copper-contaminated soils. Environ. Sci. Technol. 34, 5115-5121.

Zhang H, Lombi E, Smolders E and McGrath S 2004 Kinetics of Zn release in soils and prediction of Zn concentration in plants using diffusive gradients in thin. Environ. Sci. Technol. 38, 3608-3613.

Zhang H, Zhao F J, Sun B, Davison W and McGrath S P 2001 A new method to measure effective soil solution concentration predicts copper availability to plants. Environ. Sci. Technol. 35, 2602-2607.

Zhao F J, Rooney C P, Zhang H and McGrath S P 2006 Comparison of soil solution speciation and diffusive gradients in thin-films measurement as an indicator of copper bioavailability to plants. Environ. Toxicol. Chem. 25, 733-742.

Chapitre 3. Prélèvement et Réapprovisionnement Cu

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CHAPITRE 3 Prélèvement du cuivre par le blé dur et lien avec le réapprovisionnement

du cuivre en solution par le sol Dans le chapitre précédant, l’expérimentation menée in situ a suggéré un rôle majeur des modifications chimiques induites par les racines dans la rhizosphère sur la biodisponibilité du cuivre (Cu) pour le blé dur. La comparaison des mesures in situ et en RHIZOtest ont montré que ce dernier serait capable de rendre compte de ces modifications chimiques, notamment l’alcalinisation, dont l’impact sur la biodisponibilité est majeur. Cependant, les meilleures corrélations avec les mesures in situ ont été obtenues avec les mesures en DGT. Cette technique détermine la capacité du sol à réapprovisionner Cu en solution. Ce résultat suggère donc que le réapprovisionnement de Cu par le sol pourrait également participer au déterminisme de la biodisponibilité de Cu pour le blé dur. Sauvé et al. (1996) ont remarqué que la quantité de Cu prélèvée par les racines était très largement supérieure à la quantité de Cu2+ libre présent en solution à la surface de la racine. Ces auteurs ont donc suggéré que le nécessaire réapprovisionnement de Cu2+ libre par les pools labiles de Cu en solution et en phase solide pourrait avoir un impact considérable sur le prélèvement de Cu. Zhang et al. (2001) et Zhao et al. (2006) ont validé cette hypothèse en obtenant de très bonnes corrélations entre les mesures DGT effectuées sur le sol et les concentrations en Cu mesurées dans une plante hyperaccumulatrice, Lepidium heterophyllum L., et la tomate (Lycopersicum esculentum L.). En revanche, Nolan et al. (2005) ont montré que la concentration en Cu dans le blé tendre (Triticum aestivum L.) était mieux corrélé à la concentration totale de Cu dans le sol qu’aux mesures en DGT. Ces auteurs en ont conclu que le flux de réapprovisionnement de Cu en solution serait limitant seulement pour les plantes présentant un flux de prélèvement de Cu important et/ou cultivées dans des sols faiblement contaminés en Cu. Il est donc nécessaire de pouvoir estimer si le réapprovisionnement par le sol de Cu en solution est en mesure de contrôler la biodisponiblité de Cu pour le blé dur. Les objectifs de ce chapitre sont donc les suivants : (i) Estimer le flux de prélèvement de Cu par le blé dur en fonction de son exposition à Cu2+ libre en solution (culture hydroponique hors sol), (ii) Estimer le flux de réapprovisionnement de Cu en solution par le sol, (iii) Comparer les flux de prélèvement et de réapprovisionnement de Cu dans des conditions contrastées de niveau de contamination et de pH du sol. L’article présenté dans ce chapitre, intitulé : « Copper uptake kinetic in hydroponically-grown durum wheat as compared with soil’s ability to supply Cu », présente principalement l’estimation des paramètres cinétiques de prélèvement de Cu par le blé dur cultivé en hydroponie et exposé à des activités de Cu2+ libre pertinentes d’un point de vue environnemental. Dans un deuxième temps, le flux théorique de prélèvement de Cu par la plante a été calculé à partir de la mesure de l’activité de Cu2+ libre dans des extraits réalisés sur 7 sols présentant des niveaux de contaminations et des pH contrastés. Enfin, le flux de réapprovisionnement de Cu en solution, mesuré en DGT, a été comparé au flux théorique de prélèvement de Cu par la plante pour chacun des sols. Cet article doit être soumis à la revue Plant and Soil.


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Bibliographie Nolan A L, Zhang H and McLaughlin M J 2005 Prediction of zinc, cadmium, lead, and copper availability to

wheat in contaminated soils using chemical speciation, diffusive gradients in thin films, extraction, and isotopic dilution techniques. Journal of Environmental Quality 34, 496-507.

Sauvé S, Cook N, Hendershot W H and McBride M B 1996 Linking plant tissue concentrations and soil copper pools in urban contaminated soils. Environmental Pollution 94, 153-157.

Zhang H, Zhao F J, Sun B, Davison W and McGrath S P 2001 A new method to measure effective soil solution concentration predicts copper availability to plants. Environmental Science & Technology 35, 2602-2607.



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I. Copper uptake kinetic in hydroponically-grown durum wheat as compared with soil’s ability to supply Cu Authors : M. N. Bravin1, B. Le Merrer1, L. Denaix2, A. Schneider2 and P. Hinsinger1,* Affiliations: 1 INRA, UMR 1222 Biogéochimie du Sol et de la Rhizosphère (INRA-SupAgro), Place Viala, 34060 Montpellier, France 2 INRA, UMR 1220 Transferts sol-plante et Cycles des Eléments Minéraux dans les écosystèmes cultivés (INRA-ENITAB), Domaine de la Grande Ferrade, Avenue Edouard Bouleau, 33883 Villenave d’Ornon, France * Corresponding author: [email protected], Tel: +33 4 99 61 22 49, Fax: +33 4 99 61 30 88 Abstract Although Michaelis-Menten kinetic parameters (Fmax and KM) are required for the modelling of metal uptake by soil-grown plants, these parameters remain poorly described in the case of copper (Cu). This study therefore aimed at (i) determining the kinetic parameters of Cu uptake in durum wheat (Triticum turgidum durum L.) exposed to a relevant range of free Cu2+ activities (Cu2+), 0.4-2420 nM, and (ii) illustrating the relative importance of plant uptake flux with respect to soil’s ability to re-supply Cu2+ in solution. In the range of Cu2+ exposure encompassing most of Cu2+ usually measured in soils, Cu phytotoxicity occurred. Root elongation was particularly sensitive to Cu2+, showing a reduction of 50 % for Cu2+ as low as 60 nM. Copper uptake flux showed a hyperbolic shape, illustrating a metabolic control of Cu uptake by plant. When apoplasmic pool of Cu was accounted for, the uptake flux conserved its hyperbolic shape likely highlighting a saturation of Cu binding sites in root apoplasm for the highest Cu2+. Kinetic parameters of durum wheat and Cu2+ measured with a ion-selective electrode in 7 more or less acidic and Cu-contaminated soil samples were used to calculate the theoretical plant uptake flux of Cu (FTplt) for each soil. This flux was compared with Cu2+ flux in soil as assessed by the diffusive gradient in thin film (DGT) technique. Theoretical uptake flux was larger than DGT flux (Fdgt) for the two weakly contaminated soils only, suggesting that most Cu-contaminated soils were able to meet plant Cu requirement. Conversely, when Fmax was multiplied by four to mimic the requirement of a Cu hyperaccumulator plant, FTplt was larger than Fdgt for 5 out of 7 soils. Consequently, these results suggest that the Cu2+ flux in soil would be the rate-limiting process restricting plant Cu uptake when plant requirement is large (hyperaccumulator plants), while with crops species such as durum wheat the rate-limiting process would be either plant uptake or soil flux, depending on soil properties such as pH and total Cu. Keywords: Absorption, Copper, Depletion, Durum wheat (Triticum turgidum durum L.), Kinetic, Lability, Uptake.


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I.1. Introduction

The determination of metal uptake kinetic is a necessary step toward the modelling of soil-plant transfer in nutrient-poor or contaminated environments (Nowack et al. 2006). For instance, Barber-Cushman approach was applied to predict plant uptake of a range of metals such as cadmium (Cd), manganese (Mn) and zinc (Zn) (Mullins et al. 1986; Adhikari and Rattan 2000; Sadana and Claassen 2000; Sterckeman et al. 2004). In the case of copper (Cu), Seuntjens et al. (2004) simulated plant Cu uptake using kinetic parameters Fmax and KM determined for rice (Lindon and Henriques 1992). However, the choice of kinetic parameters used for this purpose is questionable as there is little available literature on Cu uptake kinetic and these are not environmentally relevant. Most of kinetic parameter determinations were calculated from experiments carried out with free Cu2+ activities Cu2+ varying between 1.6 and 500 µM (Cathala and Salsac 1975; Veltrup 1976; Bowen 1987), which far exceed Cu2+ usually found in soils even when heavily contaminated (Sauvé et al. 1997; Vulkan et al. 2000). Furthermore, some other studies determined kinetic parameters on the basis of total Cu concentrations in nutrient solution (Nielsen 1976; Lindon and Henriques 1992), while free Cu2+ is usually considered as the major Cu species that plants are able to take up. In comparison, uptake kinetics of Cd and Zn were recently described for a range of plant species from agricultural crops to metal hyperaccumulator (Hart et al. 1998 and 2002; Lombi et al. 2001). In these studies, uptake fluxes were determined on intact plants with metal activities from the nanomolar to micromolar range and by distinguishing the metabolic influx into root symplasm from the passive loading of metal in root apoplasm. Nevertheless, all these experiments were carried out on short-time scale (20 min) and therefore did not account for any longer-term regulation of uptake by internal plant nutrient status (Reid and Liu 2004). In the range of metal toxicity, some modifications of uptake kinetic are expected to occur (Briat and Lebrun 1999). In the particular case of Cu, it was also noted that Cu induced rhizoderm ruptures in cowpea (Vigna unguiculata L.) after 12 h of exposure to 1.1 µM Cu2+ (Kopittke et al. 2008). This result highlights the need to carry out uptake experiments over several days. Consequently, relevant kinetic parameters for Cu uptake in intact plants are currently lacking and could thus restrict the ability of numerical models to predict soil-plant transfer of Cu. This study therefore aimed at determining the kinetic parameters (Fmax and KM) of Cu uptake in durum wheat (Triticum turgidum durum L.) at optimal and toxic ranges of Cu2+. The uptake experiment was carried out over 8 days to account for the impact of Cu phytotoxicity. Finally, the relevance of kinetic parameters for soil-plant transfer was assessed by comparing the respective importance of the theoretical plant Cu flux and the soil’s ability to re-supply Cu2+ in solution on a set of 7 soil samples showing a wide range of levels of pH and total Cu. I.2. Material and Methods

I.2.1. Plant growth

After surface sterilisation for 10 min in H2O2 6 %, durum wheat seeds (cv. Acalou) were germinated for 3 days in the dark on filter paper moistened with CaCl2 600 µM and H3BO3 2 µM. The growth chamber parameters were set at (day/night): 25/20 °C, 75/70 °C of relative humidity and 450 µmol photons m-2 s-1 light intensity. Seedlings were then transferred in 35-dm3 tanks (20 couples of seedlings per tanks) for four additional days of germination. From the second week, seedlings were exposed for an additional 2-week to a complete nutrient


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solution (µM): Ca(NO3)2 2000, KNO3 2000, MgSO4 1000, KH2PO4 500, NaFe(III)EDTA 100, H3BO3 10, MnCl2 2, ZnSO4 1, CuCl2 1 and Na2MoO4 0.05. The nutrient solution was renewed every second day. At the end of this pre-culture stage, 20 homogeneous couples of plants were selected on the basis of their whole fresh biomass. Five couples of plants were harvested to determine Cu content and plant root parameters prior to exposure to a range of Cu concentrations. The remaining 15 couples of plants were transferred for another 8-day period of exposure in 15 complete nutrient solutions with the same composition as above (with KH2PO4 reduced to 50 µM) and containing Cu concentrations from 2.6 to 95 µM. Solution pH was set at 6.0 (± 0.1) and buffered with 1 mM MES (2-morpholinoethanesulphonic acid). Free ionic Cu activities in the nutrient solution were buffered with EDTA (100 µM), supplied as NaFe(III)EDTA (as a source of Fe), to reach 0.4 to 2420 nM. Free ionic Cu activities were calculated with the aqueous speciation model PHREEQC (version 2.14.3.2411) and the MINTEQ database of thermodynamic constants (Appendix). Nutrient solutions were renewed daily about 6 h after the beginning of the day-period to limit nutrient depletion as well as root-induced alkalisation and exudation of Cu-chelating compounds, especially phytosiderophores which are usually secreted from 3 to 6 h after the onset of light (Reichman and Parker 2007). Solution pH was measured daily just before renewal. Total Cu concentration was also measured in each initial solution and after 1, 4 and 8 days of plant growth in the solutions (before renewal) by flame atomic absorption spectrometry (F-AAS, Varian SpectraAA-600, Australia). The quality of speciation modelling was checked by measuring Cu2+ on 5 initial nutrient solutions with a Cu ion-selective electrode (Cu-ISE; DX-264, Mettler Toledo) and a double-junction reference electrode (Inlab-302, Mettler Toledo). ISE measurements were calibrated between pCu2+ 9.0-5.2 in 10-4 M Cu solutions buffered with iminodiacetic adic and potassium phthalate according to the procedure described by Sauvé et al. (1995). Before measurements, ISE was polished for 30 s with a 3-µm Al2O3 strip then successively soaked for 5 min in H2SO4 0.025 M and Na4EDTA 0.1 M. After 8 days of exposure, the 15 couples of plants (tillering stage) were harvested. Plant shoots and roots were separated. Roots were divided in three equivalent sub-samples in order to measure total and symplasmic Cu content as well as root length. Shoots and roots used to measure total Cu content were directly oven-dried at 105 °C, while root sub-samples used for symplasmic Cu and length measurements were stored at –20 °C before analyses. The five couples of control plants were handled similarly.

I.2.2. Plant measurements

After thawing, for the purpose of root length measurements, root sub-samples were stained for 5 min with 0.003 M methylene blue (Costigan et al. 1982), then rinsed with tap water. Roots were spread in a Perspex tray containing a thin layer of water (0.5-1 cm) and scanned at a resolution of 600 dpi (dots per inch) using a two light sources procedure (Epson expression 10000 XL). The output as greyscale images were analysed with WinRHIZO (version 2005 b, Regent Instruments, Canada) using a method of automatic global threshold. After root length measurements, root samples were oven-dried at 105°C for dry biomass determination. Relative root length (RRL) calculation was adapted from Kinraide et al. (2004) as followed:

RRL = 100 * (RL – RLmin) / (RLmax – RLmin) (1) where RL is the root length for a given Cu exposure, RLmin and RLmax, the minimal and maximal root length measured among the range of exposure. Root lengths (RL, RLmin and


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RLmax) were obtained by subtracting the mean root length of control plants to that of the considered exposure. Copper rhizotoxicity was assessed by fitting the RRL vs. Cu2+ relationship with the Hill’s equation: RRL = Cu2+ -a / (Cu2+ -a + EC50

-a) (2) where a is the Hill number and, EC50, the Cu2+ in solution resulting in a 50 % reduction in the maximal RRL. The ExcelTM macro REGTOX (version 7.0.5; Vindimian 2001) was used to compute fitting parameters (a and EC50), EC25, EC75, EC90 and the 99 % non-parametric confidence intervals for EC25, EC50, EC75 and EC90. Another set of root sub-samples was used to measure symplasmic Cu after the extraction of apoplasmic Cu. The extraction procedure was already described by Chaignon and Hinsinger (Chaignon and Hinsinger 2003). Briefly, 1 g of thawn roots was shaken end-over-end for 5 min with 50 cm3 HCl 10-3 M. After rising up HCl concentration to 10-2 M, roots were shaken for another 3 min. Roots were finally rinsed thrice with ultra-pure water (18.2 MΩ), then oven-dried at 105°C for dry biomass determination. Shoots and roots (for total and symplasmic Cu determination) were ground (MM 2000, Retsch) then digested in a microwave oven (Ethos Touch Control, Milestone) in concentrated HNO3 (65 %) at 180 °C and 2 106 Pa. Copper concentration in the digests was measured by F-AAS. Blanks and reference materials of maize shoots (Zea mays L., V 463, Bureau InterProfessionnel d’Etudes Analytiques, France) and olive leaves (Olea europaea L., n° 62, Community Bureau of References, Commission of the European Communities) were included during digestions and analyses to check the accuracy of the measurement procedure. Plant Cu flux (Fplt, ng Cu m-2 root surface area s-1) was calculated for each Cu exposure according to Mullins and Sommers (1986) formula, accounting for an exponential root growth:

Fplt = (m – mC) / (S – SC) * k (3) k = ln(S / SC) / t (4) where mC and m are the mass of Cu accumulated in the whole plants after pre-culture (control) and 8-day exposure to Cu (ng), SC and S, the root surface area after pre-culture and 8-day exposure to Cu (m2), k, the growth constant (s-1) and, t (s) is the duration of exposure to Cu (8 days). Kinetic parameters of Cu uptake by durum wheat were determined from the Michaelis-Menten equation: Fplt = Fmax * Cu2+ / (K M + Cu2+) (5) where Fmax is the maximal flux of Cu in plant (ng Cu m-2 s-1) and, KM, the Cu2+ at ½ Fmax usually standing for the affinity of Cu for transporters in the plasma membrane of root cells and/or binding sites in root apoplasm. Michaelis-Menten equation was fitted on plant Cu flux accounting for Cu in root apoplasm (uptake flux) or not (absorption flux). Parameters of Michaelis-Menten equation and root-to-shoot translocation of Cu (see Results section) as well as their statistical significance were calculated with Statistica (version 7, Statsoft) using the Marquardt-Levenberg algorithm. The experiment was conducted without replication (except for control plants). Therefore, results were discussed on the basis of the response curve of the


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experimental data. The level of statistical significance was represented by ** and *** for P < 0.01 and P < 0.001, respectively.

I.2.3. Soil measurements

Seven topsoil samples collected in former vineyards of Southern France were selected to cover a large range of pHCaCl2 (4.1-7.8). Soil samples were either strongly acidic (A and B), slightly acidic (C and D) or calcareous (E, F and G) (Table 1). For each pH category, soil samples were either weakly (B, D and G) or moderately (A, C and F) Cu-contaminated. An additional highly Cu-contaminated, calcareous soils (E) was also included. Additional soil physico-chemical properties can be found in Michaud et al. (2007, chapter 2.I) and Bravin et al. (2008b, chapter 2.II). ISE measurements were carried out on CaCl2 extracts, as a surrogate of soil solution, to determine Cu2+. Diffusive gradient in thin film (DGT) technique was also deployed on each soil sample to assess the Cu2+ flux in soil (Table 1). The procedures followed for ISE and DGT measurements were already detailed by Bravin et al. (2008b, chapter 2.II). DGT measurements were computed as a flux (Fdgt, ng Cu m-2 s-1): Fdgt = m / (A t) (6) where m is the mass of Cu accumulated in the resin (ng), A the active surface area of DGT unit (3.14 cm2) and, t the deployment time (17 h). Table 1. Free Cu2+ activity, plant (FTplt) and DGT (Fdgt) Cu fluxes in 7 soil samples with varying pH and total Cu content. FTplt was calculated by considering the uptake kinetic parameters determined for durum wheat (see Table 2) and the corresponding Cu2+. Values in parentheses stand for standard errors.

Total Cu Cu2+ ISE FTplt Fdgt Soil samples

Correspondence pHCaCl2

mg kg-1 nM ng Cu m-2 s-1 A 22 4.1 184 5091 42 64 (17) B 21 4.3 88 2853 42 51 (6) C 81 5.6 165 33 12 43 (14) D 91 5.8 53 31 11 5.5 (0.5) Ec 301 7.5 1030 10 5 123 (37) Fc 261 7.6 163 5 2 22 (2) Gc 231 7.8 56 5 3 2 (2) c Calcareous soil samples 1 Correspondence with soil samples reported in chapter 1.I 2 Correspondence with soil samples reported in chapter 1.II

I.3. Results

I.3.1. Chemical stability of nutrient solutions over time

The major parameters driving Cu2+ in nutrient solutions were total Cu concentration and pH. Total Cu concentration appeared rather stable over time with maximum changes lower than 30 % and 20 % for exposure treatments 1-5 ([Cu]Tot < 20.3 µM) and 6-15 ([Cu]Tot > 24.7 µM), respectively (results not shown). These variations were attributed to both plant Cu uptake and decrease in solution volume due to water uptake. Despite the addition of MES, alkalisation occurred and pH increased up to 7.3 in the less Cu-concentrated solutions (results not shown). In the most Cu-concentrated solutions, pH increase was lower likely due to the buffering ability of freshly precipitated Fe oxyhydroxides


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and a lower root biomass (see below). Such alkalisation induced a large decrease in Cu2+ (one or two orders of magnitude) and outlined the difficulties to maintain stable chemical conditions in nutrient solutions exposed to plant with large root biomass as stressed by Koppitke and Menzies (2006). As nutrient solutions were renewed daily, results were therefore discussed on the basis of the initial composition of each nutrient solution.

I.3.2. Plant Cu content and toxicity

Plant Cu content increased with increasing Cu2+ in nutrient solutions. Copper contents ranked from 25 to 1485 mg kg-1 in roots with 58-81 % bound to the apoplasm and from 9 to 53 mg kg-1 in shoots (results not shown). Copper translocation exhibited a dual pattern with a hyperbolic shape for Cu content in the root symplasm lower than 100 mg kg-1, then a linear shape for higher contents (Figure 1).

Figure 1. Shoot Cu content as a function of Cu content in root symplasm for plants growing at various Cu2+. Several symptoms of Cu phytotoxicity were observed. Interveinal chlorosis consistent with Fe deficiency occurred for Cu2+ in solution equal or larger than 550 nM. Shoot and especially root biomasses were also affected and decreased with increasing Cu2+ in solution (Figure 2.a). The relative root length of plants appeared particularly sensitive to Cu exposure as RRL sharply decreased with increasing Cu content in the root apoplasm and Cu2+ in solutions (Figure 3.a and b). The RRL vs. Cu2+ relationship could be fitted with Hill’s equation to determine rhizotoxicity thresholds (Figure 3.b). This revealed that free Cu2+ activities in solution of 15, 63, 268 and 1140 nM reduced the maximal RRL to 25, 50, 75 and 90 % of the control, respectively (Table 2). Visual symptoms of rhizotoxicity were also observed (Figure 2.b, c and d). The increasing exposure of plants to Cu2+ in solution induced an increase in lateral root formation. Nevertheless, the growth of these lateral roots appeared strongly restricted and almost completely inhibited at the highest Cu2+ (Figure 2.c and d).


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Figure 2. Copper toxicity for durum wheat grown for 8 days in nutrient solutions at various Cu2+. Photographs of the whole plant harvested after 8 days of exposure to Cu2+ (a) and root morphology for 0.4 (b), 553 (c) and 2420 (d) nM Cu2+, respectively. Arrows indicate abnormal lateral root formation.

I.3.3. Cu uptake kinetics in plant

Copper fluxes in plant, accounting for apoplasm pool (uptake flux) or not (absorption flux), could be fitted with the Michaelis-Menten equation (Figure 4). In both cases, experimental data exhibited a hyperbolic pattern with a sharp increase in Cu fluxes for Cu2+ lower than 100 nM, followed by a saturation shape up to 2400 nM Cu2+. The kinetic parameters (Fmax and KM) are given in Table 3. It is noteworthy that accounting for the apoplasm pool involved a 2.3-fold increase in Fmax and a 1.5-fold decrease in KM, highlighting the affinity of root apoplasm for Cu.

Figure 3. Relative root length (RRL) as a function of Cu content of root apoplasm (a) and Cu2+ in solutions (b). Curve and equation in (b) were obtained by fitting the data to Hill’s equation.


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I.3.4. Comparison between theoretical plant Cu fluxes and DGT Cu flux

The kinetic parameters specifically determined for durum wheat and modified to account for a range of plant uptake behaviours (see Discussion section for rationale) enabled us to calculate different theoretical plant Cu fluxes (FTplt) in 7 soil samples, based on the Cu2+ in soil solution, as measured with ISE (Table 1). These theoretical fluxes were then compared with corresponding soil Cu2+ fluxes, i.e. soil’s ability to re-supply Cu2+ in solution, as assessed by DGT. ISE measurements and DGT fluxes (Fdgt) are presented in Table 1. Table 2. Free ionic Cu activity (nM) involving a 25 % (EC25), 50 % (EC50), 75 % (EC75) and 90 % (EC90) reduction in the relative root length for plants growing in solutions with Cu2+ in the range 0.4-2420 nM. Values in parentheses stand for the 99 % non-parametric confidence intervals.

EC25 EC50 EC75 EC90

nM 15 63 268 1140

(7-23) (30-81) (101-353) (267-1804)

Using kinetic parameters of durum wheat (Table 3), FTplt to Fdgt ratio was larger than 1 only for slightly acidic (D) and calcareous (G), weakly contaminated soils (Table 1). Conversely, FTplt was 10- and 26-fold lower than Fdgt in moderately (F) and highly (E) contaminated, calcareous soils.

Figure 4. Activity-dependent kinetics of Cu fluxes in intact plants. Close and open symbols stand for uptake and absorption fluxes, respectively, given that uptake accounted for Cu in root apoplasm while absorption did not. Experimental data were fitted to Michaelis-Menten equation (see Table 2 for corresponding parameters). Fmax was then varied between 10 and 170 ng Cu m-2 s-1, keeping KM steady (Figure 5.a). For Fmax lower than 20 ng Cu m-2 s-1, FTplt to Fdgt ratio was lower than 1 whatever the soil. Alternatively, when Fmax was multiplied by up to 4, FTplt gradually increased. In strongly acidic soils (A and B), FTplt became higher than Fdgt for Fmax larger than 65 ng Cu m-2 s-1. In the slightly acidic, moderately contaminated soil (C), FTplt became higher than Fdgt for Fmax larger than 150 ng Cu m-2 s-1. In the moderately (F) and highly (E) contaminated, calcareous soils, Fdgt was 2.4- and 6.5-fold larger than FTplt for the maximal value of Fmax investigated (Figure 5.a). KM was then varied between 20 and 345 nM Cu2+, keeping Fmax steady (Figure 5.b). In strongly acidic soils (A and B), the maximal change in FTplt was about 10 %, leading to a FTplt to Fdgt ratio steadily lower than 1 over the range of KM investigated. For minimal KM, FTplt increased 6.5- to 10-fold as compared to maximal KM but remained at least 1.5-fold lower


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than Fdgt in slightly acidic (C) and calcareous (E and F), contaminated soils. FTplt to Fdgt ratio was larger than 1 in slightly acidic (D) and calcareous (G), weakly contaminated soils for KM lower than 170 and 125 nM (Figure 5.b). Table 3. Kinetic parameters of Michaelis-Menten equation for Cu uptake and absorption fluxes in durum wheat. Uptake flux accounts for Cu in root apoplasm, while absorption flux does not. Standard errors are indicated in parentheses.

Fmax KM R² ng Cu m-2 s-1 nM

Absorption flux 18.6 (0.9)*** 127 (27)*** 0.96***

Uptake flux 43 (3)*** 86 (23)** 0.94***

I.4. Discussion

Activity-dependent kinetics and the associated parameters, Fmax and KM, are needed for the modelling of metal uptake by plants. However, in the case of Cu, the reliability and environmental relevance of kinetic parameters reported in the literature are rather questionable. In the present study, such parameters were determined for durum wheat in a relevant range of Cu2+, 0.4-2420 nM. The interest of these kinetic parameters for plant uptake modelling is also further addressed by comparing the theoretical plant uptake flux to the ability of the soil to re-supply Cu2+ in solution according to the DGT technique.

Figure 5. Sensitivity analyses of theoretical plant Cu flux (FTplt) to DGT Cu flux (Fdgt) ratio for 7 soil samples when Fmax (a) or KM (b) varied from 0.25- to 4-fold the measured values (see Table 2). Letters stand for soil sample identification (see Table 3). Dashed lines stand for calcareous soils. Bold lines stand for non calcareous soils with pH < 5 and solid lines lines stand for non calcareous soils with pH > 5. Horizontal dotted lines stand for FTplt to Fdgt ratio equal to 1.

I.4.1. Copper phytotoxicity for environmentally relevant Cu2+

Compared to previous studies about uptake kinetic of Cu by plant (Cathala and Salsac 1975; Veltrup 1976; Bowen 1987), the range of Cu2+ investigated in the present work was several orders of magnitude lower and thus more environmentally relevant with respect to typical Cu2+ found in soils, including contaminated soils, usually ranking from 10-12 to 10-5 M (Sauvé et al. 1997; Vulkan et al. 2000). In this range, strong Cu phytotoxicity symptoms were observed, altering the growth of the whole plant. Root length was particularly altered since Cu2+ as low as 60 nM induced a 50 % reduction in root elongation (Table 2). These values appeared lower than phytotoxic thresholds previously reported in the literature. Kopittke et al.


109

(2007) mentioned a 10 % reduction in root or shoot biomasses of cowpea for 1000 nM Cu2+, while Michaud et al. (2008) reported a 50 % reduction in root elongation of durum wheat for 600 nM Cu2+. However, Cu2+ phytotoxicity for a given Cu2+ is known to increase with increasing pH (Lexmond and van der Vorm 1981; Zhao et al. 2006). Kopittke et al. (2007) and Michaud et al. (2008) experiments were carried out at pH 4.5 and 5.5 respectively, which may explain the lower phytotoxicity measured in comparison with our experiment at pH 6. The visual symptoms of rhizotoxicity, i.e. an increased number of poorly developed lateral roots with increasing Cu2+ (Figure 2), was previously mentioned by Kopittke and Menzies (2006) and Kopittke et al. (2007) for cowpea. These authors further interpreted the reduction of root elongation of cowpea by an increased rigidity of root cell wall in which Cu was accumulated, leading to cell rupturing in the elongation zone for Cu2+ around 1 µM (Kopittke et al. 2008). In a similar way as for the more documented case of Al rhizotoxicity (Kopittke et al. 2008), these alterations of root structure could be responsible for nutrient deficiencies such as iron deficiency, consistent with the interveinal chlorosis observed in our study and elsewhere (Lexmond and van der Vorm 1981; Kopittke and Menzies 2006; Michaud et al. 2008). They may also dramatically impact uptake kinetics. This conclusion therefore justifies to carry out kinetic experiments over longer durations than several minutes or hours in order to account for plant adaptative response to growth conditions.

I.4.2. Copper uptake kinetic in durum wheat

The activity-dependent kinetic of Cu absorption in durum wheat, which strictly speaking excludes the portion of root Cu adsorbed onto the cell walls (apoplasm), showed a hyperbolic shape with a saturable component for Cu2+ above 500 nM (Figure 4). Hart et al. (1998 and 2002) and Lombi et al. (2001) also described a saturable component for the absorption of Cd and Zn by several plant species. This result therefore suggests that Cu absorption in durum wheat is metabolically driven by transport protein(s) in the plasma membrane of root cells. Compared with other metals such as Zn and Fe, transporter(s) involved in Cu absorption into roots of graminaceous species are poorly described. Although Cu can efficiently compete with Fe to form metal-phytosiderophore complex (Reichman and Parker 2005), Cu-phytosiderophore absorption mediated by yellow stripe1 transporter is likely of limited significance in the primary absorption of Cu by graminaceous species (Roberts et al. 2004). Alternatively, Cu absorption in durum wheat could be mediated by the high-affinity Cu+ transporter COPT1 and the Cu2+ transporter ZIP2 as recently described for the non graminaceous species Arabidopsis thaliana (Puig et al. 2007). When considering the Cu uptake flux in durum wheat, i.e. including the apoplasmic Cu in roots, the shape of the kinetic also exhibited a saturable component with a higher maximal flux (Fmax). The difference between the uptake and absorption kinetics was constant for Cu2+ above 500 nM and amounted to about 1 g kg-1 dry root biomass, suggesting that saturation of root apoplasm occurred. This is in line with former results of Antunes and Hale (2006) who estimated a density of Cu binding sites of 4 g kg-1 in the root apoplasm of durum wheat. Compared with the literature on Cu uptake kinetic in plants (accounting for apoplasmic pool or not), the maximal fluxes (Fmax) determined on short-term experiments (from 20 min to 4 h) were 7- to 1400-fold larger than the Fmax value determined for durum wheat in the present experiment (Cathala and Salsac, 1975; Veltrup, 1976; Bowen, 1987). Veltrup (1976) reported for Hordeum distichum L. a 20-fold decrease in Fmax when measured over 2 h instead of 20 min and an additional 2-fold decrease in Fmax when measured over 24 h. This suggests that Fmax parameter was highly sensitive to the duration of uptake experiments, which could be


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related to the time required for physiological adaptation of plants to environmental constraints such as metal toxicity to occur. Conversely, KM values found in the literature did not seem to be related to the duration of the experiments. In contrast, it varied considerably with the range of tested Cu2+ concentrations, ranging from 1.6 up to 500 µM (Cathala and Salsac 1975; Veltrup 1976; Bowen 1987). In these former studies, tested Cu2+ concentrations were all extremely high compared with concentrations reported to occur in soils, even in highly contaminated soils and their environmental relevance is thus questionable. We decided to investigate a narrower range of concentrations, more likely to be experienced by soil-grown plants, which may explain why we found smaller KM values than those reported earlier. The Cu kinetic parameters determined for durum wheat could also be compared with those reported for Cd uptake as plants usually take up very small amounts of Cd as for Cu. Investigating Cd uptake in durum wheat for environmentally relevant exposure, Hart et al. (1998 and 2002) obtained Fmax values which were 6- to 8-fold larger than those found for Cu in our experiment. This discrepancy could be explained by either the occurrence of different uptake pathways (transporters) for Cd and Cu or by the shorter duration (20 min) of their experiments. Conversely, KM values of 40-70 nM obtained by these authors for Cd were in close agreement with our results for Cu. The new set of Cu uptake kinetic parameters that we determined in durum wheat therefore appeared more environmentally relevant than those available in the literature. Nevertheless, it should be kept in mind that the determination of such kinetic parameters is partly dependent on plant species/genotypes (Lombi et al. 2001), plant age (Chen et al. 2008) and experimental conditions such as solution pH or the nature of the organic ligand used to buffer metal activity (Degryse et al. 2006).

I.4.3. Comparison of Cu uptake kinetic in plants and soil’s ability to supply Cu

Most of the few studies dealing with the modelling of soil-plant metal transfer considered that soil metal supply was usually lower than plant requirement and consequently that the ability of the soil to supply metals was the rate-limiting process (Mullins et al. 1986; Adhikari and Rattan 2000; Sterckeman et al. 2004). Former model predictions of metal uptake in plants were therefore poorly sensitive to uptake kinetic parameters in comparison with soil parameters. In the case of Cu, the kinetic parameters determined for durum wheat suggested that plant requirement are very low, which is consistent with the low concentrations of Cu usually found in plants (compared with other micronutrients). Thus, it appeared relevant to compare the theoretical plant uptake flux of Cu (FTplt) to soil Cu flux, i.e. soil’s ability to re-supply Cu2+ in solution, as determined on a set of 7 soil samples exhibiting a wide range of pH and total Cu content. The theoretical plant uptake flux was deduced from the Michaelis-Menten equation provided with the kinetic parameters determined for durum wheat and Cu2+ measured with ISE. This calculation thus assumed that plant uptake was not limited by Cu2+ re-supply to soil solution and, hence, that Cu2+ was steady at the root surface. The ability of soils to re-supply Cu2+ to soil solution was assessed with DGT technique, i.e. DGT flux (Fdgt) (Zhang et al. 2001). Consequently, if FTplt was larger than Fdgt, i.e. FTplt to Fdgt ratio larger than 1, then soil metal re-supply would be the rate-limiting process. Conversely, if FTplt was lower than Fdgt then plant uptake flux would be the rate-limiting process. FTplt was larger than Fdgt only for weakly Cu-contaminated soils with pH higher than 5.5 (Table 1). This is consistent with the large increase in Fdgt noted for strongly acidic soils (pH < 5) and with increasing total soil Cu (Bravin et al., 2008, chapter 2.II). It is also striking that the ability of soil to re-supply Cu2+ was 10- and 26-fold larger than FTplt for the two Cu-contaminated, calcareous soils (E and F, Table 1). The importance of Fdgt in contaminated calcareous soils in comparison with plant uptake could be attributed to both the capability of dissolved organic carbon to buffer Cu in the soil solution at high pH and the lability of organically-bound Cu in


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solution. Consequently, the rate-limiting process for plant species with Cu requirement similar to that of durum wheat would mainly depend on soil properties such as pH and total Cu, which determine both plant uptake and soil re-supply fluxes. To check the impact of varying plant Cu requirements on the nature of the rate-limiting processes, kinetic parameters were varied from 0.25- to 4-fold, keeping the second parameter unchanged (Figure 5). These factors were chosen on the basis of the increase in Fmax and KM observed for Cd uptake when comparing durum wheat (Hart et al. 1998 and 2002) with the hyperaccumulator species Thlaspi caerulescens ecotype Ganges (Lombi et al. 2001). The FTplt to Fdgt ratio increased, i.e. FTplt was larger than Fdgt, with increasing Fmax and decreasing KM, but the impact of Fmax appeared larger than that of KM. This makes sense especially for strongly acidic soils where Cu2+ is much larger than KM since, even with a very low KM, plant uptake being thus limited by Fmax value. Therefore, for plant species showing an uptake kinetic characterised by a very low KM (20 nM Cu2+), the soil’s ability to re-supply Cu2+ in solution would be the rate-limiting processes only in weakly contaminated soils with pH higher than 5.5. Alternatively, the simulations made with the highest Fmax (170 ng Cu m-2 s-1) are particularly interesting as they enabled to compare the Cu uptake behaviour of a crop species, durum wheat, with the virtual case of a Cu hyperaccumulator species. For the latter, FTplt was larger than Fdgt for 5 out of 7 soils. A Cu hyperaccumulator plant would therefore be expected to deplete Cu2+ in its rhizosphere, except when grown in Cu-contaminated calcareous soils, and the uptake flux would mainly depend on soil’s ability to re-supply Cu2+. Such calculations may explain why DGT measurements correlated with Cu uptake in the hyperaccumulator Lepidium heterophyllum Benth (Zhang et al. 2001), while DGT measurement was not the best indicator of Cu uptake in either bread wheat (Nolan et al. 2005) or durum wheat (Bravin et al., 2008b, chapter 2.II). However, these comparisons between FTplt and Fdgt should be interpreted with cautions for a number of reasons. The measurement of Fdgt largely depends on the thickness of the diffusive layer as Fdgt increases with decreasing thickness of the diffusive layer (Lehto et al. 2006b). In our experiment, the thickness of the diffusive layer was arbitrarily set at 0.9 mm according to Zhang et al. (2001). The duration of contact between DGT device and soil can also affect Fdgt: it was found to remain approximately unchanged for 8 to 24 h and then to decrease as much as 5-fold after several days (Nowack et al. 2004). The advection flux of metal due to plant water uptake was also neglected in the present calculations. However, Oliver and Barber (1966) reported a contribution of mass-flow amounting up to 53 % for Cu in soybean (Glycine max L.). Lehto et al. (2006a) therefore estimated that mass flow would likely contribute to metal uptake for plants grown in soils with a poor ability to re-supply free metal ions to soil solution, i.e. with a high fixation capacity and/or a slow metal desorption kinetic. Finally, other rhizosphere processes could also greatly alter metal chemistry at the soil-root interface (as recently reviewed by Hinsinger and Courchesne 2008) and consequently impact plant metal uptake, as shown by Puschenreiter et al. (2005) when modelling Ni uptake in a hyperaccumulator species. In the same soils as those used in the present work, Michaud et al. (2007, chapter 2.I) suggested for field-grown durum wheat that root-induced alkalisation of the rhizosphere restricted plant Cu uptake in strongly acidic soils, while root-induced exudation of Cu-chelating compounds promoted Cu uptake in calcareous soils and ultimately resulted in Cu phytotoxicity due to induced Fe deficiency (chlorosis). In addition, we confirmed the major impact of rhizosphere alkalisation in a durum wheat bioassay (chapter 3.III). We showed that such a rhizosphere pH change resulted in a considerable decrease in Cu2+ relative to bulk soil, which explained the lower than expected uptake of Cu in strongly acidic soils. Not accounting for such rhizosphere processes in the present


112

calculations thus gives only a rough idea of the potential fluxes of Cu into the plant. Another limitation of our calculations is that they do not account for root distribution in soil and the consequent competition between root for Cu uptake (Barber 1984), which may result in altered Cu2+ in the vicinity of neighbouring roots. I.5. Acknowledgements

We thank Yves Dudal for introduction to PHREEQC, Jean-Claude Davidian, Catherine Curie and Alain Mollier for their constructive advices about the design of the uptake kinetic experiment and Pierre Berthomieu to provide free access to F-AAS. Didier Arnal, Michaël Clairotte and Lucien Roger are also acknowledged for technical assistance. Financial support was provided by an ECCO-ECODYN project and the PNETOX programme of the French Ministry of Ecology and Sustainable Development. I.6. Appendix

Table. Stability constants (log10 K) used to estimate Cu2+ in the exposure solutions. Stability constants were taken from MINTEQ database supplied with PHREEQC (version 2.14.3.2411) and amended with the NIST Standard Reference Database 46 (version 7.0; Martell and Smith 2003) for metal-EDTA complexes.

Complex log10 K Complex Log10 K Complex Log10 K Complex Log10 K CaOH+ -12.598 FeH2PO4

+ 22.253 H2EDTA2- 16.32 ZnCl3- 0.5

CaHCO3+ 11.33 Fe(OH)2 -20.57 H3EDTA- 19.01 ZnCl4

2- 0.199 CaCO3 3.15 FeHPO4 15.95 H4EDTA 21.01 ZnOH+ -8.96 CaSO4 2.309 Fe(HS)2 8.95 H5EDTA+ 22.51 Zn(OH)2 -16.899 CaHPO4 15.085 Fe(HS)3

- 10.987 KSO4- 0.85 Zn(OH)3

- -28.399 CaPO4

- 6.459 FeOH2+ -2.19 KHPO4- 12.64 Zn(OH)4

2- -41.199 CaH2PO4

+ 20.96 FeHPO4+ 17.78 KEDTA-3 0.8 ZnOHCl -7.48

CaEDTA2- 10.65 FeSO4+ 3.92 MgOH+ -11.79 Zn(HS)2 14.94

CaHEDTA- 13.75 FeCl2+ 1.48 MgCO3 2.98 Zn(HS)3- 16.1

Cu+ 2.72 FeCl2+ 2.13 MgHCO3

+ 11.4 ZnSO4 2.37 CuCl2

- 5.5 FeCl3 1.13 MgSO4 2.25 Zn(SO4)22- 3.28

CuCl32- 5.7 Fe(OH)2

+ -5.67 MgPO4- 6.589 ZnHCO3

+ 12.4 Cu(S4)2

3- 3.39 Fe(OH)3 -13.6 MgH2PO4+ 21.066 ZnCO3 5.3

CuS4S53- 2.66 Fe(OH)4

- -21.6 MgHPO4 15.22 Zn(CO3)22- 9.63

CuCO3 6.73 FeH2PO42+ 24.98 MgEDTA2- 8.79 ZnEDTA2- 16.5

Cu(CO3)22- 9.83 Fe(SO4)2

- 5.42 MgHEDTA- 12.79 ZnHEDTA- 19.5 CuCl+ 0.43 Fe2(OH)2

4+ -2.95 MnO42- -118.44 ZnH2EDTA 20.7

CuCl2 0.16 Fe3(OH)45+ -6.5 Mn2+ -25.507 ZnOHEDTA3- 4.9

CuCl3- -2.29 FeEDTA2- 14.3 MnCl+ 0.607 HMES 6.27

CuCl42- -4.59 FeHEDTA- 21.12 MnCl2 0.041 NH4

+ 119.077 CuOH+ -8 FeEDTA- 25.1 MnCl3

- -0.305 NO2- 28.57

Cu(OH)2 -13.68 FeHEDTA 26.4 MnOH+ -10.59 S2- -12.918 Cu(OH)3

- -26.899 FeOHEDTA2- 17.71 Mn(OH)3- -34.8 S2

2- -14.528 Cu(OH)4

2- -39.6 Fe2(OH)2EDTA24- 38.22 MnSO4 2.26 S3

2- -13.282 Cu2(OH)2

2+ -10.359 H2 -3.15 Mn(NO3)2 0.6 S42- -9.829

CuSO4 2.31 HS- 33.66 Mn(HCO3)+ 11.6 S5

2- -9.595 Cu(HS)3

- 25.899 H2S 6.994 MnEDTA2- 13.89 S62- -9.881

CuHCO3+ 13 H2BO3

- -9.24 MnHEDTA- 16.99 CO2/CO32- -18.16

CuEDTA2- 18.78 HCO3- 10.33 NaCO3

- 1.268 O2/H2O 83.12 CuHEDTA- 21.88 H2CO3 16.681 NaHCO3 10.08 Fe(OH)3(s) -4.891 CuH2EDTA 23.88 HSO4

- 1.987 NaSO4- 0.7

CuOHEDTA3- 7.38 HPO42- 12.346 NaHPO4

- 12.636 Fe2+ 13.032 H2PO4

- 19.553 NaEDTA-3 1.86 FeOH+ -31 H3PO4 21.7 ZnCl+ 0.43 FeSO4 2.25 HEDTA-3 10.19 ZnCl2 0.45


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I.7. Literature

Adhikari T and Rattan R K 2000 Modelling zinc uptake by rice crop using a Barber-Cushman approach. Plant Soil 227, 235-242.

Antunes P M C and Hale B A 2006 The effect of metal diffusion and supply limitations on conditional stability constants determined for durum wheat roots. Plant Soil 284, 229-241.

Barber S A 1995 Soil nutrient bioavailability: A mechanistic approach. John Wiley & Sons. 398 p. Bowen J E 1987 Physiology of genotypic differences in zinc and copper uptake in rice and tomato. Plant Soil 99,

115-125. Bravin M N, Michaud A M, Larabi B and Hinsinger P 2008b Rhizotest: a plant-based biotest to account for

rhizosphere processes for assessing metal bioavailability. submitted to Environ Pollut. Briat J F and Lebrun M 1999 Plant responses to metal toxicity. Compte-Rendu de l'Académie des Sciences 322,

43-54. Cathala N and Salsac L 1975 Absorption du cuivre par les racines de maïs (Zea mays L.) et le tournesol

(Helianthus annuus L.). Plant Soil 42, 65-83. Chaignon V and Hinsinger P 2003 A biotest for evaluating copper bioavailability to plants in a contaminated

soil. J. Environ. Qual. 32, 824-833. Chen W, Li L, Chang A C, Wu L, Kwon S I and Bottoms R 2008 Modeling uptake kinetics of cadmium by field-

grown lettuce. Environ. Pollut. 152, 147-152. Costigan P A, Rose J A and McBurney T 1982 A microcomputer based method for the rapid and detailed

measurement of seedling root systems. Plant Soil 69, 305-309. Degryse F, Smolders E and Parker D R 2006 Metal complexes increase uptake of Zn and Cu by plants:

implications for uptake and deficiency studies in chelator-buffered solutions. Plant Soil 289. Hart J J, Welch R M, Norwell W A and Kochian L V 2002 Transport interactions between cadmium and zinc in

roots of bread and durum wheat seedlings. Physiol. Plantarum 116, 73-78. Hart J J, Welch R M, Norwell W A, Sullivan L A and Kochian L V 1998 Characterization of cadmium binding,

uptake, and translocation in intact seedlings of bread and durum wheat cultivars. Plant Physiol. 116, 1413-1420.

Hinsinger P, Courchesne F 2008 Biogeochemistry of metals and metalloids at the soil-root interface. In Biophysic-Chemical Processes of Heavy Metals and Metalloids in Soil Environments, Eds Violante A, Huang PM and Gadd GM. pp 267-311. John Wiley & Sons, Hoboken, USA.

Kinraide T B, Pedler J F and Parker D R 2004 Relative effectiveness of calcium and magnesium in the alleviation of rhizotoxicity in wheat induced by copper, zinc, aluminium, sodium and low pH. Plant Soil 259, 201-208.

Kopittke P M, Blamey F P C and Menzies N W 2008 Toxicities of soluble Al, Cu, and La include ruptures to rhizodermal and root cortical cells of cowpea. Plant Soil 303, 217-227.

Kopittke P M, J. D P and Menzies N W 2007 Toxic effects of low concentrations of Cu on nodulation of cowpea (Vigna unguiculata). Environ. Pollut. 145, 309-315.

Kopittke P M and Menzies N W 2006 Effect of Cu toxicity on growth of cowpea (Vigna unguiculata). Plant Soil 279, 287-296.

Lehto N J, Davison W, Zhang H and Tych W 2006a Analysis of micro-nutrient behaviour in the rhizosphere using a DGT parameterised dynamic plant uptake model. Plant Soil 282, 227-238.

Lehto N J, Davison W, Zhang H and Tych W 2006b Theoretical comparison of how soil processes affect uptake of metals by diffusive gradients in thinfilms and plants. J. Environ. Qual. 35, 1903-1913.

Lexmond T M and van der Vorm P D J 1981 The effect of pH on copper toxicity to hydroponically grown maize. Neth. J. Agr. Sci. 29, 217-238.

Lindon F C and Henriques F S 1992 Effects of increasing concentrations of Cu on metal uptake kinetics and biomass yields. Soil Sci. 154, 44-49.

Lombi E, Zhao F J, McGrath S P, Young S D and Sacchi G A 2001 Physiological evidence for high-affinity cadmium transporter highly expressed in thlaspi caerulescens ecotype. New Phytol.149, 53-60.

Martell A E and Smith R M 2003 NIST Standard Reference Database 46. NIST Standard Reference Data, Gaithersburg, USA.


Michaud A M, Chappellaz C and Hinsinger P 2008 Copper phytotoxicity affects root elongation and iron nutrition in durum wheat (Triticum turgidum durum L.). Plant Soil, DOI 10.1007/s11104-11008-19642-11100.

Mullins G L, Sommers L E and Barber S A 1986 Modeling the plant uptake of cadmium and zinc from soils treated with sewage sludge. Soil Sci. Soc. Am. J. 50, 1245-1250.


114

Nielsen N E 1976 A transport kinetic concept for ion uptake by plants: III. Test of the concept by results from water culture and pot experiments. Plant Soil 45, 659-677.


Nowack B, Koehler S and Schulin R 2004 Use of diffusive gradients in thin films (DGT) in undisturbed field soils. Environ. Sci. Technol. 38, 1133-1138.

Nowack B, Mayer K U, Oswald S E, van Beinum W, Appelo C A J, Jacques D, Seuntjens P, Gerard F, Jaillard B, Schnepf A and Roose T 2006 Verification and intercomparison of reactive transport codes to describe root-uptake. Plant Soil 285, 305-321.

Oliver S and Barber S A 1966 Mechanisms for the movement of Mn, Fe, B, Cu, Zn, Al and Sr from one soil to the surface of soybean roots (Glycine max L.). Soil Sci. Soc. Am. J. 30, 468-470.

Puig S, Andres-Colas N, Garcia-Molina A and Penarrubia L 2007 Copper and iron homeostasis in Arabidopsis: responses to metal deficiencies, interactions and biotechnological applications. Plant Cell Environ. 30, 271-290.

Reichman S M and Parker D R 2005 Metal complexation by phytosiderophores in the rhizosphere. In Biogeochemisty of trace elements in the rhizosphere, Eds P M Huang and G R Gobran. pp 129-156. Elsevier, Amsterdam.

Reichman S M and Parker D R 2007 Probing the effects of light and temperature on diurnal rhythms of phytosiderophore release in wheat. New Phytol. 174, 101-108.

Reid R and Liu J 2004 Measurement of trace metal influx in plants: a case study with Co. Funct. Plant Biol. 31, 941-947.

Roberts L A, Pierson A J, Panaviene Z and Walker A L 2004 Yellow stripe1. Expanded roles for the maize iron-phytosiderophore transporter. Plant Physiol. 135, 112-120.

Sadana U S and Claassen N 2000 Manganese dynamics in the rhizosphere and Mn uptake by different crops evaluated by a mechanistic model. Plant Soil 218, 233-238.

Sauvé S, McBride M B and Hendershot W H 1995 Ion-selective electrode measurements of copper(II) activity in contaminated soils. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29, 373-379.


Seuntjens P, Nowack B and Schulin R 2004 Root-zone modeling of heavy metal uptake and leaching in the presence of organic ligands. Plant Soil 265, 61-73.

Sterckeman T, Perriguey J, Cael M, Schwartz C and Morel J L 2004 Applying a mechanistic model to cadmium uptake by Zea mays and Thlaspi caerulescens: Consequences for the assessment of the soil quantity and capacity factors. Plant Soil 262, 289-302.

Veltrup W 1976 Concentration dependent uptake of copper by barley roots. Plant Physiol. 36, 217-220. Vindimian E 2001 REGTOX: macro ExcelTM pour dose-réponse. last access 31 may 2008. Vulkan R, Zhao F J, Barbosa-Jefferson V, Preston S, Paton G I, Tipping E and McGrath S 2000 Copper

speciation and impacts on bacterial biosensors in the pore water of copper-contaminated soils. Environ. Sci. Technol. 34, 5115-5121.



Chapitre 4. Biodisponibilité Cu, Matières Organiques et pH du sol

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CHAPITRE 4 Biodisponibilité du cuivre pour le blé dur

en fonction de l’apport de matières organiques et du pH du sol Le chapitre précédent a permis de montrer que le flux de prélèvement du cuivre (Cu) par le blé dur était faible et, en conséquence, que le flux de réapprovisionnement de Cu en solution n’était pas systématiquement limitant vis-à-vis de la biodisponibilité de Cu. Ce résultat suggère que les modifications chimiques induites par les racines, tels que l’alcalinisation mesurée in situ en sols très acides (chapitre 2.I), seraient les principaux processus rhizosphériques impliqués dans le déterminisme de la biodisponibilité de Cu pour le blé dur. Cependant, les propriétés physico-chimiques du sol, notamment le pH, la nature et la teneur en matières organiques (MO), peuvent également influencer la biodisponibilité des métaux. Les résultats rapportés par Kornegay et al. (1976) et Bolan et al (2003) suggèrent que l’apport de MO au sol peut alternativement augmenter ou bien diminuer la biodisponibilité de Cu pour les plantes suivant que ces MO présentent une concentration élevée en Cu ou non. D’autre part, nous avons vu dans le chapitre 2 que la biodisponibilité de Cu semblait être indépendante du pH du sol. Cependant, dans ces deux expérimentations, les sols présentaient des différences, non seulement de pH, mais également de multiples autres propriétés physico-chimiques (teneurs en MO, en argiles…). Il est donc nécessaire de vérifier les résultats concernant l’absence d’effet du pH avec un sol dont le pH est la seule variable de forçage. L’objectif global de ce chapitre est donc de caractériser le rôle des modifications chimiques induites par les racines dans la rhizosphère sur la biodisponibilité de Cu pour le blé dur cultivé dans des sols dont certaines propriétés physico-chimiques varient en lien avec l’apport de MO ou la modification de pH. Plus particulièrement, je vais chercher dans le cadre de l’évaluation de la disponibilité et la biodisponibilité de Cu à : (i) Estimer l’effet de l’apport au sol de MO contaminées ou non en Cu, (ii) Estimer l’effet d’une variation de pH du sol, (iii) Evaluer les modifications de pH, en particulier l’alcalinisation, dans la rhizosphère, (iv) Evaluer les modifications de concentrations en matières organiques dissoutes dans la rhizosphère. Le premier article, intitulé : « Copper speciation and bioavailability as affected by rhizosphere processes and organic amendments in two copper-contaminated soils », aborde l’effet de l’apport de différents types de MO sur la spéciation de Cu dans la solution du sol et la biodisponibilité de Cu pour le blé dur cultivé dans un sol très acide contaminé et un sol calcaire modérément contaminé. Cet article a été rédigé pour être soumis à la revue Science of the Total Environment. Le second article, intitulé : « Rhizosphere alkalisation – a major driver of copper bioavailability over a broad pH range in an acidic, copper-contaminated soil », concerne l’effet du pH sur la biodisponibilité de Cu. Dans cette expérimentation, le sol, initialement très acide, a été chaulé pour obtenir une large gamme de pH (4,5-7,5). Deux types de nutrition azotée ont également été utilisés pour tester l’effet de l’absence ou de la présence du phénomène d’alcalinisation dans la rhizosphère sur la biodisponibilité de Cu. Cet article a été soumis à la revue Plant and Soil.


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Bibliographie Bolan N, Adriano D, Mani S and Khan A 2003 Adsorption, complexation, and phytoavailability of copper as

infuenced by organic manure. Environmental Toxicology and Chemistry 22, 450-456. Kornegay E T, Hedges J D, Martens D C and Kramer C Y 1976 Effect on soil and plant mineral levels following

application of manures of different copper contents. Plant and Soil 45, 151-162.


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I. Copper speciation and bioavailability as affected by rhizosphere processes and organic amendments in two copper-contaminated soils Authors: M. N. Bravin1, M. Chaudhary1,2 and P. Hinsinger1,* Affiliations: 1 INRA, UMR 1222 Biogéochimie du Sol et de la Rhizosphère (INRA-SupAgro), Place Viala, 34060 Montpellier, France 2 Norwegian University of Life Sciences, Department of Plant and Environmental Sciences, 1432 Aas, Norway * Corresponding author: [email protected], Tel: +33 4 99 61 22 49, Fax: +33 4 99 61 30 88 Abstract This study investigated the soil solution chemistry and bioavailability of Cu to durum wheat (Triticum turgidum durum L.) cropped in an acidic and a calcareous, Cu-contaminated soil, as affected by organic amendments: a legume straw, a commercial compost and a Cu-contaminated, composted sewage-sludge were compared. The focus of this study were the root-induced chemical changes occurring in the rhizosphere. In the acidic soil (pH = 5), the organic amendments induced a soil alkalisation ranging from 0.8 to 1.6 pH unit, while the rhizosphere pH reached pH 6.9 whatever the treatment. In the calcareous soil, pH did not significantly change. Dissolved organic carbon (DOC) concentration did not significantly increase in the rhizosphere. Total Cu concentration and free Cu2+ activity Cu2+ was therefore more affected by root-induced pH changes than by organic amendment. Copper bioavailability, i.e. the uptake flux, was also slightly higher in acidic soil than in calcareous soil, without any significant impact of organic amendment addition. Conversely, plant took up a larger percentage of total soil Cu in calcareous soil, which could be attributed to a larger ability of roots to mobilise Cu in calcareous soils. These results suggest that root-induced chemical changes such as alkalisation in acidic soil and exudation are major drivers of Cu bioavailability in soils, in contrast with the poor effect of organic amendments, even for Cu contaminated composts. Keywords: Copper, Dissolved organic matter (DOM), Organic amendment, pH, Phytoavailability, Rhizosphere.


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I.1. Introduction

Vineyard soils which usually exhibit a low soil organic matter content could be amended with organic matter to maintain soil fertility and to limit soil erosion (Besnard et al. 2001; Korboulewsky et al. 2002; Ramos and Martinez-Casasnovas 2006). However, vineyard soils are also often contaminated with copper (Cu) due to the repetitive use of Cu-based fungicides for decades (Delas 1963). The addition of organic amendments could lead to harmful effect, such as increases in Cu mobility in soil and Cu bioavailability to plants. The impact of organic amendments incorporated in soils on Cu bioavailability to plants has been studied for long. Plant Cu content was found to increase, remain unchanged or decrease depending on the Cu content in organic amendments (Kornegay et al. 1976; Jordao et al. 2006), the quantity and quality of the organic amendment (Bolan et al. 2003; Walker et al. 2003), the plant compartment and species (Kornegay et al. 1976; Jordao et al. 2006; Walker et al. 2003), the soil properties (Planquart et al. 1999; Zhang et al. 2004) and the time-scale of the study (Parat et al. 2007). The addition of organic amendments in soils can have both direct and indirect effects on the chemistry of Cu in soils and Cu bioavailability to plants. The most obvious effect was a large supply of Cu by highly contaminated organic matter, which usually involved a large increase in plant Cu content especially in roots (Zheljazkov and Warman 2004; Jordao et al. 2006). Chemical fractionation of Cu also revealed that biosolid addition involved an increase in Cu presumably bound to organic fraction and a related decrease in soluble and exchangeable Cu (Bolan et al. 2003). Organic amendments can also strongly alter the chemical properties of soil solution such as pH and dissolved organic carbon (DOC). The incorporation of organic matter with a large nitrogen (N) and organic anion contents, such as legume straw, was able to alkalinise acidic soils up to 2 pH units (Tang and Yu 1999; Xu and Coventry 2003). Increase in DOC concentration is also usually associated with organic amendment addition (Lamy et al. 1993) and was found to promote Cu desorption from soil solid-phase (Bolan et al. 2003; Zhou and Wong 2001) and to alter Cu speciation in soil solution (Salam and Helmke 1998). Plant can similarly interact with soil solution chemistry through root-induced pH changes and exudation of DOC in the rhizosphere (Hinsinger and Courchesne 2008). For instance, Jordao et al. (2006) noted an acidification of a planted soil amended with organic matter and fertilised with ammonium, which was likely due to root excretion of H+ in response to excess absorption of cations by roots compared to anions (Hinsinger et al. 2003). In contrast, root-induced alkalisation in strongly acidic soils was recently reported in the rhizosphere of field-grown plants (Michaud et al. 2007, chapter 2.I), leading to a decrease in CaCl2-extracted Cu. Despite Cu speciation in soil solution being of key relevance to Cu bioavailability, there is a lack of understanding of the effects of organic amendments on Cu concentration and speciation in soil solution. Moreover, interactions between Cu and root activities in the rhizosphere when organic amendments are applied are unknown. Consequently, this study aimed at measuring (i) Cu concentration and speciation in the soil solution in both bulk soil and rhizosphere and (ii) Cu bioavailability to durum wheat (Triticum turgidum durum L.) in two pH-contrasted, Cu-contaminated soils amended with different organic materials. The three tested organic amendments, (i) a commercial compost, (ii) a Cu-contaminated sewage-sludge compost and (iii) a legume straw were chosen to cover a range of C/N ratios and Cu contents. Plants were grown with the RHIZOtest bioassay (Chaignon and Hinsinger 2003; Bravin et al. 2008, chapter 2.II) in order to (i) estimate the environmental bioavailability as defined by ISO (2006), i.e. the flux of Cu transferred into the plants, and (ii) have easy access to Cu chemistry in the rhizosphere.


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I.2. Material and Methods

I.2.1. Properties of soils and organic amendments

The two topsoil samples used in this study were collected in Cu-contaminated, former vineyard plots in Southern France. Soil samples were air-dried and sieved at 2 mm before analyses. Soil analyses were performed by routine soil testing laboratories (INRA-LAS and CIRAD-PERSYST, France) according to standardised French (AFNOR 1999) or international (ISO 1999) procedures (Table 1). CaCl2 (0.01 M) and H2O extractions were performed with a soil:solution ratio of 1:10 (Lebourg et al. 1998). K-pyrophosphate (K4P2O7 0.1 M, pH 9.5) extraction (soil:solution ratio 1:40) was performed to recover Cu bound to organic matter (Planquart et al. 1999). The first soil sample (soil 1) was a strongly acidic soil (pHH2O = 5.0), with a total Cu content of 184 mg kg-1. The second soil sample (soil 2) was a calcareous soil with a total Cu content of 72 mg kg-1. Table 1. Physico-chemical properties of soil samples and organic amendments (C1, C2 and LS)

Soil 1 Soil 2 Compost 1

(C1) Compost 2

(C2) Legume straw

(LS) Sand 578 438 Silt 176 280 Clay

g kg-1

246 282 Corg g kg-1 15.5 5.7 243.5 230.2 433.3 C/N 12.0 6.9 10.1 7.4 15.7 pHH2O 5.0 8.3 CEC cmol+ kg-1 7.7 12.5 CaCl2-Cu 7.0 < 0.2* 1.5 0.3 H2O-Cu 0.4 0.4 2.2 0.5 Kpyr-Cu 115 48 7 111 Total-Cu

mg kg-1

184 72 43 331 12 * Lower than our working limit Three organic amendments were compared (Table 1). The first compost (C1) was a commercially-available compost with a low Cu content, 43 mg kg-1. The second compost (C2) was a sewage-sludge compost with a moderately high Cu content, 331 mg kg-1. Grounded clover shoots were also used as a legume straw (LS) for its expected alkalization effect (Tang and Yu 1999). The organic amendments C1 and C2 were applied on soils 1 and 2 with a rate of 11 and 15 g kg-1 soil, respectively, while LS was applied on soil 1 only with a rate of 8.4 g kg-1 soil. The organic amendments were mixed with the soils and the mixtures incubated at 20-25 °C for 5 weeks at soil water-holding capacities with the nutrient solution used during the soil stage of plant bioassay (see below for rationale). For each soil, a control soil without organic amendment addition was handled similarly (Treatments 0).

I.2.2. Plant growth in the RHIZOtest bioassay

The RHIZOtest bioassay was described in details by Chaignon and Hinsinger (2003) and Bravin et al. (2008, chapter 2.II). It separates plant roots from soil by a 30-µm polyamide mesh to facilitate the collection of roots and rhizosphere. Durum wheat seeds (cv. Acalou), two per pots, were germinated in hydroponics in CaCl2 600 µM and H3BO3 2 µM for 1 week, then grown in hydroponics for another 2-week in


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a complete nutrient solution (µM): Ca(NO3)2 2000, KNO3 2000, MgSO4 1000, KH2PO4 500, NaFe(III)EDTA 100, H3BO3 10, MnCl2 2, ZnSO4 1, CuCl2 1 and Na2MoO4 0.05. The pH was equal to 5.5 and the solution renewed every second day. The growth chamber parameters were set at (day/night): 25/20°C, 75/70% relative humidity and 450 µmol photons m-2 s-1 photon flux density. For the soil stage, three-week-old seedlings with a dense, planar root mat were transferred onto a thin layer of pre-incubated soil (1.5-mm thick, 3 g dry soil). Soil layers were connected to 1-dm3 nutrient solution with same composition as above minus Cu and FeEDTA. After 8 days of contact, soil was considered as rhizosphere. The root-induced changes in the rhizosphere were measured relative to control soil incubated in similar devices without plant (bulk-soil controls). Devices with and without plant were replicated five times.

I.2.3. Plant analyses

At harvest, plant shoots and roots were separated. Roots were divided in three equivalent sub-samples in order to measure total and symplasmic Cu content as well as root surface area. Shoots and roots used to measure total Cu content were directly oven-dried at 105 °C, while root sub-samples used for symplasmic Cu and surface area measurements were stored at -20 °C before analyses. Five devices were harvested after the first 3-week in hydroponics to serve as plant controls. After thawing, for the purpose of surface area measurements, root sub-samples were stained for 5 min with 0.003 M methylene blue (Costigan et al. 1982), then rinsed with tap water. Roots were spread in a Perspex tray containing a thin layer of water (0.5-1 cm) and scanned at a resolution of 600 dpi (dots per inch) using a 2-light sources procedure (Epson expression 10000 XL). The output as greyscale images were analysed with WinRHIZO (version 2005 b, Regent Instruments, Canada) using a method of automatic global threshold. After root surface area measurements, root samples were oven-dried at 105°C for dry biomass determination. Another set of root sub-samples was used to measure symplasmic Cu after the extraction of apoplasmic Cu (Chaignon and Hinsinger 2003). After thawing, 0.8 g of roots was shaken end-over-end for 5 min with 40 cm3 HCl 10-3 M. After rising up HCl concentration to 10-2 M, roots were shaken for another 3 min. Roots were finally rinsed thrice with ultra-pure water (18.2 MΩ), then oven-dried at 105°C for dry biomass determination. Shoots and roots (for total and symplasmic Cu determination) were ground (MM 2000, Retsch) then digested in a microwave oven (Ethos Touch Control, Milestone) in concentrated HNO3 (65 %) at 180°C and 2 106 Pa. Copper concentration in the digests was measured by flame atomic absorption spectrometry (F-AAS, Varian FS-220, Australia). Blanks and reference materials of maize shoots (Zea mays L., V 463, Bureau InterProfessionnel d’Etudes Analytiques, France) and olive leaves (Olea europaea L., n° 62, Community Bureau of References, Comission of the European Communities) were included during digestions and analyses to check the accuracy of the measurement procedure. Plant Cu flux (Fplt, ng Cu m-2 root surface area s-1), i.e. Cu bioavailability, was calculated for each treatment according to Mullins and Sommers (1986) formula accounting for an exponential root growth:

Fplt = (m – mC) / (S – SC) * k (1) k = ln(S / SC) / t (2)


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where mC and m are the mass of Cu accumulated in the whole plants after pre-culture (control) and 8-day exposure to soil (ng), SC and S, the root surface area after pre-culture and 8-day exposure to soil (m2), k, the growth constant (s-1) and, t (s) is the duration of soil stage (8 days).

I.2.4. Soil solution analyses

Soils collected after 5 weeks of incubation as well as rhizosphere and bulk soils collected after soil stage were oven-dried at 30-35 °C. The soil solution was considered to be in equilibrium with the nutrient solution composition supplied during soil incubation and soil stage. Consequently, a solution of identical composition as nutrient solution was used to extract the soil solution. Each soil sample was shaken end-over-end for 2 h with the nutrient solution (soil:solution ratio 1:10), then centrifuged at 10 000 g for 10 min before filtration (0.45 µm, acetate cellulose filter). Within 2 days, pH and dissolved organic carbon (DOC) were measured with a combined glass-electrode (6.0234.110, Metrohm) and a total organic carbon analyser (TOC-5000, Shimadzu). Total Cu concentration was measured by graphite furnace AAS (Varian SpectraAA-600 GTA-110, Australia). Free Cu2+ activity, Cu2+, was also determined in soil solution extracts by speciation modelling with WHAM VI (Tipping 1998). The model was previously calibrated on a set of 25 soil samples widely varying in pH (4.1-7.4) and total Cu content (32-184 mg kg-1) (Appendix, Table A-1). Soil samples were incubated for 2 weeks with the nutrient solution at around 70 %of water-holding capacities. After oven-drying at 60°C, an extraction with the nutrient solution was performed as previously described. Total concentration of major cations (Al, Ca, Fe, K, Mg, Na, NH4) and anions (Cl, NO3, PO4, SO4), total concentration of Cu, pH and DOC were measured in soil solution extracts by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP-AES, Varian Vistapro, Australia), GF-AAS, a glass-combined electrode and TOC analyser, respectively (Appendix, Table A-1). Partial pressure of CO2 was assumed to be that of the atmosphere. These parameters were used to run WHAM VI, considering that dissolved organic matter (DOM, 50 % carbon) was only represented by fulvic acid. Modelled pCu2+ was adjusted with the percentage of fulvic acid that reacts for metal binding to fit pCu2+ measured with a Cu ion-selective electrode (Cu-ISE; DX-264, Mettler Toledo) and a double-junction reference electrode (Inlab-302, Mettler Toledo). ISE measurements were calibrated as described by Bravin et al. (2008, chapter 2.II) and in the chapter 3. ISE measurements were compared and then corrected with pCu2+ estimated from differential pulse anodic stripping voltametric (DPASV) measurements as further described in the chapter 5.I. Soil solution composition was then simplified to be able to calculate pCu2+ on the basis of total Cu concentration, pH and DOC concentration only with fixed values of Al, Ca, Fe, K, Mg, NO3 and SO4 (Appendix, Figure A-1 and Table A-2). The simplified set of parameters and the optimised assumption on fulvic acid were used to calculate pCu2+ in soil solutions extracted for the purpose of this study.

I.2.5. Statistics

Analyses of variance (HSD Tuckey’s test) as well as simple and multi-linear regressions were performed with Statistica (version 6, StatSoft). The level of statistical significance was represented by *, ** and *** for P < 0.05, P < 0.01 and P < 0.001, respectively.


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I.3. Results

I.3.1. Prediction of pCu2+ using WHAM VI

WHAM VI prediction of pCu2+ was optimised by adjusting the percentage of fulvic acid participating to metal binding to minimise the root mean square residual (RMSR):

RMSR = [ ∑ (pCu2+ measured – pCu2+ calculated)2 / 25 ]1/2 (3)

The minimal RMSR was equal to 0.34 when considering that 44 % of DOM reacted as fulvic acid, the remainder being inert (Figure 1). In this case, the deviation between model prediction and measurement was lower than ± 0.5 pCu2+ unit for 21 out of 25 samples. Model predictions remained reasonably good when considering the assumptions regarding to Al, Ca, Fe, K, Mg, NO3 and SO4. pCu2+ deviation regards to the model prediction with measured concentrations of the extracted soil solution was thus within ± 0.1 for pCu2+ lower than 7 and within ± 0.4 for pCu2+ higher than 7 (R² = 0.98*** , results not shown).

Figure 1. Comparison between pCu2+ calculated with WHAM VI and measured with an ion-selective electrode (ISE) in the solutions of 25 soil samples (see Material and methods for further details). Dotted lines stand for 1:1 line ± 0.5 pCu2+ unit.

I.3.2. Chemistry of the solution of rhizosphere and bulk soils

At the end of soil stage, pH of unamended soil 1 was equal to 5, while pH increased in bulk soils due to organic amendment addition (Figure 2.a). Rhizosphere pH was higher than bulk pH whatever the treatment: it reached 6.9, without any significant difference between treatments. The pH values in soil 2 were higher than in soil 1 (P < 0.001), but there was no significant difference between the different treatments (Figure 2.a). In soil 1, when organic amendments were added DOC concentration did not significantly change in the bulk soil (Figure 2.b). In the rhizosphere, DOC concentration did not significantly change relative to bulk soil values. In bulk soil 2, DOC concentration significantly increased when C2 amendment was added (Figure 2.b). DOC concentration decreased significantly in this treatment in the rhizospher relative to bulk soil. Except for treatment 0 in soil 1, DOC concentration was slightly lower in the rhizosphere than the bulk soil (P < 0.01).


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Figure 2. pH (a), dissolved organic carbon concentration (DOC, b), total Cu concentration (c) and pCu2+ (d) in the solution of rhizosphere (black columns) and bulk soils (hatched columns). Soil 1 was initially strongly acidic (pH = 4.3), while soil 2 was calcareous. Soils were supplied with different organic amendments (+C1, compost 1; +C2, compost 2; +LS, legume straw) or not (0). Different letters for a given soil stand for a significant difference (P < 0.05). Total Cu concentration in soil solution was higher in soil 1 than in soil 2 (P < 0.001; Figure 2.c). In the rhizosphere of soil 1, total Cu concentration was greater in treatment +LS than in the other treatments and, except for this treatment, it was significantly smaller in the rhizosphere than the bulk soil. Among all soil treatments, total Cu concentration decreased from bulk to rhizosphere soils (P < 0.001). Positive linear regressions were noted between total Cu and DOC concentrations in the rhizosphere of soils 1 (R² = 0.31*) and 2 (R² = 0.46** ) (Figure 3.a).


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Figure 3. Total Cu concentration as a function of dissolved organic carbon concentration (a) and pCu2+ as a function of pH (b) and dissolved organic carbon concentration (c) in the solution of bulk (open symbols) and rhizosphere (close symbols) soils. Circles and triangles stand for soils 1 and 2, respectively. Free Cu2+ activity was considerably larger in soil 1 than in soil 2 when considering bulk soil values (P < 0.001; Figure 2.d). The difference was less than one order of magnitude for the rhizospher values. In the rhizosphere of soil 1, pCu2+ was significantly higher than in bulk soil (P < 0.001). Conversely in soil 2, no significant difference was observed neither in bulk or rhizosphere soils (Figure 2.d). Free Cu2+ activity was negatively correlated to soil solution pH (R² = 0.90*** ; Figure 3.b) which may explain the previous findings. Free Cu2+ activity was also negatively correlated to DOC concentration in the rhizosphere of soil 1 (R² = 0.48*** ) and the bulk soil 2 (R² = 0.66*** ; Figure 3.c). Free Cu2+ activity was thus almost perfectly described by the following multi-linear regression:

pCu2+ = 0.69 (± 0.01) pH + 2.42 (± 0.08) pCu + 2.69 (± 0.09) log10(DOC) – 14.4 (± 0.5) R² > 0.99*** N = 69 (4)

I.3.3. Uptake and distribution of Cu in plant

Plant uptake flux, which accounted for all Cu taken up in the plant including the root apoplasm, was slightly larger in soil 1 than in soil 2 across all treatments (P < 0.05; Figure 4). Nevertheless, there was no significant difference between treatments. No significant correlation was found between plant exposure to Cu, i.e. total Cu or free Cu2+ in soil solution, and plant uptake flux (results not shown). In soil 1, plant absorption flux, which contrary to the uptake flux does not account for the portion of Cu in root apoplasm, tended to decrease in


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amended soils in comparison with treatment 0 and the difference was significant for treatment +LS (Figure 4). The same trend was observed with no significant difference between treatments in soil 2. The mean percentage of total soil Cu taken up by plant was significantly lower in soil 1 (6 ± 1 %) than in soil 2 (14 ± 2 %).

Figure 4. Plant Cu flux accounting for root apoplasm (uptake, closed columns) or not (absorption, open columns). Soil 1 was initially strongly acidic (pH = 4.3), while soil 2 was calcareous. Soils were supplied with different organic amendments (+C1, compost 1; +C2, compost 2; +LS, legume straw) or not (0). Different letters for a given soil stand for a significant difference (P < 0.05). Shoot and root biomasses as well as root surface area were not significantly affected by treatments or soils (results not shown). Copper contents in shoots, symplasmic roots and total roots ranked between 7.6 and 15.4, 6.0 and 20.7 and 12.1 and 30.6 mg kg-1 but did not differ significantly between treatments (Figure 5). The Cu content of root symplasm was systematically smaller in amended soils. Nevertheless, total root Cu content was significantly higher in soil 1 than in soil 2 (P < 0.05). Conversely, Cu translocation from root symplasm to shoots was greater in soil 2 than in soil 1.

Figure 5. Plant Cu content in shoots, root symplasm and total roots (including root apoplasm). Soil 1 was initially strongly acidic (pH = 4.3), while soil 2 was calcareous. Soils were supplied with different organic amendments (+C1, compost 1; +C2, compost 2; +LS, legume straw) or not (0). No significant difference was observed in the different plant compartments (P > 0.05).


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I.4. Discussion

I.4.1. Soil solution chemistry as affected by rhizosphere processes and organic amendments

In the bulk of acidic soil (soil 1), pH was greatly affected by organic amendments which involved a mean alkalisation of 0.8 and 1.6 pH unit for composts and legume straw, respectively (Figure 2.a). Such alkalisation was already reported in the literature and appeared mainly attributed to microbial decarboxylation of organic anions and ammonification of organic N following organic amendment incorporation into soils (Yan et al. 1996; Yan and Schubert 2000). Tang and Yu (1999) and Xu and Coventry (2003) noted that alkalisation reached up to + 2 pH unit in strongly acidic soils when amended with legume straws. They attributed such effect to the large amount of organic N and organic anions in legume straws. This is in agreement with our results showing a larger alkalisation in the bulk soil amended with clover straw. In this acidic soil, rhizosphere pH further increased, reaching 6.8 whatever the treatment (Figure 2.a). Relative to bulk soil pH, the change amounted to 0.2 for legume straw to 1.8 pH unit in the unamended soil. This additional alkalisation could be attributed to excess anion over cation absorption for NO3

--fed plants, leading to a net efflux of OH- from roots (Haynes 1990; Hinsinger et al. 2003). One may argue that the supply of a large concentration of nitrate via the nutrient solution was likely the cause of this alkalization. However, such alkalization of similar, acidic soils of the same region was also reported when measuring rhizosphere pH of field-grown durum wheat (Michaud et al., 2007, chapter 2.I). Root-induced alkalisation of strongly acidic soils such as this one could also occur to alleviate Al phytotoxicity at low soil pH (Marschner 1991; Hinsinger et al. 2003). Conversely, pH did not change at all in the rhizosphere and bulk of calcareous soil (soil 2) whatever the treatment (Figure 2.a). This was likely the consequence of the pH buffering capacity of Ca-carbonates in calcareous soils (Hinsinger et al. 2003). Contrary to what was expected, DOC concentration did not increase upon organic amendment incorporation in the bulk of acidic soil and only slightly increased in the bulk of calcareous soil (Figure 2.b). Root activity was the main driver of DOC dynamics with a slight and most often unsignificant decrease in DOC concentration in the rhizosphere compared with the bulk soil, except for the unamended acidic soil. These results again contradict the literature as Khalid et al. (2007) noted an increase in DOC concentration in a soil planted with a range of grassland plants in comparison with the unplanted soil. Increase in DOC concentration in the rhizosphere of forest trees and maize was also reported to occur in Cu-contaminated soils (Séguin et al. 2004; Cattani et al. 2006). This pattern is usually attributed to root exudation of organic compounds in the rhizosphere. However, it is also known that mineralisation of organic compounds can increase in the rhizosphere, the so-called priming effect, due to enhanced microbial activity as a consequence of root exudation (Kuzyakov 2002). Such priming effect may thus have been responsible for the lower DOC concentration in the rhizosphere. To support this assumption, Khalid et al. (2007) observed, in parallel to DOC increase, a decrease in DON in planted soil compared to unplanted soil. On the other hand, soil samples had been dried before extraction of soil solution in the present experiment, which may have led to an alteration of both DOC concentration and composition (Akagi et al. 2007; Amery et al. 2007). Fischer et al. (2007) noted a decrease in amino acid concentration when DOM-containing soil solution was dried. A particularly strong impact of drying on the lowest molecular weight organic molecules such as those exuded by plant roots might thus occur, leading to a decrease in DOC concentration in the rhizosphere compared to the respective bulk soils.


127

Due to pH and DOC changes in bulk and rhizosphere soils, both total and free ionic Cu concentrations in solution were greatly affected (Figure 2.c and b). In comparison with the incubated acidic soil without any organic amendment incorporation (treatment 0) which exhibited very low pH, total Cu concentration largely decreased in all the other treatments of acidic soil (Figure 2.c). McBride and Blasiak (1979) showed that total Cu concentration in soil solution decreases linearly with pH for pH values lower than 5.5. However, in the 5.5-7.5 pH range, total Cu concentration is almost insensitive to pH (McBride and Blasiak 1979; Tyler and Olsson 2001). This is in line with our results (not shown) could also explain the small variation of total Cu concentration between bulk and rhizosphere in acidic soil in spite of significant pH changes. When comparing the two soils, the larger total Cu concentration found in the solution of the acidic soil could also be due to the 2.6-fold higher total Cu content of soil 1 (Table 1), as Sauvé et al. (1997) showed that total soil Cu was the main driver of total Cu concentration in soil solution over a large set of soils, followed by pH and DOC. DOC concentration also significantly affected total Cu concentration in the rhizosphere soils, which tended to decrease with decreasing DOC concentration (Figure 3.a). Similar positive correlations between DOC and total Cu concentration in soil solution have already been reported (Zhou and Wong 2001; Bolan et al. 2003; Zhao et al. 2007a and b). This may have contributed to the overall decrease in total Cu concentration in the rhizosphere with respect to bulk soil in both soils, on top of rhizosphere alkalization in the acidic soil. Compared with total Cu concentration, Cu2+ in soil solution was mainly driven by pH when considering the whole set of soil samples and treatments (Figure 3.b), in agreement with McBride and Blasiak (1979) and Salam and Helmke (1998). In the acidic soil and to a lower extend in the bulk of calcareous soil, Cu2+ was also significantly driven by DOC: opposite to total Cu concentration Cu2+ was negatively correlated to DOC concentration (Figure 3.c). Similarly, Salam and Helmke (1998) measured a decrease in Cu2+ in soil solution when DOC increased for pH higher than 5.5. Besides pH, DOC thus played a significant role in the control of both Cu concentration and speciation in the soil solution as an increase in DOC concentration lead to both Cu desorption from solid-phase to solution and Cu2+ complexation in soil solution.

I.4.2. Bioavailability of Cu to durum wheat

The bioavailability of Cu to durum wheat, i.e. the flux of Cu into the plant, as well as Cu content in the different plant compartments were not clearly discriminate between the different soils and treatments despite the large variations in total Cu and more so free Cu2+ concentrations in soil solution (Figures 4 and 6). No significant increase in Cu bioavailability was observed upon compost addition, even for the Cu-contaminated compost (C2). Highly Cu-contaminated organic amendments involved an increase in plant Cu content, especially in roots, when they were incorporated to soils at a rate that significantly increased total soil Cu (Kornegay et al. 1976; Zheljazkov and Warman 2004; Jordao et al. 2006). Conversely, when total soil Cu was not significantly altered by organic amendment addition, plant Cu content was unaffected or even decreased (Kornegay et al. 1976; Zhang et al. 2004; Jordao et al. 2006). In our study, the addition of Cu-contaminated compost only increased total soil Cu by 2 and 5.5 % for the acidic and calcareous soil respectively, which could partly explain why Cu bioavailability did not significantly increase. For the legume straw amended soil (soil 1), a significant decrease in Cu bioavailability was found when expressed as the flux of absorption of Cu, accounting for Cu in shoots and root symplasm only (Figure 4). This is in line with the significantly smaller Cu2+ in this treatment which occurred as a result of the pH increase in the bulk soil. However, neither total Cu concentration nor Cu2+ were correlated to plant Cu flux (results not shown). Plant uptake flux accounting for Cu in root apoplasm was slightly


128

larger in the acidic soil than in the calcareous soil, in agreement with total Cu and free Cu2+ in soil solution (Figure 4). This result may be mainly due to the higher total Cu content of the acidic soil than calcareous soil in the present work. Chaignon et al. (2003) with the same experimental design applied to Lycopersicum esculentum L., Nolan et al. (2005) in pot experiment with Triticum aestivum L. and Michaud et al. (2007, chapter 2.I) for field-grown durum wheat already reported significant correlations between total soil Cu and plant Cu content. Due to the small range of variation of plant uptake flux and the 2.6-fold larger total Cu content in acidic soil than in calcareous soil, the percentage of total soil Cu uptake by durum wheat was 2.3-fold larger in calcareous soil than in acidic soil. Hence, despite a larger availability of Cu in the rhizosphere of the acidic soil, plants were more able to mobilise much Cu in the calcareous soil. This result could be attributed to the particular physico-chemical properties of calcareous soil. Alternatively, the implication of root-induced exudation of Cu-chelating compounds could be also involved in the large mobilisation of Cu in the rhizosphere of calcareous soils, as already suggested for Zea mays L. (Cattani et al. 2006) and field-grown durum wheat (Michaud et al. 2007, chapter 2.I), although this was not substantiated by increased DOC concentration in the present case, in contrast with the work of Cattani et al. (2006). I.5. Conclusion

The impact of organic amendments on soil solution chemistry remained limited compared to soil total Cu and root-induced chemical changes in the rhizosphere. Total Cu concentration and Cu2+ were mainly driven by root-induced alkalisation and/or decrease in DOC concentration in the rhizosphere. Similarly, organic amendments did not affect in a large extent the bioavailability of Cu to durum wheat. We can therefore conclude that incorporation of organic amendments, even when they are Cu-contaminated, into former vineyard soils would not increase the bioavailability of Cu to plants as long as total soil Cu did not significantly increase. However, the huge impact of root-induced chemical changes in the rhizosphere, through alkalisation of acidic soils and exudation, on the mobility and bioavailability of Cu would deserve further attention. I.6. Acknowledgements

We would like to thank Denis Caboulet of the INRA experimental station of Pech-Rouge for providing the two composts. Didier Arnal, Nicole Balsera, Michaël Clairotte and Gérard Souche are kindly acknowledged for technical support. We also thank Frédéric Gérard for introduction to WHAM VI speciation model. Financial support was provided by an ECCO-ECODYN project and the PNETOX programme of the French Ministry of Ecology and Sustainable Development.


129

I.7. Appendix

Table A-1. Major cations and anions, ionic strength, pH, dissolved organic carbon and the resulting pCu2+ measured with an ion-selective electrode (ISE) and calculated using WHAM VI in the solution of 25 soil samples (see Material and methods for further details).

Ca K Mg Na NH4 Al Fe Cu NO3

SO4 Cl PO4

IS* M

pH COD

g C l-1

pCu2+

ISE

pCu2+

WHAM 1

1 2.0E-03 1.8E-03 8.5E-04 1.1E-04 1.3E-04 3.6E-05 4.7E-06 7.1E-06 5.9E-03 9.2E-04 1.3E-04 5.5E-06 1.2E-02 4.1 1.4E-02 5.5 5.4

2 2.3E-03 1.5E-03 9.4E-04 9.0E-05 5.0E-05 1.1E-05 1.1E-06 1.2E-06 6.2E-03 1.0E-03 1.1E-04 7.4E-06 1.3E-02 4.5 2.0E-02 6.2 6.6

3 2.0E-03 1.6E-03 9.3E-04 5.3E-05 3.3E-05 5.9E-06 3.6E-07 2.3E-06 6.1E-03 9.7E-04 9.1E-05 6.8E-06 1.2E-02 4.7 6.4E-03 6.1 6.0

4 2.1E-03 1.8E-03 9.2E-04 9.6E-05 7.5E-05 2.1E-05 2.0E-06 4.9E-06 6.0E-03 1.0E-03 1.1E-04 1.4E-05 1.2E-02 4.4 2.2E-02 6.1 5.7

5 1.9E-03 1.8E-03 9.5E-04 5.8E-05 2.2E-04 9.6E-06 3.6E-07 2.7E-06 6.1E-03 9.9E-04 1.1E-04 8.4E-06 1.2E-02 4.7 9.8E-03 6.2 5.9

6 2.3E-03 1.5E-03 8.6E-04 1.3E-04 4.6E-05 1.4E-05 1.6E-06 2.1E-06 6.0E-03 9.6E-04 1.3E-04 6.5E-06 1.2E-02 4.5 1.4E-02 6.3 6.1

7 1.9E-03 1.8E-03 9.7E-04 3.7E-05 9.4E-05 1.5E-06 3.6E-07 1.0E-06 5.8E-03 1.0E-03 7.6E-05 1.3E-05 1.2E-02 5.3 5.5E-03 6.8 6.5

8 2.5E-03 1.4E-03 7.6E-04 8.2E-05 7.1E-05 2.6E-06 9.0E-07 1.1E-06 6.1E-03 1.0E-03 9.9E-05 9.7E-06 1.3E-02 6.1 2.1E-02 8.1 7.7

9 2.5E-03 1.4E-03 8.5E-04 1.1E-04 8.9E-05 1.9E-06 7.2E-07 4.0E-07 6.1E-03 1.1E-03 2.0E-04 8.7E-06 1.3E-02 5.9 1.5E-02 8.1 8.3

10 2.4E-03 1.8E-03 8.5E-04 7.6E-05 1.0E-04 4.8E-06 1.3E-06 8.4E-07 6.3E-03 1.0E-03 1.4E-04 6.8E-05 1.3E-02 5.8 2.3E-02 8.0 7.7

11 2.3E-03 8.6E-04 1.2E-03 1.6E-04 1.6E-05 7.4E-07 3.6E-07 1.3E-07 6.1E-03 1.0E-03 1.0E-04 9.7E-07 1.3E-02 5.9 6.5E-03 8.0 8.6

12 2.3E-03 1.4E-03 9.4E-04 8.3E-05 2.5E-05 7.4E-07 3.6E-07 2.3E-07 6.1E-03 1.0E-03 8.6E-05 1.9E-06 1.2E-02 5.8 6.3E-03 7.8 8.0

13 2.2E-03 1.5E-03 9.9E-04 9.2E-05 1.3E-04 1.1E-06 3.6E-07 2.6E-07 6.1E-03 1.0E-03 5.0E-05 2.9E-06 1.2E-02 6.1 1.2E-02 8.2 8.7

14 2.5E-03 1.1E-03 9.3E-04 1.3E-04 2.8E-05 7.4E-07 3.6E-07 4.1E-07 6.1E-03 1.0E-03 4.9E-05 4.5E-06 1.3E-02 6.4 1.3E-02 8.3 8.6

15 2.3E-03 1.6E-03 8.9E-04 6.1E-05 2.8E-05 1.9E-06 7.2E-07 4.1E-07 5.9E-03 1.0E-03 3.5E-05 1.3E-05 1.2E-02 6.2 9.7E-03 8.0 7.9

16 3.0E-03 1.6E-03 5.4E-04 6.2E-05 5.6E-05 1.1E-06 5.4E-07 9.4E-07 6.1E-03 1.0E-03 4.8E-05 1.9E-05 1.3E-02 7.4 1.5E-02 8.9 8.6

17 2.6E-03 1.2E-03 8.1E-04 1.0E-04 3.2E-05 1.9E-06 7.2E-07 2.9E-07 6.1E-03 1.1E-03 3.6E-05 3.6E-06 1.3E-02 6.6 1.2E-02 8.5 8.7

18 2.2E-03 1.3E-03 1.1E-03 1.2E-04 3.4E-05 2.2E-06 7.2E-07 1.7E-07 6.0E-03 1.0E-03 5.5E-05 3.6E-06 1.2E-02 6.3 1.0E-02 8.2 8.8

19 2.6E-03 1.3E-03 8.2E-04 7.3E-05 5.4E-05 1.1E-06 3.6E-07 5.1E-07 6.3E-03 1.0E-03 3.1E-05 5.5E-06 1.3E-02 6.5 9.6E-03 8.1 7.9

20 2.6E-03 1.3E-03 8.6E-04 7.0E-05 4.9E-05 1.1E-06 3.6E-07 2.5E-07 6.3E-03 1.0E-03 3.1E-05 6.8E-06 1.3E-02 6.6 1.2E-02 8.2 9.0


130

21 2.4E-03 1.5E-03 8.9E-04 8.0E-05 1.1E-04 2.6E-06 9.0E-07 1.3E-06 6.1E-03 1.0E-03 4.8E-05 1.1E-05 1.3E-02 6.5 2.2E-02 8.2 7.9

22 2.4E-03 1.6E-03 8.5E-04 6.3E-05 1.3E-04 2.2E-06 9.0E-07 1.3E-06 6.1E-03 1.0E-03 4.5E-05 1.9E-05 1.3E-02 6.6 1.9E-02 8.4 7.7

23 2.7E-03 1.5E-03 6.7E-04 1.1E-04 1.2E-04 2.2E-06 9.0E-07 1.3E-06 5.9E-03 1.0E-03 1.5E-05 2.4E-05 1.3E-02 6.8 2.3E-02 8.4 8.1

24 2.4E-03 1.7E-03 8.9E-04 4.7E-05 6.8E-05 3.0E-06 9.0E-07 1.4E-06 6.1E-03 1.0E-03 4.4E-05 2.2E-05 1.3E-02 6.5 1.7E-02 8.2 7.4

25 2.7E-03 1.6E-03 6.9E-04 8.8E-05 1.1E-04 2.6E-06 9.0E-07 7.8E-07 6.0E-03 1.1E-03 4.2E-05 4.8E-05 1.3E-02 7.0 1.8E-02 8.4 8.5

* Calculated ionic strength


131

Figure A-1. Total Al and Fe concentrations as a function of pH in the solution of 25 soil samples. Fitted lines stand for assumptions made to calculate pCu2+ with WHAM VI (see Material and methods for further details).


132

Table A-2. Simplified composition of soil solutions used to calculate pCu2+ using WHAM VI (see Material and methods for further details).

Ca K Mg Al Fe NO3 SO4

Cu M

pH COD

g C l-1

pCu2+

WHAM 2

1 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 3.4E-05 4.4E-06 6.0E-03 1.0E-03 7.1E-06 4.1 1.4E-02 5.4

2 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.6E-05 1.6E-06 6.0E-03 1.0E-03 1.2E-06 4.5 2.0E-02 6.5

3 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 6.0E-06 1.2E-07 6.0E-03 1.0E-03 2.3E-06 4.7 6.4E-03 6.0

4 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-05 2.1E-06 6.0E-03 1.0E-03 4.9E-06 4.4 2.2E-02 5.7

5 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 6.0E-06 1.2E-07 6.0E-03 1.0E-03 2.7E-06 4.7 9.8E-03 6.0

6 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.6E-05 1.6E-06 6.0E-03 1.0E-03 2.1E-06 4.5 1.4E-02 6.1

7 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 1.0E-06 5.3 5.5E-03 6.5

8 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 1.1E-06 6.1 2.1E-02 7.8

9 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 4.0E-07 5.9 1.5E-02 8.3

10 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 8.4E-07 5.8 2.3E-02 8.0

11 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 1.3E-07 5.9 6.5E-03 8.3

12 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 2.3E-07 5.8 6.3E-03 7.7

13 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 2.6E-07 6.1 1.2E-02 8.5

14 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 4.1E-07 6.4 1.3E-02 8.3

15 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 4.1E-07 6.2 9.7E-03 7.9

16 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 9.4E-07 7.4 1.5E-02 8.6

17 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 2.9E-07 6.6 1.2E-02 8.7

18 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 1.7E-07 6.3 1.0E-02 8.9

19 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 5.1E-07 6.5 9.6E-03 7.8

20 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 2.5E-07 6.6 1.2E-02 8.8

21 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 1.3E-06 6.5 2.2E-02 8.0

22 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 1.3E-06 6.6 1.9E-02 7.8

23 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 1.3E-06 6.8 2.3E-02 8.2

24 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 1.4E-06 6.5 1.7E-02 7.5

25 2.4E-03 1.5E-03 8.8E-04 1.9E-06 6.6E-07 6.0E-03 1.0E-03 7.8E-07 7.0 1.8E-02 8.6


133

I.8. Literature

AFNOR 1999 Recueil de normes françaises. Qualité des sols, Paris. Akagi J, Zsolnay A and Bastida F 2007 Quantity and spectroscopic properties of soil dissolved organic matter

(DOM) as a function of soil sample treatments: Air-drying and pre-incubation. Chemosphere 69, 1040-1046.

Amery F, Degryse F, Degeling W, Smolders E and Merckx R 2007 The copper-mobilizing-potential of dissolved organic matter in soils varies 10-fold depending on soil incubation and extraction procedures. Environ. Sci. Technol. 41, 2277-2281.

Besnard E, Chenu C and Robert M 2001 Influence of organic amendments on copper distribution among particle-size and density fractions in Champagne vineyard soils. Environ. Pollut. 112, 329-337.

Bolan N, Adriano D, Mani S and Khan A 2003 Adsorption, complexation, and phytoavailability of copper as infuenced by organic manure. Environ. Toxicol. Chem. 22, 450-456.

Bravin M N, Michaud A M, Larabi B and Hinsinger P 2008a Rhizotest: a plant-based biotest to account for rhizosphere processes for assessing metal bioavailability. submitted to Environ. Pollut.

Brun L, Maillet J, Hinsinger P and Pépin M 2001 Evaluation of copper availability to plants in copper-contaminated vineyard soils. Environ. Pollut. 111, 293-302.



Chaignon V, Sanchez-Neira I, Herrmann P, Jaillard B and Hinsinger P 2003 Copper bioavailability and extractability as related to chemical properties of contaminated soils from a vine-growing area. Environ. Pollut. 123.

Costigan P A, Rose J A and McBurney T 1982 A microcomputer based method for the rapid and detailed measurement of seedling root systems. Plant Soil 69, 305-309.

Fischer H, Meyer A, Fischer K and Kuzyakov Y 2007 Carbohydrates and amino acid composition of dissolved organic matter leached from soil. Soil Biol. Biochem. 39, 2926-2935.

Haynes R J 1990 Active ion uptake and maintenance of cation-anion balance: A critical examination of their role in regulating rhizosphere pH. Plant Soil 126, 247-264.

Hinsinger P 1998 How do plants to acquire mineral nutrients? Chemical processes involved in the rhizosphere. Advances in Agronomy 64, 225-265.

Hinsinger P and Courchesne F 2008 Biogeochemistry of metals and metalloids at the soil-root interface. In Biophysic-Chemical Processes of Heavy Metals and Metalloids in Soil Environments, Eds A Violante, PM Huang and GM Gadd. pp 267–311. John Wiley & Sons, Hoboken, USA

Hinsinger P, Plassard C, Tang C and Jaillard B 2003 Origins of root-mediated pH changes in the rhizosphere and their responses to environmental constraints: A review. Plant Soil 248, 43-59.



Jordao C P, Fialho L L, Cecon P R, Matos A T, Neves J C L, Mendonça E S and Fontes R L F 2006 Effects of Cu, Ni and Zn on lettuce grown in metal-enriched vermicompost amended soil. Water Air Soil Pollut. 172, 21-38.

Journal Officiel de la République Française 1998 Arrêté du 8 janvier 1998 fixant les prescriptions techniques applicables aux épandages de boues sur les sols agricoles pris en application du décret n° 97-1133 du 8 décembre 1997 relatif à l'épandage des boues issues du traitement des eaux usées. NOR: ATEE9760538A

Khalid M, Soleman N and Jones D L 2007 Grassland plants affect dissolved organic carbon and nitrogen dynamics in soil. Soil Biol. Biochem. 39, 378-381.

Korboulewsky N, Dupouyet S and Bonin G 2002 Environmental risks of applying sewage sludge compost to vineyards: Carbon, heavy metals, nitrogen, and phosphorus accumulation. J. Environ. Qual. 31, 1522-1527.

Kornegay E T, Hedges J D, Martens D C and Kramer C Y 1976 Effect on soil and plant mineral levels following application of manures of different copper contents. Plant Soil 45, 151-162.

Kuzyakov Y 2002 Review: Factors affecting rhizosphere priming effects. Journal of Plant Nutrition and Soil Science 165, 382-396.

Lamy I, Bourgeois S and Bermond A 1993 Soil cadmium mobility as a consequence of sewage sludge disposal. J. Environ. Qual. 22, 731-737.

Lebourg A, Sterckeman T, Ciesielski H and Proix N 1998 Trace metal speciation in three unbuffered salt solutions used to assess their bioavailability in soil. J. Environ. Qual. 27, 584-590.


134

Marschner H 1991 Mechanisms of adaptation of plants to acid soils. Plant Soil 134, 1-20. Marschner H 1995 Mineral nutrition of higher plants. Academic Press, London. 889 p. McBride M B and Blasiak J J 1979 Zinc and copper solubility as a function of pH in an acid soil. Soil Sci. Soc.

Am. J. 43, 866-870. Michaud A M, Bravin M N, Galleguillos M and Hinsinger P 2007 Copper uptake and phytotoxicity as assessed

in situ for durum wheat (Triticum turgidum durum L.) cultivated in Cu-contaminated, former vineyard soils. Plant Soil 298, 99-111.

Mullins G L and Sommers L E 1986 Cadmium and zinc influx characteristics by intact corn (Zea mays L.) seedlings. Plant Soil 96, 153-164.


Parat C, Denaix L, Lévêque J, Chaussod R and Andreux F 2007 The organic carbon derived from sewage sludge as a key parameter determining the fate of trace metals. Chemosphere 69, 636-643.

Planquart P, Bonin G, Prone A and Massiani C 1999 Distribution, movement and plant availability of trace metals in soils amended with sewage sludge composts: application to low metal loadings. Sci. Total Environ. 241, 161-179.

Ramos M C and Martinez-Casasnovas J A 2006 Erosion rates and nutrient losses affected by composted cattle manure application in vineyard soils of NE Spain. Catena 68, 177-185.



Séguin V, Gagnon C, Courchesne F 2004 Changes in water extractable metals, pH and organic carbon concentrations at the soil-root interface of forested soils. Plant Soil 260, 1-17.

Tang C and Yu Q 1999 Impact of chemical composition of legume residues and initial soil pH on pH change of a soil after residue incorporation. Plant Soil 215, 29-38.

Tipping E 1998 Humic ion-binding model VI: An improved description of the interactions of protons and metal ions with humic subtances. Aquat. Geochem. 4, 3-48.

Tyler G and Olsson T 2001 Concentrations of 60 elements in the soil solution as related to the soil acidity. Eur. J. Soil Sci. 52, 151-165.

Walker D J, Clemente R, Roig A and Pilar Bernal M 2003 The effects of soil amendments on heavy metal bioavailability in two contaminated mediterranean soils. Environ. Pollut. 122, 303-312.

Xu R K and Coventry D R 2003 Soil pH changes associated with lupin and wheat plant materials incorporated in a red-brown earth soil. Plant Soil 250, 113-119.

Yan F and Schubert S 2000 Soil pH changes after application of plant shoot materials of faba bean and wheat. Plant Soil 220, 279-287.

Yan F, Schubert S and Mengel K 1996 Soil pH increase due to biological decarboxylation of organic anions. Soil Biol. Biochem. 28, 617-624.

Zhang S, Wang S, Shan X Q and Mu H 2004 Influences of lignin from paper mill sludge on soil properties and metal accumulation in wheat. Biol. Fertil. Soils 40, 237-242.

Zhao L Y L, Schulin R and Nowack B 2007a The effects of plants on the mobilization of Cu and Zn in soil columns. Environ. Sci. Technol. 41, 2770-2775.

Zhao L Y L, Schulin R, Weng L and Nowack B 2007b Coupled mobilization of dissolved organic matter and metals (Cu and Zn) in soil columns. Geochim. Cosmochim. Acta 71, 3407-3418.

Zheljazkov V D and Warman P R 2004 Phytoavailability and fractionation of copper, manganese, and zinc in soil following application of two composts to four crops. Environ. Pollut. 131, 187-195.

Zhou L and Wong J W C 2001 Effect of dissolved organic matter from sludge and sludge compost on soil copper sorption. J. Environ. Qual. 30, 878-883.


135

II. Rhizosphere alkalisation – a major driver of copper bioavailability over a wide range of pH in an acidic, copper-contaminated soil Authors : M. N. Bravin1, A. Lara Martí1,2, M. Clairotte1 and P. Hinsinger1,* Affiliations: 1 INRA, UMR 1222 Biogéochimie du Sol et de la Rhizosphère (INRA-SupAgro), Place Viala, 34060 Montpellier, France 2 Universidad Politécnica de Valencia, Camino de Vera s/n 46022, Valencia, Spain * Corresponding author: [email protected], Tel: +33 4 99 61 22 49, Fax: +33 4 99 61 30 88 Abstract While most risk assessment studies are based on bulk soil chemistry, we hypothesised that root-induced pH changes in the rhizosphere could drastically alter metal bioavailability to plants. This study investigated the occurrence of a large alkalisation in the rhizosphere of durum wheat (Triticum turgidum durum L.) and its impacts on Cu bioavailability to plants initially exposed to a broad range of bulk soil pH (4.8-7.5). For this purpose, an acidic, Cu-contaminated soil was treated with 8 levels of lime and was exposed to plants grown in a root-mat biotest. Plants were supplied either with a NO3

- solution or in the sole case of the control, unlimed soil with a NH4

+-NO3- solution. NO3

--fed plants exhibited a large rhizosphere alkalisation, up to +2.8 pH unit in the most acidic soil, which led to a roughly equivalent pH (6.9-7.6) in the rhizosphere whatever the initial pH of the bulk soil. Conversely, NH4

+-NO3--

fed plants acidified the rhizosphere which reached pH 3.9. Alkalisation induced a dramatic decrease in free Cu2+ concentration in the rhizosphere of NO3

--fed plants (pCu2+ = 8.2-9.5). In comparison, free Cu2+ concentration in the rhizosphere of NH4

+-NO3--fed plants was 3 orders

of magnitude larger as pCu2+ ranged between 5.5 and 5.8. Copper bioavailability was 2.4- to 4.2-fold larger for NH4

+-NO3--fed plants than for NO3

--fed plants which demonstrates the dramatic importance of rhizosphere alkalisation to restrict metal bioavailability to plants in such acidic soils. Copper bioavailability of NO3

--fed plants initially exposed to a broad range of bulk soil pH was also insensitive to bulk soil pH, as rhizosphere pH was ultimately neutral. The relevance of root-induced chemical changes, mostly pH, for assessing metal bioavailability to plants is further discussed. Keywords: Copper, liming, Nitrogen nutrition, pH, Phytoavailability, Rhizosphere.


136

II.1. Introduction

Soil pH is considered as one of the most prominent chemical parameters which controls the behaviour of metals in soil (Carrillo-Gonzalez et al. 2006). Consequently, metal bioavailability to plants is usually considered to be much affected by soil pH and methodologies for risk assessment take into account pH as a major criteria (Lofts et al. 2004; Sauvé et al. 1998; Thakali et al. 2006). Solid-solution partitioning of metals in soil is mainly driven by pH, total metal content and organic carbon content, but soil pH remains the most important driver (Sauvé et al. 2000). It was further found that the desorption and the mobility of zinc (Zn) and cadmium (Cd) in contaminated soils, as measured by the DGT (diffusive gradients in thin films) technique, increased with decreasing pH (Rachou et al. 2004; Zhang et al. 2004). Metal concentration and particularly metal speciation in soil solution were also substantially altered by soil pH (Salam and Helmke 1998; Fernández-Calviño et al. 2008). In the particular case of copper (Cu), total Cu in solution decreases with increasing pH up to pH 5-5.5, then remains fairly steady up to pH 7 and finally tends to increase at higher pH (McBride and Blasiak 1979; Tyler and Olsson 2001). Free ionic Cu2+ in soil solution linearly decreases as pH increases with a slope usually lower than 2 depending on the processes involved and soil properties (Ma et al. 2006). Following the pH dependence of the behaviour of metals in soil, many authors observed that metal uptake in plants is correlated with pH and increased with decreasing pH (Huang and Chen 2003). Zinc content in cress (Lepidium sativum L.) shoots was larger in acidic soils (pH ≈ 5) than in neutral soils (Zhang et al. 2004) while Zn and Cd contents in lettuce (Lactuva sativa L.) shoots increased with decreasing pH in a range of contaminated soils (Cornu and Denaix 2006). Lexmond (1980) also noted a decrease in shoot Cu content of field-grown maize (Zea mays L.) with increasing soil pH, but to a much smaller extent than the decrease in free Cu2+ concentration. This result was explained by an increase in the Cu content in root apoplasm with increasing pH which was attributed to a lower competition with protons (H+) for binding onto roots (Lexmond and van der Vorm 1981; Kinraide et al. 1992; Parker et al. 1998). Thakali et al. (2006) further implemented this theory in the terrestrial biotic ligand model (TBLM) and demonstrated that Cu2+ phytotoxicity, as estimated by a root elongation bioassay with barley (Hordeum vulgare L.), was actually increasing with increasing pH. Zhao et al. (2006) confirmed this result and even found a positive correlation between the Cu content in tomato (Lycopersicum esculentum L.) roots and pH. This last result contradicted most of the previous studies and showed that the relationship between pH and metal bioavailability to plants is not so clearly understood. It is somewhat striking that most of the studies dedicated to the assessment of metal bioavailability to plants tried to link metal content in plants with the chemistry of bulk soil. Indeed, roots are well known to be able to induce dramatic chemical changes in the rhizosphere and, among these, pH changes up to several units (Hinsinger 1998; Hinsinger et al. 2003). Such root-induced pH changes can substantially alter the behaviour of metals in soils (McLaughlin et al. 1998; Huang and Chen 2003; Hinsinger and Courchesne 2008). For instance, Michaud et al. (2007, chapter 2.I) recently noted an alkalisation of up to +1.1 pH unit in the rhizosphere of field-grown durum wheat (Triticum turgidum durum L.) in strongly acidic soils which likely explained that root Cu content was independent of pH from acidic to calcareous soils. However, this was shown on a large set of soils which differed by many other properties than soil pH and it was thus impossible to prove the little effect of pH on Cu bioavailability.


137

In the present study, durum wheat was cropped in an acidic, Cu-contaminated soil of which the pH was varied over a large range of values by liming, in order to demonstrate that rhizosphere alkalisation was responsible for (i) the lower bioavailability of Cu in strongly acidic soils than that predicted according to the chemistry of bulk soil and (ii) the little influence of bulk soil pH on Cu bioavailability to plants. The exposure of plants to Cu was investigated by measuring Cu speciation in the rhizosphere, presumably altered by both root-induced alkalisation and exudation of Cu-chelating compounds. II.2. Material and Methods

II.2.1. Soil properties and pH buffering capacity

The soil was sampled in the topsoil (0-20 cm depth) of a former vineyard of Southern France. Once sampled, it was air-dried and sieved at 2 mm. Soil analyses were performed by a routine soil-testing laboratory (INRA-LAS, France) according to French (AFNOR 1999) and international (ISO 1999) procedures (Table 1). The soil was initially strongly acidic (pHCaCl2 = 4.1) and moderately Cu-contaminated (total Cu = 184 mg kg-1). Table 1. Selected physical and chemical properties of the soil sample

Sanda 578 Silta 176 Claya 246 Corgb

g kg-1

15.5 C/N 12 pHCaCl2 1:5c 4.09 CECd cmol+ kg-1 7.7 Al oxidese 2.7 Fe oxidese

g kg-1

14.2 CaCl2-Cuf 7 EDTA-Cu g 82 Total-Cuh

mg kg-1

184 a according to NF X 31-107 (AFNOR 1999) b according to NF ISO 10694 and 13878 (ISO 1999) c according to NF ISO 10390 (ISO 1999) d according to NF X 31-130 (AFNOR 1999) e according to Mehra-Jackson procedure f according to Lebourg et al. (1998) g according to NF X 31-120 (AFNOR 1999) h according to NF EN ISO 11885 (AFNOR 1999) The soil pH buffering capacity was assessed in order to obtain soil samples covering a wide range of pH values and to compute OH- efflux from plant roots from measured pH changes in the rhizosphere. The soil was incubated for 13 days at 70 % of the water-holding capacity with either NO3

- or NH4+-NO3

- solutions, whose complete compositions are fully detailed below. Various amounts of lime (22.8 mmol OH- g-1 Ca(OH)2) or HCl (1 M, reagent-grade) were added the 13th day to soil samples incubated with NO3

- and NH4+-NO3

- solutions, respectively, to cover a pH range from about 3 to 8. In order to apply the same amount of calcium (Ca) whatever the liming or acidifying treatment, a CaCl2 solution of varying concentration was applied so as to reach an even application rate of Ca of 35.4 µmol g-1 in all soil samples and the water content was consequently raised to 100% of the water-holding capacity. Thereafter, the soil samples were left to equilibrate for another 3 days. Soil solution was extracted (see below for rationale) with the NO3

- solution (soil:solution ratio 1:10 on a


138

dry soil basis) in a end-over-end shaker for 2 h and then centrifuged at 10,000 g for 10 min before filtration (0.45 µm, acetate cellulose filter). Soil solution pH was measured with a combined glass-electrode (6.0234.110, Metrohm). Standard error was lower than 1 % of measured pH. The amount of OH- added was plotted as a function of the measured pH and experimental data were fitted with a 4th-order polynomial regression curve (R² > 0.999, Figure 1).

Figure 1. Titration curve (amount of added OH- versus soil pH) of the studied soil. Soil samples were incubated either with NO3

- (circles) or NH4+-NO3

- (triangles) solution.

II.2.2. Plant growth in the RHIZOtest bioassay

The RHIZOtest bioassay was described in details by Chaignon and Hinsinger (2003) and Bravin et al. (2008, chapter 2.II). In this device plant roots are separated from soil by a 30-µm polyamide mesh to facilitate the collection of roots and rhizosphere. Two durum wheat (cv. Acalou) seeds per pot were germinated in hydroponics in CaCl2 600 µM and H3BO3 2 µM for 1 week, then grown in hydroponics for another 2 weeks in a complete nutrient solution of following composition (µM): Ca(NO3)2 2000, KNO3 2000, MgSO4 1000, KH2PO4 500, NaFe(III)EDTA 100, H3BO3 10, MnCl2 2, ZnSO4 1, CuCl2 1 and Na2MoO4 0.05. The pH was equal to 5.5 and the solution renewed every second day. The growth chamber parameters were set at (day/night): 25/20°C, 75/70% relative humidity and 450 µmol photons m-2 s-1 photon flux density. During plant growth in hydroponics, soil samples were incubated for 13 days either with NO3

- or NH4

+-NO3- solutions at 70 % water-holding capacity. The composition of the NO3

- solution was the same as that described above, minus CuCl2 and NaFe(III)EDTA. In the NH4

+-NO3-

solution, Ca(NO3)2 and KNO3 were replaced by CaCl2 2 mM, KNO3 1 mM, K2SO4 0.5 mM and (NH4)2SO4 2.5 mM. Seven rates of Ca(OH)2 from 184 to 2626 µg g-1 dry soil were applied to soil samples incubated with the NO3

- solution and CaCl2 solution was added to normalise the total Ca input (Table 2). Two additional soil samples were not limed, but incubated either with the NO3

- or NH4+-NO3

- solution, as well as CaCl2 solution to achieve the same Ca input. Once treated with Ca(OH)2 and/or CaCl2, the soil samples were left to equilibrate for another 3 days before starting the soil stage.


139

For the soil stage, three-week-old seedlings with a dense, planar root mat were transferred onto a thin layer of pre-incubated soil (1.5-mm thick, 3 g dry soil) of each treatment. Soil layers were connected to 1-dm3 of either NO3

- or NH4+-NO3

- solution according to that used during the 13-day incubation period. After 8 days of contact, the soil was considered as rhizosphere. The root-induced changes in the rhizosphere were measured relative to control soils which had been incubated in similar devices without plant (thereafter called bulk-soil controls). Devices with and without plants were replicated five times for each treatment. Table 2. Rates of lime (Ca(OH)2) and CaCl2 applied to the soil sample and resulting pH of bulk (unplanted) soils (means ± standard error). Soils were incubated either with NO3

- or NH4+-NO3

- solution. Different letters stand for a significant difference (P < 0.05).

Ca(OH)2 addition CaCl2 addition

Incubation µg g-1 dry soil µmol g-1 dry soil

pH

T0-NH4 NH4+-NO3

- 0 35.4 4.58 ± 0.10 a T0-NO3 0 35.4 4.78 ± 0.09 a T1 184 33.0 5.32 ± 0.30 b T2 323 31.1 5.64 ± 0.17 bc T3 439 29.5 5.87 ± 0.14 c T4 811 24.5 6.42 ± 0.15 d T5 1299 17.9 6.87 ± 0.15 e T6 1904 9.7 6.91 ± 0.08 e T7

NO3-

2626 0.0 7.47 ± 0.09 f

II.2.3. Plant analyses

At harvest, plant shoots and roots were separated. Roots were divided in three sub-samples in order to measure total and symplasmic Cu content as well as root surface area. Shoots and roots used to measure total Cu content were directly oven-dried at 105 °C, while root sub-samples used for symplasmic Cu and surface area measurements were stored at -20 °C before analyses. Five plant devices were harvested after the first 3-week of growth in hydroponics to be used as control plants, for computing growth rates and Cu uptake during the 8-day soil stage. After thawing, for the purpose of surface area measurements, root sub-samples were stained for 5 min with 0.003 M methylene blue (Costigan et al. 1982), then rinsed with tap water. Roots were spread in a Perspex tray containing a thin layer of water (0.5-1 cm) and scanned at a resolution of 600 dpi (dots per inch) using a 2-light sources procedure (Epson expression 10000 XL). The output as greyscale images were analysed with WinRHIZO (version 2005 b, Regent Instruments, Canada) using a method of automatic global threshold. After root surface area measurements, root samples were oven-dried at 105°C for dry biomass determination. Another set of root sub-samples was used to measure symplasmic Cu after the extraction of apoplasmic Cu according to the procedure described by Michaud et al. (2007, chapter 2.I). After thawing, 0.8 g of roots was shaken end-over-end for 5 min with 40 cm3 HCl 10-3 M. After rising up HCl concentration to 10-2 M, roots were shaken for another 3 min. Roots were finally rinsed thrice with ultra-pure water (18.2 MΩ), then oven-dried at 105°C for dry biomass determination. Shoots and roots (for total and symplasmic Cu determination) were ground (MM 2000, Retsch grinder, Germany), then digested for 15 min in a 1000 W microwave oven (Ethos Touch Control, Milestone, Italy) with concentrated HNO3 (65 %) at 180°C and 4 106 Pa.


140

External calibration was performed using copper certified solution 1 g dm-3 (Analytika, Czech Republic). Copper concentration in the digests was measured by flame atomic absorption spectrometry (F-AAS, Varian FS-220, Australia). Blanks and reference materials of maize shoots (Zea mays L., V 463, Bureau InterProfessionnel d’Etudes Analytiques, France) and olive leaves (Olea europaea L., n° 62, Community Bureau of References, Commission of the European Communities) were included during digestions and analyses to check the accuracy of the measurement procedure. Copper bioavailability was deduced from the actual flux of Cu (FCu, ng Cu m-2 root surface area s-1) taken up by the plants during the 8-day period of growth during the soil stage. This Cu flux was calculated for each treatment according to the equation proposed by Mullins and Sommers (1986), accounting for an exponential root growth:

FCu = (m – mC) / (S – SC) * k (1) k = ln(S / SC) / t (2) where mC and m are the mass of Cu (ng) accumulated in the whole plants after 3-week hydroponic pre-culture (control plants) and 8-day exposure to soil, repectively, SC and S, the root surface area (m2) after pre-culture and 8-day exposure to soil, repectively, k, the growth constant (s-1) and, t is the time duration (s) of soil stage (8 days). The net efflux of OH- from plant roots into the soil (FOH, nmol OH- m-2 root surface area s-1) was calculated with the same equations (1) and (2), where m – mC was the amount of OH- added to the soil (expressed in nmoles) which was computed from the pH difference between rhizosphere and corresponding bulk soils and the soil pH buffering capacity (see equation in Figure 1).

II.2.4. Soil solution analyses

After the 8-day soil stage, the soil solution was considered to be in equilibrium with the composition of the NO3

- solution. Consequently, immediately after plant harvest, a solution of identical composition as the NO3

- solution was used to extract the soil solution on fresh soil samples, following the procedure described above for estimating the soil pH buffering capacity. For an easier comparison, the soil samples which had been incubated with NH4

+-NO3

- solution were also extracted with the NO3- solution. Within the day of extraction, free

ionic Cu activity (pCu2+ = -log10Cu2+) was measured in each soil solution with a Cu ion-selective electrode (ISE, DX 264, Mettler Toledo) and a double-junction reference electrode (Inlab, Mettler Toledo). ISE measurements were calibrated as described by Bravin et al. (2008, chapter 2.II) and in the chapter 3. ISE measurements were compared and then corrected with pCu2+ estimated from differential pulse anodic stripping voltammetric (DPASV) measurements as further described in the chapter 5.I. Immediately after pCu2+ determination, the soil solution pH was measured with a combined glass-electrode. The samples were stored at 4°C until total Cu and dissolved organic carbon (DOC) concentrations were measured (within a week) by graphite furnace AAS (Varian Spectra AA-600 GTA-110, Australia) and total organic carbon analyser (TOC-5000, Shimadzu), respectively.

II.2.5. Statistics

Analyses of variance (HSD Tuckey’s test) as well as simple and multi-linear regressions were performed with Statistica (version 6, StatSoft). The level of statistical significance was represented by *, ** and *** for P < 0.05, P < 0.01 and P < 0.001, respectively.


141

II.3. Results

II.3.1. pH and DOC concentrations in bulk and rhizosphere soil solutions

In NO3--fed plants, pH change between rhizosphere and bulk soils was negatively correlated

with bulk soil pH (R² = 0.98*** , Figure 2.a). According to the fitted linear regression, pH change would be nil for a bulk soil pH of 7.3. When bulk soil pH was lower than 7.3, alkalisation occurred in the rhizosphere, reaching up to +2.8 pH units at the most acidic bulk soil pH. Conversely, for bulk soil pH larger than 7.3, a slight acidification up to -0.2 pH unit occurred. In NH4

+-NO3--fed plants, an acidification amounting to -0.7 pH unit occurred

(Figure 2.a). The corresponding efflux of OH- or H+ showed a similar pattern, although not linear anymore (Figure 2.b). In NO3

--fed plants, OH- efflux decreased with increasing bulk soil pH according to a 2nd-order polynomial curve (R² = 0.89*** ) and reached about 0.6 nmol OH- m-2 s-1 (Figure 2.b). In NH4

+-NO3--fed plants, roots released 0.16 to

0.42 nmol H+ m-2 s-1. Consequently, the final pH in the rhizosphere of NO3--fed plants ranged

between 6.9 and 7.6 (and for most samples from 7.3 to 7.5) whatever the initial pH of the bulk soil. In NH4

+-NO3--fed plants, the final pH of the rhizosphere was equal to 3.9 on average.

Figure 2. pH change (a) and plant OH- efflux (b) as a function of bulk soil pH. Plants were supplied either with NO3

- (circles) or NH4+-NO3

- (triangles) solution.

In bulk soils, DOC concentration ranged between 0.9 and 13.5 mg C dm-3 (Figure 3). Concentrations of DOC in bulk soil were not correlated with pH, although DOC concentration was lowest in bulk soils with pH lower than 5, both in NO3

-- and NH4+-NO3

--treated soils. In the rhizosphere, DOC concentration exhibited a larger variability than in bulk soils and ranged between 1.6 and 64 mg C dm-3 (Figure 3). DOC concentration was 3- to 11-fold larger in the rhizosphere than in the corresponding bulk soil (P < 0.05), except for the treatment with a bulk soil pH equal to 6.87 (T5, Table 2) and NH4

+-NO3--fed plants for which the mean

DOC concentration was slightly higher in the rhizosphere than in the bulk soil but not significantly (Figure 3).


142

Figure 3. Dissolved organic carbon (DOC) concentration in bulk and rhizosphere soils as a function of plant N-nutrition and bulk soil pH. Plants were supplied either with NO3

- or NH4+-NO3

- solution. Stars stand for a significant difference between bulk and rhizosphere soil (P < 0.05). Error bars stand for standard error.

II.3.2. Copper concentration and speciation in bulk and rhizosphere soil solutions

In bulk soils treated with the NO3- solution, pH varied from 4.5 and 7.6, according to the rate

of lime addition. The total Cu concentrations in the bulk soils, when expressed as pCu (-log10[Cu]), ranged between 5.5 and 6.5, with the highest values obtained for pH lower than 5 and the lowest values for pH ranging from 5.5 to 7. Total Cu concentration (pCu) was highly correlated with pH of bulk soils according to a 2nd-order polynomial regression curve (R² = 0.97*** , Figure 4.a). Free Cu2+ concentrations were calculated from free Cu2+ activity and the activity coefficient. The latter was calculated with the extended Debye-Hückel equation (Ritsema 1993). Free Cu2+ concentration in the bulk soils, when expressed as pCu2+, ranged between 5.6 and 9.1 and was linearly, positively correlated with pH with a slope of 1.08 (R² > 0.99*** , Figure 4.a). Free Cu2+ as a percentage of total Cu in soil solution varied between 0.1 and 91 % over the whole range of pH and could be fitted as a function of pH with a 3rd-order polynomial regression curve (R² = 0.96*** , n = 85, including all the treatments excepted the soil solutions in the rhizosphere of NH4

+-NO3--fed plants; Figure 4.b). Free Cu2+

was larger than 45 % of total Cu for soil pH lower than 5.1. Alternatively, free Cu2+ was lower than 1 % of total Cu for soil pH higher than 7. In the rhizosphere of NO3

--fed plants, pH ranged from 6.9 to 7.6 due to rhizosphere alkalisation. Total Cu concentration, when expressed as pCu, in the rhizosphere soil solution ranged between 5.6 and 6.7, but did not quite fit to the pCu-pH relationship observed in bulk soil solution (Figure 4.a). Total Cu concentration was positively correlated with the DOC concentration in the rhizosphere (R² = 0.86*** , result not shown, see chapter 5.I). The mean total Cu concentration in soil solution was higher in the rhizosphere than in the bulk soil at the same pH (P < 0.01). Free Cu2+ concentration, when expressed as pCu2+, ranged between 8.2 and 9.5 in the rhizosphere soil solution of NO3

--fed plants and amounted to less than 3 % of total Cu in solution (Figure 4.a and b). Free Cu2+ concentration was mainly, negatively correlated with DOC concentration (R² = 0.61*** ) and poorly but significantly correlated with


143

pH (R² = 0.39*** , results not shown, see chapter 5.I), ultimately yielding the following multi-linear regression: p[Cu2+] = 0.59 (± 0.10) log10[DOC] + 0.7 (± 0.2) pH+3 (± 2) R² = 0.70*** n = 40 (3) The mean free Cu2+ concentration in solution was lower in the rhizosphere than in the bulk soil at the same pH (P < 0.001).

Figure 4. Total Cu concentration (pCu), free Cu2+ concentration (pCu2+) (a) and free Cu2+ as a percentage of total Cu concentration (b) in bulk and rhizosphere soil solutions as a function of soil solution pH. Plants were supplied either with NO3

- or NH4+-NO3

- solution. Circled experimental data (a) stand for pCu and pCu2+ measured in the rhizophere of NH4

+-NO3--fed plants.

In the rhizosphere of NH4

+-NO3--fed plants, soil pH ranged between 3.7 and 4.1. Total Cu

concentrations, when expressed as pCu, ranged between 5.4 and 5.8, but were clearly lower than those predicted (pCupred = 4.7-5.1) using the pCu-pH relationship observed in bulk soil solution (Figure 4.a). Free Cu2+ concentration, when expressed as pCu2+, ranged between 5.5 and 5.8 and amounted to 70-90 % of total Cu concentration (Figure 4.a and b). The mean total Cu concentration and even more so the free Cu2+ concentration in rhizosphere soil solution of NH4

+-NO3--fed plants were larger than those of NO3

--fed plants (P < 0.001).

II.3.3. Plant Growth and Cu uptake

Shoot biomass did not vary significantly with the rate of lime addition in NO3--fed plants

(Figure 5). Although root biomass did not much differ in NO3--fed plants, the root biomass of

NH4+-NO3

--fed plants was 2- to 3-fold lower than that of NO3--fed plants (P < 0.001).

In NO3

--fed plants, Cu bioavailability as assessed by the plant Cu flux ranged between 35 and 118 ng Cu m-2 s-1, with no distinct relationship with lime addition (Figure 6). However, Cu bioavailability in NH4

+-NO3--fed plants (219 ± 27 ng m-2 s-1) was 2.4- to 4.2-fold larger than

in NO3--fed plants, with a significant difference (P < 0.01). Treatment 2 (bulk soil pH = 5.6)

was significantly lower than treatments 0, 3 and 6 (bulk soil pH = 4.8, 5.9 and 6.9), without any relationship with pH, DOC, total Cu or free Cu2+ in soil solution (Figure 6). Shoot Cu content showed only weak variations between treatments and ranged between 5.6-13.4 mg kg-1 in NO3

--fed plants and peaking at 15.6 mg kg-1 in NH4+-NO3

--fed plants


144

(Figure 7). In NO3--fed plants, total root Cu content did not much vary between treatments

with a significant difference between treatments 2 and 3 only (Figure 7). Total root Cu content in NH4

+-NO3--fed plants (125 ± 11 mg kg-1) was 3.6- to 6.9-fold larger than Cu

contents in total roots of NO3--fed plants (28 ± 8 mg kg-1). This was largely due to the Cu

content in root symplasm which was much (8-fold, significantly at P < 0.001) larger in NH4+-

NO3--fed plants (104 ± 15 mg kg-1) than that of NO3

--fed plants (13 ± 3 mg kg-1). Thus, the percentage of apoplasmic Cu in roots was much lower in NH4

+-NO3--fed plants (17 ± 12 %)

than in NO3--fed plants (52 ± 14 %) (P < 0.001).

Figure 5. Shoot (closed columns) and root (open columns) dry biomasses as a function of plant N-nutrition and bulk soil pH. Plants were supplied either with NO3

- or NH4+-NO3

- solution. Different letters for shoots or roots stand for a significant difference (P < 0.001). Error bars stand for standard error. II.4. Discussion

II.4.1. Root-induced pH changes as a function of bulk soil pH

Durum wheat alkalised and acidified its rhizosphere when supplied with NO3- and NH4

+-NO3-

solution, respectively. This pattern was frequently observed for a range of plant species and is attributed to change in cation/anion uptake ratio (Riley and Barber 1971; Haynes 1990; Hinsinger et al. 2003). As nitrogen is usually the major mineral nutrient taken up by most plant species, roots supplied with NO3

- usually counterbalance the excess of negative charges by OH- efflux in the rhizosphere and, conversely, when supplied with NH4

+ roots release H+ in the rhizosphere to counteract the excess of positive charges. However, at the highest bulk soil pH (T7, pH = 7.5), a slight but significant rhizosphere acidification was observed for NO3

-

-fed plants (Figure 2.a). Loosemore et al. (2004) and Chaignon et al. (2008) also noted an acidification in the rhizosphere of NO3

--fed tobacco (Nicotiana tabacum L.) and oilseed rape (Brassica napus L.), respectively, for bulk soil pH larger than 5. In such dicotyledonous species, the reported root-induced acidification might be a response to low Fe and/or P deficiency which become increasingly prominent when soil pH increases (Hinsinger et al. 2003). In our experiment, the bulk soil pH which involved a nil pH change for durum wheat was equal to 7.3 (Figure 2.a). With a similar experimental procedure (growth in RHIZOtest and NO3

--fed plants), Chaignon et al. (2008) found a nil pH change occurring at a bulk soil pH of 4.8 for oilseed rape grown in a different acidic, vineyard topsoil. Such differences could be due to either the plant species or soil. Contrary to dicotyledonous species, graminaceous


145

species such as durum wheat are not expected to acidify their rhizosphere as a response to Fe deficiency (Hinsinger et al. 2003), as may be induced upon high rates of lime addition. The difference could also be due to a specific balance between organic acid production in plant and OH- efflux in the rhizosphere to counteract OH- production during the reduction of NO3

- taken up in plant (Haynes 1990). As already noted by Jarvis and Robson (1983), wheat as a graminaceous species seems to favour OH- efflux in the rhizosphere, leading to a higher rhizosphere alkalisation compared with dicotyledonous species. In our experiment, rhizosphere alkalisation was particularly large in the control (unlimed), acidic soils as pH increased up to +2.8 pH unit and linearly decreased with increasing bulk soil pH (Figure 2.a). This result is consistent with rhizosphere alkalisations ranging from +1 to +2 pH units already reported for a range field-grown plant species, including durum wheat, cropped in strongly acidic soils (Bagayoko et al. 2000; Michaud et al. 2007, chapter 2.I). The physiological mechanisms favouring rhizosphere alkalisation under such conditions are poorly understood yet, although this would appear as a sound strategy to alleviate aluminium (Al) or manganese toxicity. Degenhardt et al. (1998) provided the first evidence of an Al-induced increase in pH at the surface of root tip which was responsible for the Al resistance in the arabidopsis (Arabidopsis thaliana L.) mutant alr-104. It was further found that some Al-tolerant cultivars of bread wheat (Triticum aestivum L.) showed a lower uptake rate of NH4

+ and a higher uptake rate of NO3

- compared with Al-sensitive cultivars (Taylor and Foy 1985). The plasticity in root-induced pH changes as affected by soil pH as described for durum wheat in the present experiment has been reported for a few species such as barley and soybean (Glycine max L.) (Youssef and Chino 1989), oilseed rape (Chaignon et al. 2008) and Medicago murex L. (Cheng et al. 2005), as well as in field grown durum wheat (Michaud et al. 2007, chapter 2.I). Most remarkable is the linear relationship found in this experiment which suggests that durum wheat manages to set its rhizosphere pH at about 7.3, whatever the bulk soil pH, unless NH4

+ is supplied.

Figure 6. Cu bioavailability as estimated by the flux of Cu taken up by the plant as a function of plant N-nutrition and bulk soil pH. Plants were supplied either with NO3

- or NH4+-NO3

- solution. Different letters stand for a significant difference (P < 0.01). Error bars stand for standard error.


146

II.4.2. Root-induced changes in Cu concentration and speciation in soil solution

Rhizosphere alkalisation of NO3--fed durum wheat dramatically altered the speciation of Cu

in soil solution as free Cu2+ concentration decreased by as much as 3 orders of magnitude in the rhizosphere compared with the bulk soil (Figure 4.a). Jarvis and Robson (1983), Bagayoko et al. (2000) and Michaud et al. (2007, chapter 2.I) also noted a large decrease in extractable Al or Cu as a consequence of rhizosphere alkalisation. In comparison with NO3

--fed plants, as a consequence of rhizosphere acidification NH4

+-NO3--fed plants maintained a

high free Cu2+ concentration (pCu2+ = 5.5-5.8) with 70-90 % of total Cu in solution as free Cu2+ (Figure 4.a and b). Nevertheless, total Cu and free Cu2+ concentrations in the rhizosphere of NH4

+-NO3--fed plants were not as high as it would be predicted from bulk soil chemistry.

This observation could be attributed to an enhanced adsorption of Cu by DOC onto soil mineral surfaces, as suggested by McBride (1989). This hypothesis appeared particularly relevant at low pH because the chemical composition of soil solution in the rhizosphere of NH4

+-NO3--fed plants showed both high Cu and low DOC concentrations, i.e. a low DOC/Cu

ratio (Violante et al. 2005).

Figure 7. Copper content in shoots, root symplasm and whole roots (symplasm plus apoplasm) as a function of plant N-nutrition and bulk soil pH. Plants were supplied either with NO3

- or NH4+-NO3

- solution. Different letters for shoots or roots stand for a significant difference (P < 0.01). Error bars stand for standard error.


147

Dissolved organic carbon is also known as a major driver of Cu concentration and speciation in soil solution. In our experiment, DOC is likely responsible for the U-shape of the pCu-pH relationship found in bulk-soil solution (Figure 4.a). Such relationship was already reported by many authors (McBride and Blasiak 1979; Jeffery and Uren 1983; Salam and Helmke 1998; Tyler and Olsson 2001; Impellitteri et al. 2002; Fernández-Calviño et al. 2008). Some of them correlated the increase in Cu concentration at high soil pH with the increase in DOC concentration. In our experiment, DOC concentration in bulk soil-solution remained quite low (< 13.5 mg C dm-3) without any significant relationship with pH (Figure 3). However, solid-solution partitioning of DOC has been reported to be mainly related to soil solution Ca concentration and DOC concentration was found to decrease with increasing Ca concentration (0.1-10 mM), regardless of pH (6-9) (Oste et al. 2002). In our experimental conditions, Ca concentration was rather high (≈ 2 mM) but equivalent over the different treatments, which could explain the fairly steady pattern of DOC concentration. The composition of DOC in soil solution is also affected by increasing pH (Impellitteri et al. 2002). Such qualitative change of DOC, as related to increasing DOC reactivity with increasing pH, could explain why total Cu concentration in bulk soil solution was maintained at pCu around 6.4 for pH higher than 5.5, in spite of the linear decrease in free Cu2+ concentration. Nevertheless, the main impact of DOC was observed in the rhizosphere of NO3

--fed plants (Figure 4.a). DOC concentration almost always increased in the rhizosphere relative to the bulk soil (Figure 3), which is usually attributed to root exudation and microbial activity (Khalid et al. 2007; Hinsinger and Courchesne 2008). The considerable pH increase in the rhizosphere relative to the bulk soil may also have participated to the observed increase in DOC concentration in the rhizosphere. However, this is unlikely as DOC concentration did not increase with increasing pH in the bulk soil and was higher in the rhizosphere than in the bulk soil for NO3

--fed plant inducing a slight acidification of the rhizosphere (T7, Figure 3). Total Cu concentration was positively correlated with DOC concentration in the rhizosphere of NO3

--fed plants. This could explain that Cu concentration was only slightly lower than those in the rhizosphere of NH4

+-NO3--fed

plants despite the large pH discrepancy (Figure 4.a). The enhancement of Cu mobility in soil and total Cu concentration in soil solution by DOC was frequently reported both in the presence and absence of plants (Mench and Martin 1991; Cattani et al. 2006; Zhao et al. 2007; Degryse et al. 2008; Hinsinger and Courchesne 2008). Conversely, free Cu2+ concentration was found to decrease with increasing DOC concentration. The amount of Cu taken up by durum wheat, which was 5 orders of magnitude larger than the initial amount of free Cu2+ in the most alkaline bulk soil solution, could partly explain the decrease in free Cu2+ which was found in the rhizosphere soil solution (Figure 4.a). However, this hypothesis is unlikely as total Cu concentration, i.e. the main pool of Cu which replenished free Cu2+, increased concomitantly. These results therefore suggest that root-induced exudation of Cu-chelating, organic compounds enhanced both the desorption of Cu from the soil solid-phase and the complexation of Cu2+ in soil solution. Salam and Helmke (1998) already noted a decrease in free Cu2+ concentration with increasing DOC concentration in soil solution at pH above 5.5. As it is usually considered that plants take up Cu as free Cu2+ in solution, this would suggest that root exudates would induce a decrease in Cu availability in the rhizosphere relative to the bulk soil. Conversely, organically-bound Cu can participate to Cu availability to plants by replenishing the free Cu2+ pool in solution (Degryse et al. 2006). In our experiment, the increase in total Cu concentration in solution at neutral to alkaline pH where Cu is mainly organically bound (Figure 4.b) thus suggests a higher Cu availability in the rhizosphere than in bulk soil. The actual availability of Cu in the rhizosphere of neutral to alkaline soils where pH change is limited should ultimately depend on the lability of organically-bound Cu.


148

II.4.3. Copper bioavailability as affected by rhizosphere alkalisation

Copper bioavailability to durum wheat, which was estimated as the flux of Cu taken up by the plant, did not much vary with bulk soil pH for NO3

--fed plants (Figure 6). This result is likely related to rhizosphere alkalisation which led to an even rhizosphere pH value of about 7.3 whatever the initial bulk soil pH. Root Cu content of field-grown durum wheat was already shown to be independent of bulk soil pH, and it was hypothesised that this was related to the substantial rhizosphere alkalisation which occurred in the most acidic soils (Michaud et al. 2007, chapter 2.I). Conversely, Cu bioavailability was considerably larger for NH4

+-NO3--fed

plants, exposed to low rhizosphere pH and high free Cu2+ concentration, than for NO3--fed

plants, exposed to rather high rhizosphere pH and low free Cu2+ concentration (Figure 6). The comparison of plant Cu uptake fluxes in NO3

-- and NH4+-NO3

--fed plants grown in the control (unlimed soil) treatment (T0-NO3 and T0-NH4) underlines the dramatic importance of root-induced alkalisation of the rhizosphere in strongly acidic soils, as previously stressed for field-grown plants (Michaud et al. 2007, chapter 2.I), to restrict Cu bioavailability to plants. The difference in free Cu2+ concentration in the rhizosphere between NH4

+-NO3-- and NO3

--fed plants was however much larger than the difference in Cu bioavailability. This result can be partly explained by the lower affinity of root apoplasm for free Cu2+ at low pH due to a higher competition between Cu2+ and H+/Al 3+ for binding onto root cell wall components (Lexmond and van der Vorm 1981; Fortunati et al. 2005; Thakali et al. 2006; Zhao et al. 2006). This explanation is consistent with the much lower proportion of Cu in the root apoplasm found in NH4

+-NO3--fed plants compared with NO3

--fed plants (Figure 7). Chaignon et al. (2002) and Cornu et al. (2007) noted larger root Cu contents in acidic soils than in calcareous soils with equivalent total Cu content for NO3

--fed oilseed rape and tomato which exhibited a moderate rhizosphere alkalisation (+0.2 to +0.7 pH unit) compared with durum wheat in our experiment. Consequently, the extent of rhizosphere alkalisation, which can substantially vary from a plant species to another, is likely to be a major driver of the pH sensitivity of Cu bioavailability to plants as it determine both the pH and the pCu2+ ranges to which plants are exposed in the rhizosphere. This may explain the inconsistent results found in the literature, concluding to an increase, decrease or independence of Cu bioavailability to plants with respect to bulk soil pH. The RHIZOtest is not designed to assess metal phytotoxicity as it is using several-week-old plants with large biomass exposed for only 8 days to contaminated soils (Chaignon and Hinsinger 2003). However, root growth was considerably suppressed in NH4

+-NO3--fed plants

in comparison with NO3--fed plants. This could be the consequence of either the larger

amount of Cu in root symplasm or Al rhizotoxicity as a result of rhizosphere acidification. Alternatively, the large supply of NH4

+ (5 mM) might have also resulted per se in NH4+-

induced phytotoxicity, which is consistent both with the observed chlorosis of shoots and the suppression of root growth in NH4

+-NO3--fed plants (Britto and Kronzucker 2002). As for Al,

Cu firstly and mainly alters root elongation by rigidifying root apoplasm and inducing ruptures in the rhizodermal and root cortical cells (Kopittke et al. 2008). The protective effect of competitive cations, mainly H+ and Al3+, further involves a decrease in Cu phytotoxicity with decreasing pH at a given exposure to free Cu2+ (Thakali et al. 2006; Zhao et al. 2006). This suggests that the potential phytotoxicity of Cu would not be higher in NH4

+-NO3--fed

plants than in NO3--fed plants, as both treatments led to an equivalent Cu content in the root

apoplasm. However, high Cu content in the root symplasm can induce oxidative stress which damage membranes, proteins and nucleic acids (Yruela 2005; Puig et al. 2007). It is therefore difficult to predict the resulting phytotoxicity of Cu in plants exposed to either a large free Cu2+ concentration at low pH or a low free Cu2+ concentration at neutral to alkaline pH. This issue remained worth being addressed.


149

In term of risk assessment of metal bioavailability to plants in contaminated sites, current procedures are usually based on the measurement of metal concentration and speciation in bulk soil. The present study however stressed that root-induced chemical changes in the rhizosphere, such as pH changes or exudation, substantially altered both Cu concentration and speciation in soil solution compared with the bulk soil. In the case of durum wheat, rhizosphere alkalisation was so strong that Cu bioavailability was insensitive to the large range of bulk soil pH (4.8-7.5) to which plants were initially exposed. In contrast, when rhizosphere acidification occurred due to a large supply of NH4

+ to plants, Cu bioavailability greatly increased in the studied, strongly acidic soil despite the lower affinity of root apoplasm to bind Cu at low rhizosphere pH. Consequently, future methods of assessment of metal bioavailability to plants should better consider the particular dynamics of metals in the rhizosphere, as further studied in a companion paper (chapter 5.I), as well as the specific behaviour of different plant species by using biological tools such as the RHIZOtest (Chaignon and Hinsinger 2003; Bravin et al. 2008c), rather than relying only on chemical or physical methods. II.5. Acknowledgements

Edith Le Cadre-Barthélémy is acknowledged for her advices for estimating soil pH buffering capacity. Nicole Balsera, Joëlle Toucet-Louri and Bruno Buatois are also thanked for technical support. Pierre Berthomieu is acknowledged for providing free access to F-AAS. Financial support was provided by the PNETOX programme of the French Ministry of Ecology and Sustainable Development. II.6. Literature

AFNOR 1999 Recueil de normes françaises. Qualité des sols, Paris. Bagayoko M, Alvey S, Neumann G and Buerkert A 2000 Root-induced increases in soil pH and nutrient


Bravin M N, Michaud A M, Larabi B and Hinsinger P 2008 Rhizotest: a plant-based biotest to account for rhizosphere processes for assessing metal bioavailability. submitted to Environ. Pollut.

Britto D T and Kronzucker H J 2002 NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-

584. Carrillo-Gonzalez R, Simunek J, Sauvé S and Adriano D 2006 Mechanisms and pathways of trace element

mobility in soils. Adv. Agron. 91, 111-178. Cattani I, Fragoulis G, Boccelli R and Capri E 2006 Copper bioavailability in the rhizosphere of maize (Zea

mays L.) grown in two Italian soils. Chemosphere 64, 1972-1979. Chaignon V and Hinsinger P 2003 A biotest for evaluating copper bioavailability to plants in a contaminated

soil. J. Environ. Qual. 32, 824-833. Chaignon V, Bedin F and Hinsinger P 2002 Copper bioavailability and rhizosphere pH changes as affected by

nitrogen supply for tomato and oil seed rape cropped on an acidic and a calcareous soil. Plant Soil 243, 219-228.

Chaignon V, Quesnoit M and Hinsinger P 2008 Rhizosphere pH, bioavailability and extractability of Cu in an acidic Cu-contaminated soil as affected by liming. Environ. Pollut. submitted

Cheng Y, Howieson JG, O’Hara GW, Watkin ELJ, Souche G, Jaillard B and Hinsinger P 2004 Proton release by roots of Medicago murex and Medicago sativa growing in acidic conditions, and implications for rhizosphere pH changes and nodulation at low pH. Soil. Biol. Biochem. 36, 1357-1365.

Cornu J Y and Denaix L 2006 Prediction of zinc and cadmium phytoavailability within a contaminated agricultural site using DGT. Environ. Chem. 3, 61-64.


Costigan P A, Rose J A and McBurney T 1982 A microcomputer based method for the rapid and detailed measurement of seedling root systems. Plant Soil 69, 305-309.


150

Degenhardt J, Larsen P B, Howell S H and Kochian L V 1998 Aluminium resistance in the Arabidopsis mutant alr-104 is caused by an aluminium-induced increase in rhizosphere pH. Plant Physiol. 117, 19-27.

Degryse F, Smolders E and Parker D R 2006 Metal complexes increase uptake of Zn and Cu by plants: implications for uptake and deficiency studies in chelator-buffered solutions. Plant Soil 289, 171-185.

Degryse F, Verma V K and Smolders E 2008 Mobilization of Cu and Zn by root exudates of dicotyledonous plants in resin-buffered solutions and in soil. Plant Soil 306, 69-84.

Fernández-Calviño D, Pateiro-Moure M, López-Periago E, Arias-Estévez M and Nóvoa-Muñoz JC 2008 Copper distribution and acid-base mobilization in vineyard soils and sediments from Galicia (NW Spain). Eur. J. Soil. Sci. 59, 315-326.

Fortunati P, Lombi E, Hamon R E, Nolan A L and McLaughlin M J 2005 Effect of toxic cations on copper rhizotoxicity in wheat seedlings. Environ. Toxicol. Chem. 24, 372-378.

Haynes R J 1990 Active ion uptake and maintenance of cation-anion balance: A critical examination of their role in regulating rhizosphere pH. Plant Soil 126, 247-264.

Hinsinger P 1998 How do plants to acquire mineral nutrients? Chemical processes involved in the rhizosphere. Adv. Agron. 64, 225-265.

Hinsinger P and Courchesne F 2008 Biogeochemistry of metals and metalloids at the soil-root interface. In Biophysic-Chemical Processes of Heavy Metals and Metalloids in Soil Environments, Eds A Violante, P M Huang and G M Gadd. pp 267-311. John Wiley & Sons, Hoboken, USA.


Huang J W and Chen J 2003 Role of pH in phytoremediation of contaminated soils. In Handbook of soil acidity, Ed Z Rengel. pp 449-472. Marcel Dekker, New York.

Impellitteri C A, Lu Y, Saxe J K, Allen H E and Peijnenburg W J G M 2002 Correlation of the partitionning of dissolved organic matter fractions with the desorption of Cd, Cu, Ni, Pb and Zn from18 Dutch soils. Environ. Int. 28, 401-410.


Jarvis S C and Robson A D 1983 The effects of nitrogen nutrition of plants on the development of acidity in western Australian soils. II. Effects of differences in cation/anion balance between plant species grown under non-leaching conditions. Aust. J. Agric. Res. 34, 355-365.

Jeffery J J and Uren N C 1983 Copper and zinc species in the soil solution and the effects of soil pH. Aust. J. Soil Res. 21, 479-488.


Kinraide T B, Ryan P R and Kochian L V 1992 Interactive effects of Al3+, H+, and other cations on root elongation considered in terms of cell-surface electrical potential. Plant Physiol. 99, 1461-1468.

Kopittke P M, Blamey F P C and Menzies N W 2008 Toxicities of soluble Al, Cu, and La include ruptures to rhizodermal and root cortical cells of cowpea. Plant Soil 303, 217-227.

Lebourg A, Sterckmann T, Ciesielski H and Proix N 1998 Trace metal speciation in three unbuffered salt solutions used to assess their bioavailability. J. Environ. Qual. 27, 584-590.

Lexmond T M 1980 The effect of soil pH on copper toxicity to forage maize grown under field conditions. Neth. J. Agric. Sci. 28, 164-183.

Lexmond T M and van der Vorm P D J 1981 The effect of pH on copper toxicity to hydroponically grown maize. Neth. J. Agric. Sci. 29, 217-238.

Lofts S, Spurgeon D J, Svendsen C and Tipping E 2004 Deriving soil critical limits for Cu, Zn, Cd and Pb: A method based on free ion concentrations. Environ. Sci. Technol. 38, 3623-3631.

Loosemore N, Straczek A, Hinsinger P and Jaillard B 2004 Zinc mobilisation from a contaminated soil by three genotypes of tobacco as affected by soil and rhizosphere pH. Plant Soil 260, 19-32.

Ma Y B, Lombi E, Oliver I W, Nolan A L and McLaughlin M J 2006 Long-term aging of copper added to soils. Environ. Sci. Technol. 40, 6310-6317.

McBride M B 1989 Reactions controlling heavy metals solubility in soils. Adv. Soil Sci. 10, 1-56. McBride M B and Blasiak J J 1979 Zinc and copper solubility as a function of pH in an acid soil. Soil Sci. Soc.

Am. J. 43, 866-870. McLaughlin M J, Smolders E and Merckx R 1998 Soil-root interface: Physicochemical processes. In Soil

Chemistry and Ecosystem Health, Eds P M Huang, D C Adriano, T J Logan and R T Checkai. pp 233-277. Soil Science Society of America, Madison, Wisconsin, USA.

Mench M and Martin E 1991 Mobilization of cadmium and other metals from two soils by root exudates of Zea mays L., Nicotiona tabacum L. and Nicotiana rustica L. Plant Soil 132, 187-196.


151


Mullins G L and Sommers L E 1986 Cadmium and zinc influx characteristics by intact corn (Zea mays L.) seedlings. Plant Soil 96, 153-164.

Oste L A, Temminghoff E J M and Van Riemsdijk W H 2002 Solid-solution partitioning of organic matter in soils as influenced by an increase in pH and Ca concentration. Environ. Sci. Technol. 36, 208-214.

Parker D R, Pedler J F, Thomason D N and Li H 1998 Alleviation of copper rhizotoxicity by calcium and magnesium at defined free metal-ion activities. Soil Sci. Soc. Am. J. 62, 965-972.

Puig S, Andres-Colas N, Garcia-Molina A and Penarrubia L 2007 Copper and iron homeostasis in Arabidopsis: response to metal deficiencies, interactions and biotechnological applications. Plant Cell Environ. 30, 271-290.


Riley D and Barber S A 1971 Effect of ammonium and nitrate fertilization on phosphorus uptake as related to root-induced pH changes at the root-soil interface. Soil Sci. Soc. Am. Proc. 35, 301-306.

Ritsema C J 1993 Estimation of activity coefficients of individual ions in solutions with ionic strengths up to 0.3 mol dm-3. J. Soil Sci. 44, 307-315.


Sauvé S, Dumestre A, McBride M and Hendershot W 1998 Derivation of soil quality criteria using predicted chemical speciation of Pb2+ and Cu2+. Environ. Toxicol. Chem. 17, 1481-1489.

Sauvé S, Hendershot W and Allen H E 2000 Solid-solution partitioning of metals in contaminated soils: Dependence on pH, total metal burden, and organic matter. Environ. Sci. Technol. 34, 1125-1131.

Taylor G J and Foy C D 1985 Mechanisms of aluminium tolerance in Triticum aestivum (wheat). IV. The role of ammonium and nitrate nutrition. Can. J. Bot. 63, 2181-2186.


Tyler G and Olsson T 2001 Concentrations of 60 elements in the soil solution as related to the soil acidity. Eur. J. Soil Sci. 52, 151-165.

Violante A, Ricciardella M, Pigna M and Capasso R 2005 Effects of organic ligands on the adsorption of trace elements onto metal oxides and organo-mineral complexes. In Biogeochemistry of trace elements in the rhizosphere, Eds P M Huang and G R Gobran. pp 157-182. Elsevier, Amsterdam.

Youssef RA and Chino M (1989) Root-induced changes in the rhizosphere of plants. I. pH changes in relation to bulk soil. Soil Sci. Plant Nutr. 35, 461-468. Yruela I 2005 Copper in plants. Braz. J. Plant Physiol. 17, 145-156. Zhang H, Lombi E, Smolders E and McGrath S 2004 Kinetics of Zn release in soils and prediction of Zn

concentration in plants using diffusive gradients in thin. Environ. Sci. Technol. 38, 3608-3613. Zhao F J, Rooney C P, Zhang H and McGrath S P 2006 Comparison of soil solution speciation and diffusive

gradients in thin-films measurement as an indicator of copper bioavailability to plants. Environ. Toxicol. Chem. 25, 733-742.

Zhao L Y L, Schulin R and Nowack B 2007 The effects of plants on the mobilization of Cu and Zn in soil columns. Environ. Sci. Technol. 41, 2770-2775.

Chapitre 5. Disponibilité Cu dans la Rhizosphère

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CHAPITRE 5 Disponibilité du cuivre dans la rhizosphère

– Rôle majeur du pH et des matières organiques dissoutes – Dans le chapitre précédent, les résultats obtenus ont permis de montrer que l’alcalinisation et l’augmentation de la concentration en MOD induite par les racines dans la rhizosphère contrôlent la biodisponibilité de Cu pour le blé dur en modifiant fortement la disponibilité de Cu dans la rhizosphère. L’objectif global de ce dernier chapitre sera donc de mieux caractériser la disponibilité de Cu dans la rhizosphère en couplant différentes techniques analytiques ainsi qu’en utilisant la modélisation géochimique. Plus particulièrement, j’ai montré que l’augmentation de la concentration en MOD dans la rhizosphère a eu pour double conséquence d’augmenter la concentration totale en Cu dans la solution du sol, mais aussi de diminuer l’activité de Cu2+ libre. Ce résultat suggère donc que la disponibilité de Cu dans la rhizosphère serait dépendante de la labilité des complexes Cu-MOD. Degryse et al. (2008) et Dessureault-Rompré et al. (2008) ont récemment montré que la labilité des complexes organiques des métaux était vraisemblablement modifiée à l’interface sol-plante, provoquant ainsi un changement dans la biodisponibilité des métaux pour les plantes. Le premier objectif sera donc d’évaluer la labilité des complexes organiques solubles de Cu dans la rhizosphère et le bulk soil, en lien avec les variations de pH dans la solution du sol. D’autre part, l’alcalinisation de la rhizosphère a induit une diminution drastique de la biodisponibilité de Cu pour le blé dur, en réduisant notamment de plusieurs ordres de grandeur l’activité de Cu2+ libre dans la solution du sol. Cependant, cette diminution de la disponibilité de Cu dans la rhizosphère pourrait également être interprétée comme une limitation du flux de réapprovisionnement de Cu en solution par le sol, sous l’effet du prélèvement racinaire de Cu (Zhang et al. 2001, 2004 ; Zhao et al. 2006). Le second objectif sera donc de déterminer la part du gradient d’appauvrissement de Cu en solution dans les sols très acides due à l’alcalinisation de la rhizosphère, de celle due à un réapprovisionnement limitant de Cu en solution par le sol. Le premier article, intitulé : « Copper speciation and lability in durum wheat rhizosphere as affected by dissolved organic matter and root-induced alkalisation », aborde la disponibilité de Cu dans la rhizosphère du blé dur à travers diverses approches d’évaluation de la spéciation : mesure avec une électrode sélective et modélisation géochimique de l’activité de Cu2+ en solution, labilité de Cu en solution par DPASV (Differential Pulse Anodic Stripping Voltammetry) et en phase solide par mesure en DGT (Diffusive Gradients in Thin films). Cet article a été rédigé pour être soumis à la revue Geochimica et Cosmochimica Acta. Le deuxième article, intitulé : « Root-induced alkalisation of an acidic, copper-contaminated soil controls copper depletion in durum wheat rhizosphere », concerne la mise en évidence de gradients d’appauvrissement de Cu2+ libre et Cu total en solution ainsi que de flux de Cu mesuré en DGT. Le mise en place du gradient de concentration de Cu total en solution a également été simulée à l’aide du modèle DIFS (DGT Induced Flux in Soils and sediments), permettant d’évaluer le rôle du prélèvement racinaire dans la formation du gradient. Cet article a été rédigé pour être soumis à la revue Environmental Science & Technology.


153

Bibliographie Degryse F, Verma V K and Smolders E 2008 Mobilization of Cu and Zn by root exudates of dicotyledonous

plants in resin-buffered solutions and in soil. Plant and Soil 306, 69-84. Dessureault-Rompré J, Nowack B, Schulin R, Tercier-Waeber M L and Luster J 2008 Mobilization and

complexation of Zn and Cd in the rhizosphere of Thlaspi caerulescens. In Eurosoil 2008 - Book of abstracts, Eds W H Blum, G M H. and M Vodrazka. pp 131-132, Vienna.

Zhang H, Lombi E, Smolders E and McGrath S 2004 Kinetics of Zn release in soils and prediction of Zn concentration in plants using diffusive gradients in thin. Environmental Science & Technology 38, 3608-3613.

Zhang H, Zhao F J, Sun B, Davison W and McGrath S P 2001 A new method to measure effective soil solution concentration predicts copper availability to plants. Environmental Science & Technology 35, 2602-2607.



154

I. Copper speciation and lability in durum wheat rhizosphere as affected by dissolved organic matter and root-induced alkalisation Authors : M. N. Bravin1, C. Garnier2, V. Lenoble3, Y. Dudal1, F. Gérard1 and P. Hinsinger1,* Affiliations: 1 INRA, UMR 1222 Biogéochimie du Sol et de la Rhizosphère (INRA-SupAgro), Place Viala, 34060 Montpellier, France 2 Groupe de Physico Toxico Chimie des Systèmes Naturels, Institut des Sciences Moléculaires (ISM-UMR CNRS 5255), Université Bordeaux I, 33405 Talence, France 3 Laboratoire PROTEE, Université du Sud Toulon-Var, BP 132, 83957 La Garde, France * Corresponding author: [email protected], Tel: +33 4 99 61 22 49, Fax: +33 4 99 61 30 88 Abstract The change of metal availability in the rhizosphere due to root-induced chemical changes is poorly accounted for despite its relevance for assessing metal bioavailability to plants. The present study investigated the differences in copper (Cu) availability between bulk soil and the rhizosphere of durum wheat (Triticum turgidum durum L.) exposed to a Cu-contaminated soil over a wide range of pH as a result of lime addition. Copper speciation in the soil solution was measured with an ion-selective electrode and modelled using the Windermere Humic Aqueous Model version VI (WHAM VI). Copper lability was also measured in soil solution by Differential Pulse Anodic Stripping Voltammetry (DPASV) and in soils by the Diffusive Gradients in Thin Films (DGT) technique. Rhizosphere alkalisation decreased free Cu2+ concentration by three orders of magnitude and Cu lability in soil solution by a factor of 6 in the most acidic soil (pH ≈ 4.8). Due to root-induced alkalisation, rhizosphere pH was about 7.3 whatever the initial bulk soil pH. Dissolved organic matter (DOM) thus became the key parameter driving Cu availability in the rhizosphere. The increase in DOM concentration in the rhizosphere mobilised Cu sorbed onto the soil solid-phase and increased the binding of free Cu2+ in the soil solution, resulting in an increase in total Cu concentration in the rhizosphere soil solution. The modelling of free Cu2+ in the soil solution showed that the affinity of DOM for Cu likely decreased in the rhizosphere since the percentage of active fulvic acid used to fit measurements was reduced from 64 % in the bulk soils to 37 % in the rhizosphere. Copper lability became larger in the rhizosphere than in the corresponding bulk soil at bulk soil pH higher than about 5.5. This was mainly attributed to the larger lability of organic Cu complexes in the rhizosphere than in the bulk soil. These results therefore underlined the dramatic effect of such root-induced chemical changes on Cu availability in the rhizosphere and thereby on Cu bioavailability to plants. Keywords: Copper, Dissolved organic matter (DOM), DGT, Lability, pH, Rhizosphere, Speciation, Voltammetry.


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I.1. Introduction

The first step for the evaluation of metal bioavailability to plants, which is best defined as the flux of metal to the roots, is usually to determine metal availability in soils (Peijnenburg et al. 1997; ISO 2006). Metal availability depends on those physico-chemical processes that control metal speciation in soils (Peijnenburg and Jager 2003). Metals can interact with a wide range of sorbents in the soil solid-phase such as organic matter, clays and oxides as well as with components of the soil solution such as the dissolved organic matter (DOM) and inorganic ligands (Allen 1993; Weng et al. 2002). Metals are particularly well buffered by soil solid-phase and therefore exhibit rather low soil solution concentration (Sauvé et al. 2000a; Carrillo-Gonzalez et al. 2006). Solid-solution partitioning of metal and free metal activity in soil solution are mainly controlled by soil pH as well as DOM binding properties and concentration (Vulkan et al. 2000; Weng et al. 2002). Among metals, copper (Cu) exhibits a considerable affinity for DOM. In the soil solution, total Cu concentration is positively correlated with DOM concentration (Zhou and Wong 2001; Zhao et al. 2007b), while free Cu2+ concentration was shown to decrease as DOM concentration increased when pH was higher than 5.5 (Salam and Helmke 1998). Although plants presumably absorb metal in soil solution as free metal ion species, the amount of free metal ion at the root surface is several orders of magnitude lower than the amount taken up by plants which involves a re-supply of free metal ion from labile pools (Sauvé et al. 1996; Zhang et al. 2001). This underlines the need to account for the kinetic dimension of metal speciation, i.e. “dynamic speciation”, for assessing metal bioavailability to plants (van Leeuwen et al. 2005). The lability of metals in soil therefore plays a critical role in metal availability. Metal lability is usually defined as the ability of organic and inorganic metal complexes in solution to dissociate when free metal ion activity is decreased due to a sink effect (Jeffery and Uren 1983; van Leeuwen et al. 2005). To our knowledge, very few studies addressed metal lability in soil solution, and even less so in the rhizosphere. Sauvé et al. (2000b) used the technique of Differential Pulse Anodic Stripping Voltammetry (DPASV) to determine cadmium (Cd) speciation in the soil solution. Combining DPASV and binding resin measurements, Jeffery and Uren (1983) noted that zinc (Zn) concentration and lability were directly related to soil solution pH, whereas Cu concentration and lability were strongly altered by both pH and DOM concentration. The concept of lability was extrapolated to describe the pool of metals in the soil solid-phase, and a range of techniques have been developped to estimate soil metal lability (Zhang et al. 2001; Bermond et al. 2005; Oliver et al. 2006). In the recent years, the technique of the Diffusive Gradients in Thin films (DGT) was successfully applied to correlate Cu lability in soil with Cu contents in a range of plant species, mostly hyperaccumulator and tolerant plant species (Zhang et al. 2001; Song et al. 2004; Zhao et al. 2006). While most studies dealing with metal bioavailability to plants was focused on metal availability in the bulk soil, increasing evidences suggest that metal availability is considerably altered in the volume of soil that is influenced by root activity, i.e. the rhizosphere. The concentration and the speciation of Zn and Cd in soil solution appeared sensitive to root-induced changes in pH and DOM concentration (Hamon et al. 1995). Cattani et al. (2006) and Degryse et al. (2008) showed that the lability of Cu and Zn was altered by both DOM concentration and composition in the rhizosphere. More recently, Michaud et al. (2007, chapter 2.I) observed a decrease in CaCl2-extractable Cu in the rhizosphere of field-grown durum wheat, which was attributed to root-induced alkalisation. However, our understanding of the influence of root-induced chemical changes on metal availability in the rhizosphere remains fragmented.


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In a companion paper, we showed (Bravin et al. 2008a, chapter 4.II) that roots induced a drastic increase in pH and DOM concentration in the rhizosphere of durum wheat exposed to a Cu-contaminated soil over a wide range of pH. The present study investigated how such chemical changes altered Cu availability in the rhizosphere relative to the bulk soil by applying a range of techniques. Free Cu2+ activity in soil solution collected from the rhizosphere and bulk soils was measured by an ion-selective electrode (ISE) and modelled using the Windermere Humic Aqueous Model VI (WHAM VI). Dynamic speciation was addressed by using DPASV measurements on the soil solution and DGT measurements on soils collected from both the rhizosphere and bulk soils. I.2. Material and Methods

In our companion paper (Bravin et al. 2008a, chapter 4.II), both acidification and alkalisation in the rhizosphere were observed as related to the form of nitrogen supplied. However, in the present study, we focused on rhizosphere alkalisation and DOM changes in alkalised rhizosphere.

I.2.1. Soil properties and lime addition

The selected soil was sampled in the topsoil (0-20 cm) of a former vineyard of Southern France which received numerous applications of Cu-based fungicides for decades. Once sampled, the soil was air-dried, sieved at 2 mm and then analysed by a routine soil-testing laboratory (INRA-LAS, France) according to French (AFNOR 1999) and international (ISO 1999) procedures. The soil was strongly acidic (pHCaCl2 = 4.1) and moderately Cu-contaminated (total Cu = 184 mg kg-1). Additional soil properties can be found in Bravin et al. (2008a, chapter 4.II). Table 1. pH and dissolved organic carbon (DOC) concentration in the large set of rhizosphere and bulk soils (n = 80) for the different rates of lime addition. Stars stand for a significant difference in pH (P < 0.01) and DOC concentration (P < 0.05) between the rhizosphere and bulk soils for a given treatment.

Ca(OH)2 addition pH DOC µg g-1 dry soil mg C dm-3 Bulk soil Rhizosphere Bulk soil Rhizosphere T0 0 4.8 ± 0.1 7.5 ± 0.1 * 3.1 ± 0.8 35 ± 16 * T1 184 5.3 ± 0.3 7.4 ± 0.1 * 7 ± 2 26 ± 14 * T2 323 5.6 ± 0.2 7.3 ± 0.1 * 5 ± 1 41 ± 12 * T3 439 5.9 ± 0.1 7.4 ± 0.1 * 3.8 ± 0.6 42 ± 17 * T4 811 6.4 ± 0.2 7.3 ± 0.2 * 5 ± 2 25 ± 17 * T5 1299 6.9 ± 0.2 7.3 ± 0.1 * 8 ± 3 11 ± 5 T6 1904 6.9 ± 0.1 7.3 ± 0.2 * 4.2 ± 0.7 27 ± 12 * T7 2626 7.5 ± 0.1 7.3 ± 0.1 5 ± 2 18 ± 7 * The soil was amended with different rates of lime in order to obtain a wide range of bulk soil pH values (Table 1). Prior to liming, soil samples were incubated for 13 days with a nutrient solution (see below for the complete composition) at 70 % water-holding capacity (20 % water content). By then, eight rates of Ca(OH)2 from 0 to 2626 µg g-1 dry soil were applied to the incubated soil samples (Bravin et al. 2008a, chapter 4.II). In order to apply the same amount of calcium (Ca) whatever the liming treatment, a CaCl2 solution of varying concentration was used so as to reach an even application rate of Ca of 35.4 µmol g-1 in all


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soil samples. The water content was consequently raised to 100% water-holding capacity. Once treated with Ca(OH)2 and/or CaCl2, the soil samples were further incubated for another 3 days in order to equilibrate before starting the soil stage.

I.2.2. Plant growth in RHIZOtest for sampling rhizosphere and bulk soils

Plants were grown in a RHIZOtest bioassay device which separates plant roots from soil by a 30-µm polyamide mesh to facilitate the collection of roots and rhizosphere. The RHIZOtest bioassay procedure was described in details by Chaignon and Hinsinger (2003) and Bravin et al. (2008b, chapter 2.II). Briefly, two seeds of durum wheat (Triticum turgidum durum L. cv Acalou) per pot were germinated in CaCl2 600 µM and H3BO3 2 µM for 1 week, then grown in hydroponics for another 2 weeks in a complete nutrient solution of following composition (µM): Ca(NO3)2 2000, KNO3 2000, MgSO4 1000, KH2PO4 500, NaFe(III)EDTA 100, H3BO3 10, MnCl2 2, ZnSO4 1, CuCl2 1 and Na2MoO4 0.05. The growth chamber parameters were set at (day/night): 25/20°C, 75/70% relative humidity and 450 µmol photons m-2 s-1 photon flux density. For the soil stage, three-week-old seedlings with a dense, planar root mat were transferred onto a thin layer of pre-incubated soil (1.5-mm thick, 3 g dry soil) of each liming treatment. Soil layers were connected to 1-dm3 of nutrient solution with a filter paper wick. The composition of this nutrient solution, also used for pre-incubating the soils, was the same as that described above, minus CuCl2 and NaFe(III)EDTA, which may have drastically altered the concentration and speciation of soil solution Cu. After 8 days of contact, the soil was considered as rhizosphere. The root-induced chemical changes in the rhizosphere were measured relative to control soils which had been incubated in similar devices without plant (thereafter called bulk soils). Devices with and without plants were replicated five times for each liming treatment.

I.2.3. Soil solution extraction and analyses

After the 8-day soil stage, the soil solution was considered to be in equilibrium with the composition of the nutrient solution. Consequently, immediately after plant harvest, a solution of identical composition as the nutrient solution was used to extract the soil solution on fresh soil samples of each replicate (thereafter called the “large set”, n = 80) as follows: 15 cm3 of the nutrient solution were added to 1.92 g fresh soil (to yield a soil:solution ratio of 1:10 on a dry soil mass basis) in an end-over-end shaker for 2 h, and then centrifuged at 10,000 g for 10 min before filtration (0.45 µm, acetate cellulose filter). The remaining soil of the five replicates of each treatment for bulk and rhizosphere soils was then bulked, mixed homogeneously to obtain a composite sample per treatment (thereafter called the “small set of composite samples”, n = 16). The bulking of the samples was necessary to obtain enough soil and soil solution for subsequent Cu lability measurements, by DGT and DPASV respectively. Soil solution was extracted on the small set of composite samples by mixing 3.84 g fresh soil with 30 cm3 of the nutrient solution as described above. Within the day of extraction, free ionic Cu activity (pCu2+ = -log10Cu2+) was measured in each soil solution with a Cu ISE (DX 264, Mettler Toledo, USA) and a double-junction reference electrode (Inlab, Mettler Toledo). ISE measurements were calibrated as described by Rachou et al. (2007) and Bravin et al. (2008d, chapter 2.II). Free Cu2+ concentration was


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calculated from pCu2+ and the activity coefficient. The latter was calculated with the extended Debye-Hückel equation (Ritsema 1993). Immediately after pCu2+ determination, the soil solution pH was measured with a combined glass-electrode (6.0234.110, Metrohm, Switzerland). Sodium azide (NaN3) 10-4 M was added to the samples of the small set of composite samples to stop the microbial activity and the samples of both the small and the large sets were stored at 4°C. Total Cu and dissolved organic carbon (DOC) concentrations were measured (within a week) by graphite furnace atomic absorption spectrometry (GF-AAS, Varian Spectra AA-600 GTA-110, USA) and total organic carbon analyser (TOC-5000, Shimadzu, Japan), respectively. Free Cu2+ concentrations appeared slightly larger than total Cu concentrations at low soil pH (pH < 5, results not shown). ISE measurements on the small set of composite samples plus four additional samples (n = 20) were compared with pCu2+ estimated by DPASV as described below. The four additional soil samples stand for the rhizosphere and bulk soils in which root-induced acidification occurred as shown in our companion paper (Bravin et al. 2008a, chapter 4.II). The linear regression between the two methods exhibited a slope of 1 and a small deviation in the ordinate intercept point (Figure 1). ISE measurements were therefore corrected according to the equation shown in Figure 1.

Figure 1. Comparison between free Cu2+ activity as calculated from DPASV measurements (pCu2+ DPASV) and measured with an ion-selective electrode (pCu2+ ISE). Solid line stands for the regression line. Dashed line stands for the 95 % confidence interval. The equation was that used to correct ISE measurements in all the other illustrations.

I.2.4. Modelled free Cu2+ activity with WHAM VI

Free Cu2+ activity was also determined by speciation modelling with the WHAM VI numerical code (Tipping 1998). The main input parameters were total Cu concentration, pH and DOC concentration measured in each solution of rhizosphere and bulk soils (n = 80, see above). Dissolved organic matter (DOM), derived from DOC measurements assuming that it contained 50% C, was considered to be only represented by a fulvic acid. The percentage of fulvic acid reacting with protons and metals for binding was adjusted to fit ISE measurements of free Cu2+ activity. The total concentrations of major cations and anions in soil solution were fixed, according to a preliminary experiment (chapter 4.I), as follows (mM): Ca 2.4, K 1.5, Mg 0.88, NO3 6 and SO4 1. The total concentrations of aluminium (Al) and iron (Fe) in


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soil solution were fixed as a function of pH (chapter 4.I). Partial pressure of CO2 was assumed to be that of the ambient atmosphere.

I.2.5. Labile Cu in soil solution as measured by DPASV

Voltammetric measurement was performed on the soil solutions extracted from the small set of composite samples to assess the lability of Cu and especially that of organically bound-Cu in the soil solution. All voltammetric measurements were performed using a µAutolab potentiostat (EcoChemie, The Netherlands) equipped with a Metrohm 663 VA stand (Metrohm, Switzerland). The instrument was controlled using GPES 4.9 software. The working electrode was a static mercury drop electrode (0.25 mm2), the counter electrode was a glassy carbon rod and the reference electrode was Ag/AgCl (with saturated NaCl). The soil solutions were stirred with a built-in Teflon stirrer rotating at 3000 rpm and purged with oxygen-free nitrogen for at least 5 min prior to measurements, followed by maintaining a nitrogen blanket above the electrolyte surface during the measurement. Pseudopolarographic measurements were initially performed on rhizosphere and bulk soil solutions of treatments T0 (without lime addition) and T7 (with the maximum addition of lime) by using a deposition time of 30 s at a selected range of deposition potentials (Edep, from -1 to +0.1 V), followed by a desorption step of 3 s at the minimal Edep to desorb the dissolved organic matter from the mercury drop (Louis et al. 2008). The range of Edep was chosen to avoid interference with the deposition of Cd, lead (Pb), manganese (Mn) and Zn. Compared with the literature (Croot et al. 1999; Louis et al. 2008), the deposition time was decreased 10-fold to avoid any saturation of the mercury drop due to the large Cu concentration occurring in those soil solutions. Pseudopolarographic measurements were performed automatically using the PROJECT mode offered by the GPES 4.9 software and a home-written program as described by Louis et al. (2008). Analysis of voltammetric peaks and construction of pseudopolarograms were performed manually using the Microsoft Excel software. Soil solutions of T0 and T7 samples were analysed by pseudopolarography first at initial pH and second after acidifying down to pH 2 with concentrated HNO3 (supra pur grade, Merck). The acidification step was performed to fully dissociate organic Cu complexes in order to determine the peak area to total Cu concentration ratio (the method sensitivity). The related pseudopolarograms also enabled to determine the adequate Edep (-0.1 V) to measure only free Cu2+ plus inorganically bound-Cu in non-acidified samples. Rhizosphere and bulk soil solutions of the other treatments (T1 to T6) were then analysed by voltammetry at two Edep, -0.85 and -0.1 V, before and after acidifying to pH 2. Peak areas were converted into Cu concentrations by calculating the method sensitivity using the voltammograms at pH 2. The sensitivity was consistent among samples (3.5 ± 0.2 10-3 A V-1 mol-1 dm3) which further indicated that the acidification procedure fully dissociated organically bound-Cu. Free Cu2+ activities and concentrations were calculated from the concentration of inorganic Cu measured at Edep -0.1 V using the aqueous speciation model PHREEQC (version 2.14.3.2411) and the MINTEQ database of thermodynamic constants. Sulfate concentration was fixed at 1 mM as in the nutrient solution used for the extraction of soil solution. Potassium and nitrate, which are not prone to interfere with Cu speciation, were used as background electrolyte to reach the same ionic strength than in the extracted soil solution (≈ 12 mM). Their concentration were therefore fixed at 9.5 mM .


160

I.2.6. Labile Cu in soil as measured by DGT

The DGT technique was performed on the remaining part of the small set of composite fresh soil samples to assess Cu remobilisation, i.e. labile Cu in both soil solution and solid-phase. Standard cylindrical DGT (Zhang et al. 2001) units with an active surface area of 3.14 cm2 and a diffusive gel thickness of 0.083 cm were covered with 3.84 g fresh soil for 24 h at 25°C. The mass of soil exposed to the DGT units was calculated to induce a depletion of less than 0.5 % of total soil Cu. The resin was then retrieved and eluted in 1.2 cm3 of 1 M HNO3 for 24 h. The concentration of eluted Cu was determined by GF-AAS. DGT-Cu flux (FDGT, ng Cu m-2 s-1) was calculated according to:

FDGT = m / (A t) (1) where m is the mass of Cu (ng) accumulated in the resin, A, the active surface area (m2) of the DGT unit and, t, the deployment time (s).

I.2.7. Statistics

Analyses of variance (HSD Tuckey’s test) as well as simple and multi-linear regressions were performed with Statistica (version 6, StatSoft). The level of statistical significance was represented by *, ** and *** for P ≤ 0.05, P ≤ 0.01 and P ≤ 0.001, respectively. I.3. Results

I.3.1. Root-induced alkalisation and DOC concentration increase in the rhizosphere

The root-induced changes in pH and DOC concentration in the rhizosphere of durum wheat have been already reported in details in a companion paper (Bravin et al. 2008a, chapter 4.II), for a broader set of soil samples than the large set reported in the present work. The measured values are displayed in Tables 1 and 2 for the large and the small sets of soil samples, respectively. Table 2. Soil solution chemical composition of the small set of composite samples of bulk soils (BS) and rhizosphere (RZ) soils (n = 16) for the different rates of lime addition.

DPASVb

ISE

pH DOC pCuTotala pCuDPASV

c pCuinorgd pCu2+ e pCu2+f

mg C dm-3 BS RZ BS RZ BS RZ BS RZ BS RZ BS RZ BS RZ T0 4.7 7.4 2.3 26 5.7 6.1 5.7 6.5 5.8 7.4 5.8 8.3 6.0 8.7 T1 5.4 6.9 2.2 30 6.1 6.1 6.3 6.5 6.7 8.4 6.8 8.8 6.6 8.8 T2 5.7 7.0 2.9 45 6.2 5.9 6.5 6.4 7.3 8.0 7.3 8.5 7.0 8.7 T3 5.8 7.1 2.8 35 6.5 6.0 6.8 6.4 7.7 7.7 7.8 8.3 7.0 8.9 T4 6.4 6.9 3.3 41 6.5 6.0 6.8 6.5 8.5 7.9 8.6 8.2 7.6 8.9 T5 6.8 7.1 6.4 5.8 6.5 6.5 6.8 6.9 7.8 8.3 8.0 8.8 8.1 8.7 T6 7.0 7.2 4.5 23 6.4 6.1 6.9 6.4 8.1 8.0 8.5 8.7 8.1 8.7 T7 7.4 7.2 4.5 18 6.3 6.2 6.9 6.6 7.7 7.5 8.7 8.2 8.8 8.7 a measured by GF-AAS b Differential Pulse Anodic Stripping Voltammetry c measured by DPASV at a deposition potential of -0.85 V d inorganic Cu (free Cu2+ plus inorganic Cu complexes) measured by DPASV at a deposition potential of -0.1 V e calculated from pCuinorg using speciation modelling (see material and methods for further details) f measured by potentiometry with a Cu Ion-Selective Electrode (ISE)


161

As a consequence of lime addition, bulk soil pH increased between T0 and T7 from 4.6 to 7.6 (Table 1). Whatever the initial soil pH, rhizosphere pH ranged between 6.9 and 7.6 and was thus significantly higher (P < 0.01) than bulk soil pH in all treatments but T7 (Table 1; Bravin et al. 2008a, chapter 4.II). Whatever the bulk soil pH, DOC concentration was larger (P < 0.05) in the rhizosphere than in the corresponding bulk soil, except for T5 where the difference was not significant (Table 1; Bravin et al. 2008a, chapter 4.II). Similar results were found for pH and DOC as measured in the small set of composite soil samples (Table 2).

I.3.2. Total Cu and free Cu2+ concentrations in the rhizosphere and bulk soil solution

In the bulk soils, both total Cu and free Cu2+ concentrations in soil solution were strongly correlated with pH (Figure 2). The results obtained for the small set of composite samples (Figure. 2b) were in line with those obtained for the large set (Figure. 2a) which had been published in our companion paper (Bravin et al. 2008a, chapter 4.II). Total Cu concentration, when expressed as pCu (-log10[Cu]), decreased almost linearly as soil pH increased for pH values lower than 5.5 and then remained fairly stable at higher pH, with a mean value of 6.38 ± 0.09. Free Cu2+ concentration, when expressed as pCu2+, decreased linearly with increasing bulk soil pH, ranging from 5.1 to 9.1 (Figure 2).

Figure 2. Total Cu (pCu) and free Cu2+ (pCu2+) concentrations in the soil solution of rhizosphere and bulk soils as a function of soil solution pH for the large (a) and the small (b) sets of soil samples. In the rhizosphere, total Cu concentration ranged from pCu 5.6 to 6.7. Total Cu concentration was not significantly correlated with soil solution pH but linearly and positively correlated with DOC concentration in the rhizosphere (R² = 0.86*** , n = 40; Figure 3.a). In contrast with bulk soil values, free Cu2+ concentration in the soil solution of the rhizosphere remained rather small, with pCu2+ ranging from 8.2 to 9.5. Free Cu2+ concentration was mainly correlated with DOC concentration (R² = 0.61*** , n = 40; Figure 3.b) and poorly but significantly correlated with pH (R² = 0.39*** , n = 40), ultimately yielding the following multi-linear regression: p[Cu2+] = 0.59 (± 0.10) log10[DOC] + 0.7 (± 0.2) pH +3 (± 2) R² = 0.70*** n = 40 (2)


162

It is noteworthy that, contrary to total Cu, free Cu2+ concentration decreased with increasing DOC concentration. In the small set of composite soil samples, a similar relationship between pCu and DOC concentration was found (Figure 3.c), while pCu2+ was not so clearly related to DOC concentration (Figure 3.d).

Figure 3. Total Cu (pCu) (a, c) and free Cu2+ (pCu2+) (b, d) concentrations in the soil solution of rhizosphere samples as a function of dissolved organic carbon (DOC) concentration for the large (a, b) and the small (c, d) sets of soil samples.

I.3.3. Modelled free Cu2+ activity in the rhizosphere and bulk soil solution

Free Cu2+ activities in the bulk soil solution (n = 40) as calculated with WHAM VI were fitted to ISE measurements by adjusting the percentage of active fulvic acids to minimise the root mean square residual (RMSR):

RMSR = [∑=

n

i 1

(pCu2+ i, measured – pCu2+ i, calculated)2 / n ]1/2 (3)

Measured and calculated data were in fairly good agreement (RMSR = 0.32 pCu2+ unit) when considering that 64 % of fulvic acids reacted for proton and metal binding in the bulk soil solutions (Figure 4). In contrast, WHAM VI considerably under-estimated measured pCu2+ (RMSR = 0.70 pCu2+ unit) when the same assumption was applied to the soil


163

solution samples extracted from the rhizosphere (n = 40, Figure 4). The best fit (RMSR = 0.32 pCu2+ unit) was obtained when considering a reactivity of fulvic acids of only 37 % in the rhizosphere (results not shown).

Figure 4. Comparison between free Cu2+ activity calculated with WHAM VI numerical code (pCu2+ WHAM) and measured with an ion-selective electrode (pCu2+ ISE) in the soil solution of rhizosphere and bulk soils. WHAM VI was run considering that the reactivity of dissolved organic matter (presumably containing 50 % C) in the soil solution of both rhizosphere and bulk soils was 64 % of that of a soil fulvic acid (see results section for further details). Solid line stands for the 1:1 line. Dashed lines stand for 1:1 line ± 0.5 pCu2+ unit.

I.3.4. Labile Cu in the rhizosphere and bulk soil solutions as measured by DPASV

Voltammetric measurements were performed on the small set of composite soil samples only (n = 16), given the amount of solution which is necessary for this technique. In the bulk soil solution, the concentration of labile Cu as measured at Edep -0.85 V was highly correlated with pH (Figure 5.a). Labile Cu concentration in bulk soil solution samples decreased sharply and almost linearly as pH increased up to pH 5.8 and then remained fairly stable at about pCu 6.8. On the contrary, labile Cu concentration was independent of soil solution pH in the rhizosphere and was linearly, positively correlated with DOC concentration (R² = 0.91, n = 8; Figure 5.b). Copper lability showed clearly distinct relationships with pH and DOC concentration for bulk soil and rhizosphere samples (Figure 5). Labile Cu concentration was larger in the bulk soil solution than in the rhizosphere for bulk soil pH lower than 5.6 as well as in the treatment T5 which exhibited a particularly low DOC concentration in the rhizosphere (Figure 6). Conversely, the concentration of labile Cu was up to 2.5-fold larger in the rhizosphere soil solution than in the corresponding bulk soil in all the other treatments. Pseudopolarographic measurements were performed on the rhizosphere and bulk soil solutions of the extreme treatments T0 and T7. In the treatment T0 where a considerable


164

alkalisation occurred in the rhizosphere, the concentration of labile Cu was lower in the rhizosphere than in the bulk soil whatever the deposition potential (Figure 7.a.b). At the minimal Edep (-0.9 V), labile Cu amounted to 40and 94 % of total Cu concentration in the rhizosphere and bulk soil solutions, respectively. In the treatment T7 where the pH had not significantly changed in the rhizosphere and DOC concentration considerably increased (Tables 1 and 2), pseudopolarograms of bulk and rhizosphere soil solutions were fairly similar at Edep higher than -0.45 V (Figure 7.c.d). However below such Edep value, the concentration of labile Cu was up to 2.2-fold larger in the rhizosphere soil solution than in the bulk soil solution. At the minimal Edep (-1 V), labile Cu amounted to 36 and 27 % of total Cu concentration in the soil solution for rhizosphere and bulk soils, respectively.

Figure 5. Concentration of labile Cu as measured by DPASV (pCuDPASV, Edep = -0.85 V) in the soil solution of rhizosphere and bulk soils as a function of soil solution pH (a) or dissolved organic carbon (DOC) concentration (b).

I.3.5. Labile Cu in the rhizosphere and bulk soils as measured by DGT

DGT measurements were performed on the small set of composite soil samples only (n = 16), given the amount of soil which is necessary for this technique. In the bulk soils, the DGT-Cu flux, i.e. FDGT, decreased almost linearly as pH increased up to pH 5.7 and then remained fairly stable at 18 ± 3 ng Cu m-2 s-1 at higher pH (Figure 8.a). In contrast, FDGT was independent of pH in the rhizosphere and was linearly, positively correlated with DOC concentration in the rhizosphere (Figure 8.b) in a similar manner as reported earlier for labile Cu as measured by DPASV (Figure 5.b). FDGT was larger in the bulk soil than in the corresponding rhizosphere at the lowest bulk soil pH only (pH = 4.7, T0) and in the treatment T5 which exhibited a particularly low DOC concentration in the rhizosphere (Figure 9). In all the other treatments, FDGT was up to 3.3-fold larger in the rhizosphere than in the corresponding bulk soil, which matches fairly well with what was reported earlier for labile Cu as measured by DPASV (Figure 6). In the bulk soils, FDGT varied with the free Cu2+ activity in soil solution according to a 3rd-order polynomial regression curve (R² = 0.93*** , n = 8; Figure 10.a). The labile Cu in soils, as estimated by the FDGT was linearly and positively correlated with the concentration of labile Cu in solution as measured by DPASV both in the bulk soil (R² = 0.92*** , n = 8) and in the rhizosphere (R² = 0.82** , n = 8) (Figure 10.b). In the rhizosphere, FDGT increased linearly with increasing soil solution pCu (R² = 0.85** , n = 8; Figure 10.c).


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I.4. Discussion

Plant roots were able to induce considerable chemical changes in the rhizosphere of durum wheat. These chemical changes were an alkalisation of up to +2.8 pH units and an increase in DOM concentration (Tables 1, 2). Rhizosphere alkalisation can be considered as a plant strategy to alleviate aluminium and manganese toxicities as well as phosphorus deficiency which are likely to occur in strongly acidic soils (Marschner 1991; Hinsinger et al. 2003; Kochian et al. 2004), such as the soil used in this experiment in the unlimed, control treatment. In addition, the increase in DOM concentration in the rhizosphere is usually associated with both rhizodeposition, more precisely root exudation, and the subsequent enhancement of microbial activities in the rhizosphere which may ultimately lead to an increased turnover of soil organic matter (Kuzyakov 2002; Kuzyakov and Jones 2006; Khalid et al. 2007). In this study, we demonstrated that such root-induced changes of pH and DOM concentration had a considerable impact on Cu availability in the rhizosphere of durum wheat, when exposed to a wide range of bulk soil pH.

Figure 6. Concentration of labile Cu as measured by DPASV (pCuDPASV, Edep = -0.85 V) in the soil solution of rhizosphere and bulk soils as a function of the rate of lime addition.

I.4.1. Copper availability as affected by rhizosphere alkalisation

Copper availability was mainly driven by pH in the bulk soil over the wide range of investigated pH values obtained by liming. In the most acidic soil, i.e. in the unlimed soil (T0, pH ≈ 4.7), free Cu2+ amounted to 53 ± 3 % of total Cu in soil solution and inorganic Cu (free Cu2+ plus inorganic Cu complexes) amounted to 85 % (Figure 2, 7.c). Free Cu2+ concentration decreased linearly as pH increased to reach only 0.3 % of total Cu in the soil solution of the most alkaline, investigated bulk soil (pH ≈ 7.5). Copper speciation in the bulk soil solutions therefore agreed with the literature (McBride and Blasiak 1979; Salam and Helmke 1998). Nevertheless, free Cu2+ usually amounted to less than 30 % of total Cu in soil solution (Vulkan et al. 2000; Ma et al. 2006). Sauvé et al. (1997) similarly reported that more than 40 % of Cu in soil solution was organically bound. In our experiment, the low DOM


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concentration in the bulk soil solution (2.2 to 13.5 g C dm-3) is likely responsible for the larger percentage of Cu occurring as free Cu2+. This low DOM concentration could be attributed to (i) the moderate total C content of the investigated soil (15.5 mg kg-1), (ii) the fairly large concentration of Ca (2.4 mM) which was supplied upon incubation and may have coagulated some DOM or (iii) the dilution effect of the soil to solution ratio (1:10) used for soil solution extraction (Amery et al. 2007). In close agreement with the literature (McBride and Blasiak 1979; Jeffery and Uren 1983), total Cu concentration in soil solution exhibited a U-shape when plotted against pH, with maximal concentrations occurring at pH values lower than 5.5.

Figure 7. Pseudopolarograms showing the concentration and the percentage of total Cu in the soil solution occurring as labile Cu as measured by DPASV ([Cu]DPASV) in the soil solution of rhizosphere and bulk soils as a function of the DPASV deposition potential (Edep). Measurements were performed for soils treated without lime addition (T0) (a and c) and with the maximum rate of lime addition (T7) (b and d). Dashed lines stand for labile Cu at Edep = -0.1 V, i.e. the threshold corresponding to the concentration of inorganic Cu (free Cu2+ plus inorganic Cu complexes, see material and methods section for further details). The DOM concentration did not increase with increasing pH and free Cu2+ activity could be reasonably well simulated using WHAM VI with the assumption that 64% of the fulvic acids were reactive over the wide range of investigated bulk soil pH (Table 1, Figure 4). This


167

suggests that the fairly stable concentration of Cu in soil solution at pH values larger than 5.5 was mainly due to the decreasing protonation of DOM and its corresponding increasing ability to bind Cu upon increasing pH (van Riemsdijk et al. 2006). The ability of the soil to supply Cu , i.e. Cu lability, was also considerably altered by pH. In the most acidic, unlimed bulk soil (T0, pH ≈ 4.7), 94 % of Cu in soil solution was labile according to DPASV (Edep -0.9 V) measurements and this percentage decreased with increasing pH, down to 27 % in the most alkaline bulk soil solution (Figures 5.a, 7.c). Furthermore, the percentage of Cu remobilisation in soil solution due to the lability of organically bound-Cu increased from 10 % at the lowest pH to about 90 % when bulk soil pH was neutral to alkaline (results not shown). Jeffery and Uren (1983) described an identical pattern for labile Cu, as measured by DPASV and a chelex resin, as a function of pH in the soil solution of a Cu-spiked soil. The lability of Cu in soil as measured by DGT exhibited a very similar pH dependence. This is the first report of such unequivocal pH dependence of Cu lability in a contaminated soil (historical contamination, not spiking), whereas similar results were previously reported for Cd (Rachou et al. 2004). Our results therefore stressed the drastic effect of bulk soil pH on Cu availability at both a thermodynamic (equilibrium speciation) and kinetic (dynamic speciation or lability) point of view. More interestingly, root-induced alkalisation, which resulted in a rhizosphere pH of about 7.3 ± 0.1 whatever the initial bulk soil pH, dramatically altered Cu availability in the rhizosphere. The effect of alkalisation was most dramatic in the most acidic, unlimed bulk soil (T0, pH ≈ 4.7) where free Cu2+ concentration decreased by as much as three orders of magnitude and Cu lability in soil solution decreased 6-fold in the rhizosphere (Figures 2, 6). Rhizosphere alkalisation thus enabled plant roots to drastically decrease their exposure to Cu. This further support the recent findings of Bravin et al. (2008a, chapter 4.II) and Chaignon et al. (2008) who evidenced that some plant species (durum wheat and oilseed rape, repectively) were able to significantly alkalise their rhizosphere and thereby to reduce Cu bioavailability in strongly acidic, Cu-contaminated soils.

Figure 8. DGT-Cu flux (FDGT) in the rhizosphere and bulk soils as a function of soil solution pH (a) or dissolved organic carbon (DOC) concentration (b).


168

I.4.2. Copper remobilisation by DOM in the rhizosphere

As a result of root-induced alkalisation, soil pH which was the master driver of Cu availability in the bulk soils, had little impact when considering rhizosphere conditions where soil pH was systematically neutral or slightly alkaline. In contrast, the considerable quantitative and qualitative changes in DOM which occurred in the rhizosphere played a crucial role in determining Cu availability in the rhizosphere. The increase in DOM concentration in the rhizosphere was followed by a related increase in total Cu concentration in the soil solution (Figure 3.a). This led to Cu concentrations in some rhizosphere soil solution which reached those of the most acidic bulk soil despite the considerable pH difference (Figure 2). Such concomitant increases of DOM concentration and total Cu concentration in soil solution had been previously reported both in the presence and absence of plants (Jeffery and Uren 1983; Cattani et al. 2006; Zhao et al. 2007a, b). In the rhizosphere, free Cu2+ concentration was also mainly controlled by DOM concentration in the soil solution (Figure 3.b). However, opposite to total Cu, free Cu2+ concentration decreased with increasing DOM concentration. These results showed that the DOM in the rhizosphere was able to mobilise Cu by desorption from the soil solid-phase on the one hand, and to complex free Cu2+ already present in the soil solution on the other hand. According to Zhou and Wong (2001) and Weng et al. (2002), the ability of DOM to mobilise Cu from the soil solid phase is maximal in alkaline soils. In such soils, the affinity of DOM for Cu is so strong that DOM can enhance the depletion of free Cu2+ in the solution (Salam and Helmke 1998). The concomitant increase in total Cu and decrease in free Cu2+ concentration in soil solution that we observed in the rhizosphere further suggest that the resulting availability of Cu depends on the quality of DOM in the rhizosphere, i.e. its Cu binding properties and the related lability of Cu-DOM complexes.

Figure 9. DGT-Cu flux (FDGT) in the rhizosphere and bulk soils as a function of the rate of lime addition.


169

I.4.3. Copper availability as affected by the reactivity of DOM in the rhizosphere

We did not characterise the nature of the organic compounds occurring in the soil solution, neither in the bulk soil nor in the rhizosphere. Instead we rather focused on the functional characterisation of Cu-DOM complexes. In the bulk soil, DOM reactivity was equivalent to that of a fulvic acid with 64 % of its binding sites participating to proton and metal complexation (Figure 4). This percentage of reactivity was in close agreement with published values of 65 and 69 % chosen to fit measurements of free Cu2+ using WHAM VI or NICA-Donnan numerical codes in Cu-contaminated soils covering a wide range of pH (Vulkan et al. 2000; Weng et al. 2002). In contrast, when this degree of reactivity was applied to DOM in the rhizosphere, free Cu2+ activity was significantly underestimated by WHAM VI in the present work. Although it is certainly oversimplified to simulate DOM in the rhizosphere as a fulvic acid, this result suggests that the reactivity of DOM in the rhizosphere of durum wheat was lower than that in the bulk soils. In other words, DOM produced in the rhizosphere as a result of root or microbial activities exhibited a lower affinity for Cu (a lower global thermodynamic constant) and/or a lower amount of binding sites per quantity of DOM than the fulvic acid used in WHAM VI. Plant roots and microorganisms usually exude a wide range of Cu-chelating compounds in the rhizosphere, from low molecular weight organic anions (carboxylates), amino-acids and phenolics to high molecular weight organic molecules such as mucilage (root and microbial polysaccharides which bear uronic acids) and proteins (Morel et al. 1986; Mench et al. 1987; Jones 1998). Mucilage and high molecular weight organic molecules exuded by maize (Zea mays L.) roots exhibited Cu binding properties, when expressed as log K values, which ranged between 3.5 and 5.5 (Morel et al. 1986; Mench et al. 1987). For organic anions usually found in the rhizosphere, log K values varied between 2 and 13 (Jones 1998). In addition, graminaceous species such as durum wheat can secrete phytosiderophores which exhibit considerably larger affinity for Cu, with log K values as high as 18 (Murakami et al. 1989). In comparison, the largest log K values of monodentate Cu binding by the fulvic acid (i.e. dominated by phenolic-like sites) described in WHAM VI ranged between 4.6 and 7.4 (Tipping 1998). The assumption of a lower affinity of DOM for Cu in the rhizosphere compared with bulk soil thus mainly depends on the composition and the resulting binding properties of such a mixture of organic compounds which makes up the rhizosphere DOM. However, experimental data that characterise metal binding by DOM in the actual rhizosphere environment are scarce and this shall thus deserve further attention. It should also be stressed that a substantial proportion of root exudates are sugars and a range of other compounds which would can hardly complex any metal ion at all. These may result in a decrease in the overall reactivity of rhizosphere DOM, when expressed on a C mass basis. An alternative hypothesis would involve the alteration of the conformational structure of the soluble humic substances in the rhizosphere relative to bulk soil. Organic anions, i.e. potential root exudates, have been reported to induce a disruption of humic substances in smaller molecules (Piccolo et al. 2003). Such changes in the molecular size of dissolved humic substances in the rhizosphere could be responsible for the reduced reactivity of DOM. Unfortunately, to our knowledge, the relationship between conformational changes in humic molecules and the related metal-binding affinity has not been addressed so far. Beyond equilibrium considerations of DOM reactivity, a more dynamic approach of Cu speciation in soils was also addressed, i.e. Cu lability. If the DOM was able to remobilise Cu sorbed onto the soil solid-phase in the rhizosphere, DOM also promoted an increase in Cu lability as inferred from DPASV and DGT measurements (Figures 5b, 8.b). The effect of DOM was so strong at bulk soil pH larger than about 5.5 that Cu lability became larger in the


170

rhizosphere than in the corresponding bulk soil, despite the considerable pH difference (Figures 8.a, 9).

Figure 10. DGT-Cu flux (FDGT) in the rhizosphere and bulk soils as a function of free Cu2+ activity (pCu2+) (a), the concentration of labile Cu as measured by DPASV (pCuDPASV) (b) and total Cu concentration (pCu) (c) in soil solution. Cattani et al. (2006) similarly reported an increase in DGT-Cu flux concomitantly to an increase in DOM concentration in the rhizosphere of maize grown in a calcareous, Cu-contaminated soil. Our experiment showed for the first time that DGT measurements were


171

linearly related with DPASV measurements of Cu lability, both in rhizosphere and bulk soils (Figure 10.b). This suggests that the DGT measurements which were performed on soils were mainly driven by the lability of Cu in the soil solution. The pseudopolarograms performed on the rhizosphere and bulk soils of the most alkaline soil (treatment T7) demonstrated the major effect of DOM on Cu lability in the soil solution (Figure 7.b, d). Copper lability, when expressed as a percentage of total Cu in soil solution, exhibited similar shapes in bulk and rhizosphere soils for Edep larger than -0.45 V, which suggests that the inorganic Cu complexes and the most readily dissociable organic Cu complexes would have the same lability. However, at lower Edep, Cu lability became significantly larger in the rhizosphere (Figure 7.d). This original finding is consistent with a larger lability of some organic Cu complexes in the soil solution of the rhizosphere than in the bulk soil. It physically means that organic Cu complexes in the soil solution exhibit a lower thermodynamic constant and/or a larger dissociation rate constant in the rhizosphere than in the bulk soil. This increase in Cu lability in the rhizosphere shall be particularly relevant for the prediction of Cu bioavailability to plants as the short deposition time and the slightly negative Edep used for the DPASV measurements in the present work indicate that the organic Cu complexes occurring in the rhizosphere were particularly labile. In contrast, Kalis et al. (2006) observed a decrease in metal lability in nutrient solution amended with soil humic acids. To our knowledge, only one study previously measured metal lability in the actual soil solution of the rhizosphere: Dessureault-Rompré et al. (2008) noted a decrease in the lability of Cd and Zn as measured by ASV in the rhizosphere of Thlaspi caerulescens in comparison with bulk soil, which was attributed to the considerable sink effect induced by this hyperaccumulator plant. Collectively, our data have however shown a more convincing picture of root-induced changes of both equilibrium and dynamic speciation of a metal in the rhizosphere of a common crop species, and has highlighted the needs for further investigations in this domain. I.5. Conclusion

This study pointed out the dramatic effect of DOM and root-induced alkalisation on Cu availability in the rhizosphere from both an equilibrium and a dynamic point of view. It is the first report of the application of complementary speciation techniques to elucidate metal availability in soil and particularly in the peculiar micro-environment of the rhizosphere. Root-induced alkalisation considerably altered Cu availability in the most acidic pH values (pH < 5.5) by decreasing free Cu2+ concentration and Cu lability. In the rhizosphere, soil pH influence almost disappeared as rhizosphere pH was neutral to slightly alkaline whatever the bulk soil pH, and DOM thus became the critical parameter which determined Cu availability. The increase in DOM concentration in the rhizosphere resulted in a decrease in free Cu2+ concentration in soil solution but, in the mean time, a concomitant remobilisation of Cu sorbed to soil-solid phase occurred, as well as an increase in Cu lability in the soil. The nature of DOM was likely altered in the rhizosphere as its reactivity as predicted using WHAM VI decreased in comparison with the bulk soil. We also found an increase in the lability of organically bound-Cu in the rhizosphere soil solution. Degryse et al. (2006a, b) noted a larger uptake of metals by plants when the lability of organic metal complexes was increasing. Therefore, the combination of the decrease in Cu availability in acidic soils as a consequence of root-induced alkalisation and the increase in Cu lability in the rhizosphere of alkaline soils could explain why Michaud et al. (2007, chapter 2.I) did not observe any significant difference in root Cu content of field-grown durum wheat between strongly acidic and calcareous soils. These results stress the need for a better in-depth understanding of metal availability in the rhizosphere with an emphasize on the relationships between the nature and the reactivity of rhizosphere DOM, i.e. a better characterisation of its affinity for metal binding and the lability of DOM-metal complexes.


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I.6. Acknowledgements

Yoann Louis is acknowledged for his assistance to adjust DPASV procedure to our soil solution samples. Didier Arnal, Nicole Balsera, Michaël Clairotte, Ana Lara Martí, Lucien Roger and Gérard Souche are acknowledged for technical support. Financial support was provided by the PNETOX programme of the French Ministry of Ecology and Sustainable Development. I.7. Literature

AFNOR 1999 Recueil de normes françaises. Qualité des sols, Paris. Allen H E 1993 The significance of trace metal speciation for water, sediment and soil quality criteria and

standards. Sci. Total Environ. N°sup/93, 23-45. Amery F, Degryse F, Degeling W, Smolders E and Merckx R 2007 The copper-mobilizing-potential of dissolved

organic matter in soils varies 10-fold depending on soil incubation and extraction procedures. Environ. Sci. Technol. 41, 2277-2281.

Bermond A, Varrault G, Sappin-Didier V and Mench M 2005 A kinetic approach to predict soil trace metal bioavailability: preliminary results. Plant Soil 275, 21-29.

Bravin M N, Lara Marti A, Clairotte M and Hinsinger P 2008b Rhizosphere alkalisation - a major driver of copper bioavailability over a wide range of pH in an acidic, copper-contaminated soil. submitted to Plant Soil.

Bravin M N, Michaud A M, Larabi B and Hinsinger P 2008d Rhizotest: a plant-based biotest to account for rhizosphere processes for assessing metal bioavailability. submitted to Environ. Pollut.

Carrillo-Gonzalez R, Simunek J, Sauvé S and Adriano D 2006 Mechanisms and pathways of trace element mobility in soils. Adv. Agron. 91, 111-178.



Chaignon V, Quesnoit M and Hinsinger P 2008 Rhizosphere pH, bioavailability and extractability of Cu in an acidic Cu-contaminated soil as affected by liming. Environ. Pollut. submitted.

Croot P L, Moffett J W and Luther G W I 1999 Polarographic determination of half-wave potentials for coppe-organic complexes in seawater. Mar. Chem. 67, 219-232.

Degryse F, Smolders E and Merckx R 2006a Labile Cd complexes increase Cd availability to plants. Environ. Sci. Technol. 40, 830-836.

Degryse F, Smolders E and Parker D R 2006b Metal complexes increase uptake of Zn and Cu by plants: implications for uptake and deficiency studies in chelator-buffered solutions. Plant Soil 289, 171-185.

Degryse F, Verma V K and Smolders E 2008 Mobilization of Cu and Zn by root exudates of dicotyledonous plants in resin-buffered solutions and in soil. Plant Soil 306, 69-84.

Dessureault-Rompré J, Nowack B, Schulin R, Tercier-Waeber M L, and Luster J 2008 Mobilization and complexation of Zn and Cd in the rhizosphere of Thlaspi caerulescens. In Eurosoil 2008 – Book of abstracts, Eds Blum W H, Gerzabeck M H and Vodrazka M. pp 131-132. Vienna.

Hamon R E, Lorenz S E, Holm P E, Christensen P H and McGrath S P 1995 Changes in trace metal species and other components of the rhizosphere during growth of radish. Plant Cell Environ. 18, 749-756.




Jeffery J J and Uren N C 1983 Copper and zinc species in the soil solution and the effects of soil pH. Aust. J. Soil Res. 21, 479-488.

Jones D L 1998 Organic acids in the rhizosphere - a critical review. Plant Soil 205, 25-44. Kalis E J J, Temminghoff E J M, Weng L P and van Riemsdijk W H 2006 Effects of humic acid and competing

cations on metal uptake by lolium perenne. Environ. Toxicol. Chem. 25, 702-711. Khalid M, Soleman N and Jones D L 2007 Grassland plants affect dissolved organic carbon and nitrogen

dynamics in soil. Soil Biol. Biochem. 39, 378-381. Kochian L V, Hoekenga O A and Pineros M A 2004 How do crop plants tolerate acid soils? Mechanisms of

aluminium tolerance and phosphorus efficiency. Annu. Rev. Plant Biol. 55, 459-493.


173

Kuzyakov Y 2002 Review: Factors affecting rhizosphere priming effects. J. Plant Nutr. Soil Sci. 165, 382-396. Kuzyakov Y and Jones D L 2006 Glucose uptake by maize roots and its transformation in the rhizosphere. Soil

Biol. Biochem. 38, 851-860. Louis Y, Cmuk P, Omanovic D, Garnier C, Lenoble V, Mounier S and Pizeta I 2008 Speciation of trace metals

in natural waters: the influence of an adsorbed layer of natural organic matter (NOM) on voltammetric behaviour of copper. Anal. Chim. Acta 606, 37-44.

Ma Y B, Lombi E, Oliver I W, Nolan A L and McLaughlin M J 2006 Long-term aging of copper added to soils. Environ. Sci. Technol. 40, 6310-6317.

Marschner H 1991 Mechanisms of adaptation of plants to acid soils. Plant and Soil 134, 1-20. McBride M B and Blasiak J J 1979 Zinc and copper solubility as a function of pH in an acid soil. Soil Sci. Soc.

Am. J. 43, 866-870. Mench M, Morel J L and Guckert A 1987 Metal binding properties of high molecular weight soluble exudates

from maize (Zea mays L.) roots. Biol. Fertil. Soils 3, 165-169. Michaud A M, Bravin M N, Galleguillos M and Hinsinger P 2007 Copper uptake and phytotoxicity as assessed


Morel J L, Mench M and Guckert A 1986 Measurement of Pb2+, Cu2+ and Cd2+ binding with mucilage exudates from maize (Zea mays L.) roots. Biol. Fertil. Soils 2, 29-34.

Murakami T, Ise K, Hayakawa M, Kamei S and Takagi S I 1989 Stabilities of metal complexes of mugineic acids and their specific affinities for iron(III). Chem. Lett. 12, 2137-2140.

Oliver I W, Ma Y, Lombi E, Nolan A L and McLaughlin M J 2006 Stable isotope techniques for assessing labile Cu in soils: Development of an L-value procedure, its application, and reconciliation with E values. Environ. Sci. Technol. 40, 3342-3348.

Peijnenburg W J G M and Jager T 2003 Monitoring approaches to assess bioaccessibility and bioavailability of metals: Matrix issues. Ecotox. Environ. Safe. 56, 63-77.


Piccolo A, Conte P, Spaccini R and Chiarella M 2003 Effects of some dicarboxylic acids on the association of dissolved humic substances. Biol. Fertil. Soils 37, 255-259.

Rachou J, Gagnon C and Sauvé S 2007 Use of an ion-selective electrode for free copper measurements in low salinity and low ionic strength matrices. Environ. Chem. 4, 90-97.




Sauvé S, Cook N, Hendershot W H and McBride M B 1996 Linking plant tissue concentrations and soil copper pools in urban contaminated soils. Environ. Pollut. 94, 153-157.

Sauvé S, Hendershot W and Allen H E 2000a Solid-solution partitioning of metals in contaminated soils: Dependence on pH, total metal burden, and organic matter. Environ. Sci. Technol. 34, 1125-1131.


Sauvé S, Norvell W A, McBride M and Hendershot W 2000b Speciation and complexation of cadmium in extracted soil solutions. Environ. Sci. Technol. 34, 291-296.

Song J, Zhao F J, Luo Y M, McGrath S P and Zhang H 2004 Copper uptake by Elsholtzia splendes and Silene vulgaris and assessment of copper phytoavailability in contaminated soils. Environ. Pollut. 128, 307-315.

Tipping E 1998 Humic ion-binding model VI: An improved description of the interactions of protons and metal ions with humic subtances. Aquat. Geochem. 4, 3-48.

van Leeuwen H P, Town R M, Buffle J, Cleven R F M, Davison W, Puy J, van Riemsdijk W H and Sigg L 2005 Dynamic speciation analysis and bioavailability of metals in aquatic systems. Environ. Sci. Technol. 30, 8545-8556.

van Riemsdijk W H, Koopal L K, Kinniburgh D G, Benedetti M F and Weng L P 2006 Modeling the interactions between humics, ions, and mineral surfaces. Environ. Sci. Technol. 40, 7473-7480.

Vulkan R, Zhao F J, Barbosa-Jefferson V, Preston S, Paton G I, Tipping E and McGrath S 2000 Copper speciation and impacts on bacterial biosensors in the pore water of copper-contaminated soils. Environ. Sci. Technol. 34, 5115-5121.


174

Weng L P, Temminghoff E J M, Lofts S, Tipping E and Van Riemsdijk W H 2002 Complexation with dissolved organic matter and solubility control of heavy metals in a sandy soil. Environ. Sci. Technol. 36, 4804-4810.



Zhao L Y L, Schulin R and Nowack B 2007a The effects of plants on the mobilization of Cu and Zn in soil columns. Environ. Sci. Technol. 41, 2770-2775.

Zhao L Y L, Schulin R, Weng L and Nowack B 2007b Coupled mobilization of dissolved organic matter and metals (Cu and Zn) in soil columns. Geochim. Cosmochim. Acta 71, 3407-3418.

Zhou L and Wong J W C 2001 Effect of dissolved organic matter from sludge and sludge compost on soil copper sorption. J. Environ. Qual. 30, 878-883.


175

II. Root-induced alkalisation of an acidic, copper-contaminated soil controls copper depletion in durum wheat rhizosphere Authors : M. N. Bravin1, P. Tentscher1,2, J. Rose2 and P. Hinsinger1,* Affiliations: 1 INRA, UMR 1222 Biogéochimie du Sol et de la Rhizosphère (INRA-SupAgro), Place Viala, 34060 Montpellier, France 2 CNRS, UMR 6635 CEREGE (CNRS-Université Paul Cézanne Aix-Marseille III), Europôle Méditerranéen de l’Arbois BP 80, 13545 Aix en Provence, France * Corresponding author: [email protected], Tel: +33 4 99 61 22 49, Fax: +33 4 99 61 30 88 Brief Root-induced alkalisation decreased free ionic Cu2+ in solution and DGT-Cu flux at the root surface and over several millimetres in the rhizosphere. Abstract Recent studies suggest that root-induced chemical changes in the rhizosphere could substantially alter metal bioavailability to plants in comparison with re-supply limitation due to root uptake. In the present work, root-induced alkalisation was investigated using a root mat approach to assess its impact on the establishment of copper (Cu) gradients in the rhizosphere of durum wheat (Triticum turgidum durum L.) cropped in an acidic, Cu-contaminated soil. Soil pH increased by up to +2.8 unit at the root surface and over 6 mm in the rhizosphere. The related depletion of total Cu concentration in soil solution was simulated using DIFS (diffusive gradients in thin films –DGT– induced flux in soils and sediments) model and showed that the root-induced alkalisation almost entirely explained Cu depletion, while plant uptake had little impact. Experimental pH gradient was modelled as a diffusion of H+ in soil, which enabled to re-calculate the radial extension of the pH gradient around a single root in cylindrical geometry. Free Cu2+ concentration gradient was further determined and was linearly correlated with pH. Free Cu2+ concentration decreased over three orders of magnitude at the root surface as a consequence of OH- efflux from roots. Free Cu2+ depletion extended over 1 to 4 mm in the rhizosphere depending on OH- efflux and root radius. Rhizosphere alkalisation thus dramatically decreased the exposure of root to Cu. This conclusion underlines the need for a broader consideration of root-induced chemical changes in the rhizosphere for assessing metal bioavailability to plants. Keywords: Alkalisation, Copper, Diffusion, DGT, Gradient, Speciation, Rhizosphere.


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II.1. Introduction

Despite the recent breakthrough in the measurement of metal speciation in soil, metal bioavailability to plants in contaminated soils remains a matter of concern as discrepancies still exist between model predictions and experimental data (Sauvé et al. 1998; Krishnamurti and Naidu 2002; Thakali et al. 2006). Recent definitions of bioavailability stressed the importance of the “bio-influence zone”, i.e. the rhizosphere in the case of plants, on the actual exposure to metals (Peijnenburg et al. 1997; Harmsen et al. 2005). Barber and co-workers showed that the bioavailability of macronutrients such as calcium, magnesium and potassium was mainly driven by re-supply or convection processes in the rhizosphere (Barber 1995). In particular, when plant uptake exceeds the ability of soil to re-supply the nutrient at the root surface by mass-flow, desorption and diffusion, nutrient depletion occurs in the rhizosphere and nutrient re-supply becomes the rate-limiting process. Such a phenomenon is considered to be the rule when assessing metal bioavailability, as long as metals are strongly adsorbed on the soil solid-phase and hence poorly available (Sauvé et al. 2000; Weng et al. 2002). Therefore, a range of techniques was developed to assess metal re-supply in soil from a kinetic point of view (Hooda et al. 1999; Bermond et al. 2005; Oliver et al. 2006). In agreement with this theory, fairly good correlations were found between copper (Cu) and zinc (Zn) uptake in plants and the technique of diffusive gradients in thin films (DGT) which measured the ability of soil to re-supply metals as a consequence of a sink effect (Zhang et al. 2001, 2004). However, Puschenreiter et al. (2005) and Cattani et al. (2006) rather observed an increase in nickel (Ni) and Cu concentrations in soil solution in the rhizosphere. This was attributed to root-induced exudation of metal-chelating compounds. In addition, Michaud et al. (2007, chapter 2.I) and Bravin et al. (2008a, chapter 4.II) described a root-induced alkalisation of +1 to +2 pH unit in the rhizosphere of durum wheat (Triticum turgidum durum L.) cropped in strongly acidic soils which dramatically decreased Cu concentration in soil solution and Cu bioavailability. These results therefore suggest that plant uptake is not the sole rhizosphere process which can significantly impact metal availability in the rhizosphere and ultimately metal bioavailability to plants. This study investigated the occurrence of an alkalisation in the rhizosphere of durum wheat cropped in a strongly acidic, Cu-contaminated soil with the objective (i) to demonstrate that root-induced alkalisation is the major process controlling the depletion of Cu in the rhizosphere and (ii) to measure the radial extension of the pH gradient around roots and its impact on Cu availability. Plants were grown with a root-mat technique to visualise pH gradient in a planar geometry. Experimental data were then modelled to re-draw pH and Cu gradients around a single root in cylindrical geometry. Our results stressed the need to account for root-induced chemical changes in the rhizosphere when assessing metal bioavailability to plants. II.2. Material and Methods

II.2.1. Soil properties and pH buffering capacity

The selected soil was sampled in the topsoil (0-20 cm) of a former vineyard of Southern France which received repetitive applications of Cu-based fungicides for decades. Once sampled, soil was air-dried, sieved at 2 mm and then analysed by a routine soil-testing laboratory (INRA-LAS, France) according to French (AFNOR 1999) and international (ISO 1999) procedures. The soil was strongly acidic (pHCaCl2 = 4.1) and moderately Cu-


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contaminated (total Cu = 184 mg kg-1). Additional soil properties were provided by Bravin et al. (2008a, chapter 4.II). The soil pH buffering capacity was measured to compute OH- efflux from plant roots from pH changes in the rhizosphere. The procedure was fully described in supporting information (Figure SI-1, Comment SI-1).

II.2.2. Plant growth

Durum wheat (cv. Acalou) seeds were germinated for 4 days on ashless filter paper (541, Whatman) moistened with CaCl2 600 µM and H3BO3 2 µM. Roots were then inserted into bags (8-cm diameter, two seedlings per bag) made with a polyamide mesh (30-µm pore diameter, Sefar, Switzerland) and seedlings were grown in hydroponics in CaCl2-H3BO3 solution for another 3 days (Figure SI-2). Plants were then transferred for another 2 weeks in a complete nutrient solution of following composition (µM): Ca(NO3)2 2000, KNO3 2000, MgSO4 1000, KH2PO4 500, NaFe(III)EDTA 100, H3BO3 10, MnCl2 2, ZnSO4 1, CuCl2 1 and Na2MoO4 0.05. The pH was equal to 5.5 and the solution renewed every second day. The growth chamber parameters were set at (day/night): 25/20°C, 75/70% relative humidity and 450 µmol m-2 s-1 photon flux density. Soil was incubated for 5 days at 70 % of the water holding capacity (20 % water content by weight) and perspex cylinders (7-cm internal diameter) were then filled with around 260 g of moist soil and connected to 1-dm3 of the nutrient solution for another 3 days. The composition of the solution was the same as above minus micronutrients (H3BO3, CuCl2, NaFe(III)EDTA, MnCl2, Na2MoO4 and ZnSO4). For the soil stage, the root mat-containing bags of the 3-week-old seedlings were firmly pressed against the soil-containing cylinders with two glass plates for 8 days according to Hinsinger and Gilkes (1995) (planted devices, Figure SI-2). Two filter-paper wicks (541, Whatman) connected to 1-dm3 of the nutrient solution were sandwiched between each glass plate and the root-mat or the soil to ensure an adequate supply of water and nutrients. In addition, some root apices grew freely in the nutrient solution (Figure SI-2). Control soils were incubated in similar devices without plant (unplanted devices). Planted and unplanted devices were replicated four times.

II.2.3. Soil slicing and analyses

At harvest, the root mat-containing bags were gently removed from the soil surface. Soil cylinders of planted and unplanted devices were immediately cut in thin slices (up to 200-µm resolution) parallel to the root mat with a purpose-built microtome (Bravin et al. 2008e). Considering that soil solution was in equilibrium with the composition of the nutrient solution, a solution of identical composition was used to extract soil solution on the fresh soil slices of three out of four replicates (both planted and unplanted devices, n = 48), as follows: soil was mixed with the nutrient solution (soil:solution ratio 1:10 on a dry soil basis) in a end-over-end shaker for 2 h and then centrifuged at 10,000 g for 10 min before filtration (0.45 µm, acetate cellulose filter). Within the day of extraction, free ionic Cu activity (pCu2+ = -log10Cu2+) was measured in each solution with a Cu ion-selective electrode (ISE, DX 264, Mettler Toledo) and a double-junction reference electrode (Inlab, Mettler Toledo) according to Rachou et al. (2007) and


178

Bravin et al. (2008b, chapter 2.II). Free Cu2+ concentration was calculated from pCu2+ and the activity coefficient. The latter was calculated with the extended Debye-Hückel equation (Ritsema 1993). Immediately after pCu2+ determination, pH was measured with a combined glass-electrode (6.0234.110, Metrohm, Switzerland). The samples were stored at 4°C until total Cu and dissolved organic carbon (DOC) concentrations were measured (within a week) by graphite furnace atomic absorption spectrometry (GF-AAS, Varian Spectra AA-600 GTA-110, USA) and total organic carbon analyser (TOC-5000, Shimadzu, Japan), respectively. Standard cylindrical DGT (Zhang et al. 2001) unit with an active surface area of 3.14 cm2 and a diffusive gel thickness of 0.083 cm were covered with 1.92 g fresh soil of each slice (at about 24 % water content) of the fourth replicates (both planted and unplanted devices, n = 16) for 24 h at 25°C. The mass of soil exposed to the DGT units was calculated to induce a depletion lower than 1 % of total soil Cu. Resin gel was then retrieved and eluted in 1.2 cm3 of 1 M HNO3 for 24 h. The concentration of eluted Cu was determined by GF-AAS. DGT-Cu flux (FDGT, ng Cu m-2 s-1) was calculated according to:

FDGT = m / (A t) (1) where m is the mass of Cu (ng) accumulated in the resin, A, the active surface area (m2) of the DGT unit and, t, the deployment time (s). Soil water content and the mean bulk-soil density were calculated after oven-drying at 105 °C.

II.2.4. Plant analyses

At harvest, plant shoots and roots used to measure Cu content were directly oven-dried at 105 °C, while root sub-samples used to determine surface area measurements were stored at -20 °C before analyses. Roots which grew outside the bags were treated separately. Six plant devices were harvested after the 3-week period of growth in hydroponics to be used as plant controls, for calculating Cu uptake during the 8-day soil stage. After thawing, surface area measurements were performed on scanned roots with WinRhizo software (version 2005 b, Regent Instruments, Canada) as detailed in the chapter 3. Root samples were then oven-dried at 105°C for dry biomass determination. Shoots and roots were ground (MM 2000, Retsch grinder, Germany) and digested in a microwave oven (Ethos Touch Control, Milestone) with concentrated HNO3 (65 %) at 180°C and 2 106 Pa. Copper concentration in the digests was measured by flame AAS (Varian FS-220, USA). Blanks and reference materials of maize shoots (Zea mays L., V 463, Bureau InterProfessionnel d’Etudes Analytiques, France) and olive leaves (Olea europaea L., n° 62, Community Bureau of References, Commission of the European Communities) were included during digestions and analyses to check the accuracy of the measurement procedure. The flux of Cu (FCu, ng Cu m-2 s-1) across the root mat-soil interface was calculated according to equation (1) where m is the mass of Cu (ng) taken up by plants during the 8-day soil stage, A, the root surface area (m2) in contact with soil and, t, the duration (s) of soil stage.


179

II.2.5. Statistics

Analyses of variance (HSD Tuckey’s test) were performed with Statistica (version 6, StatSoft). Regression curves were fitted by using the solver of Excel software (version 2000, Microsoft, USA) to minimise the root mean square residual (RMSR):

RMSR = [∑=

n

i 1

(Xi, measured – Xi, calculated)2 / n ]1/2 (2)

The level of statistical significance was represented by *, ** and *** for P < 0.05, P < 0.01 and P < 0.001, respectively.

Figure 1. pH (a) and dissolved organic carbon (DOC) (b) concentration in the soil solution of planted (open symbols) and unplanted (closed symbols) soils as a function of the distance from the root mat surface. pH values (a) in planted soils were fitted to Nye’s equation (see discussion section for rationale).


180

II.3. Results

II.3.1. Changes in pH and DOC concentration

In unplanted devices, pH little varied throughout the whole soil cylinder, remaining equal to 4.66 ± 0.05 (Figure 1.a). In contrast, pH increased up to 7.5 at the surface of the root mat in planted devices. pH profile exhibited a linearly decreasing shape from the surface of the root mat. pH values in planted devices were equal to that in unplanted devices at about 6.8 mm from the surface of the root mat (Figure 1.a). In comparison with pH, DOC concentration did not show any significant difference between planted and unplanted devices (Figure 1.b). DOC concentration ranged between 6 to 12 mg C dm-3 without any significant spatial pattern.

II.3.2. Changes in free Cu2+ activity and total Cu concentration in soil solution

The profiles of free Cu2+ activity in soil solution showed a similar pattern as that of pH in planted and unplanted devices. Free Cu2+ activity, when expressed as pCu2+, little varied, remaining equal to 6.0 ± 0.1 in the soil cylinders of unplanted devices (Figure 2.a). In planted devices, pCu2+ amounted to 6.1 for a distance from the root mat surface larger than 6.9 mm and then linearly increased up to 9.4 at the root mat surface. pCu2+ was highly and positively correlated with pH with a slope of 1.24 ± 0.05 in planted devices (R² = 0.88*** , n = 24; Figure 3.a). Free Cu2+ concentration amounted to 93 ± 10 % of the total Cu concentration in soil solution in unplanted devices (Figure 3.b). In planted devices, the percentage of total Cu as free Cu2+ decreased with increasing pH according to a 3rd-order polynomial regression curve (R² = 0.99*** , n = 24) and ranged between 0.1 and 90 % (Figure 3.b). In unplanted devices, total Cu concentration in soil solution, when expressed as pCu, was equal to 5.8 ± 0.1 and was somewhat variable in the first 4.5 mm from the root mat surface (Figure 2.b). In planted devices, pCu increased up to 6.3 at the root mat surface and reached the pCu value measured in unplanted devices at a distance of 7.2 mm from the root mat surface. In planted devices, pCu was related to pH according to a 2nd-order polynomial regression curve (R² = 0.89*** , n = 24; Figure 3.c). Neither pCu2+, nor pCu were significantly correlated with DOC concentration in planted and unplanted devices.

II.3.3. Change in DGT-Cu flux in soil

The DGT-Cu flux, FDGT, ranged between 57 and 111 ng Cu m-2 s-1 with a mean value of 80 ± 18 ng Cu m-2 s-1 and did not exhibit any particular spatial pattern in unplanted devices (Figure 2.c). In planted devices, FDGT was close to values measured in unplanted devices at a distance greater than about 5 mm from the root mat surface. FDGT then decreased almost linearly from 5 mm to the first 3-mm from the root mat surface in which FDGT amounted to 27 ± 5 ng Cu m-2 s-1 (Figure 2.c). In this first 3-mm, FDGT was significantly lower than the mean FDGT in unplanted devices (P < 0.001) and was actually 2-fold lower than the minimal FDGT measured in unplanted devices (57 ng Cu m-2 s-1).


181

Figure 2. Free Cu2+ activity (pCu2+) (a), total Cu concentration in soil solution (pCu) (b) and DGT-Cu flux (FDGT, c) in planted (open symbols) and unplanted (closed symbols) soils as a function of the distance from the root mat surface. The diffusive gradient of Cu in the rhizosphere, as induced by plant Cu uptake (bold line, b) was calculated using the DIFS-1D model (see discussion section for rationale). Total Cu concentration in planted soils were fitted to a 3rd-order polynomial regression curve (solid line, b).


182

Figure 3. Free Cu2+ activity (pCu2+) (a), percentage of free Cu2+ (b) and total Cu concentration (pCu) (c) in the soil solution of planted (open symbols) and unplanted (closed symbols) soils as a function of soil solution pH. Data in planted soils were fitted to a 3rd- and a 2nd-order polynomial regression curve in (b) and (c), respectively.


183

II.4. Discussion

II.4.1. Copper availability as spatially affected by rhizosphere alkalisation

Among rhizosphere processes, root-induced pH change is recognised as one of the most striking phenomena, resulting in pH shifting by as much as one to two units in the rhizosphere (Marschner 1995; Hinsinger et al. 2003). In the present study, durum wheat root induced an alkalisation of up to +2.8 pH units (Figure 1.a), which is in close agreement with the alkalisation measured in the 1.5-mm soil layer in contact with the root mat of durum wheat exposed to the same soil (Bravin et al. 2008a, chapter 4.II). In field-grown plants including durum wheat, Bagayoko et al. (2000) and Michaud et al. (2007, chapter 2.I) noted alkalisation reaching +1 to +2 pH units. This major rhizosphere process is considered as a plant strategy to alleviate proton, aluminium and manganese toxicities as well as phosphorus deficiency which usually occurred in strongly acidic soils (Marschner 1991; Hinsinger et al. 2003; Kochian et al. 2004). Spatially resolved alkalisation in acidic soils was however seldom reported. Youssef and Chino (1989a) reported a rhizosphere alkalisation up to +2.3 pH units which extented up to 2-3 mm from the root mat surface in 8-week-old barley (Hordeum vulgare L.). In our experiment, rhizosphere alkalisation was significant as far as 5 to 6 mm from the root mat surface, underlying the considerable ability of durum wheat roots to alter soil pH (Figure 1.a). In contrast, DOC concentration did not vary between planted and unplanted soils (Figure 1.b). Although studies on DOC concentration in the rhizosphere of crop species remain scarce, our results differs from literature usually reporting on increased DOC concentration in the rhizosphere as related to root-induced exudation and microbial activity (Khalid et al. 2007; Cattani et al. 2006). However in our experimental conditions, a significant part of root apices, where exudation is usually maximal (Nguyen 2003), were located in the nutrient solution rather than in contact with the soil (Figure SI-2) which may explain why DOC concentration did not increase. The highly significant correlations found between pH and pCu2+ and pCu in the rhizosphere (Figure 3) suggest a control of Cu behaviour by the root-induced alkalisation. The depletion of metals in the rhizosphere is usually considered to be physically driven by root uptake of metals which would much exceed the ability of soil to supply free metals at the root surface by desorption from labile pools in soil solution and solid-phase as well as by diffusion through soil porosity (Barber 1995; Zhang et al. 2001). To assess the respective contributions of alkalisation and uptake in Cu depletion in the rhizosphere, we simulated the corresponding increase in pCu in planted soils (Figure 2.b) with the DIFS (DGT induced fluxes in sediments and soils) model (Harper et al. 2000), as formerly done by Lehto et al. (2006a and b) to account for plant uptake-driven metal depletion in the rhizosphere. The root mat-soil system can be characterised as for DGT by the concentration of metal at the root mat surface (C0 = 3.2 10-2 µg cm-3), which is therefore similar to the CDGT (Zhang et al. 2001):

C0 = CDGT = m ∆g / (Dg A t) (3)

where m is the mass of Cu taken up by plants during the 8-day soil stage (137 ± 17 µg), ∆g, the diffusive layer thickness (cm) of the corresponding DGT device which would mimic the plant uptake flux of Cu in our experiment, Dg, the diffusion coefficient (cm2 s-1) in the diffusive gel at 25°C, A, the root surface area in contact with soil (38.5 cm2) and t, the duration (s) of soil stage. According to equation (1) applied to the flux of Cu taken up by plants (FCu = 4.4 ± 0.6 10-6 µg cm-2 s-1), ∆g was calculated as follows:

∆g = C0 Dg / FCu ⇒ ∆g = 0.045 cm (4)


184

DIFS was then run to estimate the soil response time (Tc) using the input parameters given in table 1. The diffusive gradient of total Cu concentration in soil solution as estimated by DIFS is shown in Figure 2.b. This diffusive gradient was sharp but appeared dramatically limited in extent as pCu only increased in the first 0.5-mm close to the root mat surface, while measured pCu increased over more than 6 mm. The increase in pCu due to plant uptake represented only 5 % of the amount of Cu depleted in the rhizosphere in comparison with the curve fitted to experimental data (Figure 2.b). The spatial distribution of Cu was thus almost entirely determined by the root-induced alkalisation in the rhizosphere. This result contrasts with the conclusion of Zhang et al. (2001, 2004) and Lehto et al. (2006a and b) who suggested that metal bioavailability to plants was mainly restricted by the ability of soil to sustain metal concentration at the root surface. Puschenreiter et al. (2005) and Cattani et al. (2006) observed significant increases in Ni and Cu concentrations in soil solution close to the root mat surface which they attributed to root-induced chemical changes in the rhizosphere which remained to be elucidated. This further substantiates that the fate of metals in the rhizosphere could be controlled by a range of root-induced chemical changes rather than by diffusion, while our experiment identified root-induced alkalisation as the key process. As a consequence of rhizosphere alkalisation, free Cu2+ concentration decreased as much as three orders of magnitude at the root mat surface. Copper speciation in soil solution was also dramatically altered as the percentage of free Cu2+ sharply declined from 60-90 % in the bulk soil to less than 1 % close to the root surface (Figure 3.b). The ability of soil to re-supply Cu2+ in solution, as measured using by the DGT technique, decreased more than 2-fold in the close vicinity of the root mat surface. In conclusion, the actual exposure of plants to Cu at the root-soil interface was substantially diminished by the root-induced alkalisation of the rhizosphere and therefore appeared much lower than the exposure predicted on the basis of bulk soil chemistry in this strongly acidic, Cu-contaminated soil. This further confirms that rhizosphere alkalisation can reduce Cu bioavailability to plants (Chaignon et al. 2008; Bravin et al. 2008a, chapter 4.II). Table 1. Input parameters used for DIFS-1D modelling of the diffusive gradient of total Cu concentration in the soil solution of durum wheat rhizosphere

R 0.36 Response time, Tc s 30a

Distribution coefficient, Kdb cm3 g-1 2070

Particle concentration, Pcc g cm-3 3.98

Diffusion coefficient in gel 25 °C, Dgd 6.23 10-6

Diffusion coefficient in soil 25 °C, Dse cm2 s-1

2.29 10-6 Diffusive gel porosity, ϕg

f 0.95 Soil porosity, ϕs

g 0.4 Bulk-soil solution concentration, C∞ mol dm-3 1.4 10-6 DGT deployment-time, ∆t day 8 Diffusive layer thickness, ∆gh cm 0.045 a estimated parameter by running DIFS-1D b ratio of bulk-soil solution concentration (C∞) to total metal concentration in soil (184 mg kg-1) c calculated according to (Zhang et al. 2004) equation (4) d according to (Zhang 2000) e calculated according to (Fitz et al. 2003), equation (5) f according to (Harper et al. 2000) g calculated according to (Zhang et al. 2004), equation (5) h calculated from the flux of Cu in plant and the concentration at the root mat-soil interface (C0) (see discussion section for rationale)


185

II.4.2. Modelling pH and pCu2+ gradients around an individual cylindrical root

The experimental device employed here is a useful method to identify rhizosphere processes involved in metal bioavailability to plants. Root mat approach is however based on a planar geometry which modifies the extension of rhizosphere processes in comparison with the cylindrical geometry of the root-soil interface in real-world conditions (Kirk and Saleque 1995). To assess pH and pCu2+ changes in the rhizosphere of an individual cylindrical root, the experimental gradient of pH was firstly fitted using the equation of proton diffusion in soil (Kirk and Saleque 1995):

pHx = pH∞ + MH / (2 A ρ bH) (π / DH t)1/2 ƒ (5) ƒ = erfc(x / (2 (DH t)1/2)) (6)

where pHx and pH∞ are the pH at a distance x from the root mat surface and in the bulk soil (pH = 4.66), MH, the protons flux (-1.1 10-3 mol H+) from roots during soil stage, A, the root surface area in contact with soil (38.5 cm2), ρ, the bulk-soil density (1.71 ± 0.05 g cm-3), bH, the pH buffering capacity (mol H+ g-1 pH-1) of soil, DH, the proton diffusion coefficient (cm2 s-1) in soil and t, the duration (s) of soil stage. MH was calculated from the pH profiles in planted and unplanted soils, taking account of soil pH buffering capacity (Figure SI-1.a). The fitting curve was optimised by adjusting bH and DH to minimise the RMSR. bH was set at -20 10-6 mol H+ g-1 pH-1, which is in close agreement with bH values deduced from the titration curve of soil (Figure SI-1.b). DH was set at 1.1 10-7 cm2 s-1 in agreement with previous published data (Kim and Silk 1999). The fitting curve showed a good agreement with experimental data (R² = 0.95*** , n = 24; Figure 1.a), which enabled to adapt equation (6) to comply with the cylindrical geometry (Kirk and Saleque 1995):

x = r – a in equation (5) and ƒ = (a / r)1/2 erfc((r - a) / (2 (DH t)1/2)) (7)

where r is the radial distance (cm) from the root axis and a, the root radius (cm). Calculated pH profiles in the rhizosphere of an individual cylindrical root were thereby obtained (Figure 4). pCu2+ profiles were then deduced from the linear regression between pCu2+ and pH (Figure 3.a). According to the measurement of root parameters, root radius of durum wheat ranged between 0.05 to 1.5 mm with a mean value of 0.2 mm. Based on the model assumptions, pH and pCu2+ at the root surface were independent of root radius (Figure 4.a-b). However, the radial extension of pH and pCu2+ gradients increased from 1 to 4 mm around the root as root radius increased from 0.05 to 1.5 mm. At the scale of the whole root system, the depletion of available Cu in the rhizosphere would therefore increase from the small lateral roots to the thicker primary roots. In addition, the influence of a decreasing amount of OH- excreted per unit of root surface area and time, i.e. a decrease in OH- efflux from roots, was also investigated (Figure 4.c-d). This simulates the case of plant species with contrasting ability to alkalise their rhizosphere. When OH- efflux was 10-fold decreased, pH at the root surface decreased from 7.4 to 4.9 and root exposure to free Cu2+ consequently increased by three orders of magnitude (Figure 4.d).


186

Figure 4. Simulated pH and free Cu2+ activity as a function of the distance from the surface of a single root in cylindrical geometry. Root radius (a) was varied between 0.05 and 1.5 mm (a, c). The initial amount of OH- excreted by the root (a = 0.2 mm) over 8 days (MOH = 1.1 mM OH-) was divided by two and ten (b, d). Values in a and b stand for pH at the root surface. Root-induced alkalisation therefore decreased Cu availability in the rhizosphere over several millimetres around roots. To our knowledge, only one study previously reported a similar decrease in metal availability in the rhizosphere of barley due to alkalisation (Youssef and Chino 1989b), with a spatial approach as ours. This former work however did not distinguish between the uptake-driven and alkalisation-driven metal depletion and change in speciation as we did here. Our result could have important implications for the management of acidic, metal-contaminated soils. Enhancing the ability of agricultural plant species/cultivars to increase rhizosphere pH shall help decreasing metal bioavailability in strongly acidic soils. Furthermore, metals exhibit an important mobility in acidic soils which can lead to their considerable transfer to deeper soil layers and ultimately into groundwater (Arias et al. 2005; Mirlean et al. 2007). Rhizosphere alkalisation over several millimetres around roots in the top-soil where root density is the largest could therefore reduce metal leaching as well as metal availability for succeeding crops. A broader understanding of rhizosphere processes and


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especially of root-induced chemical changes for assessing bioavailability and managing phytoremediation of metal contaminated soils, as recently reviewed by Wenzel (2008), should thus deserve further attention. II.5. Acknowledgements

Ana Lara Martí and Michaël Clairotte are thanked for the technical support. Marie-Ange Cordier and Pierre Berthomieu are also acknowledged for providing free access to TOC-analyser and F-AAS, respectively. Financial support was provided by the PNETOX programme of the French Ministry of Ecology and Sustainable Development. II.6. Supporting Information

Soil pH buffering capacity (Figure SI-1, Comment SI-1) and experimental device (Figure SI-2) are presented in supporting information.

Figure SI-1. Titration curve (amount of added OH- versus soil pH) of the studied soil. Experimental data were fitted with a 4th-order polynomial regression curve (a) or two linear regression curves (b). Soil pH buffer capacity constants (bH) were deduced in b from the slope of each linear regression curve.


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Comment SI-1. The procedure followed to determine the soil pH buffering capacity was fully described by Bravin et al. (2008, chapter 3.III). Briefly, eleven amounts of lime (22.8 mmol OH- g-1 Ca(OH)2) from 0 to 89 µmol OH- g-1 dry soil were added to the soil previously incubated for 13 days with a nutrient solution (see material and methods section for composition). In order to apply the same amount of calcium (Ca) whatever the liming treatment, a CaCl2 solution of varying concentration was applied so as to reach an even application rate of Ca of 35.4 µmol g-1 in all soil samples and the water content was consequently raised to 100 % of the water-holding capacity. Thereafter, the soil samples were left to equilibrate for another 3 days. Soil solution was extracted (see material and methods section for rationale) by mixing soil with nutrient solution (soil:solution ratio 1:10 on a dry soil basis) in a end-over-end shaker for 2 h and then centrifuged at 10,000 g for 10 min before filtration (0.45 µm, acetate cellulose filter). Soil solution pH was measured with a combined glass-electrode (6.0234.110, Metrohm, Switzerland).

Figure SI-2. Experimental device for investigating chemical gradients in the rhizosphere.


189

II.7. Literature

AFNOR 1999 Recueil de normes françaises. Qualité des sols, Paris. Arias M, Pérez-Novo C, Osorio F, Lopez E and Soto B 2005 Adsorption and desorption of copper and zinc in

the surface layer of acid soils. J. Colloid Interface Sci. 288, 21-29. Bagayoko M, Alvey S, Neumann G and Buerkert A 2000 Root-induced increases in soil pH and nutrient


Barber S A 1995 Soil nutrient bioavailability: A mechanistic approach, 2nd Edition. Wiley-Interscience. 434 p. Bermond A, Varrault G, Sappin-Didier V and Mench M 2005 A kinetic approach to predict soil trace metal

bioavailability: preliminary results. Plant Soil 275, 21-29. Bravin M N, Lara Marti A, Clairotte M and Hinsinger P 2008b Rhizosphere alkalisation - a major driver of

copper bioavailability over a wide range of pH in an acidic, copper-contaminated soil. submitted to Plant Soil.

Bravin M N, Michaud A M, Larabi B and Hinsinger P 2008b Rhizotest: a plant-based biotest to account for rhizosphere processes for assessing metal bioavailability. submitted to Environ. Pollut.

Bravin M N, Travassac F, Le Floch M, Hinsinger P and Garnier J M 2008c Oxygen input controls the spatial and temporal dynamics of arsenic at the surface of a flooded paddy soil and in the rhizosphere of lowland rice (Oryza sativa L.): a microcosm study. Plant Soil DOI 10.1007/s11104-007-9532-x.


Chaignon V, Quesnoit M and Hinsinger P 2008 Rhizosphere pH, bioavailability and extractability of Cu in an acidic Cu-contaminated soil as affected by liming. Environ. Pollut. submitted.

Harmsen J, Rulkens W and Eijsackers H 2005 Bioavailability: concept for understanding or tool for prediciting? Land Contam. Recl. 13, 161-171.

Harper M P, Davison W and Tych W 2000 DIFS - a modelling and simulation tool for DGT induced trace metal remobilisation in sediments and soils. Environ. Model. Softw. 15, 55-66.

Hinsinger P and Gilkes R J 1995 Root-induced dissolution of phosphate rock in the rhizosphere of lupins grown in alkaline soil. Aust. J. Soil Res. 33, 477-489.


Hooda P S, Zhang H, Davison W and Edwards A C 1999 Measuring bioavailable trace metals by diffusive gradients in thin films (DGT): soil mosture effects on its performance in soils. Eur. J. Soil Sci. 50, 285-294.



Kim T K and Silk W K 1999 A mathematical model for pH patterns in the rhizospheres of growth zones. Plant Cell Environ. 22, 1527-1538.

Kirk G J D and Saleque M A 1995 Solubilization of phosphate by rice plants growing in reduced soil: prediction of the amount solubilized and the resultant increase in uptake. Eur. J. Soil Sci. 46, 247-255.

Kochian L V, Hoekenga O A and Pineros M A 2004 How do crop plants tolerate acid soils? Mechanisms of aluminium tolerance and phosphorus efficiency. Annu. Rev. Plant Biol. 55, 459-493.

Krishnamurti G S R and Naidu R 2002 Solid-solution speciation and phytoavailability of copper and zinc in soils. Environ. Sci. Technol. 36, 2645-2651.

Lehto N J, Davison W, Zhang H and Tych W 2006a Analysis of micro-nutrient behaviour in the rhizosphere using a DGT parameterised dynamic plant uptake model. Plant Soil 282, 227-238.

Lehto N J, Davison W, Zhang H and Tych W 2006b Theoretical comparison of how soil processes affect uptake of metals by diffusive gradients in thinfilms and plants. J. Environ. Qual. 35, 1903-1913.

Marschner H 1991 Mechanisms of adaptation of plants to acid soils. Plant Soil 134, 1-20. Marschner H 1995 Mineral nutrition of higher plants. Academic Press, London. 889 p. Michaud A M, Bravin M N, Galleguillos M and Hinsinger P 2007 Copper uptake and phytotoxicity as assessed


Mirlean N, Roisenberg A and Chies J O 2007 Metal contamination of vineyard soils in wet subtropics (southern Brazil). Environ. Pollut. 149, 10-17.

Nguyen C 2003 Rhizodeposition of organic C by plants: mechanisms and controls. Agronomie 23, 375-396. Oliver I W, Ma Y, Lombi E, Nolan A L and McLaughlin M J 2006 Stable isotope techniques for assessing labile

Cu in soils: Development of an L-value procedure, its application, and reconciliation with E values. Enviro. Sci. Technol. 40, 3342-3348.


190


Puschenreiter M, Schnepf A, Millan I M, Fitz W J, Horak O, Klepp J, Schrefl T, Lombi E and Wenzel W W 2005 Changes of Ni biogeochemistry in the rhizosphere of the hyperaccumulator Thlaspi goesingense. Plant Soil 271, 205-218.

Rachou J, Gagnon C and Sauvé S 2007 Use of an ion-selective electrode for free copper measurements in low salinity and low ionic strength matrices. Environ. Chem. 4, 90-97.


Sauvé S, Dumestre A, McBride M and Hendershot W 1998 Derivation of soil quality criteria using predicted chemical speciation of Pb2+ and Cu2+. Environ. Toxicol. Chem. 17, 1481-1489.

Sauvé S, Hendershot W and Allen H E 2000 Solid-solution partitioning of metals in contaminated soils: Dependence on pH, total metal burden, and organic matter. Environ. Sci. Technol. 34, 1125-1131.


Weng L P, Temminghoff E J M, Lofts S, Tipping E and Van Riemsdijk W H 2002 Complexation with dissolved organic matter and solubility control of heavy metals in a sandy soil. Environ. Sci. Technol. 36, 4804-4810.

Wenzel W W 2008 Rhizosphere processes and management in plant-assisted bioremediation (phytoremediation) of soils. Plant Soil DOI 10.1007/s11104-008-9686-1.

Youssef R A and Chino M 1989a Root-induced changes in the rhizosphere of plants. I. pH changes in relation to the bulk soil. Soil Sci. Plant Nutr. 35, 461-468.

Youssef R A and Chino M 1989b Root-induced changes in the rhizosphere of plants. II. Distribution of heavy metals across the rhizosphere in soils. Soil Sci. Plant Nutr. 35, 609-621.

Zhang H 2000 DGT - for measurements in waters, soils and sediments. Technical report, 52 p. Zhang H, Lombi E, Smolders E and McGrath S 2004 Kinetics of Zn release in soils and prediction of Zn

concentration in plants using diffusive gradients in thin. Environ. Sci. Technol. 38, 3608-3613. Zhang H, Zhao F J, Sun B, Davison W and McGrath S P 2001 A new method to measure effective soil solution

concentration predicts copper availability to plants. Environ. Sci. Technol. 35, 2602-2607.

Conclusion Générale

191

CONCLUSION GENERALE Vers une vision dynamique et intégrative des processus rhizosphériques impliqués dans le transfert sol-plante des métaux

A travers l’exemple de la culture du blé dur (Triticum turgidum durum L.) en sols à antécédent viticole, l’enjeu principal de mes travaux était d’évaluer la participation respective des différents processus rhizosphériques impliqués dans le déterminisme de la biodisponiblité du cuivre (Cu). Je me suis notamment intéressé à la limitation du flux de prélèvement de Cu par le blé dur en lien avec un flux de réapprovisionnement insuffisant de Cu en solution. Les résultats obtenus dans le chapitre 3 ont suggéré que le prélèvement racinaire de Cu est globalement faible et donc que le flux de réapprovisionnement de Cu en solution ne serait pas systématiquement limitant, en particulier dans les sols les plus contaminés. Cependant, les résultats les plus marquants, obtenus à la fois in situ et ex situ, ont concerné la mise en évidence de larges modifications de pH ainsi que de la concentration et des propriétés complexantes des matières organiques dissoutes (MOD) dans la rhizosphère. L’alcalinisation ainsi que les modifications quantitative et qualitative des MOD ont respectivement contribué à diminuer et augmenter la disponibilité de Cu dans la rhizosphère et, in fine, la biodisponiblité de Cu pour le blé dur. I. Biodisponibilité du cuivre pour le blé dur cultivé en sols à antécédent viticole Alors qu’il est couramment accepté que la biodisponibilité des métaux pour les plantes augmente quand le pH diminue (Lexmond 1980 ; Hough et al. 2005), les résultats obtenus in situ ont montré que la biodisponibilité n’était pas plus élevée dans les sols les plus acides, même lorsqu’ils étaient particulièrement contaminés et malgré des valeurs de pH très basses, jusque pHCaCl2 = 4,2 (chapitre 2.I). Au contraire, dans les racines, les concentrations en Cu les plus élevées ont été relevées chez les plantes cultivées en sols calcaires. Parallèlement aux mesures de concentration en Cu dans la plante, l’expérimentation in situ a permis de mettre en évidence des modifications chimiques importantes dans la rhizosphère. D’une part, une alcalinisation de près de 1 unité pH a été observée dans les sols les plus acides (pHCaCl2 < 5), provoquant une diminution de la disponibilité de Cu. Cette alcalinisation est également apparue négativement corrélée au pH du bulk soil, suggérant une régulation des modifications du pH dans la rhizosphère par la plante en fonction des conditions initiales de pH dans le sol. D’autre part, la disponibilité de Cu est apparue relativement importante dans la rhizosphère en sols calcaires contaminés, suggérant la mobilisation de Cu par des exsudats racinaires (chapitre 2.I). Dans le cas particulier des sols calcaires, les travaux de Chaignon et al. (2002) et Michaud (2007) ont suggéré une interaction entre la nutrition en fer (Fe) des graminées et la biodisponibilité de Cu par l’intermédiaire de l’exsudation des phytosidérophores. Dans la suite de mes travaux, je me suis cependant principalement concentré sur les sols acides à neutres, non calcaires. Les expérimentations menées ex situ à l’aide du biotest, que j’ai renommé RHIZOtest, ont permis de confirmer les hypothèses formulées à partir des résultats obtenus in situ quant au rôle majeur des modifications chimiques induites par les racines dans la rhizosphère sur la biodisponiblité de Cu pour le blé dur (chapitres 2.II et 4). Ces expérimentations en milieu contrôlé ont également permis de compléter les informations obtenues in situ, ainsi que


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d’étudier plus finement les conséquences de ces modifications chimiques sur la disponibilité de Cu dans la rhizosphère (chapitre 5.I). En sols très acides (pH < 5, Figure 1), la disponibilité de Cu est initialement très forte en lien avec la concentration élevée de Cu en solution qui est principalement sous forme de Cu2+ libre. En l’absence d’une alcalinisation extrêmement importante de la rhizosphère, la biodisponibilité de Cu est très élevée et Cu se retrouve principalement localisé dans le symplasme racinaire (chapitre 4.II). Cependant, le blé dur est capable d’induire une alcalinisation de la rhizosphère qui peut se traduire par un pH égal à environ 7 à la surface des racines (chapitre 5.II). Ce phénomène d’alcalinisation contrôle alors principalement l’exposition de la plante à Cu, en induisant une chute de l’activité de Cu2+ libre et de la capacité du sol à réapprovisionner la solution en Cu. Suite à l’alcalinisation, l’affinité de Cu pour l’apoplasme racinaire augmente mais la concentration de Cu dans le compartiment apoplasmique n’est pas plus forte qu’en l’absence d’alcalinisation de la rhizosphère du fait d’une plus faible disponibilité de Cu dans la rhizosphère. En fin de compte, l’absorption de Cu est fortement diminuée (Figure 1). L’alcalinisation de la rhizosphère apparaît donc comme le phénomène majeur régulant la biodisponibilité de Cu pour le blé dur dans les sols très acides (chapitre 4.II).

Figure 1. Processus rhizosphériques régulant la biodisponiblité du cuivre (Cu) à l’interface sol-racine pour le blé dur cultivé en sol très acide (pH < 5) contaminé en Cu. Explications dans le texte. En sols neutres (pH ≈ 7, Figure 2), la disponibilité de Cu est initialement faible, en lien avec une très faible activité de Cu2+ libre en solution. L’activité racinaire modifie peu le pH (∆pH ≤ 0,5) mais en revanche induit une augmentation significative de la concentration en MOD dans la rhizosphère (chapitre 4.II). L’origine de cette augmentation est généralement attribuée à l’exsudation racinaire. Les micro-organismes, dont l’activité est fortement augmentée dans la rhizosphère, participent probablement aussi à cette augmentation de la concentration en MOD. Quelle que soit son origine (racinaire ou microbienne), l’augmentation de la concentration en MOD diminue l’activité de Cu2+ libre mais augmente la concentration totale de Cu en solution dans la rhizosphère (chapitre 4.II). Parallèlement, les propriétés des MOD de la rhizosphère évoluent puisqu’elles semblent présenter une moins forte capacité de complexation vis-à-vis de Cu pour une quantité donnée de MOD, et les complexes qu’elles forment avec Cu sont plus labiles que dans le bulk soil (chapitre 5.II). De


193

même, la labilité de Cu, telle que mesurée avec la technique DGT (Diffusive Gradients in Thin films), est supérieure dans la rhizosphère par rapport au bulk soil. Ces résultats suggèrent une augmentation de la disponibilité de Cu dans la rhizosphère et, en conséquence, une augmentation de la biodisponbilité de Cu pour le blé dur, par rapport au cas d’une espèce végétale qui serait incapable de produire de telles modifications quantitative et qualitative des MOD (Figure 2). In fine, la disponibilité de Cu dans la rhizosphère du blé dur dans un sol très acide est similaire à la disponibilité de Cu dans la rhizosphère du blé dur dans un sol neutre à alcalin présentant un niveau équivalent de contamination. La biodisponibilité de Cu pour le blé dur ne serait donc pas dépendante du pH initial du sol, mais plutôt du niveau de contamination en Cu du sol tel que cela a été observé sur le terrain (chapitre 2.I) et également par divers autres auteurs chez d’autres espèces végétales (Chaignon et al. 2003 ; Nolan et al. 2005).

Figure 2. Processus rhizosphériques régulant la biodisponiblité du cuivre (Cu) à l’interface sol-racine pour le blé dur cultivé en sol neutre à alcalin (pH ≈ 7, non calcaire) contaminé en Cu. Explications dans le texte. D’un point de vue agronomique, ces résultats ont une conséquence importante du point de vue du risque associé à la culture du blé dur en sols à antécédent viticole dans le contexte languedocien, i.e. avec une large gamme de pH et un niveau modéré de contamination en Cu des sols. Dans les sols les plus acides, le phénomène d’alcalinisation semble prévenir l’apparition d’une biodisponibilité élevée et ses conséquences en terme de rhizotoxicité. Etant donné la faible dépendance de la biodisponibilité de Cu vis-à-vis du pH, les résultats obtenus suggèrent également un risque modéré de phytotoxicité due à Cu (rhizotoxicité et/ou chlorose ferrique) quel que soit le pH des sols dans la gamme acide à neutre. En revanche, les problèmes liés à une biodisponibilité excessive de Cu pour le blé dur seront vraisemblablement rencontrés très majoritairement dans les sols calcaires en lien avec un risque élevé d’apparition d’une chlorose ferrique (chapitre 2.I ; Michaud 2007).


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II. Perspectives pour une meilleure compréhension du transfert sol-plante des métaux Une des limites majeures de mes travaux est leur application à une seule espèce végétale, le blé dur, et un seul cultivar de cette espèce. Cependant, les résultats obtenus avec cette plante modèle semblent pouvoir déboucher sur un certain nombre de perspectives scientifiques en rapport avec les différents processus rhizosphériques impliqués dans le transfert sol-plante des métaux.

Figure 3. Schéma conceptuel de la biodisponibilité des métaux pour les plantes, adapté pour tenir compte des différents processus rhizosphériques présents à l’interface sol-racine (CBR = Critical Body Residue).


195

II.1. Prise en compte des modifications chimiques dans la rhizosphère

L’originalité majeure des résultats obtenus concerne la mise en évidence in situ et ex situ du rôle des modifications chimiques induites par les racines dans la rhizosphère sur la biodisponibilité de Cu. En terme d’évaluation de la biodisponiblité, cela suggère une redéfinition de la disponibilité des métaux dans la rhizosphère, i.e. disponibilité « bio-influencée », qui peut largement différer de celle qui est classiquement mesurée dans le bulk soil (Figure 3). L’alcalinisation de plus de 2,5 unités pH à la surface de la racine, dont l’amplitude a été reliée au pH initial du sol (chapitres 4.II et 5), apparaît comme l’une des modifications chimiques majeures observées dans la rhizosphère, d’autant que ce phénomène a déjà été observé pour d’autres espèces végétales (Youssef et Chino, 1989 ; Bagayoko et al. 2000 ; Chaignon et al. 2008). Pourtant, le(s) mécanisme(s) physiologique(s) expliquant la dépendance de l’ampleur de l’alcalinisation vis-à-vis du pH du sol est (sont) mal connu(s). Les variations de pH ne peuvent être uniquement dépendantes de la forme d’azote apportée puisque Chaignon et al. (2008) ont observé une acidification de la rhizosphère du colza pour des pH du bulk soil supérieurs à 4,8 et malgré la fourniture d’azote exclusivement sous la forme de NO3

-. L’alcalinisation en sols très acides pourrait être attribuée à un mécanisme induit de tolérance à la toxicité de l’aluminium (Al), comme Taylor et Foy (1985) puis Degenhardt et al. (1998) l’ont suggéré. Cependant, les risques de rhizotoxicité de Al disparaissent lorsque le pH du sol est supérieur à 5-5,5 (Marschner 1991). Ce mécanisme ne peut donc expliquer à lui seul l’alcalinisation observée dans la rhizosphère du blé dur jusqu’à des pH du sol de 7 environ (chapitre 4.II). Il semble plutôt que les modifications de pH dans la rhizosphère soient liées plus étroitement à la physiologie propre de chaque espèce, voire variété, et à leur capacité d’adaptation aux contraintes environnementales, i.e. « plasticité ». Un mécanisme physiologique qui, en ce sens, mériterait plus d’attention concerne des cinétiques différentes d’absorption de NH4

+ et NO3- par les racines observées chez différentes variétés de blé tendre

(Triticum aestivum L.) (Taylor et Foy 1985). En effet, certaines de ces variétés sont capables d’associer une faible cinétique de prélèvement de NH4

+ à une cinétique élevée de prélèvement de NO3

-, favorisant ainsi l’apparition d’une alcalinisation de la rhizosphère. Plus généralement, les différences de pH dans la rhizosphère de diverses espèces végétales semblent pouvoir être attribuées au bilans cations-anions échangés par les racines (Marschner 1995). Ce bilan cations-anions pourrait fort bien varier en fonction des conditions de pH du sol. D’autre part, l’évolution du pH rhizosphérique en fonction du pH du sol est actuellement décrite de manière empirique en reliant par exemple la variation de pH dans la rhizosphère au pH du bulk soil (chapitre 2.I, II et 4.II). Il serait cependant nécessaire de décrire ce processus rhizosphérique par une fonction mathématique à base mécaniste, comme cela est fait pour l’absorption des ions au niveau racinaire (cinétique michaelienne), de manière à pouvoir l’intégrer dans des modèles mécanistes de transfert sol-plante. Parallèlement aux modifications de pH, les racines ont également induit des modifications de concentration et des propriétés des MOD dans la rhizosphère (chapitres 4.II et 5.I). L’augmentation de la concentration en MOD dans la rhizosphère a notamment permis de diminuer l’activité de Cu2+ libre en solution. En sols très acides, l’exsudation d’anions organiques, et notamment du malate dans le cas du blé tendre (Triticum aestivum L.), a été proposée comme une stratégie permettant à la plante de limiter la rhizotoxicité de Al en diminuant l’activité de Al3+ dans l’apoplasme racinaire par un phénomène de complexation (Ryan et al. 2001). Cela suggère que l’alcalinisation et l’exsudation de ligands organiques induites par les racines dans la rhizosphère pourraient participer de manière synergique à la diminution de la biodisponbilité de Al3+ et Cu2+, notamment dans les sols très acides.


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Pourtant, ces deux processus rhizosphériques ont toujours été étudiés séparément. Une perspective intéressante à mes travaux pourrait donc être le couplage de ces deux processus rhizosphériques à l’aide de la modélisation numérique, de manière à étudier leurs effets respectifs sur la biodisponibilité des cations métalliques pour les plantes en sols très acides. Les problèmes de phytotoxicité des cations métalliques étant principalement liés à leur rhizotoxicité dans les sols très acides, le système sol plante pourrait être réduit à l’interface sol-solution-apoplasme racinaire. Dans un premier temps, le système serait considéré à l’équilibre (simulations en batch). La question centrale résiderait dans la sélection des exsudats racinaires à prendre en considération (anions organiques, composés phénoliques, phytosidérophores…), de leur constante de stabilité avec les métaux et des constantes de stabilité pour l’adsorption des métaux dans l’apoplasme. L’étape de modélisation consisterait ensuite à simuler l’adsorption des métaux sur l’apoplasme en tenant compte de différents scenarii : e.g. pas d’alcalinisation et pas d’exsudation, alcalinisation mais pas d’exsudation, pas d’alcalinisation mais exsudation, ainsi qu’alcalinisation et exsudation simultanée. Cette étude permettrait d’estimer l’importance respective de ces deux processus rhizosphériques sur la biodisponibilité des métaux et le risque de rhizotoxicité. D’autre part, les flux de prélèvement de Cu par la plante n’ont pas pu être clairement reliés à un indicateur de la disponibilité de Cu dans le sol, même lorsque les modifications chimiques induites par les racines dans la rhizosphère ont été prises en compte. Cette conclusion peut être en partie expliquée par le fait que les flux de prélèvement ont été comparés aux mesures de disponibilité Cu réalisées en fin d’expérimentation uniquement. Ces mesures de disponibilité représentent donc uniquement l’état final du système et sont en aucun cas capables de rendre compte de l’évolution temporelle de la physico-chimie dans la rhizosphère. En revanche, le flux de prélèvement de Cu par le blé dur a certainement fortement évolué au cours du contact sol-plante en lien notamment avec la diminution de l’activité de Cu2+ libre en solution suite au phénomène d’alcalinisation. L’évolution temporelle de la disponibilité des métaux dans la rhizosphère mériterait donc d’être évaluée dans le but de pouvoir la relier à la biodisponibilité du métal pour la plante. II.2. Caractérisation fonctionnelle du prélèvement des métaux par les plantes

Bien qu’il soit influencé par la spéciation du métal en solution et donc par les modifications chimiques induites par les racines dans la rhizosphère, le prélèvement des métaux par les plantes joue un rôle central puisqu’il détermine la biodisponibilité des métaux. Sa caractérisation, notamment du point de vue fonctionnel est donc indispensable. L’intérêt plus récent pour les métaux et des difficultés expérimentales sont à l’origine d’une moins bonne caractérisation du flux de prélèvement des métaux par les plantes à l’échelle de la plante entière, comparativement au cas des nutriments majeurs. Dans le cadre de mes travaux, nous avons déterminé des paramètres cinétiques de prélèvement de Cu par le blé dur exposé à des activités de Cu2+ libre pertinentes d’un point de vue environnemental (chapitre 3). Cette expérimentation a confirmé l’hypothèse d’un prélèvement particulièrement faible de Cu par le blé dur, en comparaison avec d’autres oligo-éléments comme le zinc (Zn) par exemple (Hart et al. 2002). Ces auteurs ont en effet trouvé un Fmax pour Zn près de 9 fois supérieur à celui obtenu pour Cu. D’autre part, mes travaux ont également montré la nécessité de prendre en compte la part du flux de prélèvement de Cu due à son adsorption dans l’apoplasme racinaire. En effet, la prise en compte du compartiment apoplasmique dans le flux de prélèvement a induit une augmentation d’un facteur 2 du Fmax et une diminution d’un facteur 3 du KM, i.e. une augmentation de l’affinité de Cu vis-à-vis de la racine (chapitre 3). Il est donc indispensable que les modèles simulant le transfert sol-plante des métaux soient


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alimentés avec des paramètres cinétiques tenant compte du flux d’adsorption dans l’apoplasme racinaire. Cependant, les paramètres cinétiques déterminés dans le cadre de mes travaux doivent être extrapolés avec prudence. En effet, ils sont dépendants, d’une part, de la plante (e.g. espèce, variété, âge de la plante…) (Chen et al. 2008) et, d’autre part, des conditions physico-chimiques de la solution (pH, force ionique et ligands organiques utilisés pour tamponner l’activité du métal libre en solution) (Reid et Liu 2004 ; Degryse et al. 2006b). Pour contraindre la variabilité biologique, seule la multiplication des expérimentations, avec différentes espèces par exemple, peut permettre de connaître leur influence sur l’amplitude de variation des paramètres cinétiques estimés. En revanche, la variabilité physico-chimique de la solution à laquelle les racines sont exposées peut être intégrée en modifiant le formalisme avec lequel est décrit le prélèvement des métaux par les plantes (Figure 3). Premièrement, l’adsorption des métaux dans l’apoplasme devrait être déterminée en fonction de la force ionique et du pH de la solution. Kinraide et al. (2004) et Yermiyahu et Kinraide (2005) ont décrit le formalisme permettant de calculer l’activité de métal libre à la surface des membranes plasmiques en tenant compte des propriétés physico-chimiques de la solution. Ensuite, l’influx de métal libre dans le symplasme racinaire pourra être exprimé en fonction de l’activité de métal libre à la surface des membranes plasmiques. Zhang et al. (2001) et Reid et Liu (2004) ont ainsi montré que l’influx de cobalt et de nickel, mesuré dans des conditions de force ionique et de pH variées, pouvait être décrit par une cinétique michaelienne lorsqu’il était exprimé en fonction de l’activité de métal libre à la surface des membranes plasmiques. La modélisation du transfert sol-plante des métaux devrait également faire appel à ce formalisme de manière à utiliser des paramètres plus génériques. II.3. Caractérisation du réapprovisionnement du métal libre en solution

Une fois que les propriétés physico-chimiques de la rhizosphère ont été définies, que le flux de prélèvement du métal par la plante est estimé tel que nous venons de le voir, la question centrale est alors de savoir si le transfert sol-plante des métaux est gouverné par les équilibres chimiques ou par le réapprovisionnement limitant du métal libre en solution à la surface de la racine. Dans le premier cas, la biodisponibilité pourra alors être étudiée à l’aide de modèles de spéciation (Weng et al. 2002) et de modèles conceptuels tels que le Terrestrial Biotic Ligand Model (TBLM) (Thakali et al. 2006). Dans le deuxième cas, la description de l’évolution du métal libre à la surface de la racine est plus complexe et nécessite notamment de connaître les cinétiques de désorption et de dissociation des formes adsorbées et complexées des métaux dans le sol (Zhang et al. 2001 ; Degryse et al. 2008). Dans un premier temps, il semble donc important d’être capable de déterminer simplement les conditions favorables à chacun des cas. Dans le cadre de mes travaux (chapitre 3), j’ai comparé le flux théorique de prélèvement de Cu par la plante, dont le calcul était fondé sur les paramètres cinétiques de prélèvement et l’activité de Cu2+ libre dans la solution du sol, à la capacité du sol à réapprovisionner Cu en solution sous l’effet d’un puits, estimée à partir de mesures DGT. Cette expérimentation a suggéré que le réapprovisionnement de Cu en solution par le sol n’était pas systématiquement limitant, en particulier dans les sols les plus contaminés. Cependant, cette comparaison entre flux de prélèvement et flux de réapprovisionnement n’est rigoureusement juste que si le flux de réapprovisionnement de Cu vers la résine DGT n’engendre pas de diminution de la concentration de Cu en solution à l’interface sol-DGT. Cette hypothèse n’a pas été vérifiée dans l’expérimentation du chapitre 3, la comparaison ne donnant donc au mieux qu’une indication sur une limitation potentielle du réapprovisionnement. Zhang et al. (1998) ont montré qu’il était possible d’estimer à l’issue des mesures en DGT la concentration de Cu en solution à l’interface sol-DGT, i.e. CDGT. En comparant cette mesure à la concentration de Cu


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en solution dans le bulk soil, il est donc possible de savoir si un appauvrissement de Cu en solution a eu lieu à l’interface sol-DGT. Pour un type de résine donné, le flux de Cu vers la résine DGT dépend directement de l’épaisseur de la couche de diffusion séparant la résine du sol (Zhang et al. 1998 ; Lehto et al. 2006). En comparant la valeur de CDGT à la concentration de Cu en solution dans le bulk soil pour différentes épaisseurs de la couche de diffusion, il est donc possible de connaître le flux maximal de réapprovisionnement de Cu en solution (FSmax) que le sol est capable de fournir sans qu’il y ait d’appauvrissement de Cu en solution à l’interface sol-DGT. L’existence d’une limitation du réapprovisionnement peut alors être déterminée en comparant FSmax estimé pour chacun des sols au flux théorique de la plante (Fplt) estimé dans chaque sol à partir de l’activité du métal libre en solution : le flux de réapprovisionnement est limitant si Fplt > FSmax. Dans les cas où ce flux apparaît limitant, il sera nécessaire de mieux caractériser le réapprovisionnement. Dans l’idéal, ces mesures de DGT devraient être réalisées sur la rhizosphère, obtenues par exemple à l’aide de culture en RHIZOtest, pour tenir compte de la physico-chimie réelle à l’interface sol-racine (chapitre 5.I). La méthode DGT présente un certain nombre d’avantages pour l’évaluation du flux de réapprovisionnement des métaux en solution à la surface de la racine : (i) elle permet l’intégration de la labilité des complexes de Cu en solution et du métal en phase solide ainsi que des phénomènes de diffusion à travers la porosité du sol, (ii) elle mesure le réapprovisionnement par application d’un effet puits, (iii) elle peut être utilisée in situ, (iv) elle caractérise le flux de réapprovisionnement à la fois sous la forme d’une constante d’équilibre correspondant au coefficient de partitionnement solide-solution du métal labile, i.e. Kdl, et d’une constante cinétique correspondant au temps de réponse du sol, i.e. Tc. Cependant, la méthode DGT présente également un certain nombre de limites et en particulier : (i) elle doit être utilisée sur un sol humecté entre 80 et > 100 % de sa capacité de rétention en eau, (ii) elle ne tient pas compte de la participation de l’advection au flux de métal, tel qu’il intervient dans la rhizosphère en conséquence de l’absorption d’eau par la racine. D’autres auteurs se sont intéressés plus particulièrement à la caractérisation des complexes labiles des métaux en solution (Degryse et al. 2006a ; Degryse et al. 2008 ; Dessureault-Rompré et al. 2008). Dans mon travail, les mesures voltammétriques réalisées sur des extraits de solutions dans la rhizosphère et le bulk soil ont pu être corrélées au flux de Cu mesuré en DGT (chapitre 5.I). Ces résultats suggèrent un rôle majeur des complexes de Cu en solution sur la labilité globale de Cu dans le sol et justifient donc l’attention qui est portée à la labilité de ces complexes. De nombreuses techniques ont été développées pour estimer la labilité des métaux en milieux aquatiques, y compris pour des mesures in situ (van Leeuwen et al. 2005 ; Sigg et al. 2006). En revanche, peu de ces techniques ont été appliquées à la solution du sol, en particulier dans la rhizosphère. Cela est principalement dû à la difficulté d’accéder à la solution du sol, en particulier dans la rhizosphère. Dans mes travaux, j’ai fait le choix de collecter la solution du sol à l’aide d’une extraction réalisée sur sol frais avec une solution saline non tamponnée dont la composition était a priori très proche de celle de la solution du sol (chapitres 4.II et 5). Malgré la cohérence des résultats, cette méthode présente notamment le désavantage de diminuer la concentration en MOD dont le rôle dans la spéciation des métaux et en particulier de Cu est primordial (Amery et al. 2007). La meilleure solution actuellement préconisée est l’extraction de la solution du sol à l’aide de micro-préleveur de


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type rhizon® (Cornu et al. 2007 ; Bravin et al. 2008). Cependant, cette technique nécessite le développement de techniques de spéciation miniaturisées adaptées aux petits volumes et limite donc la possibilité de comparer différentes techniques de spéciation sur un même échantillon, comme cela a pu être réalisé dans le cadre de mes travaux (chapitre 5.I). Malgré les biais inhérents aux techniques d’échantillonnage, mes travaux ont mis en évidence que la modification des MOD induites par les racines dans la rhizosphère du blé dur a provoqué une augmentation de la concentration de Cu en solution et de la labilité des complexes organiques de Cu. Une perspective intéressante serait de coupler ces modifications des propriétés complexantes des MOD vis-à-vis des métaux à la caractérisation de la nature des MOD dans la rhizosphère (Dudal et Gérard 2004). Cette approche pourrait notamment permettre de répondre à la question formulée dans le chapitre 5.I, concernant l’origine de la baisse de réactivité des MOD dans la rhizosphère. Cette dernière est-elle due à une nature différente des MOD dans la rhizosphère liées à l’exsudation par les racines de composés organiques présentant des propriétés de complexation singulières ou plutôt à la déstabilisation de la structure moléculaire des substances humiques par la présence d’anions organiques exsudés par les racines comme cela a été suggéré par Piccolo et al. (2003) ?


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III. Potentialités et limites du RHIZOtest comme outil opérationnel d’évaluation de la biodisponibilité des métaux pour les plantes Le transfert sol-plante des métaux est sous la dépendance de nombreux processus : le réapprovisionnement par le sol du métal en solution, l’adsorption du métal dans l’apoplasme racinaire, l’absorption du métal par la plante ou encore les modifications chimiques induites par les racines dans la rhizosphère (Figure 3). Un outil opérationnel d’évaluation de la biodisponibilité, environnementale ou toxicologique, doit être en mesure d’intégrer l’ensemble de ces processus tout en étant le plus simple possible dans son utilisation. L’utilisation du RHIZOtest est fondée sur l’idée que seule une plante est capable d’intégrer l’ensemble des processus impliqués dans le déterminisme de la biodisponiblité des métaux pour les plantes. Le RHIZOtest présente une géométrie simple qui permet l’évaluation de la biodisponibilité environnementale en terme de flux, prenant en compte explicitement le temps d’exposition. Le protocole de culture, fondé sur l’apport des éléments majeurs par l’intermédiaire d’une solution nutritive, permet d’assurer une nutrition similaire entre les différents sols et donc d’évaluer principalement l’effet de l’exposition de la plante aux métaux. Sa taille réduite laisse la possibilité de multiplier les modalités (types de sols, apports d’amendements…) en plus des répétitions. Par rapport aux autres tests biologiques sur plante entière, le RHIZOtest permet une collecte facilitée et propre de l’ensemble du système racinaire du fait de la séparation physique des racines et du sol. Cependant, une contamination des racines par des particules de sol de diamètre inférieure à 30 µm ne peut pas être complètement exclue malgré le rinçage des racines lors de la récolte. La vraisemblance d’une telle contamination des racines pourrait être testée en insérant un membrane filtrante (diamètre de pore ≈ 0,45 µm) entre la toile en polyamide et la couche de sol, comme cela est utilisé dans les dispositifs DGT par exemple, et en comparant les concentrations en métaux dans les racines avec celles mesurées dans les racines de dispositifs classiques. Le protocole de mesure actuellement utilisé, i.e. 8 jours de contact sol-plante, ne permet pas de mettre clairement en évidence de symptômes de phytotoxicité imputables aux métaux. En allongeant la durée de contact avec le sol, il devrait être possible de mesurer des phénomènes de phytotoxicité. De plus, il est également envisageable de réaliser des tests biochimiques sur les tissus végétaux de manière à déceler précocément des effets phytotoxiques subléthaux non perceptibles à l’échelle de la plante entière. Cependant, la géométrie en tapis du système racinaire pourrait aussi expliquer en partie les faibles concentrations mesurées dans les parties racinaires des plantes cultivées en RHIZOtest. Il est en effet possible que les racines au contact du sol présentent des concentrations en Cu beaucoup plus élevées que les racines situées au niveau de la partie supérieure du tapis racinaire, dont l’épaisseur (environ 1 cm) représente plusieurs couches de racines dans le cas du blé dur à l’issue du RHIZOtest. Pour vérifier cette hypothèse, le tapis racinaire pourrait être découpé en tranches parallèles à sa surface de contact avec le sol, pour ensuite comparer les concentrations en Cu dans chacune des tranches. Dans sa conception, le RHIZOtest se présente comme un outil permettant de reproduire l’effet moyen d’un système racinaire, dont l’ensemble des racines participerait de la même manière aux modifications chimiques de la rhizosphère ou au prélèvement des métaux. Pourtant, il est clairement reconnu que les activités racinaires peuvent être très différentes d’une portion du


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système racinaire à une autre, e.g. l’exsudation d’anions organiques en réponse à une toxicité de Al qui se localise essentiellement au niveau de la zone apicale (Ryan et al. 2001). Enfin, le RHIZOtest semble également pourvoir s’adapter à de nombreuses espèces cultivées (Chaignon 2001) ainsi qu’à différents types de contaminations métalliques des sols puisqu’il a déjà été utilisé pour évaluer la biodisponibilité de nombreux métaux, e.g. Al (Calba et al. 2004), Cu (Chaignon 2001 ; Chaignon et al. 2003 ; Michaud 2007), le césium (Cs) (Guivarch et al. 1999 ; Delvaux et al. 2000 ; Kruyts et al. 2000 et 2004), le plomb (Pb) (Uzu et Dumat 2008), le nickel (Ni) (Pinel et al. 2003), Zn (Loosemore et al. 2004) et le zirconium (Zr) (Ferrand et al. 2006).


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Bibliographie Amery F, Degryse F, Degeling W, Smolders E and Merckx R 2007 The copper-mobilizing-potential of dissolved

organic matter in soils varies 10-fold depending on soil incubation and extraction procedures. Environmental Science & Technology 41, 2277-2281.

Bagayoko M, Alvey S, Neumann G and Buerkert A 2000 Root-induced increases in soil pH and nutrient availability to field-grown cereals and legumes on acid sandy soils of Sudano-Sahelien West Africa. Plant and Soil 225, 117-127.

Bravin M N, Travassac F, Le Floch M, Hinsinger P and Garnier J M 2008e Oxygen input controls the spatial and temporal dynamics of arsenic at the surface of a flooded paddy soil and in the rhizosphere of lowland rice (Oryza sativa L.): a microcosm study. Plant Soil DOI 10.1007/s11104-007-9532-x.

Calba H, Firdaus, Cazevieille P, Thée C, Poss R and Jaillard B 2004 The dynamics of protons, aluminium and calcium in the rhizosphere of maize cultivated in tropical acid soils: experimental study and modelling. Plant and Soil 260, 33-46.


Chaignon V, Di Malta D and Hinsinger P 2002 Fe-deficiency increases Cu acquisition by wheat cropped in a Cu-contaminated vineyard soil. New Phytologist 154, 121-130.


Chaignon V, Sanchez-Neira I, Herrmann P, Jaillard B and Hinsinger P 2003 Copper bioavailability and extractability as related to chemical properties of contaminated soils from a vine-growing area. Environmental Pollution 123.

Chen W, Li L, Chang A C, Wu L, Kwon S I and Bottoms R 2008 Modeling uptake kinetics of cadmium by field-grown lettuce. Environmental Pollution 152, 147-152.


Degenhardt J, Larsen P B, Howell S H and Kochian L V 1998 Aluminium resistance in the Arabidopsis mutant alr-104 is caused by an aluminium-induced increase in rhizosphere pH. Plant Physiology 117, 19-27.

Degryse F, Smolders E and Merckx R 2006a Labile Cd complexes increase Cd availability to plants. Environmental Science & Technology 40, 830-836.

Degryse F, Smolders E and Parker D R 2006b Metal complexes increase uptake of Zn and Cu by plants: implications for uptake and deficiency studies in chelator-buffered solutions. Plant and Soil 289, 171-185.

Degryse F, Verma V K and Smolders E 2008 Mobilization of Cu and Zn by root exudates of dicotyledonous plants in resin-buffered solutions and in soil. Plant and Soil 306, 69-84.

Delvaux B, Kruyts N, Cremers A (2000) Rhizospheric mobilization of radiocesium in soils. Environ. Sci. Technol. 34 : 1489-1493.

Dessureault-Rompré J, Nowack B, Schulin R, Tercier-Waeber M L and Luster J 2008 Mobilization and complexation of Zn and Cd in the rhizosphere of Thlaspi caerulescens. In Eurosoil 2008 - Book of abstracts, Eds W H Blum, G M H. and M Vodrazka. pp 131-132, Vienna.

Dudal Y and Gérard F 2004 Accounting for natural organic matter in aqueous chemical equilibrium models: a review of the theories and applications. Earth-Science Reviews 66, 199-216.

Ferrand E, Dumat C, Leclerc-Cessac E, Benedetti MF (2006) Phytoavailability of zirconium in relation to its initial added form and soil characteristics. Plant Soil 287: 313-325.

Guivarch A, Hinsinger P and Staunton S 1999 Root uptake and distribution of radiocesium from contaminated soil and the enhancement fo Cs adsorption in the rhizosphere. Plant and Soil 211, 131-138.

Hart J J, Welch R M, Norwell W A and Kochian L V 2002 Transport interactions between cadmium and zinc in roots of bread and durum wheat seedlings. Physiologia Plantarum 116, 73-78.


Kinraide T B, Pedler J F and Parker D R 2004 Relative effectiveness of calcium and magnesium in the alleviation of rhizotoxicity in wheat induced by copper, zinc, aluminium, sodium and low pH. Plant and Soil 259, 201-208.

Kruyts N, Thiry Y, Delvaux B (2000) Respective horizon contributions to cesium-137 soil-to-plant transfer: A rhizospheric experimental approach. J. Environ. Qual. 29 : 1180-1185.

Kruyts N, Titeux H, Delvaux B (2004) Mobility of radiocesium in three distinct forest floors. Sci. Tot. Environ. 319 : 241-252.

Lehto N J, Davison W, Zhang H and Tych W 2006 Theorical comparison of how soil processes affect uptake of metals by diffusive gradients in thinfilms and plants. Journal of Environmental Quality 35, 1903-1913.


203


Loosemore N, Straczek A, Hinsinger P and Jaillard B 2004 Zinc mobilisation from a contaminated soil by three genotypes of tobacco as affected by soil and rhizosphere pH. Plant and Soil 260, 19-32.

Marschner H 1991 Mechanisms of adaptation of plants to acid soils. Plant and Soil 134, 1-20. Marschner H 1995 Mineral nutrition of higher plants. Academic Press, London. 889 p. Michaud A M 2007 Interaction entre biodisponibilité, phytotoxicité du cuivre et nutrition en fer de graminées -

mécanismes physiologiques et rhizosphériques. In Science du sol. pp 191. Montpellier SupAgro, Montpellier.

Nolan A L, Zhang H and McLaughlin M J 2005 Prediction of zinc, cadmium, lead, and copper availability to wheat in contaminated soils using chemical speciation, diffusive gradients in thin films, extraction, and isotopic dilution techniques. Journal of Environmental Quality 34, 496-507.

Piccolo A, Conte P, Spaccini R and Chiarella M 2003 Effects of some dicarboxylic acids on the association of dissolved humic substances. Biology and Fertility of Soils 37, 255-259.

Pinel F, Leclerc-Cessac E, Staunton S (2003) Relative contributions of soil chemistry, plant physiology and rhizosphere induced changes in speciation on Ni accumulation in plant shoots. Plant Soil 255 : 619-629.

Reid R and Liu J 2004 Measurement of trace metal influx in plants: a case study with Co. Functional Plant Biology 31, 941-947.

Ryan P R, Delhaize E and Jones D L 2001 Function and mechanism of organic anion exudation from plant roots. Annual Review of Plant Biology and Plant Molecular Biology 52, 527-560.

Sigg L, Black F, Buffle J, Cao J, Cleven R, Davison W, Galceran J, Gunkel P, Kalis E, Kistler D, Martin M, Noël S, Nur Y, Odzak N, Puy J, Van Riemsdijk W H, Temminghoff E J M, Tercier-Waeber M L, Toepperwien S, Town R M, Unsworth E, Warnken K W, Weng L, Xue H and Zhang H 2006 Comparison of analytical techniques for dynamic trace metal speciation in natural freshwaters. Environmental Science & Technology 40, 1934-1941.

Taylor G J and Foy C D 1985 Mechanisms of aluminium tolerance in Triticum aestivum (wheat). IV. The role of ammonium and nitrate nutrition. Canadian Journal of Botany 63, 2181-2186.

Thakali S, Allen H E, Di Toro D M, Ponizovsky A A, Rooney C P, Zhao F J and McGrath S P 2006 A Terrestrial Biotic Ligand Model. 1. Development and application to Cu and Ni toxicities to barley root elongation in soils. Environmental Science & Technology 40, 7085-7093.

Uzu G, Dumat C (2008) Study of lead phytoavailability for atmospheric industrial micronic and submicronic particles in relation with lead speciation. Environ. Poll. (in press)

van Leeuwen H P, Town R M, Buffle J, Cleven R F M, Davison W, Puy J, van Riemsdijk W H and Sigg L 2005 Dynamic speciation analysis and bioavailability of metals in aquatic systems. Environmental Science & Technology 30, 8545-8556.

Weng L P, Temminghoff E J M, Lofts S, Tipping E and Van Riemsdijk W H 2002 Complexation with dissolved organic matter and solubility control of heavy metals in a sandy soil. Environmental Science & Technology 36, 4804-4810.

Yermiyahu U and Kinraide T B 2005 Binding and electrostatic attraction of trace elements to plant root surfaces. In Biogeochemistry of trace elements in the rhizosphere, Eds P M Huang and G R Gobran. pp 365-389. Elsevier, Amsterdam.

Youssef R A and Chino M 1989 Root-induced changes in the rhizosphere of plants. I. pH changes in relation to the bulk soil. Soil Science and Plant Nutrition 35, 461-468.

Zhang H, Davison W, Knight B and McGrath S 1998 In situ measurements of solution concentrations and fluxes of trace metals in soils using DGT. Environmental Science & Technology 32, 704-710.

Zhang H, Zhao F J, Sun B, Davison W and McGrath S P 2001a A new method to measure effective soil solution concentration predicts copper availability to plants. Environmental Science & Technology 35, 2602-2607.

Zhang Q, Smith F, Sekimoto H and Reid R 2001b Effect of membrane surface charge on nickel uptake by purified mung bean root protoplasts. Planta 213, 788-793.

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ANNEXE Nouveau Chapitre de la Thèse®

Valorisation des compétences des docteurs «un nouveau chapitre de la thèse ®»

Matthieu BRAVIN

Exposition au cuivre du blé dur

cultivé en sols à antécédent viticole– De l’approfondissement des connaissances

à la validation d’un outil de diagnostic –

Sujet académique de la thèse : Spéciation, mobilité chimique, disponibilité et biodisponibilité du cuivrepour le blé dur cultivé en sols à antécédent viticole

Nom du directeur de thèse : Philippe Hinsinger

Date probable de soutenance de la thèse : Fin octobre 2008

Date de la présentation orale du « NCT » : 4 juillet 2008

Ecole doctorale : Systèmes Intégrés en Biologie, Agronomie, Géosciences, Hydrosciences,Environnement

Organisme de rattachement : Montpellier SupAgro, INRA

"Mentor" : Corine Navarro

SOMMAIRE

I. MA THESE DANS SON CONTEXTE : PROBLEMATIQUE ET ENJEUX 4

1. PROBLEMATIQUE DE LA CONTAMINATION DES SOLS PAR LES METAUX 4

a. Enjeux global 4

b. Enjeux particuliers de la thèse 4

2. LE SYSTEME DE RECHERCHE ENVIRONNANT MA THESE 7

a. Mon laboratoire et son approche scientifique 7

b. Concurrence autour de ma problématique 7

c. Réseaux de travail et collaborations 9

3. MON CHOIX DE FAIRE UNE THESE 9

II. GESTION DU PROJET DE THESE 10

1. ORIGINE ET CADRAGE 10

a. Origine de la thématique 10

b. Financements 10

c. Partenaires impliqués 11

d. Programmation initiale 11

e. Résultats attendus 11

f. Facteurs de risques 12

2. SES DIFFERENTES ETAPES 12

a. 1ère étape : Du terrain aux outils de laboratoire 13

b. 2ème étape : Détermination de la question de recherche 15

c. 3ème étape : Approfondissement de la problématique scientifique 16

d. 4ème étape : Synthèses et évaluations 18

3. COUT FINANCIER 19

4. BILAN 21

a. Résultats attendus et obtenus 21

b. Résultats obtenus et coût financier : notions de rentabilité 21

III. COMPETENCES PERSONNELLES ET PROFESSIONNELLES : QUELLE TRANSFERABILITE ? 23

1. COMPETENCES PERSONNELLES 23

2. COMPETENCES TECHNIQUES 23

3. COMPETENCES EN GESTION DE PROJET 24

IV. PROJETS PROFESSIONNELS POST-DOCTORAT 25

1. PROJET PROFESSIONNEL DANS LA RECHERCHE ACADEMIQUE 25

2. PROJET PROFESSIONNEL DANS LE SECTEUR PRIVE 25

2

TABLE DES ILLUSTRATIONS

Figure 1. Problématique (a) et contexte agricole (b) de la thèse 6

Figure 2. Structure et fonctionnement du système environnant le projet de thèse 8

Figure 3. Diagramme de Gantt simplifié des différentes étapes du projet 14

Tableau 1. Coût financier du projet de thèse 19

Figure 4. Répartition des coûts du projet de thèse par poste de dépenses (a) et par source de

financement (b) 20

3

I. Ma thèse dans son contexte : Problématique et enjeux

1. Problématique de la contamination des sols par les métaux

a. Enjeux global

(i) Question de société

La contamination des sols par les métaux pose la question de l’utilisation de ces sols,

notamment en agriculture, dont la fonction de production de denrées alimentaires reste une

question centrale dans nos sociétés. Il s’agit dans ce contexte de préserver la fertilité des sols

pour permettre une production suffisante de denrées alimentaires et assurer une innocuité de

ces produits vis-à-vis de l’environnement et de la santé humaine.

(ii) Question technique

D’un point de vue plus technique, il s’agit d’être capable d’identifier la présence et le

niveau des contaminants dans les sols pour pouvoir déterminer s’ils sont utilisables ou non à

des fins de productions agricoles et pour quels types de cultures.

(iii) Question scientifique

En terme d’enjeux scientifiques, les objectifs fixés visent, d’une part, à mieux

connaître les stratégies utilisées par les plantes pour maîtriser leur alimentation et leur

nutrition minérale en fonction du type de sol, du contaminant présent et du niveau de

contamination. D’autre part, il s’agit également de faire émerger des connaissances

scientifiques des outils permettant d’évaluer l’exposition des plantes aux contaminants et les

risques associés de toxicité et de contamination de la chaîne alimentaire.

b. Enjeux particuliers de la thèse

Mes travaux de thèse sont réalisés dans le cadre des activités de l’INRA qui est un

institut public de recherche finalisée. Ainsi, de façon générale, les connaissances issues de

mes travaux sont à destination du grand public et d’utilisateurs comme les professionnels de

l’environnement et du monde agricole. Cependant, cette mission de finalisation n’empêche

pas de conduire des approches plus fondamentales pour répondre à ces préoccupations.

4

(i) Phytotoxicité du cuivre dans les sols viticoles

La thèse aborde la problématique de la contamination des sols viticoles par le cuivre.

Cet élément est naturellement présent dans tous les sols et est essentiel à la nutrition minérale

des plantes cultivées et sauvages. En viticulture, le cuivre, composant principal de la bouillie

bordelaise, a été massivement utilisé depuis la fin du XIXème siècle pour lutter contre une

maladie de la vigne, le mildiou. Le cuivre reste encore très utilisé en agriculture (viticulture,

arboriculture, cultures maraîchères) en raison de son large spectre d’action sur diverses

maladies fongiques des plantes et de l’absence d’apparition de phénomène de résistance des

champignons phytopathogènes vis-à-vis du cuivre. Suite aux apports répétés de bouillie

bordelaise sur les vignes, le cuivre s’est accumulé dans les sols jusqu’à des teneurs

potentiellement toxiques pour les plantes (Figure 1.a). La contamination en cuivre des sols

viticoles ou à antécédents viticoles est un problème mondial, en lien avec la localisation de la

production de raisin de table et de vin. Dans le cas particlulier du Languedoc-Roussillon, une

partie des surfaces en vigne a été remplacée par d’autres cultures, en particulier le blé dur,

suite à la crise viticole dans les années 70-90 (Figure 1.b). Des symptômes de phytotoxicité

imputables à la contamination des sols en cuivre sont régulièrement observés sur le blé dur.

Les agronomes considèrent la phytotoxicité du cuivre comme l’un des problèmes

agronomiques majeurs dans la région. Au-delà de la simple baisse des rendements agricoles,

le problème se pose également en terme de possibilités d’utilisation à des fins agricoles des

sols à antécédents viticoles contaminés en cuivre. La profession agricole est donc demandeuse

d’une meilleure connaissance du problème afin, d’une part, d’être capable de diagnostiquer

les types de sol favorables à l’émergence de la phytotoxicité du cuivre et, d’autre part, de

mettre en place des techniques visant à réduire la phytotoxicité du cuivre (par exemple par

apport de matières organiques).

(ii) Objectifs de la thèse

Dans ce contexte, mes travaux de thèse visent à la caractérisation de l’exposition au

cuivre du blé dur lorsqu’il est cultivé sur des sols à antécédent viticole contaminés en cuivre.

En terme d’objectifs, je me suis proposé, d’une part, de mieux comprendre quelle(s)

propriété(s) du sol et quel(s) fonctionnement(s) biologique(s) particulier(s) de la plante

influencent le prélèvement de cuivre par le blé, ceci afin de déboucher éventuellement sur des

conseils techniques pour les agriculteurs afin de limiter les problèmes de phytotoxicité.

D’autre part, j’ai étudié la capacité d’un outil de laboratoire à prédire l’exposition des plantes

5

aux métaux présents dans les sols contaminés, afin de proposer cet outil de diagnostic comme

indicateur dans les études portant sur les sites et sols contaminés.

a. Vigne

Sol Surface contaminée en cuivre

Cu

Cu Cu

Risque Phytotoxicité Cu

Cu Cu

80 000 ha

Reconversion du vignoble

Cu Cu

Cu Cu

Traitementsphytosanitaires à

base de cuivreBlé dur

Cu : Cuivre

b. Surface Agricole Utile 1975 1995

SCOP: Surface en Céréales et Oléo-Protéagineux

Vignes

SCOP

Oléagineux

Autres cultures

BléDur

SCOP

80 000 ha

150 000 haarrachés

Vignes

Figure 1. Problématique (a) et contexte agricole (b) de la thèse

6

2. Le système de recherche environnant ma thèse

a. Mon laboratoire et son approche scientifique

Mon laboratoire, dont le nom est « Biogéochimie du Sol et de la Rhizosphère »,

s’intéresse à l’implication des phénomènes biologiques (activités des racines des plantes, des

micro-organismes du sol…) et chimiques (rétention par le sol des éléments minéraux et de

contaminants biologiques) dans le sol en lien avec la dispersion de contaminants biologiques

dans l’environnement ainsi que la nutrition minérale des plantes cultivées (blé, haricot, pin

maritime). Au sein du laboratoire, j’appartiens à l’équipe « Biodisponibilité des éléments

minéraux pour les plantes » dont l’objectif est de mieux comprendre les déterminants de la

nutrition minérale des plantes cultivées (Figure 2). L’équipe a fait le choix de se focaliser sur

les interactions entre les racines des plantes et le sol. Une large partie des études menées, y

compris celles entreprises dans le cadre de ma thèse, se focalise sur la fine couche de sol

directement au contact des racines et dont les propriétés sont principalement contrôlées par

l’activité biologique des racines : il s’agit de la « rhizosphère ». Parmi les choix stratégiques

de l’équipe, le blé dur a été retenu comme l’une des plantes modèles puisque cette espèce,

largement cultivée aux niveaux régional, national et international, est représentative de la

famille des céréales qui domine la production alimentaire mondiale.

b. Concurrence autour de ma problématique

La problématique de la concurrence est principalement reliée à l’originalité de

l’approche développée par l’équipe et, plus particulièrement, dans le cadre de mes travaux de

thèse. Le thème de la contamination des sols par les métaux et des contraintes que cela posent

sur les cultures est un sujet largement traité, particulièrement au niveau international.

Cependant, le choix, comme objet d’étude, de la rhizosphère et de son rôle dans la régulation

du transfert des métaux du sol à la plante est clairement original. Ce choix répond à une

volonté d’interdisciplinarité, tentant d’intégrer les connaissances issues des domaines de la

chimie de l’environnement et de la biologie végétale. A ce titre, l’équipe à laquelle

j’appartiens fait partie des groupes performants au niveau international, aussi bien en terme de

production de résultats que de concepts nouveaux, comme le montre l’organisation récente

(Août 2007) par mon directeur de thèse du deuxième congrès mondial dédié à l’étude de la

rhizosphère et qui a réuni 570 participants à Montpellier. En ce qui concerne les relations avec

le secteur privé, il s’agit d’un domaine très peu concurrentiel puisque aucun laboratoire privé

ne s’intéresse spécifiquement à notre domaine d’étude, ni ne cherche, pour le moment, à

utiliser des outils proches de celui développé dans le cadre de mes travaux de thèse.

7

Profession Agricole

Instituts Techniques ex: Arvalis

Techniques

Outils

Recherche fondamentale

ThèseCu

Equipe Biodisponibilité

UMR BSR

INRA

UMR TCEM

CNRS UPMC

Outil RHIZOtest

Connaissances Prélèvement Cu blé dur

Ingénierie, transferts de connaissances

et technologique Informations - Environnement - Santé publique

Grand public

ADEME

Recherche Appliquée

Projet de Recherche Cu

Programme national de recherche PNETOX (MEDD)

UTS

CNRS UAMIII

Structure académique de recherche ADEME : Agence de l’environnement et de la maîtrise de l’énergie CNRS : Centre national de la recherche scientifique INRA : Institut national de la recherche agronomique MEDD : Ministère de l’écologie et du développement durable UAMIII : Université Aix-Marseille III UMR : Unité mixte de recherche UPMC : Université Pierre et Marie Curie UTS : Université Toulon Sud

Structure non académique

Collaboration

Services

Figure 2. Structure et fonctionnement du système environnant le projet de thèse

8

c. Réseaux de travail et collaborations

L’activité de recherche est généralement fondée sur l’appartenance à des réseaux

scientifiques (Figure 2). Sur ce point, j’ai pu bénéficier dans le cadre de mes travaux des

relations précédemment tissées avec des scientifiques de divers organismes de recherche

français (INRA, CNRS, Universités…) ainsi que de collaborations établies spécifiquement au

cours de ma thèse. Des relations ont également été établies spécifiquement dans le carde de

mes travaux avec des organismes de développement comme Arvalis (institut technique pour

les productions végétales) et l’ADEME (agence de l’environnement et de la maîtrise de

l’énergie), ainsi qu’avec la profession agricole. Enfin, j’ai également eu l’occasion

d’intervenir pour des enseignements auprès d’étudiants de l’université de Montpellier II et de

l’école d’ingénieurs en agronomie (Montpellier SupAgro), me permettant de contribuer à la

sensibilisation du grand public sur la problématique environnementale sur laquelle je travaille.

3. Mon choix de faire une thèse

La décision de coupler le début de ma carrière professionnelle à la poursuite des mes

études a été dictée, d’une part, par un besoin d’approfondissement et de rationalisation de

mon domaine d’activité et, d’autre part, par ma vision du monde du travail et de la place que

je souhaite y occuper.

Les trois années passées en école d’ingénieurs m’ont permis, au-delà de la formation

aux métiers de l’agriculture, de réfléchir sur la manière dont je souhaitais guider ma façon de

travailler. Je me suis clairement rendu compte de ma préférence pour le travail

d’approfondissement plutôt que pour le travail cherchant à maximiser l’efficacité dans

l’obtention des résultats. Après plusieurs échanges avec des professionnels du monde agricole

et des enseignants de mon école d’ingénieurs, j’ai pris la décision d’orienter mon travail sur

l’acquisition et la production de connaissances plutôt que sur la résolution de problèmes

pratiques de manière rentable. Je me suis donc naturellement orienté vers une formation à la

recherche scientifique par la recherche, c’est-à-dire la thèse de doctorat. Cette orientation vers

la recherche scientifique me permet également d’entrevoir une carrière dans le public où la

rentabilité financière n’est ni le principal objectif, ni le critère majeur d’évaluation de

l’efficacité dans le travail, comme cela est généralement la règle dans le secteur privé.

9

II. Gestion du projet de thèse

1. Origine et cadrage

a. Origine de la thématique

Les scientifiques français ont commencé à s’intéresser au devenir du cuivre accumulé

dans les sols viticoles dès le milieu du XXème siècle. Pour autant, c’est seulement à la fin des

années 90 que des travaux ont commencé à être menés sur Montpellier et dans la région

Languedoc-Roussillon. La thématique s’intéressant aux impacts du cuivre pour les plantes

cultivées a été prise en charge par le groupe de recherche animé par mon directeur de thèse

(Philippe Hinsinger) dans le cadre de deux programmes de recherche nationaux (PNETOX et

ECCO-ECODYN) entre 1996 et 2007. Mes travaux de thèse sont venus s’intégrer dans ce

contexte comme le dernier projet de mon laboratoire sur cette thématique.

b. Financements

Mes travaux de thèse ont principalement été financés dans le cadre du programme

national d’écotoxicologie (PNETOX 2005-2007) du ministère de l’écologie, du

développement et de l’aménagement durables, à hauteur de 40 000 € (Figure 2). Le

financement a été obtenu quelques mois avant le début de ma thèse. Les diverses activités

parallèles (formations et congrès) ont également été financées en majeure partie par le

programme PNETOX, ainsi que par des bourses (Association Française pour l’Etude des Sols

et Académie d’Agriculture de France), pour une valeur de 2500€, que j’ai obtenues au cours

du projet.

La dernière étape préalable au démarrage du projet a été l’obtention du financement de

mon salaire. Deux sources ont été envisagées, soit un financement entre l’ADEME (Agence

de l’environnement et de la maîtrise de l’énergie) et la région Languedoc-Roussillon, soit un

financement provenant à 100 % du ministère de la recherche et de l’enseignement supérieur

(Allocation de recherche). L’attribution des deux financements a été conditionnée par le

classement au concours de l’école doctorale basé sur le classement lors de l’année de master 2

ainsi que sur un entretien devant un jury de scientifiques nommés par l’école doctorale. Pour

des raisons administratives, j’ai choisi l’allocation ministère mais l’implication de l’ADEME

a été maintenue dans la programmation du projet.

10

c. Partenaires impliqués

Les principaux partenaires scientifiques proviennent, soit des relations issues de

collaborations antérieures au projet de thèse, soit des équipes engagées dans le programme de

recherche PNETOX (Figure 2). Ces partenariats ont permis de faire bénéficier à l’ensemble

des projets englobés dans le programme de recherche (y compris mon projet de thèse) des

techniques et des savoir-faire développés dans chacun des laboratoires impliqués. Je me suis

par exemple déplacé dans deux laboratoires associés pour apprendre et utiliser de nouvelles

techniques et, réciproquement, trois étudiants de laboratoires partenaires sont venus travailler

avec moi sur des techniques que nous maîtrisions.

Des collaborations extra-scientifiques ont également été établies avec l’ADEME (voir

b.), la chambre d’agriculture de l’Hérault et Arvalis – l’institut du végétal (Figure 2).

d. Programmation initiale

La rédaction et la programmation initiale du projet de thèse s’est déroulée durant mon

stage de master 2, quelques mois avant le début de ma thèse. Ma participation dans la

définition du projet initial de thèse a été très faible puisque mon sujet a été rédigé sur la base

de résultats précédemment acquis par mon équipe. En revanche, bénéficiant d’une bourse

ministérielle, mon projet de thèse a été structuré de façon suffisamment large pour permettre

des réorientations successives au fur et à mesure des avancées. Une fois la mesure du projet

prise, j’ai donc pu pleinement participer à la programmation et à la réalisation des travaux. Par

exemple, mon projet étant à l’interface entre chimie du sol et biologie végétale, j’ai clairement

opté pour une vision plus chimique que biologique de ma problématique. D’autre part, la prise

en main définitive de ma thèse a été marquée par la sélection et la recherche autonome de

financement d’une formation et d’un congrès européen sur les problématiques liées à mon

sujet de thèse (voir II.2.c.ii).

e. Résultats attendus

Un des principaux résultats attendus d’un projet de thèse dans le domaine de la

chimie – biologie végétale est la production de publications scientifiques indexées, c’est-à-

dire d’articles publiés dans des revues à comité de lecture dont le facteur d’impact est

significatif dans leur domaine. En général, les travaux de thèse devraient donner lieu à au

moins 3 publications, dont une acceptée avant la fin du projet de thèse. D’un point de vue

scientifique, les résultats attendus ont concerné un approfondissement des connaissances sur

l’exposition au cuivre du blé dur dans les sols viticoles contaminés et, plus particulièrement,

11

le rôle joué par la plante dans le système sol-plante. D’un point de vue plus technique, les

résultats peuvent dans une certaine mesure découler sur des applications. Dans le cadre du

projet de thèse, les applications potentielles peuvent englober, d’une part, la proposition aux

agents techniques et aux agriculteurs de solutions permettant de réduire les risques de toxicité

du cuivre pour le blé dur (apport de divers amendements aux sols, sélection de variétés de blé

tolérantes) et, d’autre part, le développement d’un outil à destination des bureaux d’étude

permettant l’évaluation de l’exposition aux métaux des plantes présents dans les sols

contaminés (Figure 2).

L’objectif majeur du projet étant de communiquer nos résultats au niveau de la

communauté scientifique internationale, les aspects contractuels du projet concernent

principalement le respect des règles éthiques en matière de publication scientifique (justesse

et absence de manipulation des résultats soumis pour publication) et le fait de céder nos droits

d’auteurs sur les résultats aux maisons d’édition des revues scientifiques.

f. Facteurs de risques

Les principaux facteurs de risques sont de deux ordres, d’une part, temporel puisque la

thèse est un projet qui doit être dimensionné et réalisé sur trois ans et, d’autre part, lié à

l’originalité puisque le travail scientifique doit viser la nouveauté en terme de résultats et de

concepts. En lien avec ce dernier point, il faut également tenir compte des difficultés qui

peuvent parfois être rencontrées pour faire accepter à la communauté scientifique des idées

originales. Pour mener à bien les objectifs scientifiques fixés en limitant les facteurs de risque,

le sujet de thèse a été programmé de manière suffisamment large pour permettre diverses

orientations ou réorientations au grés des avancées. De plus, la réalisation des travaux a été

programmée de manière à débuter par des expérimentations devant répondre à des questions

globales me permettant de m’approprier le projet et d’établir des hypothèses plus ciblées,

vecteurs d’originalité, sur lesquelles ont débouché les expérimentations ultérieures.

2. Ses différentes étapes

Ma thèse a été subdivisée en quatre étapes qui se sont succédées sur les trois années du

projet. Chaque année a été jalonnée par une réunion permettant de faire le bilan de l’avancée

du projet (diagramme de Gantt simplifié, Figure 3).

12

a. 1ère étape : Du terrain aux outils de laboratoire

Cette première étape s’est principalement déroulée sur la première année et a eu pour

objectifs de me donner les moyens de m’approprier la problématique ainsi que la réalisation

de premières expérimentations me permettant de définir un éventail de questions de recherche

potentielles.

(i) Appropriation du sujet

Cette phase (APPROP. PB, Figure 3) est classiquement passée par une revue

bibliographique des connaissances scientifiques actuelles sur le devenir du cuivre dans les

sols et son effet sur les plantes. Cependant, cette phase n’a pas directement débouché sur la

rédaction d’une synthèse bibliographique du fait du démarrage rapide des premières

expérimentations dès janvier 2006. L’appropriation de la problématique s’est donc poursuivie

en parallèle des expérimentations jusqu’à la première réunion-bilan.

(ii) Expérimentations

Ma première expérimentation s’est déroulée sur le terrain (Terrain, Figure 3), d’une

part, pour échanger avec la profession agricole sur sa perception des contraintes posées par la

contamination en cuivre des sols à antécédents viticoles et, d’autre part, pour estimer

l’exposition au cuivre du blé dans les conditions les plus proches de la réalité de terrain et

donc in fine pour définir des questions de recherche pertinentes. Cette expérimentation a

malgré tout posé un certain nombre de contraintes. Son ampleur a mobilisé deux thésards

ainsi qu’un étudiant de master 2 à plein temps pendant 5 mois. De plus, la plus part des

mesures était liée aux conditions climatiques et a donc été repoussée de plusieurs semaines.

Les investigations se sont ensuite poursuivies au laboratoire (Outil/Labo., Figure 3)

dans le but de préciser, sous conditions contrôlées, les paramètres déterminants l’exposition

au cuivre du blé dur et de tester la capacité de différents outils pour l’évaluation de cette

exposition. Sur ce dernier point, un test biologique, le RHIZOtest, développé par mon équipe

en parallèle de la problématique cuivre a été comparé (été 2006) à d’autres méthodes

(Novembre 2006 et hiver 2007) actuellement considérées comme permettant une évaluation

satisfaisante de l’exposition des plantes aux métaux dans les sols contaminés. L’utilisation de

ces méthodes et des outils correspondants a fait l’objet de deux collaborations, dont une m’a

donné l’occasion de passer une semaine dans un laboratoire de l’INRA de Bordeaux associé

au programme de recherche PNETOX.

13

14

1ère étape : Du terrain aux outils de laboratoire APPROP. PB : Appropriation problématique

1ère année 2ème année 3ème année 2005 2006 2006 2007 2007 2008

O N D J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S OAPPROP. PB

Terrain

1ère é

tape

EXP. Outil/Labo. B

ilan

1

Approf. Outil EXP.

Expo. Plante

Jnes

Icobte 2ème é

tape

COMM.

Rhizo2

Bila

n 2

Approf. 1

Approf. 2 EXP.

Approf. 3

Edsb 3ème é

tape

COMM. Eurosoil

Doc.

Bila

n fin

al

SYNTH. Oral

4ème é

tape

EVALUATIONS

2ème étape : Détermination de la question de recherche EXP. : Expérimentation 3ème étape : Approfondissement de la problématique scientifique COMM. : Communication 4ème étape : Synthèses et évaluations SYNTH : Synthèse

Les autres abréviations sont précisées dans le texte Figure 3. Diagramme de Gantt simplifié des différentes étapes du projet

(iii) 1er bilan

L’école doctorale impose la tenue annuellement d’au moins un comité de pilotage

devant permettre de faire un bilan de l’avancement du projet. La première réunion s’est

déroulée en octobre 2006 et a réuni un comité composé de cinq scientifiques (dont trois

extérieurs au laboratoire) et du directeur de thèse (Bilan 1, Figure 3). Cette réunion m’a donné

l’occasion (i) de présenter une synthèse bibliographique de la thématique, (ii) de formuler

plusieurs questions de recherche qui ont été hiérarchisées avec le comité et (iii) de dresser une

feuille de route pour la deuxième année du projet.

b. 2ème étape : Détermination de la question de recherche

Cette deuxième étape s’est calée sur la deuxième année du projet. Au delà des

expérimentations qui ont été réalisées, cette étape m’aura permis d’approfondir ma

problématique de thèse, permettant in fine de définir précisément la question de recherche.

(i) Expérimentations

La première expérimentation (Approf. Outil, Figure 3) a eu pour objectif de tester le

RHIZOtest non plus seulement pour évaluer l’exposition au cuivre du blé dur mais également

pour sa capacité à rendre compte des effets toxiques du cuivre sur la plante (phytotoxicité).

La seconde expérimentation (Expo. Plante, Figure 3) a concerné la caractérisation des

besoins en cuivre du blé dur, afin de déterminer le prélèvement de cuivre par la plante ainsi

que l’apparition des symptômes de toxicité en fonction du niveau de contamination du milieu.

Un certain nombre de contraintes méthodologiques s’est posé et a rendu infructueux tous les

premiers essais. Il m’a donc fallu revoir complètement sous un autre angle l’ensemble du

protocole d’expérimentation pour parvenir aux résultats escomptés.

(ii) Communication

Cette étape a également inclus les premières communications des résultats obtenus au

niveau de la communauté scientifique nationale et internationale. Le choix de participation à

différents congrès a été dicté en fonction des opportunités qui se présentaient et également de

manière à toucher différentes communautés scientifiques intéressées par la problématique.

Ainsi, j’ai eu l’occasion de participer au congrès français de science du sol (Jnes, Figure 3), au

congrès international s’intéressant au comportement des métaux dans l’environnement en

Chine (Icobte, Figure 3) ainsi qu’au congrès international abordant spécifiquement les

interactions entre le sol et les plantes dans la rhizosphère à Montpellier (Rhizo2, Figure 3).

15

Les supports de communication ont été à la fois sous forme de présentation orale (Jnes et

Rhizo2) et de poster (Jnes et Icobte). Au delà de la communication sur les résultats obtenus,

ces congrès ont été l’occasion de renforcer (Jnes et Rhizo2) ou de créer (Icobte et Rhizo2) de

nouveaux réseaux dans les communautés scientifiques française et internationale.

(iii) 2ème bilan

Le deuxième comité de pilotage (Bilan 2, Figure 3) s’est déroulé en octobre 2007. La

question de recherche principale, « quelle est l’implication des phénomènes rhizosphériques

(à l’interface sol-plante) induits par la plante dans le déterminisme de l’exposition de la plante

au cuivre en sols à antécédent viticole », a été clairement définie. Le bilan des résultats acquis

a été dressé. Enfin, les questions restant en suspens ont été proposées au comité et validées

par celui-ci, de même que la feuille de route pour la dernière année présentant les troisième et

quatrième étapes du projet.

c. 3ème étape : Approfondissement de la problématique scientifique

Cette étape, qui est encore en cours de réalisation à la date de rédaction de ce

document, s’est principalement déroulée de septembre 2007 à mai 2008 et a eu pour objectif

majeur d’approfondir la compréhension des mécanismes impliqués dans l’exposition au

cuivre du blé. La contrainte de temps, associée à l’objectif d’achever ce projet en octobre

2008, a été la principale difficulté. Deux des trois expérimentations ont donc été réalisées en

collaborations avec deux doctorants venant de laboratoires associés.

(i) Expérimentations et collaborations

La première expérimentation (Approf. 1, Figure 3) a concerné l’impact de l’apport

d’amendements organiques au sol sur l’exposition au cuivre du blé dur. Cette expérimentation

a été réalisée en collaboration avec une doctorante indienne venant de l’université de Aas en

Norvège.

La deuxième et principale expérimentation de cette troisième étape (Approf. 2,

Figure 3) a permis d’évaluer l’effet de l’acidité du sol sur le comportement du cuivre dans le

système sol-plante. Ce travail a permis de reproduire les résultats obtenus sur le terrain et

donc de préciser leur importance dans le déterminisme de l’exposition du blé dur au cuivre.

De plus, la question du rôle de la plante dans son exposition au cuivre a été approfondie avec

des outils que nous avons pu utiliser dans le cadre de collaborations. D’une part, des collègues

québécois nous ont donné accès à leur protocole de mesure ainsi qu’à des échantillons me

16

permettant de caler cet outil dans notre laboratoire. D’autre part, j’ai également pu passer une

semaine dans un laboratoire de chimie à l’université de Toulon pour utiliser un appareil dont

nous ne disposions pas sur Montpellier.

La dernière expérimentation du projet (Approf. 3, Figure 3) a été réalisée en

collaboration avec un doctorant d’un laboratoire partenaire. Son objectif a été d’évaluer les

modifications de la chimie du cuivre et de l’arsenic dans le sol situé au contact des racines et

soumis à leurs activités, i.e. la rhizosphère. D’une part, la culture des plantes s’est déroulée

dans notre laboratoire avec un outil spécialement développé par l’équipe à laquelle

j’appartiens. D’autre part, des mesures de cuivre dans le sol, demandant un appareillage

spécifique, vont être réalisées dans le laboratoire partenaire.

Des difficultés sont apparues, liées à des pannes répétées sur un appareil d’analyse

devant donné des mesures indispensables pour cette expérimentation. Il m’a donc fallu

chercher, au travers du réseau de connaissances du laboratoire, des groupes disposant du

même appareil. Au final, l’ensemble des objectifs d’analyses ont été rempli.

(ii) Communication

La communication sur les résultats obtenus au cours de cette troisième étape va passer

par la participation (i) à une formation sur la chimie des contaminants dans l’environnement

organisée par l’université de Wageningen aux Pays-Bas (Edsb, Figure 3) et (ii) au congrès

européen de science du sol à Vienne en Autriche (Eurosoil, Figure 3). La formation aux Pays-

Bas me donnera l’occasion d’approfondir les concepts chimiques liés à ma problématique. En

ce qui concerne le congrès européen de science du sol, j’ai prévu de communiquer sur les

deux aspects de mon projet de thèse : d’une part, sur l’outil « RHIZOtest » et, d’autre part, sur

la chimie du cuivre dans la rhizosphère du blé dur dans le cadre de la session dédiée à l’étude

de la rhizosphère.

Le programme de recherche PNETOX et le budget associé finançant principalement

mon projet de thèse s’est arrêté fin 2007. Il a donc fallu trouver d’autres sources de

financement pour la participation aux opérations de communications. J’ai donc budgétisé les

montants nécessaires de participation à ces manifestations et ai sollicité une aide auprès de

l’Académie d’Agriculture de France. Celle-ci a répondu positivement en m’octroyant une

somme de 2000 € qui me permet de financer en totalité les deux manifestations pré-citées.

17

d. 4ème étape : Synthèses et évaluations

Cette étape de synthèse marquera l’achèvement du projet et coïncidera avec l’arrêt du

financement de mon salaire (septembre 2008). L’analyse globale des résultats passe par la

production de deux supports de synthèse : un document écrit (Doc., Figure 3) qui devrait être

rendu (manuscrit de thèse) au plus tard à la mi-septembre ainsi qu’une soutenance orale (Oral,

Figure 3) qui devrait se dérouler fin octobre.

(i) Document écrit

Etant donnés que les résultats attendus du projet concernent principalement

l’acquisition et la production de connaissances scientifiques, il a été choisi de construire ce

document sous la forme d’une compilation d’articles rédigés en anglais au format publication.

Ces articles seront organisés de manière cohérente en incluant une introduction générale et

une synthèse bibliographique, permettant de poser clairement la problématique et les

questions de recherche, ainsi qu’une conclusion générale, permettant de synthétiser de

manière globale l’ensemble des résultats. La rédaction a débuté fin 2005 et fin 2006 par une

première ébauche de synthèse bibliographique ainsi que par la participation à la publication

d’un premier article sur les résultats obtenus au terrain début 2007. Un deuxième article,

abordant l’intérêt du RHIZOtest, a été rédigé début 2008 et soumis en mai 2008 pour

publication à une revue scientifique. Le calendrier d’expérimentation a été calé de manière à

achever définitivement les expérimentations à la mi-mai 2008, afin de consacrer les derniers

mois à la rédaction du manuscrit et la communication sur les derniers résultats acquis. Le

manuscrit sera ensuite soumis à l’évaluation par deux scientifiques du domaine concerné.

(ii) Soutenance orale

Le deuxième travail de synthèse correspond à la préparation d’une présentation orale

publique. Si le manuscrit est accepté par les rapporteurs en charge de l’évaluer, cette

soutenance devrait se dérouler fin octobre 2008. La qualité de la présentation ainsi que la

capacité à répondre aux questions seront évaluées par un jury d’environ cinq à six

scientifiques et/ou personnes impliquées dans le projet (comme un ingénieur de l’ADEME par

exemple). Le projet pourra ensuite être validé par le jury et donnera lieu à l’obtention du

grade de docteur.

18

3. Coût financier

Le coût financier de la thèse peut être découpé en trois grands ensembles : « les

Ressources humaines », « le Fonctionnement » et « les Congrès, formations et réunions»

(Tableau 1).

Tableau 1. Coût financier du projet de thèse Coût, € Origine financement

Ressources humaines Doctorant 74 385 Ministère Recherche

Directeur thèse 17 270 Personnel permanent Soutien technique 24 300 INRA

Stagiaires 5 500 INRA Montpellier SupAgro Personnel non

permanent Collab. Doctorants 3 810 Union Européenne,

Université Aas Norvège

Total 125 265 Fonctionnement

Location locaux 24 000 INRA Expérimentation 1 4 129 Expérimentation 2 5 382 Expérimentation 3 1 873 Expérimentation 4 2 940 Expérimentation 5 1 240 Expérimentation 6 4 700 Expérimentation 7 1 962 Expérimentation 8 1 252

PNETOX, INRA

Total 47 479 Congrès, formations, réunions

Congrès 2 535 PNETOX, AFES1, AAF2

Formations 2 947 PNETOX, INRA, MED3, AAF, Union européenne

Réunions 540 PNETOX Total Congrès, formations, réunions 6 022 Total global 178 766

Le coût total du projet de thèse s’élève à près de 180 000 €, dont 41 % proviennent du

financement de mon salaire. Le poste des ressources humaines représente à lui seul 70 % du

coût total (Figure 4.a). Les frais de fonctionnement ont représenté près d’un tiers du coût du

projet.

Etant allocataire de recherche, mon salaire a été financé par le ministère de la

recherche qui a donc directement participé au financement du projet à hauteur de 41 % 1 AFES : Association Française pour l’Etude des sols 2 AAF : Académie d’Agriculture de France 3 MED : Maison des Ecoles Doctorales des établissements d’enseignement supérieur public de Montpellier

19

(Figure 4.b). L’INRA, qui a pris en charge le salaire du personnel permanent et non

permanent ainsi que le financement d’une part des frais de fonctionnement, a participé pour

près de 40 % au projet. Cependant, le budget de l’INRA est très majoritairement financé par

le ministère de la recherche, ce dernier étant donc le principal financeur du projet (≈ 80 %).

Le contrat de recherche (PNETOX) dans lequel mon projet s’est inséré a financé une part

importante des expérimentations pour une participation globale dans le projet de 14 %

(Figure 4.b).

a.

Fonctionnement 27 %

Ressources humaines 70 %

Congrès, Formations, Réunions 3 %

Ministère Recherche 41 %

Ib.

Contrat de recherchePNETOX 14 %

Divers 5 %

NRA 40 %

Figure 4. Répartition des coûts du projet de thèse par poste de dépenses (a) et par source definancement (b).

20

4. Bilan

a. Résultats attendus et obtenus

(i) Aspect scientifique

Les résultats attendus de mon projet de thèse concernaient principalement

l’approfondissement des connaissances sur l’exposition du blé dur au cuivre et sa valorisation

sous la forme de publications scientifiques (au moins trois publications attendues). A ce jour,

un premier article est publié, en collaboration avec une autre doctorante, et un deuxième est

soumis pour publication. Les résultats acquis au cours des trois premières étapes du projet

devraient permettre d’atteindre l’objectif de trois publications acceptées mais à une échéance

d’environ un an après la fin effective du projet (fin 2009). Ce schéma classique de

valorisation des projets de thèse demandera donc une implication au delà de la fin du projet et

en plus du travail nécessaire au démarrage d’une autre activité professionnelle, sans contre-

partie financière.

(ii) Application potentielle

Au-delà de l’objectif purement scientifique, le projet a ouvert la voie d’une

valorisation des acquis scientifiques sous la forme du développement d’un outil de diagnostic

de l’exposition des plantes aux métaux dans les sols contaminés. Un projet de normalisation

de cet outil est actuellement en cours de discussion avec l’ADEME et pourrait donner lieu à

l’ouverture d’un CDD dans mon laboratoire. Ce projet pourrait donc me donner l’opportunité

d’approfondir une application potentielle de la thèse tout en prenant le temps d’achever la

valorisation des acquis scientifiques.

b. Résultats obtenus et coût financier : notions de rentabilité

(i) Rentabilité financière

L’évaluation financière de la rentabilité revient à comparer le coût de publication du

projet (coût global divisé par le nombre de publications) au coût moyen de publication

d’organismes de recherche. Etant donné l’avancée du projet, il est possible de tabler sur la

production de 2 à 6 publications d’ici fin 2009 et donc sur un coût de publication compris

entre 30 000 et 90 000 € par publication. Cette estimation est cohérente avec le coût de

publication du CNR4 (équivalent italien du CNRS) qui est estimé entre 20 000 et 40 000 € par

publication. En revanche, le mode de calcul du coût de publication pour l’INRA5 et le CNRS6

4 http://www.cnr.it/sitocnr/Englishversion/CNR/Dataandstatistics/Scientificproduction/Averagecost.html 5 http://www.inra.fr/l_institut/l_inra_en_bref/les_chiffres_cles

21

doit être sensiblement différent puisque leurs coûts respectifs de publications sont estimés à

230 000 et 115 000 €. Quoiqu’il en soit, la rentabilité financière de mon projet de thèse

semble correcte mais dépend encore de la valorisation finale qui se déroulera au-delà de son

achèvement officiel.

(ii) Rentabilité scientifique

Cette notion de rentabilité financière n’est pas suffisante pour évaluer la rentabilité

globale du projet. La rentabilité scientifique peut, quant à elle, être estimée par le nombre de

publications rapporté au nombre d’années d’exercice de la recherche. L’agence d’évaluation

de la recherche et de l’enseignement supérieur (AERES) estime qu’un chargé de recherche et

un maître de conférence dans le domaine des sciences du vivant devraient produire,

respectivement, 4 et 2 publications minimum en 4 ans. A ce jour et en comptabilisant mes six

mois d’activité durant le stage de Master 2, j’ai publié deux publications indexées en 3,5

années. Ma rentabilité scientifique est donc pour le moment inférieure au ratio de référence

des chargés de recherche. Cependant, il convient d’attendre la fin de la valorisation de la thèse

pour tirer une conclusion définitive plus juste, tenant compte des publications soumises ou à

soumettre.

(iii) Impact de la thèse

Il convient également d’évaluer le projet en terme d’impact pour la communauté

scientifique et des éventuelles applications sur lesquelles il pourrait déboucher. L’impact sur

la communauté scientifique peut être principalement estimé au travers du nombre de citations

des publications issues de ma thèse dans d’autres publications. En ce qui concerne

l’application des connaissances acquises au cours du projet, l’outil développé pourrait

représenter une opportunité intéressante d’application.

Quels que soient les critères choisis pour évaluer la rentabilité du projet ou son impact,

il faudra attendre plusieurs années pour tirer des conclusions définitives à ce sujet.

6 http://www.sg.cnrs.fr/ipam/publications/bibliometrie/bib2004.pdf

22

III. Compétences personnelles et professionnelles : quelle transférabilité ?

1. Compétences personnelles

L’expérience de thèse m’aura permis de développer principalement quatre

compétences personnelles: l’autonomie, la ténacité, l’esprit critique et l’auto-remise en

question. Ces quatre compétences personnelles sont évidemment complètement transférables

dans beaucoup d’autres secteurs d’activités.

Ma prise d’autonomie s’est notamment marquée dans la gestion de la dernière année

du projet : proposition et organisation intégrale des dernières expérimentations ainsi que la

sélection et l’obtention d’un financement pour communiquer sur mes résultats (voir II.2.c.ii).

La ténacité a également été indispensable à la réalisation de mes travaux. Ce trait de

caractère s’est notamment illustré lors de la publication d’un article issu de mes travaux de

Master 2. Son acceptation aura pris plus de deux années et nécessité deux réécritures

successives en parallèle de mes travaux de thèse.

Enfin, deux compétences personnelles ont été fortement développées au contact du

monde de la recherche, à savoir l’esprit critique et l’auto-remise en question. Ces deux

compétences sont indissociables d’un bon travail de recherche et de sa marche en avant. La

première est notamment très importante lors du travail de synthèse bibliographique

puisqu’elle permet de déceler les manques dans l’état des connaissances et donc les

opportunités d’originalité. L’auto-remise en question, bien que parfois psychologiquement

déstabilisante, permet d’entretenir la motivation.

2. Compétences techniques

En marge des compétences méthodologiques et des connaissances particulières sur

divers appareils de mesure, les compétences techniques que j’ai développées peuvent se

subdiviser en trois grands ensembles. Je suis capable de caractériser les sols d’un point de vue

physico-chimique dans le but d’analyser leur fertilité. J’ai également pu développer diverses

techniques de cultures de végétaux aussi bien dans le milieu naturel (parcelles cultivées)

qu’en milieu contrôlé (chambre de culture). Enfin, j’ai pu manipuler différentes techniques

permettant de doser qualitativement et quantitativement les métaux (ou éléments en traces)

dans l’environnement (plus particulièrement dans les sols et les plantes). Si ces compétences

sont clairement valorisables dans le domaine scientifique académique, elles le sont également

23

dans le secteur privé en particulier auprès des bureaux d’étude spécialisés dans l’évaluation de

la qualité et de la gestion de l’environnement.

3. Compétences en gestion de projet

Les compétences acquises en gestion de projet sont d’utilité universelle et donc

clairement transférables dans tous les domaines d’activités. Parmi celles-ci , il me semble

avoir développé les compétence suivantes : Formulation de problématique, planification,

réactivité, gestion des risques, gestion d’équipe, budgétisation, communication et ponctualité.

Une des principales étapes du projet de thèse a été d’identifier une problématique

précise, de formuler des questions de travail et, enfin, de les traduire en expérimentations

permettant de répondre à ces questions.

La gestion des risques liés à la réussite des expérimentations (choix des types de

mesure, gestion des erreurs de manipulation…) a aussi été déterminante. Lors de la dernière

année du projet, nous avons souhaité employer de nouvelles techniques avec le risque de se

rendre compte a posteriori de l’impossibilité de les appliquer à nos systèmes expérimentaux

et donc d’obtenir les réponses escomptées. Pour limiter ces risques, j’ai planifié

l’expérimentation de manière à pouvoir utiliser en parallèle plusieurs de ces techniques de

manière à maximiser les chances qu’au moins une d’entre elles donne des résultats

satisfaisants.

Le projet de thèse m’aura donné l’occasion d’encadrer plusieurs étudiants (du DUT au

Doctorat) et ainsi de développer mon sens de la gestion d’équipe. J’ai notamment eu

l’opportunité d’encadrer à deux reprises et pendant plusieurs semaines 2 à 3 étudiants en

parallèle. Ce fût donc l’occasion d’apprendre à planifier mon travail et celui d’autres

personnes et également de mieux maîtriser la transmission des savoirs et des techniques.

Enfin, l’apprentissage de l’art de la communication a été très enrichissant. La thèse

donne la possibilité, d’une part, de diffuser ses connaissances scientifiques auprès d’un public

de spécialistes et, d’autre part, de faire de la vulgarisation auprès d’un public plus large

comme le monde étudiant ou le grand public. Les supports de communications ont été très

variés, allant du poster de vulgarisation en français lors de ma participation aux Doctoriales à

la publication scientifique en anglais à destination des spécialistes du domaine. Les phases

d’enseignement ont été pris des formes diverses depuis le cours magistrale jusqu’aux travaux

pratiques sur le terrain.

24

IV. Projets professionnels post-doctorat

1. Projet professionnel dans la recherche académique

Aux vues des raisons qui m’ont amené à partir en thèse et de la satisfaction

personnelle que cette expérience me procure, mon premier objectif reste de poursuivre dans le

domaine de la recherche académique. Pour mener à bien ce nouveau projet, je souhaite partir

travailler à l’étranger pour une expérience post-doctorale. Une destination privilégiée serait

l’Australie, d’une part, parce qu’il s’agit d’un pays anglophone et, d’autre part, parce que son

système de recherche dans le domaine de l’agronomie et de l’environnement apparaît

particulièrement performant, articulant en étroite collaboration recherches fondamentale et

finalisée.

D’un point de vue pratique, je souhaiterais passer une année supplémentaire en France

après la fin du doctorat, d’une part, pour des raisons familiales et, d’autre part, pour achever

pleinement la valorisation scientifique de mon projet de thèse.

Les contacts scientifiques que possède mon directeur de thèse dans ce pays devrait être

un atout pour trouver un bon laboratoire et un sujet d’étude qui me convient. En revanche,

l’obtention du financement de mon salaire dépendra principalement de la qualité scientifique

de mon dossier et notamment du nombre de publications issues de ma thèse. Ce dernier point

justifie également de prendre du temps après la fin du projet de thèse pour maximiser ma

production scientifique.

2. Projet professionnel dans le secteur privé

En parallèle de mon projet de poursuivre mon activité professionnelle dans la

recherche académique, j’envisage également de réintégrer le secteur privé en combinant plus

étroitement ma formation initiale d’ingénieur en agriculture et celle de doctorat. Deux pistes

professionnelles me paraissent alors envisageables.

D’une part, mon profil d’agronome me permet de postuler dans les instituts techniques

agricoles (Arvalis, CTIFL7, CETIOM8…) en orientant mes compétences sur le lien entre

agriculture et préservation de l’environnement en zone agricole. Sur ce type de poste, je

devrais mobiliser mes connaissances agronomiques de terrain en les associant à ma vision

plus large des problèmes de contamination des milieux agricoles acquises durant ma thèse. Il

me faudra savoir aller de la planification des expérimentations au champ jusqu’à la 7 CTIFL : Centre Technique Interprofessionnel des Fruits et Légumes 8 CETIOM : Centre Technique des Oléagineux Métropolitains

25

communication des résultats auprès des professionnels, principalement des agriculteurs. Mon

stage de fin d’études d’ingénieur, axé sur l’évaluation de l’impact environnemental des

produits phytosanitaires et des fertilisants appliqués en arboriculture et réalisé au sein du

CTIFL, pourrait ainsi être un atout supplémentaire. Cependant, il me faudra réactiver, voire

renforcer mes compétences techniques en agronomie acquises au cours de mes études

d’ingénieur.

D’autre part, de nombreux bureaux d’études s’intéressent à la gestion de

l’environnement en milieu agricole. Ces sociétés sont notamment à le recherche de personnes

compétentes dans la caractérisation des sols ainsi que dans l’évaluation de leur qualité

agronomique et des possibilités d’apports de déchets organiques (boues de station

d’épuration, déchets agricoles…). Je devrais donc mobiliser à la fois mes compétences

concernant les sols et l’agronomie ainsi que celles liées au montage et à la réalisation de

projet. J’aurai malgré tout à renforcer mes connaissances sur la législation associée aux

problématiques environnementales (droit sur les épandages de déchets en agriculture, droit et

directives sur la gestion et la qualité de l’eau…).

Les différents réseaux relationnels auxquels j’ai été associé devraient me permettre

d’établir des contacts avec les secteurs d’activités citées ci-dessus. Les relations établies

pendant mon stage de fin d’étude d’ingénieur au CTIFL ainsi qu’au cours de ma thèse avec

Arvalis me pemettront d’avoir une meilleur vision du marché d’emploi. D’autre part, je

bénéficie encore du réseau des anciens élèves de mon école d’ingénieur dont une partie

occupe des postes similaires à ceux que j’envisage. Enfin, mon laboratoire a également tissé

des contacts avec diverses bureaux d’étude dans le domaine de l’agriculture et de

l’environnement dont je devrais pouvoir bénéficier.

26

Résumé La rhizosphère, volume de sol soumis à l’influence des racines, est le siège d’intenses processus physico-chimiques induits par l’activité racinaire qui sont capables d’influencer le transfert sol-plante des métaux. Dans le contexte de la contamination en cuivre (Cu) des sols à antécédent viticole du Languedoc-Roussillon, mes travaux ont visé à identifier les principaux processus rhizosphériques déterminant la biodisponibilité de Cu pour le blé dur (Triticum turgidum durum L.). Une première expérimentation menée in situ sur une large gamme de sols a permis de montrer que la biodisponibilité de Cu était indépendante du pH du sol et principalement déterminée par le niveau de contamination du sol. Ces résultats ont pu être reliés à l’alcalinisation de plus de une unité pH observée dans la rhizosphère en sols très acides (pH < 5), qui a induit une forte diminution de la disponibilité de Cu. La comparaison ex situ des flux de prélèvement de Cu par le blé dur et de réapprovisionnement de Cu par le sol a montré que le réapprovisionnement de Cu en solution n’était pas systématiquement limitant, notamment dans les sols les plus contaminés. L’ampleur de l’alcalinisation de la rhizosphère est apparue linéairement corrélée au pH initial du sol, diminuant lorsque le pH augmente. Il a été confirmé que la faible biodisponibilité de Cu en sols très acides était la résultante de ce phénomène d’alcalinisation. L’activité racinaire a également induit des modifications de la concentration et des propriétés de complexation des matières organiques dissoutes (MOD) dans la rhizosphère. Ces modifications ont été responsables de l’augmentation de la disponibilité de Cu et, vraisemblablement, de sa biodisponibilité dans les sols neutres à alcalins. La biodisponibilité de Cu pour le blé dur apparaît donc principalement déterminée par les modifications de pH et de MOD induites par les racines dans la rhizosphère. Mots clés : Alcalinisation, Blé dur (Triticum turgidum durum L.), Cuivre, Labilité, Phytodisponibilité, Rhizosphère, Spéciation. Thèse réalisée à : INRA-Montpellier SupAgro UMR 1222 Biogéochimie du Sol et de la Rhizosphère 2 place Viala, bâtiment 12 34060 Montpellier Cedex 01

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