Caractérisation et optimisation des paramètres microbiens ... · caractÉrisation et optimisation...

CARACTÉRISATION ET OPTIMISATION DES PARAMÈTRES MICROBIENS DANS UNE PILE BIO-

ÉLECTROCHIMIQUE FONCTIONNANT AU LISIER DE PORC

Mémoire

Thomas Jeanne

Maîtrise en microbiologie agroalimentaire Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

© Thomas Jeanne, 2013

III

Résumé

Dans un contexte de croissance de la productivité agricole, de réduction du coût

des intrants, de valorisation des ressources et de cohabitation harmonieuse en

milieu agri-urbain par une réduction des odeurs et des sources de pollution

agroenvironnementales, il est primordial de développer des technologies

agroenvironnementales de valorisation énergétique et de réduction de l'impact

environnemental de l'industrie agricole. Les recherches sur les piles bio-

électrochimiques connaissent un développement important ces dernières années.

Les piles bio-électrochimiques produisent directement de l’électricité tout en

traitant un effluent pour en réduire les nuisances environnementales contribuant

ainsi à amener des solutions intéressantes à ces enjeux. Il reste cependant à

accroître leurs performances afin de rendre cette technologie utilisable à grande

échelle. Dans cette étude, nous avons pu identifier les populations microbiennes

intervenant dans le processus électrique et ainsi pu définir des paramètres de

fonctionnement permettant d'accroître notablement les performances électriques

lorsque le lisier de porc est le substrat utilisé dans la pile. Ce succès, rencontré

dans l'application du traitement et de la valorisation énergétique du lisier de porc,

permet d'être grandement optimiste en vue d'une mise à l'échelle industrielle non

seulement pour cette application, mais également pour d'autres effluents

organiques.

V

Table des matières

Résumé .................................................................................................................. III

Table des matières .................................................................................................. V

Liste des tableaux .................................................................................................. IX

Liste des figures ...................................................................................................... X

Liste des photos ..................................................................................................... XI

Liste des abréviations, unités et symboles ............................................................. XI

Remerciements .................................................................................................... XIII

Avant-Propos ........................................................................................................ XV

1 Introduction .......................................................................................................... 1

1.1 Problématique du lisier de porc ..................................................................... 1

1.1.1 Les surplus de lisier de porc au Québec ................................................. 1

1.1.2 Limitation de l’épandage et inconvénients .............................................. 1

1.2 Valorisation du lisier de porc .......................................................................... 2

1.3 Historique microbiologique des PBE ............................................................. 3

1.4 Fonctionnement et principe d'une PBE .......................................................... 4

1.5 Importance du métabolisme microbien pour la performance de la PBE ........ 6

1.6 Les bactéries électrophiles identifiées dans les PBE ..................................... 7

1.7 Les bactéries sulfato-réductrices ................................................................... 9

1.7.1 Classification ........................................................................................... 9

1.8 Les analyses de diversité microbienne par PCR DGGE .............................. 10

1.8.1 Principe ................................................................................................. 10

1.8.2 Avantages et limitations ......................................................................... 11

1.9 Le pyroséquençage 454 appliqué à l'écologie microbienne ........................ 12

1.9.1 Principe du séquençage 454 ................................................................. 12

1.9.2 Avantages et limitations ........................................................................ 13

VI

1.10 Expression de la performance d'une PBE .................................................. 15

1.10.1 Densité de puissance .......................................................................... 15

1.10.2 Courbes de performances électriques ................................................. 15

1.10.3 Rendement de Coulomb ...................................................................... 15

1.11 Hypothèses de l'étude ................................................................................ 16

1.12 Objectifs ..................................................................................................... 16

2 DEUXIÈME PARTIE : ARTICLE ......................................................................... 17

2.1 Abstract ........................................................................................................ 19

2.2 Introduction .................................................................................................. 19

2.2.1 Challenges faced by the swine manure management practices ............ 19

2.2.2 Microbial diversity of the swine liquid manure ....................................... 20

2.2.3 Microbial Fuel Cell ................................................................................. 21

2.3 Material and methods................................................................................... 23

2.3.1 Experimental unit ................................................................................... 23

2.3.1.1 Anodic chamber .............................................................................. 24

2.3.1.2 Cathodic chamber ........................................................................... 24

2.3.2 Physical and chemical parameters ........................................................ 24

2.3.3 Electrical parameters ............................................................................. 25

2.3.4 Sampling of SLM and DNA extraction ................................................... 25

2.3.5 qPCR amplification ................................................................................ 25

2.3.6 Pyrosequencing and bioinformatics ....................................................... 26

2.4 Results ......................................................................................................... 27

2.4.1 Electric current production ..................................................................... 27

2.4.2 Analysis of microbial communities ......................................................... 29

2.4.3 Phylogenic analysis using Unifrac method ............................................ 32

2.4.4 Rarefaction curves showing alpha diversity ........................................... 34

2.4.5 Spatial distribution of bacteria ............................................................... 35

2.5 Discussion .................................................................................................... 36

2.5.1 Anode bacterial population .................................................................... 36

2.5.2 Colonisation of the biofilm support......................................................... 37

2.5.3 Bacterial dynamic evolution in MFC ...................................................... 38

VII

2.5.4 Electrical performance and potential for scaling .................................... 39

2.6 Conclusion ................................................................................................... 40

Acknowledgments ............................................................................................. 40

3 TROISIÈME PARTIE : DÉFINITION DES PARAMÈTRES DE

FONCTIONNEMENT D'UN PILE BIO-ÉLECTROCHIMIQUE ET MISE À

L'ÉCHELLE ........................................................................................................... 43

3.1 Méthodologie ............................................................................................... 43

3.1.1 Modèle expérimental ............................................................................. 43

3.1.1.1 Anode ............................................................................................. 44

3.1.1.2 Cathode .......................................................................................... 45

3.1.1.3 Cuve ............................................................................................... 45

3.1.1.4 Oxydant et contrôleur de pH ........................................................... 46

3.1.2 Paramètres physico-chimiques de la FLLP ........................................... 48

3.1.2.1 Analyses de DBO5 et de DCO ........................................................ 48

3.1.2.2 Paramètres électriques ................................................................... 48

3.1.3 Préparation de la fraction liquide de lisier de porc (FLLP) ..................... 49

3.1.4 Milieux de cultures et isolement ............................................................ 49

3.1.5 Enrichissement du support bactérien .................................................... 51

3.1.6 Extraction d'ADN et amplification par PCR ........................................... 52

3.1.7 DGGE pour les bactéries totales ........................................................... 54

3.1.7.1 Normalisation des Gels DGGE ....................................................... 54

3.1.7.2 Séquençage des bandes DGGE identifiées et des bactéries isolées

................................................................................................................... 55

3.2 Résultats ...................................................................................................... 55

3.2.1 Identification des paramètres de contrôles ............................................ 55

3.2.2 Optimisation de l'oxydant à la cathode et propriétés ............................. 59

3.2.3 Effet de la température sur la performance de la PBE .......................... 61

3.2.4 Analyse de la diversité microbienne par PCR-DGGE............................ 62

3.2.4.1 Comparaison de la diversité bactérienne entre les dispositifs ........ 62

3.2.4.2 Effet du pourcentage d'inoculum sur les performances des PBEs . 65

3.2.5 Isolement des souches d'intérêt ............................................................ 66

VIII

3.2.6 Résultats d'enrichissement des bactéries du biofilm anodique .............. 67

3.3 Discussion .................................................................................................... 72

3.3.1 Choix du dispositif (objectif 2) ................................................................ 72

3.3.2 Les paramètres de contrôle de la pile bio-électrochimique (objectif 2) .. 72

3.3.2.1 Le pH et le potentiel d'oxydoréduction de la FLLP .......................... 72

3.3.2.2 Le potentiel électrique à l'anode ..................................................... 73

3.3.2.3 La DBO5 et la DCO ......................................................................... 74

3.3.3 Le développement du consortium anodique (objectif 1) ........................ 74

3.3.4 Potentiel des piles bio-électrochimiques (Objectif 3) ............................. 75

3.3.4.1 Comparaison avec les technologies du marché.............................. 75

3.3.4.2 Possibilité d'application et spécifications......................................... 77

3.3.5 Mise à l'échelle (Objectif 3) .................................................................... 77

3.3.5.1 Recommandations pour la conception d'un modèle de 80 litres ..... 77

3.4 Conclusion ....................................................................................................... 81

4 Conclusion Générale .......................................................................................... 83

5 Références ......................................................................................................... 85

IX

Liste des tableaux

Tableau 1.1 : Performances maximales obtenues en PBE avec différents substrats

................................................................................................................................ 3

Tableau 2.1 List of primers for qPCR .................................................................... 26

Tableau 2.2 V6-V8 Sequences Metrics ................................................................. 30

Table 2.3 Common bacteria family and their relative abundance (%) ................... 31

Table 2.4 Quantification (relative fold against reference) of total bacteria ............ 35

Table 2.5 Quantification (relative fold against reference) of Porphyromonadaceae

family ..................................................................................................................... 36

Tableau 3.1: Milieux de cultures utilisés ................................................................ 51

Tableau 3.2: Conditions d'enrichissement ............................................................. 52

Tableau 3.3: Liste des amorces utilisées ............................................................... 54

Tableau 3.4 : Évaluation des valeurs limites observées pour les paramètres de

contrôles testés ..................................................................................................... 59

Tableau 3.5: Récapitulatif des isolements bactériens ............................................ 66

Tableau 3.6 : Récapitulatifs des populations bactériennes d'intérêt identifiées par

séquençage 454 dans le support bactérien de la PBE .......................................... 68

X

Liste des figures

Figure 1.1: Les différentes configurations de PBE (Rabaey & Rozendal 2010) ....... 4

Figure 1.2: Les différents types de mécanismes de transfert des électrons ............ 5

Figure 1.3 : Schématisation simplifiée du métabolisme bactérien (Madigan &

Martinko 2000) ......................................................................................................... 6

Figure 1.4: schématisation des mécanismes réactionnels mises en oeuvre dans

une PBE biologiquement catalysée à l'anode et à la cathode (Rabaey et al. 2007).

................................................................................................................................ 7

Figure 1.5: Étapes menant à la séparation par DGGE (Nakatsu 2007) ................. 11

Figure 1.6 : Principe des principales technologies de séquençage (Medini et al.

2008) ..................................................................................................................... 13

Figure 1.7: Schématisation des étapes nécessaires au traitement bio-informatique

des séquences obtenues par séquençage 454 ..................................................... 14

Figure 2.1: Experimental model for the study ........................................................ 24

Figure 2.2: Electrical performance for the MFC. .................................................... 28

Figure 2.3: Polarization curve for Pmax calculation ............................................... 28

Figure 2.4: Two dimentional PcoA showing plot for each combination of the first

three principal coordinates (beta diversity) ............................................................ 33

Figure 2.5: Alpha diversity rarefaction plots of phylogenetic diversity .................... 34

Figure 3.1: Vue éclatée d'une PBE ........................................................................ 44

Figure 3.2 : Schéma des deux dispositifs testés .................................................... 47

Figure 3.3: Comparaison de la performance électrique du pH et du potentiel redox

du lisier en fonction du dispositif ............................................................................ 57

Figure 3.4 : Effet du dispositif sur la stabilité des paramètres d'opérations ........... 58

Figure 3.5: Relation entre la tension, le pH et la [H2O2] du milieu oxydant ........... 60

Figure 3.6 : Transfert de cations à travers la MEC vers le liquide oxydant ............ 61

XI

Figure 3.7 : Histogramme présentant la proportion relative des populations

bactériennes identifiées par PCR-DGGE en fonction du type d'échantillon et du

dispositif expérimental. .......................................................................................... 64

Figure 3.8: Comparaison de la tension des PBE inoculés avec différents

pourcentage d'inoculum microbien de support anodique. ..................................... 65

Figure 3.9 : Performance électrique obtenue pour chaque condition

d'enrichissement lors du départ d'une PBE. .......................................................... 69

Figure 3.10 : Gel DGGE présentant la diversité bactérienne des supports

bactériens après enrichissement en milieu synthétique (A) et après fonctionnement

dans une PBE pendant 7 jours (B). ....................................................................... 71

Figure 3.11 : Dendrogramme permettant de comparer la diversité bactérienne

entre les échantillons de support bactérien. .......................................................... 71

Figure 3.12: Cas d'une demande équilibrée de la cathode ................................... 79

Figure 3.13: Cas d'une demande trop forte de la cathode .................................... 80

Liste des photos

Photo 3.1: Vue de face d'une unité PBE ............................................................... 43

Photo 3.2: Dispositif expérimental ......................................................................... 44

Liste des abréviations, unités et symboles

ADN: Acide désoxyribonucléique

BLAST: Acronyme des termes anglais «Basic Local Alignment Tool»

CEM : Acronyme des termes anglais «Cation Exchange Membrane»

XII

Ct: Cycle treshold

CTAB: Cetyl trimethylammonium bromide

dNTP : dinucléotide triphosphate

DGGE: Acronyme des termes anglais «Denaturing Gradient Gel Electrophoresis»

EDTA : acide éthylène-diamine-tétraacétique

FLLP: Fraction Liquide de Lisier de Porc

MEC: Membrane Échangeuse de Cation

MFC : Acronyme des termes anglais «Microbial Fuel Cell»

Mtep : Million de Tonne d'équivalent pétrole

PBE: Pile Bio-Électrochimique

PCR: Acronyme des termes anglais «Polymerase Chain Reaction»

qPCR: PCR quantitative

rpm: Rotation par minute

SLM : Acronyme des termes anglais «Swine Liquid Manure»

TAE: Tris acide acétique EDTA

TBE: Tris Borate EDTA

Tris: Trihydroxymethyl-amino-methane

Ω : Ohm

mW⋅m-2: Milliwatt par mètre carré de surface cathodique

W⋅m-3: Watt par mètre cube de réacteur

V: Tension en Volt

XIII

Remerciements

Je tiens à remercier l'IRDA de m'avoir permis de faire ma maîtrise dans les

meilleures conditions possibles. J'ai ainsi pu allier du début à la fin, travail et

études dans le contexte de ce projet de recherche.

Je remercie également l'ensemble du personnel du laboratoire d'écologie

microbienne de l'IRDA et particulièrement Guyanne D'Astous pour son aide dans

les réalisations techniques en biologie moléculaire et en microbiologie. Comme à

son habitude, elle a su être minutieuse et précise malgré certains échantillons qui

n'étaient pas très agréables à l'odeur...

Je remercie ensuite Richard Hogue et Daniel Yves Martin pour leurs grandes

disponibilités et tous leurs précieux conseils. Leurs expériences en recherche

m’ont énormément aidé à structurer ma démarche scientifique et à analyser mes

résultats. Je remercie également Hani Antoun pour sa gentillesse et son soutien

dans ma démarche.

Je remercie enfin ma conjointe et mes enfants pour leur soutien et pour leur

compréhension face à ces longues soirées de rédaction.

XV

Avant-Propos

Les travaux présentés dans ce mémoire font suite à l'étude menée par le

chercheur Daniel Yves Martin de l'IRDA entre 2007 et 2011 visant à développer les

piles bio électrochimiques dans le domaine agricole.

Après avoir présenté la littérature pertinente pour introduire la problématique de

l'étude, la première partie du mémoire présente un article déposé dans la revue

Applied and Environmental Microbiology (AEM) en mai 2013. La deuxième partie

du mémoire définit les paramètres de fonctionnement de la pile bioélectrochimique

aussi bien en termes de design, de paramètres cathodiques et du développement

microbien à l'anode.

Le modèle expérimental utilisé pour cette étude est directement en lien avec un

brevet déposé en octobre 2011 visant à protéger à tous les niveaux, la pile bio

électrochimique développée à l'IRDA, permettant de valoriser et de traiter un

effluent organique agricole. Le procédé est également connu sous l'appellation

BioVeeVMD (TM), marque déposée en décembre 2012. Ce mémoire est déposé

avec une retenue d'un an pour la diffusion, car certains résultats de cette étude

pourraient également servir dans le cadre d'un dépôt de brevet concernant les

paramètres de fonctionnement biologique de la pile bio électrochimique BioVeeV.

L'ensemble des expérimentations a été réalisé dans les locaux de l'IRDA, situés au

2700, rue Einstein à Québec.

1

1 Introduction

1.1 Problématique du lisier de porc

1.1.1 Les surplus de lisier de porc au Québec

Près de 7 millions de porcs (FDPPQ, 2013) produisent chaque année, entre 5 et 8

millions de mètres cubes de lisier (Dutil et al., 2003). Ces effluents organiques

constituent une source importante de matières nutritives dont les effets doivent

être maîtrisés (Penuelas et al., 2009) afin de limiter les impacts néfastes sur

l’environnement que provoquent de fortes doses d'azote, de phosphore et de

potassium. De plus, les dégagements d’odeur sont de plus en plus pris en compte

au niveau de l’acceptabilité sociale de cette industrie (Luo et al., 2002; Luo et al.,

2011; Westerman et al., 2000).

1.1.2 Limitation de l’épandage et inconvénients

Les normes provinciales de la fertilisation basées sur les besoins en phosphore

des cultures sont de plus en plus contraignantes en ce qui a trait à l’épandage de

lisier de porc au Québec. Certains agriculteurs se retrouvent ainsi avec des surplus

à gérer et doivent trouver des solutions alternatives (Chantigny et al., 2006). Dans

d’autres cas où l’épandage est possible, il y a une volonté internationale croissante

de limiter les gaz à effet de serre. Dans cette optique, l’IRDA a développé une

technologie visant à séparer la partie liquide de la partie solide du lisier de porc. Ce

procédé de séparation permet ainsi de concentrer le phosphore dans la partie

solide tandis que la partie liquide peut alors être utilisée comme fertilisant

organique. Malgré cela, ces résidus organiques pourraient être davantage

valorisés, notamment au niveau de la production énergétique.

2

1.2 Valorisation du lisier de porc

Une des approches visant à valoriser les effluents organiques est la valorisation

énergétique par la production d’hydrogène et de méthane (Logan, 2004). Cette

technologie permettant de traiter des lisiers et fumiers n’est pas nouvelle. Des pays

comme l’Allemagne valorisent depuis des dizaines d’années des résidus par bio-

méthanisation. Ce procédé, souvent utilisé en bi-substrat, est maintenant très

répandu en Europe avec plus de 3500 méthanisateurs en Allemagne en 2006

(APESA, 2007), et près du double actuellement. Le nombre d'installations est

également en forte croissance dans toute l'Europe, qui s'était fixé comme objectif

d'atteindre 15 Mtep d'énergie primaire produite à partir de biogaz en 2010.

L’élément clé de l’expansion de cette technologie a été initié par des volontés

politiques permettant de rendre économiquement viable cette application de

valorisation. Il n'y a actuellement que peu de biométhanisateurs au Québec et ceci

s'explique en partie par le manque de programme politique visant à promouvoir la

production d'énergie verte à partir de résidus agricoles. En Ontario, ce

développement est un peu plus amorcé avec des incitatifs économiques plus

marqués (Brodeur et al., 2008).

Les piles bio-électrochimiques (PBE) sont encore à un stade de recherche très

fondamentale, cependant, le principe de cette technologie semble intéressant du

point de vue de la facilité de mise place et par le fait qu’en comparaison avec la

bio-méthanisation, elle ne nécessite pas de co-génératrice. De plus, les piles bio-

électrochimiques ne présentent pas autant de risques à gérer comparativement à

la biométhanisation suite au stockage de grandes quantités de méthane et aux

fuites potentielles de ce gaz à effets de serre. Une PBE est un dispositif qui

convertit l'énergie chimique en énergie électrique par la réaction catalytique de

microorganismes. Il se compose généralement d'un compartiment anodique et

d'un compartiment cathodique séparées par une membrane échangeuse de

cations.

3

1.3 Historique microbiologique des PBE

Les PBEs sont en développement depuis plus de 20 ans avec différents types de

réacteur utilisant diverses sources de carburant comme les sédiments marins, les

digestats de réacteurs anaérobies ou les effluents d’épuration. Selon les auteurs,

on peut noter à l’heure actuelle des performances très variables allant jusqu'à

4310 mW/m2 de surface cathodique (tableau 1.1). Ce procédé a longtemps été à

l’étude en milieu contrôlé se rapprochant ainsi des fondements d’une pile

électrochimique. Mais ces dernières années les meilleurs résultats ont été obtenus

avec des milieux complexes d’effluents et avec le développement de consortia

microbiens indigènes à l’effluent. Des efforts d'optimisation ont été investis en

fonction des différents éléments constituant une PBE que ce soit à l'anode, à la

cathode, ou sur les paramètres de fonctionnement.

Tableau 1.1 : Performances maximales obtenues en PBE avec différents substrats

Effort d'optimisation Chambre Inoculum Substrat P(mW/m2) ref.

Cathode Simple Eaux usées Eaux usées 26 Liu & Logan 2004a

Anodophile consortium Double Boues de digesteurs Glucose 3600 Rabaey et al.,2003

Configuration Simple Boues de digesteurs Glucose 788 Park & Zeikus, 2003

Inoculum spécifique Double Geobacter spp. Acetic acid 15 Bond & lovley, 2003

Electrode, substrat Double Rhodoferax spp. Glucose 8,2 Chaudhuri 2003

Electrode Simple Boue anaérobie Lactate 10,2 Park et al., 2001

Concentration de bactéries Double Shewanella sp. Lactate 3,6 Kim et al., 2002

Transfert, état physiologique Double Escherichia coli Glucose 0,5 Park & Zeikus, 2000

Configuration, Inoculum Double Boues de digesteurs Boues de digesteurs 4310 Rabaey et al., 2004

Configuration, cathode Double FL LP FL LP 3000 Martin 2011

Tableau adapté de (Angenent et al., 2004)

Dépendant de la configuration de la pile et du substrat utilisé, l’optimisation du

développement du consortium microbien présente un enjeu très important de la

réussite du procédé. Il apparaît primordial de connaître les paramètres physico-

4

chimiques menant à instaurer un consortium efficace au sein d’une pile bio

électrochimique afin d’éviter des problématiques liées notamment aux populations

bactériennes méthanogènes (Rittmann, 2006).

1.4 Fonctionnement et principe d'une PBE

On peut identifier deux grandes catégories de PBE avec un ou deux

compartiments. (Bond et al., 2002; Delong & Chandler, 2002; Liu & Logan, 2004).

Selon les développements les plus récents, les PBEs les plus performantes sont

celles qui fonctionnent à deux compartiments (figure 1.1).

Figure 1.1: Les différentes configurations de PBE (Korneel Rabaey & R. A.

Rozendal, 2010)

5

Au niveau des mécanismes de transfert des électrons entre les bactéries

électrophiles et l'anode, trois types de mécanismes ont été décrits: par contact

direct, par des nano liaisons (Lovley, 2008), ou par des intermédiaires

métaboliques (Rabaey & Verstraete, 2005)(figure 1.2). Le premier mécanisme de

transfert par contact direct serait le plus efficace en termes d'énergie livrable, mais

on retrouve plus souvent les deux autres mécanismes, notamment dans les PBE

utilisant les effluents complexes. Ce mode de transfert des électrons peut être

amplifié par la notion de biofilm conducteur et un transfert via le cytochrome c. Le

mécanisme impliquant des nanofibres est encore très novateur et a été identifié

chez quelques bactéries. Les nanofibres leurs permettent de s'inter relier en

utilisant des pili pour transférer leurs électrons. Enfin, selon le troisième type de

mécanisme de transfert des électrons, des molécules issues du métabolisme des

bactéries de la PBE agiraient comme des intermédiaires réactionnels qui

permettraient de fournir des électrons en étant réduit à l'anode. Les métabolismes

du soufre et du fer pourraient être impliqués (figure 1.4).

Figure 1.2: Les différents types de mécanismes de transfert des électrons

Parmi les bactéries qui peuvent directement transférer des électrons à l'anode, on

retrouve Geobacter sulfurreducens, Alteromonas sp. et Shewanella spp.

6

1.5 Importance du métabolisme microbien pour la performance de la PBE

L'étude approfondie des mécanismes réactionnels impliqués dans les PBE est

particulièrement importante pour pouvoir accroître leur potentiel. Sur la figure 1.3,

qui représente une schématisation simplifiée d'un métabolisme bactérien, on peut

identifier que, selon le type de microorganisme, certaines réactions anaboliques

permettent de dégrader et d'utiliser les nutriments de la matière organique. Dans

un second temps, différents accepteurs d'électrons peuvent intervenir d'un point de

vue catabolique. On comprend alors que selon le type de microorganisme et selon

son abondance, plus ou moins d'énergie sera utilisée par ces mêmes

microorganismes et le surplus pourra être utilisé et capté par la PBE. Le

rendement de Coulomb permet de comparer ce potentiel pour des bactéries

électrophiles.

Figure 1.3: Schématisation simplifiée du métabolisme bactérien (Madigan &

Martinko, 2003)

Nutriments

Macromolécules et composants cellulaires Source d'énergie

chimique ou lumineuse

Production d'eau, alcool, CO

2, acides,

accepteurs d'électrons.Energie pour la

biosynthèse

ANABOLISME

CATABOLISME

7

De nombreux auteurs décrivent les mécanismes réactionnels potentiellement mis

en œuvre aussi bien par des microorganismes à l'anode qu'à la cathode. Dans des

études de 2007 et 2008, les métabolismes impliquant la réduction du soufre et du

fer sont présentés comme les plus efficaces (Lovley, 2008) (figure 1.4). Ces

bactéries utilisent ainsi des métabolites secondaires issus de la fermentation

d'autres microorganismes (Holmes et al., 2007; Jung & Regan, 2007). Si par

contre d'autres bactéries colonisent l'anode, comme des méthanogènes ou des

bactéries aérobies, les performances deviennent très faibles (Lee et al., 2008).

Figure 1.4: Schématisation des mécanismes réactionnels mis en œuvre dans une

PBE biologiquement catalysée à l'anode et à la cathode (Rabaey et al., 2007).

1.6 Les bactéries électrophiles identifiées dans les PBE

La complexité des effluents ou des substrats organiques à traiter par les piles bio-

électrochimiques laisse penser qu'une communauté bactérienne complexe est

nécessaire pour permettre la dégradation de cette matière organique (Kiely et al.,

2010b). Cependant des bactéries du genre Shewenella ou Geobacter sont les plus

8

étudiées par les équipes de recherche travaillant sur les PBEs. Au niveau des eaux

usées, Shewanella oneidensis et Geobacter sulfurreducens ont pu être isolées et

leurs performances dans des PBE ont été comparées à celles des piles

constituées de cultures bactériennes mixtes (Call et al., 2009; Watson & Logan,

2010). La volonté de travailler avec des monocultures était essentiellement basée

sur le fait que certaines de ces bactéries ont un rendement de Coulomb très élevé

et qu'en ne sélectionnant que ces bactéries, les performances seraient les plus

prometteuses (Bond & Lovley, 2003; Bond et al., 2002; Chaudhuri & Lovley, 2003).

Plus récemment, le chercheur Daniel Yves Martin (Martin, 2011) a mis en évidence

des bactéries sulfato-réductrices et un mécanisme bio-électrochimique faisant

intervenir le métabolisme du soufre. Dans ce modèle expérimental, le métabolite

intermédiaire est le H2S (Martin, 2011). Pour des raisons d’équilibre, cette molécule

se répartira sous la forme HS- et H2S selon le pH de l’effluent (Speece, 2008). Au

départ d'une pile neuve avec du lisier de porc, les particules de charbon activé, qui

constituent le support bactérien, captent le HS- et, en étant conducteur et reliées à

l'anode, elles favorisent l’oxydation de cette molécule en relâchant des protons et

du soufre élémentaire S0. Après une période d'accumulation de S0 dans le support

bactérien, la colonisation de celui-ci par des bactéries sulfato-réductrices permet

le relâchement d’un métabolite sous la forme du couple H2S-HS-. Celui-ci pourra à

son tour s’oxyder au contact du charbon activé ou de l’anode augmentant ainsi le

flux d’électrons émis par la PBE au fur et à mesure que la communauté

bactérienne sulfato-réductrice prend de la maturité.

On peut ainsi résumer les étapes réactionnelles suivantes :

1) Au niveau des microorganismes :

CH3COO- + 3H2O → CO2 +HCO3- +8H+ + 8e- et S0+ 8H+ + 8e- => 4 H2S

2) Au niveau de l’anode :

4 H2S → 4 S0+ 8H+ + 8e-

3) Au niveau de la cathode :

4 H2O2 + 8H+ + 8e- → 8 H2O

9

Les données microbiologiques sont encore récentes dans le domaine des PBEs et

nettement moins abondantes que pour la digestion anaérobie (Lee et al., 2003).

La diversité des mécanismes réactionnels mis en œuvre et la complexité des

substrats étudiés mettent en avant des défis de recherche à venir afin d'accroître

les performances des PBEs.

1.7 Les bactéries sulfato-réductrices

Au regard des recherches antérieures sur les PBEs fonctionnant au lisier de porc,

la famille des bactéries sulfato-réductrices semble particulièrement importante à

étudier. Cette famille de bactéries regroupe les micro-organismes qui réduisent les

sulfates ou les sulfures pendant la respiration. Ce type d'accepteur terminal

d'électron est une voix métabolique anaérobique obligatoire où le donneur

d'électron peut provenir de plusieurs sources de substrats dont les acides

organiques, acides gras et alcools. Le produit final de cette chaîne est du H2S.

1.7.1 Classification

On observe 3 grands groupes de réducteurs de sulfates et de sulfures.

1. les réducteurs de sulfates de groupe I : Ils utilisent le lactate, le pyruvate, les

acides gras et les alcools, et produisent de l'acétate.

2. Les réducteurs de sulfates de groupe II : Ils utilisent l'acétate et produisent

du CO2 en réduisant le SO4 en H2S.

3. Les réducteur de sulfures : Ils utilisent l'acétate et l'éthanol comme donneur

d'électron et réduisent les sulfures en H2S en condition anaérobie stricte (Madigan

& Martinko, 2003).

10

1.8 Les analyses de diversité microbienne par PCR DGGE

1.8.1 Principe

La PCR DGGE permet d'étudier la diversité microbienne d'un échantillon d'ADN

complexe. Pour ce faire, les ADN sont amplifiés par PCR avec une paire

d’amorces universelles (16S rRNA) dont l’une des amorces contient une séquence

3’ variant de 18 à 35 bases G-C. Les amplicons générés portent une courte

séquence G-C qui stabilisera l’amplicon lorsque ce dernier migre dans un gel de

polyacrylamide avec un gradient dénaturant de plus en plus important (figure 1.5).

L'ADN ne va pas se dénaturer de manière linéaire, mais de manière progressive,

de domaine en domaine. La migration va ainsi être affectée par la dénaturation des

différents domaines des deux brins d'ADN. Théoriquement, des fragments

différents d'une seule base ne s'ouvriront pas au même moment et ne migreront

donc pas à la même position (Desmarais & Roizes, 1994). Un profil PCR-DGGE

constitué des diverses bandes (amplicons dénaturés) pourra être caractéristique

des communautés microbiennes présentes dans l’échantillon. L’analyse

comparative des profils DGGE permet d’évaluer l’impact des traitements sur

chacune des communautés microbiennes étudiées.

11

Figure 1.5: Étapes menant à la séparation par DGGE (Nakatsu, 2007)

1.8.2 Avantages et limitations

La PCR-DGGE a été largement utilisée les vingt dernières années en écologie

microbienne et particulièrement dans la recherche concernant la diversité

microbienne des sols. Lorsque cette technique est couplée à une bonne analyse

informatique de l'image, plusieurs échantillons peuvent être comparés entre eux,

12

aussi bien pour des systèmes de détection PCR généraux (16S ou 18S rRNA) au

niveau bactérien ou fongique, que pour des systèmes plus spécifiques (Valášková

& Baldrian, 2009). Certains auteurs ont toutefois identifié des limitations,

notamment dans le cas de faibles différences entre deux séquences ADN, où des

séquences non identiques pouvaient ne pas être différentiables (Jackson et al.,

2000). De plus, lorsque l'on désire obtenir les séquences ADN de bandes

identifiées par DGGE, l'excision des bandes et le clonage préalable au

séquençage, sont des tâches qui peuvent s'avérer longues et problématiques dans

certains cas de figure (Gafan & Spratt, 2005).

1.9 Le pyroséquençage 454 appliqué à l'écologie microbienne

La technologie de séquençage 454 de Roche est la première technologie des

nouvelles générations de séquençage mise sur le marché (Rothberg & Leamon,

2008). Cela a répondu à une demande très forte du milieu scientifique désirant

depuis des années augmenter la quantité et la rapidité du séquençage. Cette

technologie est désormais en compétition avec d'autres technologies dont les plus

connues sont SBS d'IIlumina et SOLID de ABI. Les applications de ces nouvelles

technologies de séquençage sont aussi variées que le séquençage humain, l’étude

des petits ARN, la métagénomique, la structure des génomes et la génomique

comparative.

1.9.1 Principe du séquençage 454

Le principe de la technologie est d'associer aux fragments d'ADN à séquencer,

deux adaptateurs qui pourront ainsi, après une amplification en émulsion sur les

microbilles, être séquencés en microplaques. Lorsqu'il y a correspondance d'une

base, il y a libération de pyrophosphate inorganique et par la suite production

d'ATP qui va être utilisée par de la luciférase produisant ainsi un signal lumineux

capté par une caméra CCD (figure 1.6).

13

Figure 1.6: Principe des principales technologies de séquençage (Medini et al.,

2008)

1.9.2 Avantages et limitations

Le séquençage 454 est particulièrement adapté aux études de méta-génomique

où l'on analyse la diversité des communautés microbiennes d'un environnement. Il

n'est plus nécessaire de cloner des fragments PCR pour pouvoir obtenir leurs

séquences ADN. Par rapport aux autres technologies, la technologie 454 permet

de produire directement de longs fragments (environ 400 pb), ce qui facilite par la

suite les travaux de bio-informatique nécessaires à l'interprétation des données de

séquençage. Les autres technologies sont, par contre, plus intéressantes de par la

profondeur qu'elles apportent du fait que le nombre de séquences est beaucoup

plus important. Les technologies comme celles d'Illumina ou de SOLID sont

souvent utilisées dans le cas de séquençage complet des génomes d'un

environnement. Les séquences obtenues sont beaucoup plus petites que pour le

Adaptateurs Microbille

PCR

Enzyme et amorcessur des billes

Polymérase

T

T/C/G/A

Lumière

ATP

ADNg

14

séquençage 454 et il est nécessaire de réaliser des assemblages afin de pouvoir

interpréter des données de séquençage. Les coûts relatifs aux nombres de

séquences sont également beaucoup moins importants que pour le séquençage

454.

Le traitement bio-informatique des données est donc très important dans cette

analyse. Dans le cas d'une analyse de méta génomique avec des séquences

issues de séquençage 454, les possibilités d'analyse sont très importantes et il est

nécessaire de bien cibler les besoins de l'étude (diversité alpha, diversité bêta ...)

(figure 1.7).

Figure 1.7: Schématisation des étapes nécessaires au traitement bio-informatique

des séquences obtenues par séquençage 454 (Qiime.org)

Librairie de séquences ADNQualité, Détection des donnéeschimériques

AnalysesTries et alignements des séquences

ClassificationRDP, BLAST

Arbresphylogénétiques

Diversité alphaCourbes de raréfactions

Diversité betaAbondances relativesPCoA

assign_taxonomy.pymake_otu_table.py

pick_otus.pypick-rep_set.py

align_seqs.pyfilter_alignment.py

make_phylogeny.py

single_rarefaction.py

beta_diversity.py

15

1.10 Expression de la performance d'une PBE

L'expression de la performance d'une PBE est particulièrement importante pour

comparer les différentes avancées scientifiques réalisées par les chercheurs dans

le domaine des PBE. Différentes unités sont rencontrées selon le type de PBE et

selon la nature de l'expression des résultats. On parle le plus souvent de densité

de puissance, de puissance volumique, et de puissance maximale théorique. Le

coefficient de Coulomb est également utilisé afin de comparer le potentiel des

bactéries électrophiles.

1.10.1 Densité de puissance

La densité de puissance s'exprime normalement en fonction de la section projetée

de l’anode ou de la cathode et est donnée en mW·m-2. On peut également

rapporter la sortie de puissance en fonction du volume du réacteur. Cette

puissance volumique est exprimée en W·m-3 du réacteur (Logan et al., 2006).

1.10.2 Courbes de performances électriques

Souvent représentées ensemble, les courbes de polarisation et de puissance

permettent de calculer la puissance maximale théorique que pourrait produire une

PBE et la résistance interne de la pile. Cette donnée peut être établie à partir des

données de tension en circuit ouvert (simulant une résistance infinie) et en circuit

fermé (résistance connue). Une valeur de la résistance optimale et la résistance

interne peuvent ainsi être déterminées.

1.10.3 Rendement de Coulomb

Le coefficient d'efficacité de Coulomb permet de mesurer le ratio entre la quantité

d'électricité générée par le système à un moment donné par rapport à la quantité

totale d'électricité que peut générer un substrat. (Logan et al., 2006) Ce coefficient

est particulièrement utile pour comparer le potentiel des différentes bactéries

16

électrophiles entre elles dans un même effluent. Il faut, par contre, pouvoir isoler

chaque bactérie avant de pouvoir le mesurer en condition de fonctionnement.

1.11 Hypothèses de l'étude 1.11.1 Hypothèse 1

La caractérisation précise des populations microbiennes d’une PBE fonctionnant

au lisier de porc, dont celles liées au soufre, et la détermination des paramètres

limitant leur croissance, permettraient de développer un modèle expérimental.

1.11.2 Hypothèse 2

Le contrôle des paramètres limitant permettrait d’utiliser ce modèle afin de

développer un prototype à l’échelle industrielle.

1.12 Objectifs

1.12.1 Objectif 1 : Caractériser, à l’aide des méthodes de PCR-DGGE et de

séquençage, les populations bactériennes d'une PBE, dont celles de la chambre

anodique, qui interviennent dans le processus de transfert d’électrons.

1.12.2 Objectif 2 : Selon la prémisse que le transfert d’électrons fait intervenir

l’élément soufre, un modèle expérimental de réacteur de 350 ml, relié ou non à

une cuve de 5 litres de FLLP, sera utilisé pour déterminer les paramètres physico-

chimiques et électriques nécessaires à la colonisation des bactéries cibles.

1.12.3 Objectif 3: Proposer des recommandations selon ces paramètres, en vue de

la construction d’un prototype industriel d'un réacteur d'un mètre cube.

17

2 DEUXIÈME PARTIE : ARTICLE

Cette première partie présente les résultats en lien avec l’objectif 1 concernant

l'identification des populations bactériennes électrophiles du biofilm qui se forme

sur les particules de charbon activé, le support bactérien de la chambre anodique.

Ces résultats ont servi par la suite à mettre en place une méthode

d'enrichissement des populations microbiennes du biofilm en vue de

l'augmentation des performances de la PBE, Ces résultats ont aussi servi à la mise

à l'échelle du procédé et de l'évaluation des perspectives d'application à d'autres

effluents organiques. La première partie de ce mémoire fait l’objet d’un article

scientifique rédigé en anglais et soumis à la revue Applied and Environmental

Microbiology (AEM).

18

Title: 16s METAGENOMIC CHARACTERIZATION OF THE MICROFLORA IN A SWINE

LIQUID MANURE MICROBIAL FUEL CELL

Running title: Microflora of a swine liquid manure MFC

Authors: #Thomas Jeanne1*, IRDA, 2700 Einstein, Québec, QC.

#Richard Hogue, IRDA, 2700 Einstein, Québec, QC.

#Daniel Yves Martin, IRDA, 2700 Einstein, Québec, QC.

#Patrick Dubé, IRDA, 2700 Einstein, Québec, QC.

1 Corresponding author. Mailing address: Institut de Recherche et de Développement en

Agroenvironement, 2700 Einstein, Québec, QC, G1P3W8, Canada. Phone: (418) 643-2380#423. Fax: (418) 644-6855. E-mail: [email protected].

19

2.1 Abstract

In recent years, there has been a growing need to develop alternative energy

sources to fossil fuels. , In that context, biomass valuation appears as an essential

sustainable approach. A wide range of technologies promoting biomass valuations

is available and many are already marketable. The management of organic wastes

has been widely studied in the context of agricultural applications, but recent

advances, allow the development of new applications combining the treatment of

these organic wastes with the production of energy.

The biological remediation process of the liquid phase swine manure initiated in

microbial fuel cells (MFC) can produce electricity directly, whereas

biomethanization cell produce methane that will be burned to power a generator

that will produce electricity. The latter technology is less efficient producing

electricity. In this article, we use the latest sequencing technologies to identify the

bacterial populations involved in the production of electricity in a MFC operated

with liquid phase swine manure. Bacterial populations, settling in the anode

chamber, allow the production of metabolites and the release of electrons to the

electrode. Species from Planococcaceae, Porphyromonadaceae and Clostridiales

families were identified as having an important role in this process. The study,

based on a 350 ml experimental unit, define the control parameters to be taken into

account when scaling-up an MFC using liquid phase swine manure as fuel.

2.2 Introduction

2.2.1 Challenges faced by the swine manure management practices

About 7 million pigs (MAPAQ, 2006) yield annually between 5 and 8 million cubic

meters of manure in Quebec (Dutil et al., 2003). There is a significant risk of

20

contamination of groundwater and rivers (Penuelas et al., 2009) when nutrients

inputs provided by the manure cannot be absorbed by the soil and plants.

Reduction of greenhouse gas emissions appears to be a society main concern in

recent years (Commission sur l’avenir de l’agriculture et de l’agroalimentaire

Québécois, 2008). Furthermore malodourous emission are increasingly taken into

account for the industry social acceptability (Luo et al., 2002; Luo et al., 2011;

Westerman et al., 2000). As a result, many farmers must find more sustainable

alternatives to their wastes management practices (Chantigny et al., 2006). Next to

anaerobic digestion, which is most developed in Europe, the microbial fuel cell

(MFC) appears to be a technology that offers great potential in the treatment of

swine liquid manure (SLM) to produce energy and useful by-bioproducts while

reducing undesirable ecological consequences (Martin 2011).

2.2.2 Microbial diversity of the swine liquid manure

In order to develop a biological process involving SLM as a source of nutrients and

microorganisms, it's important to acknowledge that the bacterial community in SLM

is dependent on many factors. The composition of SLM is very complex and

contains numerous volatiles fatty acids (VFA), alcohols, aromatic compounds,

amides and sulphides (Bouity-Voubou et al., 2008). SLM bacterial communities are

directly derived from the gastrointestinal populations in the animal. The bacterial

diversity of the SLM is altered by many factors, such as the swine barn

environment, the nature of feedstuff given to the animals, the rearing conditions,

the hygienic practices, and the manure management practices. Due to the physico-

chemical characteristics of swine manure, bacterial populations are largely

anaerobic and facultative anaerobic. Recent studies revealed cultivable bacteria

species detected in SLM (Pryde et al., 1999) but there is still a lot of undefined

species (Bouity-Voubou et al., 2008). This study identified numerous gram-positive

low G+C bacteria in the Clostridium genus.

21

2.2.3 Microbial Fuel Cell

MFC have been under development for over 20 years with different types of

reactor using various fuel sources such as marine sediments, anaerobic digestates

or effluents from wastewater treatment plants.

Many studies were carried out on using synthetic or natural media in combinations

with monoculture or mixed bacterial cultures. The best performances were

obtained with MFC using an industrial wastewater that produced 45 W/m3 (Rabaey

et al., 2005). Using synthetic media, the MFC generated a power of 4300 mW/m2.

Current trends show that research efforts are focused on using real substrates

involving indigenous bacteria (Fornero et al., 2010).

Two broad categories of microbial fuel cells can be identified, with one or two

compartments (Boon et al., 2002; Delong & Chandler, 2002; Liu et al., 2004).

Three types of electron transfer mechanisms between bacteria and anode have

been described: by direct contact, by nano links, (Lovley, 2008) or by intermediate

metabolite components (Rabaey & Verstraete, 2005).

Studies on MFC have been very active over the last 10 years in order to provide

environmental and economic solutions to organic waste treatment management by

industry and agriculture. Performances of MFC developed by few research

institutions are very promising for scaling up this process. (Logan et al., 2006)

2.2.4 Electrophilic bacteria identified in MFC

The complexity of the organic matter used in MFC processes, suggests that a

complex bacterial community is necessary for an efficient treatment of organic

matter degradation (Kiely et al., 2010a). Bacteria of the genera Geobacter and

Shewenella are the most studied among the research teams working on the MFC.

In terms of wastewater, Shewanella oneidensis and Geobacter sulfurreducens

22

have been isolated and were compared with mixed cultures in MFC (Call et al.,

2009; Watson & Logan, 2010). More recently (Fornero et al., 2010), researchers

highlighted sulfur-reducing bacteria involving sulfur metabolism as a metabolic

pathway to produce electricity. However, data on the microbial ecology of MFC are

scarce compared to publish literature on anaerobic digestion and biomethanization

(Lee et al., 2003).

2.2.5 Issue and problems encountered

The study of the biological and physico-chemical parameters for the establishment

of specific populations in a MFC is particularly important in order to obtain a stable

and efficient process. (Rittmann, 2010). The MFC configuration as well as

knowledge of the effluent properties may have a direct impact on the target

microbial populations. The electrochemical activity of bacterial communities is a

key of the success to obtain a high performance MFC. These microorganisms must

be identified in order to select the optimum controlled parameters (Rabaey et al.,

2007).

Next-generation DNA sequencing technologies developed in recent years can

improve the quality and accuracy of earlier PCR-DGGE and cloning experiments

(Boon et al., 2002). The next-generation sequencing technologies now allow a

quick analysis of a large number of DNA sequences for metagenomic studies

(Caporaso et al., 2010; Mardis, 2008).

The purpose of this study is to determine the bacterial species diversity of the

anodic biofilm of a high performance MFC, and to study their spatial distribution

with quantitative PCR tools targeting total and specific bacteria of the anodic

biofilm. As a result, this study will provide a better understanding of the operation

parameters to maintain in order to get the best power output and provide

recommendations for scaling-up the MFC process.

23

2.3 Material and methods

2.3.1 Experimental unit

The experimental unit is a 3rd generation MFC unit with two separate chambers

(anode and cathode). The anodic chamber is linked to a SLM tank with a capacity

of 5 liters, while the cathodic chamber is linked to a 10 liters reservoir containing an

oxidizing liquid (figure 2.1). Two peristaltic pumps can circulate the SLM in the

stack. The cell consists of two chambers (anodic, 350 ml and cathodic, 100 ml)

separated by a cations exchange membrane (CEM) (CMI-7000, Membranes

International Inc., Ringwood, NJ, USA).

24

Figure 2.1: Experimental model for the study (numbers 1 to 9 indicate the sampling

areas in each anodic areas 1 and 2)

2.3.1.1 Anodic chamber

The anodic chamber is composed of two areas, each containing 40 g of activated

charcoal (Sigma Aldrich, St-Louis, MO, USA) contained in a stainless steel

electrode (SS316, Grillage Major Inc., Québec, QC, Canada). The activated

charcoal is inoculated with 10% (v/v) of colonized activated charcoal sampled in an

anodic chamber of a 40 days MFC used with the same SLM source. Upstream of

the two anodic areas, a buffer area containing a volume of 300 ml of SLM is

separated by the perforated anodic electrode to the anodic chamber section. The

input SLM is located on top of the first anodic area and the output of the SLM is

located at the bottom of the SLM area.

2.3.1.2 Cathodic chamber

The cathodic chamber is separated from the anode by the cation exchange

membrane. The cathode is composed of platinum as catalyzer and a stainless

steel electrode (SS316, Grillage Major Inc., Québec, QC, Canada). The platinum

based cathode and the oxidizing liquid are IRDA proprietary components (IRDA

Inc., QC).

2.3.2 Physical and chemical parameters

The pH and redox potentials were measured in the recirculating swine liquid

manure tank. The redox potential was measured using an Ag/AgCl sensor

(MF2709, BASI, Lafayette, IN, USA). A thermocouple was used to measure the

temperature variation within the SLM tank.

25

2.3.3 Electrical parameters

The voltage was measured with a data acquisition module (CR10-Campell

Scientifics, Edmonton, AB, Canada). Data were recorded on a disk drive of a

personal computer every 5 minutes. Current and power density of the MFC were

calculated as I=V/R and P=VI/A, where A is the projected surface area of anode

electrode and R is the electrical external resistance. The adjustable resistance

range varied from 0 to 100 ohm.

2.3.4 Sampling of SLM and DNA extraction

Samples of initial SLM, anodic chamber recirculated manure (RM) and activated

charcoal pellets (AC) were extracted with a CTAB buffer (100 mM Tris-HCl [pH

8.0], 100 mM sodium EDTA [pH 8.0], 100 mM sodium phosphate [pH 8.0], 1.5 M

NaCl, 1% CTAB) in tubes containing silica and metal beads using a fast multiorbital

shaker. Total DNA were purified using QIAquick column (Qiagen, Toronto, ON,

Canada). For AC samples, a volume of 3 ml of sludged pellets was sampled and

washed with 5 ml of sodium pyrophosphate 0.001 M (Sigma Aldrich, St-Louis, MO,

USA). This washing step was repeated three times with 15 min of shaking at 100

rpm, and then the DNA of the activated charcoal biofilm of the pelleted suspension

was extracted. The DNA quality and quantity were controlled with a

spectrophotometer at 260 and 280 nm (A260/A280).

2.3.5 qPCR amplification

Quantitative PCR amplifications were performed with the thermocycler

CFX96Touch (Biorad, Mississauga, ON, Canada) with a Quantitech SYBRgreen

mastermix (Qiagen, Toronto, ON, Canada) in 10 µl volume of reaction. Primers

26

were used at final concentration of 25 mM.

For each gene target, a reference range was done in triplicate with a pool of

samples and an internal control. The internal control was made by spiking samples

with known concentrations of potato DNA and following the cox gene target.

Primers used are listed in table 2.1. For the detection of the Porphyromonadaceae,

specific primers were defined using the operational taxonomic unit (OTU)

representative of the pyrosequencing sequence as target on the primer blast

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Tableau 2.1 List of qPCR primers

Name Sequence Target Reference

Eub338 ACTCCTACGGGAGGCAGCAG Total bacteria Kiely et al., 2010a

534R ATTACCGCGGCTGCTGG Total bacteria Kiely et al., 2010a

PsulfF CTCGTGCCGTGAGGTGTCGG Porphyromonadaceae This study

PsulfR CGGACGTAAGGGCCGTGCTG Porphyromonadaceae This study

Cox F CGTCGCATTCCAGATTATCCA Cox gene Qu et al., 2008

Cox R CAACTACGGATATATAAGAGCCAAAACTG Cox gene Qu et al., 2008

2.3.6 Pyrosequencing and bioinformatics

Selected samples were amplified using primer and barcode sequence to produce a

508 bp fragment (Kirchman et al., 2010). The amplified products were sequenced

using the GS FLX sequencer and titanium chemistry (Roche, Branford, CT, USA).

27

Bioinformatics analysis were done using programs in the Quantitative Insights Into

Microbial Ecology (QIIME) (Caporaso et al., 2010) under the Unix platform.

Sequences were assigned to OTUs using a threshold of 97% pairwise identity. A

single representative from each OTU was aligned using Pynast (Caporaso et al.,

2010) and classified taxonomically using the BLAST database (Altschul et al.,

1997). E-values are the quality scores assigned by the BLAST taxonomy assigner.

UniFract significance and principal coordinate analysis (PCoA) were calculated

using UniFrac analysis to measure the similarity of bacterial communities in the

different types of samples. Rarefaction analysis was done using Phylogenetic

Distance (PD_whole_tree) for the index of alpha diversity.

2.4 Results

2.4.1 Electric current production

In the first 8 days of the process, power generation increased from 150 to 400

mW⋅m-2 (figure 2.2). After a phase of slow growth until day 17, power generation

rose to 800 mW⋅m-2. At this stage, the MFC was considered to have reached its

maximum potential with this type of inoculum and effluent. Once the plateau

reached, the theoretical MFC maximum power output can be determined (figure

2.3). Observations made in the laboratory have shown that the cell can be

operated without loss of efficiency at 50% of its theoretical maximum performance.

This condition may be achieved by modulating the resistance applied to the

system. These elements involving the opened and closed circuit voltage are to be

considered as parts of the scaling-up parameters needed to control the MFC.

28

Figure 2.2: Electrical performance of the MFC.

Figure 2.3: Polarization curve for Pmax calculation

29

2.4.2 Analysis of microbial communities

After removing sequences of poor quality, there were a range of 1894 and 2770

tags for each bacterial community: initial SLM, recirculated SLM and biofilm on

activated charcoal pellets (table 2.2).

Relative abundance data were obtained from 16s rRNA sequences libraries.

Anodic biofilm diversity revealed that at day 8, Planococcaceae increased from

trace amounts to 57% compared to SLM bacterial diversity (table 2.3). After that

time period, it's abundance decreased to 27% and 3% at days 18 and 40

respectively. Three families parented to Clostridiales, increased continuously and

reached a total abundance of 63% after 40 days. The amount of Clostridiales in the

inoculum, started at 28%. The family of Porphyromonadaceae first decreased from

14% to 6% at day 8 and then increased to 8% and 15% at days 18 and 40

respectively. Main decreases for SLM bacterial diversity were observed for

Bacteroidaceae and Pseudomonodaceae.

For RM samples, the abundance of these three targets were unchanged compare

with SLM bacterial abundance except for Porphyromonadaceae were abundance

at day 35 in RM increased to 30%. Bacteroidaceae and Pseudomonodaceae

conserved abundance near 10% for each group.

Next to these main populations, the amount of bacterial families or species cited in

MFC studies like Moraxella, Alcaligen and Desulfuromonadaceae seems to be

specifics to activated charcoals samples but these populations are still in minority

regarding bacterial communities with relative abundance of 1.5%, 0.9% and 0.1%

respectively.

30

Tableau 2.2 V6-V8 Sequences Metrics

Sample Sample Type Date (Days) Average Sequences/Sample

SLM Swine Liquid Manure 0 2770

ACInoculum Charcoal NA* 2336

AC_8 Charcoal 8 2389



RM_18 Swine Liquid Manure 18 2470

RM_40 Swine Liquid Manure 40 2528

*Activated charcoal from 40 days MFC operated

31

Table 2.3 Common bacteria family and their relative abundance (%)

SLM

AC In

ocul

um

AC_D

ay8_

rep1

AC-D

ay8_

rep2

RM

_Day

18

AC_D

ay18

_rp1

AC_D

ay18

_rp2

RM

_Day

35

AC_D

ay40

Planococcaceae 0 6 60 54 3 31 28 2 3 Porphyromonadaceae 15 26 6 8 14 8 6 30 17 Clostridiales F.XI** 7 5 10 10 7 17 23 8 15 Clostridiaceae 3 2 5 5 1 19 14 3 34 Bacteroidaceae 38 4 1 3 14 1 0 9 1 Clostridiales (order) 2 20 5 7 5 9 10 5 14 Pseudomonadaceae 10 7 0 0 21 0 0 10 0 Xanthomonadaceae 6 2 1 1 13 1 1 2 1 Oceanospirillaceae 1 8 0 0 5 0 0 9 0 Streptococcaceae 2 3 1 2 1 2 3 1 3 Moraxellaceae 1 0 3 1 0 3 4 0 2 Lachnospiraceae 1 1 3 3 2 1 1 1 0 Ruminococcaceae 3 1 0 0 3 1 1 1 1 Erysipelotrichaceae 2 1 1 1 1 1 2 0 1 Carnobacteriaceae 1 0 1 0 0 1 2 0 1 Alcaligenaceae 0 2 1 1 1 2 1 0 1 Bacteroidales (order) 1 1 0 0 1 0 0 3 0 Desulfobacteraceae 0 0 0 0 0 0 0 4 0 Catabacteriaceae 1 0 0 0 1 0 1 0 1 Lactobacillaceae 0 0 1 1 1 0 1 0 0 Acholeplasmataceae 1 1 0 0 1 0 0 1 0 Desulfuromonadaceae 0 0 0 0 0 0 2 0 0 Sphaerochaetaceae 0 1 0 0 1 0 0 1 0 Veillonellaceae 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Peptococcaceae 0 0 0 0 0 0 0 0 1 Succinivibrionaceae 1 0 0 0 1 0 0 0 0 Spirochaetaceae 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Clostridiales F.XIII 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Corynebacteriaceae 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Comamonadaceae 0 0 0 0 0 0 0 0 0 others 4 2 1 1 5 2 2 11 4 Grouping of OTUs by family (or order) taxonomic levels. **:Incertae Sedis

32

2.4.3 Phylogenic analysis using Unifrac method

The weighted Unifrac PCoA measures community composition by considering

bacterial abundance (Fierer et al., 2010; Lozupone et al., 2007). On figure 2.4, the

biological and technical replicate of two charcoal samples can be evaluated at days

8 and 18. They are very similar in each PCoA. This can validate the sampling and

the technical approach of pyrosequencing. On figure 2.4-A, one may observe that

charcoal and manure samples are well separated in term of similarity degree. RM

of day 8 is closer to SLM than RM from day 35. Charcoal from day 40 is more

similar to RM from day 35 than charcoal from days 8 and 18. On the other side of

the analysis (figure 2.4-B) it can be observed that charcoal samples from days 8

and 18 stay very similar, but for day 40, on this axis, they are more similar to RM

from day 8. RM from day 35 is found at the opposite and appear to be more

dissimilar than the others samples. The last side of the analysis (figure 2.4-C)

showed that RM from day 8 and SLM are again very similar to charcoal from days

8 and 18. Charcoal from day 40 and RM from day 35 were found less similar.

33

A B

C

Figure 2.4: Two dimensional

PcoA showing plot for each

combination of the first three

principal coordinates (beta

diversity)

34

2.4.4 Rarefaction curves showing alpha diversity The alpha diversity measures the diversity within a sample. By integrated

phylogenetic metric it's possible to estimate the amount of each sample. On figure

2.5, the richness of bacteria within the SLM, RM and charcoal samples can be

observed and compared at the plateau of each curve. The highest level of diversity

is observed for SLM with an index of 5. This level decrease to 3 in the RM sample

at day 35. Charcoal of day 8 and RM of day 35 present the lowest levels of

diversity. Charcoal of day 18 and 40 reach a level of 3.7.

Figure 2.5: Alpha diversity rarefaction plots of phylogenetic diversity

35

2.4.5 Spatial distribution of bacteria Quantification of total bacterial target revealed that the level of total bacteria is

higher in the anodic biofilm of compartment one than in the anodic biofilm of

compartment two (table 2.4). The anodic biofilm of the compartment one is

relatively homogenous, with a variation between 17 to 46 fold. The higher value is

found in the top right part of the compartment. In comparison, compartment two

has a range from 2 to 35 times the reference. Regardless of the compartment, the

area in the top is always higher than the bottom.

For the level of the Porphyromonadaceae family involved in MFC, the same result

can be observed between compartment one and two (table 2.5) but for

compartment one, all the area are similar with a level between 29 and 47 times the

reference. In compartment one a huge variability of the level was observed for

Porphyromonadacea with values between 3 and 75 times the reference.

Table 2.4 Quantification (relative fold against reference) of total bacteria

Anode 1 Left Center Right Total Top 17 27 46 90

Middle 26 24 30 79 Bottom 29 24 17 70 Total 72 75 92 Anode 2 Left Center Right Total

Top 25 27 7 59 Middle 3 17 9 28 Bottom 2 7 35 44 Total 29 51 51

36

Table 2.5 Quantification (relative fold against reference) of Porphyromonadaceae family

Anode 1 Left Center Right Total Top 29 43 47 119

Middle 34 38 39 111 Bottom 44 42 35 121 Total 107 122 122 Anode 2 Left Center Right Total

Top 49 44 15 107 Middle 6 32 15 54 Bottom 3 20 75 98 Total 59 96 105

Spatial distribution of selected bacterial target

2.5 Discussion

2.5.1 Anode bacterial population

Bacterial populations that grow specifically in the anode chamber have the ability to

hydrolyze proteins, glucose, casein, cellulose and pyruvate as well as smaller

organic compounds such as acetate and small acids. These secondary molecules

can also be used by other bacteria, such as Desulfuromonadaceae with specific

metabolism and participate in the electrophilic potential of the MFC.

Clostridiales and Desulforomonadaceae have already been cited as anodophilic

bacteria, wich are able to transfer their electrons to an electrode (Angenent et al.,

2004; Park et al., 2001; Shimoyama et al., 2009). The bacterial consortium

developed at the anode oxidizes organic material in the anode chamber and the

reduced intermediates are then transferred to the electrode.

37

Clostridiales are strict anaerobes, and mostly sulfate reducing bacteria. They are

well known for their role in nitrogen fixation (Purushothaman et al., 1980). More

recently, various studies have shown their ability to reduce sulfur and thiosulfate

(Escoffier et al., 2001, Escofier et al., 1998; Sallam & Steinbüchel, 2009). Some

species of Clostridium can also resist oxidative stress (Briolat & Reysset, 2002).

The Porphyromonadaceae family is developing more regularly in the MFC and

could also transfer electrons from sulfur metabolism. This family of Bacteroides

consists only of two genus and has already been identified in high abundance

(50%) in an MFC with a reconstituted organic effluent (Rothberg & Leamon, 2008),

and in other studies (Ishii et al., 2012; Kodama et al., 2012). However, no electron

transfer mechanism was identified.

Regarding the role of Planococcacea, their rapid but transient development could

be due to a limitation of metabolites in the MFC, and the competition with other

bacteria such as Clostridiales. The parameters that develop in the anode chamber

quickly degrade the living conditions for this type of bacteria.

Among the minor populations, Moraxella and Alcaligenes have already been cited

in MFC (Korneel Rabaey & Willy Verstraete, 2005) articles and are anaerobic

bacteria which can grow in the presence of nitrates. Their role in the process

seems minor. For Desulforomonadacea, this anaerobic population appears to be

secondary in the degradation chain, because they need secondary metabolites

such as acetate; however, they are important in the metabolism of sulfur.

2.5.2 Colonisation of the biofilm support

Targets of qPCR analysis were chosen to estimate the level of colonisation in the

different areas of the MFC. Total bacteria are important to evaluate the capacity of

colonisation independently of bacterial composition. The high relative amount of

bacteria in compartment one, can be explained by the flow input of RM. Nutrients

38

are delivered first in this part of the MFC, then to compartment two. Compartment

two is separated from the RM compartment of the MFC with a stainless steel grate

and the wide opening can generate preferential flow. A second factor could also

explain the low level of total bacteria in this section of the stack. It has been

observed that when the concentration of peroxide oxidizing liquid is too high, it

could damage the EMC and thus pass small amount of oxidant in the anode

compartment.

For the level of Porphyromonadacea, the constant level in compartment one shows

that this biofilm population colonised the different parts of the compartment. This

result is important because this population, which has been defined in the bacterial

diversity as a MFC specific population, is an indicator that all compartment one can

contribute to delivering metabolite intermediates to the anodic electrode. In term of

volume or area of reactor, it's important to be sure that all the bacterial support can

contribute in order to obtain the best performances. For compartment two, it will be

important to identify the causes of the lower level of colonisation. This could be

accomplished by investigating the stainless steel layer that separates the anodic

compartment from the RM area, in order to find better and more resistant CEM and

possibly to change the location of the input port of the RM.

2.5.3 Bacterial dynamic evolution in MFC

At the start-up of an MFC, the inoculum, which represents an addition of 10% (v /

v) of total bacterial support, can provide a source of bacteria more specialized than

those present in the SLM. Intitially the SLM with its high bacterial diversity (alpha

diversity), that provide metabolic nutrients to the bacteria colonizing and forming a

biofilm on the anode support. It was observed that the bacteria of the

Planococcaceae family, grow very quickly and can use and degrade the organic

matter of the SLM. Their rapid growth rate then decreases in favour of bacteria

families or species that will grow steadily on the activated charcoal in the MFC to

form a biofilm of specialized bacteria.

39

Biofilm formation and recirculating manure thus generates less abundant, but more

specialized bacteria. Moreover, Clostridiales families play a complementary role to

these more specialized bacterial families like Porphyromonadacea and

Desulfuromonadaceae, which are related to specific metabolisms like the sulfur

cycle. When the physico-chemical parameters of RM become limiting for

specialized bacteria in the MFC, it is necessary to provide additional nutrients to

the bacteria in the anode compartment. During our experiments, we observed that

the processing capacity of an MFC operated with SLM allows a reduction of 50% to

60% of the Chemical Oxygen Demand COD (data not shown).

2.5.4 Electrical performance and potential for scaling

The results obtained in this study relate the bacterial population that have

electrochemical activity, and involved in the process of the MFC. The

performances obtained are close to the best MFC with a complex substrate. After

18 days of operation, the MFC produced a constant value of 450 mW⋅m-2 in

operation and a maximum potential of 3200 mW⋅m-2. At this step, it was observed

that the MFC can be constant in terms of power generation, if operating conditions

do not exceed 50% of the maximum power calculated. After this phase of

treatment, physical and chemical parameters of the RM became limiting for

anodophilic populations.

The described process allows a continuous performance over a long period. The

design of the MFC was chosen, in order to be transferable to industry and

agriculture. In this context and to reduce the production cost of the MFC, recent

results have enabled a new cathode, made with another material than platinum.

Platinum is extremely expensive, so it seemed important to find alternative before

starting scaling-up the MC unit.

While testing the MFC with the new cathode, the same results were obtained for

bacterial diversity, and performance was increased by about 15%. At this stage,

40

each step forward, for example in the control of the operation cycle or for the

temperature of the anode compartment, can significantly increase the performance

of the MFC. Using this new MFC design, we observed that output powers continue

to increase over time and reach 188 W⋅m-3 or 5100 mW⋅m-2 (data not shown,

patent pending).

2.6 Conclusion

This study identified the bacterial population that are the major components of a

MFC fueled with swine liquid manure. Mostly Clostridiales and

Porphyromonadaceae families were identified in the biofilm of anodic support by

pyrosequencing 454 analysis. Green energy production by MFC, implements a

bacterial consortium where each population has a role, in the degradation of

organic matter, and electrochemical activity, based on a metabolic intermediate

potentially of the sulfur cycle. Results obtained through new sequencing

technologies and qPCR, will be crucial for the monitoring of the enrichment

process of the bacterial consortium that need to be implemented to increase MFC

performance and to allow a successful scaling-up.

Moreover, detailed studies of metabolites dynamics involved in this process could

complement microbial diversity analysis to facilitate the application of this

technology to other industrial or agricultural effluents.

Acknowledgments

This work was funded by The Research and Development Institute for the Agri-

Environment. We thank Guyanne D'Astous for her help with sample collection,

Hani Antoun and Mathieu Girard, for their suggestions and comments.

43

3 TROISIÈME PARTIE : DÉFINITION DES PARAMÈTRES DE FONCTIONNEMENT D'UN PILE BIO-ÉLECTROCHIMIQUE ET MISE À L'ÉCHELLE

3.1 Méthodologie

3.1.1 Modèle expérimental

Le modèle expérimental choisi est un modèle de 3ième génération qui découle des

travaux de Daniel Yves Martin en 2011 (photo 3.1, figure 3.1). Lors de mes travaux

de maîtrise, certaines modifications à ce modèle ont permis d'aboutir à un modèle

stable permettant l’étude des paramètres de fonctionnement d'une PBE.

Photo 3.1: Vue de face d'une unité PBE

44

Figure 3.1: Vue éclatée d'une PBE

Photo 3.2: Dispositif expérimental

3.1.1.1 Anode

L'anode de la PBE est composée de deux sections circulaires, chacune

comprenant une électrode en acier inoxydable (SS316, Grillage Major Inc.,

45

Québec, QC, Canada) et un support microbien composé de charbon actif

analytique (Sigma, St-Louis, MO, É.U.). Ce support, sélectionné entre 2007 et

2010, a permis à ce jour de développer une meilleure croissance de consortium

microbien et de performance électrique. Le charbon actif permet, grâce à certaines

propriétés « adsorbantes » liées à sa structure particulière, de capter du HS- et de

le stocker sous forme de soufre élémentaire, qui sera à son tour utilisé par les

bactéries de la chambre anodique.

3.1.1.2 Cathode

Lors de mes travaux de maîtrise, des recherches spécifiques concernant la

cathode se faisaient en parallèle à mes expérimentations. Pour faciliter

l'interprétation et pour concentrer mes efforts sur la partie microbienne du projet, il

a été choisi d’utiliser une cathode constituée d’une toile en acier inoxydable

(SS316, Grillage Major Inc, Québec, QC, Canada) électro-plaquée avec du platine.

Le platine est le catalyseur de réaction majoritairement utilisé pour les PBEs. Une

autre cathode développée par l'IRDA servira dans le dernier volet concernant les

phases d'enrichissement du consortium bactérien anodique. Cette cathode électro-

plaquée présente des innovations de conception qui sont actuellement en dépôt de

brevet et apportent une performance accrue à un coût nettement moindre que le

platine.

Le compartiment anodique et le compartiment cathodique sont séparés

physiquement par une membrane échangeuse de cations (MEC) (CMI-7000,

Membranes International Inc, Ringwood, NJ, É.U.) qui est préalablement

conditionnée dans une solution 0,1 M de NaCl pendant 24 h.

3.1.1.3 Cuve

Une cuve d'une capacité maximale de 5 litres est utilisée pour permettre une

circulation continue de la fraction liquide de lisier de porc. Pendant les phases

expérimentales, un volume de 2 litres de FLLP a été utilisé. Deux dispositifs ont

été testés, soit en recirculation mais non connectée à la cuve ou soit connectée à

la cuve (débit de circulation de 0,1 litres⋅min-1; figure 3.2). Les dispositifs n’étaient

46

pas équipés pour mesurer une production potentielle de biogaz (les résultats

préliminaires sur le modèle expérimental ne révélaient pas de production de

biogaz). Il a été choisi d'étudier les deux dispositifs en parallèle car lors des

premiers essais, le dispositif en recirculation semblait manquer de stabilité et cela

aurait pu avoir des effets importants sur les paramètres analysés pour les objectifs

de l'étude.

3.1.1.4 Oxydant et contrôleur de pH

La section cathodique d'un volume de 100 ml de la PBE est immergée dans un flux

circulant d'oxydant en milieu acide. Un contenant de 10 litres relié à une sonde de

pH et à un contrôleur de pH permet de maintenir les conditions de fonctionnement

au pH souhaité avec une solution concentré de H2SO4 0,1 N. Pour l'oxydant du

peroxyde d'hydrogène est utilisé à une concentration variant de 0,01M à 0,03 M.

La concentration de l'oxydant est ajustée manuellement durant les cycles de

fonctionnement avec une solution de peroxyde d'hydrogène 30 % v/v.

47

Dispositif 1: recirculation

Dispositif 2: Unité reliée à une cuve

Figure 3.2 : Schéma des deux dispositifs testés

Vue de dessus

Anode

Lisier

Cathode

Oxidant

Modèle de PBE en recirculation

Vue de dessus

Anode

FLLP

Cathode

OxidantFLLP

Modèle de PBE relié à une cuve

48

3.1.2 Paramètres physico-chimiques de la FLLP

Le pH et le potentiel d'oxydo-réduction de la FLLP sont suivis avec une sonde de

pH et une sonde Ag/AgCl (MH 2079, BASI, Lafayette, IN, É.U.) par prélèvement de

15 ml de FLLP ou directement dans la cuve.

3.1.2.1 Analyses de DBO5 et de DCO

Les demandes chimiques et biologiques en oxygène permettent de mesurer le

niveau de traitement d'un effluent. On parle alors de pourcentage de réduction de

ces paramètres. Ce paramètre est important au départ afin de fournir une

concentration suffisante de matière organique à la PBE. La demande biologique en

oxygène se base sur la méthode décrite par (Eaton et al., 2005) et la demande

chimique en oxygène par la méthode du dichromate de potassium (CEAEQ, 2006).

3.1.2.2 Paramètres électriques

3.1.2.2.1 Suivi de la tension de la pile

Les PBEs sont reliées à un système d'acquisition de données (CR10, Campbell

Scientific, Edmonton, AB, Canada) et à une résistance variable. Les données de

tension en circuit fermé sont acquises en continue. Les données sont complétées

ponctuellement par des mesures directes avec un voltmètre pour obtenir des

données en circuit ouvert.

3.1.2.2.2 Puissance théorique

La puissance théorique peut être calculée avec les données de tension en circuit

ouvert et fermé à une résistance fixe. On obtient ainsi une courbe d'extrapolation

qui nous donne la puissance théorique maximale.

49

3.1.3 Préparation de la fraction liquide de lisier de porc (FLLP)

La FLLP est obtenue après séparation d’un lisier brut par un séparateur décanteur

centrifuge industriel (Martin & Léveillée, 2005). Le lisier brut provient de la préfosse

d'une ferme porcine de la région de Québec (2000 porcs place) avec des sujets

d’âges variés (plusieurs cycles de croissance en même temps au sein d'un même

bâtiment). La FLLP utilisée pour l'étude était la même (échantillonnée le 21 juin

2011) et conservée jusqu'à la dernière phase expérimentale (mai 2012) à 4°C. Les

paramètres physico-chimiques sont restés stables pendant la durée des essais.

Aucun traitement n'a été administré aux sujets pour la phase d'élevage qui a

produit le lisier ayant servi à l'étude.

3.1.4 Milieux de cultures et isolement

Quatre phases d'essai d'isolement ont eu lieu entre août 2011 et août 2012. Les

différentes stratégies d'isolement ont fait intervenir les milieux de culture décrits

dans le tableau 3.1. Pour chaque phase d'isolement, un effort particulier a été

effectué afin de sélectionner les bactéries du biofilm anodique. Les prélèvements

effectués à l’aide d’une spatule dans le compartiment anodique représentent une

vingtaine de grains (de diamètre compris entre 2 et 5 mm) de charbon activé, le

support bactérien anodique, et contiennent à la fois, le biofilm anodique, mais

aussi du lisier circulant environnant. Deux lavages par immersion avec 5 ml d'eau

stérile sont nécessaires afin d'éliminer le maximum de ce lisier environnant. Par la

suite le biofilm des grains est récupéré par agitation manuelle avec 5 ml de NaCl

0.85% pendant deux cycles de 5 min sous la hotte en anaérobie. Durant chacune

des phases d'isolement, les milieux de culture ont été sélectionnés en vérifiant la

disponibilité de la source de soufre élémentaire. La phase 1 de l'isolement

consistait à accroître par enrichissement puis isoler des espèces du genre

Desulfuromonas spp., en utilisant un milieu minimum supplémenté avec différentes

sources de donneurs d'électrons, à savoir, du malate, du fumarate et de l'acétate.

Afin d'obtenir les conditions les plus similaires à celles vécues dans la PBE, du

50

charbon neuf était ajouté en même temps que la suspension à isoler par

épuisement sur gélose nutritive. L'ensemble du dispositif est mis en agitation sous

hotte anaérobie puis la totalité de l’ADN du biofilm à la surface du charbon activé

est extrait et quantifié afin d'identifier les conditions permettant d'accroître le

nombre de bactéries du genre Desulfuromonas spp.

51

Tableau 3.1: Milieux de cultures utilisés

Milieu Spécification Cible Référence

MMS 4 phases d'enrichissement Desulfuromonas spp. (Bond & Lovley, 2003)

GYTS Porphyromonadaceae (Grabowski et al., 2005)

BHIS ± Kanamycine Bactéries anaérobes (Basis & Smith, 2008)

FLLP* Dilution 1/100 et 1/1000 Bactéries de PBE NA

*Fraction liquide de lisier de porc diluée 1/100 ou 1/1000 et stérilisée

3.1.5 Enrichissement du support bactérien

Les enrichissements du support bactérien ont été réalisés sous une hotte

anaérobie en inoculant 315 ml de charbon actif (Sigma, St-Louis, MO, É.U.) avec

35 ml de support bactérien provenant d'une pile mature de 50 jours de

fonctionnement. Afin de réaliser des comparatifs, différentes fractions de 35 ml du

même inoculum sont additionnées de glycérol (concentration finale 50 % (v/v)) puis

congelées à -80°C. Chaque condition d'enrichissement comprend une phase de

croissance en anaérobie de cinq jours avec un renouvellement du milieu nutritif

après 48 h et une deuxième phase de sept jours en pile avec acquisition des

données électriques à une résistance de 100 Ω. Des prélèvements aléatoires de

support bactérien sont réalisés en deux répétitions après chaque phase de

l'enrichissement. Les quatre conditions d'enrichissement sont listées dans le

tableau 3.2 de même que le nom des communautés bactériennes identifiées suite

à l'analyse des résultats de pyroséquençage 454 (voir la partie 1 du mémoire).

52

Tableau 3.2: Conditions d'enrichissement

Milieu Spécification Cible**

CMM Standard Clostridium spp.

GYTS Standard Bacteriodes

BHIS ± enrichissement ± Kanamycine Bactéries anaérobies

FLLP* Dilution 1/50 Bactéries de PBE***

*Fraction liquide de lisier de porc diluée 1/50 et stérilisée

**Populations ou groupe de bactéries ciblées par la condition d’enrichissement

***Bactéries étant adaptées aux conditions de vie de la fraction liquide de lisier de porc dont celles provenant du biofilm du support anodique de la PBE

3.1.6 Extraction d'ADN et amplification par PCR

Les lisiers et le biofilm du support bactérien ont été extraits avec un tampon

d'extraction CTAB (100 mM Tris-HCl [pH 8.0], 100 mM sodium EDTA [pH 8.0], 100

mM sodium phosphate [pH 8.0], 1.5 M NaCl, 1% CTAB) de manière directe pour

les lisiers circulants et indirects pour les biofilm. Pour les lisiers, 200 µL sont

centrifugés et 200 µl de silice additionnée de 600 µl de CTAB sont ajoutés au tube

puis agités pendant 2 cycles de 30 secondes. Après une incubation d'une heure à

60°C, l'ajout de 600 µl de chloroforme/alcool isoamylique permet par séparation de

phases et centrifugation de 15 min à 8000 rpm, de récupérer dans la phase

supérieure les ADN génomiques et de les précipiter avec 500 µl d'isopropanol et

une incubation de 16 h à -20°C. Après un lavage à l'éthanol 70 % (v/v) et une

digestion des ARNs avec l’ajout de 10-2 volume de RNase A (20 mg.ml-1) (Sigma,

53

St-Louis, MO, É.U.) les ADN obtenus sont purifiés sur minicolonne QiaQuick

(Qiagen, Toronto, ON, Canada) selon les instructions du fournisseur.

Pour les biofilms du support bactérien, 3 ml de charbon actif sont lavés deux fois

avec 5 mL d'eau pour éliminer le lisier circulant. Le biofilm est ensuite remis en

suspension par une succession de trois étapes d'ajout de tampon sodium

pyrophosphate 0,001M pH7 et avec une agitation 5 min à 100 rpm en tube de 15

ml horizontalement. Ces trois suspensions sont centrifugées dans un même tube

de 15 ml et les culots sont extraits de la même manière que les lisiers, mais avec

un volume de CTAB de 4 ml et un volume de suspension d'ADN génomique à

précipiter de 2 ml.

La quantité d'ADN est déterminée par absorbance à 260 nm et la qualité évaluée

par le ratio A260/A230 ainsi que par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8 % (p/v)

(Invitrogen, Burlington, ON, Canada).

Les amplifications PCR ont été réalisées avec un appareil de type PTC-200

(MJResearch-Biorad, Mississauga, ON, Canada). Les systèmes PCR utilisés sont

décrits dans le tableau 3.3.

Les réactions PCR sont réalisées dans un volume de 25 µl avec une polymérase

Hotstart (Giagen, Toronto, ON, Canada) dans 1.5 mM de MgCl2 , des dNTP à un

concentration finale de 0.2 mM et les amorces sont utilisées à une concentration

finale de 0.25 µM. Les conditions d'amplification pour le système des paires

d'amorces 341F/534R sont les suivantes : Activation de la polymérase 15 min à

94°C, 20 cycles avec une dénaturation 30 s à 95°C, un appariement des amorces

à 65°C avec une diminution de 0,5°C par cycle, suivie de 15 cycles additionnels de

30 s à 55°C. Les élongations pour chaque cycle sont réalisées en 30 s à 72°C.

L'élongation finale est de 10 min à 72°C.

Pour le système des paires d'amorces 63F/1378R, les conditions sont les mêmes

sauf pour l'appariement des amorces avec 35 cycles de 30 s à 55°C.

54

Les produits d'amplification PCR sont visualisés par électrophorèse sur gel

d'agarose de 1,6 % (p/v) avec un marqueur de poids moléculaire 100 pb

(Invitrogen, Burlington, ON, Canada).

Tableau 3.3: Liste des amorces utilisées

Nom Séquence Cible Référence

341F* ACTCCTACGGGAGGCAGCAG Bactéries (Muyzer et al., 1993)

534R ATTACCGCGGCTGCTGGCA Bactéries (Muyzer et al., 1993)

63F CAGGCCTAACACATGCAAGTC Bactéries (Marchesi et al., 1998)

1378R CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG Bactéries (Heuer et al., 1997)

* une chaîne riche en GC (Muyzer et al., 1993) est ajoutée dans le cas d'une PCR

réalisée pour une analyse ultérieure DGGE

3.1.7 DGGE pour les bactéries totales

Les produits d'amplification obtenus par PCR sont séparés sur gel en gradient

dénaturant à l’aide d’un système Dcode (Biorad, Mississauga, ON, Canada) dans

un gel de 10 % d'acrylamide et un gradient dénaturant de 40 %-60 % (pour 100 ml

de solution : solution 40 %, 16 ml de formamide (Labmat, Québec, QC, Canada) et

de 16.8 g d’urée (Sigma, St-Louis, MO, É.U.); solution 60 %, 24 ml de formamide

et 25.2 g d’urée). La migration est réalisée dans un tampon TAE à 60°C pendant

15h30 à 63 V. Les gels sont ensuite colorés au SYBR Gold (Invitrogen, Burlington,

ON, Canada) et numérisés sous UV à l'aide d'un système Geldoc XR+ (Biorad,

Mississauga, ON, Canada)

3.1.7.1 Normalisation des Gels DGGE

Les gels d'acrylamides obtenus par DGGE sont normalisés par le logiciel Phoretix

1D pro (Nonlinear, Newcastle, UK). Chaque gel contient trois puits réservés à un

55

marqueur composé de cinq produits PCR issus de clones de fragment 16S rRNA

de position connue. Chaque marqueur permet d'identifier cinq bandes réparties

dans les zones d'intérêt du gel DGGE. Le bruit de fond de chaque gel est corrigé

et les proportions relatives des intensités des pics par rapport à la valeur totale

d'intensité du profil DGGE sont calculées.

3.1.7.2 Séquençage des bandes DGGE identifiées et des bactéries isolées

Les bandes DGGE d'intérêt sont piquées dans un gel à l'aide d'une épingle

préalablement traitée aux U.V, puis resuspendues dans 10 µl d’eau stérile. Les

amplicons élués sont ré-amplifiés avec les amorces 341F et 534R avant d'être

séquencés par la plateforme de séquençage et de génotypage du CRCHUL

(Québec, QC, Canada). L'ADN extrait de chacune des bactéries purifiés par

isolement sur gélose nutritive, est amplifié avec les amorces 63F et 1378R puis

séquencé.

3.2 Résultats

3.2.1 Identification des paramètres de contrôles

Le début du projet s'est réalisé en trois phases. Dans un premier temps, il a fallu

réussir à identifier des paramètres généraux de fonctionnement des PBE en

fonction des données issues du modèle expérimental. Le suivi du pH et du

potentiel d'oxydoréduction est apparu comme étant primordial pour obtenir une

augmentation de la performance. Dans ce contexte, différentes expérimentations

ont été réalisées dans un dispositif en recirculation sans cuve en ayant comme

objectif d'obtenir une pile stable sur une période de plus de 10 jours. Des

56

prélèvements de support anodique et de lisier circulant ont également été réalisés.

Les performances obtenues ont encore été très instables et les conditions de pH et

de potentiel d'oxydoréduction très variables nécessitant ainsi un changement

fréquent de la FLLP (figure 3.3). Étant donné la nature microbiologique riche de la

FLLP avant son utilisation en PBE, il était primordial de trouver une solution à cette

instabilité de la PBE afin d'étudier et de suivre les populations microbiennes

impliquées dans le processus. En augmentant le volume total de FLLP en

circulation dans la PBE par l'utilisation d'une cuve d’une capacité de 5 litres, les

paramètres électriques et physicochimiques sont devenus beaucoup plus stables

dans le temps (Figure 3.4) et les changements de FLLP étaient moins fréquents.

Dès lors, il devenait plus facile d'entrevoir une phase d'étude des populations

microbiennes du biofilm anodique et de la FLLP circulante.

57

Figure 3.3: Comparaison de la performance électrique du pH et du potentiel redox

du lisier en fonction du dispositif. CF: Circuit fermé, CO: Circuit ouvert (dispositif de

recirculation avec cuve en haut et dispositif de recirculation sans cuve en bas) Une

résistance de 100 ohms est appliquée.

6,4

6,6

6,8

7

7,2

7,4

7,6

7,8

8

8,2

-600

-400

-200

0

200

400

600

800

1000

1200

J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14 J15 J16 J17 J18 J19 J20 J21 J22

Tens

ion

(mv)

Redox lisier CF (mv) CO (mv) Resist. Ω pH lisier

6,2

6,4

6,6

6,8

7

7,2

7,4

7,6

7,8

-600

-400

-200

0

200

400

600

800

1000

1200

J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14 J15 J16 J17 J18 J19 J20 J21 J22

pH

Tens

ion

(mv)

Redox lisier CF CO pH Lisier

58

Figure 3.4 : Effet du dispositif sur la stabilité des paramètres d'opérations. Une

flèche rouge signale un changement de FLLP (max pile signifie tension maximale

au borne d'une pile). La courbe verte représente la température moyenne du lisier.

Dans la deuxième phase, il fallait réussir à réaliser un échantillonnage sélectif du

biofilm anodique. Pour ce faire, des protocoles de préparation ont été testés afin

d'éliminer au maximum les traces de lisier circulant sur le support anodique et

d'identifier plus facilement les populations microbiennes du biofilm anodique. Cette

étape sera également importante pour les phases d'isolement et d'enrichissement

du projet.

Les résultats obtenus ont permis d'identifier les paramètres limitants permettant de

suivre l'établissement des populations anodiques et le bon fonctionnement d'une

PBE. Le tableau 3.4 résume les conditions d'opération observées dans les deux

59

dispositifs. En résumé, le pH ne doit pas descendre en dessous de 6.9 et le

potentiel d'oxydoréduction doit rester inférieur à -250 mV sinon, les conditions

d'anaérobie deviennent limitantes pour les populations bactériennes de l’anode..

Tableau 3.4 : Évaluation des valeurs limites observées pour les paramètres de

contrôles testés. VCO: Tension en circuit ouvert, DCO en mg.L-1.

Syst. Comportement de la PBE VCO pH FLLP Redox DBO/DCO

Recirc

En Croissance 0,9V 7,2 - 292 NA

Stable 0,9V 7,1 -300 NA

En décroissance 0,8V 6,9 -250 NA

Cuve

En Croissance 1,1V 7,5 - 330 NA

Stable 1,1V 8,1 -380 -40% DCO

En décroissance 6,9 -250 -60% DCO

Le pH initial du lisier brut utilisé pour l'expérience était de 7.2 et le potentiel

d'oxydo-réduction de -295 mV (Ag/AgCl). Syst = système; recirc = recirculation.

3.2.2 Optimisation de l'oxydant à la cathode et propriétés

Afin de maintenir des conditions d'opérations constantes et ainsi suivre avec

précision l'évolution des populations bactériennes de l’anode, il était important de

définir les conditions d'opération de la cathode. De plus, en vue d'une mise à

l'échelle du procédé, les paramètres cathodiques sont particulièrement importants

pour établir des données technico-économiques. La figure 3.5 illustre les mises au

point réalisées pour obtenir une PBE performante, pour les conditions d'opération

du milieu environnant de la cathode catalysée au platine. On a observé qu'à partir

d'un pH de 3,5 et d'une concentration en H2O2 de 0,01 M, les performances ont été

maximales. Une concentration de peroxyde de 0,03 M n'a pas semblé augmenter

les performances. En mesurant ainsi la consommation journalière de peroxyde et

d'acide pour maintenir la solution oxydante à ce niveau, on pouvait contrôler

60

automatiquement ces conditions, à l'aide d'une sonde de pH placée dans la cuve

d'oxydant et relié à un contrôleur de pH.

Figure 3.5: Relation entre la tension, le pH du liquide oxydant et la [H2O2] du milieu

oxydant

Un autre aspect du liquide oxydant est qu'il semble concentrer les cations NH4+ et

K+. La figure 3.6 montre qu'après 10 jours de fonctionnement, le liquide oxydant

contenait près de 270 mg.l-1 de NH4+ et 220 mg.l-1 de K+. En effet, la MEC, laisse

passer les cations pour équilibrer les charges ioniques et on observe donc un

transfert des éléments cationiques azotés.

-600

-400

-200

0

200

400

600

800

1000

7,6 7,4 4,8 4,2 3,3 3,0 3,0 2,5

pH

Tens

ion

(mv)

Tension CF anode cathode

[H2O2]=0.015

[H2O2]=0.03

61

Figure 3.6 : Transfert de cations à travers la MEC vers le liquide oxydant

3.2.3 Effet de la température sur la performance de la PBE

Les contraintes de locaux disponibles pour opérer les PBEs n'ont pas permis le

fonctionnement des PBEs à une température constante durant chaque phase

d'opération. Cependant les données comparées pour le choix du dispositif ou du

pourcentage d'inoculum ont été mesurées à des températures comparables. En

période chaude durant l'été, les variations pouvaient être plus importantes et nous

avons pu faire quelques observations pour mettre en relation la performance de la

PBE et la température. Ainsi, deux répétitions de mesures de la tension d'une PBE

ont été réalisées dans des journées où la température variait de 20 à 35°C. Les

mesures effectuées en été ont montré qu'il y avait une relation entre la température

et la performance de la PBE. Les microorganismes spécifiques qui s'établissent

dans la PBE semblent permettre une augmentation de la performance de la PBE

de 15 % lorsque la PBE est à la température de 30°C. Au-delà de cette

température, il ne semble pas y avoir de gain notable. Ces données sont

J0 J10 J170

50

100

150

200

250

300

350

400

450

N-NH4(mg/l) K(mg/l) Ca(mg/l) Mg(mg/l)

Jours d'opération

Con

cent

ratio

n (m

g/l)

62

évidemment préliminaires et peu précises et devraient être complétées dans des

études ultérieures.

3.2.4 Analyse de la diversité microbienne par PCR-DGGE

La technique de PCR-DGGE a permis de suivre les microorganismes impliqués

dans le procédé PBE aux différentes étapes qui ont mené à définir les paramètres

de fonctionnement ainsi que les recommandations pour une mise à l'échelle

industrielle. Plus particulièrement, cette technique a permis de comparer les

diversités bactériennes des biofilms et des lisiers des PBEs selon le dispositif mis

en place, mais également pour suivre l'enrichissement des populations identifiées

par séquençage 454.

3.2.4.1 Comparaison de la diversité bactérienne entre les dispositifs

La Figure 3.7 présente quatre histogrammes qui sont une représentation des

proportions des diverses communautés bactériennes détectées dans les

échantillons de FLLP circulante et du biofilm du support anodique pour chacun des

deux dispositifs testés. L’analyse des profils DGGE a révélé un impact du dispositif

plus important pour les FLLP circulantes et dans une moindre mesure des biofilms

du support anodique.

Le tableau sous-jacent à la Figure 3.7 présente, pour chacune des vingt

communautés bactériennes (A à T), détectées dans l'ensemble des profils DGGE,

la proportion arrondie à l’unité de pourcentage qu’occupait chacune d’elles dans

les profils DGGE moyens issus des extraits de FLLP circulante et de biofilm du

support anodique pour les deux dispositifs testés. Le nombre de bandes affichant

une proportion inférieure à 1 % variait de 5 à 8.

63

Les profils DGGE des communautés bactériennes comptent entre 20 et 24 bandes

pour le dispositif en recirculation et 17 bandes pour les profils du dispositif en cuve.

Alors que les profils DGGE des communautés bactériennes des biofilms des

supports anodiques ne comptent que deux populations affichant une proportion

élevée (supérieure à 10 %), les profils DGGE des communautés bactériennes de

la FLLP en circulation affichent plutôt un ensemble de quatre et cinq populations,

selon le type de dispositif, dont les proportions sont supérieures à 10 %.

Étant donné que le profil des communautés bactériennes du biofilm du support

anodique dans le dispositif en cuve sert de référence, le calcul de l’indice de

Pearson indique que les profils DGGE de la FLLP du dispositif en cuve (0.696) et

de la FLLP du dispositif en recirculation (0.775), sont les plus différents. Le profil

du biofilm anodique du dispositif en recirculation est, quant à, lui plus similaire à la

référence (0,881).

Plus spécifiquement, seule la population O est plus abondante dans le biofilm du

support anodique que dans la FLLP quel que soit le dispositif utilisé. Par contre,

pour le dispositif en cuve, les populations E, I, O et P sont plus importantes dans le

biofilm anodique que dans la FLLP.

64

Cuve Recirculation Population Charbon Lisier Charbon Lisier

A 0 0 1 1 B 5 12 11 5 C 8 17 4 4 D 9 5 4 6 E 21 14 22 23 F 1 11 2 1 G 1 1 0 0 H 2 3 3 3 I 6 3 0 1 J 1 5 8 11 K 0 0 1 1 L 0 0 0 0 M 4 3 5 10 N 2 0 2 4 O 21 15 21 11 P 8 1 4 9 Q 0 0 0 0 R 2 2 2 1 S 3 2 3 1 T 1 0 2 1

Bandes <1% 5 8 6 5 NB bande 17 17 20 24

I total 1193888 1988357 1299502 1233320 Pearson 1,000 0,696 0,881 0,775

Figure 3.7 : Histogramme présentant la proportion relative des populations

bactériennes identifiées par PCR-DGGE en fonction du type d'échantillon et du

dispositif expérimental.

65

3.2.4.2 Effet du pourcentage d'inoculum sur les performances des PBEs

La figure 3.8 illustre les montées de tension aux bornes de PBEs ayant été

inoculées avec 10 %, 30 % et 50 % d'inoculum microbien, composé de support

anodique avec un biofilm anodophile provenant d'une pile précédente fonctionnant

dans les mêmes conditions de FLLP et de dispositif. On observe qu'une pile

inoculée avec 10 % d'inoculum commence à une tension de 450 mV alors qu'avec

30 % et 50 % d'inoculum les tensions observées sont de 650 mV et 790 mV

respectivement. De plus, il ne faut que 48 heures au support anodique composé

de 30 % d'inoculum et 24h dans le cas de 50 % d'inoculum, pour atteindre une

phase de plateau. Dans le cas d'un inoculum de 10 %, au 7e jour, la PBE est

toujours en phase de croissance au niveau de la tension observée. Il est à noter

que sans inoculum, la montée en puissance est plus variable et une période de

plateau n'est observée qu'après 10 à 12 jours dans les mêmes conditions

d'opération.

Figure 3.8: Comparaison de la tension des PBE inoculées avec différents

pourcentages d'inoculum microbien de support anodique.

66

3.2.5 Isolement des souches d'intérêt

Résultats d'isolement des bactéries du biofilm anodique

Les trois phases d'isolement des bactéries de l’anode ont permis d'identifier 13

espèces bactériennes (tableau 3.5). Parmi ces espèces, seuls les genres

Alcaligenes et Bacteroides, ont été cités dans les articles en contexte de PBE. La

nature très riche en bactéries de la FLLP environnant le biofilm du support

anodique a rendu l'isolation des bactéries ciblées plus difficile que prévu et il a été

choisi, à la suite des résultats de l'objectif 1 obtenus par séquençage 454, de

concentrer les efforts sur l'enrichissement des bactéries anodophiles.

Tableau 3.5: Récapitulatif des isolements bactériens

BHIS+K BHIS+K

Na2S elec 48H

GYTS Nutrient Agar PCA

Alcaligenes

faecalis

Aerosphaera

taetra

Lactobacillus

acidipiscis

Peptostreptococcus

russellii

Enterococcus

villorum

Bacteroides

coprosuis

Enterococcus

faecalis

Pediococcus

pentosaceus

Propionibacterium

acidipropionici

Propionibacterium

freudenreichii

Enterococcus Enterococcus

Globicatella

sanguinis

Myroides

odoratus

67

3.2.6 Résultats d'enrichissement des bactéries du biofilm anodique

Au regard des résultats de séquençage 454 présentés dans la partie 2 du

mémoire, les principales familles bactériennes rencontrées sont identifiées dans le

tableau 3.6. Parmi les six familles les plus importantes, on retrouve deux gram

positifs et quatre gram négatifs. Sans surprise, elles sont toutes anaérobes, et trois

familles sont de type fermentaire. Il est important de noter que quatre familles ont

la capacité de fonctionner au sein du cycle du soufre. Afin de réaliser un

enrichissement du biofilm anodique, il est important d'envisager au vue des

métabolismes identifiés dans le tableau 3.6 différents types de milieux

d'enrichissement. Il faudra donc prévoir un milieu ciblant les bactéries du type des

Clostridium, un milieu de type Bactéroides, incluant les Phorphyromonadaceae et

les bacteroidaceae et un milieu plus limitant. Pour cibler les bactéries au

métabolisme plus simple, on peut penser qu'un milieu composé des constituants

de la FLLP en fonctionnement serait idéal. Un milieu composé de FLLP dilué 1/50

est donc préparé par stérilisation. Les conditions d'enrichissement sont résumées

dans le tableau 3.2.

68

Tableau 3.6 : Récapitulatifs des populations bactériennes d'intérêt identifiées par

séquençage 454 dans le support bactérien de la PBE

Famille bactérienne Gram+/- Anaérobie/

aérobie

Métabolisme

fermentaire

Métabolisme du

soufre

Clostridiaceae + AF F +

Planoccocaceae + A -

Phorphyromonadaceae - AS F +

Bacteroidaceae - A F +/-

Alcalignes - AE/A -

Desulfuromonadaceae - AS NF +

AF : anaérobie facultative, A : Anaérobie, AS : Anaérobie stricte, AE : Aérobie

La figure 3.9 montre les performances obtenues pour les différents types

d'enrichissement. Après 5 jours d'enrichissement en condition anaérobie artificielle,

100 % du charbon enrichi est ajouté à une pile neuve avec une FLLP également

neuve. Il est important de noter que pour chaque phase de montée en puissance la

même source de FLLP est utilisée. Par contre, les performances atteintes sont

supérieures aux données issues des autres tests dans les autres étapes

antérieures de l'étude, car une autre cathode a été utilisée (Propriété de l'IRDA et

en cours de brevet). Cette cathode est nettement moins coûteuse que celle

électro-plaquée avec du platine, et elle est plus performante.

On observe que les enrichissements CMM et BHIS permettent de débuter dès les

premières heures de fonctionnement avec des performances supérieures à 800

mV comparativement à une pile inoculée avec 10 % où la tension au départ est de

600 mV. Les conditions FLLP et 30 % d'inoculum sont similaires au départ, mais

l'enrichissement FLLP semble plus lent à atteindre une phase de plateau. On peut

69

penser que les populations ciblées qui sont a priori des bactéries fermentaires

dans le cas des conditions d'enrichissement CMM et BHIS s'établissent dans le

biofilm anodique du support et sont responsables du transfert d'électrons à l'anode.

Ces éléments sont en contradiction avec la littérature (D R Lovley, 2008) où dans

un cas de figure où des bactéries fermentaires prenaient la place des bactéries

électrophiles, les performances étaient minimes.

Figure 3.9 : Performance électrique obtenue pour chaque condition

d'enrichissement comparativement à 3 conditions d'inoculations directes (0%, 10%

et 30% v/v) lors du départ d'une PBE.

La figure 3.10 présente une photo d'un gel DGGE illustrant la diversité bactérienne

totale des biofilms des supports anodiques après la période d'enrichissement et

après sept jours de fonctionnement dans une PBE neuve avec de la FLLP neuve.

Dans un premier temps, on peut noter que les réplicats biologiques encadrés par

type de couleur sont très similaires sauf dans les cas où la détection DGGE a été

70

faible, pour les milieux LC50 et GYTS pour lesquels la quantité d’ADN extrait et la

quantité d’amplicons à analyser en DGGE étaient insuffisantes.

Les résultats obtenus des profils DGGE des réplicats confirment que notre

approche technique de prélèvement des échantillons et d'extraction des ADNs était

justifiée et reproductible,

Dans un second temps, la figure 3.11 présente un dendrogramme des mêmes

profils DGGE et on observe que les profils DGGE de l'ensemble des conditions

d'enrichissement après sept jours de fonctionnement dans une PBE, forme un

groupe de similarité incluant le profil de l'inoculum ayant été utilisé comme source

de biofilm anodique pour toutes les conditions d'enrichissement (environ 70 % de

similarité minimum). On observe également que les conditions d'enrichissement

LC50 et GYTS ont généré des profils bactériens les plus différents après cinq jours

d'enrichissement en milieu contrôlé (inférieur à 50 % de similarité). Rappelons que

la quantité d’ADN extrait et la quantité d’amplicons à analyser en DGGE étaient

insuffisantes pour générer des profils DGGE reproductibles. À l'inverse les

conditions CMM et BHIS, qui ont donné les meilleures performances et des profils

DGGE très reproductibles, sont les plus proches des profils bactériens obtenus

des PBS témoins après huit jours de fonctionnement en PBE. Ces deux dernières

conditions d'enrichissement génèrent donc des diversités bactériennes proches

des conditions d'opérations d'une PBE mature. On peut également noter que parmi

les bandes majeures identifiées sur les profils DGGE des conditions CMM et BHIS,

l'excision et le séquençage des bandes d’intérêt ont pu confirmer la présence de

bactéries des familles des Clostridiaceae et des Porphyromonadaceae.

71

Figure 3.10 : Gel DGGE présentant la diversité bactérienne des supports

bactériens après enrichissement en milieu synthétique (A) et après fonctionnement

dans une PBE pendant 7 jours (B).

Figure 3.11 : Dendrogramme permettant de comparer la diversité bactérienne

entre les échantillons de support bactérien issus de PBE témoin et de PBE

inoculée après un enrichissement du consortium anodique.

72

3.3 Discussion

3.3.1 Choix du dispositif (objectif 2)

Le choix du dispositif est très vite apparu comme étant déterminant pour permettre

d'obtenir une pile performante et d'envisager une mise à l'échelle industrielle. En

effet, le modèle initial en recirculation de 350 ml est apparu comme limitant avec

des conditions de fonctionnement très variables et peu stables. À ce stade de

connaissance sur les métabolites limitants et sur les paramètres de

fonctionnement, la FLLP en recirculation sans cuve dans le modèle initial évoluait

trop rapidement pour permettre d'étudier correctement les populations

microbiennes mises en œuvre. Le modèle relié à une cuve contenant un volume

additionnel de FLLP présente l'avantage de produire des performances électriques

plus constantes et de reproduire des conditions d'opération plus proches de la

réalité d'un traitement d'effluent agricole en continu. De plus, les problèmes

rencontrés au niveau de la détérioration de la membrane échangeuse de cations

pouvaient entraîner davantage d'interférences sur le développement microbien à

l'anode ainsi que sur les performances électriques. En lien avec les résultats

moléculaires d'analyse DGGE de la diversité bactérienne, le dispositif en cuve

semble générer une diversité plus restreinte que dans le dispositif en recirculation,

lié au fait que les populations du biofilm anodique sont plus spécialisées.

L'abondance de ces populations entraîne sûrement des modifications des

paramètres physicochimiques du milieu environnant la FLLP, qui deviennent ainsi

plus favorables aux bactéries de l’anode d'une PBE.

3.3.2 Les paramètres de contrôle de la pile bio-électrochimique (objectif 2)

3.3.2.1 Le pH et le potentiel d'oxydoréduction de la FLLP

73

Ces deux paramètres ont été identifiés comme étant primordiaux à suivre et

peuvent également être facilement faire l’objet de monitorage en direct dans le

procédé de traitement. Cela est particulièrement important pour une mise à

l'échelle notamment afin de pouvoir agir rapidement sur les conditions d'opération

de la PBE. La gamme de pH permettant le bon fonctionnement de la PBE est

directement reliée aux conditions de vie des bactéries de l’anode et se situe entre

6.9 et 8.5. Des conditions plus alcalines n'ont pas été générées par le procédé,

mais pourraient faire l'objet de complément en vue d'études de faisabilité de

traitement d'autres effluents organiques. Il apparaît ainsi que la source de lisier et

de FLLP qui peut être très variable doit être contrôlée à la source. Les données du

producteur concernant l'alimentation des porcs, et le type de désinfection peuvent

particulièrement influencer le pH du lisier à traiter. Le potentiel d'oxydoréduction

identifie les conditions d'anaérobie de la FLLP et est également très important à

suivre. Pour alimenter une PBE, une FLLP doit avoir un potentiel d'oxydoréduction

inférieur à -250 mV (Ag/AgCl). En fonctionnement, il est important de suivre ce

paramètre en continu afin d'ajuster la demande électrique imposée. En effet si la

demande est trop forte, le potentiel d'oxydo réduction pourrait monter au-dessus

de -250 mV et ainsi générer des conditions de vie moins anaérobies pour les

bactéries de l’anode. À l'inverse, une demande électrique trop faible ou inexistante

pourrait générer des conditions inhibant ces mêmes bactéries et favoriser d'autres

populations bactériennes. Cet effet a été observé dans le cas des bactéries

sulfato-réductrices (Reis et al., 1992).

3.3.2.2 Le potentiel électrique à l'anode

Le potentiel électrique à l'anode, enregistré à partir d’une sonde Ag/AgCl, permet

de mesurer le potentiel électrique de la demi-réaction qui survient à l’anode et,

indirectement, indique l'activité métabolique des bactéries de l’anode. Les résultats

obtenus montrent que l'on peut obtenir une activité forte et stable dans le modèle

en cuve avec un potentiel inférieur à -400 mv. Ce paramètre permet de suivre

l'avancée du traitement effectué et devrait pouvoir identifier des conditions limites

74

en terme métaboliques. Ces données restent à être étudiées avec une analyse

précise des diverses molécules organiques du lisier de la FLLP à différents stades

de traitement.

3.3.2.3 La DBO5 et la DCO

La DBO5 et la DCO sont des données qui n'ont pas été approfondies. En effet la

majorité des phases expérimentales de l'étude pour identifier les paramètres de

contrôles et les populations microbiennes impliqués dans le processus, ont été

réalisées avant que la DBO5 ou la DCO ne deviennent limites. Cependant dans les

derniers mois de l'étude, lorsque tous les paramètres étaient optimisés, certaines

piles ont fonctionné avec des cycles de fonctionnement régulé par les paramètres

de contrôles identifiés, pendant une période de plus de 4 mois. Avec cette stabilité,

on peut penser que la disponibilité des nutriments pour les bactéries de l’anode

devenait limite. Les analyses de DBO5 et de DCO ont révélé des diminutions

d'environ 65% et 60% respectivement par rapport à la FLLP de départ. Dans les

meilleures conditions de fonctionnement d’une PBE ayant une chambre anodique

d’un volume de 350 ml et un dispositif de recirculation en cuve, le temps de

traitement de 2 litres de FLLP a été de 30 jours en fonctionnant avec une

résistance à 30 Ω.

3.3.3 Le développement du consortium anodique (objectif 1)

La FLLP utilisée a permis l'inoculation du support anodique sous les paramètres de

fonctionnement identifiés. Parmi les populations bactériennes qui composent ce

consortium bactérien anodique, il a été identifié que les familles des Clostridiales et

des Porphyromonadaceae étaient les populations majoritaires dans ce consortium.

Dans le cas des Clostridiales, trois groupes distincts semblent se développer.

Cette famille a la particularité de se développer très majoritairement au niveau du

biofilm du support anodique. Les Porphyromonadaceae quant à elles, semblent se

développer dans l'ensemble de la PBE indépendamment du biofilm ou du support

75

anodique. D'autres familles bactériennes, plus spécifiquement liées au cycle du

soufre comme les Desulfuromonadaceae, sont impliquées ainsi que des familles

également citées dans d’autres études sur les PBEs comme les Alcaligenes et

Moraxellaceae (Rabaey et al., 2004).

Les différentes stratégies d'isolement n'ont pas permis d'isoler les populations

majoritairement établies dans ce consortium. Cette avenue semble davantage utile

pour étudier plus fondamentalement les mécanismes de transfert d'électrons

impliqués que pour obtenir des PBE plus performantes (Kiely et al., 2010a). Cette

dernière étude montre notamment que l'on n'obtient pas forcément de gain de

puissance en isolant des bactéries électrophiles, les différences de performance

obtenues sont généralement de 25 à 50 % moindres selon les souches identifiées.

Par contre, la stratégie visant à enrichir en milieu contrôlé le consortium bactérien,

a permis de produire artificiellement un support anodique inoculé permettant de

démarrer le procédé de PBE de manière quasiment instantanée. C'est notamment

le cas avec une condition d'enrichissement visant à accroître les populations de

Clostridiaceae. Ce succès est particulièrement important afin de produire un

consortium spécialisé plus métaboliquement actif au niveau du transfert des

électrons. Cela permet également d'accentuer la responsabilité de ces bactéries

enrichies dans le procédé par rapport aux bactéries identifiées, mais ayant un

métabolisme plus spécifique et moins rapide. Enfin, cela permettrait également de

faciliter l'application de ce procédé à d'autres effluents organiques en proposant

une source d'inoculum stable et reproductible artificiellement.

3.3.4 Potentiel des piles bio-électrochimiques (Objectif 3)

3.3.4.1 Comparaison avec les technologies du marché

La principale technologie permettant de comparer la production énergétique issue

de la valorisation agricole est la biométhanisation. Cette technologie est beaucoup

plus ancienne en termes de développement et fait intervenir d'autres groupes

76

bactériens appelés méthanogènes. Cette technologie permet deux types de

valorisation énergétique. Soit au niveau du chauffage par la combustion du

méthane produit, soit par la conversion de ce méthane via une génératrice

d'électricité. Si l'on regarde la production nette d'électricité produite, les PBEs

semblent rivaliser avec cette technologie avec des puissances de sortie de l'ordre

15 à 65 kWh (Brodeur et al., 2008; Castaing et al., 2002; Onouadjé, 2011; Pouech

et al., 2005; Schneider, 1997) basées sur le potentiel d'un mètre cube de méthane

produisant 9,7 kWh (APESA, 2007). Pour comparer réellement les deux

technologies, il faut comparer la puissance instantanée des deux systèmes. En

ramenant la production de méthane par mètre cube de réacteur, l'énergie totale

produite par seconde est alors ramenée en puissance électrique avec un

pourcentage d'efficacité théorique de 35 %. On obtient alors, dans l'étude de

Puech en 2005, une puissance de 50 W⋅m-3. Dans le cas de PBE, les meilleurs

résultats intégrant les plus récentes avancées technologiques au niveau anodique

et cathodique ont permis d'obtenir des sorties de puissance de plus de 165 W⋅m-3

ce qui est plus de trois fois supérieur à la biométhanisation.

De plus, les coûts d'installation d'une PBE devraient être moins importants que

pour la biométhanisation car les PBE ne nécessitent pas de génératrice

d'électricité, ce qui représente près de 40 % du coût total d'installation d'un

biométhanisateur couplé à un groupe électrogène. Il en résulte que le marché des

PBEs peut être plus large en termes de taille d'exploitation agricole pour obtenir la

rentabilité de ce procédé. Enfin, les risques reliés au méthane rendent la

biométhanisation plus difficile à mettre en place et à faire accepter socialement.

Dans un autre ordre d'idée, suite à une revue de littérature réalisée en 2004,

Angenent et al. jugent les perspectives des PBEs et de la biométhanisation comme

étant moins intéressantes économiquement que la production de bioproduits

permettant d'avoir une valeur ajoutée au traitement. Ils mentionnent également

que le coût de l'électricité était en 2004 un des facteurs pouvant limiter le

développement de la technologie.

77

3.3.4.2 Possibilité d'application et spécifications

Les connaissances acquises lors de cette étude au niveau microbiologiques ainsi

qu'au niveau électrochimique ont permis d'obtenir une PBE délivrant plus de 5000

mW·m-2. Ces performances, ainsi que la stabilité du procédé bioélectrochimique,

rendent particulièrement prometteuses les applications futures et leur

commercialisation. Les possibilités sont diverses et selon leur application, peuvent

être orientées, soit pour le traitement d'un effluent organique, notamment dans les

pays où le coût de l'électricité est faible, soit pour la valorisation en électricité

lorsque son coût est élevé. Une autre avenue d'application pourrait également être

très intéressante dans le cas de pays en voie de développement ou en régions

isolées où les sources fossiles d'électricité deviennent de plus en plus coûteuses.

Un autre aspect qui semble être intéressant serait la valorisation des sous-

produits, dont le liquide oxydant qui concentre les cations NH4+. Cela pourrait être

valorisé comme fertilisant et ainsi compléter les avantages de la technologie.

3.3.5 Mise à l'échelle (Objectif 3)

Le développement des PBE a largement été réalisé avec de petits réacteurs visant

à minimiser la perte de charge du réacteur. Une étude de 2010 identifie la phase

de mise à l'échelle des PBE comme l'enjeu des recherches à venir avec trois

points majeurs qui sont premièrement, de maintenir la résistance interne faible en

augmentant la biomasse électro-chimiquement active, deuxièmement, d'optimiser

le design des réacteurs et troisièmement, de développer les approches de

séparation entre l'anode et la cathode (Fornero et al., 2010).

3.3.5.1 Recommandations pour la conception d'un modèle de 80 litres

Un modèle de 80 litres représente une étape importante en vue de développer un

réacteur de plus grande échelle. Les unités de PBE devront, dans un premier

temps, permettre de développer une tension de 12 V afin de faire fonctionner un

78

plus grand nombre d'applications. C'est la mise en série de douze unités PBE qui

permettra d'atteindre ce résultat. Dans cette optique, les expérimentations

réalisées sur le modèle de PBE de 350 ml permettent d'envisager deux types de

réacteur. Le premier serait de créer un réacteur le plus compact possible en

utilisant des unités sous forme de feuillet anode /cathode ou de cylindre. Le

réacteur peut ensuite être alimenté par un effluent à traiter en continu ou en

recirculation. Le deuxième type de réacteur serait d'immerger des unités dans une

cuve de traitement. Les deux types de procédé sont à évaluer en fonction de

l'application visée, favorisant le traitement ou la sortie de puissance. À ce stade, il

est également important de relier le développement de ce réacteur expérimental

aux contraintes des installations potentielles d'effluents organiques dans le milieu

agricole et industriel.

3.3.5.2 Support bactérien

Le ratio de support bactérien par rapport à la surface cathodique est sans doute le

paramètre à respecter dans le cas d'une mise à l'échelle. Le support bactérien

enrichi en milieu contrôlé permet d'obtenir rapidement un consortium bactérien de

bactéries sur l’anode, mais si la cathode est surdimensionnée, les conditions

pourraient devenir défavorables au consortium et ainsi entraîner des baisses de

performance. Le fait de pouvoir enrichir artificiellement les bactéries de l’anode est

sans doute un atout majeur pour permettre la réussite d'une mise à l'échelle en

vue d'un développement industriel de la technologie. De plus, il pourrait servir à

démarquer la technologie par rapport à d'autres technologies où la phase

d'inoculation est beaucoup plus longue (bio-méthanisation). Cependant, le support

bactérien utilisé jusqu’à présent pourrait nécessiter une évolution en terme de

granulation du charbon activé et d'autres types de support pourraient aussi être

testés dans l'optique de rentabilité d'un réacteur PBE. Il pourrait être, par exemple,

intéressant de trouver un support alternatif à valoriser et ainsi, augmenter l'image

environnementale de la technologie PBE.

79

3.3.5.3 Paramètres de contrôles et algorithme de fonctionnement

Afin de comprendre l'équilibre qui se crée dans le fonctionnement d'une PBE, on

peut comparer deux cas de figure.

Dans le cas d'une demande équilibrée de la cathode (figure 3.12), les bactéries de

l’anode dégradent la matière organique et produisent un surplus de métabolites

intermédiaires comme le H2S qui ne transfèrent pas leurs électrons à l'anode. Ces

espèces métaboliques participent alors au maintien de conditions favorables dans

le milieu environnant. Le pH aura tendance à augmenter et le potentiel

d'oxydoréduction à diminuer.

Figure 3.12: Cas d'une demande équilibrée de la cathode

Dans le cas d'une demande trop forte de la cathode (figure 3.13), toutes les

espèces métaboliques produites par les bactéries de l’anode transfèrent leurs

électrons à l'anode. La performance de la PBE est alors maximale, mais non

80

stable. Les conditions de vie environnantes des bactéries anodophiles se

dégradent et peuvent devenir critiques pour leurs survies. Le pH diminue et le

potentiel d'oxydoréduction augmente, les conditions deviennent de moins en moins

anaérobies.

Figure 3.13: Cas d'une demande trop forte de la cathode

Les dernières expérimentations avec un consortium bactérien idéalement

développé montrent qu'il est important de définir des algorithmes de contrôle d'une

PBE afin d'en obtenir une performance équilibrée maximale. D'une manière

générale, il est important de ne pas dépasser des conditions d'opération de plus de

50 % de la puissance maximale théorique. Il a été observé qu'en dépassant ce

seuil, le procédé devient moins stable et les bactéries du biofilm anodique peuvent

être affectées par des modifications plus rapides de leur milieu de vie. Plus

précisément, en incluant dans un algorithme, le potentiel électrique à l'anode, on

peut réussir à préserver les conditions de vie du consortium bactérien anodique et

81

ainsi obtenir un procédé stable dans le temps. Une deuxième option serait de

définir des plages d'opération de la PBE dans le temps et ainsi obtenir des sorties

de puissance plus importantes à des moments de la journée où la demande est

plus forte. Les résultats obtenus suite aux conditions d'enrichissement du support

anodique montrent qu’un cycle jour/nuit permet d'obtenir ce résultat (vérifié pour

une période de trois mois de fonctionnement).

3.4 Conclusion

Un dispositif et des conditions d'opération ont pu être identifiés et les perspectives

de réussite pour une mise à l'échelle sont extrêmement prometteuses. Les

conditions d'enrichissements déterminées pour les bactéries de l'anode identifiées

rajoutent un élément primordial pour l'augmentation de la performance de la PBE

et pour son adaptabilité à d'autres effluents organiques. Cependant, chaque mise à

l'échelle représente un défi d'envergure où chaque difficulté rencontrée n'est pas

toujours prévisible. On peut penser que des données complémentaires sur les

métabolismes impliqués et sur les limitations de ceux-ci au niveau réactionnel,

ainsi qu'une modélisation précise basée sur les paramètres de contrôle identifiés,

permettraient de préparer au mieux ces étapes à venir. À la différence de certains

procédés de traitement biologique, les PBEs apparaissent comme étant une

interface directe entre un système biologique et une valorisation énergétique. Les

différents paramètres sont intimement liés et interagissent entre eux.

83

4 Conclusion Générale

Je suis très content d'avoir eu la chance de travailler sur les paramètres

microbiens de la PBE. Les avancées réalisées ont permis de contrôler un procédé

novateur et qui se veut performant en comparaison aux autres technologies du

marché. Les populations bactériennes impliquées dans ce procédé ont été

identifiées ainsi que leurs conditions d'enrichissements. Les paramètres de

fonctionnement identifiés permettent désormais de produire de l'électricité verte de

manière stable et sur une longue période, et les lignes directrices à suivre pour

une mise à l'échelle pilote et industrielle ont été exposées. Les enjeux sont

également politiques, car l'expansion de ces technologies est reliée aux volontés

provinciale et nationale de promouvoir ou non les énergies vertes. Une étude de

marché permettra de faciliter les associations et les développements futurs en vue

de la réussite de l'application du procédé de Pile Bio-Électrochimique au Canada,

en Amérique du Nord, ou dans les pays en voie de développement où les

ressources électriques sont encore très dépendantes du pétrole.

85

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Westerman, P.W., Bicudo, J.R., Kantardjie, A., 2000. Upflow biological aerated filters for the treatment of flushed swine manure. Bioresource Technology 74, 181–190.

Caractérisation et optimisation des paramètres microbiens ... · caractÉrisation et optimisation...

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