CARACTÉRISATION MOLÉCULAIRE DES BACTÉRIES ...

DEPARTEMENT DE BIOTECHNOLOGIE

Thèse présentée en vue de l’obtention du diplôme de Doctorat en Science

Option : Microbiologie

Par Mme

GUERMOUCHE M’RASSI Amel

Sujet de thèse :

Caractérisation moléculaire des

bactéries impliquées dans la

biodégradation des hydrocarbures

Devant le jury composé de :

Président Pr ABI AYAD Sidi Mohammed El-Amine Université d’Oran (Es-Sénia)

Promoteur Pr BENSALAH Farid Université d’Oran (Es-Sénia)

Examinateur Pr MESLI TALEB BENDIAB Farida Université d’Oran (Es-Sénia)

Examinateur Pr SLIMANI Miloud Université de Saida

Examinateur Pr ABDELOUAHID Djamel Eddine Université de Tlemcen

Examinateur Pr BENYAHIA Mohamed Université de Sidi Belabbes

Invité Mr RAIS Ali Abdelhamid Directeur Raffinerie Arzew-

Oran- Sonatrach

2013-2014

REMERCIEMENTS

Merci au bon Dieu de m’avoir aidé à réaliser cet ouvrage.

J’exprime ma gratitude aux membres du jury pour avoir accepté d’examiner ce travail ainsi

que pour la discussion apportée sur ce projet. Je témoigne mes plus vifs remerciements au

Pr Abi Ayad Sidi Mohammed El-Amine qui a bien voulu présider le jury de ce Doctorat, au

Pr Mesli Taleb Bendiab Farida, au Pr Benyahya Mohamed, au Pr Abdelouahid Djamel

Eddine et au Pr Slimani Miloud qui nous ont honoré de leur présence et pour avoir accepté

de juger ce travail.

Par ailleurs, j’adresse mes sincères salutations à Mr Rais Ali abdelhamid Directeur de la

raffinerie d’Arzew-Oran d’avoir accepté notre invitation.

Un projet de thèse ne se réalise jamais seul, c’est pourquoi je souhaiterai ici remercier toutes

les personnes qui ont participé à des années d’aventure scientifique et humaine.

Je souhaiterai tout d’abord exprimer mes remerciements au professeur Bensalah Farid,

directeur du Laboratoire de Génétique Microbienne (LGM) à l’Université d’Oran- Es-Sénia,

pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et permis de réaliser une partie de cette

thèse dans de bonnes conditions. Je lui dis merci également pour m’avoir fait profiter de ses

connaissances scientifiques, pour toute l'aide qu'il m'a apporté sur mes travaux, pour ses

encouragements durant ces années au sein de l’équipe.

Je voudrai dire un grand merci au Pr Robert Duran et au Dr Jérôme Gury du Laboratoire

de l’Environnement Ecologie Microbienne (EEM) de l’Université de Pau et des Pays de

l’Adour en France pour leur accueil et leur collaboration, pour les connaissances qu’ils

m’ont fait partager durant 18 mois de travail. Merci à Jérôme pour l’aide précieuse en

biologie moléculaire et pour les discussions enrichissantes que nous avons eu sur le projet.

Cela m’a permis d’explorer les données selon de nouvelles perspectives et de développer mon

esprit critique sur les méthodes moléculaires que nous utilisons.

Merci à tous les membres de l’équipe LGM et EEM pour m’avoir donné un environnement de

travail agréable grâce à leur présence, leur bonne humeur et leur soutien.

Un merci particulier à Neil Gray du Laboratoire de l’École de génie civil et de géosciences

de l'Université de Newcastle en Angleterre, qui m’a accueillie dans son laboratoire afin de

travailler sur les analyses TLC/FID, pour sa gentillesse, son aide scientifique, et sa

disponibilité.

Pour terminer, je souhaiterai remercier ma famille et mes amis pour leur soutien non

seulement tout au long de la thèse mais aussi depuis de nombreuses années. Merci pour leur

présence, leur aide, leur compréhension et leur amour. Merci aussi à mon mari, pour son

soutien et son amour indéfectible. Je leur dédie cette thèse.

Enfin, je tiens à remercier le Groupe de la plateforme SONATRACH, de nous avoir ouvert

les portes pour entamer ce travail avec les échantillons de sol contaminé, sans qui cette thèse

aurait été encore plus difficile.

Merci a tous.

Résumé

Les produits pétroliers, du fait de leur utilisation massive, constituent des polluants importants

des aquifères et des sols. Le devenir de ces polluants rejetés dans l’environnement est

principalement gouverné par les processus de biodégradation. L’existence de ces phénomènes

dépend de la biodégradabilité intrinsèque du polluant mais aussi de la présence de microflores

dégradatrices compétentes dans les eaux souterraines et dans les sols.

Au cours de ce travail, nous avons développé une méthodologie permettant d’évaluer la

biodégradabilité des hydrocarbures pétroliers en conditions aérobies. Elle consiste à mesurer,

par méthodes analytiques telles: Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) et

Chromatographie sur Couche Mince (CCM) couplées à un Détecteur à Flamme d’Ionisation

(FID), après incubation dans des conditions optimales, la consommation de chacun des

hydrocarbures présents dans différentes fractions du pétrole (saturés et aromatiques).

En utilisant une méthode de séquençage des gènes codant l’ADNr 16S, les compositions en

micro-organismes des bactéries adaptées au sol contaminé par les hydrocarbures ont été

déterminées. Des arbres phylogénétiques ont été élaborés. Les capacités de dégradation des

bactéries sélectionnées et la présence ou non de gènes fonctionnels de dégradation codant

pour l’oxydation initiale des hydrocarbures (alkB, nahAc, nidA) ont été étudiées.

Les résultats indiquent que le groupe Gamma-Protéobactéries était le principal acteur de cette

dégradation. Pseudomonas sp. groupe bactérien majoritaire spécifique adapté à la pollution

aux hydrocarbures à la capacité de métaboliser (en culture simple) certains hydrocarbures

récalcitrants (alcanes ramifiés tel le Pristane (n-C19) à 35.11% et les aromatiques lourds tels le

Benzo[a]Pyrène (n-C20) à 33.93% et de cométaboliser (en consortium) les différentes

fractions du pétrole brut à 50.44% pour les saturés et à 30.42% pour les aromatiques

polycycliques. L’efficacité de la biodégradation des microflores est liée à la présence de voies

métaboliques particulières chez certains micro-organismes et à la coopération entre les

différents micro-organismes composant les microflores. Ces bactéries hydrocarbonoclastes

peuvent être utilisées pour concevoir des cultures mixtes (consortium) avec des capacités de

biodégradation spécifiques pour les différentes fractions pétrolières dans les traitements des

stations d’épuration.

Mots-clés : bioremédiation, hydrocarbures pétroliers, Pseudomonas, HAP, alcanes,

ADNr16S, biomarqueurs alkB;nahAc; nidA, consortium.

Abstract

Because of their massive utilization, hydrocarbons are major pollutants of soils and aquifers.

Biodegradation is a key aspect of the fate of pollutants in the environment. Such knowledge

concerns in particular the intrinsic biodegradability of the products and the distribution in the

environment of competent degradative microflorae.

In this study, a methodology has been developed to assess the aerobic biodegradability of

petroleum hydrocarbons. It is based on the Gas Chromatographic and Thin Layer

Chromatography (TLC) coupled with a Flame Ionization Detector (FID) analysis of

hydrocarbons, after incubation in optimal conditions of major compounds in crude oil

(saturates and aromatics fractions).

Using a method of gene sequencing 16S rDNA, the identification of bacteria adapted to soil

was determined. Based on nearly full length 16S rRNA gene sequencing analysis, a

phylogenetic trees was constructed. Capacity of degradation of selected bacteria and the

presence or absence of functional genes coding for the initial oxidation of hydrocarbons

(alkB, nahAc, nidA) were studied.

The results indicate that the Gamma-Proteobacteria group was the main actor of this

degradation. Pseudomonas sp, specific bacterial group suitable for petroleum hydrocarbon

pollution has the ability to metabolize (single culture) a high mass residues, Pristane (n-C19)

at 35.11% and Benzo[a]Pyrene (n-C20) at 33.93% and co-metabolize (in consortium) fractions

in petroleum-hydrocarbon, 50.44% of saturates and 30.42% of aromatics compounds.

Biodegradation efficiency of soil microflorae depended on the specific metabolic pathways of

some microorganisms and on the cooperation within microbial population. This study

provides a better understanding of the adaptation of bacteria inhabiting polluted environments

and for developing and implanting adequate bio-strategies in the future to enhance oil in

contaminated soil and the biotreatment of oily waste water in refineries.

Keywords: bioremediation, petroleum hydrocarbons, Pseudomonas, PAH, alkanes,

DNAr16S, biomarqueurs alkB, nahAc, nidA, consortium.

ملخص

حؼ حؼزف حزكب :انؼبندت انحت نهحزلبث انفطت ف انخزبت انهثت ببنفط ػ طزك بكخزب يحهت حزابت

ػهبث حضخى خبث يخخصصت )انكبئبث انذلمت انخخصصت ف ححهم اناد انفطت ػ طزك انبنخب اندشئت

(Polymérase Chain Réaction) ػ طزك سهسهت حفبػم انبنزاس ( ADN)نهحض ان

. نكثزة إخبج اسخخذاو انحزلبث انفطت ػه طبق اسغ ف حؼخبزي انهثبث انزئست ف انخزبت انب اندفت

خد ذ انظبزة ؼخذ ػه انخحهم انح . خضغ أسبسب يصز ذ انهثبث ف انبئت نؼهت انخحهم انبنخ

. انخخص ببنهثبث نك أضب بخد كبئبث دلمت فؼبنت ف انخزبت انب اندفت

ف ذا انؼم لب بخطبك يدت نخمى لببهت انبكخزب ػه انؼبندت انبنخت نهحزلبث انبخزكبئت بخد

(CPG) كزيبحغزافب بخد انغبس : انخ ححث ػه انمبص ي خالل أسبنب ححههت يثم (O2) األكسد

بؼذ يزر فخزة . (FID) انؼخذح ػه خد كبشف انخأ ببنهب (TLC)كزيبحغزافب ػ طزك انطبمت انزلمت

انحضبت ححج ظزف يئت خى ححهم اناد انفطت انخدة انشكهت نألخشاء انزئست انكت نهبخزل انخبو

. (انشبؼت انؼطزت)

حى حؼ حؼزف حزكب انكبئبث انحت انذلمت انخخبرة ADNr 16S ببسخخذاو طزمت انخسهسم اند انذ حث ػه

حج دراست لذرة إيكببث انبكخزب انخخبرة ػه ححهم انهثبث انبخزكبئت انبحث ػ . انخدة ف انخزبت

ػذ انبكخزب انحصهت ) (alkB, nahAc, nidAاندبث ظفت انخزيش انخخصت ف األكسذة األن نهاد انفطت

. ػهب

انع . انثم انزئس نذا انخحهم انبنخGamma-Protéobactériesحشز انخبئح إن أ يدػت

Pseudomonas يخخصص ف حفكك انهثبث انفطت ن انمذرة نخحهم انهثبث نحذ يثم انكبث انشبؼت انثمهت:

Pristane( n-C19) انكبث انؼطزت % 35.11بحان : Benzo [a] Pyrène ( n-C20) ن % 33.93 بحان

نهكبث انشبؼت بحان % 50.44انمذرة ػه ححهم انبخزل ببالسخؼبت انخزبت يغ أحبء دلمت أخز بحان

. نهكبث انؼطزت% 30.42

حزحبط فؼبنت انخحهم انبنخ ػ طزك انبكخزب انحهت انخزابت بخد يسبراث اضت يحذدة يخخصت نع يؼ

. نبؼض انبكخزب نخد انخؼب انخزبت يغ يخخهف انكبئبث انحت انذلمت انخدة ف انخزبت

انحزلبث انشبؼت - انحزلبث انؼطزت - Pseudomonas– انحزلبث انفطت - يؼبندت بنخت :انكهبث انذانت

.نهبكخزب حزبت بسطت يخؼذدة - alkB nahAc, nidAحؼ اندبث انظفت - - ADNr 16Sاالنكب

Table des matières

INTRODUCTION .......................................................................................................................................... 1

CHAPITRE 1 : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................................................................ 5

1. HYDROCARBURES PETROLIERS ......................................................................................................... 6

1.1. DEFINITION ................................................................................................................................................. 6

1.2. CLASSIFICATION ......................................................................................................................................... 6

1.2.1. Hydrocarbures saturés ........................................................................................................................ 6

1.2.2. Hydrocarbures aromatiques (HAPs) .................................................................................................. 6

1.2.3. Composés polaires ............................................................................................................................... 7

I.2.4. Résines et asphaltènes .......................................................................................................................... 7

1.3. LES TYPE DE PETROLES ............................................................................................................................... 8

2. POLLUTION DE L’ENVIRONNEMENT PAR LES HYDROCARBURES ET LEUR IMPACT .......... 8

2.1. IMPACT ECO-TOXICOLOGIQUE ................................................................................................................... 9

2.2. TOXICITE ET PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES HAPS ................................................................... 11

2.3. EFFLUENTS INDUSTRIELS -PROBLEMATIQUE ET ENJEUX SUR LA SANTE ET L’ENVIRONNEMENT ........... 14

2.4. MESURE DE PROTECTION CONTRE LA POLLUTION .................................................................................. 14

2.4.1. Evaluation des sites pollués ............................................................................................................... 14

2.4.2. Réglementation au niveau national .................................................................................................. 15

2.4.3. Le Règlement et normes de rejets internationales sur les effluents liquides des raffineries de

pétrole 16

3. HYDROCARBURES EN ALGERIE ....................................................................................................... 17

3.1. HISTORIQUE ET SITUATION GEOGRAPHIQUE DE LA RAFFINERIE D’ARZEW ........................................... 17

3.1.1. Présentation du complexe ................................................................................................................. 17

3.2. PROBLEMATIQUE LIEE AUX HYDROCARBURES PETROLIERS EN ALGERIE .............................................. 19

3.3. DESCRIPTION DES UNITES DE TRAITEMENT DES REJETS DE LA RAFFINERIE D'ARZEW .......................... 20

3.3.1. Nature et composition des effluents avant épuration ....................................................................... 20

3.3.2. Station de traitement PPI/API (zone 28) .......................................................................................... 21

3.3.3. Station de traitement des effluents huileux U1800 (STEP) ............................................................. 21

3.3.4. Caractéristiques des effluents............................................................................................................ 23

3.3.5. Principe de traitements des effluents pour rejet ............................................................................... 23

4. DEVENIR DES HYDROCARBURES DANS L’ENVIRONNEMENT ................................................... 24

4.1. TRANSFORMATIONS ABIOTIQUES ............................................................................................................ 24

4.1.1. Evaporation........................................................................................................................................ 24

4.1.2. Solubilisation ..................................................................................................................................... 24

4.1.3. Emulsification.................................................................................................................................... 24

4.1.4. Sédimentation .................................................................................................................................... 24

4.1.5. Photo-oxydation ................................................................................................................................. 24

4.1.6. L'hydrolyse ......................................................................................................................................... 25

4.2. TRANSFORMATION BIOTIQUE ................................................................................................................... 25

4.2.1. Biodégradation par les micro-organismes ........................................................................................ 25

4.3. TRAITEMENT ET METHODES DE REMEDIATION DES SITES POLLUES PAR LES HYDROCARBURES....... 26

4.3.1. Traitements des effluents contaminés par des hydrocarbures ......................................................... 26

4.3.2. Traitements biologiques des sols ....................................................................................................... 30

4.4.3. Les principales technologies utilisées dans la bioremédiation sont les suivantes ....................... 30

5. BIODEGRADATION AEROBIE DES HYDROCARBURES PETROLIERS PAR LES BACTERIES 32

5.1. PROCESSUS GENERAUX DE BIODEGRADATION DES COMPOSES ORGANIQUES ......................................... 32

5.1.1. La dégradation primaire (Minéralisation) ....................................................................................... 34

5.1.2. Le co-métabolisme des substrats ...................................................................................................... 34

5.2. MICROORGANISMES APTES A BIODEGRADER LES HYDROCARBURES ...................................................... 35

5.2.1. Rôle des Protéobactéries dans la dégradation des hydrocarbures ................................................... 37

5.2.2. Exemples de biodégradation ............................................................................................................. 37

5.3. MECANISME D’ACCESSION DES MICROORGANISMES AUX COMPOSES ORGANIQUES HYDROPHOBES .... 40

5.4. ADAPTATION DES MICRO-ORGANISMES AUX SITES POLLUES .................................................................. 42

5.5. ADAPTATION GENETIQUE DES BACTERIES ............................................................................................... 42

5.6. BIODETECTION DE LA POLLUTION PAR LES HYDROCARBURES ............................................................... 43

5.7. FACTEURS AFFECTANT LA BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES DANS L’ENVIRONNMENT ............ 44

5.8. FACTEURS BIOLOGIQUES FAVORISANT L’ACCESSIBILITE ET LA DEGRADATION DES HYDROCARBURES 46

6. BIODEGRADATION DU PETROLE BRUT .......................................................................................... 47

7. BIODEGRADATION PAR TYPE D’HYDROCARBURE ...................................................................... 49

7.1. BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES SATURES ................................................................................ 49

7.1.1. Voies de dégradation des alcanes linéaires ....................................................................................... 49

7.1.2. Voies de dégradation des alcanes branchés ...................................................................................... 52

7.2. BIODEGRADATION OXYDATIVE DES HAPS PAR LES BACTERIES ............................................................. 56

7.2.1. Biodégradation des HAPs à 2 ou 3 noyaux aromatiques ................................................................. 58

7.2.2. Dégradation des HAPs à 4 noyaux aromatiques ou plus ................................................................. 58

7.2.3. Diversité des genres bactériens dégradant les HAPs et des gènes codant une HAP-dioxygènase .. 60

8. DIVERSITE BACTERIENNE ET CLASSIFICATION DES MICROORGANISMES

(TAXONOMIE)………………………………………………………………………………………………………………………………………… 62

8.1. MICROBIOLOGIE « CLASSIQUE » .............................................................................................................. 62

8.2. APPORT DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE ................................................................................................. 63

8.2.1. Le choix de l’ADNr 16S .................................................................................................................... 63

8.3. LA DIVERSITE DU DOMAINE « BACTERIA » ............................................................................................... 65

9. ETUDE DE LA REPONSE DES COMMUNAUTES BACTERIENNES SOUMISES A UNE

CONTAMINATION PETROLIERE 67

10. DETECTION ET ANALYSE DES HYDROCARBURES PETROLIERS ............................................ 69

10.1. TECHNIQUES BASEES SUR LA BIOLOGIE MOLECULAIRE ........................................................................ 69

10.2. TECHNIQUES ANALYTIQUES BASEES SUR LA CHROMATOGRAPHIE ....................................................... 70

10.2.1. Chromatographie sur couche mince avec détection à ionisation de flamme ................................ 71

10.2.2. Quantification des hydrocarbures résiduels par chromatographie en phase gazeuse CPG/FID 72

CHAPITRE II : PROCÉDURES ÉXPÉRIMENTALES ............................................................................ 73

PARTIE 1 : APPLICATION DES METHODES MOLECULAIRES COMME BIOMARQUEURS EN

BIOREMEDIATION .................................................................................................................................... 74

AVANT-PROPOS ......................................................................................................................................... 75

1. MATERIELS ET METHODES ............................................................................................................... 76

1.1. SITE DE PRELEVEMENT DES ECHANTILLONS ............................................................................................ 76

1.2. ENRICHISSEMENT ET ISOLEMENT DES BACTERIES AEROBIES DEGRADANT LES HYDROCARBURES ....... 76

1.3. LE CRIBLAGE ET LA CONSERVATION DES SOUCHES ISOLEES................................................................... 77

1.4. DETERMINATION DU POTENTIEL DE BIODEGRADATION BACTERIENNE PAR TURBIDIMETRIE ............... 77

1.5. EXTRACTION DE L'ADN GENOMIQUE DES SOUCHES BACTERIENNES SELECTIONNEES .......................... 77

1.6. AMPLIFICATION DE L’ADNR 16S, SEQUENÇAGE ET ANALYSE PHYLOGENETIQUE ................................. 78

1.7. DETECTION DE GENE DE DEGRADATION ALKB ......................................................................................... 78

1.8. ANALYSE DE LA BIODEGRADATION DES FRACTIONS PETROLIERES PAR TLC/FID ................................ 78

2. RÉSULTATS ............................................................................................................................................ 79

2.1. ISOLEMENT ET CRIBLAGE DES SOUCHES ISOLEES .................................................................................... 79

2.2. ÉVALUATION DE L'UTILISATION DES HYDROCARBURES PAR TURBIDIMETRIE ....................................... 80

2.3. LA CARACTERISATION MOLECULAIRE DES BACTERIES SELECTIONNEES ............................................... 80

2.4. LA DETECTION DE GENE DE DEGRADATION: ALCANES OXYGENASE ....................................................... 80

2.5. LA BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES PETROLIERS PAR UN CONSORTIUM SELECTIONNE .......... 81

3. DISCUSSION ........................................................................................................................................... 81

PARTIE 2 : CARACTERISATION MOLECULAIRE DES BACTERIES AEROBIES CAPABLES DE

DEGRADER DES POLLUANTS ALIPHATIQUES ET AROMATIQUES DE DIFFERENTES

FRACTIONS DES HYDROCARBURES PETROLIERS ........................................................................... 91

AVANT-PROPOS ......................................................................................................................................... 92

1. MATERIELS ET METHODES ............................................................................................................... 94

1.1. SITE DE PRELEVEMENT ............................................................................................................................. 94

1.2. ENRICHISSEMENT, ISOLEMENT DES BACTERIES AEROBIES ..................................................................... 94

1.3. CRIBLAGE DES SOUCHES ISOLEES ET CARACTERISATION PHENOTYPIQUE ............................................. 94

1.4. TEST INT EN PRESENCE DE DIFFERENTES SOURCES DE CARBONES, PETROLE ET (HAPS) SEPAREMENT

.......................................................................................................................................................................... 95

1.5. EXTRACTION DE L'ADN GENOMIQUE ...................................................................................................... 95

1.6. ELECTROPHORESE SUR GEL D’AGAROSE ................................................................................................. 95

1.7. AMPLIFICATION DES GENES D’ADNR 16S PAR REACTION DE POLYMERISATION EN CHAINE (PCR) .... 96

1.8. PURIFICATION DES PRODUITS PCR .......................................................................................................... 96

1.9. SEQUENÇAGE DES FRAGMENTS AMPLIFIES .............................................................................................. 96

1.10. DETECTION ET AMPLIFICATION DES GENES DE DEGRADATION EN UTILISANT DES AMORCES

SPECIFIQUES PAR PCR ..................................................................................................................................... 96

1.11. ANALYSE PHYLOGENETIQUE DES SEQUENCES ....................................................................................... 98

1.12. TESTS DE BIODEGRADATION DES SOUCHES SELECTIONNEES ................................................................ 99

1.13. DOSAGE DES HYDROCARBURES RESIDUELS PAR CPG/FID ................................................................. 100

1.14. PERFORMANCES FINALES DES BACTERIES TESTEES EN POURCENTAGE (%) DE BIODEGRADATION .. 102

2. RESULTATS ET DISCUSSIONS .......................................................................................................... 102

2.1. CARACTERISATION PHENOTYPIQUE ....................................................................................................... 102

2.2. IDENTIFICATION DES SOUCHES PAR AMPLIFICATION ET SEQUENÇAGE D’ADNR 16S .......................... 104

2.3. RECHERCHE DES GENES D’INTERET (BIOMARQUEURS) PAR PCR ......................................................... 105

2.4. BIODEGRADATION (%) DES BACTERIES SELECTIONNEES VIS-A-VIS DES SUBSTRATS CHOISIS ............. 107

CHAPITRE III : CONCLUSIONS GÉNÉRALES & PERSPECTIVES................................................. 124

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................................... 130

LISTE DES FIGURES

Figure 1: Représentation schématique des principales familles d’hydrocarbures et autres composés d’un

pétrole avec quelques exemples de molécules. Modifié d’après Syakti (2004). ...................................... 8

Figure 2: Vue aérienne de la raffinerie d’Arzew .......................................................................................... 18

Figure 3: Schéma général de la raffinerie d’Arzew- (Boudjillouli, 2001) .................................................... 19

Figure 4: Schéma représentatif de l’unité de traitement des éffluents de la raffinerie d’Arzew U1800-

(Naftec Spa, 2010b). .............................................................................................................................. 22

Figure 5: Représentation schématique du devenir d’une pollution pétrolière à la surface du sol (Morgan et

Watkinson, 1989). ................................................................................................................................. 25

Figure 6: Schéma d’une filière de traitement des eaux de raffinerie (Royal Haskoning, 2003). ................. 28

Figure 7: Schéma de principe du traitement biologique des eaux et mécanismes principaux d’élimination

des substances prioritaires dans un réacteur biologique conventionnel (Lesage, 2009) ...................... 29

Figure 8: Principe simplifié de la biodégradation aérobie des hydrocarbures (Lecomte, 1995). ............ 33

Figure 9: Les mécanismes d’accession des microorganismes aux hydrocarbures (Vandecasteele, 2005) ... 41

Figure 10: Voie métabolique de dégradation des n-alcanes (van Beilen et al., 2003) ................................... 50

Figure 11: Système de l’alcane hydroxylase à fer non hémique chez Pseudomonas putida Gpo1 (chaîne de

transfert d’électrons) Van Beilen et al., 2001 ....................................................................................... 50

Figure 12: Voie de dégradation des alcanes chez Pseudomonas putida Gpo1, rôle et localisation cellulaire

des protéines Alk et de leur système de régulation (Van Beilen et al., 2001) ....................................... 52

Figure 13: Voies métaboliques de dégradation du Pristane (2,6,10,14-tétraméthylpentadécane) Fall et al.

(1979) .................................................................................................................................................... 54

Figure 14: Réaction d’oxydation initiale du naphtalène par la naphtalène dioxygénase (NahAc) chez

Pseudomonas NCIB 9816 (Habe et Omori, 2003). ................................................................................ 56

Figure 15: Dégradation du naphtalène en salicylate par voie intradiol par des bactéries aérobies du genre

Pseudomonas (Vandecasteele, 2005) ..................................................................................................... 57

Figure 16: Arbre phylogénétique des principales lignées (phylums ou divisions) du domaine « Bacteria »

Woese (1987) ......................................................................................................................................... 66

Figure 17: Carte de l'Algérie, région d’échantillonnage de sols contaminés par les hydrocarbures

pétroliers - raffinerie d'Arzew-Oran (Smail et Khalef., 2007) ............................................................. 84

Figure 18: Courbe de croissance (DO) de bactéries en présence du pétrole (P) pendant 15 jours

d'incubation. ......................................................................................................................................... 85

Figure 19: Courbe de croissance (DO) de bactéries en présence du rejet industriel (RI) pendant 15 jours

d'incubation .......................................................................................................................................... 85

Figure 20: Amplification PCR de l’ADNr 16S des bactéries du consortium sélectionné. ............................ 86

Figure 21: Arbre phylogénétique par la méthode Neighbor-joining basée sur les séquences d’ADNr 16S

des souches du consortium bactérien. .................................................................................................. 87

Figure 22: Gel d’électrophorèse de la PCR alkB des souches sélectionnées ................................................ 88

Figure 23: Chromatogrammes de la TLC/FID par (Iatroscan). .................................................................. 89

Figure 24: Structure des substrats en hydrocarbures ayant fait l’objet dans cette étude. ........................ 100

Figure 25: Carte d’Algérie, région d’échantillonnage de sol contaminé par les hydrocarbures – Raffinerie

d’Arzew- ORAN (Ladji et al., 2010). .................................................................................................. 116

Figure 26: Gel d’électrophorèse des produits PCR d’ADNr16S des souches sélectionnées. ..................... 116

Figure 27: Arbre phylogénétique par la méthode Neighbor-joining basée sur les séquences d’ADNr16S

repésentés par des OTUs affiliées aux Protéobactéries, Firmicutes et Actinobactéries isolées du sol

contaminé par les hydrocarbures et des espèces apparentées du BLASTn database. ....................... 117


des souches LGM affiliées aux Protéobactéries et Firmicutes isolées du sol contaminé par les

hydrocarbures et des espèces apparentées du BLASTn database. .................................................... 118

Figure 29: Gel d’électrophorèse des produits PCR d’AlkB des souches sélectionnées. ............................. 119

Figure 30: Gel d’électrophorèse des produits PCR de NahAc des souches sélectionnées. ......................... 119

Figure 31: Gel d’électrophorèse des produits PCR de NidA des souches sélectionnées. ........................... 120

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Propriétés physico-chimiques des 16 HAPs prioritaires de la liste EPA d’apères Vandecasteele,

2005 modifié .......................................................................................................................................... 13

Tableau 2: Valeurs guides québécoises et francaises pour différents HAPs [Ministère de l'Enivironnement

du Québec, 1988] .................................................................................................................................. 16

Tableau 3: Normes de rejets en mer méditerranée (Naftec Spa, 2010a). ..................................................... 23

Tableau 4: Exemples de durée de demi-vie des HAPs dans le sol (LCPE, 1994). ........................................ 26

Tableau 5: Méthodes disponibles pour le traitement des eaux contaminées par des produits pétroliers

(Farhadian et al., 2008). ........................................................................................................................ 27

Tableau 6: Différentes techniques de traitement biologique des sols pollués (Scriban,1999). ..................... 31

Tableau 7: Principales souches bactériennes aérobies qui participent à la dégradation des HAPs et des

Alcanes .................................................................................................................................................. 36

Tableau 8: Proportions des différents familles de composés dans divers bruts pétroliers (Bertrand et Mille,

1989) ...................................................................................................................................................... 48

Tableau 9: Qualité moyenne du brut Algérien (Naftec Spa, 2007) .............................................................. 49

Tableau 10: Enzymes capables d’oxyder les alcanes (Van Beilen et Funhoff, 2005) ................................... 55

Tableau 11: Diversité des gènes de dégradation des HAPs décrits dans la littérature (Louvel, 2010) ....... 60

Tableau 12: Cultivabilité des bactéries (Amann et al., 1995) ....................................................................... 62

Tableau 13: Composition (%) des fractions pétrolières dans les controles biotiques (P+c et RI+c) et

abiotiques pendant 28 jours d'incubation. ........................................................................................... 90

Tableau 14: Caractéristiques des différents couples d’amorces utilisées lors des PCRs de notre étude. .... 98

Tableau 15: Conditions chromatographiques pour l’analyse des hydrocarbures résiduels par CPG/FID

(Brito et al., 2006) ............................................................................................................................... 101

Tableau 16: Différents phénotypes des bactéries isolées ............................................................................ 111

Tableau 17: Numéro d’accession EMBL-GenBank et l’affiliation des séquences aux OTUs (unité

taxonomique opérationnelle) disponibles sur NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ....................... 112

Tableau 18: Résiduels hydrocarbures aromatiques polycycliques (mg/L) et % de biodégradation par les

souches sélectionnées. HAPs à haut poids moléculaire (50 mg/L) et HAPs à bas poids moléculaire

(100 mg/L) après 30 jours de culture. ................................................................................................ 121

Tableau 19: Résiduels alcanes (mg/L) et % de biodégradation par les souches sélectionnées. (250mg/L)

après 21 jours de culture. ................................................................................................................... 122

ABREVIATIONS

% : pourcentage

GC : Teneur en Guanine et Cytosine

A : Adenine, T : Thymine

ADN : Acide désoxyribonucléique

ADNr 16 S : ADN codant la sous-unité

16S de l’ARN ribosomal

ADNc : ADN complémentaire

ADNr : ADN ribosomique

AlkB : Alcane hydroxylase membranaire

de type AlkBs

ARN : Acide ribonucléique

ARNr : Acide ribonucléique ribosomique

ARNr 16S : Sous-unité 16S de l’ARN ribosomal

B[a]P: Benzo[a]Pyrène

BET: Bromure d’éthidium

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

bp / pb, kbp : base pair / paire de base, kilo

base pairs

BSASOL:Base de données Basol sur les sols

pollués:http://basol.developpementdurable.gouv.fr/

CPG-FID : Chromatographie en phase gazeuse

à détection par ionisation de flamme

GC: Gas chromatography

GC-MS: Gas Chromatography-Mass Spectrometry

dNTP : Désoxyribonucléotides triphosphates

DO : Densité optique

EDTA : Ethylène Diamine Tétra Acétique

EMBL : European Molecular Biology Laboratory

Pyr : Pyrène

HAPs : Hydrocarbure aromatique polycyclique

HMW: Hight molecular weight

LMW: low molecular weight

HPLC: Chromatographie Liquide Haute Performance

INT: Iodo-Nitro-Tétrazolium

LB : Luria-Bertani

LGM : laboratoire de génetique microbienne

m/z : ratio masse sur charge d’une molécule

M : Marqueur de taille

MED POL/MED PAS : Programme des Nations Unies

pour l’environnement. Plan d’action pour la

Méditerranée.http://www.unepmap.org/index.php?module

=content2&catid=001017003

MEGA 0.5: Molecular Evolutionary Genetics

Analysis

MSM: Mineral salt medium

NAD/NADH : Nicotinamide Adénine

Dinucléotide (oxydé/réduit)

NahAc : Naphtalène dioxygénase

ND : Non Déterminé

NidA : Série de dioxygénase Gram-positif

OTU : Operational Taxonomic Unit

OMS : Organisation mondiale de la santé

PCR : Polymerase Chain Reaction

P : Pétrole

pH : Potentiel Hydrogène

Phe : Phénanthrène

ppm : partie par million

http://www.unepmap.org/index.php?module=content2&catid=001017003



qPCR : quantitative Polymerase Chain Reaction

qsp : quantité suffisante pour

RDP : Ribosomal Database Project

RT-PCR : Transcription inverse suivie d’une

réaction d’amplification génique

RI : Rejet Industriel

S (16S) : Svedberg

SARA : Saturés, Aromatiques, Résines et

Asphaltènes

SDS : Sodium Dodécyl Sulfate

sp. : Espèce non précise

Std : Standard

TBE : Tris-Borate-EDTA

TE: Tris base, EDTA

Tris: trishydroxyméthylaminométhane

TLC/FID: Thin layer chromatography/ flame

ionization detection

Tm: Temperature of melting

UFC: Unité Formant Colonie

UV: Ultra Violet

Unités de mesure :

h, min, s : Heure, minute, seconde

l, ml, µl : Litre, milli-litre, microlitre

mM : Milli-molaire

rpm : Rotation par minute

U : Unité

p/v : masse à volume

v/v : volume à volume

C° : Celsius

km, cm, mm, nm, µm : kilomètre, centimètre,

millimètre, nanomètre, micromètre

g, mg, µg : Gramme, milligramme,

microgramme

INTRODUCTION

Introduction

1

INTRODUCTION

La pollution par les hydrocarbures en milieu marin et terrestre, qu’elle soit chronique

ou accidentelle, pose d’importants problèmes d’élimination. Les voies d’élimination chimique

et physique ont leurs limites du fait de leur coût ou de leur impact secondaire sur

l’environnement. La voie biologique est actuellement en plein essor et suscite de très

nombreux travaux par le monde. A l’heure où se développe une large «sensibilité écologique»

dans notre société, la connaissance des propriétés de biodégradabilité des produits pétroliers

apparaît comme un enjeu essentiel pour légitimer l’utilisation de ces produits. Les activités

industrielles dans les raffineries génèrent une multitude de composés plus ou moins toxiques

pour les organismes vivants. Par exemple, l’extraction, la transformation et l’utilisation des

produits pétroliers produisent des composés organiques tels les hydrocarbures que l’on

retrouve dans le pétrole brut, les fiouls, les essences, les lubrifiants, rejets industriels

principalement les rejets liquides et des composés inorganiques tels que les métaux lourds.

Ces polluants contaminent tous les compartiments de l’environnement : le sol, l’eau, l’air et la

biosphère.

Selon la base de données BASOL (http://basol.ecologie.gouv.fr/), les hydrocarbures,

les solvants halogénés et les métaux lourds sont les composés le plus souvent rencontrés, seuls

ou en mélanges, sur les sites pollués. Les composés les plus récalcitrants sont les

hydrocarbures saturés principalement, les alcanes lourds ramifiés tel le Pristane (C19), les

hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) à haut poids moléculaires tel le Pyrène

(C16) et Benzo[a] Pyrène (C20). Ces polluants sont présents au niveau de sites industriels en

activité, proche des voies de communication routière, au niveau des sols agricoles notamment

et autres écosystèmes aquatiques. Ces substances plus ou moins mobiles se déplacent soit

sous forme particulaire dans l’atmosphère, soit en solution dans les eaux de surface ou

souterraines. Elles peuvent alors atteindre différents écosystèmes naturels. De part leurs

caractéristiques physico-chimiques, ces composés présentent des dangers pour

l’environnement et les organismes vivants. Ils entrent dans la chaine alimentaire, et finissent,

à terme par menacer la santé humaine en raison de leurs des propriétés mutagènes et

cancérigènes (Yakimov et al., 2007).

Malgré leur transformation au cours de l’accumulation, les hydrocarbures enfouis dans

les sols et les nappes aquifères peuvent persister longuement. La formulation des

hydrocarbures d’origine pétrolière doivent prendre en compte des critères de biodégradabilité

afin de limiter autant qu’il est possible les risques environnementaux liés à leur utilisation. De

surcroît, dans l’hypothèse de déversements accidentels, l’autorité publique algérienne se doit

d’être en mesure de prévoir l’impact de toute pollution par ces hydrocarbures. Elle doit

également être à même de prédire si les chances d’atténuation naturelle du site pollué sont

réelles ou si, à l’inverse, il conviendrait d’entreprendre un traitement de dépollution. Il est

donc primordial de mettre en œuvre des moyens de dépollution des sites contaminés. Leur

réhabilitation peut être réalisée par traitement physico-chimique sur site ou après excavation

des sols. Les produits pétroliers sont aussi introduits dans l’environnement marin sous forme

de produits raffinés: carburants et huiles, leurs compositions dépendent de l’origine du pétrole

et des opérations subies au cours du raffinage.

Introduction

2

Ces techniques sont coûteuses et non respectueuses des écosystèmes. Cependant, pour

certains polluants organiques (les hydrocarbures saturés, les HAPs à hauts poids

moléculaires), une approche par bioremédiation peut être envisagée. Elle utilise le pouvoir

épurateur des microorganismes de l’environnement, et présente l’avantage d’être peu invasive

et moins onéreuse. Les groupes de composés pétroliers polluants pour lesquelles la

biodépollution est possible sont : Les hydrocarbures pétroliers (gasoils, fuels, kérosène, huiles

minérales) et Les déchets d’exploitation et de transformation du pétrole (boues et résidus

d’huiles de forages et principalement les rejets ou effluents liquides) (Bertrand et al., 1972).

La grande diversité bactérienne et la versatilité métabolique liée aux gènes de

dégradation a permis à des microorganismes de coloniser l’ensemble des niches écologiques

de la planète en s’adaptant aux changements environnementaux. Ces microorganismes

ubiquistes sont ainsi retrouvés de la stratosphère aux sous-sols profonds. Certaines bactéries

possèdent par ailleurs la capacité d’adopter des formes de vie (spores, symbiose) tel Bacillus

sp. (Dandie et al., 2004) et des structures (biofilms, tapis microbiens) particulières leur

permettant d’appréhender des contraintes environnementales plus ou moins extrêmes tel

Pseudomonas sp. (Johnsen et al., 2007). Ces microorganismes montrent par ailleurs un

potentiel élevé d’adaptation aux pollutions aux hydrocarbures dans les stations de traitement

des sites pollués (Molina et al., 2009). Ainsi, malgré les nombreuses techniques physico-

chimiques et mécaniques développées pour éliminer les hydrocarbures d’environnements

contaminés, la bio-réhabilitation impliquant les populations bactériennes du milieu reste

l’alternative la plus efficace.

La question du devenir des hydrocarbures dans les sites pollués a conduit dans un

premier temps à l’isolement et l’étude physiologique de nombreuses bactéries à partir du sol.

Ces études ont permis de montrer que certaines bactéries hydrocarbonoclastes principalement

les Pseudomonas sont capables de baser leur métabolisme exclusivement sur la dégradation

des hydrocarbures bien que de nombreuses sources de carbone plus facilement métabolisables

soient disponibles dans l’environnement (Juhasz et al., 2000). Cependant, les conditions de

culture limitent l’extrapolation du comportement de la souche isolée dans la communauté

exposée (seul 1% des souches d’une communauté est cultivable en condition de laboratoire).

Avec l’essor des outils moléculaires, de nouvelles approches sur l’écologie des communautés

bactériennes soumises à une contamination pétrolière ont pu être envisagées. Il a été démontré

que les consortia possèdent une efficacité de dégradation des hydrocarbures supérieure à des

souches isolées, grâce à la dégradation séquentielle de ces molécules ou encore à la mise en

place de coopérations métaboliques. Aussi, les métabolismes aérobies permettent une

dégradation plus rapide et plus efficace.

Ce travail a pour but d’étudier la capacité de dégradation des bactéries isolées du sol

contaminé par les hydrocarbures pétroliers de la raffinerie d’Arzew –Oran- afin de mettre au

point des procédés fiables de biodégradation accélérée. En cas de pollution, la connaissance

de la microflore locale du sol contaminé et de ses capacités intrinsèques de biodégradation est

essentielle pour pronostiquer les chances d'atténuation naturelle du site pollué.

Introduction

3

C'est en effet la microflore native qui détermine les capacités d'auto-épuration du site en

l'absence de toute limitation d'ordre physico-chimique. C'est pour cela qu'il est important de

connaître les compositions et performances des bactéries capables de dégrader les polluants.

Dans un premier temps, la problématique des effluents industriels, du rejet des

substances toxiques dans l’environnement et des traitements envisagés sera posée. Puis, les

résultats présentés sur les bactéries sélectionnées capables de dégrader les hydrocarbures

pétroliers principalement le rejet industriel liquide et le pétrole brut ainsi que les polluants

ciblés en HAPs et alcanes s’articuleront autour de quatre points principaux :

Le premier concerne la mise au point méthodologique sur l’enrichissement,

l’isolement et sélection des souches bactériennes aptes à vivre en présence de ces polluants

en s’appuyant sur la démarche adoptée pour l’étude de la biodégradabilité du pétrole brut

(Solano-Serena et al., 1999). Dans la partie expérimentale, la répartition des capacités de

dégradation vis-à-vis de différents substrats des bactéries sélectionnées a été réalisée par le

test de respiration pertinent avec les sels de Tétrazolium (INT) pour la détermination des

capacités intrinsèques des bactéries isolées ayant la capacité de croitre en présence du pétrole

et ses dérivés. Il convenait alors de prendre en considération non seulement l’origine des

microflores mais aussi la variation possible de la formulation du substrat en hydrocarbures

pétroliers. La persistance des HAPs augmente avec le nombre de cycles de la molécule, les

composés de poids moléculaires élevés sont très persistants et par conséquent

bioaccumulables, de ce fait nous nous sommes intéressés à une large gamme de HAPs tels :

phénanthrène, pyrène et le Benzo[a]Pyrène. Autres substrats d’adaptation représentatifs des

familles chimiques du pétrole dans la gamme des alcanes ont été choisis : l’octadecane

(alcane linèaire), le pristane et squalène pour les alcanes ramifiés afin d’évaluer la capacité de

dégradation des isolats sélectionnés.

Le deuxième volet de l’étude est relatif à la caractérisation moléculaire des

microorganismes dégradatrices. Actuellement, la majorité des espèces microbiennes ne sont

connues qu’au travers de leurs biomarqueurs, essentiellement les gènes codants pour les

ARNr 16S, la méthodologie choisie est basée sur l'analyse phylogénétique de séquences

d’ADNr 16S obtenues par amplification génique après extraction de l’ADN génomique des

bactéries isolées. En utilisant une méthode de séquençage des gènes codant l’ARNr16S,

l’identification des bactéries a été déterminée et comparée avec celles présentes dans la

banque de données GenBank database du National Center for Biotechnology Information

(NCBI). Cette étape permet de déterminer une affiliation phylogénétique entre les séquences

analysées et des séquences connues. Les séquences obtenues dans cette étude seront déposées

dans les banques de données NCBI/DDBJ/EMBL/GenBank avec des numéros d’accession

définies.

Le troisième point de l’étude concerne les différentes techniques de dosage utilisées

afin de pouvoir suivre la biodégradation au cours du temps, la détermination des différentes

classes de pétrole par Iatroscan est une méthode basée sur le principe d’une analyse faite par

chromatographie sur couche mince (CCM) couplée à une détection par ionisation de flamme

(TLC-FID) (Cavalier et al., 2009), elle permet de séparer, identifier et quantifier la proportion

relative des fractions majeures du pétrole.

Introduction

4

Les constituants aromatiques et saturés ciblés ont été ensuite quantifiés individuellement par

la chromatographie en phase gazeuse (CPG), c’est une technique permettant de séparer les

composés d'un mélange. Elle s'applique principalement aux composés gazeux ou susceptibles

d'être vaporisés par chauffage sans décomposition. Dans notre étude, nous avons utilisé un

détecteur à ionisation de flamme (FID), afin de pouvoir caractériser les hydrocarbures

résiduels à la fin de la période d'incubation.

Dans la quatrième et dernière partie de cette étude, la relation entre la présence de

certains gènes de dégradation et les performances d’adaptation de différentes souches isolées

a pu être abordée. Les enzymes intervenant dans l’attaque initiale des hydrocarbures sont des

cibles intéressants pour la détection des gènes d’intérêt ciblant la dégradation des

hydrocarbures pétroliers et la détection de bactéries ayant un potentiel de bioremédiation vis-

à-vis de ces composés (Hamman et al., 1999). Nous avons plus particulièrement recherché

ceux de l’attaque initiale des alcanes, l’alcane hydroxylase (alkB) et ceux de l’attaque initiale

des hydrocarbures aromatiques, la dioxygènase (HAP-diox), la naphtalène dioxygénase

(nahAc) susceptible d’intervenir dans l’attaque initiale des HAPs chez les bactéries Gram-

négatif (HAP-diox GN) et (nidA) chez les Gram-positif (HAP-diox GP). Un séquençage des

amplifias a été réalisé afin de confirmer l’identité du gène par rapport à une banque de

données.

Chapitre 1

ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE

Étude bibliographique

6

1. HYDROCARBURES PETROLIERS

1.1. Définition

Les hydrocarbures sont des composés organiques contenant exclusivement des atomes

de carbones (C) et d'hydrogène (H) (Heider et al., 1999). D'après Harayama et al., (1999), le

terme « hydrocarbure pétrolier » est un terme générique qui désigne les mélanges de

composés organiques présents dans des matières géologiques comme l’huile, le bitume et le

charbon ou dérivés de ces matières.

1.2. Classification

Les hydrocarbures constituent la fraction la plus importante d'un brut pétrolier, ils

représentent entre 65 et 95 % de la plupart des pétroles bruts. Ces hydrocarbures peuvent être

classés en quatre familles principales qui sont présentes en proportions variables selon leur

origine: les hydrocarbures saturés (30 à 70 %), les hydrocarbures aromatiques et

polyaromatiques (20 à 40 %), les composés polaires (5 à 25 %) et les asphaltènes (0 à 10 %)

(Figure 1). Selon Syakti (2004), les hydrocarbures pétroliers sont classés comme suit:

1.2.1. Hydrocarbures saturés

Parmi les hydrocarbures saturés on distingue:

. Alcanes linéaires

Les alcanes linéaires (n-alcanes, CnH2n+2), dont la longueur de leur chaîne varie de 7 à 40

atomes de carbone constituent une des classes les plus abondantes (10 à 40 % des

hydrocarbures totaux d'un brut pétrolier).

. Alcanes ramifiés

Les alcanes ramifiés les plus abondants sont les iso-alcanes (groupement méthyle en position

2). Les autres composés ramifiés antéiso (groupement méthyle en position 3) ou polyramifiés

tels que les isoprénoïdes (exemple: pristane, phytane) sont beaucoup moins nombreux. Ces

composés se trouvent dans le pétrole brut à des proportions sensiblement égales à celles des

n-alcanes.

. Cycloalcanes

Les cycloalcanes renferment des composés cycliques (à 5 ou 6 atomes de carbone) saturés et

le plus souvent substitués. Quelques dérivés polycycliques sont aussi présents et certains

d’entre eux tels que les stéranes et les triterpanes sont caractéristiques d’un pétrole brut. Cette

famille peut représenter entre 30 et 40 % des hydrocarbures totaux d’un pétrole brut.

1.2.2. Hydrocarbures aromatiques (HAPs)

Plusieurs familles d'hydrocarbures aromatiques et polyaromatiques dont le nombre de

noyaux varie de 2 à 6 sont présentes dans les pétroles bruts. Ces composés sont dominés pa

des composés mono-, diet tri-aromatiques, les cycles aromatiques peuvent être agencés de

manière linéaire (anthracène), angulaire (phénanthrène) ou groupé (pyrène). Au sens strict, ils

ne contiennent donc que des atomes de carbone et d’hydrogène (Vandecasteele, 2005; Seo et

al., 2009). Les HAPs se subdivisent en deux groupes : les légers, dont la masse molaire est

comprise entre 150 et 180 g.mol-1

(HAP de moins de quatre cycles) et les lourds (au moins

quatre cycles) ; dont les masses molaires varient de 200 à 280 g.mol-1

.


7

Les HAPs présentant un caractère génotoxique élevé, seize d’entre eux ont été classés par

l’American Environmental Protection Agency (EPA) comme polluants fortement toxiques

dont l’étude est prioritaire (Samanta et al., 2002) sont présentés dans la (Tableau 1). Depuis

quelques années, certains de ces 16 HAPs font également partie des listes de l’OMS

(Organisation Mondiale de la Santé) et de la Communauté Européenne. Ces HAPs sont

constitués de cycles aromatiques accolés en nombre croissant, allant de deux cycles (comme

le naphtalène) et n’ayant pas de limite supérieure encore démontrée. Cependant, certains

composés aromatiques contenant du soufre (comme par exemple le phénanthrothiophène :

C14H8S), de l’azote (comme la quinoline : C9H7N) ou de l’oxygène (comme le

dibenzofurane : C12H8O) sont parfois associés, et ces composés peuvent alors être aussi

considérés comme des HAPs. Les HAPs sont très stables, peu volatils et hydrophobes. Les

caractéristiques physico- chimiques de certains HAPs sont détaillées dans le (Tableau 1).

En général, les hydrocarbures aromatiques sont moins abondants que les alcanes, et ne

représentent que 10 à 30 % des hydrocarbures totaux d'un brut pétrolier.

1.2.3. Composés polaires

Les composés polaires correspondent à des molécules hétérocycliques, telles que:

- des composés oxygénés: phénols, acides carboxyliques, alcools, aldéhydes,…

- des composés soufrés: mercaptans, sulfures, disulfures,

- des composés azotés: pyridines, quinoléines,

Les dérivés soufrés sont dans la plupart des cas plus abondants que les composés oxygénés ou

azotés.

I.2.4. Résines et asphaltènes

Les résines sont des composés très polaires ayant un caractère aromatique très marqué

solubles dans les solvants organiques tels que l’n-heptane. Les asphaltènes correspondent à

une classe de composés de hauts poids moléculaires, insolubles dans le pentane ou l’hexane.

Les composés appartenant à la fraction des résines et asphaltènes peuvent être complexés à

des éléments autres que l’hydrogène et le carbone tels que l’azote, l’oxygène et le soufre pour

former des hétéroéléments. Ces éléments peuvent également être complexés à des métaux

lourds, tels que le nickel et le vanadium, généralement présents à l’état de trace dans les

pétroles (Tissot et Welte, 1984).


8

Figure 1: Représentation schématique des principales familles d’hydrocarbures et

autres composés d’un pétrole avec quelques exemples de molécules. Modifié d’après

Syakti (2004).

1.3. Les type de pétroles

Le terme de pétrole recouvre un ensemble de produits dont les compositions peuvent

être très différentes. La diversité de composition des bruts repose principalement sur leur

provenance. En effet, les conditions de formation d’un brut vont influencer l’importance

relative de chacune des familles de constituants citées précédemment. Cependant, des bruts

issus d’une région donnée peuvent présenter des différences importantes liées aux conditions

de formation et d’évolution différentes. Les bruts lourds (Boscan, Sofania) contiennent des

proportions importantes de résines et d’alphaltènes par rapport aux hydrocarbures saturés. Au

contraire, les bruts légers sont très riches en hydrocarbures saturés et très pauvres en

asphaltènes (Arabian Light) (Syakti, 2004). Cette diversité dans la composition des bruts est

un aspect très important dans l’industrie du raffinage.

2. POLLUTION DE L’ENVIRONNEMENT PAR LES HYDROCARBURES ET

LEUR IMPACT

La notion de la pollution est toute relative. On peut considérer qu’il y a pollution par

les hydrocarbures lorsque l’action de ceux-ci peut être considérée comme néfaste aux

conditions de vie de l’homme directement, ou indirectement, si elle affecte les populations

animales et végétales qui lui sont utiles (Bertrand et Mille, 1989). La pollution est une

modification défavorable du milieu naturel (dégradation, altération) qui apparaît en totalité ou

en partie comme le sous-produit de l'action humaine (Vogel et Ballerini, 2001).

Les hydrocarbures sont des contaminants environnementaux omniprésents. Ils constituent une

classe des produits chimiques organiques dangereux dont certains de leurs effets toxiques sont

reconnus comme fortement cancérogènes, génotoxiques, immunotoxique, mutagénique ou

tératogénique. Ils représentent une menace pour la santé publique (Eriksson et al., 2003).

Hydrocarbures aromatiques

(monoaromatiques et HAP)

Alcanes

n-alcanes et alcanes ramifiés

Phénanthrène

Benzène

Toluène

Naphtalène

Métaux

Porphyrines

Asphaltènes

Composés

oxygénés

Composés

soufrés

Composés

azotés

Hexadécane Pristane

Octadécane

Cycloalcanes

Cyclohexane

Cyclopentane

10 - 40%

30 - 40%

5 - 20%

10 - 30%


9

Les sols contaminés par les hydrocarbures présentent un danger lors d'un contact direct avec

l'homme ou l'animal ou lors de leur transfert dans les chaines alimentaires. C'est le

phénomène de bioaccumulation avec le piégeage par les végétaux et les animaux des

polluants ou de leurs produits de dégradation jusqu'à des teneurs atteignant les seuils de

toxicité (Gabet., 2004). Aux polluants transitant par les cours d’eau s’ajoutent ceux provenant

des territoires proches de la mer. Ils peuvent avoir une origine diffuse (principalement

agricole) ou ponctuelle (stations d’épuration industrielles ou urbaines).

Les impacts de la pollution par les hydrocarbures sont multiples. Les aspects les plus

évidents sont les grandes catastrophes très médiatisés (Soltani, 2004). La plus grande

catastrophe pétrolière fut celle du sous marin d’Ixtoc one, dans le golfe du Mexique où

350 000 tonnes de pétrole brut se sont déversées dans l’océan entre juin 1979 et février 1980.

D’autres sources viennent alourdir le bilan, citons l’exemple de la première guerre du Golfe,

où la fin du conflit en 1991 à révélé la catastrophe des champs de puits de pétrole en flamme

et le naufrage de pétroliers bombardés, déversant des quantités importantes de brut. Le bilan

total a été estimé à 800 000 tonnes déversées, 40 millions de tonnes de sols saturés de pétrole

et 700 km de côtes polluées (Kennish, 2001). En 1980, l’Algérie non plus n’a pas été

épargnée, à ce titre, l’accident du pétrolier Juan Lavalleja a déversé plus de 40 000

tonnes de pétrole dans les eaux territoriales algériennes. Un plan d’action Algérien

national pour la réduction de la pollution marine due à des activités industrielles menées à

terre a été élaboré sous l’égide du Ministère de l'Aménagement du Territoire et de

l'Environnement: MED POL/MED PAS (2005)

(http://www.themedpartnership.org/med/documents/library/backgrounddocuments/naps/en/att

achments%7Cattachments%3A001%7Cfile).

L’essor de l’industrie a entraîné le rejet massif de résidus toxiques dans

l’environnement. Le pétrole constituant la première source mondiale d’énergie, la pollution

par les hydrocarbures est la plus répandue et affecte le milieu marin, les environnements

côtiers et tout particulièrement le sol et les eaux souterraines.

2.1. Impact éco-toxicologique

Dans l’environnement, les contaminants peuvent être présents sous différentes formes

augmentant ainsi les risques d’exposition. En effet, à température ambiante, les hydrocarbures

aliphatiques sont gazeux jusqu'à C4, puis liquides et enfin solides à partir de C16 (excepté

pour les alcynes qui se solidifient à partir de C15). Ces formes induisent des modes de

contamination différents. Par ordre d’importance, on notera l’inhalation, la pénétration à

travers la peau puis l’ingestion (Baudouin et al., 2002). Une fois dans l’organisme, ces

composés hautement liposolubles rejoignent la circulation sanguine puis sont répartis vers un

spectre très large de tissus avec une localisation préférentielle au niveau des tissus adipeux.

Du fait de leur caractère lipophile, ces polluants ont une tendance à la bioaccumulation via les

réseaux trophiques (Fent, 2004). De nombreux hydrocarbures aliphatiques présentent des

risques toxicologiques, mutagènes voire même cancérigènes pour de nombreux organismes

dont l’homme (Spencer et al., 2002). Il est cependant difficile de dissocier leurs effets propres

car ils sont souvent présents en mélange avec d’autres hydrocarbures, tels les HAPs, qui sont

largement plus étudiés.

http://www.themedpartnership.org/med/documents/library/%20backgrounddocuments/naps/en/attachments%7Cattachments%3A001%7Cfile

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10

Les hydrocarbures aromatiques sont des composés toxiques, de par leur caractère

mutagène, carcinogène et récalcitrant (Phale et al., 2007). Ils constituent une classe de

composés hydrophobes, donnant une stabilité thermodynamique non négligeable. Les HAPs

se trouvent dans l’environnement à des doses relativement faibles, mais leur caractère

hydrophobe entraîne leur bioconcentration dans la chaîne alimentaire. Certains ont été

reconnus comme cancérigènes (benzo(a)pyrène, benzo(a)anthracène, chrysène, benzo (b)

fluoranthène…). Chez l’homme, les HAPs deviennent toxiques après oxydation enzymatique,

provoquant la formation de métabolites électrophiles solubles.

Ces métabolites peuvent alors former des adduits sur les acides nucléiques ainsi que sur les

protéines, amenant à un dérèglement du processus de division cellulaire et à la formation de

tumeurs (Kallimanis et al., 2007). Le Benzo(a)pyrène (BaP) est certainement le plus connu et

le plus étudié des HAPs quant à sa cancérogenicité. Certains de ses dérivés seraient impliqués

dans le développement de cancers du poumon chez l’homme par la formation d’adduits avec

l’ADN, notamment au niveau du gène p53 (Coppotelli et al., 2008). Des études font état

d’une plus grande mutagénicité de mélanges de HAPs lorsque la proportion en BaP est plus

importante (Phale et al., 2007).

L'homme est exposé aux HAPs par l'ingestion de denrées alimentaires (légumes,

viandes grillées), Phillips (1999) indique que l'alimentation est la source majoritaire

d'exposition aux HAPs pour les non fumeurs (70 % de l'exposition). Des études menées dans

différents pays ont montré que la quantité de HAP ingérée variait de 1,2 à 5 μg par jour.

Par comparaison, la fumée de cigarette ajoute 2 à 5 μg par jour pour une consommation d'un

paquet par jour. Les hydrocarbures aliphatiques chlorés (méthanes, éthanes et éthènes chlorés)

sont les plus étudiés car ce sont des composés chimiques qui sont largement utilisés pour leurs

propriétés de solvants et dont la toxicité est avérée (Ruder, 2006). En effet, le contact avec ces

contaminants peut entraîner des dommages, pouvant aller jusqu’au développement de cancers,

au niveau de nombreux organes (foie, reins, système cardio-vasculaire, système reproductif,

système nerveux) (Ruder, 2006 ; Spencer et al., 2002). Le caractère toxique du pétrole ne

s’applique pas qu’aux organismes supérieurs. En effet, de nombreuses études ont permis de

mettre en évidence le caractère toxique de certains hydrocarbures chez les bactéries (Shirai,

1987). Ces molécules agissent principalement en s’accumulant au niveau de la bicouche

lipidique de la membrane plasmique bactérienne. Elles affectent ainsi la cellule bactérienne en

modifiant la structure et l’intégrité membranaire.

Outre ces effets, certains composés volatils aromatiques contribuent, au travers de réactions

faisant intervenir les oxydes d'azote et le rayonnement solaire, à la formation de polluants

photochimiques, tels que l'ozone, nocifs pour la santé et l’environnement.


11

2.2. Toxicité et propriétes physico-chimiques des HAPs

Les hydrocarbures aromatiques sont des composés que l’on retrouve de manière

naturelle au sein des environnements (produits pétrolifères, dégradation de la matière

organique comme la lignine, feux de forêts, activités volcaniques) (Vandecasteele, 2005).

Cependant, de nombreuses activités anthropiques (comme le raffinage du pétrole brut ou

l’expansion des industries chimiques) entraînent une forte production de ces molécules, qui

malheureusement dans certains cas, vont s’accumuler au sein des sols et donc générer des

pollutions, ces composés organiques ainsi que certains de leurs métabolites de dégradation

peuvent en fonction du degré de contamination, du mode et du temps d’exposition et de

l’organisme considéré, être retrouvés dans une grande variété de tissus affectant ainsi les

capacités fonctionnelles des organismes (augmentation des attaques parasitaires, atteintes des

fonctions de reproduction, modification d’activités cérébrales) (Meador et al., 1995 ; Mearns

et al., 2008).

Dans le cas particulier des marées noires ont pu être constatés des dégâts importants sur les

populations d’oiseaux, de poissons et de mollusques plusieurs années après la catastrophe

(Gentile, 2006).

Les molécules aromatiques ont également la particularité d’être présentes dans les effluents

d’industries chimiques, pétrochimiques et pétrolières tels Benzène, Toluène, Ethylbenzène,

Xylène (BTEX), certains dérivés du phénol et les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques

(HAPs). Cette liste est composée des polluants aux effets sur la santé parfois très différents

(nuisances olfactives, altération de la fonction respiratoire, troubles nerveux (Germain, 1995).

Le devenir et la mobilité des polluants dans l’environnement sont principalement

contrôlés par leurs propriétés chimiques. Ces propriétés les rendent relativement résistants à

la biodégradation. De fait, ils persistent dans l’environnement, faisant courir un risque

sanitaire. En effet, des études ont montré que certains HAPs sont génotoxiques, mutagènes et

cancérigènes (Phale et al., 2007).

La stabilité des HAPs est grandement fonction de l’arrangement des cycles, les HAPs

angulaires étant les plus stables, et les linéaires les moins stables (Vandecasteele, 2005; Seo et

al., 2009). Leur solubilité en milieu aqueux est notable pour le naphtalène (32 mg/L avec

deux cycles aromatiques), mais décroît rapidement avec le nombre de cycles aromatiques

(4 μg/L pour le Benzo[a]Pyrène qui se compose de cinq cycles). Il en va de même pour leur

volatilité, leur faible solubilité et volatilité font que ces hydrocarbures aromatiques sont

persistants dans l’environnement et entraînent des pollutions des écosystèmes (Haritash et

Kaushik, 2009).

A l'état pur, les HAPs sont des solides souvent colorés et cristallins à température ambiante.

Leurs propriétés physico-chimiques varient avec leur masse molaire et leur structure. Le

(Tableau 1) regroupe principales propriétés physico-chimiques des 16 HAPs prioritaires

classés par l'Agence de Protection de l'Environnement américaine (USEPA). Les HAPs ont un

point de fusion supérieur à 100°C et un point d’ébullition élevé (supérieur à 300°C). Ce sont

des composés neutres et non polaires.


12

Les HAPs sont classifiés selon les propriétés qui indiquent leur propension à transferer

vers les differentes phases. Le coefficient de partage octanol/eau (Kow), (Daugulis and

Janikowski, 2002) permet de qualifier l’hydrophobicité d’une molécule. Plus il est important,

plus la molécule aura tendance à s’adsorber sur une surface solide. La solubilité d’un

composé en phase aqueuse, reflétant le degré d’attraction pour ce solvant, est aussi un bon

indicateur de sa capacité d’adsorption. Dans la mesure où elle définit l’affinité du soluté pour

le solvant (Demaneche et al., 2004), plus la solubilité sera élevée, plus les forces reliant le

soluté au solvant seront fortes et plus l’adsorption sera faible. D’autre part, la température

d’ébullition permet d’évaluer la volatilité d’un composé. Plus la température d’ébullition est

faible, plus le composé aura tendance à transferer facilement vers la phase gazeuse.

Dans l’eau, les HAPs sont généralement présents en faible concentration du fait de

leur faible solubilité. Le caractère lipophile (Log Kow >3,2), des HAPs se traduit par une

tendance à se fixer sur les fractions organiques des matières en suspension (MES) et

sédiments (sols). Cela explique que la présence des HAPs est très marquée sur les matières en

suspension alors qu’elle est peu visible dans la phase aqueuse (Feix and Wiart, 1995).

HAPs

Formule semi-

développée

Formule

brute

Masse molaire

(g/mol)

Pression de

vapeur (Pa)

Point de

fusion(C°)

Point d’ébull-

ition(C°)

Solubilité

(mg/L)

Coefficient de partage

octanol /eau log Pow

Toxicité

Cancérogène ou

mutagène

Commentaires

Naphthalène

C8H10 128.2 36.8 80 218 31 3.35 Modérée Non confirmé

Cancérigène chez les

animaux

Acénaphthylène

C12H8 152.2 4.14 82 270 16.1 4 Modérée Constaté

Acénaphthène

C12H10 154.2 1.52 93 279 3.8 3.92 Modérée Constaté

Fluorène

C13H10 166.2 0.715 116 294 1.9 4.18 Faible Constaté Mutagène pour l’homme

Phénanthrène

C14H10 178.2 0.113 100 338 1.10 4.52 Modérée Constaté

Photo-

sensibilisateur de peau

Anthracène

C14H10 178.2 0.0778 216 340 0.045 5.54 Modérée Constaté Cancérigène chez les animaux. Cancérigène/

Retenu par la norme

européenne relative à l’eau potable

Fluoranthène

C16H10 202 8.72 10-3 107 383 0.26 5.22 Modérée Constaté

Pyrène

C16H10 202 0.0119 150 393 0.132 5.18 Modérée Constaté

Dommage sur ADN.

Mutagène pour l’homme

Benzo[a]

anthracène

C18H12 228.3 6.06 10-4 167 435 0.011 5.91 Elevé Confirmé

Cancérigène.

Mutagène pour l’homme

Chrysène



animaux.

Mutagène pour l’Homme

Benzo[b]

fluoranthène



animaux

Benzo[k]

fluoranthène

C20H12 252.3 4.12 10-6 169.4 443 0.0008 6 Elevé Confirmé


animaux

Benzo[a]pyrène


Cancérigène de l’humain.

Mutagène pour l’Homme

Dibenzo

[a,h]anthracène

C22H14 278.3 9.16 10-8 267 524 0.0006 6.75 Elevé Constaté

Dibenzo[g,h,i]

pérylène



animaux. Mutagène pour l’Homme

Indéno[1,2,3-

c,d]pyrène



animaux

La solubilité est déterminée dans l’eau à 25°C. Le Log P0/W est défini comme le logarithme décimal du coefficient de partition K0W d’un composé donné dans un système de standard diphasique octanol/ eau.

Tableau 1 : Propriétés physico-chimiques des 16 HAPs prioritaires de la liste EPA d’apères Vandecasteele, 2005 modifié


14

2.3. Effluents industriels -problématique et enjeux sur la santé et l’environnement

La pollution engendrée par les raffineries est caractérisée par trois types de rejets:

solides, gazeux et principalement des rejets liquides. Le traitement des eaux résiduaires

produites par l’activité industrielle est une préoccupation importante des exploitants d’usines

et notamment, de ceux des raffineries et des ensembles pétrochimiques. Si la pollution

domestique des ressources en eaux est relativement maîtrisée et définie, les rejets industriels

sont, au contraire, caractérisés par une très grande diversité suivant l'utilisation qui est faite de

l'eau au cours du processus industriel. La lutte contre la pollution et le durcissement des

réglementations incitent en effet les industriels à optimiser les installations de traitement des

eaux de leurs sites.

Les raffineries, de par leur activité de conversion du pétrole brut et des procédés

appliqués, sont particulièrement concernées, différentes étapes du procédé de traitement des

bruts (fractionnement, craquage thermique, dessalage) conduisent à la production d’eaux

résiduaires qui se distinguent des eaux résiduaires urbaines par leur charge organique et

certains composants spécifiques tels que des hydrocarbures (saturés ou cycliques), les huiles ,

les composés phénoliques, des sulfures, de l’ammoniaque, des composés naphténiques, des

solvants et des chlorures. Le risque majeur que présentent certains de ces composés est leur

capacité à induire le développement de cancer chez les organismes exposés. Par exemple le

Benzo[a]Pyrène, un HAPs à 5 cycles dont les propriétés cancérigènes sont reconnues

représente 3 % des HAPs émis par les alumineries (Germain, 1995). Plusieurs métabolites du

B[a]P sont suspectés d’interférer avec les processus biochimiques cellulaires. Ces

interférences pourraient conduire à des anomalies dans le développement ou à l'induction de

cancers par altération du processus génétique et du processus de division cellulaire lors de la

combinaison avec l'ADN. Il existe beaucoup d'autres sources de contamination des eaux dans

une raffinerie de pétrole mais elles sont de moindre importance. Mentionnons les eaux

pluviales qui ruissellent sur les terrains de la raffinerie, les eaux usées domestiques, les eaux

de service (chaudières, eaux brutes, eaux de refroidissement); en outre, les nombreux produits

chimiques utilisés dans les procédés telle la soude caustique et les acides, les solvants, les

inhibiteurs de corrosion, les détergents, etc. peuvent contribuer à contaminer l'effluent à la

suite d'un déversement, lors des purges ou des nettoyages d'équipements.

2.4. Mesure de protection contre la pollution

2.4.1. Evaluation des sites pollués

L’évaluation de la contamination des sites suspects et l’estimation du danger qui

l’associe est un grand problème. L’évaluation simplifiée des risques (ESR) concerne leur

impact potentiel sur les cibles définies. Le risque est défini par la combinaison de trois

facteurs : Le danger de la source polluante lié à la nature des substances polluantes présentes

sur le site et à leur quantité, le transfert des substances de la source vers les milieux naturels et

la cible qui est l’homme, ou l’environnement (Bertrand et al., 1972). Ainsi, les paramètres les

plus représentatifs pour assurer une surveillance adéquate d'un effluent d'une raffinerie de

pétrole sont les MES (Matières En Suspension), dans une eau, par opposition aux matières

dissoutes mesurées par DCO (Demande Chimique en Oxygène) et DBO5 (est la quantité de

dioxygène nécessaire aux micro-organismes aérobies pour oxyder en 5 jours les matières

organiques dissoutes ou en suspension), les hydrocarbures (huiles et graisses), les phénols, les

sulfures, le NH3 . Le pH doit aussi être mesuré en continu.


15

2.4.2. Réglementation au niveau national

Le littoral algérien n’est pas totalement dépourvu de réglementation. Il est couvert

directement ou indirectement par une pluralité de textes dont certains sont très anciens et

d’autres plus récents et qui touchent à des domaines très variés. L’Algérie a élaboré une loi-

cadre pour l’environnement en 1983, établissant des principes généraux de gestion et de

protection de l’environnement. Des mesures réglementaires ont vu le jour (Loi des finances

1992, Art 117) portant sur l’institution de taxes sur les activités polluantes et dangereuses.

Ces taxes servent à alimenter le Fonds National de l’Environnement (FNE). Ce fonds vise la

promotion d’actions de sensibilisation dans le champ environnemental et de soutien financier

concret à toute activité et mesure de protection de l’environnement.

Bien que la réglementation instaurée en matière de protection de l’environnement soit

complète et détaillée, elle reste, cependant, inefficace sur le terrain pour plusieurs raisons:

Manque de procédures spécifiques d’application, Manque de moyens d’intervention au niveau

des inspections de l’environnement, Contraintes d’ordre social liées à la prise de mesures

environnementales, Manque de sensibilisation des décideurs et des acteurs sociaux. Les

dispositions juridiques ne permettent pas le contrôle intégré des pollutions et la gestion

adéquate des déchets. Elles sont insuffisantes pour protéger le littoral et assurer l’exercice

effectif de la puissance publique.

Le Code des Eaux, réaménagé en 1996, constitue une base suffisante pour une gestion

rationnelle et intégrée des ressources en eaux, mais il est encore peu appliqué. L’Algérie a

continué à chercher d’autres instruments législatifs à fin de mieux protéger son

environnement, alors elle a adopté en 2002 une nouvelle loi relative à la protection et la

valorisation de l’environnement qui incite à préserver les espaces terrestres et marins

remarquables ou nécessaires au maintien des équilibres naturels et à l’interdiction de toute

implantation d’activité industrielles nouvelles sur le littoral. C’est en 2003, que l’état a conçu

la loi n°03-10 relative à la protection de l’environnement dans le cadre du développement

durable [102], où elle interdit toute déversement, immersion et incinération dans les eaux

maritimes sous juridiction algérienne, de substances et matières susceptibles de nuire

l’environnement. Concernant les normes algériennes sur les hydrocarbures, il existe le décret

exécutif n° 93-160 du juillet 1993 (J.O n°46 du 14 juillet 1993) qui fixe la valeur limite

maximale des hydrocarbures rejetés des installations de déversements industriels à 20 mg/l. Il

y a aussi le décret exécutif n° 06-141 du 19 avril 2006 qui définit les valeurs limites des rejets

d'effluents liquides industriels au niveau des anciennes installations pétrolières par 15 mg/L

des hydrocarbures totaux en attendant la mise à niveau des installations dans un délai de sept

(7) ans (conformément aux dispositions législatives en vigueur, et notamment celles de la loi

n°05-07 du 28 avril 2005). Après ce délai la valeur limite des hydrocarbures totaux devient

10 mg/L (Sakker, 2007).


16

2.4.3. Le Règlement et normes de rejets internationales sur les effluents liquides

des raffineries de pétrole

Du fait du caractère toxique des HAPs, il est important de légiférer sur les teneurs

maximales admissibles pour éviter tout risque environnemental ou humain. Au Québec et en

France, ce qui concerne les eaux, le décret n° 2001-1220 du 20 décembre 2001 relatif aux

eaux destinées à la consommation humaine (à l'exception des eaux minérales naturelles)

indique que la somme des concentrations en benzo(b)fluoranthène, benzo(k)fluoranthène,

benzo(a)pyrène, benzo (g,h,i) pérylène et indéno (1,2,3-cd) pyrène ne doit pas excéder 0,1

μg.L-1

. Il est à noter que la concentration en benzo[a]pyrène ne doit pas dépasser la valeur de

0,01 μg.L-1

.

Dans le domaine de la pollution des sols, les seules données disponibles sont les VCI

(Valeur de Constat d'Impact), au-delà desquelles une étude de la nature de la pollution et de

ses impacts est nécessaire.

Des valeurs dites guides, servant de référence, sont utilisées au Québec [Ministère de

l'Environnement du Québec, 1988] où un seuil de concentration est défini, correspondant à la

valeur d'intervention au-dessus de laquelle le site doit être dépollué. Le (Tableau 2) récapitule

les valeurs retenues par ces gouvernements :

Tableau 2: Valeurs guides québécoises et francaises pour différents HAPs [Ministère de

l'Enivironnement du Québec, 1988]

Critères québécois pour les sols

(mg/Kg de matière sèche

)

VCI françaises (mg/Kg de

matière sèche)

Niveau A Niveau B Niveau C Usage

sensible

Usage non

sensible

Naphtalène

0.1

5 50 46 pvl

Fluorène 10 100

Phénanthrène 5 50

Anthracène 10 100 pvl pvl

Fluoranthène 10 100 6100 pvl

Pyrène 10 100

Benzo(a)anthracène 1 10 13.9 252

Chrysène

1

10

10350 25200

Benzo (a)pyrère 7 25

Benzo(g,h,i)pérylène

Benzo (k)fluoranthène 900 2520

Indéno (1,2,3-

cd)pyrène

16.1 252

Pvl : pas de valeur limite.

Le niveau A représente le bruit de fond ou la limite de détection du contaminant. Le niveau B

constitue le seuil de contamination pour lequel des analyses approfondies sont nécessaires, et à partir

du niveau C, des techniques de dépollution doivent être mises en œuvre.


17

Le Marpol (pollution marine) (http://marpol.com/) est une convention internationale

concernant la pollution de la mer, fondée en 1978, élaborée dans le cadre de l'Organisation

Maritime Internationale (OMI). Parmi ses principales dispositions :

A une distance de 1 Km de la côte et dans d'autres zones spéciales désignées, les pétroliers

sont autorisés à rejeter de l'eau contenant jusqu'à 15 ppm d'hydrocarbure. Au-delà de cette

concentration une pellicule brillante serait visible à la surface de l'eau, constituant une preuve

de non-conformité. Au-delà d'une limite de 1 Km de la côte et hors des zones spéciales, les

pétroliers sont autorisés à déverser jusqu'à 60 litres par la distance parcourue, jusqu'à un rejet

total maximum représentant 1/15.000 de leur cargaison totale pour les navires-citernes

existants ou 1/30.000 pour les navires-citernes neufs.

Les normes MARPOL 15 ppm et 60 litres au Km peuvent servir de limites plancher aux rejets

des navires-citernes par km pour prévoir les incidences sur l'environnement d'un

accroissement du transport des hydrocarbures.

3. HYDROCARBURES EN ALGERIE

3.1. Historique et situation géographique de la raffinerie d’Arzew

La raffinerie d’Arzew est l’une des cinq raffineries de pétrole d’Algérie, considérée

parmi les complexes les plus importants dans le Nord d’Afrique (Figure 2), troisième

raffinerie du pays après celles d’Alger et de Hassi-Messaoud. Elle est située dans la zone

industrielle sur le plateau d’el Mahgoune à 2 kilomètre de la ville d’Arzew et environ 40

kilomètres de la ville d’Oran. Elle se situe au voisinage du port d’Arzew qui lui permettant les

enlèvements par bateau des produits finis et semi-finis (Bouharis, 2005). Les enlèvements se

font aussi par : camions, pipes et par wagons. Elle est gérée par la société publique Naftec Spa

-SONATRACH.

Les hydrocarbures Algériens ont été nationalises juste après l’indépendance (24 février 1971),

ils occupent une place importante par rapport l’économie nationale. L’Algérie dispose de

potentialités importantes en pétrole et gaz naturel lesquels ne sont pas exploités sous forme de

matières premières mais transformés en partie sur place, selon une stratégie et une

planification rigoureuses. Le transport, la transformation et la commercialisation des

hydrocarbures ont été confiés à la société nationale SONATRACH dont les principaux sièges

se trouvent à: Hassi Messaoud, Alger, Arzew et Skikda.

Arzew, wilaya d’Oran représente un pôle important de transformation et transport des

hydrocarbures. Elle renferme un grand complexe d’industrie pétrochimique en Afrique.

Néanmoins, le développement d’une telle industrie s’est fait au détriment de l’environnement

de cette belle ville qu’on voit se dégrader d’année en année.

3.1.1. Présentation du complexe

La raffinerie d’Arzew occupe 170 hectares, elle a été construite dans le cadre du

premier plan 1970-1974 par la société Japonaise (Japon Gazoline Corporation). Le complexe

traite 2.5 millions Tonnes/an de pétrole brut acheminé du Sahara par pipeline, et plus de

280.000 Tonnes/an de brut réduit importé. D’une manière générale, la raffinerie d’Arzew est

divisée en trois grandes unités, de production, de stockage et zone administrative (Figure 2).

http://marpol.com/


18

Elle répond aux exigences suivantes : Traitement de pétrole brut de Hassi Messaoud,

satisfaction des besoins de consommation du marché national, en carburant, lubrifiants et

bitumes, et l’exploitation de produits excédentaires (naphta kérosène, fuel, gas-oil et huile,

GPL (Gaz de Petrole Liquéfié), essences, lubrifiants et bitumes (Figure 3).

Plus que la moitié de la production est destiné au marché local et le reste à l’exploitation

(Europe, USA) qui sont de grands consommateurs de fuel léger a basse teneur en soufre et de

naphta utilisé comme charge pour les unités pétrochimiques produisant des gaz, essences et

gas-oils (Bouharis, 2005). La raffinerie approvisionne la région Ouest et Sud-Ouest du pays

par 62% de sa production. Les fuels (Basse Teneur en Soufre (BTS) et Haute Teneur en

Soufre (HTS) et la naphta pétrochimique sont exportés à partir du port d’Arzew.

Figure 2: Vue aérienne de la raffinerie d’Arzew


19

Figure 3: Schéma général de la raffinerie d’Arzew- (Boudjillouli, 2001)

3.2. Problématique liée aux hydrocarbures pétroliers en Algérie

Le littoral de l’Ouest d’Algérie recèle un potentiel biologique important, une flore et

une faune riches et variés, des sites naturels exceptionnels, un tel littoral devrait faire l’objet

d’un soin minutieux. Les hydrocarbures représentent la plus importante source de pollution

des eaux de mers et d’océans. Cette pollution résulte de plusieurs activités liées surtout à

l’extraction du pétrole, à son transport et en aval à l’utilisation des produits finis dans les

raffineries.

En effet, de nombreuses études ont permis d’observer l’apparition de problèmes de santé lors

de la baignade ou de pratique de sports aquatiques en eau contaminées. Les plus fréquents

sont des troubles digestifs et des infections cutanées. Cette pollution à retenue l’attention de

l’opinion mondiale et a suscité de nombreuses conventions nationales et internationales tel

que la convention internationale de Londres du 12 mai 1954 la prévention de la pollution des

eaux de la mer par les hydrocarbures » et la convention internationale de Bruxelles de 1971

relative à la création d’un fonds international d’indemnisation pour les dommages dus à la

pollution par les hydrocarbures. En mai 1974, l’Algérie porta ratification de la convention de

Bruxelles, puis, elle adopta le décret n°94-279 du 17 septembre 1994, portant organisation de

lutte contre les pollutions marines et institutions de plans d’urgence. Enfin, le 05 février 2002

la loi algérienne n°02-02 relative à la protection et à la valorisation du littoral est promulguée.


20

Théoriquement la législation protège la baie algérienne, cependant la réalité est toute autre.

Les textes de la loi restent inappliqués, puisque sur le terrain rien n’est respecté. Les rejets des

déchets riches en hydrocarbures émanant des zones industrielles se déversent directement

dans la grande bleue et sans parler de ceux émanant des bateaux poubelles et les navires de

ballastage qui traversent quotidiennement la côte, comme ce fut le cas en 1989 par le pétrolier

‘Maas Luis’ et en 2003 par le navire italien ‘Valbruna’ (Saker, 2007). En attendant

l’application de ces textes et la concrétisation de ces projets, seule l’état de la faune et la flore

pourra témoigner de la triste vérité.

En effet, la pollution par les hydrocarbures en Algérie a fait l’objet de plusieurs études,

parmi lesquelles on cite les travaux de Talbi (2009) et Ghouas en 2005 qui touchent aux

techniques physico-chimiques de traitement des effluents de la raffinerie d’Arzew- Oran, ils

montrent la composition des produits pétroliers tels que Naphta léger et le Naphta lourd, le

kérosène et gasoil. Le gasoil est le produit le plus chargé en alcane (62.36%), ces composés

varient entre (C1 à C30), et en aromatique (17.36%) et il regroupe le benzène et des

hydrocarbures aromatiques non identifiés. Yassa (2005) cible la pollution atmosphérique, ces

travaux traitent la composition en particules organiques de la torche (combustion du pétrole

brut) émis par la raffinerie à Hassi-Messaoud et la comparer avec la pollution présente en

ville. La compostion en particules chimiques atmosphériques en n-alcanes est de 33% pour

(C16 et C34) tel Octadecane (0.012 ppm), et de 47% pour les n-alcanoique acides (A10 à

A30) tel acide pamitique (0.061 ppm). En HAPs 20% tels Phénanthrène (0.011 ppm) et

pyrène (0.003 ppm). Ladji (2010) étudie la composition organique du sable du Sahara pollué

par les hydrocarbures des différentes régions d’Algérie, Hassi-Messaoud, Hassi-Bahbah,

Laghouat, Tougguort et Ghardaia, la plus grande pollution est détectée en n-alcanes à Hassi-

Bahbah avec 66% entre (C16 à C35), le % de chaque n-alcanes est défini dans le sable pollué

et pour chaque ville. En HAPs la ville la plus polluée est Laghouat avec 21.8% entre les

aromatiques légers tels phénanthrènes, anthracène et les aromatiques lourds tels pyrènes et

benzo[a]pyrène, le % de chaque composé aromatique est défini dans le sable pollué et pour

chaque ville. Boutenfnouchet en (2005) a permis d’établir une cartographie de la pollution et

à évaluer la pollution industrielle par les hydrocarbures totaux au niveau de la plateforme

industrielle de Skikda.

Cependant, il serait intéressant de connaître l’identité de ces hydrocarbures directement dans

l’effluent industriel et même dans le pétrole brut avant et après le traitement en raffinerie, qui

est un élément important pour définir le degré du danger qu’ils constituent. C’est pourquoi,

dans notre travail nous nous sommes intéressés à la détermination de la teneur et la nature des

hydrocarbures présents dans le site de traitement de la raffinerie d’Arzew- Oran afin de

prévenir les risques courus dans l’avenir.

3.3. Description des unités de traitement des rejets de la raffinerie d'Arzew

3.3.1. Nature et composition des effluents avant épuration

La pollution engendrée par la raffinerie est caractérisée par trois types de rejets: solides,

gazeux et principalement les rejets liquides (Naftec Spa, 2010a).

La raffinerie d’Arzew rejette des quantités importantes d’eau vers le milieu marin qui sont :

Eaux huileuses ou chargées, eaux de procédés, eaux à forte salinité et eaux chimiques. Eaux

de pluie et de lavage, eaux sanitaires.


21

Types du réseau d’assainissement : Aérien et souterrain. Sites récepteurs des effluents : Oued

Tasmanite, mer. Ces rejets ou effluents liquides canalisés dans des systèmes de réseaux semi-

aériens ou souterrains sont récupérés dans des stations appropriées où ils seront traités.

Pour le traitement des effluents des unités de production 1. La méthode la plus simple et la

plus classique de traitement eaux-huile consiste à utiliser la séparation par gravité. Celle-ci

s’effectue dans des bassins rectangulaires (bassin PPI/API). L’huile écumée est renvoyée dans

des réservoirs pour être retraitée, l’eau prétraitée est évacuée vers la mer.

3.3.2. Station de traitement PPI/API (zone 28)

Le premier bassin PPI (Plaques Parallèles Intercepteurs) contient neuf cellules

parallèles et identiques et chaque cellule traite un débit de 50 m3/h, où on retrouve dans chaque

cellule un crémaillère de déchet ( ensemble de grilles à l’amont inclinées à 45° dans le sens de

l’écoulement) pour éliminer les déchets solides volumineux entraînés par l’eau, ensuite l’eau

huileuse passe dans un tuyau d’admission en tourbillon qui contient un cône et 12 plaques

parallèles de chaque coté, incliné avec une angle de 80° et orientées dans le sens d’écoulement, le

cône joue un rôle de tranquillisant et augmente le rendement de déshuilage, ensuite l’eau passe à

travers les plaques parallèles et par différence de densité les globules d’huiles montent avec une

vitesse ascensionnelle qui doit être supérieur à la vitesse d’écoulement, ensuite l’huile s’accumule

à l’intérieur du capuchon de submersion puis se déversent dans un écumoire et se dirige vers la

fosse d’huile (les huile sont envoyées vers le bac de slop pour être retraitées avec le pétrole brut

dans la charge…). L’eau partiellement déshuilée traverse le long des plaques, en passant aux

dessous du vase, et passe dans un canal commun qui relie les neuf cellules le conduisant vers la

fosse à eau.

Au cours du passage de l’eau huileuse dans les tuyaux d’admission, il se passe une décantation

(sable et déchet) formant une couche qu’il faut éliminer, cette élimination se passe à travers un

tube d’admission, par un tuyau flexible d’aspiration qui est relié à une pompe, il est tiré par un

câble relié à un treuil dans la direction de l’écoulement de l’eau jusqu’au fond de la fosse.

Le seconde bassin API (Antiparallèle Plaques Intercepteurs) est un séparateur par

gravité qui occupe un volume de 4000 m3 se trouve en aval du PPI, par gravité, on enlève les

composés libres des huiles et autres solides venant du bassin PPI, il est constitué de quatre zones :

Zone 1 : C’est une zone de dispersion des filets liquide. L’eau venant du PPI rencontre des

chicanes qui ont un rôle de repartir uniformément l’eau et abaisser le nombre de Reynolds de son

écoulement.

Zone 2 : Correspond à une zone de collecte et de tassement des matières sédimentées. On a des

globules d’huiles montant avec une vitesse ascensionnelle par différence de densité.

Zone 3 : C’est la zone de mise en vitesse avant le déversoir terminal.

Zone 4 : Dans cette zone on récupère l’huile dans une fosse, et on la refoule par pompage vers le

bac de slop. L’eau déshuilée sera évacuée vers la mer.

3.3.3. Station de traitement des effluents huileux U1800 (STEP)

Pour le traitement des effluents de la production 2 (Figure 4). L’unité dispose de

modes de traitements conjugués : traitement physique suivi d’un traitement biologique puis

tertiaire pour l’amélioration de la qualité de l’eau à recycler. Les eaux à forte salinité sont

traitées dans un circuit autonome.

L’unité dispose également d’un système de dégazage des eaux chimiques avant qu’elles ne

soient déversées dans le bassin de réception de tous les effluents liquides.


22

Cette installation a pour objet :

Le traitement des effluents provenant de la raffinerie, c’est-à-dire les effluents des unités de

production, des zones de stockage et des bâtiments. Les effluents traités répondent aux

normes de rejet vers mer et traitement des effluents pour recyclage d’eau vers circuit

refroidissement.

Figure 4: Schéma représentatif de l’unité de traitement des éffluents de la

raffinerie d’Arzew U1800- (Naftec Spa, 2010b).

Débit de traitement maximal de l’installation U1800 est de : 83 m3/h


23

3.3.4. Caractéristiques des effluents

Effluents bruts : Ils proviennent des égouts suivants :

Egout des eaux claires : ce sont les eaux de pluie provenant des toitures, des routes et

également de la vidange des eaux de pluie des cuves de rétention des réservoirs ainsi les aires

de stockage. Toutefois, cette dernière opération ne sera effectuée en dehors des périodes

pluvieuses.

Egout des eaux huileuses ou chargées : ce sont des eaux huileuses, provenant des aires pavées

des unités de production, stations de pompage, pluie chargée en huiles et réseau de

canalisation. Ce sont également les eaux provenant de vidange des équipements, cuves ou

réservoirs, à l’exception toutefois des vidanges qui pourraient contenir une très petite quantité

d’huile, mais ayant une teneur importante en sels minéraux,

Egout des eaux de procédés : ce sont les eaux condensées polluées provenant : du strippage

des condensats acides, du strippage furfural, du strippage Méthyl- éthyl-cétone et Toluène.

Elles ont une faible minéralisation mais une haute teneur en pollution organique.

Egout des eaux à forte salinité : ce sont les eaux provenant : des purges de déconcentration du

circuit de refroidissement, des purges de déconcentration des chaudières et des effluents de

régénération de l’unité de déminéralisation.

Effluents traités

Le Tableau 3 ci-dessous illustre les normes de rejets en mer méditerranée.

Tableau 3: Normes de rejets en mer méditerranée (Naftec Spa, 2010a).

Paramètres Normes pH 6.5 à 8,5 DBO5 mg/l 35 DCO mg/l 120 MES mg/l 35 PHENOL mg/l 1 AZOTE TOTAL mg/l 10 PLOMB mg/l 0,1 CHROME EN Cr6+ mg/l 0,05 HYDROCARBURES mg/l 10

3.3.5. Principe de traitements des effluents pour rejet

Pour obtenir des effluents traités répandant aux normes de rejet, il est effectué sur les

effluents bruts les traitements suivants :

Sur Egouts : dessablage et dégraissage, dégazage, prédéshuilage, coagulation–floculation,

flottation, épuration biologique, clarification, filtration à sable et à charbon actif

Sur boues d’épuration biologique de décarbonatation : épaississement. Sur mélange boues de

flottation, boues épaissies et déshydratation sur lit de séchage.


24

4. DEVENIR DES HYDROCARBURES DANS L’ENVIRONNEMENT

C'est par des processus physiques, chimiques et biologiques qu'un hydrocarbure va

pouvoir être déplacer, transformer ou éliminé, après avoir été diffusé dans l'environnement.

Parmi les différentes altérations que peut subir un hydrocarbure, on citera les facteurs

environnementaux qui sont :

4.1. Transformations abiotiques

Les pertes abiotiques des hydrocarbures sont uniquement dues à des phénomènes

d’ordre physique et chimique. Aucune action d’organismes vivant n’intervient. Elles serait

responsables de la perte de à 20% des hydrocarbures aromatiques à 2 et 3 cycles dans les sol

(Park et al., 2001). Les phénomènes de transformation abiotique des hydrocarbures peuvent

se traduire principalement par :

4.1.1. Evaporation

L'évaporation est un phénomène qui touche les fractions de faible poids moléculaire et

dépend des conditions atmosphériques (vent, vagues, température,…). Les hydrocarbures les

plus légers, ayant de 4 à 12 atomes de carbone (T° ébullition < 270 °C), qui représentent

généralement prés de 50 % des hydrocarbures totaux d’un brut moyen, sont éliminés

rapidement dès les premiers jours, pouvant conduire à une pollution de l’atmosphère (Soltani,

2004).

4.1.2. Solubilisation

La solubilité des hydrocarbures dans l’eau est très faible. Un hydrocarbure est d’autant

plus soluble que sa masse moléculaire est faible et que sa polarité est élevée. Il est important

de noter que ces hydrocarbures solubles sont parmi les plus dangereux pour l’environnement.

Ils sont difficiles à éliminer et sont adsorbés par la faune et la flore (Bouchez et al., 1995).

4.1.3. Emulsification

Deux types d’émulsions peuvent se former : eau dans l'huile appelée "mousse

chocolat" et huile dans l'eau. Les émulsions eau dans l'huile sont constituées par des

hydrocarbures de haut poids moléculaires. Ces émulsions difficilement dégradables sont

lesprécurseurs des résidus goudronneux retrouvés sur les plages, alors que les émulsions «

huile dans l'eau » facilitent l’élimination des hydrocarbures (Soltani, 2004).

4.1.4. Sédimentation

La sédimentation est le passage du pétrole de la surface vers le fond (Figure 5). Ce

phénomène concerne les résidus goudronneux constitués de la fraction pétrolière la plus

lourde et dont la densité est supérieure à celle de l’eau de mer. La sédimentation conduit à la

constitution d’agrégats de haute densité difficilement dégradable par voie naturelle (Morgan

et Watkinson, 1989).

4.1.5. Photo-oxydation

La photooxydation est observée au niveau de la surface de l’eau où l’air (oxygène) et

la lumière (radiations solaires) sont présents pour la transformation des hydrocarbures.

L’efficacité de ce phénomène dépend de la nature des hydrocarbures et de la présence de

composés non hydrocarbonés. Ainsi, la photooxydation touche plus particulièrement les

composés aromatiques qui sont plus photosensibles que les composés aliphatiques. Parmi ces

derniers, les composés ramifiés sont plus facilement photo-oxydés que les n-alcanes (Wilcke

et al., 2000).


25

Figure 5: Représentation schématique du devenir d’une pollution pétrolière à la surface

du sol (Morgan et Watkinson, 1989).

La photolyse correspond à la transformation des hydrocarbures sous l'effet d'un rayonnement

lumineux. Après absorption de l'énergie lumineuse, la molécule est déstabilisée et peut

réagir (généralement avec de l'oxygène) pour former une molécule oxydée, plus polaire

et généralement plus toxique (Lampi, 2005). Dans le cas des sols, ce phénomène n'a lieu que

dans les premiers centimètres de la surface (Park et al., 2001). La photolyse est un processus

extrêmement rapide (temps de demi-vie de l'ordre de la minute, Lehto et al., 2000) qui peut

poser des problèmes expérimentaux. Matsuzawa et al. (2001) ont testé différentes modalités

pour tenter d’évaluer la photodégradation de certains HAPs.

Les demi-vie de certains d’entre eux sous éclairage UV constant et selon les conditions sont

données dans le (Tableau 1). La photodegradation parait donc atténuée par la présence de sol.

4.1.6. L'hydrolyse

Processus de dégradation des molécules organiques sous l'action de l'eau, fortement

influencé par le pH et la température du sol.

4.2. Transformation biotique

4.2.1. Biodégradation par les micro-organismes

La biodégradation est le processus naturel le plus important dans la dépollution de

l’environnement. Les microorganismes en sont responsables, en particulier les bactéries

(Vogel et al., 2001). L’importance de la biodégradation dans l’élimination du pétrole, les

voies métaboliques d’oxydation des hydrocarbures par les bactéries et les paramètres qui

peuvent influencer la biodégradation seront traitées plus loin.

Pétrole

Evaporation

Ecoulement latéral

Sol et sous-sol

Formation d’une langue

Nappe phréatique Pétrole dans la Phase aqueuse

Zone capillaire


26

Particulièrement intéressantes dans le cadre de dépollution de sites contaminés en

hydrocarbures pétroliers, la bioremédiation est considéré comme une façon écologique de

diminuer la teneur de ces polluants récalcitrants notamment les HAPs. C’est en vue

d’exploiter la faculté de certains organismes à dégrader les hydrocarbures que des études

s’attachent à caractériser, quantifier et comprendre ces mécanismes de dégradation. Il est

important de souligner que la durée de demi-vie des hydrocarbures aromatiques dans les sols

est régie par différents mécanismes, dont les biodégradations. Elle consiste en une attaque des

molécules organiques par les micro-organismes du sol, les bactéries, champignons et algues

peuvent en effet cataboliser les hydrocarbures d’origine pétrolière. Le (Tableau 4) illustre les

fortes différences de durée de demi-vie dans un sol.

Tableau 4: Exemples de durée de demi-vie des HAPs dans le sol (LCPE, 1994).

HAPs Demi-vie

Fluorène 32 à 60 jours

Phénanthrène 2.5 à 210 jours

Anthracène 170 jours à 8 ans

Fluoranthène 268 jours à 377 jours

Pyrène 2010 jours à 5.5 ans

Benzo[a]pyrène 0.3 à 58 ans

Le temps de demie vie correspond au temps nécessaire pour que la moitié d'une quantité ou d'une concentration

d'un polluant disparaisse du milieu ou de l'organisme qu'il contamine (Ballerini et al., 1998)

Les micro-organismes produisent des enzymes qui vont réagir avec les molécules

d’hydrocarbures pour les transformer en molécules généralement plus simples. Si la

biodégradation est complète, les polluants sont entièrement décomposés en CO2, c'est la

minéralisation.

4.3. Traitement et méthodes de remédiation des sites pollués par les

hydrocarbures

4.3.1. Traitements des effluents contaminés par des hydrocarbures

Plusieurs techniques de traitement ont vu le jour afin de tenter de restaurer les sites

pollués classés dangereux pour les écosystèmes et la santé humaine. L’intérêt d’une méthode

se mesure à son efficacité, à son coût, à la facilité de sa mise en oeuvre, à la qualité des

effluents obtenu après traitement ainsi qu’à la facilité de retraitement des sous- produits

générés (Vogel et Ballerini, 2001). Pour réaliser une action curative sur un site reconnu

contaminer par les hydrocarbures, plusieurs filières sont envisageables : traitements

physiques, chimiques ou biologiques. Le choix de la filière obéit à des impératifs

technologiques (moyens disponibles, volume à traiter, nature des effluents et objectifs à

atteindre) et économiques (Bernheim, 1999).


27

Les hydrocarbures provenant des industries chimiques et de transformation constituent

les principaux composés de déchets organiques qui contaminent l’environnement. La

présence de ces composés semble être largement attribuable aux techniques inadéquates

d’élimination. Ce type de déchets peut causer de sérieux problèmes de pollution

environnementale tels que la contamination des eaux souterraines (Holliger et al., 1997).

La réglementation nationale et internationale de plus en plus sévère vis-à-vis l’environnement

a permis le développement et l’optimisation de technologies visant la réduction de la pollution

de l’air, de l’eau et du sol. Beaucoup d’efforts ont été directement déployés pour le traitement

des solvants aromatiques dans les effluents gazeux et plusieurs méthodes ont été rapportées

(Tiburtius et al., 2005; Wallace and Kadlec, 2005).

L’évaluation des performances de traitement des stations d’épuration vis-à-vis de ces

substances reste insuffisante. Le bilan complet du devenir des micropolluants dans les stations

est par ailleurs rarement effectué notamment en raison des difficultés analytiques rencontrées

pour la mesure de ces composés dans les matrices solides (comme les boues : fraction

adsorbée) et dans la phase gazeuse. Les industriels doivent aujourd’hui traiter leurs eaux

résiduaires avant de les rejeter dans le milieu extérieur. Le Tableau 5 résume les techniques

d’élimination les plus employées pour le traitement des eaux contaminées par des produits

pétroliers. Les techniques de traitement employées peuvent être basées sur des principes

physiques, chimiques ou biologiques.

Tableau 5: Méthodes disponibles pour le traitement des eaux contaminées par des

produits pétroliers (Farhadian et al., 2008).

A titre d’exemple, les differentes étapes du traitement d’un effluent de raffinerie sont

illustrées sur la (Figure 6). Des procédés d’épuration physicochimiques qui permettent

l’élimination de la pollution colloidale précèdent le traitement biologique qui a pour objectif

l’élimination de la pollution dissoute et biodégradable.

Technologies in-situ Technologies ex-situ

Physique Electro-rémédiation

Barrière

Injection d’Air

Confinement hydraulique

Electro-remédiation (électrodialyse)

Extraction d’Air

Ajout de surfactant

Adsorption sur charbon actif

Filtration membranaire

Chimique

Oxydation

(O3, O2, H2O2, Cl2)

Coagulation, flocculation et précipitation

Remediation photocatalytique

Oxydation (O3, O2, H2O2, Cl2)

Biologique

Bioremédiation In-situ

Bioremédiation Ex-situ (aérobie et anaérobie)


28

Figure 6: Schéma d’une filière de traitement des eaux de raffinerie

(Royal Haskoning, 2003).

D’après le Royal Haskoning (2003), les meilleures techniques pour éliminer les HAPs des

eaux usées sont les suivantes:

1. séparation de l’huile et de l’eau avec un cyclone, par micro-filtration ou separateur API

(American Petroleum Institute),

2. micro filtration, media filtration granulaire ou flottaison des gaz,

3. traitement biologique.

Généralement, une raffinerie de pétrole traite les eaux usées de procédé de façon

semblable avec une chaine de traitement : l'épuisement des eaux acides sert principalement à

réduire la concentration des sulfures et de l'ammoniac et, à un moindre degré, les phénols

dans les eaux usées en provenance des unités d'hydrotraitement et de craquage, l'eau acide est

chauffée pour en récupérer les gaz. Les eaux acides épuisées sont utilisées de nouveau à

l'unité de dessalage en présence du pétrole brut où les phénols encore présents dans ces eaux

ont une plus forte tendance à migrer dans le pétrole brut en fonction du coefficient de partition

eau-huile. Les eaux usées sont ensuite traitées pour enlever les matières en suspension et les

huiles et graisses. Les eaux circulent d'abord dans des séparateurs où sédimentent les

particules et où flottent les huiles (hydrocarbures) libres qui sont récupérées dans le procédé

de raffinage. Par la suite, un flottateur à air dissous ou induit permet d'éliminer pratiquement

toutes les huiles libres en atteignant des concentrations de l'ordre de 10 mg/l. Un bassin

d'égalisation permet ensuite de régulariser le débit et sert également à équilibrer le pH avant le

traitement secondaire.

Sur ce dernier point, les raffineries se distinguent par leur traitement biologique. Ainsi, il

exixiste les réacteurs à lits bactériens, des systèmes à boues activées ou encore traitement des

eaux dans un étang d'aération. Ces trois systèmes sont suivis d'un décanteur secondaire. Les

eaux usées ainsi traitées sont mesurées et échantillonnées avant d'être rejetées au milieu

récepteur (génralement en mer).


29

Les effluents ayant subi un traitement physico-chimique préalable, sont peu chargés en

MES, leur DBO5 est donc essentiellement soluble (la DBO5 exprime le niveau de

biodégradabilité de l’effluent) ; leur composition en nutriments nécessaires à la vie

bactérienne (carbone, azote et phosphore) est rarement équilibrée, un complément est souvent

nécessaire ; les fortes concentrations en sels minéraux sont fréquentes et leurs variations

rapides nuisent au développement de l’épuration biologique, il faut donc les prévenir ; les

valeurs de pH et de température sont souvent variables ; elles doivent être surveillées avec

beaucoup d’attention et rectifiées pour être maintenues dans des zones optimales au

développement de l’activité biologique. Les paramètres de dimensionnement, charge

massique, charge volumique, temps de séjour, âge des boues sont éminemment variables

suivant les procédés utilisés et les secteurs industriels considérés (Gilbert et al., 2005).

Généralités sur les procédés biologiques

La biodegradation aérobie est la plus utilisée dans le traitement d’effluents pétrochimiques

(Figure 7), et qui est considérée comme la technique actuellement disponible la plus éfficace

pour traiter les polluants aromatiques polycycliques récalcitrants de Nardi, 2006;

Kermanshahi et al., 2006, Guieysse et al., 2000).

Figure 7: Schéma de principe du traitement biologique des eaux et mécanismes

principaux d’élimination des substances prioritaires dans un réacteur biologique

conventionnel (Lesage, 2009)

L’épuration biologique aérobie est basée sur la mise en oeuvre de bactéries hétérotrophes qui

éliminent les polluants principalement par les processus suivant : I) par conversion en matière

cellulaire (anabolisme), II) par oxydation en CO2 et H2O qui produit l'énergie nécessaire au

fonctionnement et à la production du matériau cellulaire (catabolisme).


30

Bien que le traitement biologique aérobie soit le traitement le plus courant pour traiter les

effluents industriels, l’application d’un tel procédé à l’élimination de certaines substances

prioritaires est difficile du fait I) de leur vitesse de dégradation parfois lente (nécessitant des

populations bactériennes adaptées), II) des faibles concentrations rencontrées pour certains

micropolluants (qui limitent les cinétiques), III) de la variabilité de l’effluent (Alinsafi et al.,

2006), IV) des propriétés inhibitrices ou toxiques de certaines molécules sur les

microorganismes et enfin V) des processus de transfert par volatilisation et adsorption qui

peuvent nuire à la biodisponibilité et qui sont rarement maîtrisés (Daifullah et al., 2003; Ania

et al., 2007).

4.3.2. Traitements biologiques des sols

Les différents procédés mis en oeuvre sont classés en grandes familles principalement

les traitements aérobies qui utilisent l’oxygène pour transformer les polluants (substrat) en

matériel biologique et participent à la formation de biomasse telles les cultures libres appelée

boues activées c’est l’aération de surface (Actirotor), aération profonde par air surpressé

(Dipair) aération à l’O2 pur et les cultures fixées : lits bactériens à matériau plastique c’est des

filtres biologiques à matériau granulaire (Biofor) et les cultures mixtes ce sont des boues

actives avec support (Meteor).

Les procédés biologiques permettent de dégrader les polluants par l'action de

microorganismes (bactéries, champignons). Ils peuvent être utilisés seuls ou en complément

d'une autre technique. La décontamination par voie biologique consiste donc à stimuler un

phénomène naturel pour en augmenter le rendement afin de détruire le polluant organique qui

sera utilisé comme source de carbone. La décontamination se fait in situ en introduisant dans

le site de traitement les éléments nécessaires au développement de la biomasse ou bien ex situ

dans le cas le sol excavé traité (Colin, 2000). Si la flore locale est inadaptée à la dégradation

des polluants ou est peu abondante, des souches bactériennes performantes allochtones

peuvent être ajoutées au sol (Scow, 2003). Les procédés de traitements biologiques sont : le

bioventing, le biosparging, le pompage et traitement, le traitement bioréacteur (bioslurry) et le

traitement en tas (biotertre et landfarming) représentés dans le Tableau 6.

4.4.3. Les principales technologies utilisées dans la bioremédiation sont les

suivantes

La bioaugmentation : cette technologie consiste à introduire des cultures de

microrganismes à la surface du milieu contaminé dans l’objectif d’augmenter la

biodégradation des contaminants organiques. Généralement les microorganismes sont

sélectionnés sur la base de leur aptitude à dégrader les composés organiques présents dans le

site à dépolluer. La culture peut comprendre une ou plusieurs espèces de microorganimes.

Des éléments nutritifs sont généralement apportés dans la solution contenant les

microorganismes. Cette suspension de microorganisme est apportée à la surface du sol dans

les conditions naturelles ou injecte dans le site contaminé sous pression. Cette technologie est

largement utilisée pour décontaminer les sites contenant des hydrocarbures : Les

microrganismes choisis sont des bactéries dotées d’une grande capacité de digestion de ces

hydrocarbures (Viñas et al., 2002).


31

La biostimulation : cette technologie consiste à stimuler l’activité des populations

microbiennes indigènes (présentes dans le sol ou dans les eaux souterraines) par apport de

nutriments et par ajustement des conditions du milieu (potentiel d’oxydo-réduction, humidité)

(Abdelly, 2007).

Tableau 6: Différentes techniques de traitement biologique des sols pollués

(Scriban,1999).

Type de

traitement

Principe du Traitement

Type de pollution

Avantages et

Inconvénients

Tra

item

ent

in-s

itu

.

" B

iov

enti

ng

"

Aération de la zone

insaturée

(au dessus du niveau

de la nappe phréatique)

Composés organiques

semi-volatils (gazole)

- procédé lent.

- rendement limité.

- utilisé sur les

hydrocarbures

aliphatiques.

- plus limité pour les

hydrocarbures

polycycliques et chlorés.

"B

iosp

arg

ing

"

Injection d'air dans

la nappe phréatique

(au niveau de la zone saturée)

Composés volatils tel que

solvants chlorés et

hydrocarbures pétroliers

volatils (essences,

kérosène

Le rendement du procédé

peut eut atteindre 99%.

Po

mp

ag

e et

tra

item

ent

Traitement des pollutions des

zones saturées ou insaturées du

sol. L'eau pompée est traitée à la

surface et enrichie en nutriments

minéraux, oxygène et parfois en

microflore adaptée au

polluant, avant d'être

réinjectée dans les

poches contaminées du sol.

Composés organiques.

Procédé lent.

Tra

item

ent

ex-s

itu

Tra

item

ent

en t

as

"L

an

d-

farm

ing

"

Traitement extensif,

oxygénation naturelle en

couches peu épaisses

(biostimulation-bioaugmentation)

Pour améliorer la dégradation

Hydrocarbures (fuel)

- durée importante.

- coût peu élevé.

- nécessité de l'espace

Ter

tre b

iolo

giq

ue

(

bio

tert

re)

Consommation accélérée par

l'ajout de nutriments

(biostimulation) et micro-

organismes

(bioaugmentation) aux polluants.

Possibilité de traitement des

effluents gazeux.

Hydrocarbures

(fuel, solvants

Chlorés, kérosène)

- coût modéré.

Nécessité de l'espace.

Bioslurry

(traitement en

bioréacteur)

Traitement du sol pollué dans

un ou plusieurs réacteurs sous

forme de boue avec ajout

d'ingrédients nécessaires à la

biodégradation ; Contrôle des

paramètres physicochimiques tel

que le pH.

Composés organiques

hydrocarbonés semi- ou

non volatils (gasoil, fuel,

HAP)

- bon rendement.

- contrôle précis des

paramètres

physicochimiques.


32

La biofiltration consiste à l’utilisation d’un biolfiltre pour traiter les émissions gazeuses : Le

principe consiste à utiliser des microorganismes pour dégrader les polluants contenus dans

l’air à traiter : la phase aqueuse (l’air contaminé) est mise en contact avec une phase aqueuse

dans laquelle se développe la population microbienne, connue aussi sous le nom de la

biomasse. Dans une unité de biofiltration, l’air à épurer (à dépolluer) traverse d’abord un filtre

et un humidificateur afin de supprimer les particules (poussières, graisses) présentes dans le

gaz et d’amener le niveau d’humidité à 100%. L’air est ensuite introduit dans un réacteur (une

cuve) contenant un garnissage formé de matériaux très poreux (très avide pour l’humidité). A

la surface des particules qui constituent le garnissage se trouve un biofilm qui correspond à

une pellicule d’eau contenant des microorganismes (bactéries et champignons) dont la

fonction est de dégrader les polluants présents dans l’air à traiter. Cette technologie est par

exemple utilisée pour traiter l’air pollué par le xylène ou par des composés azotés (Abdelly,

2007).

5. BIODEGRADATION AEROBIE DES HYDROCARBURES PETROLIERS PAR LES

BACTERIES

L’utilisation de méthodes biologiques dans la dépollution des zones contaminées par

les hydrocarbures se basant sur le phénomène de la biodégradation par les microorganismes

appelés hydrocarbonoclastes a été mise en évidence dès 1946 par ZoBell. Depuis cette date le

nombre d’espèces bactériennes identifiées possédant cette propriété n’a cessé d’augmenter

(Soltani, 2004). La biodégradation est l’ensemble des mécanismes de transformation d’un

contaminant en différents sous produits par l’action des microorganismes. Ce phénomène peut

s’effectuer à n’importe quel milieu (sol, eau) ainsi que dans différentes phases du polluant

(liquide, solide, gazeuse) (Lecomte, 1995).

Certains microorganismes du sol, en particulier des bactéries, sont capables d’obtenir

de l’énergie via le métabolisme des polluants du sol tels que les HAPs (Diaz, 2004). Ils ont

développé des stratégies pour utiliser ces molécules comme sources de carbone et d’énergie,

assurant la détoxification de l’environnement, ou pour les transformer en substrats

métabolisables par d’autres microorganismes (Johnsen et al., 2005). La réduction de la

pollution qui en résulte, est exploitée dans des procédés de bioremédiation visant à

décontaminer les sites pollués tout en conservant l’intégrité de l’écosystème. L’importance de

la biodégradation dans l’élimination du pétrole, les voies métaboliques d’oxydation des

hydrocarbures par les bactéries et les paramètres qui peuvent influencer la biodégradation

seront traitées plus loin.

5.1. Processus généraux de biodégradation des composés organiques

La biodégradation est un phénomène naturel. Elle est le résultat de la dégradation de

molécules organiques par les microorganismes (bactéries, champignons…) dont la croissance

s’effectue par l’oxydation du carbone qui est utilisé comme source d’énergie. Cette réaction

met en jeu deux autres éléments, l’azote et le phosphore, qui participent à la synthèse

protéique ; lorsque l’oxydant est représenté par l’oxygène, on parle de condition d’aérobiose.

Dans le cas d’anaérobiose, l’oxygène est remplacé par les nitrates, sulfates ou méthane (Jose,

1999).


33

La littérature concernant l’oxydation des hydrocarbures par les microorganismes indique que

la croissance cellulaire dépend des processus de transport des hydrocarbures à la surface

cellulaire et de passage à travers l’enveloppe cellulaire jusqu’au cytoplasme (Soltani, 2004).

Dans les conditions naturelles, la biodégradation des hydrocarbures est un processus lent et

complexe, son mécanisme simplifié est décrit dans la Figure 8. Elle se déroule selon une

réaction d’oxydation en chaine, les hydrocarbures sont transformés par cassures successives

en molécules de moins en moins complexe jusqu’à l’obtention de sous-produits simples qui

sont représentés par l’H2O et le CO2 avec renouvellement de la biomasse (Lecomte, 1995).

Deux processus sont communément impliqués dans la biodégradation des composés

organiques (INERIS, 2004) :

I) l’utilisation du xénobiotique comme source d’énergie pour la croissance bactérienne

(oxydation, réduction, fermentation) ;

II) le co-métabolisme, au cours duquel le composé chimique n’est pas utilisé pour la

croissance bactérienne mais est dégradé du fait de l’activité métabolique.

R-CH2- CH2- CH3 Chaine hydrocarbonée

O2 Oxydation de la longue chaine hydrocarbonée en acide.

O

||

R-CH2- CH2- C-OH

β-oxydation sous l’action enzymatique des microorganismes

O2 et de l’oxygène, la chaine hydrocarbonée est dégradée en

acide acétique.

O

||

CH3-C-OH

Dégradation de l’acide acétique en CO2 et H2O dans le cycle

de Krebs.

CO2 + H2O

Figure 8: Principe simplifié de la biodégradation aérobie des hydrocarbures

(Lecomte, 1995).


34

5.1.1. La dégradation primaire (Minéralisation)

La minéralisation de la molécule organique par les micro-organismes est une forme de

biodégradation complète, elle est couplée à une production d’énergie et de carbone au travers

d’une série de réactions complexes d’oxydoréduction. Dans ce cas, les substances impliquées

sont considérées comme des sources de croissances primaires, puisqu’elles sont directement

impliquées dans la croissance bactérienne. Au cours de ce procédé biologique, les électrons

subissent des transferts par addition ou retrait au niveau d’intermédiaires tout au long de la

chaîne de réactions.

La biodégradation se traduit par une simplification progressive de la structure chimique d'un

composé organique de formule Cx Hy Oz Nt Pu avec la minéralisation du carbone

(aboutissant à la formation du dioxyde de carbone CO2) et l'obtention de métabolites de faible

poids moléculaire, disponibles alors pour la synthèse de constituants cellulaires.

5.1.2. Le co-métabolisme des substrats

Horvath (1972) a été un des premiers à faire une synthèse des connaissances autour du

principe de co-métabolisme. Le co-métabolisme correspond à la dégradation biologique d'un

composé, par une enzyme produite de manière fortuite. Cette enzyme catalyse normalement

un autre substrat, mais elle peut présenter une certaine non-spécificité de substrat. Par

principe, le phénomène de co-métabolisme ne bénéficie pas aux microorganismes produisant

l'enzyme. Le polluant ne sert pas de source principale de carbone ou d'énergie, le micro-

organisme à besoin d'une source primaire de substrat, et le polluant est considéré comme un

substrat secondaire. Ainsi, les produits de dégradation liés au co-métabolisme ne stimulent

pas la croissance bactérienne des populations concernées. En culture bactérienne pure, le

produit du co-métabolisme est généralement stocké et n'est pas entièrement minéralisé. Tant

que le métabolite n'est pas toxique, la transformation du substrat peut continuer. Dans le cas

d'un consortium microbien, il peut exister une forme de commensalisme, où une première

espèce dégrade un substrat. Le métabolite produit n'étant pas utilisé par la bactérie, cette

source d'énergie peut servir à une seconde espèce comme un champignon (Bouchez et al.,

1999). Un exemple d’alcane cométabolisé est le cyclohexane dégradé par Mycobacterium

austroafricanum en présence d’isooctane (Marchal et al., 2003).

Le co-métabolisme est reconnu pour permettre la dégradation des HAPs de haut poids

moléculaires dont le benzo(a)pyrène (Juhasz et Naidu, 2000; Kanaly et Harayama, 2000). En

dépit de nombreux essais, seul un nombre très limité de bactéries pouvant croître en cultures

pures à partir de HAP de 5 cycles aromatiques et plus comme substrats, ont été isolées

(Johnsen et al., 2005). Ces HAPs peuvent par contre être dégradés par co-métabolisme.

Le cométabolisme demeure toutefois un phénomène complexe. En effet, cette complexité a

été soulignée par Ye et al., (1996), ils ont trouvé que différents co-substrats (glucose, xylose,

glycérol, acétate) avaient des effets différents sur la transformation du xylène par

Pseudomonas aeruginosa.

Plusieurs microorganismes sont capables de minéraliser les hydrocarbures. Par contre

la présence d’un consortium bactérien peut être requise pour la dégradation complète de

HAPs, particulièrement les HAPs à haut poids moléculaire. Vu la nature complexe et la

diversité de ces composés, la dégradation effectuée par un consortium est souvent plus

efficace (Vinas et al., 2002).


35

En effet, lorsqu’il ya plusieurs bactéries impliquées, chaque microorganisme peut fournir les

enzymes impliquées dans une certaine étape de la dégradation. Les métabolites intermédiaires

de la dégradation des composés peuvent alors être utilisés comme source de carbone par les

autres bactéries (Marcoux, 1998). De plus, certains métabolites intermédiaires peuvent être

toxiques pour quelques bactéries tandis que d’autres peuvent les utiliser comme source de

carbone. Plusieurs études ont d’ailleurs montré la dégradation des HAPs par différents

consortium bactériens (Mueller et al., 1989; Yu et al., 2005)

5.2. Microorganismes aptes à biodégrader les hydrocarbures

Ils proviennent de milieux très variés et peuvent vivre dans des conditions extrêmes :

des températures en dessous de 0°C ou au contraire, très élevées, dans des milieux inondés ou

en plein désert, en présence d’un excès d’oxygène ou milieu anaérobie.

En raison de leur pouvoir d’adaptation, ces microoganismes sont utilisés pour éliminer les

composés xénobiotiques. L’existence d’organismes susceptibles de métaboliser les

hydrocarbures a été signalée dès le début du 20ème siècle par Sohgen (Gatellier, 1970). Les

bactéries sont des acteurs essentiels dans le recyclage des composés organiques de toutes

natures, contribuant ainsi à la biodégradation d’une foule de substances utilisées comme

source d’énergie ou comme source de carbone directement assimilable par les cellules

(Pelmont, 1995).

La dégradation des hydrocarbures dans les milieux marin et terrestre est réalisée par les

bactéries suivantes : Achromobacter, Acinétobacter, Alcaligens, Arthrobacter, Bacillus,

Flavobacterium, Nocardia, Pseudomonas, Micrococcus, Actinomycétes, Rhodococcus,

Corynebacterium et Mycobacterium (Champagnat et Adrian, 1974).

Selon Pelmont, (1995), Les caractéristiques des bactéries aptes à biodégrader les

hydrocarbures sont les suivantes : Génétiquement stable, apte à se reproduire rapidement suite

à un entreposage de longue durée, apte à biodégrader une vaste étendue de polluants

pétroliers, activité enzymatique et croissance des bactéries dans des conditions

environnementales optimum , aucun effet secondaire néfaste et produits finaux non toxiques,

63% pigmentés (orange, jaune et rouge), la majorité des souches bâtonnées Gram négatives,

2% des bactéries motiles ou mobiles, 20% des bactéries à Gram positives, filamenteuses.

Parmi les microorganismes aptes à se développer sur les hydrocarbures (Tableau 7),

les bactéries restent qualitativement et quantitativement prépondérantes pour métaboliser ces

substrats. On peut y retrouver tous les types de bactéries, des autochtones, des hétérotrophes,

des aérobies ; des anaérobies ; des mésophiles ; des psychrophiles et des thermophiles (Gabet

et al., 2004). L’étude de la littérature nous a permis de synthétiser le tableau suivant.


36

Tableau 7: Principales souches bactériennes aérobies qui participent à la dégradation

des HAPs et des Alcanes

Composés Microorganismes Références

Naphtalène Pseudomonas Sp.

Rhodococcus sp.

Mycobacterium sp.

Eaton et Chapman.,1992

Grund et al,, 1983

Daane et al. 2001

Fluorène Pseudomonas sp.

Rodococcus sp.

Genney et al., 2004

Boldrin et al., 1993

Anthracène Pseudomonas sp. Juhasz et al., 2009

Phénanthrène Pseudomonas sp. Kang et al., 2005

Fluoranthène Pseudomonas sp.

Paucimobilis sp.

Lopez et al., 2005

Pyrène Mycobacterium sp. Boldrin et al.,1993

Benzo[a]pyrène Beijerinckia sp.

Pseudomonas sp.

Jerina et al., 1976

Kanaly et al., 2000

N-alcanes : C5-C10

C10-C20

C20-C32

Pseudomonas aeruginosa

Corynebacterium sp.

Mycobacterium sp.

Rhodococcus sp.

Rhodococcus sp.

Zhang et al.,2010

Zuber et al.,2008

Snapper et al., 1990

Sokplovska et al.,2003

Whyte et al.,1998

Isoalcane Mycobacterium fortuitum Solano-Serena et al., 2000

Cycloalcanes Nocardia sp.

Pseudomonas sp.

Bouchez-Naitali et al.,1999

Smith et al., 2004

Plusieurs microorganismes peuvent dégrader partiellement ou complètement les

hydrocarbures. Ce sont principalement des bactéries qui participent à cette dégradation, par

contre certains champignons et algues ont aussi démontré qu’ils pouvaient dégrader ces

composés. Les champignons peuvent transformer les hydrocarbures de façon cométabolique

en métabolites moins toxique par l’action de peroxydase et de monooxygénase. Un des

champignons les plus étudiés pour ses capacités de dégradation est Phanerochaete

chrysosporium (Boonchan et al., 2000) qui à la capacité de dégrader une grande variété de

polluants persistants dans l’environnement comme les HAPs, les biphéniles polychlorés ou les

pesticides. Cette capacité de dégradation serait reliée au système d’enzymes ligninolytiques

extracellulaire sécrétées dans l’environnement (Kanaly et Hur, 2006). Les champignons

dégradant les HAPs qui sont les plus fréquemment retrouvés dans la littérature appartiennent

aux genres Aspergillus, Cunninghamella, Penicillium, Trametes, Fusarium, Sacharomyces et

Bjerkandera.

Quelques recherches ont aussi démontré la dégradation de certains HAPs pas des

algues. En effet, Selenastrum capricoruntum, une algue verte, peut dégrader le fluoranthène,

le pyrène (Lei et al., 2007) et le Benzo[a]Pyène (Cerniglia, 1992, Juhasz et Naidu, 2000).

D’autres espèces comme Chlorella vulgaris, Scenedesmus platydiscus et Scenedesmus

quadricauda ont aussi montré une certaine capacité de dégradation des HAPs (Lei et al.,

2007).

Il est reconnu que les hydrocarbures sont souvent dégradés en aérobie. Par contre, la

biodégradation des HAPs a aussi été rapportée sous différentes conditions anaérobies :

conditions dénitrifinates, sulfato-réductrices ou méthanogène (Chang et al., 2005). En fait le

Naphtalène (Rockne et al., 2000), le phénanthrène, le pyrène et l’anthracène on été

complètement oxydé en C02 sous conditions dénitrifiantes (McNally et al., 1998).


37

De plus, la dégradation de Naphtalène et Phénanthrène a été obtenue sous conditions sulfato-

réductrices (Meckenstock et al., 2000).

5.2.1. Rôle des Protéobactéries dans la dégradation des hydrocarbures

L’identification de bactéries possédant des capacités épuratrices peut aussi être réaliser

au cours de la bioremédiation des sols pollués. Ainsi, une étude sur l’évolution de la diversité

d’un sol pollué aux alcanes et aux aromatiques pendant un processus de bioremédiation a

permis de mettre en évidence que le sol pollué est toujours dominé par des microorganismes

de type Gamma-Proteobacteria (Juhasz et al., 2000). Les bactéries appartenant aux sous-

divisions Gamma-Proteobacteria et Beta-Proteobacteria sont toutefois importantes tout au

long de la décontamination. Par ailleurs, la plupart des souches bactériennes, caractérisées au

cours de ce travail, avaient déjà été identifiées au niveau de sols contaminés par des

hydrocarbures (Eriksson et al., 2003). Les Pseudomonales, et surtout le genre Pseudomonas,

sont très souvent dominants dans les sites contaminés aux hydrocarbures (Evans et al., 2004).

Ils semblent, en effet, être impliqués dans les premières phases des procédés de

bioremédiation lorsque les polluants sont biodisponibles (Kaplan et Kitt, 2004).

Des bactéries du genre Pseudomonas, appartenant à la classe des

Gammaprotéobactéries, ont servi de modèles pour étudier le métabolisme du naphtalène et du

phénanthrène. Les opérons cataboliques de P. putida G7 et P. stutzeri AN10 ont a été

caractérisés après isolement sur naphtalène (Bosch et al., 1999). De même, Pseudomonas

aeruginosa a été isolée pour ses capacités à dégrader le phénanthrène (Romero et al., 1998).

Pseudomonas putida, et Pseudomonas aeruginosa sont aussi connues pour leur faculté de

chimiotactisme vis à vis des HAPs (Grimm and Harwood, 1999). D’autres Pseudomonas ont

été détectées dans des sols contaminés par une pollution diffuse (Johnsen et al., 2002). Une

autre Gammaprotéobactérie, Stenotrophomonas, est capable de dégrader le phénanthrène ainsi

que des HAP de haut poids moléculaire comme le benz[a]anthracène, le benzo[a]pyrène, le

fluoranthène et le pyrène (Juhasz et al., 2000).

5.2.2. Exemples de biodégradation

Biofiltration des effluents

La dégradation des composés organiques volatils (COV) par les microorganismes

capables de les utiliser comme source d’énergie ou de carbone, abrités dans un bioréacteur

filtrant les effluants gazeux, représente une solution moins onéreuse que les méthodes

physicochimiques, qui peuvent dégager des composés toxiques comme les oxydes d’azote.

Déjà largement utilisé pour le traitement de l’eau et de certains rejets liquides industriels, le

traitement biologique s’étend depuis quelques années aux effluents gazeux, en particulier en

hollande, en Allemagne et plus récemment aux USA.

Selon la nature des polluants à éliminer, la transformation biologique implique des bactéries,

des algues ou des champignons. De manière générale, de nombreuses souches microbiennes

métabolisent les alcools, les acides, les esters et les cétones. Les hydrocarbures aromatiques

nécessitent une assez longue adaptation de la population microbienne dans le réacteur. Il faut

considérer éventuellement la toxicité de certains composés présents dans les gaz à traiter

comme le dioxyde de soufre.


38

Il est cependant plus simple d’ensemencer le réacteur avec de la boue active provenant d’une

station d’épuration d’eau, dont la population microbienne s’adaptera d’elle-même. Quelque

soit l’origine de la souche dégradant le polluant, une population microbienne extrêmement

variée se développera dans le bioréacteur.

Il arrive souvent que les bactéries ne dégradent pas complètement les composés organiques

mais les transforment en métabolites secondaires, eux-mêmes utilisés comme substrats

nutritifs par d’autres espèces. Ainsi de proche en proche, les microorganismes finissent par

dégrader totalement lescomposés organiques en eau, sels et gaz carboniques (CO2). Les

cellules mortes servent à leur tour de substrat à des espèces saprophytes, si bien que le

réacteur peut être considéré comme un système fermé (Abedelly, 2007).

Dépollution des eaux usées et des effluents industriels

Dans les stations d’épuration, ce sont des microorganismes qui retirent des eaux

usées les polluants les plus courants, avant qu’elles ne rejoignent la rivière, le lac ou la mer.

Les pollutions croissantes (dues à l’industrie et à l’agriculture) nécessitent le développement

de procédés capables d’éliminer des polluants spécifiques comme l’azote, le phosphore, les

métaux lourds et les composés chlorés.

Selon la vieille méthode des boues activées, les eaux usées passent dans un premier bassin dit

biologique, où un agitateur mécanique brasse les boues (mélange de biomasse, de polluants et

de débris) pour les maintenir en suspension et stimuler la biodégradation du substrat. Les

bactéries se développent librement dans ce bassin où les effluents sont fournis de manière

continue et les boues se décantent. L’eau est alors libérée dans la nature (et utilisée) alors que

les boues sont maintenues dans ce bassin biologique.

Plusieurs dizaines d’espèces bactériennes, en particulier du genre Pseudomonas, peuvent

dégrader les polluants organiques. Ces organismes hétéroptrophes se reproduisent très vite et

les boues sont renouvelées au bout de 2 à 10 jours. En revanche les Nitrosomas, qui

transforment en nitrite les fortes concentrations d’ammoniac des eaux résiduaires et les

Nitrobacters qui convertissent ces nitrites en nitrates ont un faible taux de croissance. Pour

laisser à ces bactéries le temps d’opérer, on ne peut renouveler les boues qu’en 20 jours

environ (Kermanshahi et al., 2006).

A la place des cultures libres, les professionnels développement depuis quelques années des

cultures de bactéries sur des supports minéraux fixes ou sur des supports mobiles constitués

de billes de polystyrène en suspension. Le recyclage des déchets en produits utiles peut

réduire les coûts du traitement des eaux usées. Par exemple, grâce à des bactéries utilisant le

soufre dans leur métabolisme, les métaux lourds et les composés soufrés, présents dans les

eaux usées peuvent être retirés puis réutilisés. La production d’aliments pour les animaux à

partir la biomasse de champignons qui demeure après l’extraction de la pénicilline en est un

autre exemple. Enfin la plupart des systèmes de traitement des eaux usées produisent un gaz

utilisable (biogaz) (Alemzadeh and Vossoughi, 2001).


39

Dépollution du milieu marin

Pour lutter contre les marées noires (arrivée de nappes de pétrole provenant d’un

navire qui a été accidenté ou qui a purgé ses réservoirs ou de l’éruption accidentelle d’une tête

de puits sous marine), l’expérience a prouvé que la plupart des produits commercialisés à base

de microorganismes exogènes ne sont pas plus efficaces que les organismes oléophiles

(microorganismes qui dégradent les produits pétroliers) indigènes, dont la profilération est

stimulée par la marée noire.

Le mouvement des marées apporte l’oxygène nécessaire, ainsi un simple ajout de fertilisants

azotés dans les zones contaminées suffit pour éliminer la pollution 3 à 5 fois plus vite que

dans les zones non traitées. Malheureusement un tel succès dans le nettoyage d’une marée

noire reste rare. La bioremédiation ne devient efficace que lorsque la couche de pétrole n’est

pas épaisse, c'est-à-dire après plusieurs nettoyages mécaniques.

Lorsque la couche est épaisse, l’absence d’oxygène à l’intérieur de la couche d’hydrocarbures

diminue l’action des microorganismes.

Un autre problème auquel est confrontée la dépollution est la contamination des sédiments

des océans et des estuaires. Au cours du temps, un grand nombre de polluants comme les

polychlorobiphényles, les hydrocarbures aromatiques polycycliques, les pesticides

s’accumulent. Leur attaque par les bactéries est parfois difficile en raison de leur adsorption

sur les particules sédimentaires. Des détergents (produits permettant d’éliminer d’un milieu

solide les particules étrangères qui y adhèrent par leur mise en suspension ou en solution)

d’origine microbienne, les bio surfactants peuvent permettre leur désorption et faciliter leur

attaque par les bactéries. Les chercheurs travaillant sur les microorganismes qui utilisent des

hydrocarbures comme seule source de carbone pour leur croissance, ont observé que ces

microorganismes libèrent leurs propres agents surfactants dans le milieu. En facilitant la

désorption des nutriments dans la matrice du sol ou leur dispersion dans l’eau, ces

biosurfactants rendent les souches microbiennes qui les sécrètent plus compétitives.

Au cours de ces dernières années, la recherche sur les biosurfactants a fortement

augmenté sous l’effet des progrès de la biotechnologie. Aussi efficaces que leurs homologues

chimiques, les biosurfactants présentent l’avantage d’être biodégradables et non toxiques. De

plus certains qui sont sécrétés par des organismes extrêmophiles (et sont donc très efficaces),

restent fonctionnel malgré les conditions sévères de température, de salinité et de pH. De

nombreux microorganismes producteurs de biosurfactants ont été déjà isolés et il est devenu

maintenant possible de produire par voie biologique une grande variété de biosurfactants dont

la nature chimique et les propriétés dépendent des paramètres physiques de l’environnement

(pH, température, salinité) et de la composition du milieu nutritif (N, P, K, Fe et Mn). Les

conditions qui existent dans le futur milieu d’utilisation du biosurfactant déterminent

d’ailleurs en grande partie le choix d’une souche pour une application donnée. Etant donné

leur diversité chimique et fonctionnelle, les biosurfactants trouveront probablement des

applications aussi variées que leurs homologues de synthèse (Zimmerman et al., 2004).


40

5.3. Mécanisme d’accession des microorganismes aux composés organiques

hydrophobes

Certains microorganismes utilisent les hydrocarbures comme source de carbone pour

leur croissance. De ce fait, ils se sont adaptés en termes de résistance et d’équipement

enzymatique pour utiliser ce type de substrat. Les hydrocarbures sont des composés

hydrophobes dont la solubilité diminue à mesure que la masse moléculaire des composés

augmente. Pour les hydrocarbures dont la solubilité est faible (< 0,1 g/l), les microorganismes

ont développé des stratégies pour venir au contact du substrat. Quatre modes d'accession,

illustrés dans la (Figure 9) ont été avancés pour expliquer l'assimilation des hydrocarbures

par les microorganismes (Bouchez-Naitali et al., 1999).

L’assimilation des hydrocarbures solubles, l’assimilation en phase aqueuse a surtout été

rapportée pour les hydrocarbures aromatiques suffisamment solubles et les alcanes légers

(Bouchez et al., 1995; Goswami et Singh, 1991). C'est sous forme solubilisée que le substrat

pénètre dans la cellule.

L'accession interfaciale, les micro-organismes utilisant les alcanes peu solubles possèdent

fréquemment une membrane externe hydrophobe (Rosenberg, 1986).

L'hydrophobicité élevée de cette enveloppe permet l'adhésion du microorganisme aux

gouttelettes de substrat présentes dans le milieu aqueux, souvent de taille très supérieure à

celle des bactéries. Le substrat pénètre directement dans la cellule par diffusion ou transport

actif sans dissolution préalable dans la phase aqueuse. L'hydrophobicité des microorganismes

concernés entraîne souvent une forte tendance à l'agrégation.

L'accession interfaciale facilitée (émulsification), dans ce cas, l'intervention de

biosurfactants produits par les microorganismes accélère le transfert des hydrocarbures en

augmentant l'aire interfaciale entre les phases hydrophobe et hydrophile. On parle de transfert

interfacial assisté. L'action des biosurfactants est souvent complexe.

Ils participent à la pseudo solubilisation des alcanes nécessaires à la croissance tout en restant

associés aux cellules bactériennes pendant la croissance, puis sont libérés massivement

lorsque le microorganisme a cessé toute croissance (Singer et Finnerty, 1984).

Le transfert micellaire, différents auteurs ont montré que la solubilité apparente des n-

alcanes était très largement supérieure à celle mesurée dans l'eau dans les cultures de levures

sur n-alcanes (Roy et al., 2003) ou sur HAP (Kim et al., 2001).

Cette augmentation de la solubilité apparente est liée à la formation d'une microémulsion

résultant de la pseudo solubilisation des hydrocarbures par des biosurfactants produits par le

microorganisme. Les micelles ainsi formées, de taille très inférieure aux bactéries, entrent en

contact avec la cellule. Le mécanisme de transfert à travers l'enveloppe cellulaire n'est en

réalité pas connu. Une protéine de transport membranaire AlkL a été cependant mise en

évidence (van Beilen et al., 1992b). Hommel, 1994 a formulé une hypothèse sur l'existence

des pores hydrophobes au niveau de l'enveloppe bactérienne. Il faut noter que la surface

externe d'une micelle est majoritairement hydrophile et le transfert micellaire apparaît

privilégié chez les microorganismes dont l'hydrophobicité de l'enveloppe micellaire est faible

(Bouchez-Naitali et al., 1999). Les interactions hydrophobes entre substrat et cellule

microbienne sont d'ailleurs complexes car les biosurfactants produits sont susceptibles

d'affecter l'hydrophobicité cellulaire. En effet, le rôle physiologique des biosurfactants est

multiple.


41

Ils interviennent dans la formation de microcolonies, ils facilitent l’association en surface des

bactéries et de part ce fait la formation d’agrégats, ils assurent la formation d’une structure de

type filamenteuse et jouent un rôle dans la dispersion des biofilms (Pamp et Tolker-Nielsen,

2007).

Figure 9: Les mécanismes d’accession des microorganismes aux hydrocarbures

(Vandecasteele, 2005)

4.6. Acquisition des HAPs par les bactéries

Les HAPs à l’état solide, sous forme de cristaux, ne semblent pas disponibles pour

être utilisés comme source de carbone et d’énergie par les bactéries (Volkering et al., 1992).

Seuls les HAPs dissous dans la phase aqueuse sont capables de pénétrer à l’intérieur de la

cellule pour être catalysés par des enzymes intracellulaires. Ainsi la croissance des bactéries

dégradantes ne dépend pas de la quantité de naphtalène ou de phénanthrène solide présent

dans le milieu de culture mais de la quantité dissoute dans la solution aqueuse (Wodzinski et

Coyle, 1974). Néanmoins, la surface spécifique des composés aromatiques joue un rôle

important dans la dissolution spontanée, ce qui favorise à terme la minéralisation des HAPs

par les bactéries (Thomas et al., 1986). L’utilisation d’un microscope électronique à

balayage montre de petits cratères laissés par les bactéries à la surface des cristaux

d’anthracène (Wick et al., 2002).

Lorsque la quantité d’anthracène solide dans le milieu de culture est faible, Mycobacterium

sp. est capable de développer un biofilm à la surface, ce qui optimise sa dissolution. La

distance entre les bactéries et les cristaux est inférieure à 1 µm. Une fine couche d‘eau reste

dans l’espace intermédiaire dans laquelle la concentration d’équilibre de l’anthracène est

atteinte (45-62 µg.L-1). La surface de la bactérie présente une forte affinité pour le composé

organique, ce qui diminue localement la concentration du polluant par rapport à la

concentration dans le milieu, et favorise le taux de transfert de l’anthracène vers la bactérie

pour entraîner à nouveau la dissolution de l’anthracène (Wick et al., 2002). Le mécanisme de

prélèvement des HAPs par les bactéries semble un processus de diffusion passif lié à la nature

lipidique de la membrane cytoplasmique (Hori et al., 2009).

Solubilisation de

l’hydrocarbure dans

la phase aqueuse

Transfert interfacial

direct

Transfert interfacial

Facilité (Hydrocarbure

émulsionné)

Transfert micellaire

(micelles < 50 nm)

Bactéries


42

L’inhibition des protéines membranaires ne modifie pas le prélèvement de phénanthrène par

Pseudomonas fluorescens (Bugg et al., 2000). Les protéines de transport de la membrane

externe et les protéines plasmiques ne semblent pas avoir de rôle dans le prélèvement des

HAPs. À l'inverse, il semble qu'elles permettent l’efflux actif en dehors de la cellule des

polluants dont le phénanthrène et le fluoranthène (Bugg et al., 2000). Les propriétés de

surface de l’enveloppe bactérienne, dont le caractère hydrophobe, sont affectées par plusieurs

paramètres liés à l’environnement de la cellule.

L’augmentation de la température de 28°C à 37°C de Pseudomonas sp. TIS1-127 entraîne une

variation de l’hydrophobicité, ce qui implique une diminution de l’acquisition du toluène

(Hori et al., 2009). La nature du substrat de croissance peut aussi affecter les propriétés de

surface de Mycobacterium sp. (Wick et al., 2002). Lorsque le substrat est le glucose, la

surface des cellules est plus hydrophile et moins électronégativement chargée que dans le cas

où les bactéries ont poussé sur l’anthracène, lesquelles adhèrent mieux sur les surfaces

hydrophobes.

5.4. Adaptation des micro-organismes aux sites pollués

Dans les sites pollués aux hydrocarbures depuis longtemps, il a été mis en évidence

que les micro-organismes présentent la capacité de s'adapter à la présence des polluants, leur

sensibilité vis à vis des composés organiques peut ainsi être diminuée de plusieurs ordres de

grandeur (Klimkowicz et Maliszewska, 2003). De même la dégradation des hydrocarbures

pétroliers dans un sol ayant déjà été exposé à ces molécules est plus rapide que dans un sol

non précédemment exposé (Barriuso et al., 1996 ; Barriuso et al., 2000). Ainsi dans un sol

n'ayant jamais contenu de HAPs par exemple, leur minéralisation est inférieure à 5% alors

qu'elle atteint 60% de la quantité de HAPs ajoutée au bout de 9 semaines dans un sol pré-

exposé (Carmichael et al., 1997). Il semble également que la quantité de HAPs qui doit être

présent dans le sol pour maintenir ou activer une capacité de biodégradation n'a pas besoin

d'être très importante. Johnsen et Karlson (2005) ont en effet montré que " le bruit de fond "

de la contamination en HAPs des sols danois (0,1 mg kg-1) était suffisant pour observer la

minéralisation du pyrène alors que celle-ci reste inexistante dans des sols de forêts. Ainsi

l'historique de pollution d'un sol est un paramètre à prendre en compte lors de l'étude de la

capacité de biodégradation de sa microflore.

5.5. Adaptation génétique des bactéries

Les microorganismes d’un sol non exposé à des composés contaminants ne possèdent

pas forcément la capacité de les métaboliser. Cependant, lorsqu’ils sont exposés à de tels

composés, ils sont souvent capables de s’adapter, c'est-à-dire d’acquérir le potentiel

métabolique de dégradation de ces polluants par recrutement vertical ou horizontal de gènes

spécifiques (George et Hay, 2011).

Le recrutement des voies métaboliques, présentes dans le génome mais non exprimées, peut

se faire par des évènements de mutation ponctuelle, de réarrangement génétique ou de

transposition (recrutement vertical) (Habe et Omori, 2003). Les microorganismes peuvent

aussi acquérir des clusters de gènes cataboliques via des éléments mobiles transférés d’un

hôte donneur à un hôte receveur (transfert horizontal).


43

Chez les bactéries, les phénomènes de transferts les plus connus sont la conjugaison via des

plasmides, la transformation ou la transduction (Juhas et al., 2009). Ces phénomènes de

transferts horizontaux augmentent les capacités métaboliques des bactéries, notamment en

élargissant leur gamme de substrats, et permettent l’adaptation des populations microbiennes

à de nouveaux contaminants (van der Meer et al., 1992; van der Meer et Sentchilo, 2003).

5.6. Biodétection de la pollution par les hydrocarbures

Il paraît nécessaire de donner quelques définitions concernant la notion de

bioindication qui, avec l’avancement des travaux de recherche, se diversifie et recouvre en

réalité plusieurs concepts.

Rhee et ses collaborateurs (2002) considèrent le terme de bio-indicateur comme « un simple

relais ne faisant référence qu’à des effets observables au niveau de l’individu se traduisant par

des altérations morphologiques, tissulaires ou physiologiques (croissance et reproduction) ».

Les auteurs prennent ainsi la réaction au niveau individuel. Lorsque la réaction se situe au

niveau populationnel et/ou communautaire (disparition ou apparition d’espèces, variation

densitaire), on utilisera le terme de bio-intégrateur.

Un troisième concept relève également des processus biologiques mais se situe au niveau

infra-individuel : altérations moléculaires, biochimiques, cellulaires ou physiologiques non

visibles à l’oeil. Il s’agit de la notion de bio-marqueur dont on peut donner la définition de

Mendum et al (1998): « Un bio-marqueur est un changement observable et/ou mesurable au

niveau moléculaire, biochimique, cellulaire, physiologique, qui révèle l’exposition présente

ou passée d’un individu à au moins une substance chimique à caractère polluant». Plusieurs

auteurs ont étudié la répartition des dégradeurs des HAPs dans l'environnement (Kastner et

al.1998 ; Bakker et al., 2000; Besombes et al., 2001) . La plupart de ces études ont trait aux

bactéries des sols.

La diversité microbienne contribue au fonctionnement des sols et peut être utilisée comme un

indicateur biologique de la qualité des sols et de leur fertilité. Les bactéries hétérotrophes

participent directement ou indirectement à l’altération des matières organiques dans le sol

(Kastner et al., 1994).

La capacité de dégrader les hydrocarbures est distribuée parmi de nombreux genres

bactériens appartenant aux Protéobacteries et aux bactéries Gram positives. Les souches

isolées sont généralement mésophiles et sont le plus souvent isolées à partir du sol. La gamme

de substrats utilisée par une souche peut être restreinte à un ou deux hydrocarbures ou

s'étendre à cinq et plus. Elle peut être liée à la présence chez la même souche d'une ou de

plusieurs voies cataboliques mais ne peut pas être clairement assignée à des genres bactériens

particuliers (Vandecasteele, 2005).

Les études de la microflore des sols pollués par les hydrocarbures ont mis en évidence

plusieurs points relatifs à l'activité des bactéries aérobie. Ces études ont notamment souligné

l'intérêt physiologique et écologique de la croissance microbienne, la grande diversité de la

microflore et leur adaptation aux conditions du milieu. La prédominance des souches à

croissance rapide du genre telles Pseudomonas et Bacillus a fréquemment été observée

(Daane et al., 2001). Andreoni et Gianfreda (2007) ont étudié la distribution des

microorganismes dégradeurs d'hydrocarbures dans différents habitats.


44

Des microorganismes ont été isolés dans des sédiments marins, des océans, des eaux côtières,

des étangs arctiques, des lacs et des estuaires. Cependant, ces microorganismes se retrouvent

en proportions variables dans la communauté microbienne totale. Smit et al. (2001) ont

montré que la composition de la microflore des sols est modifiée par la venue d'une pollution

par des carburants, avec un enrichissement en Beta-Protéobactéries et/ou Gama-

Protéobactéries.

Les résultats de Kiyohara et al. (1978) montrent que la plupart des bactéries utilisant les

HAPs ont été trouvées dans des environnements où une activité humaine non négligeable à

amené des contaminations par HAPs. Les auteurs, notent également la rareté des souches

dégradant l'anthracène et le kérosène ainsi que l'ubiquite remarquable des souches dégradant

le phénanthrène. Il n'est pas exclu que cette études complaise aussi certains cas de dégradation

des HAPs par cométabolisme. Si les bactéries capables de dégrader le naphtalène sont

observées dans tous les sols en quantité non négligeables, c'est –à- dire supérieures à 104

UFC/g, les bactéries dégradant les HAPs à trois ou quatre cycles ne sont au contraire

présentes en quantités importantes (de 103à 10

6 UFC g

-1 de sol) que dans les sols contaminés

par les HAPs.

5.7. Facteurs affectant la biodégradation des hydrocarbures dans l’environnment

Les travaux de recherche sur l’oxydation des hydrocarbures par les

microorganismes ont montré que ce processus dépend de la structure chimique des

hydrocarbures et des conditions environnementales (Leahy et Colwelli, 1990). Les facteurs

physico-chimiques influant sur la vitesse de biodégradation microbienne sont :

a- Structure et nature du milieu récepteur

Les bioprocédés s’appliquent à une grande variété de sol. Pour cela, il est

important de connaitre la structure et la nature du sol à traiter (Lecomte, 1995). La taille des

pores et les propriétés de l’eau et de l’air dans ces pores sont des facteurs spécifiques de

chaque sol (Girard et al., 2005). Les particules élémentaires du sol sont généralement liées

entre elles par les forces électrostatiques formant des agrégats plus au moins volumineuses

groupés en unités structurales du sol. En effet, les agrégats tendent à diminuer l’activité

microbienne dans le sol de manière indirect. Par un ralentissement de la diffusion de

l’oxygène et l’apport des nutriments à l’intérieur de l’unité structurale et par la protection

mécanique des substrats qu’elle renferme (Girard et al., 2005).

b- Nature du polluant - Composition chimique des hydrocarbures

Les composés pétroliers différents par leur susceptibilité à l’attaque microbienne.

Ainsi, la vitesse de biodégradation est plus élevée pour les hydrocarbures saturés, viennent

ensuite les hydrocarbures aromatiques légers, les hydrocarbures aromatiques à haut poids

moléculaire et les composés polaires ayant la vitesse de dégradation la plus faible (Soltani,

2004).

La biodégradabilité des pétroles bruts est très fortement dépendante de leur composition ; à

une température déterminée, un pétrole léger est plus susceptible d’être biodégradé qu’un

pétrole lourd (Soltani, 2004). En général, ils sont classées selon leur sensibilité aux attaques

microbiennes de la manière suivante : n-alcanes > alcanes ramifiés > aromatiques à faible

poids moléculaire > alcanes cycliques > aromatiques à haut poids moléculaire > stéranes-

hopanes (Van Hamme et al., 2003).


45

c- Facteurs microbiologiques

Les hydrocarbures à faible poids moléculaire sont considérés comme des composés

toxiques pour les microorganismes à cause de leur grande solubilité et par conséquent leur

concentration très élevée dans les phases aqueuses (Zhang et al., 2009). L’action toxique du

polluant peut provoquer un ralentissement de l’activité de la microflore du sol (Vogel et

Ballerni, 2001).

Dans un habitat bien défini, il est reconnu que les différentes communautés microbiennes

autochtones ont eu la possibilité de développer des interactions :

· Positives : le concept de commensalisme implique l’action normale d’une population qui

modifie l’environnement de telle façon que ces modifications permettent le développement

d’une espèce.

· Négatives : parmi ces interactions, le phénomène dénommé amensalisme ou «antagonisme»

qui implique la production par une espèce donnée de métabolites inhibiteurs pour d’autre

population qui ne pourront ainsi venir coloniser l’habitat (Vogel et Ballerni, 2001).

d- Facteurs environnementaux

1. Influence de la température

La température est un paramètre pouvant influencer la biodégradation du pétrole en

modifiant son état physique, sa composition chimique, l’activité physiologique des

microorganismes et par conséquent la vitesse de dégradation des hydrocarbures, ainsi que la

nature et la concentration des espèces microbiennes présentes (Leahy et Colwell, 1990). Une

diminution de la température est généralement accompagnée par une diminution de la vitesse

de biodégradation qui peut être expliquée par une décroissance de l’activité enzymatique. Des

températures plus élevées ont pour effet d’augmenter la vitesse de biodégradation (Sikkema et

al., 1995 ). Le maximum de l’activité métabolique des microorganismes est généralement

observé à une température comprise entre 30 et 40 °C. Au delà de la température optimale de

croissance et de biodégradation on assiste à une augmentation de la toxicité des hydrocarbures

et une diminution de l’activité métabolique. Roling et al., (2004) mentionnent une inhibition

totale de la biodégradation au-delà de 80-90°C après l’isolement des bactéries thermophiles.

2. Influence de l’oxygène

L’étape initiale du catabolisme des hydrocarbures par les bactéries et les champignons

inclus l’oxydation de ces substrats par l’intermédiaire d’hydroxylases et d’oxygénases, pour

lesquelles l’oxygène moléculaire est indispensable. Les conditions aérobies sont, nécessaires

pour cette voie d’oxydation microbienne des hydrocarbures dans l’environnement (Leahy et

Colwell, 1990).

La concentration en oxygène a été identifiée comme une variable limitante de la vitesse de la

biodégradation du pétrole dans les sols, Marin et al. (2001), ont constaté une augmentation de

la dégradation des hydrocarbures totaux de 10 % par la bactérie Acinetobactercalcoaceticus,

après un apport supplémentaire d’oxygène par agitation. Théoriquement, 3,5 g d’oxygène sont

nécessaires pour l’oxydation complète de 1 g de pétrole (Soltani, 2004).

3. Influence des éléments nutritifs

Le rejet des hydrocarbures dans les environnements qui contiennent des éléments

nutritifs inorganiques en faibles concentrations, conduit généralement à des rapports

carbone/azote et carbone/phosphore très élevés, défavorables pour la croissance microbienne

(Leahy et Colwell, 1990).


46

Le pétrole lui-même contient de tels nutriments en petites quantités, mais ils sont toujours

présents sous forme de composés hétérocycliques (exemple: dérivés de la pyridine et du

pyrrole pour l’azote) ou organométalliques complexes; ils ne sont donc pas utilisables par les

microorganismes. L’azote et le phosphore sont donc des facteurs limitant la biodégradation

des hydrocarbures dans les sols (Bertrand et Mille, 1989).

4. Effet de la salinité

Les fortes salinités constituent une barrière naturelle pour la biodégradation des

hydrocarbures. Des chercheurs ont trouvé que la biodégradation des hydrocarbures est

maximale pour une concentration en sel de 0,4 M et diminue lentement pour des valeurs

supérieures et inférieures à celle-ci (Soltani, 2004).

Thiele-Bruhn et Brummer, 2004 ont montré que la vitesse de la biodégradation des

hydrocarbures décroit lorsque la salinité passe de 3,3 à 28,4%, et ils ont attribué ces résultats à

une réduction générale des vitesses métaboliques des microorganismes.

5. Effet du pH

Les biotopes naturels peuvent avoir des valeurs de pH très variables, allant de 2,5 à

11,0. Des valeurs extrêmes de pH pourraient avoir une influence négative sur la capacité des

microorganismes à dégrader les hydrocarbures. La croissance des bactéries hétérotrophes et

des champignons étant favorisée par un pH proche de la neutralité (Leahy et Colwell, 1990).

Liebeg et Cutright, 1999 et Straube et al., 2003 ont trouvé que la dégradation des

hydrocarbures est plus élevée dans des conditions légèrement basiques.

6. Effet de l’humidité

L’humidité est un paramètre important dans le processus de la biodégradation car l’eau

est un élément indispensable au développement des bactéries. Les bactéries sont influencées

par la concentration osmotique et la disponibilité en eau dans le sol, pour cella, Gabet (2004)

a signalé que pour une meilleure activité de biodégradation, l’humidité doit être de 25 à 90%.

5.8. Facteurs biologiques favorisant l’accessibilité et la dégradation des

hydrocarbures

De nombreux mécanismes ont été développés par les microorganismes pour détecter,

importer et dégrader les hydrocarbures. Dans la plupart des cas, les enzymes de dégradation

des hydrocarbures sont localisées à l’intérieur de la cellule et par conséquent les

hydrocarbures doivent être importés dans la cellule pour être dégradés. Plusieurs modes de

transport des hydrocarbures ont pu être identifiés chez les bactéries : la diffusion passive au

travers de la bicouche lipidique de la membrane ou au travers de pores non spécifiques

(Pinkart et White, 1997 ; Sikkema et al;, 1995 ; Tsitko et al., 1999) ; le transport actif par

système de pompe à efflux permettant la concentration du composé dans la cellule

(Kallimanis et al., 2007). C’est le cas de certains composés aromatiques comme le

naphthalène chez Pseudomonas fluorescens (Rojas et al., 2001). D’autres systèmes actifs de

pompe à efflux permettent la résistance aux composés par leur élimination de la cellule

(Duque et al., 2001).

D’autres comportements favorisant l’incorporation des hydrocarbures ont pu être observés

chez les bactéries :


47

- Certains microorganismes sont capables de détecter la présence des hydrocarbures par

chimiotactisme et de se diriger dans un gradient de concentration (Pandey et Jain, 2002), ces

mécanismes interviennent via des chimiorécepteurs et des voies de signalisation, et

provoquent un déplacement des bactéries selon le gradient de concentration du polluant. Les

bactéries s’accumulent alors à l’interface entre le polluant hydrophobe et le milieu hydrophile,

provoquant une augmentation du taux de dégradation des composés et souvent une

augmentation de leur désorption (Law et Aitken, 2003).

- Certains microorganismes sont capables de s’adsorber aux particules riches en polluants

grâce à leur paroi hydrophobe (Miyata et al., 2004) et de former des biofilms (Johnsen et al.,

2005). D’autres microorganismes produisent des surfactants. Ces molécules ont la propriété

d’augmenter la solubilité des composés hydrophobes et d’en améliorer l’accessibilité (Zheng

et Obbard, 2002).

- Aussi, l’excrétion d’enzymes à la surface de l’organisme a pu être observée afin de favoriser

le transport des hydrocarbures (Walzer et al., 2008).

- Dans le cas des HAPs très récalcitrants à la biodégradation comme le benzo[a]pyrène, des

processus coopératifs peuvent se mettre en place : les champignons, connus pour leur capacité

à dégrader les HAPs de haut poids moléculaire (Cerniglia, 1992), amorcent la dégradation.

Les bactéries utilisent ensuite les produits de dégradation plus hydrophiles et plus réactifs

comme sources de carbone (Boonchan et al., 2000).

6. BIODEGRADATION DU PETROLE BRUT

La spécificité des substrats à l’attque microbienne a été largement étudiée. Atlas 1981

et Leahy et Colwell (1990), ont classé les composés du pétrole en quatre familles. Ces

composés différents par leur susceptiblité à l’attaque microbienne. Ainsi la vitesse de

biodégradation est plus élevée pour les saturés, viennet ensuite les aromatiques légers, les

aromaiques à haut poids moléculaire, les composés polaires ayant la vitesse de dégradation la

plus faible.

Les hydrocarbures saturés incluent les n-alcanes, les alcanes ramifiés et les

cycloalcanes. Les alcanes à chaines linéaires sont les plus abondants des hydocarbures totaux

dans le cas du pétrole leger et peuvent atteindre dans certains cas 60%, les plus rapidement

dégradable tels les n-alcanes à nombre de carbone supérieur à 44 peuvent etre métabolisés par

les microorganismes et ceux ayant de 10 à 24 atomes de carone (C10-C24) sont généralement

les plus facilement dégradables. Les alcanes ramifiés sont plus récalcitrants à la

biodégradation que les n-alcanes et plus le nombre de ramification augmente, moins ces

composés sont susceptibles à la biodégradation microbienne. Les hydrocarbures cycliques

constituent une fraction importante des hydrocarbures dans la plupart des bruts pétroliers, ils

sont difficilement dégradables que les deux séries précédentes à cause de leur toxicité suite à

l’intéraction avec la membrane cellulaire des microorganismes (Sikkema et al., 1995).

Les expériences montrent de façon équivoque que la biodégradation des cycloalcanes

est très limitée (atlas 1981). La non accumulation des hydrocarbures cycliques dans

l’environnement implique des phénomènes non conventionnels de dégradation tel que

l’intervention des phénomènes de co-oxydation impliquant plusieurs souches microbiennes

dont l’équipement enzymatique est complémentaire (Bertrand et al., 1989, Rotani et al.,

1992).


48

Des études sur la transformation des HAPs par les microrganismes ont montrés leur

toxicité cellulaire (Sikkema et al., 1995). Les HAPs de faible poids moléculaires constituent

généralement 2 à 20% des hydrocarbures des pétroles légers et moins de 2% des

hydrocarbures des pétroles lourds tels les alkyl-benzènes légers qui sont les plus toxiques à

cause de leur solubilité dans l’eau, mais peuvent cependant être métabolisés par les

microorganismes quand ils sont présents en faibles concentrations.

La structure moléculaire des HAPs détermine la vitesse de leur dégradation, un grand

nombre de méthyle empêche l’oxydation initiale, les polyaromatiques sont moins toxiques

pour les microoorganismes, mais ils sont rarement métabolisés et quand ils le sont leur

biodégradation est lente, c’est ce qui explique leur accumulation dans l’environnement. Ces

hydrocarbures aromatiques lourds constituent 2 à 10% des hydrocarbures des pétroles léger et

plus de 35% des hydrocarbures des pétroles lourds.

Les asphaltènes et les résines constituent une fraction faible du pétrole brut, 1 à 5 % du

pétrole légers alors qu’un pétrole lourd peut contenir plus de 25% d’asphaltènes et 20 % de

résines. Cette dernière classe de composés pétroliers n’est pas biodégradable ou très

lentement dégradable.

La biodégradabilité des pétroles bruts est très fortement dépendante de leur

composition (Atlas, 1981), à une température déterminée, un pétrole léger est plus susceptible

d’étre biodégradé qu’un pétrole lourd. Par exemple, un brut à très faible teneur en soufre et

très riche en composész saturés (exemple : Louisiane du Sud) (Tableau 8) sera facilement

biodégradé, contrairement à un fuel de type Bunker C à très haute teneur en soufre et

composés aromatiques. Les n-alcanes contenus dans un pétrole provenant du Vénézuéla sont

moins bien dégradés que ceux présents dans un pétrole de type Léger d’Arabie (Bertrand et

Mille, 1989). Les caractéristiques du brut algérien sont representés dans le Tableau 9.

Tableau 8: Proportions des différents familles de composés dans divers bruts pétroliers

(Bertrand et Mille, 1989)

Bruts pétroliers Saturés Aromatiques Polaires (Résines) Asphaltènes

Louisiane du Sud 69 20 10.3 0.3

Koweit 44 28.3 23.2 4.5

Buncker C 21.1 34.2 30.3 14.4

Léger d’Arabie 48 35 9 7.5

Tunisien (Asthar) 48 32 12 8

Vénézulien 46 21.6 19.3 9

Prudho Bay 55 25 10 10


49

Tableau 9: Qualité moyenne du brut Algérien (Naftec Spa, 2007)

Caractéristiques du pétrole

Densité 0.8025

TVR (bar) 0.650

Soufre (ppm) 850

TVR : Tension de vapeur

Bertrand 1989, a rassemblé des règles qui ont des applications générales à l’ensemble des

micoorganismes :

1- Les hydrocarbures aliphatiques sont assimilés par une grande variété de microorganismes,

les composés aromatiques peuvent être oxydé mais sont assimilés par quelque bactéries

seulement.

2- Les n-alcanes à chaines courtes tels que n-nonane ne sont pas toujours assimilés mais

peuvent être oxydé, seuls quelques bactéries ont la capacité de croitre sur des alcanes plus

court que le n-octane. Quand la longueur des chaines augmente au delà de C9, le facteur de

production augmente, mais la vitesse d’oxydation décroit.

3- Les composés saturés sont plus rapidement dégradés que les insaturés.

4- Les composés ramifiés sont moins rapidement degradés que les composés non substitués.

7. BIODEGRADATION PAR TYPE D’HYDROCARBURE

En aérobiose, de nombreuses bactéries ont développé des stratégies enzymatiques qui

leur permettent d’incorporer un ou deux atomes d’oxygène à la molécule cible. Cette réaction

d’oxydation rend l’hydrocarbure plus hydrophile et par conséquent plus facilement

dégradable par le métabolisme bactérien. Les réactions impliquées dans ces processus font le

plus souvent appel à l’action d’oxygénases (mono- ou dioxygénase). L’acquisition par les

organismes des gènes de dégradation des hydrocarbures se fait le plus souvent par transfert

horizontal via des plasmides, des transposons (Phale et al., 2007).

7.1. Biodégradation des hydrocarbures saturés

7.1.1. Voies de dégradation des alcanes linéaires

La dégradation aérobie des alcanes est amorcée par l’introduction d’un atome

d’oxygène sur la chaîne aliphatique via l’action d’une monooxygénase pour former un alcool

linéaire (Figure 10). Cette réaction peut être réalisée par des cytochromes P450 (Sariaslani et

Omer, 1992), des méthanes monooxygénases et des systèmes d’hydroxylases à fer non

hémique appelés « alcane hydroxylase » qui semblent être les plus répandus dans la

dégradation des alcanes (Van Beilen et al., 2001).


50

Figure 10: Voie métabolique de dégradation des n-alcanes (van Beilen et al., 2003)

L’étude du système d’alcane hydroxylase de Pseudomonas putida a permis de mettre en

évidence une large spécificité de l’enzyme, celle-ci permettant l’oxydation d’n-alcanes,

d’alkylbenzènes et de cycloalcanes (Van Ravenswaay et van Linden, 1971).

Cette oxydation peut être monoterminale, biterminale ou subterminale, et nécessite de

l’énergie qui est le plus souvent fourni par l’oxydation d’un composé intermédiaire réduit tel

NADH (Figure 11). L’alcool obtenu est ensuite converti après plusieurs réactions en un acide

gras qui pourra être introduit dans les cycles de la β -oxydation et/ou des acides

tricarboxyliques. Les intermédiaires produits servent à d’autres réactions métaboliques, à la

constitution de biomasse cellulaire, de réserves lipidiques (inclusions) et peuvent également

être totalement minéralisés en CO2.

R-CH3 : alcane ; R-CH2OH : alcool primaire.

Figure 11: Système de l’alcane hydroxylase à fer non hémique chez Pseudomonas putida

Gpo1 (chaîne de transfert d’électrons) Van Beilen et al., 2001

Oxydation terminale Oxydation subterminale

Oxydation diterminale


51

La dégradation des alcanes a été mise en évidence chez de nombreux micro-

organismes (Singer et Finnerty, 1984; Watkinson et Morgan, 1990). Une spécialisation des

micro-organismes en fonction de la longueur de la chaîne a pu ainsi être mise en évidence. La

biodégradation des alcanes à chaîne moyenne (nC5-nC10) est de loin la plus étudiée. Ceux-ci

peuvent être dégradés par des bactéries du genre Pseudomonas (Whyte et al., 1997). Les

alcanes à longues chaînes (nC10- nC20) sont également dégradés par différents genres

bactériens tels qu’Acinetobacter (Lai et Khanna, 1996) ou encore Rhodococcus (Whyte et al.,

1998). La biodégradation des alcanes à très longues chaînes (> nC20) est plus difficile.

Cependant, une souche psychrotrophe, Rhodococcus sp. Q15, capable de minéraliser

l’octacosane (nC28) et le dotriacontane (nC32) a pu être isolée (Whyte et al., 1998).

Le système d’oxydation des alcanes de Pseudomonas putida Gpo1 est codé par

l’opéron alkBFGHJKL et le locus alkST situés sur deux régions du grand plasmide OCT (Van

Beilen et al., 2001) (Figure 12). L’opéron alkBFGHJKL code pour l’alcane hydroxylase

(AlkB), deux rubrédoxines (AlkF et AlkG), une aldéhyde déshydrogénase (AlkH), une alcool

déshydrogénase (AlkJ), une acétyl-CoA synthase (AlkK) et une protéine de la membrane

externe qui jouerait un rôle dans le transport du substrat (AlkL). Le locus alkST code pour une

protéine de régulation (AlkS) qui active l’expression des deux opérons, et une rubrédoxine

réductase (AlkT). AlkN interviendrait dans le chimiotactisme pour atteindre le substrat. Chez

le genre Acinetobater, les gènes ne sont pas regroupés en opéron et ne sont pas portés par un

plasmide. Aussi, la protéine AlkR (homologue de AlkS) est nécessaire pour activer AlkM

(homologue de AlkB).

Récemment, des enzymes apparentées aux système alcane hydroxylase de Pseudomonas

putida ont été clonées à partir de différentes souches appartenant à des genres différents

(Smits et al., 1999). Le système enzymatique chez P. putida semble dégrader les n-alcanes C5

à C12 (van Beilen et al., 1994) alors que la plupart des autres systèmes homologues isolés

dégradent généralement les alcanes ayant plus de 10 atomes de carbone (Smits et al., 2002).

Les bactéries capables de dégrader les alcanes sont largement répandus dans l’environnement,

mais leur étude reste difficile car les gènes responsables de la dégradation sont très

diversifiés. Les différents gènes du système alkB isolés aujourd’hui sont notamment très peu

conservés, ce qui rend leur étude plus difficile (van Beilen et al., 2003).


52

FAD : flavo adénine dinucléotide ; NADH : nicotinamide adénine dinucléotide ; ATP : adénine tri-phosphate ;

CoA : coenzymeA ; Cycle TCA : cycle des acides tri-carboxyliques

Figure 12: Voie de dégradation des alcanes chez Pseudomonas putida Gpo1, rôle et

localisation cellulaire des protéines Alk et de leur système de régulation

(Van Beilen et al., 2001)

7.1.2. Voies de dégradation des alcanes branchés

Les alcanes branchés contenant un ou deux groupements méthyles sur leurs chaînes

principales sont complètement métabolisés en CO2. Leurs voies de dégradation semblent

similaires à celles intervenant lors de la dégradation des alcanes linéaires (Thijsse et Van der

Linden, 1961). En général, plus les groupements méthyles sont éloignés sur la chaîne, plus la

biodégradation est facile (Pirnik, 1977). Les molécules présentant des carbones tertiaires sont

dégradées plus lentement. Les composés les plus récalcitrants sont ceux qui comportent un

carbone quaternaire. Plus la chaîne carbonée est grande et/ou plus le carbone substitué est près

du centre de la chaîne principale et/ou plus le degré de substitution est élevé, plus la molécule

est difficilement biodégradable (Mc Kenna, 1972).

Les composés branchés sont en général plus résistants à la dégradation que leurs homologues

linéaires. D'autres raisons pour lesquelles le mécanisme d'oxydation peut contribuer à cette

résistance, sont : I) les cellules sont incapables de transférer les molécules branchées au travers

des membranes, II) le système enzymatique n'est pas capable d'oxyder ce type de molécule,

III) les alcanes branchés ne parviennent pas à induire le système enzymatique d'oxydation ou

enfin, IV) le substrat est toxique pour les cellules.


53

Le cas du pristane (2,6,10,14-tétraméthylpentadecane) est présenté sur la Figure 13. Des

produits d’oxydation monoterminale (Nakamiya et al., 1985), diterminale et subterminale

(Alvarez et al., 2001) de la dégradation du pristane ont été identifiés. La structure

régulièrement ramifiée du pristane a été considérée comme réfractaire pendant longtemps.

L’acide ou le diacide, après activation en acyl-CoA, est dégradé par Bêta-oxydation (Rontani

et al., 1986).

Les autres systèmes d’oxydation

Plusieurs systèmes enzymatiques peuvent être impliqués dans l’étape initiale d’oxydation des

alcanes. Les différentes classes d’enzymes impliquées dans la dégradation des n-alcanes sont

présentées dans le Tableau 10 (van Beilen et al., 2003).

Les alcanes à chaînes courtes sont la plupart du temps oxydés par des alcanes hydroxylases

solubles ou liées à la membrane et similaires aux méthane monooxygénases, comme c’est le

cas chez P. butanovora. Un système d’oxydation différent de l’alcane hydroxylase a

également été mis en évidence chez Acinetobacter sp. M1. L’enzyme impliquée est ici une

flavoprotéine nécessitant la présence de cuivre pour son activité. Elle est capable d’oxyder les

n-alcanes ayant de 10 à 30 atomes de carbone et les alkylbenzènes à longues chaînes latérales

(Maeng et al., 1996).


54

Figure 13: Voies métaboliques de dégradation du Pristane (2,6,10,14-

tétraméthylpentadécane) Fall et al. (1979)

Ox

yd

atio

n t

erm

inal

e

Ox

yd

atio

n s

ub

term

inal

e

Ox

yd

atio

n d

iter

min

ale


55

Tableau 10: Enzymes capables d’oxyder les alcanes (Van Beilen et Funhoff, 2005)

Classe d’enzyme

Composition et cofacteurs

Présents chez

Substrats

Classe I

P450 (CYP153)

P450 oxygénase : P450

Ferredoxine :[2Fe-2S]

Ferredoxine reductase :FAD, NADH

Sphingomonas sp.HXN-200

Mycobacterium sp.HXN-1500

Acinetobacter sp.EB104

C4-C16

Classe II

P450 (CYP52)

oxygénase: P450

Reductase: FAD, FMN, NADPH

Candida maltose, Candida tropicalis,

Yarrowia lipolytica

C10-C16

Classe II P450

(CYP2E,CYP4B)

oxygénase: P450

Réductase: FAD, FMN, NADPH

Les humains et les lapins

C6-C16

membrane

alkane hydroxylase

Membrane hydroxylase: à fer non

hémique

Rubredoxine: iron

Rubredoxin reductase: FAD, NADH

Acinetobacter, Alcanivorax,

Burkholderia, Mycobacterium,

Pseudomonas, Rhodococcus

C5-C16

Soluble méthane

monooxygenase

hydroxylase : à fer non hémique

Reductase: [2Fe-2S], FAD, NADH

Sous uité de régulation

Methylisinus trichosporium OB3B

Methylococcus capsulatus (Bath)

C1-C16

méthane

monooxygenase


Tous les méthanotrophes connus

C1-C5

Propane monooxygénase

Reductase: NADH

Regulatory subunit

Gordonia sp. TY-5

C3 and C13-C22

Butane monooxygénase


Réductase: [2Fe-2S], FAD, NADH

Sous uité de régulation

Pseudomonas butanovora

ATCC43655

C2-C8

P450cam

P450 oxygenase: P450

Putidaredoxine : [2Fe-2S]

Putidaredoxine réductase :FAD, NADH

Pseudomonas putida ATCC 29607

C3-C10

P450BM-3

polypeptide: FAD, FMN, NADPH

Bacillus megaterium ATCC 14581

C3-C8

Quelques bactéries dégradant les n-alcanes et les cyclo-alcanes disposent d’un système

nécessitant la présence d’un cytochrome P450. Ainsi, une souche d’Acinetobacter

calcoaceticus, dégradant les alcanes à chaînes longues, dispose d’un système enzymatique

comprenant un cytochrome P450 inductible (Kleber et al., 1985). La spécificité de substrat du

cytochrome semble variable selon les micro-organismes (Sariaslani, 1991; Sariaslani & Omer,

1992). Ainsi, le cytochrome P450 identifié chez Xanthomonas sp. est inductible par le

cyclohexane et catalyse l’oxydation de nombreux hydrocarbures (alkylcyclohexane, terpènes

cycliques). Le système enzymatique identifié chez Streptomyces griseus est quant à lui

capable de réaliser l’hydroxylation de composés aromatiques et alicycliques (Sariaslani &

Omer, 1992). Récemment, Maier et al. (2001) ont cloné et étudié le cytochrome P450

d’Acinetobacter sp. EB104, impliqué dans l’oxydation des n-alcanes.


56

7.2. Biodegradation oxydative des HAPs par les bactéries

Une grande variété de bactéries à Gram-positif et Gram-négatif ont été isolées et

caractérisées pour leur capacité à métaboliser les HAPs. Si la dégradation bactérienne des

HAPs à faible poids moléculaire tels que le naphtalène, le phénanthrène, ou encore

l’anthracène est clairement mise en évidence et présente des similarités importantes

(Cerniglia, 1992), les mécanismes intervenants dans celle des HAPs à cinq cycles aromatiques

ou plus tels que le Benzo[a]Pyrène restent encore à explorer.

Les HAPs peuvent être dégradés et minéralisés par un seul organisme ou par cométabolisme.

Les bactéries oxydent initialement les HAPs par l’incorporation de deux atomes d’oxygène

via l’action d’une dioxygénase entraînant ainsi l’oxydation d’un cycle aromatique

(Figure 14).

Entre parenthèses sont annotés les gènes codant pour les enzymes nécessaires à cette réaction d’oxydation.

Figure 14: Réaction d’oxydation initiale du naphtalène par la naphtalène dioxygénase

(NahAc) chez Pseudomonas NCIB 9816 (Habe et Omori, 2003).

L’étape initiale d’attaque des HAPs peut être réalisée via une monooxygénase, une

dioxygénase, ou par oxydation du groupement substitué par l’action de monooxygénase

(Gibson et Parales, 2000 ; Khan et al., 2001 ; Williams et Sayers, 1994). A l’issu de plusieurs

réactions biochimiques, l’attaque par une dioxygénase conduit à un cis-dihydrodiol

caractéristique de la dégradation bactérienne. Les produits sont par la suite minéralisés ou

incorporés en biomasse cellulaire (dépendant du nombre de cycles et de substitutions).

La dégradation du naphtalène par clivage intradiol est la mieux connue et constitue la

référence pour la dégradation des HAPs (Figure 15). L’étape initiale de la dégradation du

naphtalène, catalysée par la naphtalène dioxygénase (NahAc) implique l’incorporation de

deux atomes d’oxygène pour former le cis-1,2-naphtalène dihydrodiol. Les étapes

enzymatiques suivantes aboutissent à la formation de salicylate et sont spécifiques des

composés polyaromatiques (Eaton, 1994). Le salicylate évolue ensuite en catéchol ou en

gentisate, intermédiaires classiques de la dégradation des composés monoaromatiques.


57

Figure 15: Dégradation du naphtalène en salicylate par voie intradiol par des bactéries

aérobies du genre Pseudomonas (Vandecasteele, 2005)

Composés : naphtalène (1); cis-1,2-naphtalène dihydrodiol (2); 1,2-dihydroxynaphtalène (3);2-hydroxy-4-(2’-

oxo-3,5-cyclohexadiényl)-buta-2,4-diénoate (4) ; cis-o-hydroxybenzylidène pyruvate (5); 2-hydroxychromène-2-

carboxylate (6) ; trans-o-hydroxybenzylidène pyruvate (7) ; pyruvate (8) ; salicylaldéhyde (9) ; salycilate (10) ;

gentisate (11) et catéchol (12). Enzymes: naphtalène-1,2- dioxygénase (a); cis-1,2-naphtalène dihydrodiol

déshydrogénase NAD-dépendante (b);1,2- dihydroxynaphtalène dioxygénase (c) ; 2-hydroxy-4-(2’-oxo-3,5-

cyclohexadiényl)-buta-2,4-diénoate isomérase (d); spontané (e);2-hydroxychromène-2-carboxylate isomérase (f);

trans-ohydroxybenzylidène pyruvate hydratase-aldolase (g); salicylaldéhyde déshydrogénase NADdépendante

(h) ; voies métaboliques du gentisate (i) et du catéchol (j).

Le naphtalène est dégradé par de nombreux micro-organismes tels qu’Acinetobacter,

Alcaligenes, Mycobacterium, Pseudomonas, Corynebacterium, Comamonas (Cerniglia,

1992). Chez Pseudomonas, les gènes de dégradation sont souvent plasmidiques. Chez

Pseudomonas putida PpG7 et NCIB 9816, les gènes de dégradation du naphtalène sont sur le

plasmide NAH7 (Yen et Gunsalus, 1982).

De nombreuses études ont montré que les gènes de dégradation sont localisés sur deux

opérons : nah et sal. Le premier code pour les gènes dégradant le naphthalène en acide

salicylique et le deuxième code pour les gènes impliqués dans la conversion de l’acide

salicylique en pyruvate et acétyl-CoA. La régulation de ces deux opérons se fait grâce au

salicylate (inducteur) et à la protéine NahR qui agit en tant que régulateur positif pour les

deux promoteurs (Schell et Wender, 1986).

De manière générale, les dioxygénases responsables de l’attaque des hydrocarbures

aromatiques sont des cibles intéressantes pour la détection des gènes de dégradation des

hydrocarbures aromatiques et la détection de bactéries ayant un potentiel de dégradation vis à

vis de ces composés (Wilson et al., 1999). La naphtalène dioxygénase est une enzyme

multimérique qui comprend une réductase (NahAa), une ferredoxine (NahAb) et deux sous-

unités protéiques contenant des domaines Fer/Soufre (NahAc et NahAd) (Eaton et Chapman,

1992; Habe et Omori, 2003; Harayama et al., 1999; Williams et Sayers, 1994).


58

C’est généralement le gène codant la grande sous-unité α de la dioxygénase qui est utilisée

dans les études visant à détecter les gènes de dégradation des composés aromatiques. Cette

sous-unité est par exemple très conservée chez les bactéries du genre Pseudomonas (gène

nahAc chez Pseudomonas putida NAH7). Les différentes études effectuées montrent que cette

sous-unité est conservée au sein des différents genres étudiés : Pseudomonas, Comamonas,

Rhodococcus, mais semble très divergente entre les différents genres (Moser et Stahl, 2001).

7.2.1. Biodégradation des HAPs à 2 ou 3 noyaux aromatiques

Les voies de dégradation des HAPs, comme le naphtalène et le phénanthrène, ont été

largement étudiées depuis de nombreuses années (Stolz, 2009). Plusieurs voies de dégradation

bactériennes aérobies du phénanthrène ont été mises en évidence (Moody et al., 2001;

Krivobok et al., 2003; Seo et al., 2007; au sein d’une grande variété de souches appartenant à

de nombreux genres bactériens.

La dégradation du phénanthrène par les bactéries se déroule de manière analogue à celle du

naphtalène, à savoir la formation d’un dihydrodiol, puis de différents intermédiaires avant le

clivage du cycle (Cerniglia, 1992; Saito et al., 2000).

Il arrive fréquemment qu’un produit de dégradation d’un HAP à grand nombre de cycles

passe par la voie de dégradation d’un HAP à plus petit nombre de cycles (ainsi, certains

produits de dégradation du phénanthrène vont pouvoir être dégradés via les enzymes de

dégradation du naphtalène, et donc la voie du naphtalène). De plus, pour une grande majorité

de bactéries, la dégradation du phénanthrène nécessite les mêmes étapes biochimiques (et

souvent les mêmes enzymes) que la dégradation du naphtalène (Mallick et al., 2007; Seo et

al., 2009).

De nombreuses espèces Gram-négatives et Gram-positives ont été décrites pour leur aptitude

à croître sur phénanthrène (Kang et al., 2003, Moody et al., 2001). Beaucoup de bactéries

capables de dégrader le naphtalène sont également capables de dégrader le phénanthrène, et

dans ce cas les mêmes enzymes catalysent l’oxydation des deux substrats (Parales, 2003).

7.2.2. Dégradation des HAPs à 4 noyaux aromatiques ou plus

Malgré le grand intérêt apporté à la biodégradation des HAPs légers, la présence de

HAPs à haut poids moléculaire continue de poser problème du fait de la persistence et de la

toxicité de ces composés. Alors que les HAPs de 2 à 3 noyaux aromatiques sont relativement

facilement dégradés par des bactéries, les HAPs de haut poids moléculaire sont beaucoup plus

récalcitrants à la biodégradation.

La biodégradation de molécules de poids moléculaires supérieurs (nombre de cycles

aromatiques supérieur à 3) est encore mal connue (Cerniglia, 1984b; Smith, 1990). Les

composés les plus étudiés sont le fluoranthène, le pyrène, le chrysène et le le benzo[a]pyrène.

Heitkamp et Cerniglia (1988a) furent les premiers à isoler de l’environnement une bactérie

capable de dégrader les composés aromatiques contenant quatre cycles. Mueller et al. (1989)

démontrèrent pour la première fois l’utilisation de composés aromatiques à quatre cycles et

plus comme seule source de carbone.


59

Le fluoranthène, souvent utilisé comme composé modèle, a été largement étudié : sa

biodégradation a été démontrée à de nombreuses reprises, par exemple, par une souche pure

de Pseudomonas paucimobilis isolée d’un consortium (Mueller et al., 1990) ou encore par

Alcalinogenes dentrificans WW1 (Weissenfels et al., 1990) isolée d’un sol. Kim et al. (2007)

ont pu identifier que 27 enzymes étaient nécessaires à la dégradation complète du pyrène.

Cependant, concernant les HAPs à 5 cycles aromatiques et plus, tels que le benzo[a]pyrene ou

encore le benz[a]anthracene, peu d’information sont disponibles sur les capacités des

bactéries à métaboliser ces composés. Aussi, les mécanismes impliqués dans la dégradation

de ces molécules restent inconnus (Fernández-Luqueño et al., 2010).

La plupart des bactéries identifiées pour leur capacité de dégradation du pyrène sont des

actinomycètes du genre Mycobacterium (Schneider et al., 1996), Rhodococcus (Bouchez et

al., 1995), Gordonia (Kastner et al., 1994) ou Bacillus cereus (Seo et al., 2009). Des espèces

Gram-négatives ont également été identifiées, comme Pseudomonas fluorescens (Boonchan et

al., 1998), Sphingomonas paucimobilis (Kastner et al., 1998), Burkholderia cepacia (Juhasz

et al., 1997), Xanthamonas sp. ou Stenotrophomonas maltophilia (Seo et al., 2009).

Les études les plus complètes ont été réalisées sur le genre Mycobacterium, de par ses

capacités à dégrader les HAPs avec un grand nombre de cycles, et donc les plus récalcitrants

(comme le Benzo[a]Pyrène) (Kim et al., 2006; Kweon et al., 2007). Elles montrent que la

dégradation du pyrène nécessite les mêmes étapes biochimiques que la dégradation du

naphtalène et du phénanthrène. Cependant, beaucoup de métabolites intermédiaires ont pu

être détectés, constituant parfois des impasses métaboliques. La dégradation bactérienne

principale du pyrène chez les espèces du genre Mycobacterium est réalisée par une

dioxygénase initiale formant des produits du métabolisme du pyrène,

Certaines souches sont capables de cométaboliser des HAP à 5 cycles aromatiques,

comme le benzo[a]pyrène. C’est le cas de Sphingomonas yanoikuyae B1 (Gibson et al., 1975)

et de Mycobacterium sp. RJGII-135 (Schneider et al., 1996) qui sont capables de

cométaboliser le benz[a]anthracène et le benzo[a]pyrène. Chez cette dernière bactérie, 3 voies

de dégradation du benzo[a]pyrène ont été mises en évidence (Lee et al., 2007).

Certains de ces microorganismes épurateurs ont de plus la capacité d’améliorer la

solubilisation des HAPs, molécules fortement hydrophobes, par la production de

biosurfactants (formation de micelles), ou par la production de biofilms (matrices

extracellulaires adhésives et protectrices) (Leglize et al., 2008). C’est par exemple le cas de la

souche bactérienne Pseudomonas aeruginosa P-CG3, capable de produire un biosurfactant

améliorant fortement la solubilisation du phénanthrène et du pyrène au sein de sols

contaminés (Cheng et al., 2004). La formation de biofilms est également une des stratégies

mises en place dans l’amélioration de la dégradation des HAPs (Andreoni et al., 2004;

Johnsen et Karlson, 2004). Cette formation de biofilms permet à la fois aux microorganismes

de se protéger des effets toxiques inhérents aux HAPs, mais aussi d’améliorer leur

biodisponibilité. Ces microorganismes ont donc développé diverses capacités leur permettant

de métaboliser les HAPs.


60

7.2.3. Diversité des genres bactériens dégradant les HAPs et des gènes codant une

HAP-dioxygènase

De nombreuses bactéries distinctes sont capables d'amorcer la dégradation des HAPs

(Mueller et al., 1997). Il est intéressant de constater que les capacités métaboliques des genres

bactériens semblent liées à la morphologie. Les bactéries capables de dégrader le

phénanthrène et le fluoranthène appartiennent plutôt à des genres à Gram négatif comme

Achromobacter, Burkholderia, Pseudomonas et Sphingomonas (Rockne et al., 2000; Ho et

al., 2000). Des bactéries du genre Pseudomonas, appartenant à la classe des Gamma-

Protéobactéries, ont servi de modèles pour étudier le métabolisme du naphtalène et du

phénanthrène. De même, Pseudomonas aeruginosa a été isolée pour ses capacités à dégrader

le phénanthrène (Romero et al., 1998). L'étude de Juhasz et al. (1997) est l'une des premières

à montrer que Burkhoderia cepacia a été capable de croître sur du pyrène. Les bactéries

capables de dégrader le pyrène sont plus généralement des genres à Gram positif comme

Mycobacterium, Nocardia, Peanibacillus, et Rhodococcus. Les études montrant des genres

bactériens à Gram positif capable de croître sur le fluoranthène sont plus rares (Lopez et al.,

2005). La diversité des bactéries dégradantes peut être définie par une diversité génétique des

gènes codant les arènes dioxygènases, plus particulièrement les gènes codant la sous-unité ɑ

des HAP-dioxygènases. Le gène nah est un des premiers à avoir été étudié (Yen et Gunsalus,

1982), d'autres gènes ont été découverts par la suite (Tableau 11).

Tableau 11: Diversité des gènes de dégradation des HAPs décrits dans la littérature

(Louvel, 2010)

Gène Localisation Genres N° accession Références

bphA1 pNL1 Sphingomonas aromaticivorans F199

Romine et al., 1999

dntAc Plasmide Burkholderia sp. DNT

AF169302 Suen et al., 1996

nagAC pWWF6 Ralstonia sp. U2

AF036940 Fuenmayor et al., 1998

doxB Plasmide Pseudomonas sp.C18

M83949 Denome et al., 1993

nahAc Plasmide

NAP7

Pseudomonas sp.

Pseudomonas stutzeri

U49496

AF039533

Yen et Gunsalus, 1982

Bosch et al., 1999

nbzAc Comamonas sp. JS765

AF379638 Lessner et al., 2002

narAa Chromosome Rhodococcus sp. NCIMB 12038

AF082663 Larkin et al., 1999

ndoB Plasmide Pseudomonas putida NCIB9816

M23914 Kurkela et al., 1988

ntdAc PDTG800 Pseudomonas sp.JS42

U49505 Parales et al., 1996

pahAc Chromosome Comamonas testosteroni

Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas putida OUS82

AF252550

AF252550

AB004059

Moser et Stahl, 2001

Takizawa et al., 1999

Takizawa et al., 1999

pdoA1 Chromosome Mycobacterium sp. 6PY1

Krivobok et al., 2003

phnAc Burkholderia sp. RP007

AADO9872 Laurie et lloyd-Jones, 1999


61

Chez les Gamma-Protéobactéries, les dioxygénases de Pseudomonas sp.ont

essentiellement été étudiées à partir d’espèces capables d’utiliser le naphtalène, Nah chez

Psudomonas putida G7, Ndo chez Pseudomonas putida NCIB 9816-4 (Takizawa et al.,

1994).

Chez les Alpha-Protéobactéries, les Sphingomonades sont des microorganismes capables de

dégrader un large spectre de composés aromatiques (Leys et al., 2004). Ils ont été isolés ou

détectés dans des sols fortement contaminés aux hydrocarbures.

Chez Les Beta-Protéobactéries, Les dioxygénases des betaprotéobactéries ont été nettement

moins étudiées notamment pour ce qui est de leur spécificité du substrat. Les souches dont

elles sont issues ont été caractérisées pour leur capacité à minéraliser certains HAPs.

Dans la litérature, parmi ceux-ci citons ceux regroupant les gènes nah de dégradation du

naphtalène chez Pseudomonas (Simon et al., 1999; Simon et al., 1993), les gènes ndo, dox et

nag codant pour des dioxygenases impliquées dans la dégradation du naphtalène chez

Pseudomonas (Denome et al., 1993), les gènes phn et pah de dégradation du phénathrène

chez Burkholderia et Pseudomonas respectivement (Laurie et Lloyd-Jones, 1999),

Les bactéries Gram-positives, et plus particulièrement celles appartenant au phylum

des Actinobactéries, sont aussi impliquées dans la dégradation des HAPs. Les mycobactéries,

genre le plus étudié, sont capables de se développer en utilisant le phénanthrène, l’anthracène

ou le pyrène comme uniques sources de carbone et sont aussi impliquées dans la dégradation

d’HAPs de haut poids moléculaire, comme le fluoranthène et le benzo[a]pyrène. Ces

microorganismes ont été détectés dans des environnements à pollution diffuse, avec une faible

concentration et une faible biodisponibilité en HAPs. Ils produisent dans leur paroi externe

des acides mycoliques, acides gras alkylés et hydroxylés, qui forment une couche quasi

cristalline protégeant la cellule de la toxicité des polluants.

La présence de cette barrière de protection associée à la fluidité de leur bicouche lipidique

sert aussi à l’internalisation des HAPs (Jouanneau et al., 2011; Leys et al., 2005).

Les bactéries Gram-positives possèdent, quant à elles, plusieurs copies de gènes cataboliques

leur conférant une large gamme de spécificité. Ainsi le système décrit chez Mycobacterium

PYR-1 comporte NidBA, dont le substrat préféré est le pyrène, et NidA3B3 qui oxyde

préférentiellement le fluoranthène, mais qui oxyde aussi le naphtalène, le phénanthrène,

l’anthracène et le pyrène (Khan et al., 2001; Kim et al., 2006).

Les gènes phd et nid chez les souches à gram positif Nocardioides et Rhodococcus sont

impliqués dans la dégradation de l’anthracène, fluorenthène et pyrène chez Mycobacterium et

Sphingomonas respectivement (Story et al., 2000).


62

8. DIVERSITE BACTERIENNE ET CLASSIFICATION DES

MICROORGANISMES (taxonomie)

L’étude de la diversité microbienne a longtemps été limitée aux techniques de

microbiologie classique. La structure des communautés bactériennes reposait donc sur

l’isolement et la culture des micro-organismes. Ces techniques ont conduit à une sous

estimation de leur nombre réel car il est impossible de mettre au point des milieux de culture

adaptés à toutes les espèces présentes.

D’après Amann et al. (1995) ou encore (Pace, 1997), un faible pourcentage de bactéries

d’écosystèmes complexes et plus particulièrement du sol seraient donc cultivables

(Tableau 12). Plusieurs raisons peuvent être la cause de cette «incultivabilité» comme i)

l’absence de milieu de culture adapté, ii) les interactions entre différentes espèces rendant

impossible leur isolement (phénomènes de coopération), iii) les temps de générations très

variables d’une espèce à l’autre, iv) la quantité d’inoculum, et donc iv) l’abondance relative

de chaque espèce au sein de la population considérée (une population moins abondante peut

prendre la place d’une population majoritaire mais moins adaptée au milieu de culture choisi)

(Amann et al., 1995; Ward et al., 1997).

Tableau 12: Cultivabilité des bactéries (Amann et al., 1995)

Habitats Cultivabilité (%)

Eau de mer 0.001 - 0.1

Eau douce 0.25

Lac mésotrophique 0.1 - 1

Eaux d’estuaires non polluées 0.1 - 3

Boues activées 1 -15

Sédiments 0.25

Sols 0.3

Pourcentage des bactéries cultivalbles par rapport aux cellules totales déterminées par comptage direct; bactéries

cultivablles mesurées en tant qu’unités formant colonies (UFC).

8.1. Microbiologie « classique »

La microbiologie, selon la technique utilisée, permet de définir les trais

morphologiques, physiologiques et/ou métaboliques des microorganismes d’un écosystème

donné (Heitkamp et al., 1988b). La majeure partie des connaissances concernant la

biodégradation des hydrocarbures dans l’environnement a été acquise à partir d’études basées

sur l’isolement de microorganismes hydrocarbonoclastes (Watanabe et Hamamura, 2003).

L’isolement présente comme avantage essentiel de pouvoir travailler sur des souches pures et

ainsi d’étudier précisément un microorganisme et certaines de ses fonctions.

Il est par exemple possible de caractériser in vitro les mécanismes biochimiques et

moléculaires impliqués dans la dégradation d’un hydrocarbure. Cependant, les souches

hydrocarbonoclastes isolées ne sont pas forcément représentatives des capacités métaboliques

de la communauté naturellement présente (Thompson et al., 2005).


63

En effet, seul 1% des bactéries d’une communauté serait cultivable en condition de

laboratoire (Amann et al., 1995), le principal biais de ces techniques étant une sous-estimation

importante de la diversité soit une sous-estimation des capacités métaboliques de la

communauté étudiée. Aussi, les cinétiques de biodégradation d’un polluant in vitro sont très

différentes de celles observées dans l’environnement (Watanabe et Baker, 2000).

Toutes ces méthodes, à l’exception des comptages directs, sont dépendantes de la culture des

microorganismes. Afin de s’affranchir de tels biais, des approches biochimiques et

moléculaires ont été développées au cours de ces vingt dernières années. La simple utilisation

de techniques de microbiologie classique ne permet pas la caractérisation de communautés

complexes. Elles sont aujourd’hui généralement utilisées en complément d’approches

moléculaires afin d’apporter des informations complémentaires sur la communauté

bactérienne étudiée.

Au début du XXème siècle, la classification des microorganismes reposait sur des critères

morphologiques observés par microscopie ou cultures pures sur boites de Petri. A cette

époque, les microbiologistes étaient conscients que ces méthodes étaient restrictives et

insuffisantes pour distinguer les espèces les unes des autres (Janssen, 2006). Les méthodes

d’identification à base d’ADN restent discirminantes et plus résolutives (Devriesse et al.,

1995).

8.2. Apport de la biologie moléculaire

Le développement des méthodes moléculaires, dans les années 1990, a permis de

décrire plus précisément les microorganismes et d’établir un nouveau système de

classification fondé sur une comparaison de la séquence du gène codant la sous-unité 16S de

l’ARN ribosomal (ARNr16S). En 1992, Carl Woese et ses collègues présentent la première

librairie de séquences de gènes d’ARNr16S (Woese et al., 1990).

8.2.1. Le choix de l’ADNr 16S

L’émergence des techniques moléculaires est liée au développement de la phylogénie

moléculaire et du concept d’horloge moléculaire (Zwirglmaier et al., 2004) et au choix de

l’ADNr 16S comme marqueur évolutif universel (Woese et Fox, 1977). Le concept d’horloge

moléculaire est basé sur la théorie neutraliste de l’évolution (Kimura, 1968). Les mutations

s’accumulent au cours du temps dans le génome. Le taux d’accumulation est alors dicté par

l’intensité de la pression de sélection. Il est du même ordre de grandeur dans les régions

soumises à la même pression de sélection. Les évènements évolutifs récents sont alors reflétés

par les gènes à mutations rapides, alors que les gènes très conservés sont considérés comme

les témoins d’un passé très éloigné. Cette théorie a été largement contestée (Li, 1993). La

différence de taux d’évolution serait alors attribuée aux différences de temps de génération ou

aux différences d’activité du métabolisme.

L’ADNr 16S, codant l’ARNr 16S, se prête bien aux analyses phylogénétiques pour plusieurs

raisons (Amann et Ludwig, 2000) : i) élément clé dans la synthèse des protéines, il est

abondamment présent dans tous les organismes vivants, où il accomplit le même rôle, ii) il a

évolué lentement iii) sa séquence (1 500 pb environ) est suffisamment longue pour réaliser

des comparaisons statistiquement significatives, et iv) elle possède des régions dites

conservées (comparaison d’espèces éloignées) et d’autres variables ou hyper variables

(comparaison d’espèces proches),


64

v) elle est facilement obtenue par des méthodes standard d’extraction et de séquençage ; et

enfin, vi) les bases de données pour l’analyse comparative des séquences sont bien fournies et

régulièrement mises à jour (par exemple, Ribosomal Database Project (RDP)

(http://rdp.cme.msu.edu/html/), European Molecular Biology Laboratory (EMBL)

(http://www.ebi.ac.uk/embl/).

Le choix de l’ADNr 16S est parfois contesté. Il serait en effet préférable de pouvoir

établir les phylogénies sur plusieurs gènes afin de ne conserver que l’arbre consensus à toutes

ces phylogénies (Gupta, 1998). Les techniques fondées sur l’étude comparative des séquences

d’ADNr 16S contribuent à améliorer les connaissances concernant la diversité phylogénétique

microbienne associée à un milieu. Le séquençage et l’analyse des séquences obtenues, par

comparaison aux séquences présentes dans les banques de données, permettent d’accéder à la

diversité phylogénétique de l’échantillon (Amann et al., 1995). Même si l’ARNr 16S (~1.500

nucléotides) ne contient environ que deux fois moins d’informations que l’ARNr 23S (~3.000

nucléotides), il est actuellement le biomarqueur phylogénétique bactérien de référence. D’une

part, il est plus facile à cloner et à séquencer et d’autre part, les bases de données sur les

ARNr 16S sont les plus denses et ne cessent d’augmenter. Ainsi, certains serveurs, comme la

base de données RDP (Ribosomal Database Project) proposent des plateformes de traitement

en ligne et sont mis à jours régulièrement, c’est un outil très performant pour positionner

finement une séquence d’ADN 16S et savoir à quoi elle correspond.

Ce marqueur biologique de l’identité est présent chez tous les procaryotes. Il a servi de

pilier à la classification taxonomique des microorganismes jusqu’à ce jour, et par conséquent

à la description des communautés bactériennes de l’environnement. Sur cette base, le Bergey's

Manual of Systematic Bacteriology (Ludwig et Klenk, 2001) définit les groupes

taxonomiques selon 7 niveaux principaux – Domaine, Phylum, Classe, Ordre, Famille, Genre,

Espèce – certains de ces niveaux pouvant être déclinés en sous-divisions. L’affiliation de

séquences au niveau du phylum est considérée comme fiable et aisée. Actuellement, 52

phylums bactériens majeurs ont été identifiés tous environnements confondus (Rappe et

Giovannoni, 2003).

En définitive, les séquences d’ARNr 16S constituent une bonne base d’affiliation

taxonomique mais la discrimination en genres et espèces doit s’appuyer sur un séquençage

plus systématique d’un panel de « gènes de référence » ou de génomes entiers. De plus, la

classification actuelle ne tient compte ni de la nature des écosystèmes d’où proviennent les

bactéries, ni des fonctions qu’elles y assurent.

La compréhension de la distribution et de l’organisation des groupes taxonomiques dans

différents biotopes reste un challenge pour la microbiologie environnementale.

Les approches moléculaires, indépendantes de la culture des micoorganismes, utilisées

pour déterminer la diversité et la structure des communautés bactériennes dans les

environnements naturels sont variées et se basent essentiellement sur la diversité des

séquences d’ADNr 16S (Theron et Cloete, 2000). Ces techniques reposent sur la variation de

la séquence et la structure secondaire de fragments d’ADNr 16S.

Ces techniques basées sur l’amplification par PCR d’un gène d’intérêt permettent soit

d’étudier des organismes en particulier, soit des groupes d’organismes (populations) ou

encore l’ensemble de la communauté.

http://rdp.cme.msu.edu/html/

http://www.ebi.ac.uk/embl/


65

Bien que révolutionnaire dans l’étude des communautés bactériennes d’environnements

complexes, ces techniques ne permettent pas une analyse quantitative absolue du fait des biais

dues à l’extraction des acides nucléiques, à l’amplification par PCR (utilisation

d’oligonucléotides, présences d’inhibiteurs, séquence préférentiellement amplifiées due à leur

composition) et aux propres biais de chacune des techniques (seuil de détection, bruit de

fond). Cependant, ces approches moléculaires couplées à des outils statistiques sont très

adaptées en écologie microbienne pour suivre l’évolution d’une communauté bactérienne

soumise à une pollution ou pour la comparaison de communautés bactériennes

d’environnements différents (pollué/sain, traité/non traité, etc). L’étude du suivi des

communautés est généralement basée sur l’étude du gène codant pour l’ARN ribosomique

16S (ARNr 16S) et ses transcrits qui sont utilisés comme marqueurs phylogénétiques.

8.3. La diversité du domaine « Bacteria »

Un arbre basé sur l’analyse phylogénétique de l’ARNr 16S du domaine «Bacteria»

est présenté sur la (Figure 16). Les 11 divisions définies par Woese (1987) sont symbolisées

par les 12 branches blanches. En effet, les bactéries à Gram positif sont maintenant reconnues

comme formant deux divisions distinctes : les Firmicutes (bactéries à faible pourcentage en

GC) et les Actinobactéries (bactéries à fort pourcentage en GC). Parmi ces divisions

initialement décrites, la mieux connue est celle des Protéobactéries, largement représentée sur

l’ensemble de la planète. Cette division regroupe cinq classes (α-, β-, γ-, δ- et ε-

Protéobactéries). Depuis 1987, 14 divisions supplémentaires (branches blanches) ont été

identifiées (Hugenholtz, 2002). Un certain nombre de ces divisions regroupent des

organismes thermophiles, comme les Aquificae, Thermodesulfobacteria, Dictyoglomi,

Coprothermobacter et Desulfobacteria. Beaucoup de ces divisions semblent émerger tôt de

l’arbre phylogénétique bactérien. La physiologie divergente de micro-organismes regroupés

dans une même division peut rendre difficile les descriptions relatives à ces divisions, comme

c’est le cas pour la division des Acidobactéries (Barns et al., 1999).

En phylogenie, certains phylums bactériens sont dominants et leur abondance relative

varie selon les caractéristiques environnementales et les méthodes d’analyse (Janssen, 2006).

En comparant 32 librairies de gènes d’ARNr 16S, Janssen, 2006 montre qu’en moyenne, 40%

des séquences identifiées dans des échantillons de sol appartiennent aux Protéobactéries, 20%

aux Acidobactéries et 13% aux Actinobactéries. En revanche, l’affiliation de séquences aux

niveaux taxonomiques les plus détaillés (genre, espèce) est plus complexe car un grand

nombre de genres bactériens n’a pas été caractérisé. Malgré ce défaut de connaissance, les

séquences des gènes d’ADNr 16S constituent une base robuste et fiable pour évaluer les

relations pylogénétiques jusqu’au niveau du genre (Cole et al., 2010). En revanche, la

classification au niveau de l’espèce basée sur la seule comparaison des gènes d’ADNr 16S

n’est souvent pas pertinente. Ainsi, certaines espèces de Bacillus, distinguées sur la base de

leur phénotype, présentent des séquences d’ARNr 16S identiques (Maughan et Van der

Auwera, 2011).


66

Figure 16: Arbre phylogénétique des principales lignées (phylums ou divisions) du

domaine « Bacteria » Woese (1987)

Les branches en noir correspondent aux 12 divisions originales décrites par Woese (1987) ; les branches

blanches correspondent aux 14 divisions ayant des représentants cultivables reconnues depuis 1987, et en gris

sont représentées les 26 divisions candidates n’ayant pas de représentant cultivable. Cet arbre a été construit

selon la méthode de matrices des distances après analyse de plus de 600 séquences d’ADNr 16S pratiquement

complètes en utilisant la base de données ARB (Rappe et Giovanonni, 2003).


67

Dans la classification bactérienne reposant sur le seul critère ARNr 16S, on considère

que deux gènes d’ARNr 16S montrant plus de 96% de similarités de séquence appartiennent à

des microorganismes de même genre, et que deux gènes ayant plus de 98% de similarité

appartiennent à la même espèce. Cependant, en se basant sur d’autres critères comme le taux

d’hybridation ADN : ADN, il s’avère que des espèces différentes peuvent avoir des gènes

d’ARNr 16S similaires à 99% (Torsvik et al., 1996). La notion d’espèce étant difficile à

définir sur des bases moléculaires, la plupart des auteurs préfèrent donc classer les gènes

d’ARNr 16S en unités taxonomiques opérationnelles (OTUs), définies par un seuil de

similarité, plutôt que de les affilier à des espèces ou des genres (Schloss et Handelsman,

2005).

9. ETUDE DE LA REPONSE DES COMMUNAUTES BACTERIENNES

SOUMISES A UNE CONTAMINATION PETROLIERE

Une contamination par des hydrocarbures peut induire de nombreux effets sur la

biomasse, les métabolismes, la structure et la diversité taxonomique et/ou fonctionnelle d’une

communauté microbienne. Cependant, les connaissances sur la dynamique adaptative des

communautés bactériennes en réponse à cette contamination restent encore limitées et

exposées à de nombreuses controverses. Suite à une contamination pétrolière, de nombreuses

études ont démontré la mise en place rapide au sein de la communauté de certains

microorganismes hydrocarbonoclastes jouant un rôle majeur dans les processus de

dégradation.

De nombreux auteurs ont isolé des bactéries sur des substrats très différents, comme

des alcanes à longues chaînes, cycliques, branchés et des iso-alcanes. La dégradation

d’hydrocarbures pris individuellement est largement étudiée depuis de nombreuses années.

Mais rares sont ceux qui se sont intéressés à l’évaluation des possibilités de biodégradation

sur un ensemble de composés aussi variés et complexes que le pétrole brut. Il existe

cependant un intérêt général pour l’étude de la diversité des microflores capables de dégrader

les polluants tels que les huiles (Abed et al., 2007), les composés aromatiques (Kanaly et al.,

2000) ou encore les composés chlorés (Dojka et al., 1998).

La biodégradation d’un mélange de composés n’est pas la somme de la biodégradation

de chaque composé pris individuellement. Olson et al. (1999) ont travaillé sur la dégradation

des principales familles chimiques du pétrole (n-alcanes, iso- et cyclo-alcanes, aromatiques),

comparée à la dégradation d’une fraction composite de ces trois familles. La susceptibilité à la

biodégradation semble se présenter dans l’ordre suivant : n-alcanes > aromatiques > iso- et

cyclo-alcanes. Sur la fraction composée de l’ensemble des familles, la fraction aliphatique se

dégrade plus rapidement que la fraction aromatique. Cependant, la biodégradation est moins

rapide en mélange que sur les composés pris individuellement.

Les données concernant la biodégradation du pétrole sont souvent issues

d’observations effectuées sur des sites pollués, c’est-à-dire des écosystèmes ouverts dans

lesquels les bilans complets ne sont pas réalisables. Plusieurs études concernant la

biodégradation du pétrole, sur site ou en laboratoire, ont été effectuées (Salanitro, 2001). Des

études en laboratoire sur des sols sableux ou argileux ont ainsi montré que le pétrole est

biodégradable à hauteur de 40 à 65 % (Margesin et Schinner, 2001).


68

Certaines de ces études ont prouvé que les taux de dégradation étaient souvent surestimés,

soulignant ainsi l’importance de travailler en milieu fermé afin de pouvoir effectuer des bilans

carbone sur les tests de dégradation effectués. En effet, d’après les travaux de Margesin et al.,

2003), 20 à 25 % de ces taux seraient dus à des pertes abiotiques par volatilisation ou

adsorption au cours des expériences, ce qui ramène le taux de dégradation réel à une valeur

comprise entre 15 et 40 %. Les données obtenues lors d’expérimentations sur site (Margesin

et Schinner, 2001 ; Stefanoff et Garcia, 1995) ont montré que 50 à 95 % du pétrole brut

pouvait disparaître en 3 à 24 mois.

Des études ont été effectuées sur la capacité de consortiums bactériens à dégrader les

produits pétroliers (Richard et Vogel, 1999). Ainsi, Marquez-Rocha et al. (2001) ont utilisé

un consortium contenant des bactéries du genre Pseudomonas, Serratia, Acinetobacter et

Flavobacterium et dégradant le pétrole brut à 85 % en 6 semaines.

Richard et Vogel (1999) ont isolé un consortium du sol contenant sept bactéries différentes

(cinq Pseudomonas, un Achromobacter et une non-identifiée) dont trois seulement sont

capables d’utiliser les hydrocarbures comme substrat de croissance. Il semblerait que les

autres bactéries présentes dans le consortium utilisent les intermédiaires métaboliques comme

substrat de croissance. Après 50 jours d’incubation, 90 % du pétrole initial était dégradé. La

dégradation d’un mélange aussi complexe que le pétrole dépend de différents types de

bactéries dont les capacités cataboliques sont complémentaires et qui peuvent ainsi coopérer

dans la biodégradation. Chaque biotope a un potentiel de dégradation, et donc une microflore

indigène qui lui est propre. Une contamination similaire ne provoque pas le développement de

communautés microbiennes similaires (Bundy et al., 2002). De plus, il apparaît que

l’exposition d’un sol à une pollution de type carbonée altère la composition de la microflore

considérée. Ainsi une forte pollution diminue la densité de la population microbienne alors

qu’une teneur plus faible enrichit la microflore en micro-organismes capables de dégrader les

hydrocarbures considérés (Long et al., 1995).

L’évolution de la diversité bactérienne ainsi que la capacité métabolique de la

communauté à faire face à la contamination semble être influencée par l’historique de

contamination de l’environnement étudié (Evans et al., 2004 ; Röling et al., 2004 ). En effet,

les communautés bactériennes présentant ou non un antécédent de contamination, ou encore

soumises à des contaminations chroniques ou accidentelles, ne présentent pas les mêmes

réponses adaptatives. Aussi, la durée d’exposition, la complexité et le niveau de

contamination en hydrocarbures influencent la réponse de la communauté (Yakimov et al.,

2005).

Des successions particulières de groupes bactériens au cours du processus de

remédiation des systèmes étudiés ont pu être mentionnées. Plusieurs études soulignent le lien

existant entre la contamination et la dynamique des communautés bactériennes comme la

dominance de Gamma-Proteobactéries lors de la contamination ou encore l’enrichissement

en Alpha-proteobactéries lors de l’appauvrissement en hydrocarbures (Röling et al., 2002).

Selon Head et al. (2006), la dynamique de la communauté est fonction de l’évolution

qualitative et quantitative des hydrocarbures présents et inversement. Dans le cas d’un pétrole

par exemple, au fur et à mesure que les bactéries dégradent les substrats pour lesquels elles

ont la meilleure affinité, les autres composés du pétrole deviennent prédominants dans le

mélange.


69

Il s’en suit ainsi une modification de la communauté avec la sélection d’autres organismes

présentant une meilleure affinité pour les composés restants.

Les capacités des bactéries à biodégrader des hydrocarbures ont ainsi déjà fait l’objet

de plusieurs publications (Abed et al., 2006; Chaillan et al., 2006. Même si leur rôle dans ces

processus reste discutable (De Oteyza et al., 2006), il apparaît que ces structures bactériennes

se développent parfaitement dans des environnements contaminés en produits pétroliers

(Abed et al., 2007 ; Hernandez-Raquet et al., 2006 ; Kasai et al., 2005). Par ailleurs,

l’identification et l’isolement de nombreuses espèces bactériennes hydrocarbonoclastes à

partir de ces écosystèmes soulignent leur potentiel de biodégradation (Chaillan et al., 2004 ;

Goréguès et al., 2004). Les bactéries de par leur richesse spécifique et métabolique

constituent des systèmes de choix pour étudier les processus métaboliques et de modification

de structure de communautés en réponse à une contamination pétrolière. L’étude de la

réponse des communautés microbienne à une contamination pétrolière apparaît d’un grand

intérêt en termes d’écologie microbienne afin de mieux comprendre la capacité d’adaptation

de ces structures face à des changements environnementaux importants.

10. DETECTION ET ANALYSE DES HYDROCARBURES PETROLIERS

10.1. Techniques basées sur la biologie moléculaire

La compréhension des écosystèmes et l’identification des micro-organismes jouant un

rôle clé dans les processus de biodégradation restent un enjeu de taille pour le développement

optimal de stratégies de bioremédiation. Les techniques moléculaires permettent d’accéder à

la diversité microbienne d’un écosystème (Theron et Cloete, 2000). Elles peuvent également

servir à surveiller et évaluer la bioremédiation des biotopes pollués (Widada et al., 2002).

L’évaluation de la bioremédiation peut être étudiée par les techniques d’empreintes

génétiques appliquées aux gènes de dégradation. Le polymorphisme des gènes considérés

est alors détecté par restriction enzymatique et examen des profils de restriction après

amplification génique. Watanabe et al. (1998) ont ainsi utilisé une analyse du gène codant une

phénol hydroxylase (LmPH) et du gène codant l’ARNr 16S afin de détecter et de caractériser

les bactéries dégradant le phénol prédominantes dans des boues activées d’une station

d’épuration. Ils ont montré que seulement deux bactéries dominantes étaient

vraisemblablement impliquées dans la dégradation du phénol et qu’elles dominaient au bout

de 20 jours de culture sur phénol. Cavalca et al. (2004) ont également analysé la biodiversité

phylogénétique et fonctionnelle de microflores d’eaux souterraines polluées avec des

hydrocarbures aromatiques. Dans leur étude, ils ont montré que peu de changements étaient

globalement observés dans la population bactérienne recensée pendant cinq mois d’injection

d’air dans les eaux polluées. L’étude leur permet également de conclure à la persistance du

groupe Pseudomonas au cours de l’étude. L’emploi combiné de plusieurs méthodes offre des

informations intéressantes quant à la diversité microbienne des écosystèmes étudiés.

Il est également intéressant de pouvoir coupler l’analyse de la diversité microbienne à

une activité de dégradation. Kanaly et al. (2000) ont ainsi étudié l’évolution d’un consortium

bactérien au cours de la dégradation du Benzo[a]Pyrène.


70

Ils ont confirmé la présence, dans leur consortium, de micro-organismes connus pour

dégrader les composés aromatiques, tels que Sphingomonas paucimobilis EPA505 (Ye et al.,

1996), Mycobacterium str.PYR-1 (Cerniglia, 1992) ou Alcaligenes denitrificans WW1

(Stapleton et al., 2000).

Dans une optique de bioremédiation, il semble intéressant de détecter spécifiquement

les gènes impliqués dans la biodégradation. L’expression de ces gènes peut être détectée avec

des méthodes adaptées utilisant les ARNm (Van Hamme et al., 2003). Ces méthodes offrent

une alternative intéressante dans la mesure où la majorité des microorganismes présents dans

les sols par exemple demeurent à ce jour non cultivés. Les études concernant la détection de

certains gènes de dégradation et leur diversité se multiplient donc depuis quelques années.

Beaucoup d’auteurs ont travaillé à l’aide d’amorces dégénérées, en séparant les produits

d’amplification par clonage ou électrophorèse (Watanabe et al., 1998). Certaines voies de

dégradation sont bien caractérisées et quelques gènes de dégradation sont connus à l’heure

actuelle. Ceci a permis le développement d’une grande variété d’amorces.

La détection du gène alkB, impliqué dans le métabolisme des alcanes (Smits et al., 1999) ou

encore des gènes impliqués dans le métabolisme des hydrocarbures aromatiques (Widada et

al., 2002) est actuellement bien documentée. Langworthy et al. (1998) ont par exemple

montré que les gènes nahA et alkB sont plus fréquemment détectés dans les sols pollués que

dans les sols non pollués. Margesin et al. (2003) se sont, eux, intéressés à la caractérisation de

sols alpins pollués. Ils ont montrés que les génotypes des gènes de dégradation de bactéries à

Gram négatif, comme le gène alkB de Pseudomonas putida, se retrouvent plus fréquemment

dans les sols pollués que dans les sols non pollués. Les méthodes basées sur les ARNm

permettent d’évaluer l’expression des gènes de dégradation connus. Wilson et al. (1999) ont

ainsi développé une méthode pour isoler et caractériser les ARNm de micro-organismes

dégradant le naphtalène dans un aquifère contaminé. L’extraction d’ARNm suivie d’une

transcription inverse en ADNc et d’une amplification génique (RT-PCR) et couplée à une

analyse des ADNr 16S permet d’avoir une idée des micro-organismes actifs dans une

microflore (Nogales et al., 2001).

L’amélioration de notre compréhension de la composition des microflores et de

l’activité des micro-organismes impliqués dans la biodégradation permet de mieux envisager

les stratégies de bioremédiation acceptables pour un site pollué. Il est donc important de

développer une approche pluridisciplinaire permettant d’englober l’ensemble des paramètres

intervenant dans l’atténuation naturelle en utilisant toutes les méthodes mises à disposition,

quelles soit basées sur une approche moléculaire, culturale ou physiologique.

10.2. Techniques analytiques basées sur la chromatographie

L'analyse des dérivés pétroliers se fait généralement par classes de composés

chimiques (hydrocarbures saturés, aromatiques, polaires. Elle comprend la séparation et la

quantification des familles d’hydrocarbures d’un échantillon, pour lesquelles on emploie

généralement les techniques chromatographiques. Les critères de sélection d'une technique

particulière sont basés sur les points d'ébullition et/ou la polarité des composés à séparer et à

quantifier (ito et al., 2008) .


71

la chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase normale, couplée à un

détecteur ultraviolet (UV) ou à indice de réfraction (RI), c'est la technique la plus

fréquemment utilisée pour la détermination de la composition de distillats moyens (gasoil) et

lourds (fuel) du pétrole, en familles d’hydrocarbures (saturés, aromatiques et polaires). Elle

permet aussi la séparation et l’analyse des hydrocarbures en fonction du nombre de cycles.

Cependant, lorsque le point d'ébullition des produits à analyser est élevé, les composés lourds

et/ou polaires peuvent être adsorbés irréversiblement sur les colonnes, les déteriorant et

donnant lieu à une élution incomplète (Goto et al., 1994).

10.2.1. Chromatographie sur couche mince avec détection à ionisation de flamme

La TLC-FID plus communément appelée IATROSCAN, est devenue une technique

complémentaire de la Chromatographie Liquide Haute Performance, permettant la séparation

et la quantification d’échantillons à teneur élevés en composés lourds et/ou polaire, elle

combine l’efficacité de la séparation sur couche mince de silice avec la très grande sensibilité,

la rapidité de réponse et les capacités de quantification d'un détecteur FID (Maki et al., 2001).

L’analyse chromatographique est une technique de séparation des différentes familles du

pétrole par gravimétrie (SARA : Saturés, Aromatiques, Resines et Asphaltènes) (Woods et al.,

2008), elle a été mise au point au Japon par les laboratoires Iatron, elle conduit à des

chromatogrammes, cependant, chaque pic étant représentatif de centaines de composés qui

peuvent varier d'un échantillon à l’autre, les facteurs de réponse obtenus par FID sont

différents.

L’étalonnage du détecteur est généralement réalisé à l’aide d'étalons externes, étant donné que

la relation entre la masse d'échantillon et la réponse fournie dépend de la nature de cet

échantillon. Ce type d'étalonnage est généralement aisé pour des composés purs connus et

disponibles. Il est généralement nécessaire de réaliser une séparation préalable des

échantillons pour obtenir des fractions séparés et pures.

Les composés du mélange sont séparés par élution dans une cuve de développement en verre

saturée par un mélange de solvants propres à séparer la classe des composés organiques

donnés suivant le modèle de la CCM classique.

Les composés du mélange d’hydrocarbures sont identifiés par analogie entre leur temps de

rétention et celui de composés contenus dans un mélange standard déposé sur le premier rod.

La quantification se fait par intégration des pics des chromatogrammes. L’analyseur MK4 est

couplé en sortie au logiciel d’exploitation développé par l’entreprise JMBS.

Une des originalités de la méthode IATROSCAN est la possibilité de ne brûler qu’une partie

du rod à la suite d’une élution. Ceci permet de garder intact, près du point de dépôt, les

composés n’ayant pas ou peu migré lors de l’élution. La séquence d'élution choisie pour

analyser les échantillons permet de séparer et quantifier les composés majeurs d'un extrait

complexe (Woods et al., 2008).

La CCM présente certains avantages tels la possibilité de traiter plusieurs échantillons

simultanément, analyse d'échantillons sans fractionnement initial ni élimination préalable des

asphaltènes et la possibilité de stocker les plaques développées.


72

10.2.2. Quantification des hydrocarbures résiduels par chromatographie en phase

gazeuse CPG/FID

Les hydrocarbures résiduels sont dosés par CPG/FID en fin de test de dégradation. Au

préalable, une extraction avec un solvant est effectuée. Le standard interne utilisé à une

concentration déterminée et doit être dans la même gamme des hydrocarbures recherchés,

après extraction des hydrocarbures, la phase organique recueillie est analysée en CPG/FID,

sur un appareil de type Varian 3 400 équipé d’un passeur d’échantillon automatique Varian 8

200. Le débit du gaz vecteur (Hélium) est régulé par la pression d’entrée dans la colonne (180

ou 190 kPa). Ce gaz est préalablement épuré de toute trace d’O2 et d’H2O. L’air et

l’hydrogène sont filtrés pour éliminer toute trace d’hydrocarbures. L’acquisition des données

se fait par le logiciel informatique Borwin. C’est l’analyse fine du chromatogramme qui nous

permet de quantifier les hydrocarbures résiduels. La réponse spécifique est considérée comme

identique quel que soit le composé considéré. Les pics sont intégrés par rapport à la ligne de

base du chromatogramme. C’est la différence d’aire entre les chromatogrammes en début et

en fin de test qui nous permet d’accéder aux taux de dégradation (Brito et al., 2006).

Chapitre II

PROCÉDURES ÉXPÉRIMENTALES

Procédures expérimentales – Partie I

74

Partie 1

Ce travail a été publié en 2013 dans le journal International Journal of Biotechnology

Applications (5) 1: (147-154) sous le titre :

Application des méthodes moléculaires comme biomarqueurs en

bioremédiation


75

AVANT-PROPOS

L'Algérie est un pays producteur de pétrole et son économie est étroitement liée aux

hydrocarbures. La production, l’industrie du raffinage, le transport et l'utilisation du pétrole

contribuent à la pollution de l'environnement et produisent des problèmes écologiques

conséquents. La contamination des sols par des hydrocarbures pétroliers entraîne une baisse

significative de sa qualité et deviennent inutilisables. (Gojgic-Cvijovic et al., 2011). Les

rejets industriels dans les eaux entrainent un déséquilibre des écosystèmes aquatiques.

Le pétrole contient des hydrocarbures simples et des composés complexes, leurs principaux

composants sont les saturés, les composés aromatiques polycycliques (HAPs), les résines et

les asphaltènes (hydrocarbures hétérocycliques ou oxygénés) (Viñas et al., 2002).

L’élimination des hydrocarbures dans le milieu marin et le traitement biologique dans les

stations d'épuration des déchets industriels à partir des raffineries nécessite l'intervention de

différents facteurs biotiques et abiotiques dont la biodégradation par les micro-organismes

particulièrement les bactéries. Les hydrocarbures, y compris les HAPs, ont été classés comme

polluants prioritaires par l’Agence de protection environnementale des États-Unis et par

d’autres organisations de l’environnement et de la santé dans le monde (Yerushalmi et al.,

2003). Afin d'optimiser le processus de bioremediation, deux approches principales ont été

explorées, la biostimulation, où les nutriments sont ajoutés pour stimuler les bactéries, et la

bioaugmentation, dans laquelle les souches microbiennes avec des capacités de dégradation

spécifiques sont ajoutées à des micro-organismes indigènes isolés à partir du sol contaminé

(Viñas et al., 2002).

De nombreux micro-organismes capables de dégrader les hydrocarbures d’origine pétrolière

ont été isolés par les chercheurs. Selon la complexité des produits pétroliers, une combinaison

de souches bactériennes telles un consortium seront nécessaires pour atteindre une

dégradation extensive.

Cependant, la plupart des études rapportées dans la littérature sur la biodégradation du pétrole

brut ont été réalisées avec des cultures de bactéries simples ou mixtes. Il est généralement

admis qu'un seul micro-organisme n'est pas capable de dégrader tous les composés de ce

mélange complexe et les cultures mixtes ont non seulement un large choix de substrat, mais

aussi la dégradation a pu être réalisé dans un système de cooxydation et commensalisme

(Chikere et al., 2011). De nombreux scientifiques ont reporté que les populations mixtes avec

leurs vastes capacités enzymatiques sont nécessaires pour dégrader les mélanges complexes

d'hydrocarbures tels que le pétrole dans les milieux marins, l'eau douce, et le sol.

Les bactéries sont les organismes les plus actifs dans la dégradation du pétrole, elles agissent

comme agents dépolluants primaire sur le pétrole déversé dans l'environnement (Brooijmans

et al., 2009). Le séquençage de l'ADNr 16S a révélé que ces bactéries dépolluantes sont en

majorité affiliées au groupe de Gamma-Proteobacteria et Actinobacteria. Christopher et

Christopher, (2004) ont démontré l'importance des espèces de Pseudomonas dans le stade

précoce de dégradation du pétrole et dans le traitement des sols contaminés. D’autres

bactéries Gram-négatif telles Shewanella et Pseudomonas isolées de boues huileuses se sont

avérées tolérantes aux hydrocarbures saturés, mono-aromatique, et polyaromatiques. Ces

bactéries sont moins sensibles aux composés toxiques que les bactéries Gram-positif (Stancu

et Grifoll, 2011).


76

Certains Enterobacteriacaea notamment Enterobacter sp. et Serratia sp. isolées du sol

contaminé par les hydrocarbures ont également été caractérisées par leur potentiel de

dégradation d’hydrocarbures d’origine pétrolière (Zhang et al., 2010).

Par l’application des techniques à base d’ADN, il est possible d'évaluer le potentiel de

biodégradation en détectant les gènes cataboliques chez les microorganismes indigènes. De

nombreuses bactéries à Gram-négatif, impliquées dans la dégradation des alcanes disposent

de systèmes enzymatiques similaires au système alcane hydroxylase de Pseudomonas putida

Gpo1. L’alcane hydoxylase système (alkB) est constitué de trois protéines : une hydroxylase à

fer non hémique, une rubrédoxine (flavoprotéine) contenant deux atomes de fer et une

rubrédoxine réductase (van Beilen et al., 1994).

La chromatographie sur couche mince couplée à un détecteur à flamme d’ionisation

(TLC/FID) a été utilisé pour évaluer la biodégradabilité de pétrole brut et du rejet industriel, y

compris la fraction non volatile du pétrole brut (Maki et al., 2001). Les produits de

biodégradation du pétrole ont été séparés par analyse gravimétrique avec un modèle de

système SARA (Saturés, aromatiques, résines, asphaltènes) de séparation en plusieurs

fractions qui sont facilement séparés sur la base des différences de polarité fournissant ainsi

des informations plus détaillées sur la répartition des classes de composants au cours du temps

(Woods et al., 2008).

L'objectif principal de ce travail est d'isoler et d'identifier des bactéries capables de dégrader

les hydrocarbures pétroliers en utilisant l’analyse phylogénétique basée sur les séquençages

du gène ADNr 16S et d'optimiser le processus de dégradation avec un consortium bactérien

sélectionné. En outre, l'objectif est aussi de déterminer l'ampleur de la dégradation en

comparant les fractions spécifiques d'hydrocarbures résiduelles par la méthode de TLC/FID.

La recherche du gène alkB par réaction d’amplification génique est réalisée afin de

caractériser les bactéries sélectionnées.

1. MATERIELS ET METHODES

1.1. Site de prélèvement des échantillons

Les échantillons de sol contaminés par les hydrocarbures pétroliers ont été prélevés

depuis la raffinerie d'Arzew (Sonatrach, compagnie Algérienne de pétrole) (Figure 17). Au

total, cinq échantillons ont été utilisés à partir de deux sites contaminés par les hydrocarbures.

Pétrole brut (P) et rejets industriels (RI) ont été utilisés séparément comme seule source de

carbone en milieu minimum (MSM) pour des croissances bactériennes.

1.2. Enrichissement et isolement des bactéries aérobies dégradant les

hydrocarbures

Les bactéries sont isolées sur milieu minimum à base de sels minéraux (MSM),

contenant par litre: 1,2g NH4C; 1,6g K2HPO4; 0,4g KH2PO4; 0,1g NaCl, 1g KNO3, 20g

MgSO4.7H2O; 10g CaCl2.2H2O; 0,05g FeCl3, pH 7,1, une solution d'oligo-éléments (1 ml) et

une solution de vitamine (1 ml) décrite par Pfennig et Trüper (1992) ont été ajoutés

séparément en conditions stériles.


77

Pour l'enrichissement, 20g de sol contaminé sont ajoutés à 200 ml de MSM contenant les

polluants filtrés (P ou RI) à 0,025% (v/v) de chaque source de carbone séparément (Brito et

al., 2006). Les cultures ont été maintenues en agitation (200 rpm) pendant 2 heures à

température ambiante (±28°C). Les bactéries capables d'utiliser les polluants ont été isolées

sur MSM. 20 ml de la culture précédente ont été repris en MSM frais dans des conditions

similaires, ainsi l’opération est répétée quatre fois. Après les quatre transferts consécutifs à de

courts intervalles (4 semaines), 1 ml de culture est dilué à 10-8

et 100µl ont été étalées sur

milieu Luria-Bertani (LB) agar et incubées à 30°C.

1.3. Le criblage et la conservation des souches isolées

La capacité de dégrader les hydrocarbures pétroliers est confirmée par inoculation du

milieu LB liquide avec des pures cultures (18h), transférées en milieu MSM frais contenant

des polluants comme seule source de carbone. Les colonies sont inoculées individuellement

sur le MSM contenant (P) ou (RI) à 1% (v/v), et incubées à 30°C en agitation (200rpm)

pendant 2 semaines. La consommation des hydrocarbures est indiquée par la variation de la

turbidité.

Les isolats ont été maintenus dans un milieu nutritif additionné de glycérol (1:1, v/v),

additionné de la source de carbone filtré (0,005%). Le mélange est agité au vortex et conservé

à -20°C (Obayori et al., 2009).

1.4. Détermination du potentiel de biodégradation bactérienne par turbidimétrie

La turbidimétrie est utilisé pour déterminer la croissance bactérienne en présence

hydrocarbures (P) ou (RI) utilisés comme sources de carbone à 1% (p/v) pour chaque

hydrocarbure dans le milieu MSM à température ambiante pendant 15 jours. La densité

optique (DO) à 600 nm est mesurée à des intervalles réguliers de 2 jours pendant la période

d’incubation.

1.5. Extraction de l'ADN génomique des souches bactériennes sélectionnées

L’extraction d'ADN est préparée selon la méthode modifiée de Gevers et al. (2001),

les colonies ont été repris dans 1 ml d'eau distillée stérile, centrifugées et congelées pendant 1

heure à -20°C. Le culot est lavé dans 1 ml de tampon TES (6,7% (p/v) de saccharose, 50 mM

Tris-Hcl (pH 8,0), EDTA 1 mM) et remis en suspension dans 300μl de tampon STET (8%

(p/v) de saccharose, 5% de Triton X-100, 50 mM Tris-Hcl (pH 8,0), 50 mM EDTA).

75μl de tampon de lyse (TES contenant 1330 U/ml mutanolysine et 40 mg/ml de lysozyme)

est ajouté, et la suspension est incubée à 37°C. Après addition de 40μl de solution de SDS

20% préchauffé (37°C) dans le tampon TE (10 mM Tris-Hcl, 1 mM EDTA, pH 8,0) et de

billes de verre, les cellules sont agitées au vortex pendant 60s et incubées à 37°C pendant 10

min, suivie d'une incubation à 65°C pendant 10 minutes. 100µl de tampon TE sont ajoutés et

le lysat est extrait avec 1 volume phénol/chloroforme/alcoolisoamylique.

Les phases sont séparées par centrifugation (12.000x g, 10 min). La phase aqueuse est

soigneusement mélangée avec 70 µl de NaCl 5M et 1 ml d'isopropanol, et l'ADN est précipité

dans la glace pendant au moins 15 min. Il est recueilli par centrifugation (12.000x g, 10 min)

et le culot est lavé à l'éthanol froid à 70%. Le culot d'ADN est finalement dissout dans 50µl

d'eau distillée et stocké à -20°C. L'ADN est vérifié par une électrophorèse sur gel d’agarose à

1% dans Tris-acétate-EDTA (TAE).


78

1.6. Amplification de l’ADNr 16S, séquençage et analyse phylogénétique

Des amorces universelles suivants sont utilisées pour l'amplification par PCR de

l'ADN ribosomal 16S : 8UA: (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3 '), 1492r (5'-TAC

TAC CTT GTT GGG ACG LOI T-3') (Sato et al., 2003).

Le mélange de PCR (50 µl) contient 100 ng d'ADN Taq polymerase selon les instructions du

fournisseur, 0,2 mM de dNTP, 1,0 µM de chaque amorce et 2,0 mM MgCl2 et le tampon

(10X). L'amplification a été effectuée à l'aide d'une PCR TECHNE TC-312 (Pierre ST 15

OSA, UK) programmé comme suit: 15 min à 95 °C, 35 cycles de 1 min à 94 °C pour la

dénaturation, 1 min à 60 °C pour l’hybridation et 1,5 min à 72°C pour l'élongation et 10min à

72 °C pour une extension finale. 5µl de l’ADN (produit PCR) est analysé par une

électrophorèse avec migration sur gel d’agarose 1% à 100V.

Les réactions de séquençage de gènes ADNr 16S sont effectués à l’aide du Kit « Big Dye

Terminator Cycle Sequencing » par l'analyseur d'ADN 370A (Applied Biosystem).

Les séquences ont été comparées à celles présentes dans une banque de données du National

Center for Biotechnology Information (NCBI) sur le site Infobiogen en utilisant l’outil

d’alignement Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) et alignées sur le programme

ClustalW. Un arbre phylogénétique a été conçu en utilisant le logiciel MEGA 5.05 par la

méthode neighbor-joining (Tamura et al., 2011).

1.7. Détection de gène de dégradation alkB

Pour la détection de gène alkB responsable de l’enzyme clé de l’oxydation des alcanes,

(alcane oxygénase), une PCR spécifique a été réalisée avec un couple d’amorces dégénérées,

Monf (5'-TCAAYACMGSNCAYGARCT-3') et Monr (5'CCGTARTGYTCNAYRTARTT-

3'), conçus sur la base des motifs conservés de l’alkB dans la N-(NTXHELGHK) et C-

terminal (INYIEHYGLL) domaines (Wang et al., 2010). Ce couple d'amorces a été prévu

pour amplifier un produit PCR (fragment d’ADN) d'environ 420 pb. Le mélange final de

PCR réaction est de 50µl contient: qsp H2O, 2.0 mM de MgCl2 et du tampon 10X (fourni

avec la Taq polymérase), 0.2 mM de dNTP, 1µM de chaque amorces, et 2,5U Taq ADN

polymérase (HotStart Taq Master Mix Qiagen Gmbh, Gernany) et 10-15 ng d'ADN purifié à

partir de souches sélectionnées. La PCR a été effectuée avec une dénaturation initiale de 5

min à 94 °C suivi par 32 cycles de 30s à 94 °C, 30s à 50-55 °C, et de 45s à 72 °C et une étape

finale d'élongation de 5 min à 72 °C. Les produits de PCR ont été séparés avec une

électrophorèse sur un gel de 1,0% agarose. L’ADN Smart ladder 200pb (Eurogentec) a été

utilisé comme marqueur de taille moléculaire.

1.8. Analyse de la biodégradation des fractions pétrolières par TLC/FID

La biodégradation a été suivi dans des flacons de 1L en triplicata contenant 500 ml de

MSM additionné de (P ou RI) filtré à 1% (p/v) comme seule source de carbone et 5% (v/v)

d’inoculum de quatre souches sélectionnées (consortium). Les cultures pures de souches

sélectionnées sur (LB) ont été centrifugées afin de récupérer le culot bactérien, lavés deux fois

avec du MSM pour éliminer toute trace de source de carbone restante.


79

Les cultures ont été incubées en agitation (180 rpm) à 30 °C pendant 4 semaines. Les témoins

(abiotiques) non inoculés pour chaque polluant ont été mis dans les mêmes conditions de

culture. Les interactions et les témoins non inoculés ont été soumis à l’extraction

d’hydrocarbures avec le dichlorométhane (DCM), puis passer à l’analyse de chromatographie

liquide sur colonnes de silice couplée à des mesures gravimétriques (méthode SARA)-

TLC/FID (type Iatroscan MK-5, Mitsubishi Kagaku Iatron, Tokyo, Japon) (Goto et al., 1994).

La solution du DCM (3 µl) été déposé sur l’extrémité d'une tige de gel de silice (Chromarods-

SIII; Iatron). Toutes les tiges sont repérés par les échantillons, le support est placé dans la

cuve de migration avec le premier éluant le n-hexane pendant 30 minutes pour séparer les

hydrocarbures saturés environ 10 cm à partit du dépôt, ensuite avec le toluène pour séparer les

hydrocarbures aromatiques (5cm), et enfin 2 min dans une solution de 95:5 DCM:méthanol

pour séparer les résines des asphaltènes. Après chaque migration, les colonnes ont été mises à

une température ambiante pendant 5-10 min afin de sécher le solvant et arrêter la

chromatographie. Dès que les colonnes sont séchées, elles sont placées dans le système

Iatroscan pour l’analyse (débit d'hydrogène 160 ml.min-1, le débit d'air 2 L. min-1 et 30 s

vitesse de numérisation scan-1), de manière efficace à analyser 10 échantillons en 5 minutes.

Les composants organiques séparés sur la colonne (chromarod) sont ionisés et chargés à la

fois positivement et négativement. Les données qui en résultent sont des pourcentages de

différentes fractions du mélange complexe représentés par des chromatographes; cette

méthode permet de séparer les hydrocarbures pétroliers en quatre pics appelés les fractions,

saturés, aromatiques, résines et asphaltènes (Maki et al., 1997). L’étalon interne (Std du

laboratoire, Newcastle, UK) a été utilisé pour évaluer la dégradation des hydrocarbures

analysés par TLC/FID, 3µl ont été déposé sur la colonne et analysé comme décrit ci-dessus.

Le processus nous a permis de suivre le contenu total des fractions d'hydrocarbures pétroliers

dans les échantillons contaminés.

2. RÉSULTATS

2.1. Isolement et criblage des souches isolées Avec une étape d’enrichissement et de purification en utilisant (P) et (RI) comme

source de carbone et d'énergie, 15 colonies bactériennes au total ont été obtenues avec une

diversité morphologique différente à caractère macroscopique et microscopique, certaines

d’entre-elles ont été répertoriés comme suit : LGM106, les cellules sont Gram-négatif en

forme de bâtonnet, colonies beiges muqueuses en boite de Petri sur milieu LB, LGM101

étaient des coques à Gram-négatif, des colonies rondes et rose, à croissance rapide. LGM10

en forme de bâtonnet, à Gram-négatif, colonies blanches gluantes et LGM104 étaient en

forme de bâtonnet Gram-négatif, des colonies blanches, de forme arrondie. Les souches LGM

(101, 103, 104 et 106) ont démontré une turbidité importante dans les cultures d'interactions

en signe de croissance, elles ont été choisies pour la composition d’un consortium microbien.

Ces quatre souches ont été cultivées séparément et mélangés en proportions égales pour une

utilisation en culture dans les interactions avec les polluants hydrocarbures (P et RI).

.


80

2.2. Évaluation de l'utilisation des hydrocarbures par turbidimétrie

La DO change avec le temps pour chaque isolat et pour la culture mixte en présence

des hydrocarbures (P- Figure 18), (RI- Figure 19). La turbidité mesurée à intervalle régulier

(tous les 2 jours) montre le potentiel de dégradation des hydrocarbures choisis par les

bactéries sélectionnées. Plus précisément, la croissance est linéaire entre le 4ème

et 12ème

jour

d’incubation, l’utilisation du xénobiotique comme source d’énergie pour la croissance

bactérienne (oxydation); la croissance est limitée apres 12 jours d’incubation, process au

cours duquel le composé chimique n’est pas utilisé pour la croissance bactérienne mais est

dégradé du fait de l’activité métabolique (le co-métabolisme). Les résultats montrent que

LGM 101 et LGM 106 ont plus de capacité à dégrader le pétrole (P), en plus la souche

LGM 106 utilisée seule montre un meilleur potentiel à dégrader le rejet industriel (RI).

Ces mesures de DO ont montré que les bactéries testées ont la capacité d’utiliser les substrats

hydrocarbonés (P et RI) comme seule source de carbone et d'énergie, le degrès de turbitidé

diffère d'une bactérie à une autre (probablement en raison de l’attaque initiale de la source de

carbone qui diffère d’une souche à l’autre et les caractéristiques individuels de la croissance).

La culture mixte composée de quatre souches a montré une plus forte densité de cellules. Ceci

peut être expliqué du fait que les micro-organismes en culture simple peuvent métaboliser une

gamme limitée de substrats, tandis qu’en culture mixte, les souches bactériennes ont un

cométabolisme plus large et attribue une plus grande capacité de dégradation des mélanges

complexes d’hydrocarbures (Mueller et al., 1997).

2.3. La caractérisation moléculaire des bactéries sélectionnées

Après amplification de l'ADNr 16S (Figure 20). Une étude basée sur le séquençage de

l'ADNr 16S a été réalisée. Avec une homologie de 95-100% comparée avec les séquences de

la banque de données dans Genbank-BLASTn, l'analyse d'affiliation génétique (Figure 21) a

révélé que la souche LGM106 forme un groupe avec Pseudomonas Cedrina subsp. fulgida

DSM 14938 (99% de similarité) et avec la souche Pseudomonas Cedrina (99%). Dans la

littérature, la souche Pseudomonas Cedrina fait partie du groupe Pseudomonas fluorescence

selon Anzai et al., (2000). (LGM106 est identifiée comme Pseudomonas sp.). En outre,

l'analyse phylogénétique a indiqué que LGM101 présente (98%) de similarité de séquence

avec la souche Shewanella hafniensis P010. Le séquençage du gène ADNr 16S a permis

d’identifier deux Enterobacteriales LGM103 présentant (98%) de similarité de séquence avec

Enterobacter hormaechei ATCC 49162 souche CIP 103441 et LGM104 à (99%) de similarité

avec la souche Serratia proteamaculans 4364. Ceci permet la classification de LGM103 et

LGM104 comme souche au genre Enterobacter sp.

2.4. La détection de gène de dégradation: alcanes oxygénase

L’ADN génomique extrait à partir des souches sélectionnées a été utilisé pour l'amplification

du gène alkB. En utilisant le couple d’amorces dégénérées Monf et Monr, le fragment de gène

alkB de (420 pb) a été amplifié chez Pseudomonas sp. (LGM106). Cependant, aucune

amplification n’a été observée chez les autres isolats Shewanella sp. (LGM101), Enterobacter

sp. (LGM103) et Serratia sp. (LGM104) qui présentaient une capacité de croissance en

présence des hydrocarbures pétroliers, le gène alkB est absent chez ces souches

(Figure 22).


81

La capacité de croissance peut s’expliquer par la possibilité de présence d’autres groupes

d’alcanes monooxygénase et/ou présence d’autres gènes de dégradation responsables de

l’attaque initiale des autres groupes pétroliers.

2.5. La biodégradation des hydrocarbures pétroliers par un consortium

sélectionné

Les données à partir de l’analyse TLC/FID indiquent les concentrations de quatre

fractions majeures d'hydrocarbures pétroliers au cours du temps (Tableau 13).

La concentration de chaque composant a été calculée sur la base du rapport des aires des pics

pour chaque fraction par rapport au standard (Std). La chromatographie liquide sur colonne de

silice couplée à des mesures gravimétriques montre que le pétrole brut utilisé comme standard

(Std) contient 58,05% d'hydrocarbures saturés, 34,91% d'hydrocarbures aromatiques, 5,33%

des résines et 1,72% d'asphaltènes, ces résultats correspondent approximativement aux

composants des fractions de (P) et (RI) mesurée par TLC/FID (Figure 23-B et

Figure 23-D). Cependant, le pétrole brut algérien (P) contient plus de composés saturés, une

fraction de 66,19% (Tableau 13) par rapport au (Std) à savoir 58.05%.

L'analyse des produits de biodégradation dans les cultures d'interactions (P+c et RI+c) montre

que le pourcentage de biodégradation des composants saturés diminue avec l'augmentation

importante des fractions non biodégradables (asphaltènes). Cette biodégradation

(consommation ou disparition) importante de cette classe de composés est due à leur grande

sensibilité à l’attaque microbienne comme cela a été souligné dans la littérature (Ulrici, 2000).

Les résultats de la fraction aromatique en (P+c) ne montre aucune variation importante et peut

être expliqué que ces substrats (polluants) ne sont pas appropriés ni apprécier par le

consortium, alors que dans (RI+c), il y’a la possibilité que le RI a pu subir un traitement

chimique pendant le raffinage du pétrole et les composants générés sont moins complexes et

peuvent présenter une meilleure accessibilité pour le consortium bactérien sélectionné.

Cependant, les résultats montrent que le pourcentage de biodégradation de résines est stable

dans tous les échantillons et le pourcentage d’asphaltènes augmente et reste stable comme

observé dans (Figure 23-C) et (Figure 23-E), cela pourrait s’expliquer par le fait qu'ils ne

sont pas dégradés en raison de leurs structures complexes et ils sont difficiles à analyser, les

résines et asphalthènes sont généralement insolubles dans le solvant et résiste à la

biodégradation (Ito et al., 2008).

3. DISCUSSION

La biodégradation est l'un des principaux moyens par lesquels les polluants

d'hydrocarbures peuvent être retirés de l'environnement et de nombreuses espèces de bactéries

aérobies peuvent utiliser ces hydrocarbures et leurs dérivés dans l’environnement. L'efficacité

de biodégradation varie de 0,13% à 50% pour ces bactéries, d’autres organismes peuvent être

impliqués dans ce processus, agissant souvent sous forme de consortiums.

Il est souvent difficile de trouver des organismes qui dégradent individuellement toutes les

fractions de pétrole brut (aliphatiques et aromatiques) (Das et Chandran., 2011).


82

Dans cette étude, quatre bactéries ont été caractérisées et identifiées, la phylogénie a permis

de les regrouper dans un groupe de Gamma-Protéobactéries et les affilier aux genres

Pseudomonas, Shewanella, Enterobacter et Serratia. Selon la littérature et leur affiliation, ces

souches ont été adaptées à un environnement complexe, et pourraient être d'une grande utilité

en bioremédiation, dans les zones contaminées par les hydrocarbures (Kim et Picardal, 2000).

Des consortiums microbiens ayant la capacité de dégrader le pétrole brut à basse température

ont été étudiée par Deppe et al., (2005), et Shewanella sp. et Pseudomonas sp. ont été les

phylotypes prédominants dans ce microcosme destinés à la biodégradation des hydrocarbures.

Les cultures mixtes montrent plus d’avantage de dégradation par rapport à la monoculture, y

compris la stabilité du consortium, avec une importante adaptation de ces bactéries dans des

combinaisons différentes, elles démontrent la capacité d'utiliser divers hydrocarbures, tels que

les alcanes à longue chaîne (n- C24 à n-C34), le pristane, (méthyl)-naphtalènes et des xylènes,

en tant que seule source de carbone et d’énergie. Katsivela et al., (2005) ont noté que le genre

Enterobacter en communauté microbienne à été détecté dans les boues résiduaires actives de

raffinerie et contribuent à l'épuisement des n-alcanes d'environ 75-100%. En outre, Chikere et

al. (2012) ont noté que la souche CEE_131 (T) a été isolée à partir des sédiments, cette

dernière à la capacité de dégrader les hydrocarbures aromatiques polycycliques à haut poids

moléculaire (quatre à cinq noyaux aromatiques, cette souche présente 91% de séquence

similaire avec Serratia proteomaculans DSM4597 (T).

Jin et al. (2012) ont démontré que Serratia sp. NB2 en culture mixte pourrait améliorer la

dégradation de nitrobenzène par rapport à sa croissance en culture simple.

Dans ce travail, la dégradation des hydrocarbures pétroliers par un consortium sélectionné à

montré que les fractions saturés et aromatiques ont subi une biodégradation. Les voies

métaboliques de dégradation majeures pour de nombreux composants pétroliers ont été

étudiées et documentées (Watkinson et Morgon, 1990) pour expliquer leur sensibilité et

accessibilité par les bactéries. Les n-alcanes sont les composés les plus facilement

biodégradés dans un mélange de pétrole, bien que les composés aromatiques sont

généralement les plus résistants à la biodégradation. Les hydrocarbures aromatiques de bas

poids moléculaire tels que le naphtalène peuvent être oxydés avant de nombreux composés

saturés (Zhu et al., 2001). Comme décrit par Maki et al., (2001), la diminution de la fraction

aromatique pourrait s'expliquer par l'hypothèse que les composés aromatiques ont été

transformés à une forme polaire (transformés à la fraction résine ou asphaltènes).

Différents facteurs influençant sur la dégradation des hydrocarbures ont été rapportés par

Cooney et al. (1985) et la plus importante est celle qui limite la biodégradation est leur

biodisponibilité aux micro-organismes. Les constituants d'hydrocarbures pétroliers se lient à

des composants du milieu, ils sont piégés et donc difficiles à être disponibles ou dégradés

(Barathi et Vasudevan, 2001).

Les hydrocarbures diffèrent par leur sensibilité et accessibilité aux attaques microbiennes, ils

peuvent généralement être classées comme suit: alcanes linéaires> alcanes ramifiés >

aromatiques légers > alcanes cycliques (Ulrici, 2000). Selon Warne Zouekia et al. (2010), une

biodégradation efficace dépend de divers paramètres, notamment sur la composition du

pétrole, sur la capacité des bactéries à adhérer et sur le potentiel de dégradation les

hydrocarbures.


83

Beaucoup de recherches ont été effectuées pour comprendre les propriétés physico-chimiques

des différents constituants du pétrole brut, cependant la compréhension de la façon dont les

principales composantes du pétrole brut peuvent affecter l'adhésion bactérienne est encore très

limitée.

Le cométabolisme joue également un rôle important dans la biodégradation du pétrole.

Plusieurs hydrocarbures complexes, ramifiés, cycliques et aromatiques ne sont pas

biodégradables individuellement, ils ne peuvent être oxydés que par cométabolisme dans un

mélange d’hydrocarbures due à la présence d’autres substrats qui peuvent être métabolisés

facilement au sein d’un mélange complexe (Atlas, 1981).

Dans la présente étude, le système enzymatique d'alcane hydroxylase a été étudié, il s’agit du

gène alkB, codant une alcane hydroxylase intervenant dans l’attaque initiale des alcanes. Le

genre Pseudomonas a été différencié des autres genres par sa possession du gène alkB. La

première découverte dans la biodegradation de l’hexane concernant Pseudomonas fluorescens

(Smits et al., 2003). Les gènes codant pour l’alkB sont présents dans de nombreux groupes

bactériens ɑ -,ẞ- et ƴ -Proteobacteria, telles Rhodocuccus erythropolis, Pseudomonas

aeruginosa, plusieurs Acinetobacter sp. et Alcanivorax borkumensis (Van Beilen et al., 2005).

Les souches bactériennes peuvent contenir plusieurs alcanes hydroxylases membranaires de

types AlkBs, et il ya une explication possible à cette redondance apparente, les enzymes

peuvent avoir différentes gammes de substrat: certains enzymes oxydent les n-alcanes de C5 à

C12, tandis que d'autres oxydent de C10-C16 (Van Beilen et al., 2004). Différents AlkBs

pourraient également être actifs au cours des différentes phases de croissance, une autre

explication est que les AlkBs pourraient avoir des affinités constantes pour différents alcanes

ou quelques AlkBs pourraient préférentiellement oxyder les composés non-linéaires, ramifiés,

aliphatiques cycliques ou aromatiques.

La fraction organique des sols contaminés associée aux sables des localités du Sahara

Algérien a été caractérisé, elle contient une fraction de n-alcanes appartenant à C16-C35, des

hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) et des acides carboxyliques (Ladji et al.,

2010), ce qui peut expliquer l’adaptation des communautés bactériennes aux composés

organiques présents dans les sols contaminés.

Les résultats obtenus dans cette étude précisent que le consortium sélectionné, à été identifié

comme un consortium bactérien qui a le potentiel de dégrader les hydrocarbures pétroliers.

L'analyse phylogénétique a révélé que les souches appartiennent à des genres de

Pseudomonas, Enterobacter, Serratia et Shewanella. La culture bactérienne mixte

sélectionnée pourrait être utilisée en bioremédiation.

Récemment, des souches à Gram-négatif appartenant à Shewanella et Pseudomonas isolées de

boues actives sont révélées être tolérantes aux composés saturés (n-hexane, n-heptane,

n-décane, n-pentadécane, n-hexadécane, cyclohexane), aux mono-aromatiques (benzène,

toluène, styrène, isomères du xylène, éthylbenzène, propyl benzène) et aux aromatiques

polycycliques (Stancu et Grifoll, 2011). Dans le domaine de la bioremédiation, le choix d'une

méthode de biodégradation dépend en grande partie sur les capacités de dégradation naturelle

de la microflore locale. À cet égard, la TLC/FID est une technique prometteuse pour évaluer

en détail les capacités de bioremédiation de la microflore bactérienne.


84

Cette méthode présente des avantages dans la mesure où on peut utiliser des hauts points

d'ébullition dans les mélanges des hydrocarbures tels que les saturés de poids moléculaire

élevé, les aromatiques, les résines et les asphaltènes, dont certains peuvent ne pas être

détectable par la GC ou la HPLC (Zhu et al., 2001). Dans une optique de bioremédiation,

l’analyse fonctionnelle des bactéries selectionnées, et donc des gènes intervenant dans les

processus de dégradation est un paramètre clé.

De ce qui précède, il est assez judicieux que cette culture bactérienne mixte présente des

candidats potentiels pour la bioremédiation des sites pollués par les hydrocarbures, cette étude

fournit un aperçu d'une meilleure compréhension de l'adaptation des bactéries vivant dans des

environnements pollués et d'élaborer une solution de mettre en œuvre des bio-stratégies

adéquates à l'avenir pour intervenir, contribuer et améliorer le bon fonctionnement au niveau

des sites de traitement biologique des raffineries.

Figure 17: Carte de l'Algérie, région d’échantillonnage de sols contaminés par les

hydrocarbures pétroliers - raffinerie d'Arzew-Oran (Smail et Khalef., 2007)

Sites de prélèvement 1 et 2


85

Figure 18: Courbe de croissance (DO) de bactéries en présence du pétrole (P) pendant

15 jours d'incubation.

Figure 19: Courbe de croissance (DO) de bactéries en présence du rejet industriel (RI)

pendant 15 jours d'incubation

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 2 4 6 8 10 12 14

DO

Jours

LGM 106

LGM 101

LGM 103

LGM 104

Culture mixte

Contrôle abiotique

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 2 4 6 8 10 12 14

DO

Jours

LGM 106

LGM 101

LGM 103

LGM 104

Culture mixte

Contrôle abiotique


86

Figure 20: Amplification PCR de l’ADNr 16S des bactéries du consortium sélectionné.

M: Marqueur de taille (ADN Smart Ladder 200 pb), 1 : Souche LGM 101, 2: LGM 103,

3: LGM 104, 4 : LGM 106, 5 : Contrôle positif (Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853),

6: Contrôle négative sans ADN.

1500 bp

1000 bp

800 bp

600 bp

400 bp

200 bp

M 1 2 3 4 5 6


87

Les arbres ont été générés avec 1000 répétition et le pourcentage (%) au niveau des nœuds représente les valeurs

de probabilités de la robustesse de la similitude. Bar = 0,02 substitution de nucléotides par site.

Figure 21: Arbre phylogénétique par la méthode Neighbor-joining basée sur les

séquences d’ADNr 16S des souches du consortium bactérien (LGM 106, LGM 101, LGM 103,

LGM 104) et des espèces apparentées du BLASTn database.

Pseudomonas libanensis CIP 105460

Pseudomonas panacis CG20106

Pseudomonas gessardii CIP 105469

Pseudomonas brenneri CFML 97-391

Pseudomonas synxantha IAM12356

Pseudomonas mucidolens IAM12406

Pseudomonas azotoformans KS 0034

Pseudomonas fluorescens IAM 12022

Pseudomonas cedrina subsp. fulgida : DSM 14938 LMG 21467

Pseudomonas cedrina CFML 96-198

LGM 106

Shewanella basaltis J83 (NR_044418)

Shewanella hafniensis P010 (NR_041296)

Shewanella oneidensis MR-1 (NR_074798)

LGM 101

Shewanella putrefaciens CN-32 (NR_074817)

Shewanella putrefaciens LMG 26268 (NR_044863)

LGM 103

Enterobacter hormaechei ATCC 49162 CIP 103441(NR_042154)

Enterobacter ludwigii EN-119 DSMZ 16688 CIP 108491(NR_042349)

Enterobacter asburiae JCM6051 (NR_024640)

Serratia plymuthica K-7 (NR_037111)

Serratia liquefaciens CIP 103238 (NR_042062)

LGM 104

Serratia proteamaculans 4364 (NR_037112)

Serratia proteamaculans 568 (NR_074820)

Serratia proteamaculans DSM 4543 (NR_025341)

Serratia grimesii DSM 30063 (NR_025340)

Sphingobium scionense (T) WP01

87 62

80 97

100

87 61

99

63

45

99

100

64

100

75

64

41 46

32 36

43

35

Gammaproteobacteria

0.02

Alphaproteobacteria

Proteo

bacteria


88

Figure 22: Gel d’électrophorèse de la PCR alkB des souches sélectionnées.

1, 2 et 3 : amplification PCR des souches LGM (101, 103, 104) respectivement, 4 : Présence

de gène AlkB chez LGM 106, 5: Contrôle négatif sans ADN, M: Marqueur de taille (ADN

Smart Ladder 200pb)

600 bp

400 bp

200 bp

1500 bp

1000 bp

800 bp

1 2 3 4 5 M


89

A Std (Standard)

B P (Pétrole brut) C P+c (Consortium)

D RI (Rejet industriel) E RI+c (Consortium)

(A) Standard (Std), (B) Pétrole brut (P), (C) P avec Consortium, (D) le rejet industriel

(RI) et (E) RI avec consortium après 4 semaines d’incubation.

Figure 23: Chromatogrammes de la TLC/FID par (Iatroscan).

Sample 1 (rod 4) (4,1) Atlas,nrg_ch14.CeG_Iatroscan 03-18 1004,4,1,1

Acquired 18 March 2009 10:24:09

50

52

54

56

58

60

62

64

Response

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Retention time

0.11

0.23

0.330.46



50

52

54

56

58

60

62

64

Response

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Retention time

0.12

0.28

0.32

0.35

0.42

0.47

Standard (rod 2) (2,1) Atlas,nrg_ch14.CeG_Iatroscan 03-18 1004,2,1,1


50

52

54

56

58

60

62

64

Response

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Retention time

0.11

0.26

0.33

0.46



50

52

54

56

58

60

62

64

Response

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Retention time

0.12

0.270.35

0.42

0.47

Standard (rod 2) (2,1) Atlas,nrg_ch14.CeG_Iatroscan 03-18 1004,2,1,1


50

52

54

56

58

60

62

64

Response

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Retention time

0.11

0.26

0.33

0.46

Saturates

Aromatics

Resins

Asphaltenes


90

Tableau 13: Composition (%) des fractions pétrolières dans les contrôles biotiques (P+c

et RI+c) et abiotiques pendant 28 jours d'incubation.

Echantillons Saturés Aromatiques Résines Ashphaltènes

Std 58.05 34.91 5.33 1.72

P 66.19 29.78 3.03 1.00

P+c 50.40 30.42 3.65 15.53

RI 56.44 34.72 5.15 3.68

RI+c 51.77 27.77 5.07 15.39

P: Pétrole brut, (P+c): Pétrole avec consortium, RI: Rejet industriel, (RI+c): Rejet industriel

avec consortium.

Std : Standard

Procédures expérimentales – Partie II

91

Partie 2

Ce travail est en phase rédactionnelle en vue d’une publication de renommée internationale

Caractérisation moléculaire des bactéries aérobies capables de dégrader des

polluants aliphatiques et aromatiques de différentes fractions des

hydrocarbures pétroliers


92

AVANT-PROPOS

La production pétrolière, le raffinage et le transport des hydrocarbures contribuent fortement à

la pollution de l'environnement. L'industrie pétrochimique génère des rejets d'effluents

liquides vers un site de traitement. Les boues et les rejets industriels qui résultent de ce

procédé de traitement ont une teneur élevée en hydrocarbures dérivés du pétrole,

principalement des alcanes et des composés aromatiques (Overcash et Pal., 1979), ce qui les

rend des produits de déchet potentiellement dangereux. La dépollution, l’incinération des

déchets d’origine pétrolière des sites contaminés est une préoccupation majeure, en raison

d’une part, de l’impact de cette pollution sur l’environnement et la santé, liée notamment à la

propagation des molécules dangereuses dans le milieu et leur transfert dans les nappes

phréatiques et dans la chaîne alimentaire, et d’autre part des coûts exorbitants engendrés par

les projets de réhabilitation qui exigent souvent l’excavation des sols et le transport onéreux

des terres vers les installations de dépollution (Baheri et Meysami., 2001).

Les traitements mis en œuvre pour dépolluer les sites contaminés sont nombreux et depuis des

années déjà, de nouvelles technologies sont en développement. Sur le terrain, les techniques

de traitement thermiques et physico-chimiques sont les plus répandues, Le traitement

biologique, qui repose sur le pouvoir d’autoépuration naturel des micro-organismes

(bactéries, champignons), suscite actuellement un grand intérêt. L’étape ultime est

l’élimination complète (minéralisation) des polluants. Le traitement biologique peut se faire

enfin sur site. Deux types de traitements sont fréquemment utilisés : le traitement en tertre

dynamique (landfarming) ou en tertre statique (biotertre). L’intérêt de ces techniques réside

essentiellement dans le fait qu’elles ne nécessitent ni excavation, ni transport, ce qui rend leur

mise en œuvre bien moins coûteuse (Persson et Welander 1994). L’atténuation naturelle des

hydrocarbures pétroliers dans les sites pollués est dépendante à la fois des caractéristiques

physico-chimiques des polluants et des sols considérés. Cette situation justifie l’utilité des

études sur la biodégradabilité des produits pétroliers pour évaluer les possibilités d'atténuation

naturelle dans les sols afin de définir des stratégies de bioremédiation.

L’atténuation naturelle d’une pollution désigne l’ensemble des processus qui concourent à la

réduction de la pollution sur le site considéré. Il s’agit essentiellement de la migration des

polluants sous toutes leurs formes, mais aussi de la biodégradation. L’évaluation de

l’atténuation naturelle dans un site pollué défini est un objectif essentiel. En effet, elle vise à

prévoir le devenir de cette pollution pour en tirer les conclusions relatives aux actions à

entreprendre (Leahy et al., 1990).

D’autre part si une action de réhabilitation doit voir le jour, elle permet de proposer un type de

traitement et ses modalités principales (Atlas et al., 1991; Babla et al, 1998). Il semble donc

essentiel de travailler à la caractérisation de communautés bactériennes, telles que celles

dégradant les hydrocarbures pétroliers, car les relations entre les micro-organismes, entre eux

et vis-à-vis de leur environnement est un élément essentiel pour comprendre un écosystème,

et donc envisager une stratégie de bioremédiation.

Le pétrole brut est essentiellement composé d’hydrocarbures, parmi lesquels les

hydrocarbures saturés, les hydrocarbures aromatiques, les résines, et les asphaltènes. Ces

composés sont fortement nocifs, particulièrement les aromatiques puisqu’ils montrent des

propriétés toxiques, mutagènes et carcinogènes (Sudip et al., 2002).


93

La biodégradation d’un mélange de composés n’est pas la somme de la biodégradation de

chaque composé pris individuellement. Kanaly et Hareyama., 2000 et Lal et Khanna., 1996

ont travaillé sur la dégradation des principales familles chimiques du pétrole brut (n-alcanes,

iso- et cyclo-alcanes, aromatiques), comparée à la dégradation d’une fraction composite de

ces trois familles. La susceptibilité à la biodégradation semble se présenter dans l’ordre

suivant : n-alcanes > aromatiques > iso- et cyclo-alcanes (Amund et al ., 1987).

Les n-alcanes sont les composés les plus facilement biodégradables lors d’une éventuelle

pollution. Leur dégradation aérobie a largement été étudiée, et a première étape d’oxydation

est catalysée par une oxygénase. La présence d’oxygène est donc une condition nécessaire à la

dégradation de ces molécules. Les composés branchés sont en général plus résistants à la

dégradation que leurs homologues linéaires (Singer et al., 1984, Kaczorek et Olszanowski.,

2011). La biodégradabilité des hydrocarbures aromatiques de faible poids moléculaire (2 et 3

noyaux aromatiques) sont davantage soumis à la biodégradation que les hydrocarbures

aromatiques de poids moléculaire plus élevé (4 et 5-6 noyaux aromatiques) (Juhasz et Naidu,

2000).

L’étude de gènes fonctionnels impliqués dans la dégradation des hydrocarbures permettrait de

mieux définir la réponse mise en place par la communauté bactérienne. De nombreuses études

se sont intéressées aux capacités de dégradation et à la diversité de gènes impliqués présents

au sein de souches ou de communautés bactériennes (Nam et Alexander, 2001 ; Watanabe et

Hamamura, 2003 ; Zhou et al., 2006). Cependant, Il existe à ce jour peu d’informations sur

l’expression de ces gènes dans les heures et les jours suivant la contamination (Margesin et

al., 2003). La relation entre la présence ou l’absence de gènes de dégradation et les

performances de dégradation des souches isolées n’est pas toujours directe.

Beaucoup de voies de dégradation sont encore inconnues à ce jour (Marquez-Rocha et al.,

2005, Zhang et al., 2010). L’écologie microbienne cherche également à mieux appréhender et

comprendre le rôle exact des micro-organismes dans le fonctionnement des écosystèmes

complexes et également à préciser l’impact des différents facteurs du milieu, tant abiotiques

que biotiques, intervenant sur les micro-organismes (Bouaid et al., 2010).

L’amélioration de notre compréhension de la composition des microflores et de l’activité des

micro-organismes impliqués dans la biodégradation permet de mieux envisager les stratégies

de bioremédiation acceptables pour un site pollué. Il est donc important de développer une

approche pluridisciplinaire permettant d’englober l’ensemble des paramètres intervenant dans

l’atténuation naturelle en utilisant toutes les méthodes mises à disposition, quelles soit basées

sur une approche moléculaire, culturale ou physiologique. Dans ce contexte, la

chromatographie en phase gazeuse (GC) est une technique prometteuse pour évaluer les

capacités de biodégradation de la microflore bactérienne locale (Brito et al., 2006).

L’intérêt de ce travail est d’isoler à partir du sol contaminé par les hydrocarbures d’origine

pétrolière de la raffinerie d'Arzew des souches bactériennes aptes à vivre en présence des

composés ciblés, et d’évaluer la capacité de dégradation des souches sélectionnées par le

dosage des hydrocarbures résiduels par la GC/FID. Les isolats bactériens seront identifiés par

l’analyse des séquences d'ADNr 16S en utilisant les amorces universelles.


94

Par ailleurs, des amorces spécifiques (biomarqueurs) seront utilisées afin d’amplifier les gènes

de dégradation (AlkB, NahAc et NidA). Dans cette étude, nous rapportons les isolats

capables de dégrader les hydrocarbures aromatiques et aliphatiques présents dans le pétrole

brut.

1. MATERIELS ET METHODES

1.1. Site de prélèvement

La collecte des échantillons s’est réalisée en Juin 2009 à partir des différents sites

(sols) contaminés par les hydrocarbures au niveau de la zone d’Arzew (Naftec-Sonatrach)

(Figure 25) et aussi à partir de bourbier stocké sur le site. Sur terrain, les échantillons du sol

contaminé sont prélevés à partir de 2 à 5 cm de la surface du sol pour des analyses

microbiologiques. Quinze échantillonnages au total ont été utilisés à partir de trois sites

contaminés par les hydrocarbures. Le pétrole brut (P) et le rejet industriel (RI) utilisé dans

cette étude sont fournis par la même compagnie, utilisé comme seule source de carbone et

d’énergie en culture d’enrichissement. Le pétrole utilisé en tant que source de carbone a été

filtré et conservé à 4°C.

1.2. Enrichissement, Isolement des bactéries aérobies

Les méthodes d’analyses microbiologiques ont été réalisées à partir d’une solution

mère d’enrichissement des pré-cultures (180rpm, 27 ± 2°C ) présentant 20g se sol contaminé

mélangé à 200 ml du milieu minimum minéral (MSM), contient par litre: 1.2g NH4C; 1.6g

K2HPO4; 0.4g KH2PO4; 0.1g NaCl, 1g KNO3; 20g MgSO4.7H2O; 10g CaCl2.2H2O; 0.05g

FeCl3; pH 7.1; 1 ml de solution de traces d’éléments minéraux et 1 ml de solution de

vitamines (Pfennig et Trüper, 1992), pH 7. Ces dernières sont ajoutées stérilement par

filtration (0,22 μm) de la solution mère de vitamines. Une semaine après, 20 ml de la pré-

culture sont transférés dans 200 ml de MSM, ces cultures de bactéries capables de dégrader

les hydrocarbures pétroliers ont été réalisées dans le milieu minimum minéral (MSM) en

présence de polluants (pétrole brut) à 50 ppm, utilisés comme seule source de carbone. Ce

procédé est répété trois fois avec une augmentation de la concentration de pétrole, 66, 85, et

100 ppm respectivement à des intervalles d’une semaine à chaque fois (Langlois; 1998). Une

numération microbienne a été effectuée sur MSM agar avec 1% (p/v) de pétrole brut comme

source de carbone à partir des dilutions décimales de 10-4

. Apres 2 jours d’incubations à 30°C,

plusieurs colonies apparaissent sur milieu Luria Bertani (LB) Agar. La conservation et le

stockage des souches sont réaisés à -20°C en présence de 20% glycérol.

1.3. Criblage des souches isolées et caractérisation phénotypique

Les bactéries oxydent initialement les hydrocarbures par l’incorporation de deux

atomes d’oxygènes moléculaires dans le substrat pour former des dihydrodiols de

configuration cis. Cette réaction est catalysée par une enzyme, la déshydrogénase. La mise au

point de ce test de respiration est estimée par les sels de Tétrazolium, appelé test INT [2-(p-

Iodophenyl)-3(p-Nitrophenyl)-5-phenyl Tetrazolium chloride (Johnsen et al., 2002) afin

d’évaluer le potentiel de dégradation des isolats. Pour déterminer l’activité déshydrogénase

(Johnsen et al., 2005), les isolats ont été incubés à 30 °C pendant 3 à 4 semaines d'incubation

selon la source de carbone sélectionnées. Les réactions positives sont marquées par une

coloration pourpre due à la réduction de l'INT à (0,75 g/L).


95

La précision de cette méthode a été évaluée en comparant la différence de coloration entre les

cultures en présence d’un témoin sans source de carbone pour chaque polluant.

1.4. Test INT en présence de différentes sources de carbones, pétrole et (HAPs)

séparément

Plusieurs interactions ont été utilisées afin de déterminer le potentiel de dégradation

des souches sélectionnées, Les cultures ont été réalisées dans le milieu (MSM) en présence de

polluant sélectionné et de la souche purifiée.

Une suspension de cellules lavées (1 ml) d’une pré-culture de (A600nm =0.9) sur milieu Luria-

Bertany (LB) est utilisée pour inoculer 20 ml de MSM additionné de la source de carbone

(Vila et al., 2001), contenant 1% (v/v) de pétrole brut filtré ou des hydrocarbures aromatiques

sélectionnés avec un nombre croissant d'atomes de carbone (cycles aromatiques). le

phénanthrène (Phe) comme aromatique léger à faible poids moléculaire (LMW) est ajouté à

une concentration finale de 100 mg/L, le pyrène (Pyr) et le Benzo[a]Pyrène (BaP) comme

composés aromatiques lourds à haut poids moléculaire (HMW) à 50 mg/L (Brito et al., 2006).

Tous les hydrocarbures ont été fournis par Sigma Aldrich. Ils ont été préparé en solutions

mères dans de l'acétone ou le dichlorométhane, un volume de 80 µl est mis dans des flacons

de cultures. Les échantillons préparés ont été incubés à 30°C pendant 3 à 4 semaines en

aérobie (agitation à 200 rpm). Deux témoins ont été utilisés, le premier positif avec une

interaction de cellules et une solution de Glucose à (25mg/ml), et un autre négatif contient

des cellules sans hydrocarbures (source de carbone).

Aux jours 14, 21 et 28, 200µl de chaque interaction en présence de pétrole brut ou des HAPs

sont soumis au test INT. Cette méthode colorimétrique basée sur la réduction de l’INT,

fournit une analyse précise sur la présence de l’activité déshydrogénase dans des conditions

aérobies (Bhupathiraju et al., 1999; Von Mersi et Schinner, 1991).

1.5. Extraction de l'ADN génomique

Les ADNs génomiques on été extraits à partir des différentes souches à l’aide du kit

commercial Ultraclean Microbial DNA Isolation (MoBio Laboratories) selon les

recommandations du fournisseur. Ce kit combine deux types de lyse cellulaire, une lyse

mécanique par broyage et une lyse chimique. L’ADN génomique d’un large spectre de

bactéries a pu ainsi être extrait.

En outre la rapidité d’exécution qu’offre l’utilisation du kit, il permet également des

extractions homogènes et facilement reproductibles limitant ainsi les biais inhérents à

l’extraction d’ADN (important lors de l’analyse de la diversité microbienne). Une fois

extraits, les ADNs génomiques sont conservés à –20°C dans 50 μl d’eau milliQ.

1.6. Electrophorèse sur gel d’agarose

Contrôle de la qualité et de la taille des ADNs

Après extraction, la qualité et la taille des ADNs extraits ont été vérifiées par électrophorèse

sur gel d’agarose (Eurobio). Les gels contenaient 1% (m/v) d’agarose dans un tampon TBE

1X (Acide borique 90 mM, Tris-base 90 mM, EDTA 2,5 mM pH 8.3). La migration des

différents échantillons a été réalisée sous une tension de 100 V pendant 30 minutes environ,

en parallèle de la migration d’un marqueur de poids moléculaire (Smart Ladder, échelle de

200 à 10 000 pb, Eurogentec).


96

Après 15 à 20 min dans un bain de bromure d’éthidium à une concentration de 0,5 μg.ml-1

(BET : agent intercalant de l’ADN), les gels d’agarose ont été placés sous lumière UV afin de

visualiser par fluorescence la qualité et la quantité des ADNs génomiques extraits.

1.7. Amplification des gènes d’ADNr 16S par réaction de polymérisation en

chaîne (PCR)

Les gènes d’ARNr 16S sont amplifiés à partir de l’ADN génomique extrait des

bactéries isolées avec des amorces universelles (Youssef et al., 2009). Un thermocycleur

automatisé répète 35 cycles de trois étapes : la dénaturation de l’ADN (20s à 95°C),

l’hybridation des amorces (55s) à la température d’hybridation (voir Tableau 14) et la

synthèse du brin complémentaire grâce à une ADN polymérase thermostable (105s à 72°C).

L’ensemble des cycles de PCR est précédé par une étape de dénaturation de l’ADN (10 min à

95°C) et suivi d’une élongation finale (105s à 72°C). La réaction de PCR est préparée dans un

volume réactionnel final de 50 μl contenant l’ADN matriciel, 0,2 μM de chacune des deux

amorces utilisées (Tableau 14), 0,2 mM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 0,5 à 1 U de Taq

polymerase (Eurobio) en fonction du gène à amplifier avec son tampon réactionnel 1X final.

1.8. Purification des produits PCR

Les produits PCR en solution ont été purifiés à l’aide du kit commercial Kit PCR-

Clean-up (Promega, Madison, USA). Cette purification a pour but de séparer les fragments

d’ADN amplifiés du milieu réactionnel de PCR (protéines, sels) ainsi que des autres acides

nucléiques (amorces non utilisées, amplification des séquences non désirées inférieures à 100

paires de bases). La qualité et la taille des produits de PCR purifiés ont été vérifiées par

électrophorèse en suivant les mêmes conditions décrites ci-dessus.

1.9. Séquençage des fragments amplifiés

Une librairie d’ADNr 16S est ensuite constituée et les gènes sont séquencés par la

méthode de Sanger (Sanger et al., 1992). La séparation des fragments de séquençage a été

réalisée par La société GATC BIOTECH, prestataire Européen leader de séquençage d’ADN

et de bioinformatique pour l’industrie et la recherche académique. Les fragments de

séquençage sont alors séparés dans un séquenceur capillaire qui permettra de déterminer les

séquences des fragments analysés. Le traitement des séquences brutes a été réalisé à l’aide du

logiciel Blast. Chaque séquence est alors affiliée à un taxon par comparaison avec les

séquences de référence contenues dans les bases de données. Un alignement multiple conduit

à la création d’un arbre phylogénétique qui ordonne les séquences expérimentales et calcule

des distances relatives par rapport à des séquences de référence.

1.10. Détection et amplification des gènes de dégradation en utilisant des amorces

spécifiques par PCR

Dans une optique de bioremédiation, l’analyse fonctionnelle des microflores, et donc

des gènes intervenant dans les processus de dégradation est un paramètre clé. L’étude de

fonctions métaboliques chez les bactéries est souvent appréhendée par la recherche de gènes

connus impliqués ou associés à des mécanismes de dégradation. Ces techniques de screening

impliquent l’utilisation d’amorces pour l’utilisation en PCR ou de sondes pour les

hydridations qui sont dessinées à partir d’éléments génétiques de souches isolées.


97

Ainsi, les amorces ou les sondes utilisées sont plus ou moins dégénérées de manière à cibler

une diversité plus ou moins importante.

Dans cette étude, grâce à la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), des gènes d’intérêts

(également appelés biomarqueurs) ont été spécifiquement amplifiés (Tableau 14), à partir

de l’ADN génomique des souches bactérienne étudiées, trois gènes fonctionnels modèles ont

été choisis pour amplification, Il s’agit :

- Le gène alkB, codant une alcane hydroxylase intervenant dans l’attaque initiale des alcanes,

des amorces dégénérées ont été dessinés spécialement dans le but d'amplifier la séquence du

gène par PCR (Paisse et al. 2011). Un premier alignement de 42 séquences ont été utilisées à

partir d’une banque de données. Les séquences de l’alkB ont été utilisées pour l'alignement

des séquences de quatre groupes d'alcane hydroxylase décrits par Heiss-Blanquet et al,

(2005): le groupe de Rhodococcus, Pseudomonas groupe1, Pseudomonas groupe 2 et le

groupe d’Acinetobacter. Un second alignement de nucléotides de la même séquence a été

réalisé pour définir le niveau de la dégénérescence des amorces conçues (Paisse et al. 2011).

- Le gène nahAc codant la grande sous-unité de naphtalène dioxygénase chez les bactéries à

Gram-négatif, responsable de la première étape de dégradation des HAPs, intervenant dans le

métabolisme de composés aromatiques (tels : naphtalène, phénantrène ou encore

benzo[a]pyrene). Les amorces utilisées pour amplifier la grande sous-unité de la naphtalène

dioxygénase ont été développées suite à l’alignement sur ClustalW des séquences de

Burkholderia sp. U62430, Pseudomonas aeruginosa D84146, Pseudomonas fluorescens

AF00483 selon Bordenave et al. (2007)

- Les bactéries Gram-positif possèdent, quant à elles, plusieurs copies de gènes cataboliques

(nidA) leur conférant une large gamme de spécificité. Ainsi le système décrit chez

Mycobacterium PYR-1 comporte NidBA, dont le substrat préféré est le pyrène, et NidA3B3

qui oxyde préférentiellement le fluoranthène, mais qui oxyde aussi le naphtalène, le

phénanthrène, l’anthracène et le pyrène (Khan et al., 2001; Kim et al., 2006). Mycobacterium

6PY1 possède Pdo1 qui oxyde préférentiellement le pyrène, ainsi que le phénanthrène, et

Pdo2 qui oxyde les HAPs de 2 à 3 cycles avec une préférence pour le phénanthrène (Krivobok

et al., 2003).

Ces trois gènes cataboliques participent à la dégradation des hydrocarbures en condition

oxique, la dégradation d’hydrocarbures en condition d’aérobiose étant plus rapide qu’en

anaérobiose.


98

Tableau 14: Caractéristiques des différents couples d’amorces utilisées lors des PCRs de

notre étude.

La température d’hybridation est évaluée à partir du Tm de chaque amorce calculé selon la formule Tm = 2nA/T

+ 4nG/C (avec nA/T le nombre de bases A et T dans l’amorce et nG/C le nombre de bases G et C). Y=C/T ;

R=A/G ; S= C/G ; W=A/T ; M=A/C ; K=G/T ; H=A/C/T ; N=A/C/T/G.

Séquence cible Amorces Séquences (5’….3’) Taille Température

du produit d’hybridation

attendue (pb) utilisée (C°)

Fragments de gènes codant pour les 8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1500 55°

ADNr16S des Eubactéries 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT-3'. (Youssef et al, 2009),

(Desai et Madamwar,

2006)

alkB AlkB1F CAYGARYTGGGYCAYAAR 414 55°C

AlkB1R AACTAYNTYGARCAYTACGG (Paisse et al., 2011)

Fragments de gènes codant pour des

Dioxygénases

nahAc FRT5A TYR ARG CYA ACT GGA A 437 50°

FRT3B CAT GTC TTT TTC KAC VAT GGC (Bordenave et al., 2007)

nidA GP F GGG GAA CAC GGT GCC RTG DAT RAA 292 52°C

GP R GGG GAA CAC GGT GCC RTG DAT RAA (Cébron et al.,2008)

Les souches utilisées comme contrôle positif (test de biodégradation des substrats

sélectionnés et amplifications PCR) sont des souches de références du laboratoire d’accueil

EEM (Equipe Environnement et Microbiologie de Pau).

Contrôle positif pour l’amplification de l’ADNr 16S : ADN génomique total de la souche

EEM 50 Pseudomonas aeruginosa.

Contrôle positif pour l’amplification de alkB : souche EEM 48 Marinobacter

hydrocarbonoclastticus ATTC 27132.

Contrôle positif pour l’amplification de nahAc : souche EEM 25 Alcaniorax venusti IS 04.

Contrôle positif pour l’amplification de nidA : souche Cd1 Rhodococcus rubberrzofil.

La vérification des amplifications PCR par comparaison avec un contrôle (ADN) positif est

réalisée par une électrophorèse sur gel d’agarose de 1 à 2 % en fonction de la taille du

fragment attendu (conditions de migration identiques à celle décrites précédemment).

1.11. Analyse phylogénétique des séquences

Les séquences ont dans un premier temps été comparées avec celles présentes dans la

banque de données GenBank database du National Center for Biotechnology Information

(NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) grâce à l’outil d’alignement Basic Local Alignment

Search Tool (BLAST). Cette étape permet l’identification de la séquence par homologie avec

des séquences connues.


99

Les séquences codant pour l’ARN ribosomique 16S ont en parallèle été vérifiées avec le

programme CHECK_CHIMERA du Ribosomal Database Project II (RDP)

(http://35.8.164.52/cgis/chimera.cgi?su=SSU) pour déterminer d’éventuelles séquences

hybrides générées par PCR. Les séquences ont ensuite été alignées à l’aide du logiciel

ClustalW, puis ajustées à la taille de la séquence nucléotidique la plus courte

(http://helios.bto.ed.ac.uk/evolgen/filatov/proseq.html). Une analyse par le logiciel

MEGA5.05 (www.megasoftware.net) a permis de générer une matrice de distance élaborée

par comparaison des séquences d’ADN selon la méthode de neighbor joining. Cette matrice

est ensuite représentée sous forme d’un arbre phylogénétique. Des analyses de bootstrap

avec 1000 itérations ont été effectuées pour vérifier la robustesse des arbres. Par ailleurs, les

séquences obtenues dans cette étude ont été déposées dans les banques de données

DDBJ/EMBL/GenBank (voir numéros d’accession dans chapitre des résultats).

1.12. Tests de biodégradation des souches sélectionnées

Les essais sont réalisés dans des fioles de pénicilline de 120 mL avec un volume de milieu de

culture de 20 mL en triplicata. Le substrat est introduit à l’aide d’une seringue Hamilton, juste

avant la fermeture des fioles. Ces dernières sont fermées par des bouchons butyle téflonnés et

scellées par des capsules d’aluminium. Le choix de ce type de bouchon résulte d’essais

effectués lors d’études antérieures ayant mis en évidence l’importance du type de fermeture

des fioles pour minimiser les pertes d’hydrocarbures par évaporation mesurée dans les

témoins abiotiques. Ces derniers sont réalisés pour chacun des tests de biodégradation dans

les mêmes conditions. Des essais sans substrat sont également réalisés dans les mêmes

conditions que les essais biotiques, afin d’estimer le niveau de respiration endogène de

l’échantillon utilisé. Les fioles sont ensuite incubées pendant 21 à 30 jours à 30 °C sous

agitation à 200 rpm (Brito et al.,2006).

Les substrats (SIGMA-ALDRICH) de croissance choisis lors des tests de dégradation sont :

- Pristane (C19H40 : 2,6,10,14-tétraméthylpentadécane) représentatif des alcanes ramifiés

- Octadecane (C18H38) représentatif des alcanes linéaires

- Squalène C30H50 représentatif des alcanes ramifiés

- Phénanthrène C14H10 représentatif des tri-aromatiques

- Pyrène C16H10 à quatre cycles aromatiques

- Benzo[a]Pyrène C20H12 à cinq cycles aromatiques

http://helios.bto.ed.ac.uk/evolgen/filatov/proseq.html


100

Phénanthrène C14H10 Pyrène C16H10 Benzo[a]Pyrène C20H12

Pristane C19H40 Octadécane C18H38

Squalène C30H50

Figure 24: Structure des substrats en hydrocarbures ayant fait l’objet dans cette étude.

La concentration en hydrocarbures est de 50 mg/L pour les aromatiques lourds et 100 mg/L

pour les aromatiques légers, et 250 mg/L pour les alcanes (Brito et al., 2006).

1.13. Dosage des hydrocarbures résiduels par CPG/FID

Les hydrocarbures résiduels sont dosés en chromatographie en phase gazeuse couplée

à un détecteur à flame d’ionisation. Au préalable, une extraction avec 10 mL de

dichlorométhane ou Hexane est effectuée. Le standard interne utilisé est le Triphenylmethane

(C19H16) à une concentration de 100 mg/L dans le dichlorométhane. Après agitation pendant

30 min à 250 rpm, la phase organique est récupérée et analysée en CPG/FID, sur un appareil

de type (GC 8000 Serie, Fisons instruments, Italy) équipé d’un passeur d’échantillons

automatique. Le débit du gaz vecteur (Hélium) est régulé par la pression d’entrée dans la

colonne (180 ou 190 kPa). Ce gaz est préalablement épuré de toute trace d’O2 et d’H2O. L’air

et l’hydrogène sont filtrés pour éliminer toute trace d’hydrocarbures. La méthode est définie

dans l’appareil comme l’indique le Tableau 15:

http://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:Phenanthrene-3D-balls.png

http://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:Pyr%C3%A8ne3D.png

http://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:Benzo(a)pyrene-3D-balls.png

http://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:Pristane-3D-balls.png

http://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:Octad%C3%A9cane3D.png

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Squalene-from-xtal-3D-balls-A.png


101

Tableau 15: Conditions chromatographiques pour l’analyse des hydrocarbures résiduels

par CPG/FID (Brito et al., 2006)

Paramètres du chromatographe Valeur

Colonne HP

Longueur 30 m

Diamètre intérieur 0,32 mm

Phase méthyl-phényl-silicone

Epaisseur de la phase 0,1 μm

Méthode colonne

Isotherme initiale 60 °C

Durée de l’isotherme 1 min

Température finale 300 °C

Pente 40 °C.min-1

Durée de palier finale 5 min

Détecteur

Température 300 °C

Injecteur

Température initiale 60 °C

Pente 180 °C.min-1

Température finale 280 °C

Méthode d’injection

Volume 1 μL

Vitesse 5 μL.s-1

Temps de séjour de l’aiguille 0 sec

Débit de fuite 0 μL.min-1

Gaz vecteur Hélium

Pression d’entrée 190 kPa (27 psi)

Débit 1 mL.min-1

Autres gaz

Make Up (N2) 20 mL.min-1

Air 320 mL.min-1

Hydrogène 30 mL.min-1

L’acquisition des données se fait par le logiciel informatique Borwin software (Borwin ver. 1.22, JMBS Developments,

Grenoble, France)


102

1.14. Performances finales des bactéries testées en pourcentage (%) de

biodégradation

Le % de biodégradation des souches testées est calculé en incluant les valeurs

résiduelles en GC/FID de T0 et le témoin abiotique AB. Cela correspond au rapport entre la

quantité de substrat dosée par CPG/FID dans les essais et le substrat présent dans les témoins

abiotiques à la fin de la période d’incubation et la quantité de substrat initialement introduite

afin de valider l’expérience. Il indique notamment si l’étanchéité des fioles utilisées est

correcte. Il permet également de valider les résultats obtenus pour le calcul du taux de

dégradation et du rendement de minéralisation qui prennent en compte les valeurs des

concentrations en hydrocarbures résiduels.

Les valeurs en (mg/l) sont encadrées par des écarts types et suivis par un test statistique pour

souligner la différence entre les valeurs des souches et des contrôles.

2. RESULTATS ET DISCUSSIONS

2.1. Caractérisation phénotypique

150 bactéries au total ont été isolées du sol contaminé après plusieurs étapes de

purification successives, le pétrole brut a éré utilisé comme seule source de carbone et

d’énergie.

Mise au point d’un test de potentiel de dégradation

Afin de mesurer les capacités de dégradation des bactéries sélectionnées, il fallait mettre au

point un test à la fois simple, fiable et utilisable pour l’ensemble des échantillons et des

substrats à tester. Il repose sur la détermination directe de la présence de l’activité

enzymatique, la deshydrogénase en présence d’O2 au bout d’une période d’incubation

suffisamment prolongée, généralement fixée entre 14 et 30 jours. L’utilisation d’une source

de carbone comme le Glucose était utilisé comme témoin positif.

Détermination de l’activité déshydrogénase par test INT:

L’Oxydation initiale des hydrocarbures a été déterminée par le test de respiration INT (2-(p-

Iodophenyl)-3(p-Nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride, les cultures sont cultivées sur

milieu MSM additionné de pétrole ou des HAPs comme source de carbone: le phénanthrène,

le pyrène et le benzo [a] pyrène.

La précision du criblage de ces 150 souches a été évaluée en comparant la densité

colorimétrique observée en cultures pures des bactéries dégradant les hydrocarbures choisis

après une incubation de 3-4 semaines, en présence des sels de Tétrazolium, avec ou sans

source de carbone.

Le composé organique est utilisé en tant que donneur d’électrons et en tant que source de

carbone (croissance). Les électrons générés par l’oxydation du composé sont transférés vers

l’accepteur d’électrons qui est l’oxygène et donc il est dégradé en CO2 et H2O et participe à la

formation de biomasse.

Par conséquent, c’est un système enzymatique qui fait intervenir un transfert d’électrons en

présence d’oxygène. L’oxydation du substrat est rendu possible grâce à l’activation de

l’oxygène.


103

A la base, la solution de sels de Tétrazolium est incolore tandis que son produit «Formazan »

donne une solution fortement colorée (pourpre). Les sels sont réduits en présence d’un agent

réducteur (NADH) qui est responsable de la couleur pourpre.

L’activité totale (intensité de la couleur) de cette déshydrogénase dans l’échantillon augmente

avec l’augmentation des cellules viables et liée directement avec le nombre de cellules

métaboliquement actives dans le milieu.

Le (Tableau 16) résume les différents phénotypes, 5 groupes ont été obtenus avec le test INT,

ils ont été caractérisés : pétrole brut +, phénanthrène +, pyrène +, le benzo[a]pyrène+, et

(pétrole brut, benzo [a] pyrène) +.

La réduction des sels de tétrazolium a été utilisée comme un indicateur de l'activité de

déshydrogénase de 150 bactéries isolées; après incubation, 96 souches ont été caractérisées

positives par la réduction de l’Iodonitrotetrazolium

L’étude de la contribution des différents groupes bactériens d’une microflore à la dégradation

d’un mélange de substrats tels que le pétrole est réalisée par enrichissement de la microflore

d’étude sur chacun des constituants du mélange. Les micro-organismes ne participant pas à la

dégradation de tel ou tel substrat sont éliminés par les lessivages occasionnés par les transferts

successifs. Par conséquent, seules les espèces bactériennes pouvant se développer sur le

substrat concerné vont persister dans les microflores « adaptées ».

L’analyse de la composition des microflores adaptées permet alors d'appréhender la

participation directe ou indirecte des espèces bactériennes constitutives à la dégradation de

chaque substrat individuel.

Une telle approche expérimentale ne pouvait être adoptée directement dans le cas de la

dégradation du pétrole brut puisque celui-ci est constitué de plusieurs milliers

d’hydrocarbures (Anthony, 2006). Par ailleurs, même si le pétrole n’est constitué que de

quatre grandes classes structurales d’hydrocarbures (alcanes, iso-alcanes, cyclo-alcanes et

aromatiques), la séparation des ces classes structurales, semblait délicate, c’est la raison pour

laquelle nous avons utilisé le pétrole brut comme source d’adaptation.

La biodégradation d’un mélange de composés n’est pas la somme de la biodégradation de

chaque composé pris individuellement. Olson et al. (1999) ont travaillé sur la dégradation des

principales familles chimiques du gazole (n-alcanes, iso- et cyclo-alcanes, aromatiques),

comparée à la dégradation d’une fraction composite de ces trois familles. La susceptibilité à la

biodégradation semble se présenter dans l’ordre suivant : n-alcanes > aromatiques > iso- et

cyclo-alcanes.

Sur la fraction composée de l’ensemble des familles, la fraction aliphatique se dégrade plus

rapidement que la fraction aromatique. Cependant, la biodégradation est moins rapide en

mélange que sur les composés pris individuellement. La récalcitrance relative des différents

hydrocarbures présents dans le pétrole est illustrée par les différents tests de dégradation

effectués au cours de cette étude.

Pour chaque type de substrat testé, les alcanes linéaires sont dégradés en quelques jours. Les

hydrocarbures récalcitrants sont principalement les alcanes branchés et les aromatiques.


104

Les hydrocarbures aliphatiques et aromatiques polycycliques majoritaires du pétrole brut ont

été biodégradés dès la première semaine d’incubation. Apres 12 jours d’incubation une

proportion importante d’organismes impliqués spécifiquement dans la dégradation des

hydrocarbures (tel que les souches LGM 20, LGM 22 et LGM30) qui présentent une réaction

positive nettement prononcée par rapport aux autres souches bactériennes.

2.2. Identification des souches par amplification et séquençage d’ADNr 16S

L’ADN génomique a directement été extrait des souches. L’ADN 16S a ensuite été

amplifié par PCR grâce aux amorces universelles du domaine Bacteria (8F) et (1492R)

(Figure 26). Les produits PCR ont ensuite été purifiés et séquencés par la méthode de Sanger

(Sanger et al., 1992), les séquences obtenues ont été soumises à une analyse de type BLAST

via la base de données NCBI.

Lorsque le pourcentage d’homologie des séquences obtenues est supérieur ou égal à 97 %

entre elles, ces séquences sont regroupées en OTU (Unité Taxonomique Opérationnelle)

alignées avec le logiciel Mothur project level 0.03 en utilisant la banque de données

Ribosomal Database Project (RDP) qui réalise une analyse fine de la diversité et la

construction d’arbre phylogénétique (Figure 27).

Numéros d’accession des séquences nucléotidiques

Les séquences déterminées dans cette étude (95 séquences) sont deposées à EMBL (European

Molecular Biology Laboratory) / GenBank database du National Center for Biotechnology

Information (NCBI) et désignées sous les numéros d’Accession de KF032720 à KF032814.

(Tableau 17) résume les numéros d’accession et les codes attribués aux souches au

laboratoire LGM (Université d’Oran).

Groupes phylogénétiques prédominants

L’arbre phylogénétique général des séquences obtenues pour l’analyse de la microflore

bactérienne est présenté en (Figure 27). L’arbre récapitule les séquences analysées en

fonction de leur appartenance aux différents groupes au sein du domaine « Bacteria ».

L’analyse de 95 séquences nous a permis de définir 17 OTUs différentes se répartissant sur 2

divisions, à savoir : les Gamma-Protéobactéries et les Firmicutes (bactéries à Gram-positif

regroupant les Actinobactéries)

Parmi ces groupes 65 souches sont regroupées dans le cluster des γ- Protéobactérie, et

appartiennent au genre Pseudomonas, Enterobacter et Acinetobacter. Les OTUs de ce

premier cluster represente 68.5% de l’echantillon de cette etude, il inclut (OTU1 (44%, OTU2

(10%) et OTU17 (1%)) representés par Pseudomonas sp. OTU9 represente (3%) representé

par Acinetobacter sp. OTUs12 avec (2% represneté par Serratia sp., OTU 15 avec 1%

representé par Enterobacter sp. et OTU4 avec 6% representé par Bervundimonas sp.

30 souches sont regroupées dans le deuxième cluster des Firmicutes, il represente 31.5% de la

totalité de l’echantillon analysé, representé par plusieurs d’OTUs, OTU3 (7%) representé par

le groupe des Enterococcacae, OTU5 (4%) et OTU8 (3%) representés par le groupe des

Bacillales, les souches appartiennent au genre Bacillus. Parmi les Firmicute, OTU6 (4%) et

OTU7 (3%) sont representés par Staphylococcus sp. Le groupe des Actinobacteriadae inclut

OTU14 et OTU16, les souches appartiennent au genre Kocuria sp. et OTU13 (2%), OUT11

(2%) representés par Corynecacterium sp. et Agrococcus sp. respectivement.


105

La (Figure 28) illustre l’appartenance et la phylogenie des souches testées sur les

hydrocarbures aromatiques (Phe, Pyr et B[a]P) et les alcanes (Pristane, Octadécane et

Squalène). Ces souches appartiennet au groupe des Gamma-Protéobactéries et sont affiliées

aux genres de Pseudomonas sp. et Acineteobacter sp. Des isolats appartenant au groupe ƴ -

protéobactéries, étroitement liée à Acineteobacter sp. et Enterobacter sp. ont la capacité à

dégrader des hydrocarbures pétroliers (Wong et al, 2010 ; Thangaraj et al, 2008 ; Katsivela et

al, 2002).

Dans cette étude, le pourcentage élevé des isolats est représenté par le genre Pseudomonas sp.

ces bactéries sont faciles à cultiver dans les conditions utilisés et préférent le climat des

environnements méditerranéens (Fiorella et Spain, 1997); le genre Pseudomonas est parmi les

espèces qui montrent une grande efficacité à dégrader les hydrocarbures aromatiques

polycycliques et les alcanes (Zhang et al, 2011 ; Rocha et al, 2011).

Les isolats aappartenant au groupe Firmicutes incluant les bactéries du genre Bacillus et

Enterobacter (Figure 28) ont la capacité de minéraliser les hydrocarbures aromatiques

polycycliques lègers, Bacillus subtilis à la capacité d’assimiler le Pyrène (Das et Mukherjee.,

2007), et il a été démontré que la voie métabolique de dégradation du Benzo[a] Pyrène est

réalisée par B. Subtilis (BMT4i) (Lily et al.,2010).

Le pourcentage élevé des souches de Pseudomonas identifiées (~56%) dans ce travail pourrait

être liée à la propriété de ces microorganismes à coloniser les environnements contaminés par

des hydrocarbures (Karamalidis et al., 2010). Dans ce contexte, Pérez-Silva et al., (2006) ont

rapporté que l'espèce Pseudomonas était parmi les micro-organismes prédominants dans des

échantillons de sol hautement pollués par les hydrocarbures. Les espèces de ce genre ont une

large affinité pour les hydrocarbures et peuvent dégrader les alcanes tels, alycyclics,

thiophènes et aromatiques (Allen et al. 1997, Obayori et al., 2000). Les souches bactériennes

isolées sont adaptées à un environnement difficile, chose qui pourrait être d'une grande utilité

pour les inclure dans le domaine de décontamination et de bioremediation qui impliquent des

micro-organismes dans de telles circonstances.

2.3. Recherche des gènes d’intérêt (biomarqueurs) par PCR

Gène AlkB

Des amorces spécifiques du gène alkB ont été utilisées pour détecter sa présence dans les

souches isolées et sélectionnées.

D’après Kloos et al., (2006), des régions conservées ont été choisies pour la conception de ces

amorces pour chacun des quatres groupes cités en matériel et méthodes, les fragments

amplifiés ne représentent pas la totalité des gènes considérés. Pour tous les cas où aucune

amplification n’est observée, et au vu des performances de dégradation obtenues vis-à-vis des

hydrocarbure brut dans notre travail, il est probable qu’un gène codant l’alcane hydroxylase

alkB soit présent. Cependant, sa séquence divergerait suffisamment pour ne pas permettre

l’hybridation avec le couple d’amorces utilisé au cours de l’amplification (Paisse et al., 2011).

La (Figure 29) présente les résultats d’amplification obtenus pour les bactéries sélectionnées,

la souche Marinobacter hydrocarbonoclasticus (EEM48) est utilisée comme témoin positif

pour la détection du gène alkB. Nous observons une amplification à la taille attendue de 414

bp pour 16 espèces de Pseudomonas sp. sur la totalité (95) des souches sélectionnées

(Tableau 17).


106

L’étude du gène alkB a permis de mettre en évidence la présence de ce gène chez les bactéries

du sol contaminé par les produits pétroliers de la raffinerie d’Arzew. Ainsi, malgré

l’optimisation des outils utilisés pour la détection de ce gène chez les bactéries, le gène alkB

ne permet pas de rendre compte de la réponse à une contamination pétrolière dans

l’environnement étudié. Plusieurs hypothèses peuvent expliquer ces observations. Tout

d’abord, la dégradation des alcanes au sein de communautés impliquerait plusieurs familles

d’enzymes, dont les cytochromes P450, aux spécificités de substrats différentes. Il serait donc

intéressant de suivre également la détection des gènes codant pour les cytochromes P450

durant 30 jours d’incubation. Par conséquent, la detection de ce gène n’étant pas spécifique à

la contamination, ce gène ne peut être utilisé comme gène modèle pour caractériser la réponse

de la communauté bactérienne à une contamination pétrolière spécifique aux alcanes.

Cependant, la recherche d’autres gènes de dégradation tels les gènes codant un cytochrome

(P450), susceptible d’intervenir dans la dégradation des iso-alcanes sont nécessaires afin de

mieux caractériser la microflore bactérienne, et sa capacité de dégradation vis-à-vis d’une

contamination par les alcanes.

Gène Nah Ac

La naphtalène dioxygénase (nahAc) susceptible d’intervenir dans l’attaque initiale des

hydrocarbures aromatique des bactéries Gram-négatif. La taille recherchée est de 437 bp.

La (Figure 30) représente un des gels des tests de mise au point de la méthode PCR, la taille

amplifiée est de 600 bp pour la plupart des souches testées. Le séquençage du produit PCR à

révélé que la partie amplifiée code pour une protéine (amino acid permease, APC family) et

non pas pour les dioxygenases responsables de l’attaque initiale des aromatiques (cela peut

s’expliquer par le problème d’alignement des amorces).

Gène NidA

La taille recherchée est de 292 bp. La (Figure 31) représente un des gels des amplifications.

Les amorces ont permis d’amplifier différentes tailles chez les souches potentiellement

impliquées dans la dégradation des aromatiques, chez les bactéries Gram-positif et les

bactéries Gram-négatif. La bande amplifiée entre 200 et 450 bp ne correspondait pas à la taille

recherchée sauf pour les souches LGM 10 et LGM 12 à environ 292 pb, ces souches sont

Gram-négatif appartenant au genre Pseudomonas sp. Résultats qui ne concordent pas avec la

littérature, les bactéries Gram positif possèdent plusieurs copies de gènes cataboliques leur

conférant une large gamme de spécificité. Le système décrit chez Mycobacterium PYR-1

comporte NidA, dont le substrat préféré est le pyrène, et NidA3B3 qui oxyde

préférentiellement le fluoranthène, mais qui oxyde aussi le naphtalène, le phénanthrène,

l’anthracène et le pyrène (Khan et al., 2001; Kim et al., 2006).

Un séquençage des produits amplifiés pour les Gram-positif et Gram-négatif est en cours afin

de confirmer la présence ou pas du gène nidA et l’appartenance de ce gène à la banque de

données des gènes responsables dans l’attaque initiale des hydrocarbures aromatique des

bactéries Gram-positif (Cébron et al., 2008).


107

2.4. Biodégradation (%) des bactéries sélectionnées vis-à-vis des substrats choisis

Afin de caractériser au mieux les capacités de dégradation des bactéries identifiées vis-

à-vis des substrats sélectionnés, la quantité du substrat biodégradé a été mesurée en utilisant

l’analyse en chromatographie en phase gazeuse avec détection par ionisation de flamme

(CPG-FID). Ce type d’analyse nécessite, pour être répétable, une intégration très minutieuse

des chromatogrammes. Au niveau du test lui-même, il convenait également de ne pas négliger

la mise en œuvre de fioles dites « abiotiques », afin de quantifier les pertes liées notamment

aux fuites de substrats, des fioles dites « biotiques » pour s’assurer que la bactérie utilise la

source de carbone mise en culture et fioles dites « T0 » afin de vérifier la quantité

d’hydrocarbure mise au départ.

Quantification des hydrocarbures résiduels par CPG-FID

Les hydrocarbures résiduels sont donnés par CPG-FID en fin de test de dégradation. C’est

l’analyse fine du chromatogramme qui nous permet de quantifier ces hydrocarbures résiduels.

Les pics sont intégrés par rapport à la ligne de base du chromatogramme. C’est la différence

d’aire entre les chromatogrammes en début et en fin de test qui nous permet d’accéder aux

pourcentages de dégradation.

L’ensemble des résultats (%) de biodégradation des alcanes linéaires (C18) et branchés

utilisés (C19 et C30) et les aromatiques légers (Phe) et aromatiques lourds (Pyr er B[a]pyrene

par 23 espèces choisies sont présentés dans le (Figure 32 et 33 respectivement).

Biodégradation des n-alcanes

La dégradation des composés linéaires et ramifiés a été étudiée de façon indépendante pour

confirmer l'activité de dégradation des bactéries sélectionnées vis-à-vis des alcanes, à la fin de

la période d’incubation de 21 jours, les n-alcanes diminuent au cours du temps, mais reste

toujours présent à la fin du test de dégradation. Le genre Pseudomonas est un groupe de

bactéries qui présente une gamme variée d'activités métaboliques, y compris la dégradation de

divers hydrocarbures aliphatiques (n-alcanes) (Binazadeh et al, 2009) et ramifiés comme

source de carbone et d'énergie (Xie et al, 2011 ; Vomberg et Klinner, 2000).

Les alcanes avec une longueur de chaîne carbonée de C18, C19 et C30 ont été utilisés pour

tester la capacité de certaines bactéries qui ont répondu positivement au test de sélection

précédent (test INT). Les résultats indiquent que sur une période de 21 jours d'incubation à

30 °C dans le milieu MSM contenant 250 mg/L d’alcane que la dégradation de n-alcanes est

estimée à 13,29 % pour l’Octadecane par Pseudomonas sp. (LGM 27), 21.33% pour le

Squalène par Pseudomonas sp. (LGM 31) et 35.11% pour le Pristane (Tableau 18) par

Pseudomonas sp. (LGM 20), à signaler que ces souches possèdent le gène alkB.

La minéralisation du Pristane (C19) par les bactéries est plus rapide, alors qu’elle est plus

lente sur les n-alcanes tels Octadecane et Squalène (C18 et C30), la biodégradation de

l’Octadecane (C18) était beaucoup plus lente que c’elle du Pristane, cela est due au caractère

hydrophobe élevé de l’octadécane (Grötzschel et al, 2002 ; Hua et Wang, 2011).

La valeur résiduelle minimale des n-alcanes observée est pour 242.58 mg/L pour le Pristane

par Pseudomonas sp. (LGM 20), 304.17 mg/L pour l’Octadecane par Pseudomonas sp. (LGM

27) et 322.54 mg/L pour Squalène par Pseudomonas sp (LGM 31), cependant les pertes en

abiotique sont de 18.35% pour le Pristane 0.17% pour l’Octadécane.


108

Biodégradation des HAPs

Les HAPs sont beaucoup plus résistants à la biodégradation. La dégradation des HAPs à trois,

quatre et cinq noyaux aromatiques ont été testés par les bactéries sélectionnées dans cette

étude pendant 30 jours à 30°C dans MSM contenant 100 mg/L de HAPs à bas poids

moléculaire et 50 mg/L pour HAPs à haut poids moléculaire.

La souche (LGM 10) appartenant au genre Pseudomonas sp. a la capacité de dégrader 11.51%

le Phénanthrène, environ 10.14% le Pyrène, pour le Benzo[a]Pyrene, le taux de dégradation le

plus elevé est de 33.93% pour LGM 11. Des études récentes montrent que plusieurs espèces

de bactéries capables de dégrader les HAPs à haut poids moléculaire ont été isolées (Rentza et

al, 2008; Juhasz et Naidu, 2000), de ces micro-organismes peu ont été montré capables

d’utiliser des HAPs à quatre ou cinq noyaux aromatiques pour la croissance en l'absence de

co-facteurs ou des agents tensio-actifs, leur métabolisme a lieu généralement sous des

conditions de co-metabolisme avec autres HAPs ou autres hydrocarbures (Boonchan et al.,

2000).

Dans ce travail, outre que Pseudomonas qui appartiennent à Gamma-Protéobactéries,

Enterobacter sp. LGM 60 minéralise 31.63% le B[a]P, Bacillus sp. à 31.49% et

Acinetobacter sp. LGM 7 environ 30.13% (Tableau 18), ce qui n'est pas commun avec la

littérature, les bactéries attaquent d'abord les composés à faible poids moléculaire (Mrozik et

al., 2003). Nous suggérons que ces isolats possèdent un système enzymatique spécifique pour

dégrader les aromatiques lourds à plus de quatre-benzène sans cofacteur ou des agents tensio-

actifs ajoutés au milieu minéral. Certaines bactéries ont la capacité de produire un agent

tensioactif comme Pseudomonas, Acinetobacter et Bacillus (Rocha et al., 2011; Thangaraj et

al., 2008 ; Das et Mukhrjee 2007, Salgado-Brito et al., 2007).

Cependant, les résultats montrent que Pseudomonas sp. a plus de capacité de dégradation que

Bacillus sp, Acinetobacter sp. et Enterobacter sp. avec un maximum de 33.93% pour le B[a]P

par Pseudomonas sp. LGM 11, un maximum de minéralisation de 10.14% pour Pyr et

11.51% pour Phe par LGM 10 illustré dans le (Tableau 18).

Hasanshahian et Giti (2008) ont montré que Bacillus subtilis produit 0,8 g/l de biosurfactant

comparée à Pseudomonas sp. qui produit 0,6 g/l. L'effet de l'agent tensio-actif produit par les

micro-organismes dans le milieu de culture en présence des hydrocarbures aromatiques,

solubilise le HAP et conduit à une augmentation de sa concentration dans le milieu et devient

plus accessible aux micro-organismes (Zhang et al., 1994, Toledo et al., 2006).

Quelques espèces de bactéries appartenant aux Micrococcus, Mycobacterium, Pseudomonas

et Bacillus, ont été caractérisées par leur aptitude à utiliser les HAPs lourds comme seule

source de carbone et d'énergie (Zhuang et al., 2002).

Les résultats de cette étude montrent que deux souches à Gram-positif appartenant au genre

Bacillus ont la capacité de dégrader les aromatiques récalcitrants lourds, LGM8 à 7.89% pour

Pyr et 28.74% pour B[a]P. LGM4 à 6.73% pour Pyr et 31.49 % pour B[a]P, montrant ainsi

la diversité des groupes de bactéries isolées à partir de sols contaminés et qui ont la capacité

de croître en présence des HAPs.


109

Un isolat observé possédant le gène alkB à la capacité de dégrader à la fois les HAPs et les n-

alcanes, Pseudomoans sp. LGM 2 à la capacité de minéraliser l’alcane ramifié (Pristane) à

29.65% après 21 jours d’incubation, le Pyrène à 9.61%, et le Benzo[a]Pyrène à 15.37%

après 30 jours d’incubation, cette souche de Pseudomonas sp. possède à la fois les voies

cataboliques responsables de la dégradation des aromatiques et des aliphatiques. Il a été

rapporté que les deux composés HAP et alcanes peuvent être dégradés par une seule espèce

bactérienne (Sotsky et al, 1994; Whyte et al., 1997).

Le genre Pseudomonas à la capacité de croître sur les deux fractions aliphatiques et

aromatiques de pétrole, ce genre d’espèce présente un grand intérêt dans la bioremediation,

non seulement pour la dégradations des hydrocarbures pétroliers, mais aussi une gamme

variée de composés xénobiotiques (Parales et al., 2002). Cette capacité différencie

Pseudomonas sp. (LGM2) de toutes les bactéries isolées à partir du même site contaminé par

les hydrocarbures.

Dans notre étude, la prédominance de la minéralisation des hydrocarbures aliphatiques

estimée à 35.11% cas du Pristane (Tableau 19), elle est plus élevée que c’elle des

aromatiques estimée à 33.93% cas du B[a]P (Tableaux 18) ainsi que la dégradation des

aliphatiques est plus rapide, ces résultats ont été observés dans plusieurs études (Vinas et al.,

2002 ; Manee et al, 1998 ; Hasanshahian et Giti (2008).

L’accessibilité difficile des substrats complexes pour les microorganismes apparaît comme un

facteur limitant important à prendre en compte pour expliquer ce phénomène. En effet, ce sont

les hydrocarbures les plus lourds et complexes (cas du Squalène dans notre étude) qui

résistent le plus à la biodégradation.

Dans la présente étude, les résultats montrent les C18, C30 des n-alcanes sont faiblement

dégradés par les bactéries testées en comparant avec C19, les données fournies de l’étude par

Ladji et al, (2010) ont montré que les n-alcanes tels C18 et C30 ne sont pas des constituants

abondants dans le sable contaminé par les hydrocarbures de Hassi-Messaoud, donc moins

presents dans le pétrole brut, contrairement aux composés aromatiques qui sont plus présents

dans le sable contaminé. A ce stade, il est important de considérer l’adaptation et la

biodisponibilité des composés pour utilisation microbienne (Reid et al., 2000).

L'adaptation des bactéries aux contaminants a été largement mentionnée dans la

biodégradation du pétrole (Horowitz et Atlas., 1977 ; Solano et al., 2000). Penet et al., (2006)

ont montré une comparaison entre les échantillons de sol contaminé et non contaminé par une

adaptation à la pollution, les capacités de dégradation des bactéries du sol contaminé ont été

plus élevés que ceux des sols non contaminés.

Ce travail a montré que les souches sélectionnées identifiées comme Pseudomonas sp. ont le

potentiel d’utiliser efficacement les fractions de n-alcanes ramifiés (Pristane) comme source

de carbone et certains Pseudomonas sp., Bacillus sp. Enterobacter sp et Acinetebacter sp.

étaient capables de dégrader les hydrocarbures aromatiques récalcitrants comme le pyrène et

le Benzo[a]Pyrène. Par conséquent, nos résultats suggèrent que ces micro-organismes peuvent

être intéressants pour une application dans les techniques de la bioremédiation et utilisées

dans un site de traitement biologique des eaux usées des stations de raffinerie. Ils seraient

donc des candidates potentiellement importantes afin de sélectionner un consortium en

biotechnologie.


110

Ainsi, ces souches peuvent être utilisées pour concevoir des cultures mixtes avec des

capacités de biodégradation spécifiques pour des fractions pétrolières déterminés. Néanmoins,

des études devraient être menées pour évaluer les interactions microbiennes au cours de la

biodégradation des hydrocarbures au fil du temps.

La valeur résiduelle minimale des HAPs observée est pour 109.94 mg/L pour Phénanthrène et

35.74 mg/L pour le Pyrène par Pseudomonas sp. LGM 10, et 114.67 mg/L pour B[a]P par

Pseudomonas sp. (LGM 11), cependant les pertes en abiotique sont de 38,75%, 63,01% et

10% respectivement (Tableau 18).

Les rendements de biodégradation dans les stations d’épuration dans les raffineries doivent

être étudiées par des expériences de bioaugmentation selon Andreoni et Gianfreda, 2007 qui

ereposait sur l’introduction dans ces sites des microorganismes présentant les capacités

métaboliques nécessaires à la dégradation des polluants présents. Cela consiste à ensemencer

le site avec des microorganismes adaptés à la dégradation du (ou des) xénobiotique(s)

présent(s), afin d’assurer ou d’accélérer le processus de dépollution. Cet ajout peut se faire

sous la forme d’une souche unique, ou d’un groupe de souches appelé consortia (Samanta et

al., 2002; Silva et al., 2009; Zanaroli et al., 2010). Ce qui conduirait à la mise au point de

nouvelles technologies de bioremédiation des sites de traitement biologiques contaminés par

les hydrocarbures pétroliers.

Certains microorganismes épurateurs ont de plus la capacité d’améliorer la solubilisation des

hydrocarbures particulièrement les HAPs, molécules fortement hydrophobes, par la

production de biosurfactants (formation de micelles), ou par la production de biofilms

(matrices extracellulaires adhésives et protectrices) (Johnsen et Karlson, 2004; Leglize et al.,

2008). C’est par exemple le cas de la souche bactérienne Pseudomonas aeruginosa P-CG3,

capable de produire un biosurfactant améliorant fortement la solubilisation du phénanthrène et

du pyrène au sein de sols contaminés (Cheng et al., 2004).

Dans notre travail des souches LGM 4 et LGM 8 sont des bactéries Gram-positif, appartenant

au genre Bacillus présentent des capacités de dégradation des composés aromatiques de

31.49% et 28.74% pour le B[a]P respectivement. Ces souches sont potentiellement

considérées comme positives pour le gène nidA, d’après la littérature c’est un gène spécifique

des Gram-positif (Andreoni et al., 2004), le genre Bacillus est capable de se protéger des

effets toxiques inhérents aux HAPs, et peut être susceptibles de produire des biosurfactants.

La formation également de biofilms est une des stratégies mises en place dans l’amélioration

de la dégradation des HAPs (Andreoni et al., 2004). Cette formation de biofilms permet à la

fois aux microorganismes de se protéger des effets toxiques des HAPs, mais aussi d’améliorer

leur biodisponibilité (Johnsen et Karlson, 2004).

Les bactéries sélectionnées ont montré des préférences spécifiques pour les différentes

sources de carbone testées, par conséquent leur capacité à utiliser les différents constituants

du pétrole, ces souches peuvent être utilisées pour concevoir des cultures mixtes (consortium)

avec des capacités de biodégradation spécifiques pour les différentes fractions pétrolières.


111

Tableau 16: Différents phénotypes des bactéries isolées

Nombre de souches testées

Phénotypes Dehydrogenase positive alkB positive

C.Oil+ 9 (++) 22 (+) 15

Phe+

7 (++) 19 (+)

Pyr+ 5 (++) 12 (+)

B[a]P+ 2 (++) 15 (+)

C.oil+, B[a]P+ 5 (++) 2 (+) 2

C.Oil: crude oil; Phe, phenanthrene; Pyr, pyrene; B[a]P: benzo[a]pyrene.

L’activité dehydrogenase déterminée par le test INT.

150 souches isolées du sol contaminé par les hydrocarbures, 96 souches testées par INT.

(++) Coloration forte. (+) coloration faible.


112

Tableau 17: Numéro d’accession EMBL-GenBank et l’affiliation des séquences aux

OTUs (unité taxonomique opérationnelle) disponibles sur NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

Souches plus proche parent BLAST % d’identité Numéro Numéro Groupe amplification

déterminé (EMBL) d’OTUs d’accession Phénotypique alkB

LGM1 Pseudomonas libanensis 99.49% 1 KF032720 C.Oil+

LGM2 Pseudomonas brenneri 99.49% 1 KF032721 C.Oil+

, B[a]P+

+

LGM3 Pseudomonas libanensis 99,86% 1 KF032722 C.Oil+

LGM4 Bacillus amyloliquefaciens 99.76% 5 KF032723 C.Oil+

, B[a]P+


, B[a]P+ +


LGM7 Acinetobacter lwoffii 99.38% 9 KF032726 C.Oil+

, B[a]P+, Pyr

+, Phe

+

LGM8 Bacillus amyloliquefaciens 99.62% 5 KF032727 C.Oil+, B[a]P

+, Pyr

+, Phe

+

LGM9 Bacillus amyloliquefaciens 99.74% 5 KF032728 C.Oil+

LGM10 Pseudomonas fragi 99.36% 2 KF032729 C.Oil+

, B[a]P+


, B[a]P+

LGM12 Pseudomonas psychrophila 98.97% 2 KF032731 C.Oil+

, B[a]P+



, B[a]P+ +






+



+


LGM24 Serratia proteamaculans 98.37% 12 KF032742 C.Oil+

LGM25 Pseudomonas extremorientalis 99.51% 2 KF032743 C.Oil+/-

+

LGM26 Pseudomonas brenneri 99.47% 1 KF032744 C.Oil+/-

+


113




+


LGM29 Pseudomonas veronii 100% 2 KF032747 C.Oil+/-

+


+


+

LGM32 Enterococcus durans 99.52% 3 KF032750 C.Oil+



LGM35 Pseudomonas veronii 99.20% 2 KF032753 C.Oil+/-

+

LGM36 Pseudomonas extremorientalis 99.84% 2 KF032754 C.Oil+/-

+


LGM38 Pseudomonas lurida 100 % 2 KF032756 C.Oil+/-

+

LGM39 Kocuria rhizophila 99.36% 14 KF032757 C.Oil+


+









+


LGM50 Bacillus anthracis 99.73% 8 KF032768 C.Oil+


LGM52 Enterococcus hirae 99.60% 3 KF032770 C.Oil+


114



LGM53 Kocuria rhizophila 100% 14 KF032771 C.Oil+



LGM56 Agrococcus jenensis 99.01% 11 KF032774 C.Oil+

LGM57 Kocuria polaris 98.62% 16 KF032775 C.Oil+

LGM58 Brevundimonas diminuta 97.52% 4 KF032776 C.Oil+

LGM59 Pseudomonas xanthomarina 99.38% 17 KF032777 C.Oil+


, B[a]P+, Pyr

+

LGM61 Carnobacterium inhibens 97.72% 10 KF032779 C.Oil+

LGM62 Pseudomonas cedrina 100% 1 KF032780 C.Oil+

LGM63 Enterococcus durans 99.88% 3 KF032781 C.Oil+

LGM64 Staphylococcus warneri 100% 7 KF032782 C.Oil+




LGM68 Corynebacterium xerosis 99.74% 13 KF032786 C.Oil+

LGM69 Staphylococcus succinus 99.87% 6 KF032787 C.Oil+



LGM72 Bacillus thuringiensis 99.32% 8 KF032790 C.Oil+

LGM73 Carnobacterium inhibens 98.55% 10 KF032791 C.Oil+




LGM77 Agrococcus jenensis 99.14% 11 KF032795 C.Oil+



115



LGM79 Serratia proteamaculans 98.43% 12 KF032797 C.Oil+

LGM80 Enterobacter amnigenus 99.75% 15 KF032798 C.Oil+






LGM86 Corynebacterium xerosis 99.75% 13 KF032804 C.Oil+

LGM87 Staphylococcus equorum 99.63% 6 KF032805 C.Oil+

LGM88 Staphylococcus equorum 100% 6 KF032806 C.Oil+


LGM90 Bacillus thuringiensis 99.49% 8 KF032808 C.Oil+

LGM91 Staphylococcus succinus 99.87% 6 KF032809 C.Oil+



LGM94 Staphylococcus warneri 99.87% 7 KF032812 C.Oil+

LGM95 Bacillus subtilis 100% 5 KF032813 C.Oil+

LGM96 Staphylococcus warneri 100% 7 KF032814 C.Oil+


116

Figure 25: Carte d’Algérie, région d’échantillonnage de sol contaminé par les

hydrocarbures – Raffinerie d’Arzew- ORAN (Ladji et al., 2010).

Figure 26: Gel d’électrophorèse des produits PCR d’ADNr16S des souches

sélectionnées.

M: SmartLadder 10000 bp DNA, P: Contrôle positif Pseudomonas sp. EEM 50,

C- : Contrôle négatif (échantillon sans ADN), 1: souche LGM 52, 2: LGM 79, 3: LGM 92,

4: LGM 59, 5: LGM 84, 6 : LGM 1.

ORAN ARZEW

1 2 3 4 5 6 7 C- P M

1500 bp

1000 bp

800 bp

600 bp

400 bp

200 bp


117

Pro

teo

ba

cte

ria

Firm

icu

tes

Actin

ob

ac

teria

Pseudomonas auricularis AB680413

Pseudomonas trivialis DQ536517

Pseudomonas poae HQ898902

Pseudomonas poae GU188952

Pseudomonas grimontii FJ005054

Pseudomonas brenneri HQ824860

Pseudomonas libanensis JQ014183

Pseudomonas lini EU169168

3643 Pseudomonas teessidea HQ003439

63 Pseudomonas fluorescens JQ336977

Pseudomonas veronii HQ824863

63 Pseudomonas veronii HQ824944

Pseudomonas corrugata HQ407237

42 Pseudomonas fluorescens AY267197

Pseudomonas fluorescens GU198115

Pseudomonas gessardii JF766369

36 OTU1 LGM76

OTU2 LGM35 Gammaproteobacteria

Pseudomonas syringae D84026

67 OTU17 LGM59

Pseudomonas sp. 122 EU003535

Pseudomonas fluorescens GU198121

99 Pseudomonas sp. A10.1(2011)HQ412501

63 Pseudomonas poae HQ898909

Nannospalax galili (Upper Galilee mountains blind mole rat)JO020273

98 Pseudomonas fluorescens JQ361752

Pseudomonas sp. SV3 AF251333

Acinetobacter lwoffii AM293675

Acinetobacter sp. TM6 6 DQ279315

99 Acinetobacter lwoffii DQ328322

99 OTU9 LGM33

Rahnella aquatilis DQ440548 99

98

92

98 98

Rahnella sp. D FJ386501

OTU12 LGM24

Enterobacter sp. 15 FJ587228

OTU15 LGM80

Proteus vulgaris FJ799903

99 Proteus mirabilis HQ398231

uncultured Hyphomicrobiaceae bacterium EF018179

67 Brevundimonas diminuta HE575935

99 OTU4 LGM83

OTU3 LGM60

Alphaproteobacteria

Enterococcus faecium HM638426 99

Enterococcus durans GQ421476

Enterococcus faecium FJ870986

Enterococcus sp. A1 DQ376914

OTU5 LGM4 62

65 Bacillus subtilis JN004058

Bacillus amyloliquefaciens HQ256522

Enterococcacae

99 Geobacillus sp. RSNPB7 HM588147

Bacillus amyloliquefaciens JQ342907

Bacillales

59 55 43 Bacillus subtilis GQ872186

Bacillus sp. 4828 JN874809

94 Bacillus sp. SXMCr-4 JN606323

90 OTU8 LGM72

41 Bacillus sp. SAFN-018 AY167812

99 Carnobacterium sp. KOPRI80155 JN873179

99 OTU10 LGM61

Lactobacillales

67 Staphylococcus pasteuri EU379258

89 OTU7 LGM94

Staphylococcus pasteuri JQ085395

87 99 Staphylococcus sp. SX4 JN029836

OTU6 LGM87

44 Staphylococcus succinus JN411418

99 Kocuria sp. Z21zhy AM418389

86 Kocuria sp. B1 EU196518

Kocuria sp. SGb392 HQ224638 97

85 OTU14 LGM39

74 Kocuria sp. CCBAU 10913 JF772568

Actinobacteridae 93 OTU16 LGM57

uncultured Corynebacterium sp.GQ424180

99 99 OTU13 LGM68

Agrococcus sp. 8 1Kb EF540451

99 Agrococcus sp. m4-6 HM587914

78 OTU11 LGM56

0.02

Les arbres ont été générés avec 1000 répétitions et les pourcentages (%) au niveau des nœuds représentent les valeurs

de probabilité de la robustesse de la similitude. Bar = 0.02 substitution de nucléotides par site.

Figure 27: Arbre phylogénétique par la méthode Neighbor-joining basée sur les séquences

d’ADNr16S repésentés par des OTUs affiliées aux Protéobactéries, Firmicutes et Actinobactéries

isolées du sol contaminé par les hydrocarbures et des espèces apparentées du BLASTn database.


118

Pro

teo

bac

teria

F

irmic

ute

s

Les arbres ont été générés avec 1000 répétitions et les pourcentages (%) au niveau des nœuds représentent les valeurs de

probabilité de la robustesse de la similitude. Bar = 0.05 substitution de nucléotides par site.


des souches LGM affiliées aux Protéobactéries et Firmicutes isolées du sol contaminé par les

hydrocarbures et des espèces apparentées du BLASTn database.

LGM 35 Pseudomonas extremorientalis KMM 3447 LGM 36 Pseudomonas meridiana CMS 38 Pseudomonas antarctica CMS 35

LGM 29 Pseudomonas veronii CIP 104663 Pseudomonas trivialis P 513/19 Pseudomonas poae P 527/13 LGM 38 Pseudomonas lurida : DSM 15835 Pseudomonas costantinii CFBP 5705 Pseudomonas tolaasii LMG 2342 LGM 25

LGM 10 Pseudomonas fragi ATCC 4973 Pseudomonas psychrophila E-3

LGM 12 Pseudomonas lundensis ATCC 49968

Pseudomonas brenneri strain CFML 97-391 Pseudomonas proteolytica CMS 64

Pseudomonas panacis CG20106 Pseudomonas migulae CIP 105470 LGM 30 LGM 2 LGM 5 LGM 14 LGM 27 LGM 26 LGM 20 LGM 40 LGM 48 LGM 31 LGM 22

Pseudomonas gessardii CIP 105469 Pseudomonas libanensis CIP 105460 LGM 11 Pseudomonas cedrina subsp. fulgida : DSM 14938 LMG 21467 Pseudomonas cedrina CFML 96-198

Acinetobacter radioresistens DSM 6976 Acinetobacter venetianus ATCC 31012

LGM 7 Acinetobacter lwoffii DSM 2403

LGM 24 Serratia fonticola DSM 4576

Serratia proteamaculans DSM 4543 Serratia grimesii DSM 30063

Bacillus subtilis subsp. subtilis DSM 10 Bacillus vallismortis DSM11031 Bacillus atrophaeus JCM9070 Bacillus amyloliquefaciens NBRC 15535 LGM 8 LGM 4

Gammaproteobacteria

Bacillales

Firm

icu

tes

Pro

teo

bac

teria


119

Figure 29: Gel d’électrophorèse des produits PCR d’AlkB des souches sélectionnées.

M: SmartLadder 10000 bp DNA, P: Contrôle positif : Marinobacter carbonocalsticus

(EEM48), 1: souche LGM2, 2: LGM5, 3: LGM14, 4: LGM25, 5: LGM22, 6: LGM 27,

7: LGM26.

Figure 30: Gel d’électrophorèse des produits PCR de NahAc des souches sélectionnées.

M: SmartLadder 10000 bp DNA, P: Contrôle positif : Alcaniorax sp. EEM25, C- : Contrôle négatif, 1:

souche LGM 1, 2: LGM 52, 3: LGM 2, 4: LGM 3, 5: LGM 4, 6: LGM 7: LGM 53, 8: LGM 6, 9 :

LGM 54, 10 : LGM 55, 11 : LGM 7, 12 : LGM 8, 13 : LGM 10, 14 :LGM9.

1 2 3 4 5 6 7 P M

1000 bp

800 bp

600 bp

400 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 P C- M

1500 bp

1000 bp

800 bp

600 bp

400 bp

200 bp


120

Figure 31: Gel d’électrophorèse des produits PCR de NidA des souches sélectionnées.

M: SmartLadder 10000 bp DNA, P: Contrôle positif Rhodococcus sp. (Cd1), C- : Contrôle négatif,

1: souche LGM 2, 2: LGM 4, 3: LGM 7, 4: LGM 8, 5: LGM 9, 6: LGM 10, 7: LGM 11, 7:LGM 12.

1 2 3 4 5 6 P 7 C- M

1500 bp

1000 bp

800 bp

600 bp

400 bp

200 bp


121

Tableau 18: Résiduels hydrocarbures aromatiques polycycliques (mg/L) et % de

biodégradation par les souches sélectionnées. HAPs à haut poids moléculaire (50 mg/L)

et HAPs à bas poids moléculaire (100 mg/L) après 30 jours de culture.

Phénanthrène

Pyrène

Benzo [a] Pyrène

Contrôle

s moyenne concentration résiduelle (mg/l) / écart type % Biodégradation

moyenne concentration résiduelle (mg/l) / écart type % Biodégradation

moyenne concentration résiduelle (mg/l) / écart type % Biodégradation

T0 217,58 ± 0,2

230,58 ± 0,6

193,27 ± 0,04

AB 133,25 ± 0,8

48,29 ± 0,4

173,92 ± 1,2

Souches

LGM 2 116,63 ± 2,1 7,63 ± 0,9 35,74 ± 0,7 9,61 ± 0,5 146,45 ± 0,3 15,37 ± 0,1

LGM 10 109,94 ± 0,01 11,51 ± 0,007 35,38 ± 0,6

10,14 ± 0,4 150,3 ± 1,2 13,62 ± 0,6

LGM 12 111,58 ± 1,7 9,96 ± 0,8 36,62 ± 2,21 8,93 ± 1,6 146,28 ± 1,7 14,96 ± 1

LGM 8 122,31 ± 0,03 5,67 ± 001 38,72 ± 0,5 7,89 ± 1,02 120,76 ± 0,8

28,74 ± 0,4

LGM 4 131,35 ± 0,9 2,03 ± 1,7 39,95 ± 0,5 6,73 ± 0,7 114,67 ± 1,04

31,49 ± 0,5

LGM 60 132,31 ± 0,4 0 ± 0 39,79 ± 0,9 6,78 ± 0,7 117,74 ± 3,7

31,63 ± 1,9

LGM 7 125,42 ± 1,3 3,59 ± 1,3 39,38 ± 0,7 7,42 ± 1,4 118,98 ± 3,7 30,13 ± 2,6

LGM 11 127,27 ± 0,7 2,75 ± 0,3 38,8 ± 0,2 7,83 ± 0,1 111,67 ± 3,2 33,93 ± 1,7

AB: contrôle abiotique


122

ND : non dégrader

AB: contrôle abiotique

Contrôles

Pristane

moyenne concentration

résiduelle (mg/l) / écart type % Biodégradation

Octadécane



Squalène



T0 533,54 ± 9,8

341,1 ± 1,06

368,88 ± 0,62

AB 435,6 ± 0,4

340,49 ± 0,91

380,94 ± 3,92

Souches

LGM 2 277,39 ± 0,9 29,65 ± 0,45 326,94 ± 0,31 4,47 ± 0,09 369,18 ± 1,49 1,44 ± 0,88

LGM 5 262,57 ± 3,7 32,42 ± 1,05 323,61 ± 0,36 4,95 ± 0,1

354,34 ± 6,62 3,94 ± 2,56

LGM 14 272,55 ± 2,5 30,56 ± 1,09 327,34 ± 0,52 4,68 ± 0,15 365,7 ± 1,83 3,18 ± 2,2

LGM 25 266,52 ± 1,5 31,68 ± 0,82 324,28 ± 0,5 5,25 ± 0,14

371,16 ± 2,77 0,69 ± 0,74

LGM 22 252,09 ± 2,4 a

35,11 ± 0,45 333,65 ± 1,93 ND 358,65 ± 6,08 4,46 ± 1,64

LGM 27 270,9 ± 0,9 31,53 ± 0,18 304,17 ± 2,65 13,29 ± 0,77 361,11 ± 1,18 2,1 ± 0,67

LGM 26 244,59 ± 0,01 a

33,25 ± 3,82 324,14 ± 1,93 5,51 ± 0,56 379,79 ± 6,97 ND

LGM 20 242,58 ± 0,4 a

34,41 ± 0,08 320,72 ± 1,28 7,11 ± 0,37 364,04 ± 0,8 1,5 ± 0,41

LGM 30 303,57 ± 2,9 23,47 ± 0,56 321,14 ± 1,03 6,15 ± 1,03 349,49 ± 5,32 8,22 ± 9,7

LGM 40 288,77 ± 10,8 27,51 ± 2,02 336,16 ± 3,76 ND 371,46 ± 4,78 ND

LGM 36 313,96 ± 1,6 22,8 ± 0,31 327,8 ± 1,72 4,18 ± 0,5

362,53 ± 1,81 ND

LGM 48 327,59 ± 1,6 20,24 ± 0,31 328,76 ± 2,42 6,84 ± 0,71 370,14 ± 1,32 ND

LGM 38 308,74 ± 1,1 23,77 ± 0,21 320,19 ± 1,08 6,16 ± 0,32 380,52 ± 0,45 ND

LGM 29 294,34 ± 0,5 26,47 ± 0,1 320,46 ± 1,08 5,87 ± 0,45

370,95 ± 3,85 ND

LGM 31 314,5 ± 0,5 22,69 ± 0,1 332,3 ± 1,68 2,84 ± 0,86

322,54 ± 28,54 21,33 ±,21,75

LGM 35 300,86 ± 5,9 25,25 ± 1,12 322,38 ± 4,2 6,56 ± 1,23 367,2 ± 4,07 1,24 ± 1,13

Tableau 19: Résiduels alcanes (mg/L) et % de biodégradation par les souches

sélectionnées. (250mg/L) après 21 jours de culture.


123

Figure 32: Histogramme montrant la biodégradation (%) des aromatiques utilisés dans

cette étude par les souches les plus performantes.

Figure 33: Histogramme montrant la biodégradation (%) des alcanes utilisés dans cette

étude par les souches les plus performantes.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

LGM2 LGM10 LGM12 LGM8 LGM4 LGM60 LGM7 LGM11

% Biodégradation du Benzo[a]Pyrène

% Biodégradation du Pyrène

% Biodégradation du Phénanthrene

05

10152025303540

LGM

2

LGM

5

LGM

14

LGM

25

LGM

22

LGM

27

LGM

26

LGM

20

LGM

30

LGM

40

LGM

36

LGM

48

LGM

38

LGM

29

LGM

31

LGM

35

% Biodegradation de l'Octadécane

% Biodegradation du Pristane

% Biodegradation du Squalène

Chapitre III

CONCLUSIONS GÉNÉRALES & PERSPECTIVES

Conclusions et perspectives

125

L’objectif de notre travail était ambitieux puisqu’il visait à établir des relations entre la

composition (culture simple ou consortium) des bactéries sélectionnées, leur bagage

génétique permettant l’oxydation initiale des principaux types d’hydrocarbures et les

capacités de dégradation des hydrocarbures par ces bactéries hydrocarbonoclastes. Le

principal but était d’explorer la diversité des bactéries capables de dégrader les hydrocarbures

pétroliers à partir de la station de raffinerie d’Arzew afin de caractériser la réponse de

communautés bactériennes à une contamination pétrolière. Dans cette perspective, nous avons

abordé différents axes de recherche :

I) L’élaboration d’une collection de souches à partir de la flore tellurique autochtone.

II) L’identification par des méthodes ADN des bactéries hydrocarbonoclastes afin de mettre

en interactions les communautés associées à des concentrations élevées en hydrocarbures

pétroliers choisis.

III) Le suivi de la biodégradation par chromatographie en réponse à une contamination

pétrolière afin de mesurer la capacité de dégradation des bactéries sélectionnées en réponse à

l’effet polluant ou stimulant de l’hydrocarbure.

IV) L’étude et détection de gènes fonctionnels impliqués dans la dégradation des

hydrocarbures choisis chez les bactéries sélectionnées afin de mettre en évidence des

mécanismes adaptatifs mis en place par certaines bactéries en réponse à la contamination.

V) Dépôt des séquences de l’ADNr16S dans une banque universelle.

Cette étude a été menée sur les communautés bactériennes présentes dans les sols de la

raffinerie de la région d’Arzew en Algérie. Ces sols sont soumis depuis plusieurs décennies à

une contamination en hydrocarbures chronique et élevée. Ils constituent ainsi un modèle de

choix pour comprendre les mécanismes microbiens impliqués dans la réponse à la présence

d’hydrocarbures. En effet, ces populations bactériennes sont supposées posséder les systèmes

enzymatiques permettant de répondre à la contamination.

Afin de mettre en évidence la réponse adaptative précoce, un intérêt tout particulier a été

apporté aux composés récalcitrants (alcanes ramifiés et aromatiques lourds) et à l’étude des

mécanismes mis en place par la communauté bactérienne pendant quelques semaines (2 à 4)

selon la contamination.

Ces différentes études ont fait appel à l’utilisation de techniques de biologie moléculaire afin

d’accéder à l’identification précise des microorganismes dominants (extraction ADN, PCR,

séquençage, analyse par bioinformatique, élaboration d’arbres phylogénétiques et dépôt de

séquences dans la banque de données universelle ‘GenBank’) couplées à des méthodes

analytiques chimiques (CPG/FID et TLC/FID) permettant le dosage résiduel des

hydrocarbures.

L’atténuation naturelle d’une pollution désigne l’ensemble des processus qui concourent à la

réduction de la pollution sur le site considéré. Il s’agit essentiellement de la migration des

polluants sous toutes leurs formes, mais aussi de la biodégradation.


126

L’évaluation de l’atténuation naturelle dans un site pollué défini est un objectif essentiel. En

effet, elle vise à prévoir le devenir de cette pollution pour en tirer les conclusions relatives aux

actions à entreprendre. D’autre part, si une action de réhabilitation doit voir le jour, elle

permet de proposer un type de traitement et ses modalités principales.

Plusieurs points de conclusion peuvent être tirés de ce travail :

Méthode d’étude de la diversité microbienne des microflores

Une méthode basée sur le séquençage des échantillons d’ADNr 16S de la population

bactérienne a été principalement utilisée pour étudier la biodiversité microbienne des

microflores dégradatrices. Cette méthode permet une analyse fine de la diversité des

environnements complexes, en multipliant le nombre de séquences analysées.

L’échantillonnage effectué doit en effet être suffisamment important pour donner une bonne

image de la diversité. Il convient également de porter un intérêt particulier à l’échantillonnage

à la méthode de conservation des échantillons, ainsi qu’aux protocoles adaptés pour

l’éxtraction de l’ADN.

Mesure des capacités de dégradation des microflores

Une approche méthodologique reprenant en partie celle qui avait été mise au point pour

mesurer les capacités de dégradation des microflores vis-à-vis de l'essence a été utilisée

(Solano-Serena et al., 1999). Le test de mesure des capacités de dégradation sur les

hydrocarbures est conduit en présence d’oxygène. Le pétrole et rejet industriel sont alors

l’unique source de carbone disponible pour la microflore bactérienne. La mise au point du test

a consisté à optimiser deux facteurs : la quantité initiale de substrat choisis et le mode

d’apport de la microflore bactérienne. La microflore bactérienne a été introduite sous forme

d’interaction simple d’une part et complexe (consortuim) d’autre part. Le paramètre suivi au

cours de l'incubation est la concentration des hydrocarbures résiduels. La méthodologie

utilisée s'est avérée tout à fait pertinente puisque le taux de recouvrement des hydrocarbures

mesuré sur les fioles abiotiques après incubation est généralement supérieur à 80 %.

L’utilisation d’un standard interne (nC19) pour le dosage des hydrocarbures résiduels par

CPG/FID permet une bonne estimation de ces derniers (Vinas et al., 2002).

La séparation des principales familles d'hydrocarbures obtenue par TLC/FID en

utilisant des microcolonnes de silice est convenable pour accéder aux informations concernant

la biodégradabilité intrinsèque des différentes familles chimiques du pétrole. Même s’il est

possible de déterminer une réponse spécifique moyenne pour des familles de composés tels

que les composés saturés (alcanes) et les hydrocarbures aromatiques, il existe à l'intérieur de

chaque famille une variation significative de l'indice de réfraction pour les hydrocarbures

considérés individuellement (Brito et al., 2006). En effet en l'état actuel, la technique de

TLC/FID ne peut donc fournir que des informations globales sur les classes structurales des

composés qui sont dégradés ou qui, à l'inverse, sont récalcitrants. Les progrès attendus de la

CPG/FID dans les années futures devrait permettre d’atteindre cet objectif, dès lors que la

détection par spectrophotométrie de masse sera utilisable GC/MS.


127

Biodégradabilité intrinsèque du pétrole et ses dérivés

Plusieurs études avaient déjà été effectuées sur la biodégradabilité d'un produit pétrolier tel

que le pétrole et ses dérivés qui constituent des polluants potentiels des eaux et des sols. Les

performances de dégradation obtenues ici en utilisant des perélèvements de la flore téllurique

de sols contaminés corroborent avec les résultats précédemment publiés par Marquez-Rocha

et al. (2001), une biodégradabilité moindre s’explique par l’accessibilité restreinte des micro-

organismes pour les hydrocarbures les plus lourds. Nos résultats indiquent que le groupe

Gamma-Protéobactéries était le principal acteur de cette dégradation, Pseudomonas sp.

groupe bactérien majoritaire spécifique adapté à la pollution aux hydrocarbures pétroliers

(Rocha et al, 2011) a la capacité de métaboliser (en culture simple) certains hydrocarbures

récalcitrants (alcanes ramifiés tel le Pristane à 35.11% et les aromatiques lourds tel le

Benzo[a]Pyrène à 33.93%) et de cométaboliser (en consortium) les différentes fractions du

pétrole brut à 50.44% pour les saturés et à 30.42% pour les aromatiques polycycliques.

La récalcitrance relative des différents hydrocarbures présents dans le pétrole est illustrée par

les différents tests de dégradation effectués individuellement au cours de cette étude.

Les hydrocarbures récalcitrants sont principalement les alcanes branchés et les aromatiques

(Rontani et al., 1986). Ceci a été vérifié avec certains composés branchés repérables sur les

chromatogrammes CPG/FID tels que le Pristane. En effet, la dégradation de ceux-ci est

beaucoup plus lente que celle des n-alcanes.

Ces données ont également été confirmées par l’utilisation de la TLC/FID, la

détermination qualitative et quantitative des hydrocarbures selon leur nombre d’atomes de

carbone et leur famille chimique ainsi sur la comparaison des cartographies d’échantillons

restent des éléments importants pour juger de l’efficacité de dégradation d’un type de

microflore. Les composés les plus réfractaires à la biodégradation sont des composés saturés

(cyclo et iso-alcanes) contenant entre C16 et C23 atomes de carbone et les aromatiques lourds à

plus de quatre-benzène (Thangaraj et al., 2008).

Composition des microflores dégradatrices

La méthode basée sur le séquençage des gènes codant l’ARNr 16S a été utilisée pour étudier

la diversité de la microflore bactérienne du sol contaminé. La banque « Bacteria » a été

analysée pour la microflore sol et recense 17 OTUS. Le groupe prédominant dans la banque

de clones d’ADNr 16S est celui des Protéobactéries, constituant 67 % des séquences

obtenues. La classe des Gamma-Protéobactéries est la plus abondante. Des résultats

similaires ont été obtenus lors de l’étude de la diversité microbienne d’une boue de station

d’épuration où les Protéobactéries représentaient 60 % des OTUs retrouvées (Chouari, 2003).

Ce groupe phylogénétique est d’ailleurs reconnu comme un élément très important des

écosystèmes tels que les boues de stations d’épuration (Snaidr et al., 1997).

La prévalence des bactéries à Gram négatif, et en particulier des Protéobactéries, dans la

microflore de sol pollué, est en accord avec les résultats précédemment décrits dans la

littérature (Margesin et al., 2003). Ceci peut nous laisser supposer que les Protéobactéries

jouent un rôle important dans la dégradation des hydrocarbures. L’analyse phylogénétique a

également permis de mettre en évidence la présence de division ayant peu de représentants

cultivables, comme les Firmicutes (24.18%) et les Actinibactéries 7.3%).


128

L’utilisation de différents substrats, représentatifs des grandes classes structurales intervenant

dans la composition du pétrole, a permis la sélection de micro-organismes particuliers à

chaque microflore adaptée. En effet, chaque genre bactérien sélectioné présente une

composition en OTUs qui lui est propre.

Détection de gènes de dégradation

Dans une optique de bioremédiation, l’analyse fonctionnelle des microflores, et donc des

gènes intervenant dans les processus de dégradation est un paramètre clé, Il existe à ce jour

peu d’informations sur la prévalence et la distribution géographique des populations

dégradant les hydrocarbures (Margesin et al., 2003; Sotsky et al., 1994).

Lors de cette étude, différents gènes intervenant dans l’attaque initiale des hydrocarbures ont

été choisis. Il s’agit des gènes alkB, nahAc et nid A. La grande diversité de ces gènes rend

difficile leur détection au sein de microflores complexes ou de souches isolées. En effet, il a

été montré que leur séquence nucléotidique est très peu conservée (Paisse et al., 2011).

Il est cependant intéressant de remarquer que le gène alkB était présent chez 16 espèces de

Pseudomonas sp. Pour les gènes nahAc et le nid A, on a rencontré des difficultés à les

détecter chez les souches sélectionnées. Ces observations confortent le manque certain de

connaissance dont nous disposons pour étudier les gènes de dégradation. Les gènes

recherchés peuvent alors : i) ne pas être détectés (manque de sensibilité de la méthode, trop de

divergence avec les amorces utilisées), ii) ne pas être présents au sein des microflores de

souches isolées.

Beaucoup de voies métaboliques de dégradation empruntées sont en effet encore inconnues.

Ce ne sont par ailleurs pas forcément les micro-organismes les plus représentés dans les

banques des souches bactériennes identifiées par l’ADNr 16S qui sont les plus actifs au sein

d’un écosystème. Les capacités de dégradation sont probablement dispersées au sein de ces

microflores. Beaucoup de gènes identifiés jusqu'à maintenant semblent par ailleurs situés sur

des plasmides. Il existe probablement de nombreux cas de transferts horizontaux entre

microorganismes qui favoriseraient le transfert des capacités de dégradation au sein d’une

microflore. Il est également évident, que

i) les couples d’amorces développés ici ne permettent pas forcément la détection des gènes

choisis pour l’étude,

ii) la séquence de nombreux gènes de dégradation est encore inconnue,

iii) les informations sur l’organisation des gènes de dégradation au sein de la cellule ne sont

pas forcément connues,

iv) l’impact réel des phénomènes d’interactions entre souches comme le cométabolisme reste

difficile à évaluer.

Tous ces éléments limitent encore la mise en évidence de relations entre gènes de

dégradation et performances des microflores et donc la compréhension du fonctionnement de

communautés bactériennes complexe dégradant les hydrocarbures. L’efficacité de la

biodégradation des microflores est liée à la présence de voies métaboliques particulières chez

certains micro-organismes et à la coopération entre les différents micro-organismes

composant ces microflores. Ainsi, la caractérisation de nouveaux gènes et donc la mise en

évidence de mécanismes adaptatifs nous permettrait de mieux appréhender la réponse des

communautés bactériennes à une contamination pétrolière.


129

Les informations disponibles sur les enzymes impliquées dans les voies de dégradation

des HAPs sont assez fragmentaires, sauf pour les HAPs modèles comme le phénanthrène ou

le naphtalène (Seo et al., 2009). De plus, celles-ci ne sont disponibles que pour des

microorganismes généralement cultivables et isolés. Or les microorganismes épurateurs

agissent le plus souvent en consortia au sein des environnements pollués, et beaucoup d’entre

eux ne peuvent être isolés et étudiés facilement. De plus, ces consortia possèdent des

capacités de dégradation plus importantes que les microorganismes isolés (Molina et al.,

2009; Vila et al., 2010). Obtenir plus d’informations sur ces consortia permettrait de franchir

une nouvelle étape dans la compréhension des capacités de biodégradation des HAPs, et donc

d’améliorer les techniques de bioremédiation.

L’évaluation de la bioremédiation peut être étudiée par les techniques d’empreintes

génétiques appliquées aux gènes de dégradation. Le polymorphisme des gènes considérés est

alors détecté par restriction enzymatique et examen des profils de restriction après

amplification génique. Enfin, l’avènement des approches indépendantes de la culture

(métagénomique) pourrait donner un nouvel élan à des approches d’isolement des

microorganismes, qui représentent le moyen le plus direct et le plus opérationnel de tirer parti

sur le plan biotechnologique de la richesse microbiologique à partir d’échantillons

d’environnement pollué.

Chaque méthode apporte un éclairage partiel de la diversité des communautés bactériennes et

leur combinaison est susceptible de fournir une image plus réaliste de sa complexité

(Bombach et al., 2010; Hill et al., 2000).

D’un point de vue plus appliqué, les résultats obtenus pourraient permettre de développer des

outils de diagnostic et de suivi des sites contaminés par les hydrocarbures pétroliers ou rejet

industriel. Connaissant les séquences d’ADNr 16S des bactéries dégradant les HAPs et les

alcanes, on peut envisager de les détecter in situ par qPCR en fonction des conditions

environnementales.

Les études de biodégradabilité de produits tels que les produits pétroliers ont pour but de

répondre à une série de questions. Elles doivent notamment donner la possibilité de pouvoir

juger, en cas de déversements accidentels, si les chances d’atténuation naturelle de la

pollution sont réelles. La microflore indigène de sol et aquatique sur laquelle survient un

déversement constitue l’acteur principal du processus d’atténuation naturelle. C’est la raison

pour laquelle, il est important d’avoir une bonne vision des relations existant entre la

composition bactérienne d’une microflore et son aptitude à dégrader le polluant. Appliqué à la

gestion des bassins de traitement des eaux rejetées polluées, un tel suivi permettrait de mieux

comprendre le système de traitement des eaux contaminées par les hydrocarbures pétroliers et

d’améliorer l’efficacité du traitement par bioremédiation.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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