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AMIN AHMED OUAMEUR
Caractérisation de la famille des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT) chez le parasite protozoaire
Leishmania
Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de doctorat en microbiologie-immunologie pour l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
FACULTE DE MEDECINE UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2011
©Amin Ahmed Ouameur, 2011
11
Résumé La leishmaniose est une maladie causée par des parasites appartenant au genre
Leishmania. Elle est transmise à l'homme par la piqûre d'un insecte vecteur et est
endémique dans plus de 88 pays où approximativement 350 millions de personnes vivent
dans les zones à risque. À ce jour, aucun vaccin efficace n'est encore disponible pour
prévenir la leishmaniose et le traitement repose actuellement sur la chimiothérapie. Les
composés utilisés pour traiter la maladie sont limités et la plupart d'entre eux sont associés
à des problèmes comme le coût élevé du traitement, les effets secondaires et l'émergence
de souches de parasites résistantes aux médicaments. L'identification de nouvelles cibles
thérapeutiques pour le développement de molécules anti-Leishmania s'avère donc urgente.
La voie métabolique de l'acide folique constitue un champ thérapeutique potentiel d'autant
plus que la découverte chez Leishmania de 13 protéines appartenant à la famille de
transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT) permet d'envisager la possibilité de les
exploiter dans un but thérapeutique. Mis à part trois (FT1, FT5 et BT1), les fonctions des
autres protéines de la famille FBT sont inconnues et mon projet de doctorat avait comme
objectif principal de caractériser cette famille et de tenter de trouver des fonctions à ces
transporteurs.
Les objectifs spécifiques de cette thèse étaient 1) de déterminer le profil
d'expression des gènes de la famille FBT aux différentes phases de croissance chez les
deux stades de vie du parasite et chez des mutants résistants au methotrexate (MTX); 2) de
caractériser la fonction d'un nouveau membre de la famille FBT qui était réarrangé chez
des mutants résistants à la sinéfungine (SNF); et 3) d'étudier la localisation subcellulaire
des différents membres de la famille FBT et de quelques protéines de la famille des
transporteurs mitochondriaux (MCF) dans le but d'identifier et de caractériser les
transporteurs de donneurs d'unités monocarbonées, localisés au niveau de la membrane de
la mitochondrie.
L'analyse du profil d'expression de la famille FBT a permis de montrer que
plusieurs gènes FBT sont exprimés préférentiellement en phase stationnaire de croissance,
tandis que seul FT1, le principal transporteur de folate, est exprimé préférentiellement en
I l l
phase logarithmique de croissance ce qui est en accord avec la forte accumulation de folate
durant cette phase de croissance. Aussi, il semblerait que les niveaux d'expression de FT1
dépendent aussi des niveaux de folate dans le milieu de culture. De plus, cette analyse a
permis d'identifier les mécanismes de recombinaison génique impliqués dans l'inactivation
de FT1 chez les souches hautement résistantes au MTX. Par ailleurs, la sélection des
mutants résistants au MTX et à la SNF a permis de caractériser un nouveau membre
(AdoMetTl) de la famille FBT. L'AdoMetTl correspond au transporteur de haute affinité
pour la S-adénosylméthionine. Finalement, les études de localisation protéique ont permis
de déterminer la localisation intracellulaire de trois protéines FBT ainsi que la localisation
mitochondriale des protéines de la MCF.
IV
Abstract
Leishmaniasis is a disease caused by protozoan parasites that belong to the genus
Leishmania. It is transmitted to humans by the bite of an insect vector and is endemic in
over 88 countries, where 12 million people are currently affected and approximately 350
million people are at risk. There is yet no effective vaccine available and treatments rely
exclusively on chemotherapy. The compounds used for the treatment of leishmaniasis are
limited and most of them are associated with problems such as the high cost of treatment,
side effects and the emergence of drug-resistant parasite strains. The discovery of new
therapeutic targets for the development of new anti-Leishmania molecules is thus urgently
needed. The folate metabolic pathway is a potential therapeutic target and the discovery of
a gene family of 13 proteins belonging to the folate/biopterin transporters (FBT) family in
Leishmania suggested new therapeutic strategies. With the exception of three transporters
(FT1, FT5, BTI), the functions of the other FBT proteins were unknown and the main
objective of this thesis was to characterize these transporters and find new functions.
The specific objectives of this thesis were 1) to determine the expression profile of
the FBT family genes during different growth phases and life stages of wild-type parasites
and in methotrexate (MTX)-resistant mutants; 2) to characterize the function of a new
member of the FBT family, which was rearranged in sinefungin (SNF)-resistant mutants;
and 3) to study the subcellular localization of the FBT family proteins and some members
of the mitochondrial carrier family (MCF) in order to identify and characterize the
mitochondrial transporters of one-carbon donors.
The expression profile analysis of the FBT family revealed that several FBT genes
were preferentially expressed in stationary growth phase, whereas only FT1, the main folate
transporter, was preferentially expressed in the logarithmic growth phase, the phase where
accumulation of folate is the highest. Also, it seems that FT1 expression levels are related
to folic acid concentration in the culture medium. Moreover, this analysis revealed that
recombination events are involved in the inactivation ofthe transporter FT1 in the highly
methotrexate-resistant mutants. The selection of mutants resistant to MTX and to SNF led
to the characterization of new members (AdoMetTl) ofthe FBT family. AdoMetTl is the
main high affinity S-adenosylmethionine transporter of Leishmania. Subcellular
localization experiments were useful for the intracellular localization of three FBT proteins
and the mitochondrial localization ofthe MCF proteins.
VI
À mes parents,
Vil
Avant-Propos
Remerciements
Tout d'abord, je tiens à exprimer toute ma gratitude à mon directeur de thèse, le Professeur
Marc Ouellette pour m'avoir accueilli dans son laboratoire, pour la confiance qu'il m'a
accordée tout au long de mon cheminement ainsi que pour l'attention avec laquelle il a
suivi ce travail.
J'adresse mes plus vifs remerciements aux Docteurs Ikram Guizani, Barbara Papadopoulou
et Dave Richard, pour l'honneur qu'ils me font en acceptant d'évaluer cette thèse.
Je remercie également les Instituts de Recherche en Santé du Canada (IRSC) pour leur
support financier.
De plus, j'associe à ces remerciements tous les membres de l'équipe MOU que j 'ai côtoyés
au cours de ces années pour leur soutien et surtout pour les moments de détente partagés
avec eux. Une mention spéciale pour Suzanne Avoine, Gaétan Roy et Dre Danielle Légaré.
Un merci particulier à Wilfried Moreira et Dominic Gagnon pour leur amitié et je
n'oublierai jamais ce qu'ils ont fait pour moi durant toutes ces années de doctorat.
Merci infiniment à mes parents qui m'ont toujours soutenu et encouragé à poursuivre des
études supérieures. Avec l'âge, j 'ai réalisé à quel point mes parents étaient des personnes
extraordinaires car ils ont tout sacrifié pour rendre la vie meilleure à leurs quatre enfants.
Un grand merci à mes deux frères Messaoud et Fouad ainsi qu'à ma sœur Hanane pour leur
fraternité exemplaire et leur soutien permanent.
Enfin, merci à mon épouse et l'amour de ma vie Sihem qui partage ma vie depuis déjà deux
ans. Elle a été très patiente avec moi durant ces deux années et m'a soutenu jusqu'à la fin de
ce travail. En plus, elle m'a amenée de la joie et de la richesse dans ma vie avec la
naissance de notre premier enfant, Yasmine.
vin
Contributions
Cette thèse de doctorat est présentée sous forme de thèse-articles. L'introduction générale
ainsi que la conclusion générale ont été rédigées en français. Les chapitres II, III et IV sont
écrits en langue anglaise pour permettre leur publication dans des journaux scientifiques
internationaux. Les références citées dans chaque article sont placées à la fin de celui-ci.
Les références de l'introduction générale ainsi que de la conclusion générale sont
regroupées et placées à la fin du manuscrit dans la section « Bibliographie ». La liste des
articles ainsi que la contribution de chacun des auteurs sont décrites ci-dessous.
Le manuscrit présenté au chapitre II, intitulé : "Functional analysis and complex gene
rearrangements of the folate/biopterin transporter (FBT) gene family in the protozoan
parasite Leishmania" a été publié dans la revue Molecular and Biochemical Parasitology.
J'ai conçu et réalisé la totalité des expériences présentées dans ce chapitre. Isabelle Girard a
supervisé les étapes d'extraction d'ARN et la synthèse de l'ADNc et a participé dans
l'analyse des résultats de PCR en temps réel. Danielle Légaré a collaboré dans l'étape de la
conception des oligonucleotides et des sondes TaqMan et l'optimisation de la RT-PCR
duplexe en temps réel.
Le manuscrit présenté au chapitre III, intitulé : "The high affinity S-adenosylmethionine
plasma membrane transporter of Leishmania is a member of the folate biopterin transporter
(FBT) family" a été publié dans la revue Journal of Biological Chemistry. Je suis co-
premier auteur dans ce travail. Toutes les étapes de clonage d''AdoMetTl ont été effectuées
par moi-même. Larbi Dridi a généré les cassettes pour l'inactivation génique d''AdoMetTl.
Les expériences que j 'ai effectuées se résument comme suit: Figures 1 et 2, Tableau 1
(IC50), Figure 3 (B et C), Figure 4, Figure 6 et Figure 8. La contribution de Larbi Dridi se
résume comme suit: Tableau 1 (Km et Fmax), Figure 3 (A), Figure 5 et Figure 7.
Le manuscrit présenté au chapitre IV, intitulé: "Intracellular localization of folate/biopterin
transporter (FBT) and mitochondrial carriers family (MCF) proteins in Leishmania''' sera
bientôt soumis pour publication. La grande majorité de clonages et les transfections ont été
effectuées par moi-même. J'ai également effectué les analyses de microscopie à
fluorescence de tous les transfectants. Jean-François Ritt a participé dans le clonage de
IX
quatre gènes FBT (LinJ04.0020-GFP, LinJ10.0390-GFP, LinJ10.1450-GFP et
LinJ35.5120-GFP). Danielle Légaré a contribué dans la révision de l'article.
Table des matières RÉSUMÉ II ABSTRACT iv AVANT-PROPOS VII TABLE DES MATIÈRES X LISTE DES FIGURES xm LISTE DES ABRÉVIATIONS XIV
CHAPITRE I. INTRODUCTION GÉNÉRALE 16
1.1 G É N É R A L I T É S SUR LE PARASITE LEISHMANIA 1 6 1.1.1 INTRODUCTION 16 1.1.2 ÉPIDÉMIOLOGIE ET DISTRIBUTION GÉOGRAPHIQUE 1 7 1.1.3 CYCLE DE VIE ET MORPHOLOGIE 1 9 1.1.4 L E S MANIFESTATIONS CLINIQUES 2 0 1.1.5 L E TRAITEMENT DE LA LEISHMANIOSE 2 2 1.1.5.1 L E S DÉRIVÉS D'ANTIMOINE PENTAVALENT ( S B V ) 2 3 1.1.5.2 PENTAMIDINE 24 1.1.5.3 AMPHOTÉRICINE B 24 1.1.5.4 MlLTEFOSINE 25 1.1.5.5 AUTRES FORMULATIONS 25 1.1.6 L E GÉNOME DE LEISHMANIA 26 1.1.6.1 SÉQUENÇAGE DU GÉNOME 26 1.1.6.2 RÉGULATION DE L'EXPRESSION GÉNIQUE 26
1.2 L E MÉTABOLISME MONOCARBONÉ 28 1.2.1 L E MÉTABOLISME DES FOLATES 2 8 1.2.1.1 INTRODUCTION 28 1.2.1.2 L A BIOSYNTHÈSE DE NOVO DU THF 30 1.2.1.3 RÔLES PHYSIOLOGIQUES DES FOLATES 3 1 1.2.2 L E MÉTABOLISME DE LA S-ADÉNOSYLMÉTHIONINE 3 4 1.2.2.1 INTRODUCTION 34 1.2.2.2 L E CYCLE DE LA METHIONINE ET LA BIOSYNTHÈSE DE L ' A D O M E T 3 5 1.2.2.3 RÔLE PHYSIOLOGIQUE DE L ' A D O M E T 3 6 1.2.3 PATHOLOGIES LIÉES À UNE CARENCE EN FOLATES 3 7 1.2.4 L E S ANTIFOLATES 3 8 1.2.4.1 DÉFINITION 3 8 1.2.4.2 CONTRE LE CANCER 3 8 1.2.4.3 CONTRE LES INFECTIONS BACTÉRIENNES 39 1.2.4.4 CONTRE LES INFECTIONS PARASITAIRES 3 9 1.2.4.6 RÉSISTANCE AUX ANTIFOLATES 4 0
1.3 L E M É T A B O L I S M E MONOCARBONÉ C H E Z LEISHMANIA 4 1 1.3.1 L E MÉTABOLISME DES PTÉRINES 4 1 1.3.1.1 L E TRANSPORT ET LA RÉDUCTION DES PTÉRINES 4 3 1.3.1.2 AUTRES ENZYMES DU MÉTABOLISME DES PTÉRINES 43 1.3.1.3 ROLE PHYSIOLOGIQUE DE LA BIOPTERINE CHEZ LEISHMANIA 4 4 1.3.2 L E MÉTABOLISME DES FOLATES 4 6 1.3.2.1 L A RÉDUCTION ET LA POLYGLUTAMYLATION DES FOLATES 4 6 1.3.2.2 RÔLE PHYSIOLOGIQUE DES FOLATES CHEZ LEISHMANIA 4 7 1.3.3 L E MÉTABOLISME DE LA 5-ADÉNOSYLMÉTHIONINE 4 9
XI
1.3.3.1 LA BIOSYNTHÈSE DE L'ADOMET PAR MAT2 49 1.3.3.2 RÔLE DE L'ADOMET CHEZ LEISHMANIA 50
1.4 LES ANTIFOLATES ET LEISHMANIA 51 1.4.1 LES MÉCANISMES DE RÉSISTANCE AU METHOTREXATE CHEZ LEISHMANIA 51 1.4.1.1 DIMINUTION DE L'ENTRÉE DU MTX 52 1.4.1.2 AMPLIFICATION GÉNIQUE DE LA DHFR-TS 53 1.4.1.3 AMPLIFICATION GÉNIQUE DE PTR1 53 1.4.1.4 ALTÉRATION DE LA POLYGLUTAMYLATION DU MTX 54
1.5 T R A N S P O R T DES DONNEURS D ' U N I T É S MONOCARBONÉES ( F O L A T E , A D O M E T ) 55 1.5.1 CHEZ LES BACTÉRIES 5 5 1.5.1.1 L E TRANSPORTEUR S L R 0 6 4 2 DE LA FAMILLE F B T 5 5 1.5.1.2 L E TRANSPORTEUR F O L T DE LA CLASSE DES TRANSPORTEURS E C F 5 7 1.5.1.3 L E TRANSPORTEUR DE LA S-ADÉNOSYLMÉTHIONINE 5 8 1.5.2 CHEZ LES LEVURES ET LES CHAMPIGNONS 5 9 1.5.2.1 L E TRANSPORTEUR S A M 3 5 9 1.5.2.2 L E TRANSPORTEUR S A M 5 P 6 0 1.5.3 CHEZ LES PROTOZOAIRES 6 1 1.5.4 CHEZ LES PLANTES 6 2 1.5.4.1 L E TRANSPORT DES FOLATES 6 2 1.5.4.2 L E TRANSPORT DE LA S-ADÉNOSYLMÉTHIONINE 6 3 1.5.5 CHEZ LES MAMMIFÈRES 6 4 1.5.5.1 L E TRANSPORT DES FOLATES 6 4 1.5.5.2 L E TRANSPORT DE LA S-ADÉNOSYLMÉTHIONINE 7 0 1.5.6 CHEZ LE VER NEMATODE CAENORHABDITIS ELEGANS 7 2
1.6 L E TRANSPORT DES PTÉRIDINES ET DE L ' A D O M E T C H E Z LEISHMANIA 7 3 1.6.1 L E TRANSPORTEUR B T 1 7 4 1.6.2 LES TRANSPORTEURS DES FOLATES ( F T 5 ET F T 1 ) 7 4 1.6.2.1 STRUCTURE SECONDAIRE DE F T 1 7 5 1.6.2.2 RÉGULATION DE L'EXPRESSION DE F T 1 7 6 1.6.3 L E TRANSPORT DE LA S-ADÉNOSYLMÉTHIONINE CHEZ LEISHMANIA 7 7
1.7 P R O B L É M A T I Q U E , HYPOTHÈSES ET O B J E C T I F S 7 8 1.7.1 PROBLÉMATIQUE 78 1.7.2 HYPOTHÈSES 78 1.7.3 OBJECTIFS 79
CHAPITRE II . ANALYSE FONCTIONNELLE ET RÉARRANGEMENTS GÉNIQUES COMPLEXES DES GÈNES DE LA FAMDLLE DES TRANSPORTEURS DE FOLATE ET DE LA BIOPTÉRINE (FBT) C H E Z LE PARASITE PROTOZOAIRE LEISHMANIA 81 2.1 RÉSUMÉ 81 2.2 ARTICLE 82
CHAPITRE III. LE TRANSPORTEUR DE LA S-ADÉNOSYLMÉTHIONINE DE HAUTE AFFINITÉ LOCALISÉ AU NTVEAU DE LA MEMBRANE PLASMIQUE DU PARASITE LEISHMANIA EST UN M E M B R E DE LA FAMILLE DES TRANSPORTEURS DE FOLATE ET DE LA BIOPTÉRINE (FBT) 114 3.1 RÉSUMÉ 114 3.2 ARTICLE 115
Xll
CHAPITRE IV. LOCALISATION INTRACELLULAIRE DES PROTÉINES DE LA FAJVflLLE DES TRANSPORTEURS DE FOLATE ET DE LA BIOPTÉRINE (FBT) ET DE LA FAMILLE DES TRANSPORTEURS MITOCHONDRIAUX (MCF) CHEZ LEISHMANIA 143 4.1 RÉSUMÉ 143 4.2 ARTICLE 144
CHAPITRE V. CONCLUSION GÉNÉRALE 168 5.1 DISCUSSION 168 5.2 CONCLUSIONS 182
BD3LIOGRAPHTE 184
Xlll
Liste des figures
Figure 1.1. Classification des espèces de Leishmania 17 Figure 1.2. Distribution géographique des leishmanioses 18 Figure 1.3. Cycle de vie du parasite Leishmania 20 Figure 1.4. Manifestations cliniques des différentes formes de leishmanioses 21 Figure 1.5. Organisation génique et maturation des messagers chez Leishmania 27 Figure 1.6. Structure chimique des différentes formes des folates et de l'antifolate
methotrexate 29 Figure 1.7. La biosynthèse de novo des ptérines et des folates 31 Figure 1.8. Rôle des folates dans le métabolisme monocarboné 33 Figure 1.9. Structure de la .V-adénosylmethionine (AdoMet), de la 5-adénosyl-
homocystéine (AdoHcy) et de la sinéfungine (SNF) 34 Figure 1.10. Le métabolisme de la methionine et de la 5-adénosylméthionine 36 Figure 1.11. Le métabolisme monocarboné chez le parasite Leishmania 42 Figure 1.12. Représentation de la structure secondaire du slr0642 56 Figure 1.13. Organisation schématique des transporteurs ECF 57 Figure 1.14. Modèle topologique des membres de la MCF 61 Figure 1.15. Topologle membranaire du transporteur de folate réduit 66 Figure 1.16. Structure secondaire prédite du PCFT 68 Figure 1.17. Structure secondaire prédite du transporteur folt-1 73 Figure 1.18. Topologie membranaire prédite du transporteur FT1 76
XIV
Liste des abréviations
ADN acide désoxyribonucléique AdoMet S-adénosylméthionine AdoHcy 5-adénosylhomocystéine AICARFT « aminoimidazolcarboxamide ribonucleotide formyltransferase » AQP1 aquaglycoprotéine 1 ARN acide ribonucléique ARNm ARN messager ATP adenine triphosphate AmB amphotéricine B BH2 dihydrobioptérine BH4 tétrahydrobioptérine BHMT bétaïne-homocystéineméthyltransférase BT1 « bioptérine transporter 1» Cl monocarboné CBS cystathionine P-synthase CGC complexe enzymatique du clivage de la glycine DHCH méthylènetétrahydrofolatedéshydrogénase/méthényltétrahydrofolate
cyclohydrolase DHF dihydrofolate DHFR dihydrofolate reductase DHFS dihydrofolate synthase DHPR dihydroptéroate reductase DHPS dihydroptéroate synthase dTMP desoxythymine monophosphate (thymidilate) dUMP desoxyuridine monophosphate (urydilate) ECF « energy-coupling factor » FBT « folate and bioptérine transporter » FTL formyl-tétrahydrofolate ligase FPGS folylpolyglutamate synthetase FRs « folate receptors » FT « folate transporter » yGCS y-glutamyl-cystéine synthase GARFT « glycinamide ribonucleotide formyltransferase » GGH gamma-glutamyl hydrolase GPI glycosylphosphatidylinositol GTP guanosinetriphosphate Hcy homocysteine IC50 « 50 % inhibitory concentration » Km constante d'affinité LDI « Leishmania DNA 1 » mM millimolaire MAT methionine adénosyltransférase MCF « mitochondrial carrier family »
XV
MFS MFT MTHFR MTX MS NADPH nM NO NOS pABA PCFT PTR1 qBH2 QDPR RFC SAHH SbV Sblll SHMT SLC THF TMP TS pM VIH Vmax
« major facilitator superfamily » méthionyl-tRNA formy-transferase méthyl tétrahydrofolate reductase methotrexate methionine synthase nicotinamide adenine dinucléotide phosphate nanomolaire « nitric oxyde » « nitric oxyde synthase » acide para-aminobenzoique « proton-coupled folate transporter » ptérine reductase 1 dihydrobioptérine quinonoi'de dihydrobioptérine quinonoi'de reductase « reduced folate carrier » .S-adénosylhomocystéine hydrolase antimoine pentavalent antimoine trivalent serine hydroxyméthyltransférase « solute carrier » tétrahydrofolate trimethoprim thymidilate synthase micromolaire virus d'immunodéficience humain vitesse maximale
16
Chapitre I. Introduction générale
1.1 Généralités sur le parasite Leishmania
1.1.1 Introduction
Le parasite Leishmania est un eucaryote unicellulaire appartenant à l'ordre des
Kinetoplastidae et à la famille des Trypanosomatidae. Ce protiste se transmet à l'homme
par la piqûre d'un insecte femelle, appelé phlébotome (ou mouche des sables), appartenant
au genre Phlebotomus ou Lutzomyia. Plusieurs espèces du genre Leishmania peuvent
infecter l'homme et causer des manifestations cliniques, ou des leishmanioses, allant des
formes cutanées qui guérissent spontanément aux formes viscérales, mortelles en l'absence
de traitement (140, 324). Initialement, la classification des espèces de Leishmania était
basée sur des critères extrinsèques comme les manifestations cliniques, la distribution
géographique et la morphologie. Des techniques de biologie moléculaire et biochimique ont
par la suite été utilisées pour mieux définir les espèces (183). Ainsi, les espèces de
Leishmania qui infectent les mammifères ont été classées en 2 sous-genres, Leishmania et
Viannia, selon la position des parasites au niveau de l'intestin du vecteur, tandis que celles
infectant les reptiles (e.g. L. tarentolae) appartiennent au sous-genre Sauroleishmania (Fig.
1.1). Le sous-genre Viannia comprend des espèces retrouvées uniquement dans le Nouveau
monde (e.g. L. braziliensis, L. panamensis) tandis que le sous-genre Leishmania comprend
des espèces retrouvées dans le Nouveau monde (e.g. L. mexicana) et l'Ancien monde (e.g.
L. infantum, L. major) (23). Pour ce qui est de la distribution du vecteur, le genre
Phlebotomus est prédominant dans l'Ancien monde alors que le genre Lutzomyia est
prédominant dans le Nouveau monde. Parmi les 500 espèces de phlébotomes connues,
seulement 31 ont été positivement identifiées comme vecteurs des espèces pathogènes de
Leishmania et 43 comme vecteurs potentiels (163, 164).
17
Ordre
Famille
Kinetoplastidae
I Trypanosomatidae
,1 i 1 1 i r 1 1 1 1
G e n r e Crithidia Leplomonas Herpetomonas Blastocrithidia Leishmania Sauroleishmania Trypanosoma Phytomonas Endotrypanum
, ' ' = = -Sous-genre Leishmania
i H—i 1 1 Complexe L. donovani L. tropica L. major L. aethiopica L. mexicana
Espèce i i i
L. archibaldi L. chagasi L. donovani L. infantum
L. killicki L, tropica
L. major L. aethiopica L. amazonensis L. gamhami L. mexicana L. pifanoi L. venezuelensis
— I Viannia
I I L. braziliensis L. guyanensis
I I L. braziliensis L. guyanensis L. peruviana L. panamensis
L. tarentolae
Figure 1.1. Classification des espèces de Leishmania. (Inspiré de (23)).
1.1.2 Epidemiologic et distribution géographique
La leishmaniose, une maladie dite négligée, est un problème de santé publique
majeur dans les pays pauvres du globe (4). La plupart du temps, la leishmaniose est
transmise à l'homme à partir d'animaux (leishmaniose zoonotique) mais il existe
néanmoins des formes transmises d'une personne à l'autre (leishmaniose anthroponotique)
comme dans le cas de l'Inde où l'homme à été identifié comme étant l'unique réservoir.
Les leishmanioses sont endémiques dans plusieurs pays situés dans les régions tropicales et
subtropicales du globe. On distingue deux grandes subdivisions géographiques, l'Ancien
monde (Afrique, Asie, Europe) et le Nouveau monde (Amérique du Nord, du Sud et
Centrale). La leishmaniose est endémique dans environ 88 pays où approximativement 350
millions de personnes vivent dans ces zones à risque (Fig. 1.2). On estime qu'environ 12
millions de personnes sont atteintes, avec une incidence annuelle de 500 000 nouveaux cas
de leishmanioses viscérales (90 % des cas se rencontrent en Inde, au Bangladesh, au Népal,
au Soudan et au Brésil) et entre 1 et 1.5 millions cas de leishmanioses cutanées (90 % des
cas se rencontrent en Afghanistan, en Algérie, au Brésil, en Iran, au Pérou, en Arabie
18
Saoudite et au Soudan) (79, 133). De plus, l'émergence des cas de co-infection
LeishmaniafVUî dans différentes parties du monde est un facteur qui vient aggraver la
situation. En effet, une infection au VIH augmente le risque de développer une
leishmaniose viscérale de 100 à 2000 fois dans les zones endémiques (3).
LEISHMANIASIS ^ - x ^ v - > i * ^
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mÊÊÊ '^••W^J V
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Visceral
Cutaneous / Mucocutaneous
Visceral + Cutaneous 1 Mucocutaneo
^ L 12 million people infected \M ^ f 350 million people at risk i B [ * r us
Figure 1.2. Distribution géographique des leishmanioses. (Tiré de (133)).
Les zones touchées par la leishmaniose viscérale sont indiquées en vert tandis que celles touchées par la leishmaniose cutanée sont indiquées en rouge. Les zones en violet sont autant touchées par les leishmanioses viscérales que cutanées.
19
1.1.3 Cycle de vie et morphologie
Les parasites Leishmania possèdent un cycle de vie dimorphique caractéristique de
l'hôte dans lequel ils évoluent (Fig. 1.3). Lorsqu'ils se trouvent dans le tractus digestif de
l'insecte vecteur, ils sont sous une forme dite promastigote, une forme allongée (15 à 20
um), flagellée et mobile. Lorsque le phlébotome se prépare à transmettre les parasites à un
hôte mammifère, les promastigotes se différencient à l'intérieur du tractus digestif de
l'insecte en passant du stade procyclique (phase de croissance rapide des promastigotes et
forme non infectieuse du parasite) vers le stade métacyclique (forme mature et infectieuse
du parasite) (325). Cette forme métacyclique est caractérisée par l'expression de protéines
spécifiques (221). Lors de la piqûre par le phlébotome les parasites métacycliques sont
inoculés dans l'hôte vertébré puis reconnus par les cellules du système immunitaire,
notamment les macrophages qui phagocytent les parasites opsonisés par les molécules du
complément. Une fois à l'intérieur du phagolysosome, les parasites se transforment au
stade amastigote, caractérisé par une apparence sphérique de plus petite taille (2 à 5 pm).
La différenciation de la forme promastigote métacyclique vers la forme amastigote est
induite par les changements de température et de pH (insecte : 25°C et pH neutre;
phagolysosome : 37°C et pH acide) (422). Il est possible de faire croître in vitro les divers
stades de differentiation de plusieurs espèces de Leishmania dans des milieux de culture
relativement complexes. Les amastigotes se multiplient dans le phagolysosome par
scissiparité jusqu'à l'éclatement de la cellule et vont ensuite coloniser d'autres
macrophages sains avoisinants. Le cycle de vie est complété lorsqu'un nouveau
phlébotome ingère les amastigotes libres dans le sang de l'hôte mammifère infecté lors de
son repas.
20
Uptake
0®
Proliferation In the midgut
Figure 1.3. Cycle de vie du parasite Leishmania. (Tiré de (133)).
La transmission de Leishmania à un hôte vertébré se fait par une piqûre de la mouche des sables. Ainsi, les parasites sous forme promastigotes sont injectés dans la circulation sanguine. Les promastigotes seront phagocytés par les macrophages puis, à l'intérieur du phagolysosome, se différencient en amastigotes. Ces derniers se multiplient par scissiparité jusqu'à l'éclatement de la cellule et iront infecter d'autres macrophages sains avoisinants ou seront ingérés à nouveau par un phlébotome afin de compléter le cycle.
1.1.4 Les manifestations cliniques
On distingue trois principales manifestations cliniques; la leishmaniose cutanée, la
leishmaniose mucocutanée et la leishmaniose viscérale (Fig. 1.4). Sur une vingtaine
d'espèces pathogènes du genre Leishmania, on peut globalement distinguer deux espèces à
tropisme viscéral (L. donovani et L. infantum), c'est-à-dire responsables de la leishmaniose
21
viscérale. Pratiquement toutes les autres espèces sont dermotropes, responsables de la
leishmaniose cutanée. L. braziliensis, et plus rarement L. panamensis, sont connues pour
leur localisation secondaire aux muqueuses faciales (140). Les manifestations cliniques ne
dépendent pas seulement de l'espèce de Leishmania en cause, mais également de la santé
immunitaire de l'hôte et de son profil génétique.
Figure 1.4. Manifestations cliniques des différentes formes de leishmanioses. (Tiré de (23)).
A, leishmaniose cutanée; B, leishmaniose mucocutanée; C, leishmaniose viscérale
La leishmaniose cutanée (Fig. 1.4 A) est causée par plusieurs espèces de
Leishmania de l'Ancien et du Nouveau monde (e.g. L. major, L. tropica, L. aethiopica, L.
mexicana, L. amazonensis, L. panamensis, L. guyanensis). La maladie est caractérisée par
une ulcération de la peau au niveau du site d'inoculation. La lésion peut évoluer en
quelques mois vers une guérison spontanée, mais laissera une cicatrice indélébile. La
leishmaniose cutanée peut aussi être diffuse, c'est-à-dire qu'on assiste à une dissémination
des lésions. Cette forme de la maladie est plus grave et affecte plus souvent les personnes
immunosupprimées qui sont incapables de guérir spontanément et qui ont tendance à
22
rechuter après le traitement. La leishmaniose cutanée diffuse est causée principalement par
L. amazonensis et L. guyanensis.
La leishmaniose mucocutanée (Fig. 1.4 B) se manifeste par des lésions pouvant
conduire à une destruction étendue des muqueuses du visage et provoquant ainsi une
défiguration permanente du patient. Elle est principalement causée par L. braziliensis et la
cause de décès est souvent attribuable à une infection bactérienne opportuniste des voies
respiratoires.
La leishmaniose viscérale (Fig. 1.4 C) est causée principalement par deux espèces,
L. infantum et L. donovani. En Amérique du sud, L. infantum est connue sous le nom de L.
chagasi, mais elles sont génétiquement identiques (23). La leishmaniose viscérale est la
manifestation clinique la plus sévère et elle est mortelle en absence de traitement. Elle
s'attaque aux organes internes tels que la rate et le foie et se caractérise notamment par des
poussées irrégulières de fièvre, une perte de poids importante, une hépatosplénomégalie et
de l'anémie. Une autre forme de leishmaniose viscérale appelée leishmaniose dermique
post kala-azar (PKDL) peut survenir quelques années plus tard chez les patients qui n'ont
pas été traités adéquatement pour la première forme. La PKDL se caractérise par une
éruption cutanée sur tout le corps et est très longue à traiter (332).
1.1.5 Le traitement de la leishmaniose
Aucun vaccin efficace n'est présentement disponible pour combattre les
leishmanioses humaines et le traitement actuel repose essentiellement sur la chimiothérapie.
En matière de prévention vaccinale, plusieurs candidats ont été développés et testés en
prophylaxie chez des modèles animaux et chez l'humain. Des essais cliniques ont été
pratiqués chez l'homme avec des vaccins de première génération constitués de
promastigotes tués et de fractions antigéniques, accompagnés ou non d'adjuvant (BCG),
mais l'efficacité obtenue est souvent insuffisante (revue dans (161, 265)). Encore
aujourd'hui, plusieurs stratégies de vaccination sont en développement contre les
leishmanioses cutanées et viscérales chez les canidés et chez l'humain. En attendant un
vaccin, le contrôle préventif de la leishmaniose repose sur la lutte contre les vecteurs dans
les zones endémiques à l'aide d'insecticides ou de moustiquaires imprégnés d'insecticide
23
ainsi que par le contrôle des réservoirs, animaux domestiques en particulier, par l'utilisation
de colliers imprégnés d'insecticide.
L'arsenal de médicaments disponible pour contrer la leishmaniose est très restreint
et le traitement repose en première intention sur des dérivés d'antimoine pentavalent (SbV).
Dans les cas de non-réponse au traitement par l'antimoine, d'autres médicaments utilisés en
seconde ligne de défense (e.g. la pentamidine, l'amphotéricine B, la miltefosine) prennent
le relais (revue dans (68, 260)).
1.1.5.1 Les dérivés d'antimoine pentavalent (SbV)
La classe de médicaments à base d'antimoine pentavalent (SbV) constitue la
première ligne de défense contre la majorité des formes de leishmanioses et est utilisée
depuis plus de 50 ans. Elle est commercialisée sous le nom de Glucantime® (ou
méthylglucamine antimoine) et de Pentostam® (ou stibogluconate de sodium). Bien que le
mode d'action de l'antimoine pentavalent ne soit pas encore bien défini, il est généralement
reconnu qu'il s'agit d'un pro-médicament qui doit être réduit en sa forme active (SblII)
pour acquérir son activité antileishmanienne (348). Des données récentes suggèrent que
l'antimoine interfère avec le métabolisme des thiols en augmentant leur efflux en plus
d'inhiber la reductase, une enzyme responsable du maintien du trypanothione sous sa forme
réduite chez le parasite (412). Il a été démontré pour la première fois chez Leishmania que
le transport de SblII se fait par l'intermédiaire d'une aquaglycéroporine (AQP1) (120) et
que ce transporteur membranaire jouerait un rôle important dans la résistance à l'antimoine
(210). Il est à noter que la toxicité et les effets secondaires parfois graves des dérivés
d'antimoine pentavalent sont bien connus ainsi que la résistance parasitaire croissante à ces
composés. La résistance développée par Leishmania envers les médicaments de première
ligne dans certaines régions du globe, comme en Inde, est de plus en plus préoccupante
(363) et les mécanismes de résistance chez Leishmania sont étudiés de façon intensive (69,
260).
24
1.1.5.2 Pentamidine
La pentamidine est une diamidine aromatique utilisée comme médicament de
seconde ligne pour le traitement des leishmanioses viscérales réfractaires au traitement par
les dérivés d'antimoine (363). Bien que la cible cellulaire de la pentamidine ne soit pas
encore connue, certaines évidences suggèrent que la pentamidine pourrait cibler la
mitochondrie (24, 233, 392). Des études récentes ont mis en évidence la contribution des
transporteurs de pentamidine dans le phénomène de résistance (42, 66). En raison d'une
importante toxicité (hypotension, hypoglycémie, diabète, néphrotoxicité) et d'une
diminution de son efficacité liée à une résistance croissante, notamment en Inde (363),
l'utilisation de la pentamidine devient de plus en plus limitée.
1.1.5.3 Amphotéricine B
L'amphotéricine B (AmB) est un antibiotique polyene utilisé initialement pour
traiter les infections fongiques systémiques. Ce médicament a été utilisé en seconde
intention pour le traitement des leishmanioses depuis les années 1960. Il interagit avec les
sterols des membranes plasmiques et préférentiellement avec l'ergostérol, causant des
lésions cellulaires par altération des membranes. Comme pour les champignons,
l'ergostérol est aussi présent au niveau de la membrane plasmique de Leishmania (113), ce
qui explique l'efficacité de l'amphotéricine B contre la leishmaniose. De nos jours l'AmB
est utilisé sous forme liposomale, beaucoup plus efficace et moins toxique, en particulier
dans le cas de leishmanioses viscérales résistantes à l'antimoine (365). Cependant,
l'amphotéricine B, sous sa forme liposomale, est financièrement hors de portée pour les
populations démunies qui malheureusement sont les plus touchées. Bien que la résistance à
l'AmB ne semble pas poser de problème pour le moment chez les souches cliniques, les
études in vitro démontrent que l'émergence de la résistance pourrait être associée à un
changement au niveau de la fluidité membranaire en remplaçant l'ergostérol par un
précurseur de moindre affinité avec le médicament (216).
25
1.1.5.4 Miltefosine
La miltefosine (introduite dans les années 1980) est un dérivé de la phosphocholine
utilisé initialement pour traiter le cancer du sein. Elle est utilisée par voie orale dans le
traitement de la leishmaniose viscérale (364) et a aussi été utilisée avec succès pour le
traitement des cas résistants à l'antimoine (366). Considérée comme sûre, provoquant peu
d'effets secondaires et permettant ainsi d'obtenir des taux de guérison atteignant 97% (35),
la miltefosine a été homologuée en Inde en 2002 et en Colombie en 2005 (68). Le
mécanisme d'action de la miltefosine reste mal connu, il semblerait qu'elle interfère avec le
métabolisme des alkyl-lipides et la biosynthèse des phospholipides (201, 302). En raison de
l'introduction récente de la miltefosine sur le terrain, la résistance des souches cliniques n'a
pas encore été rapportée. Cependant, la résistance peut facilement être obtenue in vitro, ce
qui permet de présager le développement de ce phénomène sur le terrain. La caractérisation
des mutants résistants à la miltefosine a permis d'associer la résistance à un défaut dans
l'accumulation du médicament à l'intérieur de la cellule. Ce phénomène serait causé par
des mutations inactivant son transporteur situé au niveau de la membrane plasmique (284,
285, 346).
1.1.5.5 Autres formulations
D'autres molécules qui viennent renforcer l'arsenal thérapeutique sont en phase
clinique de développement, mais elles sont malheureusement peu nombreuses (revue dans
(68)). Les principales molécules sont la paromomycine (en phase clinique III) et la
sitamaquine (en phase clinique II). La paromomycine est utilisée en monothérapie ou en
association avec l'antimoine dans le traitement des leishmanioses cutanées et viscérales. La
sitamaquine, connu aussi sous le nom de WR6026, est utilisée en monothérapie pour le
traitement de la leishmaniose viscérale. La résistance ne présente pas encrore de problème
pour la paromomycine et la sitamaquine vue que leur utilisation est limitée en clinique.
Cependant, la résistance à la paromomycine a pu être observée in vitro et est associée à une
diminution du transport de la molécule (205). L'activité de la paromomycine contre
Leishmania semblerait être dirigée contre les ribosomes (208) et certaines enzymes
mitochondriales (206), en plus de causer une altération au niveau de la fluidité
26
membranaire et du métabolisme lipidique (207). Plus d'études sont nécessaires pour mieux
comprendre le mode d'action de la sitamaquine et les mécanismes de résistance associés à
cette molécule.
1.1.6 Le génome de Leishmania
1.1.6.1 Séquençage du génome
Le séquençage du génome de Leishmania major Friedlin (153) a été complété en
2005, suivi par le séquençage des génomes de Leishmania infantum et Leishmania
braziliensis qui a été achevé en 2007 (278). Ainsi, Leishmania major et Leishmania
infantum contiennent 36 paires de chromosomes, tandis que Leishmania braziliensis n'en
contient que 35, dû à la fusion des chromosomes 20 et 34 dans ce dernier (44). Le nombre
total de gènes codants pour des protéines est de 8298 pour Leishmania major (dont 97
pseudogènes), de 8154 pour Leishmania infantum (dont 41 pseudogènes) et de 8153 pour
Leishmania braziliensis (dont 161 pseudogènes). L'analyse des séquences du génome a
révélé une densité de gène de 1 gène par 3.5 kb et un contenu en bases G-C d'environ 60
%. Les gènes codants pour des protéines sont dépourvus d'introns et les fonctions chez
seulement 36% d'entre eux ont été prédites (153). Malgré les 20 à 200 millions d'années
qui séparent les espèces des deux genres Leishmania et Viannia, la synthénie est bien
conservée entre les trois génomes (278). Une particularité remarquable chez les
Trypanosomatidae, notamment chez Leishmania, est l'organisation des gènes en grandes
unités polycistroniques (242). Par exemple, le chromosome 1 de Leishmania major contient
deux larges unités polycistroniques divergentes, ce qui veut dire que leur ARNm est
transcrit de façon divergente vers les telomeres; une unité de 29 gènes située sur un brin
d'ADN et l'autre de 50 gènes sur le brin complémentaire. D'autres chromosomes peuvent
avoir des unités convergentes ou une combinaison d'unités convergentes et divergentes
(242).
1.1.6.2 Régulation de l'expression génique
La régulation de l'expression des gènes chez Leishmania, un organisme qui a
divergé très tôt au cours de l'évolution des eukaryotes, se fait principalement au niveau
27
post-transcriptionnel (63, 64). En effet, même si la transcription de plusieurs ARNm par
une polymerase de type ARN pol II a été démontrée chez Leishmania, aucune séquence
promotrice n'a été détectée en amont de ces gènes. Ainsi, chez Leishmania, les larges
unités polycistroniques contenant des gènes organisés en tandem sont initialement
transcrites par l'ARN pol II en longs ARN pré-messagers (Fig. 1.5). La maturation de ces
ARN pré-messagers se fait par deux mécanismes majeurs, soit l'épissage en trans (ajout
d'un mini exon de 39 nucleotides en 5' du gène) et la polyadénylation en 3' du gène. Tous
les ARNm chez Leishmania possèdent ce mini-exon de 39 nucleotides à leur extrémité 5' et
son addition est étroitement associée à la polyadénylation et fournit également la structure
de coiffe (cap) (63, 64). Des éléments situés dans les séquences 3' non-traduites (3'UTRs)
des transcrits interviennent dans la régulation de l'expression des gènes en modulant la
stabilité des ARN messagers ou l'efficacité de la traduction (39, 43, 224, 235, 236). La
modulation de l'expression génique chez des parasites sélectionnés pour la résistance aux
médicaments est associée à des événements de deletion ou d'amplification géniques ainsi
qu'aux changements du nombre de copie de chromosomes (189, 384).
ADN GÉNOMIQUE
: IMUUU* < «
ARN PRE-MESSAGER
39 nt mini-exon
Transcription
nnnnnnnn N M — H -
> »
< « - «Vi n „ r i n n»»» Copies de SL-ARN (chromosome II)
Épissage < pofyadénylat
ARNm MATURES
RÉGULATION POST-TRANSCRIPTIONNEUE C Stabilité des ARNm
Modulation de la traduction des ARNm
Figure 1.5. Organisation génique et maturation des messagers chez Leishmania. (Tiré de (263)).
28
1.2 Le métabolisme monocarboné
Le métabolisme monocarboné (ou métabolisme Cl) désigne l'ensemble des
réactions métaboliques qui nécessitent le transfert d'unités à un carbone (revue dans (62,
104, 374)). Deux cofacteurs jouent un rôle essentiel dans le métabolisme Cl; les folates et
la S-adénosylméthionine (AdoMet). Le métabolisme de ces deux cofacteurs est étroitement
connecté puisque les folates sont impliqués dans la synthèse de l'AdoMet, le donneur
universel des groupements méthyl ((62, 104, 374)). Par ailleurs, le métabolisme des folates
est d'un grand intérêt pour les industries pharmaceutiques puisqu'il a été exploité avec
succès pour le traitement de plusieurs maladies comme le cancer et les infections
microbiennes à l'aide des antifolates (section 1.2.4). Dans cette section du chapitre I nous
allons introduire le métabolisme monocarboné chez les eucaryotes supérieurs, notamment
chez les mammifères. Le transport des folates et de l'AdoMet sera traité dans la section 1.5.
1.2.1 Le métabolisme des folates
1.2.1.1 Introduction
Folate(s) est un terme générique qui désigne un ensemble de molécules qui ont pour
structure de base l'acide folique (Fig. 1.6). L'acide folique (AF), appelé également vitamine
BQ OU acide ptéroylglutamique, est la forme synthétique des folates et existe sous forme
monoglutamate. L'AF est une molécule tripartite composée d'un noyau de ptérine, une
molécule d'acide para-aminobenzoïque (pABA) et une molécule de glutamate. La forme
active de l'acide folique dans la cellule est sa forme réduite, le tétrahydrofolate (THF) (337,
350, 395). Le THF joue un rôle de donneur et d'accepteur d'unités monocarbonnées (Cl),
principalement sous la forme de groupements méthylène (-CH2-), formyl (-CHO) et méthyl
(-CH3). Ces derniers sont impliqués dans la biosynthèse de la thymidine, la conversion de
la serine en glycine, la biosynthèse des purines et du formyl-méthionyl-ARNt ainsi que la
methylation de 1'homocysteine en methionine. Les trois principaux donneurs d'unités Cl
dans la cellule sont la serine, la glycine et le formate. Chez les mammifères, le catabolisme
de l'histidine, de la choline et des purines est également source d'unités Cl (104). Dans le
sérum, les folates sont sous formes monoglutamylées, tandis que les folates intracellulaires
existent sous forme polyglutamylée (220, 229). La chaine polyglutamate permet
29
d'augmenter la rétention des folates dans les différents compartiments de la cellule ainsi
que leur affinité envers les enzymes folate-dépendantes ce qui augmente leur stabilité
(337).
Ptérine p-ABA Glutamate
OH
" ifNY C H - N H
O r = \ Il
A\ / ) - C - \ H H — CH
CH Acide folique
COOH
COOH.
Forme oxidee de folate
H , N ^ % ^ N
O COOH
v " !
N ^ ^ C H j - M H - t ^ ^ - C - N H - C H
ÇH, COOH
5-CHj-THF
OH
H ^ N ^ N ^
O COOH Il I
^ - C - N H - Ç H
CH,
CH, I COOH
10-CHO-THF
<ÇH °»v$rNr\ //
1 N H 5,10-CH2-THF
O COOH Il I C —NH —CH
I CH,
ÇH, COOH
v Formes réduites r de folate
NH,
V r S i ^ N *
CH, 0 COOH I
- C H I
CH,
CH
Antifolate (inhibiteur de la DHFR)
Methotrexate Ç H, COOH
Figure 1.6. Structure chimique des différentes formes des folates et de l'antifolate methotrexate
La molécule d'acide folique (AF) constitue la structure de base des folates. Elle est composée d'un noyau de ptérine, d'une molécule d'acide para-aminobenzoïque (pABA) et d'une molécule de glutamate. Les principales unités Cl (-CH3, -CHO, -CH2-) portées par le tétrahydrofolate (THF) sont indiquées dans un cercle gris. Le methotrexate, un inhibiteur de la dihydrofolate reductase (DHFR), est un analogue structural de l'AF.
30
1.2.1.2 La biosynthèse de novo du THF
Toutes les cellules, procaryotes ou eucaryotes, ont besoin des folates pour leur
croissance et leur survie. Les cellules des mammifères ne possèdent pas la totalité des
enzymes nécessaires à la biosynthèse du THF. En effet, elles n'ont que la capacité de
synthétiser la molécule de ptérine sous forme réduite, la tétrahydrobioptérine (BH4) (revue
dans (194, 373)). Les plantes, les levures, les champignons, la plupart des bactéries et
quelques parasites (e.g. Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii) ont la capacité de
synthétiser de novo le THF (259, 307). Les cellules des mammifères sont donc autotrophes
pour la bioptérine et auxotrophes pour les folates qu'elles doivent obligatoirement importer
du milieu extérieur.
Les différentes étapes de la voie de biosynthèse du THF sont illustrées dans la
figure 1.7. Elle débute avec une molécule de guanosine triphosphate (GTP) qui est
convertie en noyau de ptéridine par la GTP cyclohydrolase I (GTPCH). Après deux
réactions enzymatiques catalysées respectivement par la 6-pyruvoyltétrahydroptérine
synthase (PTPS) et la sepiapterine reductase (SR), une molécule de tétrahydrobioptérine
(BH4) est obtenue chez les mammifères. Cette molécule joue un rôle important dans la
cellule puisqu'elle sert de cofacteur lors de la synthèse d'oxyde nitrique (NO) et est
également impliquée dans l'hydroxylation des acides aminés aromatiques (e.g.
phenylalanine, tryptophane, tyrosine) et le catabolisme des lipides (194, 373).
Chez les organismes autotrophes pour les folates comme les bactéries, la molécule
de ptéridine obtenue à la suite d'une série de réactions enzymatiques est conjuguée avec
une molécule d'acide para-aminobenzoïque (pABA), dérivée à l'origine de la voie du
chorismate, pour former une molécule de dihydroptéroate. Cette conjugaison est catalysée
par la dihydroptéroate synthase (DHPS). Une autre enzyme, la dihydrofolate synthase
(DHFS), conjugue une molécule d'acide glutamique avec le dihydroptéroate pour former
une molécule de dihydrofolate (DHF). Pour être active, cette dernière doit subir une
seconde réduction par la dihydrofolate reductase (DHFR) afin d'obtenir le tétrahydrofolate
(THF). La dernière étape de la voie de biosynthèse du THF consiste à l'ajout d'une ou de
plusieurs molécules de glutamate par la folylpolyglutamate synthase (FPGS) (Fig. 1.7).
31
Micro-organismes Mammifères GTP
GTPCH V Pase V
DHNA y Chorismate
pABA
PPPK y
Ptéridine
JIDHPS
7,8-dihydroptéroate D H F S ^ ^
\
PTPS
v SR
BIT
^ D H F R
BH,
DHF I DHFR
THF I FPGS
THF(Glu)n
Figure 1.7. La biosynthèse de novo des ptérines et des folates. (Modifié de (259)).
GTPCH, GTP cyclohydrolase I; PTPS, 6-pyruvoyltétrahydroptérine synthase; SR, sepiapterine reductase; Pase, phosphatase non-spécifique; DHNA, dihydronéoptérine aldolase; PPPK, hydroxyméthyl-dihydroptérine pyrophosphokinase; DHPS, dihydroptéroate synthase, DHFR, dihydrofolate reductase; FPGS, folylpolyglutamate synthase; GTP, guanosine triphosphate; pABA, acide para-aminobenzoïque; BH4, tétrahydrobioptérine; BH2, dihydrobioptérine; DHF, dihydrofolate; THF, tétrahydrofolate, THF(Glu)n, forme polyglutamylée du THF.
32
1.2.1.3 Rôles physiologiques des folates
Le rôle physiologique général des folates est de fournir des unités monocarbonées
nécessaires à un grand nombre de réactions métaboliques connues sous le nom du
métabolisme monocarboné (62, 104, 374). Chaque dérivé du THF est impliqué dans un
nombre limité de réactions qui lui sont propres (Fig. 1.8). Ainsi, le 10-formyl-
tétrahydrofolate (10-CHO-THF) est impliqué dans la synthèse des purines mais également
dans celle du formyl-méthionyl-ARNt dans la mitochondrie (355, 371). Le 5,10-méthylène-
tétrahydrofolate (5,10-CH2-THF) est impliqué dans la conversion de la serine en glycine
par la serine hydroxyméthyltransférase (SHMT) et est aussi essentiel pour la synthèse de la
thymidine (conversion dUMP en dTMP) par la thymidylate synthase (TS) (104). La
réaction catalysée par TS est la seule source de la biosynthèse de novo de la thymidine,
rendant cette dernière indispensable pour la replication et la réparation de l'ADN ainsi que
pour la stabilité du génome (144). Enfin, le 5-méthyl-tétrahydrofolate (5-CH3-THF) fournit
le groupement méthyl nécessaire pour la conversion de ltiomocystéine en methionine par la
methionine synthase (MS) (104). Cette réaction est irréversible et occupe un rôle important
dans le métabolisme monocarboné puisqu'elle est impliquée dans la synthèse de la S-
adénosylméthionine (AdoMet) à partir de la methionine, permettant ainsi d'alimenter les
réactions de transmethylation en groupements méthyl via l'AdoMet (revue dans (45, 214,
215)). Cet aspect du métabolisme monocarboné sera traité plus bas.
33
Histidine
I Formiminoglutamate
I glutamate formiminotransférase
N-Formimino-THF Nucleotides purines
cyclodeamlnase
F
/
Formate + THF
N5-N10-Méthènyl-THF .10 N l u-Formyl-THF
méthylène-THF dehydrogenase
méthènyl-THF cyclohydrolase Iformyl-THF
dehydrogenase
THF + CO2
N5-N10-Méthylène-THF
méthylène-THF reductase (MTHFR)
N5-Méthyl-THF
methionine synthase
s ^ Glycine
' serine hydroxyméthyI-. transferase (SHMT)
>«► Serine
. — d U M P thymidilate synthase *—fedTMP
DHF
l—r Homocysteine Methionine
THF I dihydrofolate reductase
Nucleotides Pyrimidines
NADPH
Figure 1.8. Rôle des folates dans le métabolisme monocarboné. (Tiré de la thèse de doctorat de Dave Richard, Université Laval, 2004).
Les folates jouent un rôle essentiel dans le métabolisme monocarboné. Ils sont impliqués dans la biosynthèse de la thymidine, des purines et la methionine. Ils sont également impliqués, entre autres, dans la conversion de la serine en glycine et dans le catabolisme de l'histidine.
34
1.2.2 Le métabolisme de la S-adénosylmethionine
1.2.2.1 Introduction
La structure de la 5-adénosylméthionine (AdoMet ou SAM) (Fig. 1.9) a été élucidée
pour la première fois par Cantoni en 1951 et depuis, plusieurs études ont montré que
l'AdoMet est impliquée dans plusieurs réactions biologiques importantes telles la
transmethylation, la trans-sulfuration et la synthèse des polyamines (revue dans (103, 197)).
L'AdoMet est utilisée principalement dans les réactions de transmethylation comme
donneur universel des groupements méthyl. Ces réactions sont assurées par de nombreuses
enzymes du groupe des méthyltransférases (58, 340) qui transfèrent des groupements
méthyl de l'AdoMet aux diverses molécules acceptrices tels les acides nucléiques, les
protéines et les phospholipides (103, 197). La 5-adénosylhomocystéine (AdoHcy) formée
au cours de ces réactions de transmethylation est connue comme étant un inhibiteur
compétitif de ces dernières (215). D'autres inhibiteurs des réactions de transmethylation ont
aussi été décrits, parmi eux la sinéfungine (SNF) (Fig. 1.9), un analogue structural de
l'AdoMet et l'AdoHcy (168, 338). Il s'agit d'un antibiotique naturel qui possède des
propriétés antifongiques, antiparasitaires et antivirales (20, 61, 84, 270, 296, 378).
COOH OH OH OH OH OH OH
AdoMet AdoHcy SNF
Figure 1.9. Structure de la .S-adénosylméthionine (AdoMet), de la S-adénosyl-homocystéine (AdoHcy) et de la sinéfungine (SNF).
35
1.2.2.2 Le cycle de la methionine et la biosynthèse de l'AdoMet
La methionine, un acide aminé essentiel, est nécessaire non seulement pour la
synthèse des protéines mais également pour la synthèse de la 5-adénosylméthionine
(AdoMet) (45, 215). L'AdoMet est synthétisée dans le cytosol à partir de la methionine et
de l'ATP par la methionine adénosyltransférase (MAT) (214). Cette étape de biosynthèse
constitue la première réaction du cycle de la methionine (Fig. 1.10, réaction 1). L'utilisation
de l'AdoMet dans les réactions de methylation cellulaire génère de la S-
adénosylhomocystéine (AdoHcy) qui est hydrolysée en homocysteine (Hcy) et en
adenosine par la S-adénosylhomocystéine hydrolase (SAHH) (Fig. 1.10, réaction 3) (383).
Cette série de réactions est appelée transmethylation (45, 215). L'Hcy formée se situe au
carrefour de deux voies métaboliques; la reméthylation et la trans-sulfuration (Fig. 1.10).
La voie de la reméthylation recycle l'Hcy en methionine à l'aide de la methionine synmase
qui utilise le 5-CH3-THF comme donneur du groupement méthyl (Fig. 1.10, réaction 8).
Chez les mammifères, notamment dans le foie et les reins, il existe aussi une deuxième voie
de reméthylation catalysée par la bétaïne-homocystéine méthyltransférase (BHMT) (Fig.
1.10, réaction 9) utilisant la bétaïne comme donneur du groupement méthyl (45, 215). La
voie de methylation constitue la dernière étape du cycle de la methionine (215). Dans la
voie de la trans-sulfuration 1'homocysteine est transformée de façon irréversible en cysteine
pour la production, entre autres, du glutathion (215). Dans le foie, environ 50 % de la
cysteine utilisée dans la synthèse du glutathion provient de la trans-sulfuration (22).
36
5-CHi-THF Diméthy glycine
Betaine
Methionine I ATP
Cycle de la methionine
AdoMet
Synthèse des
polyamines
co. \ & J ^ AdoMet
décarboxylé
Accepteur (e.g. ADN, ARN, protéines, lipides)
>• y-Glutamylcystéine ATP ©.
Glutamate r
Glycine
Glutathion
Figure 1.10. Le métabolisme de la methionine et de la 5-adénosylméthionine. (Modifié de (197)).
1, methionine adénosyltransférase (MAT); 2, réactions de transmethylation; 3, S-adénosylhomocystéine hydrolase (SAHH); 4, cystathionine P-synthase (CBS), 5, y-cystathionase; 6, y-glutamyl-cystéine synthase (yGCS); 7, glutathion synthetase; 8, methionine synthase (MS); 9, bétaïne-homocystéine méthyltransférase (BHMT); 10, S-adénosylméthionine decarboxylase. AdoMet, S-adénosylméthionine; AdoHcy, S-adénosylhomocystéine; Hey, homocysteine; THF, tétrahydrofolate.
1.2.2.3 Rôle physiologique de l'AdoMet
La transmethylation, la trans-sulfuration ainsi que la synthèse des polyamines
constituent les principales fonctions de l'AdoMet dans la cellule (103, 197). En raison des
nombreux accepteurs des groupements méthyl de l'AdoMet les réactions de
transmethylation jouent plusieurs rôles essentiels dans la cellule. Par exemple, la
methylation des acides nucléiques est cruciale dans le contrôle de l'expression des gènes et
37
la stabilité du génome (85, 98). La methylation des protéines est essentielle, entre autres,
pour la transduction de signaux et la prolifération cellulaire (122) tandis que la methylation
des phospholipides permet de maintenir la flexibilité et la perméabilité des membranes
cellulaires (389). Les méthylations sont aussi impliquées, entre autres, dans la synthèse de
metabolites (e.g. creatine, phosphatidylcholine, epinephrine) et dans la detoxification des
xénobiotiques (e.g. thiols, arsenite) (45). L'AdoMet est aussi important dans la trans-
sulfuration étant impliqué via 1'homocysteine dans la synthèse du tripeptide glutathion
(215). Cette molécule est d'une grande importance puisqu'elle est le principal antioxydant
chez l'homme (196). En raison de son rôle dans la synthèse du glutathion, l'AdoMet a été
utilisé en médecine comme médicament pour traiter les maladies chroniques du foie (197).
L'AdoMet est aussi impliquée, comme seul donneur de groupements aminopropyl, dans la
synthèse des polyamines (spermidine, spermine) (103, 197). Les polyamines jouent un rôle
important dans la cellule, notamment dans l'expression des gènes et la prolifération
cellulaire (228).
1.2.3 Pathologies liées à une carence en folates
Une insuffisance en acide folique est l'une des carences vitaminiques les plus
répandues à travers le monde et cause un certain nombre de maladies graves (165). La
manifestation clinique la plus connue d'une carence en folates est l'anémie mégaloblastique
(11). Il est bien connu maintenant qu'une carence en folates est considérée comme facteur
de risque de plusieurs affections telles une anomalie de fermeture du tube neural (AFTN)
chez le fœtus (109), les maladies cardiovasculaires et l'apparition de démence de type
Alzheimer (349, 359). Le cancer figure aussi parmi ces affections, le plus fréquent étant le
cancer colorectal (166). En raison de leur rôle dans la synthèse de l'ADN et dans les
processus de methylation, les folates peuvent interférer avec la carcinogenèse par deux
mécanismes; soit en induisant l'instabilité de l'ADN, notamment par la réduction de la
biosynthèse de la thymidine, ou en modulant la methylation de l'ADN et des histones (85,
200). Une carence en folates peut habituellement être traitée par une alimentation équilibrée
et riche en fruits et légumes. Parfois, des compléments d'acide folique sont nécessaires,
comme chez les femmes enceintes pour aider à prévenir les malformations du tube neural.
Certains pays, comme les États-Unis et le Canada, ont adopté une politique
38
d'enrichissement en acide folique de certains produits alimentaires. L'apport journalier en
folates recommandé par l'Académie Nationale des Sciences Américaine est de 400 pg pour
l'ensemble de la population et de 600 pg pour les femmes enceintes.
1.2.4 Les antifolates
1.2.4.1 Définition
Le tétrahydrofolate (THF) étant un facteur de croissance essentiel pour toutes les
cellules vivantes, plusieurs médicaments ont été développés pour interférer avec son
métabolisme. En effet, les antifolates sont des antimetabolites utilisés pour inhiber les
enzymes impliquées dans le métabolisme des folates et des purines (enzymes folate-
dépendantes). Il s'agit de molécules ayant une structure analogue à celle des folates ou d'un
de ses précurseurs. Ils sont utilisés comme agents anticancéreux, antibactériens et
antiparasitaires, et la majorité d'entre eux ont pour cible la dihydrofolate reductase
(DHFR). Les autres cibles des antifolates incluent la thymidilate synthase (TS), la
dihydroptéroate synthase (DHPS) et les deux enzymes folate-dépendantes de la voie de
biosynthèse des purines, la glycinamide ribonucleotide formyltransferase (GARFT) et
l'aminoimidazolcarboxamide ribonucleotide formyltransferase (AICARFT) (revue dans
(173,219,254)).
1.2.4.2 Contre le cancer
Le methotrexate (MTX) (Fig. 1.6) a été le premier antimetabolite développé pour
inhiber la croissance et la prolifération des cellules malignes. Initialement il a été utilisé en
oncologic pour le traitement de la leucémie lymphoblastique aiguë (LLA), le cancer le plus
fréquent chez l'enfant, où il a démontré sa pleine efficacité (59, 176). Cet antagoniste de
folate est aussi très efficace dans le traitement de l'arthrite rhumatoïde, la psoriasis et la
maladie de Crohn (101, 167, 335). Le MTX exerce son rôle en inhibant la DHFR
empêchant ainsi la synthèse de tétrahydrofolate (THF) à partir du dihydrofolate (DHF) et
menant à une carence en cofacteurs THF. Ces derniers étant importants pour la synthèse de
l'ADN, leur diminution provoque un arrêt de la division cellulaire conduisant ainsi la
cellule vers la mort. Sous sa forme polyglutamate, le MTX inhibe de façon directe la TS et
la GARFT (2). En raison de la toxicité du MTX et l'émergence de la résistance au
39
traitement, des efforts considérables ont été investis pour développer de nouvelles
molécules antifolates plus sélectives ou à plus large spectre d'action (173, 219). Cependant,
en se basant sur la DHFR comme cible thérapeutique, aucun nouvel antifolate n'a montré
une activité supérieure à celle du MTX et la recherche s'est principalement concentrée sur
les inhibiteurs de la TS, de la GARFT et de la AICARFT (173, 219). Le raltitrexed et le
pemetrexed sont des nouvelles molécules antifolates récemment utilisées en clinique
comme agents anti-cancéreux. Le raltitrexed est un inhibiteur sélectif de la thymidilate
synthase (TS) et, contrairement au MTX, il est très efficace dans le traitement du cancer
colorectal (407). Le pemetrexed, quant à lui, est un antifolate multi-cibles et à large spectre
d'activité. Il inhibe très fortement la TS mais aussi la DHFR, la GARFT et la AICARFT
bloquant ainsi la synthèse des pyrimidines et des purines. C'est en 2004 que le pemetrexed
a été autorisé en clinique pour le traitement du mésothéliome pleural en association avec la
cisplatine et dans le traitement en seconde ligne du cancer du poumon non à petites cellules
(255).
1.2.4.3 Contre les infections bactériennes
Les sulfonamides et le triméthoprime (TMP) sont deux types d'antifolates utilisées
depuis plusieurs décennies pour le traitement des infections bactériennes (333). Le TMP
appartient à la famille des diaminopyrimidines, une classe de molécules couramment
employées comme antibiotiques (219). En raison des différences structurales entre la
DHFR procaryote et eucaryote, le TMP est plus spécifique pour la DHFR bactérienne ce
qui diminue grandement les effets secondaires associés à son utilisation (299). Les
sulfonamides sont un groupe de molécules qui inhibent compétitivement la synthèse de
novo des folates au niveau de la DHPS empêchant ainsi la conjugaison de la molécule de
pABA à l'acide ptéroique (Fig. 1.7) (358).
1.2.4.4 Contre les infections parasitaires
Les antifolates sont fréquemment utilisés pour traiter quelques infections
parasitaires en particulier la malaria causée par Plasmodium falciparum. La pyrimethamine
et la sulfadoxine, ciblant respectivement la DHFR et la DHPS, sont utilisées en première
ligne de défense pour traiter la malaria dans les régions où la résistance à la chloroquine est
40
endémique (241). La combinaison proguanil/dapsone est aussi utilisée pour traiter la
malaria et le metabolite du proguanil, le cycloguanil, est un inhibiteur de la DHFR (195).
De plus, le chlorcycloguanil, la forme active de chlorproguanil, s'avère plus puissant que le
cycloguanil avantageant ainsi l'utilisation en clinique la combinaison
chlorproguanil/dapsone à celle de proguanil/dapsone (254). Une nouvelle classe
d'antifolates, les oxyguanils, représentée par le PS-15 et son metabolite WR99210, des
puissants inhibiteurs de la DHFR, est également utilisée comme agents anti-malaria, mais
son utilisation en clinique a suscité moins d'intérêt à cause de l'intolérance gastro
intestinale (48).
1.2.4.6 Résistance aux antifolates
Le phénomène de résistance aux antifolates pose un sérieux problème quant à leur
utilisation en chimiothérapie. Cette résistance est rencontrée chez tous les types de maladies
traitées avec les antifolates. Les mécanismes de résistance aux antifolates ont été étudiés de
façon extensive et continuent d'être le sujet de plusieurs études (revue dans (12, 121, 262,
370, 418). Les différents mécanismes de résistance aux antifolates rencontrés in vitro et in
vivo sont :
(i) Réduction de l'entrée de l'antifolate suite à l'altération de la fonction de son
transporteur, soit par des mutations ou par une diminution de son expression;
(ii) Surexpression d'un système d'efflux pour expulser l'antifolate vers l'extérieur de la
cellule;
(iii) Surproduction de la cible cellulaire de l'antifolate ou diminution de son affinité pour
celui-ci par des mutations;
(iv) Réduction de l'activité FPGS ou une augmentation de l'activité y-glutamyl
hydrolase (GGH) dégradant ainsi la chaîne de polyglutamate de l'antifolate et, par
conséquent, en diminuant sa rétention intracellulaire.
41
13 Le métabolisme monocarboné chez Leishmania
Le métabolisme monocarboné est vital pour tous les organismes. Les dérivés du
THF sont à la base de ce métabolisme qui regroupe un ensemble de réactions de transfert
d'unités monocarbonées impliquées dans la synthèse des nucleotides (thymidylate,
purines), la synthèse de certains acides aminés (serine, glycine, methionine) et dans la
synthèse de S-adénosylméthionine (AdoMet) (Fig. 1.8 et 1.10). L'étude des mécanismes de
résistance à l'antifolate methotrexate (MTX) chez le parasite Leishmania nous a conduit
vers la caractérisation et une meilleure compréhension des voies métaboliques des ptérines
(e.g. bioptérine) et des folates (Fig. 1.11). Les ptérines et les folates forment la classe des
ptéridines. La coopération entre les sentiers métaboliques de ces deux molécules constitue
une particularité intéressante du métabolisme des ptéridines chez Leishmania (revue dans
(246, 259)). Une variation du métabolisme de la S-adénosylméthionine (AdoMet) est
observée en réponse à la perturbation du métabolisme des folates par le methotrexate (83,
127). Les folates et l'AdoMet sont les principaux donneurs d'unités monocarbonées dans la
cellule et jouent un rôle crucial dans la biologie du parasite (259, 310). Cette section traitera
du métabolisme des ptérines, des folates et de l'AdoMet chez Leishmania. Nous aborderons
le transport de ses trois molécules chez Leishmania ultérieurement.
1.3.1 Le métabolisme des ptérines
Contrairement aux mammifères, le parasite Leishmania ne possède pas les enzymes
nécessaires à la biosynthèse de novo de la tétrahydrobioptérine (BH4) (246, 259). La
bioptérine a été décrite initialement comme étant un facteur de croissance chez le parasite
Crithidia fasciculata (158, 162). Plusieures études ont par la suite montré que la bioptérine
ainsi que d'autres ptérines sont aussi essentielles pour la croissance de plusieurs espèces de
Leishmania (28, 159, 274, 279, 322, 343, 377). Deux enzymes jouent un rôle clé dans le
métabolisme des ptérines chez Leishmania; le transporteur de la bioptérine (BT1) (voir
section 1.6) et la ptéridine reductase (PTR1) (Fig. 1.11).
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42
43
1.3.1.1 Le transport et la réduction des ptérines
L'entrée de la bioptérine dans la cellule se fait par l'intermédiaire d'un transporteur
spécifique nommé BT1 (179, 188) (Fig. 1.11). Une fois à l'intérieur du parasite, la
bioptérine sous forme oxydée est successivement réduite en dihydrobioptérine (BH2) puis
en tétrahydrobioptérine (BH4) par la ptéridine reductase (PTR1) (Fig. 1.11) (199, 245).
Cette protéine appartient à une famille de déshydrogénases reductases à courte chaîne, elle
est NADPH-dépendante et active sous forme tétramérique (245, 398). Chez les parasites
promastigotes, l'enzyme PTR1 est différentiellement exprimée au cours des phases de
croissance et son activité est plus élevée au stade promastigote par rapport au stade
amastigote (73). Une des particularités intéressantes de cette enzyme chez Leishmania est
qu'elle possède une activité dihydrofolate reductase catalysant la réduction de l'acide
folique et la dihydrofolate (DHF) en tétrahydrofolate (THF) (Fig. 1.11) (245). Les mutants
PTRl' ' sont incapables de croître sans l'ajout de la bioptérine sous forme réduite, mais non
des folates, dans le milieu de culture démontrant l'importance de la réduction des ptérines
dans la biologie du parasite (30, 245). De plus, F inactivation de PTRl dans plusieurs
espèces de Leishmania conduit à une hypersensibilité au MTX (30, 180, 274) et a une
hypervirulence des parasites (74).
Des homologues de PTRl de Leishmania ont été identifiés et caractérisés chez
d'autres Trypanosomatidae comme Trypanosoma brucei (76, 351, 354) et Trypanosoma
cruzi (314, 339) et également chez certaines bactéries (77, 111, 248). Contrairement aux
PTRl des trypanosomatides qui possèdent la capacité de réduire les formes oxidées des
ptérines (76, 314, 354), les hydrolases identifiées chez les bactéries (e.g. E. coli, Xylella
fastidiosa) n'ont pas d'activité sur ces formes (77, 111, 248).
1.3.1.2 Autres enzymes du métabolisme des ptérines
Deux enzymes de la voie des ptérines ont été identifiées dans le génome de
Leishmania; la quinonoide dihydroptéridine reductase (QDPR) et la ptérine 4a-
carbinolamine dehydratase (www.genedb.org). Chez les mammifères, ces enzymes sont
impliquées dans la régénération des pools de tétrahydrobioptérine (BH4) (373). Il a été
démontré que la QDPR de Leishmania possède la capacité de régénérer la BH4 à partir de la
44
dihydrobioptérine quinonoi'de (qBH2) (202) tandis que la fonction de la ptérine 4a-
carbinolamine dehydratase reste à déterminer. PTRl, quant à elle, n'a aucune activité
envers la qBH2 (398).
1.3.1.3 Rôle physiologique de la bioptérine chez Leishmania
L'importance de la tétrahydrobioptérine (BH4) comme facteur de croissance a été
démontrée à plusieurs reprises chez Leishmania. Par exemple, il a été observé que des
souches de Leishmania fraîchement isolées de lésions pouvaient croître beaucoup plus
rapidement avec un apport de bioptérine dans le milieu de culture, jusqu'à un certain
nombre de passages où l'ajout de la bioptérine n'était plus d'aucun avantage pour la
replication (322). Au cours de la culture, ces parasites s'adaptent en surexprimant le
transporteur BT1 ou PTRl afin de leur permettre d'utiliser plus efficacement la bioptérine
(322). De plus, le locus Leishmania DNA 1 (LDI), sur lequel se retrouve le gène BT1, est
fréquemment amplifié chez plusieurs souches de Leishmania (345, 379) et la deletion du
gène BT1 par recombinaison homologue réduit fortement la croissance des parasites (179,
272). Ces résultats démontrent l'avantage que procure le transport de la bioptérine pour la
croissance du parasite.
La BH4 joue aussi un rôle déterminant dans la différenciation du parasite de la phase
promastigote non-infectieuse au stade promastigote métacyclique (Fig. 1.7), processus
appelé la métacyclogénèse (74). En effet, il a été démontré, à l'aide d'un mutant PTRÏ ',
que de bas niveaux de BH4 étaient nécessaires pour augmenter la métacyclogénèse, ce qui
conduisait aussi à de l'hypervirulence (74, 230). Cependant, le mécanisme par lequel la
diminution du niveau de BH4 augmente la métacyclogénèse est inconnu. Une des
hypothèses est que BH4 agirait comme signal contrôlant la differentiation (74), comme
c'est le cas chez d'autres organismes, tel Dictyostélium, où les ptérines sont impliquées
dans le processus de signalisation menant au développement multicellulaire (129, 330). Il
serait aussi possible que BH4 joue un rôle de cofacteur pour des enzymes, non identifiées
jusqu'à maintenant, impliquées dans le processus de differentiation (74).
Par ailleurs, on ne connait pas le rôle exact des ptérines dans le métabolisme de
Leishmania. Chez les mammifères, la BH4 est un cofacteur des enzymes impliquées dans
45
l'hydroxylation des acides aminés aromatiques, de la glycéryl-éther monooxygénase, une
enzyme impliquée dans le catabolisme des lipides et de l'oxyde nitrique synthase (NOS)
(revue dans (194, 373)). Chez Leishmania, la présence des activités enzymatiques
catalysant la synthèse de l'oxyde nitrique et le clivage éther-lipide a été démontrée (25,
110, 204). Cependant, aucune oxyde nitrique synthase (NOS) n'a été identifiée dans le
génome de Leishmania (www.genedb.org) et l'activité de clivage éther-lipide est NADPH-
dépendante (204). Par contre, Leishmania possède une phénylananine hydroxylase (PAH),
mais la génération de souches déficientes en PAH n'a. mené à aucune différence par rapport
à la souche sauvage en termes de croissance, de differentiation ou de virulence (203). La
BH4 joue aussi un rôle dans la défense contre le stress oxidatif et nitrosatif chez les
mammifères (172, 227). Des études récentes ont aussi suggéré le même rôle chez
Leishmania (230, 244). Cependant, le mécanisme impliqué dans cette résistance n'est pas
encore clair.
1.3.1.3.1 Rôle des ptérines dans la synthèse des folates chez Leishmania
Leishmania est auxotrophe pour les folates et doit obligatoirement les importer du
milieu externe (159, 279, 343, 377). Par contre, certaines espèces de Leishmania ont la
capacité de croître dans un milieu dépourvu de folates, mais complété par l'ajout de
ptérines (28, 274, 279). Cette observation a été faite chez L. donovani qui serait capable de
métaboliser la bioptérine en dérivés tétrahydrofolates (27). Une étape importante dans la
biosynthèse du THF est la conjugaison du noyau du ptérine avec la molécule d'acide para-
aminobenzoïque (pABA) par la dihydroptéroate synthase (DHPS) (Fig. 1.7). Or, il a été
démontré que L. major ne peut pas métaboliser le pABA en folates (175) et que L. major
ainsi que L. donovani sont insensibles aux sulfonamides, les inhibiteurs de la DHPS (159,
279). Ceci fournit un argument mettant en doute que L. donovani ait la capacité de
synthétiser ses propres folates à partir de la bioptérine. Par contre, si les ptérines jouent un
rôle dans la synthèse des folates, la voie métabolique impliquée dans ce processus, jusqu'à
présent inconnue, est peut-être différente de la voie classique. De toute façon, le besoin en
folates chez le parasite Leishmania est assuré principalement par l'import de ces molécules
à partir du milieu extérieur via des transporteurs spécifiques.
46
1.3.2 Le métabolisme des folates
Aucun des gènes codant pour des enzymes de la voie de biosynthèse des folates n'a
été identifié dans le génome de Leishmania (www.genedb.org) suggérant que ce parasite
est auxotrophe pour les folates. Par contre, une famille de gènes codant pour plusieurs
transporteurs a été identifiée dont deux membres, FT1 et FT5, jouent un rôle important
dans le transport de l'acide folique et de l'antifolate methotrexate chez ce parasite (311,
312). Le séquençage du génome de Leishmania a permis de caractériser certaines enzymes
du métabolisme monocarboné utilisant les folates comme la serine
hydroxyméthyltransférase (SHMT) (106), la méthyiène-tétrahydro folate reductase
(MTHFR) (394), l'enzyme bifonctionnelle méthylènetétrahydrofolate
déshydrogénase/méthényltétrahydrofolate cyclohydrolase (DHCH) (240), la formyl-
tétrahydrofolate ligase (FTL) (393) ainsi que le complexe enzymatique du clivage de la
glycine (CGC) (237, 344). Ces études ont apporté des nouvelles informations sur le rôle des
folates dans le métabolisme cellulaire du parasite ainsi que les premières preuves d'une
compartimentation du métabolisme monocarboné entre le cytoplasme et la mitochondrie
(Fig. 1.11).
1.3.2.1 La réduction et la polyglutamylation des folates
Leishmania possède la capacité de réduire l'acide folique en DHF et ce dernier en sa
forme active, le THF. Cette activité est assurée par la dihydrofolate reductase (DHFR), une
enzyme qui a la particularité, chez Leishmania, d'être associée à la thymidilate synthase
(TS) formant une enzyme bifonctionnelle DHFR-TS. L'activité TS, quant à elle, est
responsable de la synthèse de la thymidine (34, 126). Concernant la nature bifonctionnelle
de l'enzyme, plusieurs études ont mis en lumière un phénomène d'enchaînement du
substrat où le produit de la réaction de DHFR est transféré directement de son site actif à
celui de la TS sans qu'il ne soit relâché dans le milieu environnant (14, 170, 191, 225).
Contrairement aux DHFRs des mammifères qui possèdent une activité reductase envers la
BH2, la DHFR-TS de Leishmania est dépourvue de cette activité (245). Des mutants nuls
du gène DHFR-TS deviennent auxotrophes pour la thymidine confirmant le rôle essentiel
de cette enzyme dans la synthèse de la thymidine (70, 71). Bien qu'il est relativement
simple de générer des mutants DHFR-TS' ' chez des souches de L. major de laboratoire, il
47
semble en être autrement chez les souches très virulentes (72). Cela suggère qu'en plus de
jouer un rôle dans la biosynthèse de la thymidine, la DHFR-TS semble être nécessaire à la
virulence des parasites (72). En effet, il a été démontré que des souches DHFR-TS' ' sont
incapables de soutenir une infection de macrophages en culture ou chez des souris
normalement sensibles au Leishmania (375).
À l'intérieur des cellules de mammifère, les folates et l'antifolate methotrexate sont
polyglutamylés grâce à l'enzyme folylpolyglutamate synthetase (FPGS) (229, 350).
L'activité folylpolyglutamate a été décrite pour la première fois chez L. major où il a été
découvert que la majorité des folates se trouvaient sous une forme tétraglutamylée et
pentaglutamylée tandis que le methotrexate (MTX) était très faiblement polyglutamylé (96,
334). L'enzyme responsable de la polyglutamylation des folates, la folylpolyglutamate
synthetase (FPGS), a été clonée et caractérisée chez L. tarantolae (91). La FPGS de L.
tarentolae est une protéine de 538 acides aminés ayant une homologie de séquence avec les
FPGS humaine et de la levure (respectivement 33% et 30% d'identité). Contrairement à L.
major, le MTX est retrouvé sous une forme polyglutamylée chez L. tarentolae (89, 96).
Cette différence pourrait être expliquée par la présence d'une plus forte activité MTX
alpha-hydrolase facilement mesurable chez L. major mais non chez L. tarentolae (89, 96).
Cette activité a aussi été observée chez d'autres parasites comme L. donovani (159) et
Crithidia fasciculata (256). L'incapacité de générer une souche déficiente en FPGS suggère
que cette enzyme est essentielle à la survie du parasite Leishmania (91).
1.3.2.2 Rôle physiologique des folates chez Leishmania
Le rôle connu des dérivés du THF chez Leishmania est la synthèse de la thymidine
(70, 71). La présence d'une activité serine hydroxyméthyltransférase (SHMT) responsable
de la conversion de la serine en glycine a été détectée chez plusieurs espèces de Leishmania
(250) et a été confirmée chez L. donovani par la purification et la caractérisation
biochimique de cette enzyme (391). La présence de deux isoformes de SHMT chez L.
major, une cytosolique et l'autre mitochondriale, a été récemment démontrée (106). La
localisation de ces deux isoformes de SHMT fournit la première évidence de la
compartimentation du métabolisme monocarboné chez Leishmania (106). De plus, le
parasite Leishmania est capable de synthétiser le dérivé 5,10-CH2-THF dans la
48
mitochondrie par le complexe enzymatique du clivage de la glycine (CGC) (344). Ces
résultats suggèrent un rôle des folates dans le métabolisme de la mitochondrie.
Lorsque les cellules de Leishmania sont incubées avec de l'acide folique marqué au
tritium, ce dernier est métabolisé principalement en 5-méthyltétrahydrofolate (5-CH3-THF)
et en 10-formyltétrahydrofolate (10-CHO-THF) (27, 343, 394). Le rôle connu du 5-CH3-
THF est la reméthylation de l'homocystéine en methionine, tandis que le 10-CHO-THF est
impliqué dans la synthèse des purines et la formylation de la méthionyl-ARNt (62). Le
génome de Leishmania code pour une méthylèneTHF reductase (MTHFR), l'enzyme qui
génère le 5-CH3-THF (Fig. 1.8), et deux methionines synthases. Bien que la methionine
synthase ne soit pas encore étudiée, l'étude biochimique et fonctionnelle de la MTHFR
chez L. major a montré que la voie de la reméthylation de l'homocystéine en methionine
est fonctionnelle chez ce parasite (394).
Le rôle du 10-CHO-THF dans le métabolisme de Leishmania n'est pas encore clair
mais ce metabolite est essentiel pour la survie du parasite (240). Leishmania est auxotrophe
pour les purines (51), ce qui suggère que le seul rôle que peut avoir le 10-CHO-THF chez
le parasite est la formylation de la méthionyl-ARNt dans la mitochondrie (240) (Fig. 1.11).
La formylation de la méthionyl-ARNt n'est pas encore étudiée chez Leishmania, mais elle
semble être essentielle pour la biosynthèse des protéines chez le parasite trypanosomatide
T. brucei (56). Des études antérieures ont rapporté que la formylation de la méthionyl-
ARNt chez T. brucei se fait dans la matrice mitochondriale et qu'une méthionyl-tRNA
formyl-transferase (MFT) serait responsable de cette activité (372). Le génome de
Leishmania code pour un analogue de MFT, mais des études sont nécessaires pour
determiner si cette enzyme est fonctionnelle chez Leishmania (Fig. 1.11). Le fait que le 10-
CHO-THF est synthétisé exclusivement dans le cytoplasme chez L. major suggère que ce
cofacteur doit être transporté par la mitochondrie pour la formylation de la méthionyl-
ARNt (240, 393). Chez les mammifères le 10-CHO-THF est transporté à l'intérieur de la
mitochondrie par une protéine de la famille des transporteurs membranaires
mitochondriaux (MCF) (217, 280, 376) et des homologues de ce transporteur ont été
identifiés chez les trypanosomatides (67).
49
1.3.3 Le métabolisme de la 5-adénosyIméthionine
L'AdoMet est le donneur principal des groupements méthyl dans toutes les
réactions de methylation cellulaire exceptée la methylation de l'homocystéine en
methionine (Fig. 1.10, réactions 8 et 9). Le génome de Leishmania code pour les enzymes
du métabolisme de l'AdoMet dont la methionine adénosyltransférase (MAT) qui a été bien
étudiée chez ce parasite (Fig. 1.11) (revue dans (251, 310)). Mentionnons que la
sinéfungine (Fig. 1.9), un inhibiteur des réactions de transmethylation, a montré une très
forte activité anti-Leishmania in vitro et in vivo, d'où l'intérêt grandissant pour l'étude du
métabolisme de l'AdoMet dans la course aux nouvelles cibles thérapeutiques (310, 396).
1.3.3.1 La biosynthèse de l'AdoMet par MAT2
La methionine adénosyltransférase (MAT) (Fig. 1.10, réaction 1) catalyse la
formation de l'AdoMet à partir de l'ATP et de la methionine. Chez Leishmania, cette
protéine de 394 acides aminés est codée par deux gènes identiques (gène MAT2) situés en
tandem, et elle partage une forte homologie de séquence (entre 52% et 60% de similarité)
avec les MATs des autres organismes (e.g. S. cerevisiae, E. coli, Homo sapiens, P.
falciparum) (309). MAT2 est active sous forme de dimère et son activité est insensible à
une inhibition allostérique par l'AdoMet (309). Des études de mutageneses dirigées ont
permis d'identifier les acides aminés impliqués dans l'hydrolyse de l'ATP, dans
l'interaction avec les métaux (e.g. Mg2*) et dans le site actif de l'enzyme (281, 283).
L'expression de la protéine MAT2 ainsi que son activité sont régulées lors des différentes
phases de croissance chez les promastigotes, étant plus élevées en phase logarithmique et
quasi-indétectables en phase stationnaire de croissance (282). Par contre, le niveau de
l'ARNm de MAT2 ne change pas lors des différentes phases de croissance, ce qui suggère
que la régulation du gène MAT2 se fait au niveau post-traductionnel (282). La
surexpression du gène MAT2 chez Leishmania conduit à l'efflux de l'AdoMet et à la
résistance à la sinéfungine (282). Par ailleurs, un changement au niveau du métabolisme de
l'AdoMet a été observé chez des souches de Leishmania sélectionnées pour la résistance à
l'antifolate methotrexate (MTX) (83, 127). En effet, l'expression de MAT2 augmente chez
ces mutants (83, 127) et la surexpression du gène MAT2 chez une souche sensible au MTX
50
facilite l'acquisition de la résistance à cet antifolate (83). Ces résultats démontrent
l'implication, quoiqu'indirecte, de MAT dans la résistance au methotrexate.
1.3.3.2 Rôle de l'AdoMet chez Leishmania
Il est connu depuis longtemps que l'AdoMet joue un rôle dans les réactions de
methylation cellulaire chez Leishmania (17, 187, 269), mais aucune méthyltransférase
spécifique n'a encore été caractérisée à l'échelle moléculaire (310). Récemment, une
guanine-N7 méthyltransférase, une enzyme qui catalyse la methylation AdoMet-
dépendante de la coiffe des ARNm a été identifiée et caractérisée chez le parasite T. brucei
et un homologue de cette protéine est codé par le génome de Leishmania (132).
Chez les mammifères, l'AdoMet sert également de précurseur pour la synthèse de la
cysteine et du glutathion (Fig. 1.10, réactions 4-7). La présence d'une voie de trans-
sulfuration inverse (Fig. 1.10, réaction 4, 5) active a surtout été démontrée chez les
trypanosomes, notamment chez T. brucei (19, 115, 252, 413). Le génome de Leishmania
code pour les deux enzymes de la voie de trans-sulfuration inverse (Fig. 1.10, réaction 4, 5)
et la caractérisation biochimique de l'une d'entre elles, la cystathionine p-synthase (CBS),
suggère que cette voie est fonctionnelle chez Leishmania (406). Une étude récente a
démontré que la y-glutamyl-cystéine synthase (yGCS) (Fig. 1.10, réaction 6), une enzyme
catalysant la première étape dans la biosynthèse du glutathion, est essentielle chez
Leishmania (234) ce qui démontre l'importance de cette molécule dans la biologie du
parasite. De plus, les trypanosomatides synthétisent un antioxydant très puissant, le
trypanothione (264). Ce conjugué glutathion-spermidine joue un rôle central dans le
maintien d'un environnement réducteur intracellulaire et dans les défenses anti-oxydatives
des parasites (238).
L'AdoMet sous sa forme décarboxylée (Fig. 1.10, réaction 10) joue un rôle
important dans le métabolisme des polyamines, notamment dans la biosynthèse de la
spermidine. La S-adénosylméthionine decarboxylase (Fig. 1.10, réaction 10), l'enzyme qui
génère les formes décarboxylées de l'AdoMet est largement étudiée chez les trypanosomes
et a été exploitée comme cible thérapeutique chez ces parasites (251, 396). Le gène de la S-
adénosylméthionine decarboxylase est présent dans le génome de Leishmania et une étude
51
a montré que des mutants nuls de ce gène deviennent auxotrophes pour la spermidine
confirmant le rôle de cette enzyme dans la synthèse des polyamines (315).
1.4 Les antifolates et Leishmania
Les folates sont essentiels pour la croissance et la survie de Leishmania. Cela
suggère que l'inhibition de certaines voies métaboliques vitales pour le parasite pourrait
constituer une excellente cible thérapeutique pour lutter contre la leishmaniose. Malgré leur
efficacité dans le traitement des infections bactériennes et parasitaires, les antifolates se
révèlent inefficaces contre les leishmanies. L'inefficacité de certains composés comme la
pyrimethamine et le trimethoprim résulte de leur faible affinité pour l'enzyme
bifonctionnelle DHFR-TS de Leishmania. Toutefois, le methotrexate, un analogue de
l'acide folique (Fig. 1.6), a démontré une très bonne affinité pour cette enzyme, mais inhibe
également très fortement la DHFR humaine et rend donc son utilisation comme agent anti-
Leishmania impossible (341). Par contre, l'étude des mécanismes de résistance au
methotrexate rencontrés chez le parasite a permis d'identifier plusieurs particularités du
métabolisme des ptéridines qui pourraient être exploitées dans le but de concevoir de
nouvelles stratégies pour combattre la leishmaniose.
1.4.1 Les mécanismes de résistance au methotrexate chez Leishmania
La génération des souches de Leishmania résistantes au methotrexate, en plus de
permettre d'identifier et d'étudier le métabolisme des ptérines, des folates et de la S-
adénosylméthionine, a conduit également à 1'elucidation des principaux mécanismes de
défense cellulaire permettant au parasite de survivre en présence du methotrexate. Les
principaux mécanismes de résistance au MTX rencontrés in vitro chez Leishmania sont (i)
une diminution de l'entrée de l'inhibiteur, (ii) une amplification génique de la DHFR-TS,
(iii) une amplification du gène de PTRl et (iv) une modification de la polyglutamylation
du MTX.
52
1.4.1.1 Diminution de l'entrée du MTX
Un moyen très efficace permettant au parasite Leishmania de résister aux effets
toxiques du MTX est de diminuer son entrée dans la cellule. Étant donné que le MTX et
l'acide folique partage le même système de transport, la réduction du transport de ces deux
molécules se fait de façon concomitante (95, 159, 275). Deux types de défauts dans le
système de transport folate/MTX ont été répertoriés chez les mutants hautement résistants
au MTX, une diminution partielle d'environ cinq fois le niveau de la souche sauvage et une
abrogation presque complète de l'influx (275). Leishmania est auxotrophe pour les folates
et dépend principalement du transport de ces molécules du milieu externe pour sa survie.
Or, les souches résistantes ayant un système de transport folate/MTX profondément altéré
doivent compenser pour cette perte. Chez L. tarantolae, tous les mutants ayant une
diminution presque complète de l'accumulation du MTX avaient en plus une surexpression
du transporteur de la bioptérine BT1. Cette surexpression n'est pas due à une amplification
du gène BT1 mais à un réarrangement génique impliquant celui-ci (179). La caractérisation
du transporteur BT1 a démontré qu'il peut transporter avec une faible capacité les folates
mais pas le methotrexate. La surexpression de BT1 permet donc d'avoir un apport suffisant
en folates pour assurer la survie du parasite lorsque le système privilégié de transport des
folates est inactif (179).
Par ailleurs, il est possible qu'une amplification du gène BT1 soit observée chez
d'autres espèces de Leishmania, chez qui l'entrée des folates est diminuée. Par exemple,
l'amplification du locus LDI, contenant le gène BT1, a été détectée chez des souches de L.
major résistantes au MTX et est bel et bien utilisée par le parasite pour survivre à la
présence du MTX (32). Toutefois, la surexpression de BT1 demeure surtout une réponse
secondaire à la suppression du transporteur primaire des folates.
BTI fait partie d'une famille multigénique dont certains membres sont délétés chez
des mutants hautement résistants au MTX et chez qui l'entrée des folates est abrogée (311,
312, 384). Deux de ces membres nommés FT5 et FT1 correspondent a des transporteurs de
folates et du MTX (311, 312). Les mutants où FT5 a été complètement inactivé par
recombinaison homologue sont encore capables de transporter des folates, et la transfection
de FT5 chez ces mutants renverse partiellement la résistance au MTX (311). Ces résultats
53
suggèrent qu'un autre transporteur de la famille multigénique pourrait aussi être impliqué
dans la résistance au MTX. En effet, des mutants de L. infantum amputés du gène FT1
présentent une diminution d'environ 75 % du transport des folates et du MTX (312)
confirmant ainsi son implication dans ce mécanisme de résistance. De plus, la
surexpression de FT1 chez des mutants de L. tarentolae hautement résistants au MTX
restaure le transport de l'antifolate au même niveau que la souche sauvage (312).
1.4.1.2 Amplification génique de la DHFR-TS
L'amplification génique chez Leishmania est un mécanisme fréquemment utilisé en
réponse aux stress extérieurs (31, 108, 125, 261). L'amplification du gène DHFR-TS est le
premier exemple d'amplification génique étudié chez un parasite protozoaire et a été
observé chez une souche de L. tropica résistante au MTX (65). Par la suite, ce phénomène a
été retrouvé chez d'autres espèces de Leishmania sélectionnées pour la résistance au MTX
(31, 34, 95, 384, 400). Une amplification du gène de la DHFR-TS est fréquemment
observée chez des mutants sélectionnés de L. major. Par contre, chez d'autres espèces
comme L. tarentolae, il n'est possible d'observer une telle amplification seulement lorsque
le gène de la ptéridine reductase (PTRl) a été préalablement inactivé (92, 180). Ceci
pourrait s'expliquer par le fait que PTRl confère un plus haut niveau de résistance au MTX
et que le locus sur lequel il se trouve est plus facile à amplifier par le parasite (180).
Les cas de résistance aux antifolates due à des mutations dans le gène de la DHFR-
TS sont très fréquents chez Plasmodium falciparum, l'agent étiologique de la malaria
(254). Par contre, ce mécanisme de résistance n'a été décrit qu'une fois chez Leishmania
(9).
1.4.1.3 Amplification génique de PTRl
Le gène de PTRl est situé dans une région du génome nommée le locus H. Ce
dernier est souvent amplifié chez des mutants résistants à divers inhibiteurs tels les
oxyanions (5, 46, 123, 273), l'antimoine (131), l'arsenite (258), la primaquine (94) et le
MTX (33, 124, 142, 275, 276, 287).
54
La fonction principale de PTRl est la réduction de la bioptérine et de la
dihydrobioptérine (BH2) en tétrahydrobioptérine (BH4), mais elle peut en plus, dans une
moindre mesure, réduire l'acide folique en tétrahydrofolate (THF) (245, 398). La
surexpression de PTRl en présence du MTX confère des niveaux de résistance
considérables chez le parasite (47, 276). Le MTX est un puissant inhibiteur de la DHFR et
cette activité est attribuée principalement aux fortes interactions entre le site actif de
l'enzyme et le groupement p ABA de l'antifolate (149). Par contre, ce groupement n'a que
très peu d'affinité avec le site actif de la PTRl, ce qui explique pourquoi la surexpression
de celle-ci peut outrepasser l'inhibition de DHFR-TS et assurer la survie des parasites en
fournissant à la cellule des quantités suffisantes de folates réduits (149, 246). Ce
mécanisme de compensation suggère qu'une stratégie thérapeutique basée sur la
suppression de la régénération du THF doit nécessairement combiner l'inhibition de
DHFR-TS et de PTRl.
1.4.1.4 Altération de la polyglutamylation du MTX
Il a été démontré chez différents mutants résistants au MTX et ayant une réduction
partielle ou presque complète de l'accumulation de folate/MTX que les formes
monoglutamylées du MTX sont majoritaires dans ces mutants alors que l'acide folique est
polyglutamylé. Cette différence n'est pas due à une diminution de l'activité FPGS face au
MTX. Par contre, il est possible qu'une activité MTX-hydrolase (e.g. alpha-hydrolase,
gama-glutamyl hydrolase) pourrait être responsable de la diminution de la chaine
polyglutamate du MTX (89). Il a aussi été observé que la concentration extracellulaire en
folates pouvait influencer le comportement du parasite envers le MTX. En effet, la
surexpression de FPGS conduit à une résistance au MTX dans un milieu riche en folates et
à une susceptibilité dans un milieu pauvre en folates comparativement à la souche sauvage
(89).
55
1.5 Transport des donneurs d'unités monocarbonées (folate, AdoMet)
Les folates et l'AdoMet sont des molécules polaires et sont incapables de traverser
la bicouche lipidique par diffusion passive. Leur passage à travers la membrane nécessite
donc des protéines de transport membranaire. Dans cette section nous allons aborder les
différents systèmes de transport des folates et de l'AdoMet présents chez différents
organismes. Le transport des ptéridines (bioptérine et folate) et d'AdoMet chez Leishmania
sera abordé dans la section 1.6.
1.5.1 Chez les bactéries
Chez les bactéries, deux systèmes de transport de folates ont été caractérisés; le
transporteur slr0642 de la famille FBT et le transporteur FolT de la classe des transporteurs
ECF (Energy-Coupling Factor), par contre le transport de l'AdoMet est assuré par un
membre de la superfamille des transporteurs de metabolites.
1.5.1.1 Le transporteur slr0642 de la famille FBT
Le premier système permettant l'influx des folates chez les bactéries a été isolé et
caractérisé chez la cyanobactérie Synechocystis (169), un organisme qui a en plus la faculté
de synthétiser les folates (77). Ce transport est assuré par la protéine slr0642, un membre de
la famille des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT) caractérisée à l'origine chez
le parasite Leishmania (169). Les expériences de complémentation réalisées avec slr0642
sur des mutants E. coli auxotrophes pour les folates et incapables d'en effectuer le
transport, ont montré que la protéine slr0642 transporte le folate monoglutamylé ainsi que
le methotrexate, mais pas le folate triglutamylé et le pABA-Glu (169). Chez E. coli, le
transport de/?ABA-Glu est effectué par un système de faible affinité codé par le gène AbgT
(50, 150). La caractérisation du transporteur AbgT est à l'origine de la famille de
transporteur pAB A-Glu, classée dans la superfamille de transporteur d'ions (293).
Le transporteur slr0642 ainsi que les autres membres de la famille FBT font partie
de la superfamille des facilitateurs majeurs (MFS pour Major Facilitator Superfamily) (55)
caractérisée par la présence de 12 domaines transmembranaires avec les parties N- et C-
56
terminales dirigées vers le cytoplasme (185). Des transporteurs de la MFS avec seulement
6, 14 ou 24 domaines transmembranaires ont été aussi identifiés (185). Cette superfamille
de protéines membranaires est retrouvée des bactéries jusqu'aux eucaryotes supérieurs où
elles assurent le symport, l'antiport et l'uniport de divers substrats, tels des sucres, des
metabolites intermédiaires et des antibiotiques (328). L'analyse de séquence de la protéine
slr0642 a indiqué la présence de 12 domaines transmembranaires avec une localisation
cytoplasmique des extrémités N- et C-terminales (Fig. 1.12). L'utilisation de la mutagénèse
dirigée et la construction d'un modèle structural de slr0642 en se basant sur la structure
cristallographique de LacY d'E.coli ont apportées des données précieuses sur la relation
structure-fonction du transporteur (100). En particulier, l'étude des acides aminés conservés
dans l'ensemble des transporteurs de la famille FBT a permis de montrer leur importance
pour l'activité de transport (100). Ce même travail met en évidence les résidus qui sont
critiques pour l'activité de transport et dont la majorité se concentre au niveau des
domaines transmembranaires 1, 4, 7 et 10, formant la base de la cavité centrale telle que
prédite dans le modèle structural de slr0642 (100).
H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12
Figure 1.12. Représentation de la structure secondaire du slr0642. (Tiré de (169)).
Le slr0642 est une protéine formée de deux groupes de 6 hélices transmembranaires reliés par une petite boucle cytoplasmique entre les hélices 6 et 7. Les deux extrémités N- et C-terminales sont du côté cytoplasmique.
57
1.5.1.2 Le transporteur FolT de la classe des transporteurs ECF
Certains lactobacilles comme Lactobacillus casei et Lactobacillus salivarius sont
auxotrophes pour les folates et requièrent une source de folates exogène pour leur
croissance. L'existence d'un système permettant l'influx des folates chez ces bactéries est
connu depuis maintenant un peu plus de 30 ans (138, 139, 178) et le transporteur
responsable de cette activité, FolT, a été récemment caractérisé (316). FolT fait partie d'une
nouvelle classe de transporteurs membranaires identifiée exclusivement chez les
procaryotes; les transporteurs ECF (Energy-Coupling Factor) (316). Chaque transporteur
ECF (Fig. 1.13) est composé d'une protéine de liaison au substrat (composante S) et d'un
module de couplage d'énergie (module AT) constitué de deux domaines ATPases
(composantes AA') et d'une protéine transmembranaire conservée (composante T) (88,
316). Les nombreuses composantes S de cette classe de transporteurs ont été classées en 21
familles de protéines et un substrat spécifique a été prédit pour chacune d'elles (316). Pour
un certain nombre de transporteurs (e.g. transporteurs de folate, thiamine, biotine,
riboflavine et pantothenate) la spécificité de substrat a été vérifiée expérimentalement (88,
316).
Substrate
Periplasm
Cytoplasm
Figure 1.13. Organisation schématique des transporteurs ECF. (Tiré de (415)). Un transporteur ECF comporte 4 domaines : 2 domaines transmembranaires dont un de liaison au substrat (S) et 2 domaines de couplage d'énergie (AA').
58
La composante S du transporteur des folates de L. casei, codée par le gène FolT, est
une protéine de 6 domaines transmembranaires ayant une très forte affinité pour les folates
(99) et forme avec un module AT (EcfAA'T) un transporteur actif permettant l'influx de 5-
CHO-THF chez Lactococcus lactis (316). La fonction de FolT a aussi été caractérisée grâce
à l'utilisation d'une souche d'E.coli auxotrophe pour le pABA et naturellement déficiente
pour le transport des folates, où seulement la surexpression à la fois de FolT et du module
EcfAA'T permet au mutant de croître en présence de 5-CHO-THF (316). Des homologues
de la composante S du FolT ont été identifiés principalement chez les Firmicutes qui
comprend plusieurs pathogènes, tels Mycoplasma capricolum, Clostridium novyi,
Streptococus mutans, Bacillus anthracis et Clostridium botulinum (99).
1.5.1.3 Le transporteur de la .V-adénosv (methionine
L'AdoMet est une molécule vitale pour toutes cellules procaryotes et eucaryotes. Ce
metabolite est synthétisé par la methionine adénosyltransférase (MAT), une enzyme
essentielle chez E. coli (401). L'analyse de la séquence du génome de Rickettsiaprowazekii
a révélé la présence de plusieurs pseudogènes, parmi eux le gène metK codant pour MAT
(6, 7). Le gène metK d'une souche de R. prowazekii est inactivé par un codon stop et code
pour une enzyme non fonctionnelle (82). Afin de compenser la perte de la fonction de
MAT, Rickettsia possède un transporteur permettant l'influx de l'AdoMet (381). Ce
transporteur, nommé SAM, a été isolé par criblage fonctionnel sélectionnant pour le
transport de l'AdoMet radioactif. La caractérisation du transporteur a montré que c'est une
protéine de 294 acides aminés, contenant 10 domaines transmembranaires, et qui a une
forte affinité pour l'AdoMet (Km= 4.7 pM) (381). L'homologie de séquence observée entre
SAM et certains membres de la superfamille des transporteurs de metabolites suggère que
celui-ci est aussi membre de cette superfamille (381). La deletion du gène metK chez E.
coli n'a pu être obtenue sans une complémentation par le gène codant pour le transporteur
SAM, confirmant ainsi le rôle essentiel de ce transporteur (82). Par ailleurs, un membre de
la classe des transporteurs ECF pourrait aussi médier le transport de l'AdoMet chez les
bactéries. En effet, une fonction de transport d'AdoMet a été prédite pour la famille
MtsTUV, mais l'activité de transport n'a pas encore été démontrée (88, 316).
59
1.5.2 Chez les levures et les champignons
Grâce à la génération de mutants déficients dans la synthèse des folates on sait
maintenant que les cellules de Saccharomyces cerevisiae peuvent puiser les folates du
milieu extérieur (26, 128). Ces études suggèrent la présence d'un système de transport des
folates chez la levure, mais cet aspect du métabolisme des folates n'a pas été caractérisé.
Quant au transport de l'AdoMet, des études antérieures ont mis en évidence l'existence
d'un système de transport de haute affinité permettant l'influx de l'AdoMet à travers la
membrane plasmique de S. cerevisiae (239, 288) et le transporteur en question, SAM3, a
été identifié et caractérisé (321). Cette dernière étude a aussi mis en évidence l'existence
d'un transporteur putatif de faible affinité (Km= 160 pM) pour l'AdoMet chez la levure
(321). Les vacuoles de S. cerevisiae possèdent aussi un système de transport de faible
affinité (Km= 68 pM) pour l'AdoMet (342), mais le transporteur impliqué dans ce système
n'a pas jusqu'à présent été identifié. Par contre, un transporteur mitochondrial d'AdoMet,
SAM5P, a été caractérisé (209).
Des évidences biochimiques ont montré que le champignon Pneumocystis carinii
possède un système de transport actif de haute affinité (4.5 pM) pour l'AdoMet (226). Par
contre, les auteurs de cette étude n'ont pu mesurer l'activité enzymatique de l'enzyme
MAT et concluent que Pneumocystis carinii est auxotrophe pour l'AdoMet et dépend
exclusivement de l'influx de cette molécule du milieu extérieur (226). Une étude récente a
mis en doute cette auxotrophic puisque la purification et la caractérisation biochimique de
l'enzyme MAT de P. carinii ont démontré que celle-ci est bel et bien fonctionnelle (181).
Jusqu'à présent, le seul organisme dont le gène de MAT a été inactivé et qui dépend
exclusivement d'une source exogène d'AdoMet pour sa survie est la bactérie Rickettsia
prowazekii (82, 381).
1.5.2.1 Le transporteur SAM3
Le transporteur SAM3 a été isolé par complémentation fonctionnelle d'un mutant de
S. cerevisiae incapable d'utiliser l'AdoMet comme source de soufre dû à un défaut au
niveau du transport de cette molécule (321). L'étude des paramètres cinétiques du transport
de l'AdoMet chez la cellule sauvage ainsi que chez la cellule dont le gène codant pour
60
SAM3 a été supprimé a montré que celui-ci correspondait à un transporteur de haute
affinité pour l'AdoMet (321). La protéine SAM3 est constituée de 12 domaines
transmembranaires et appartient à la famille de permeases aux acides aminés (321).
Récemment, il a été démontré que SAM3 a aussi la capacité de transporter les polyamines
(putrescine et spermidine) (385) mais avec une faible affinité et une faible capacité de
transport comparativement à l'AdoMet. La surexpression de SAM3 chez la levure conduit à
une hypersensibilité à la sinéfungine, indiquant que SAM3 transporte aussi l'inhibiteur
(421).
1.5.2.2 Le transporteur SAM5P
La protéine SAM5P, connue aussi sous le nom de PET8, correspond à un
transporteur mitochondrial de l'AdoMet (209). Lorsqu'il est reconstitué en liposome,
SAM5P peut fonctionner comme un uniporteur permettant l'import de l'AdoMet dans une
seule direction et comme un antiporteur qui échange l'AdoMet extérieur contre l'AdoMet
ou l'AdoHcy intérieur (209). Une cellule de levure dont le gène YNL003c codant pour
SAM5P a été supprimé est auxotrophe pour la biotine dû à un manque d'AdoMet dans la
mitochondrie (209). En effet, ce phénotype peut être complémenté soit par la surexpression
du transporteur SAM5P ou bien par celle de l'enzyme methionine adénosyltransférase
(MAT) cytosolique à l'intérieur de la mitochondrie, démontrant ainsi l'importance du
transporteur SAM5P dans le métabolisme de la biotine (209). Des orthologues de SAM5P
ont été retrouvés chez d'autres cellules eucaryotes incluant les mammifères (1),
Arabidopsis thaliana (40, 267) et les trypanosomatides (67).
SAM5P appartient à la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF pour
Mitochondrial Carrier Family) (revue dans (8, 266, 291)). Les transporteurs de la MCF
assurent le transport spécifique d'une variété de molécules (e.g. acides aminés, nucleotides,
coenzymes, intermédiaires du cycle de Krebs) de l'espace intermembranaire vers la
matrice, ou inversement (8, 266, 291). Certains membres de cette famille se retrouvent
aussi au niveau des membranes des organelles telles les hydrogénosomes, les peroxysomes,
les chloroplastes et le reticulum endoplasmique (40, 87, 190, 268). Tous les transporteurs
de la MCF présentent une structure tripartite composée d'une répétition de trois domaines
61
homologues d'une taille d'environ 100 résidus (Fig. 1.15). Chaque domaine contient deux
hélices a transmembranaires jointe par une boucle hydrophile, et un motif conservé
(PX[D/E]XX[R/K]). Les deux extrémités N- et C-terminales sont situées du coté
cytosolique (266, 291).
Cytosol
HjN
J J J J J J J J J Matrix
rrs COOH
Figure 1.14. Modèle topologique des membres de la MCF. (Tiré de (291)).
Tous les membres de la MCF sont formés de 6 hélices a transmembranaires (I-VI) organisées en trois domaines (A, B et C). Les trois domaines sont connectés par une petite boucle hydrophile (a et b). Les deux extrémités N- et C-terminales sont situées dans le cytoplasme.
1.5.3 Chez les protozoaires
Des évidences biochimiques montrent que les parasites de la famille des
apicomplexes comme Toxoplasma gondii et Plasmodium falciparum possèdent un système
de transport actif et spécifique pour les folates (211, 399), mais l'identité du transporteur
impliqué dans ce système est inconnue. Par contre, le génome de ces deux parasites code
pour des transporteurs de la famille FBT, évoquant la possibilité qu'un membre de cette
famille soit impliqué dans le transport des folates (211, 399). Chez les trypanosomes (e.g.
62
Trypanomosa brucei, Trypanomosa rhodesiense), les travaux de Goldberg et al. ont mis en
évidence l'existence d'un système de transport spécifique pour l'AdoMet (114, 116, 117).
Ce système a une faible affinité (de l'ordre du mM) pour l'AdoMet et il est insensible aux
inhibiteurs métaboliques indiquant que l'accumulation d'AdoMet se fait par un transporteur
facilité (114, 117).
1.5.4 Chez les plantes
Trois types de transporteurs de folate ont été caractérisés chez les cellules végétales;
cela inclus les deux transporteurs de l'enveloppe plastidiale et un transporteur localisé au
niveau de la membrane des vacuoles. Par contre, un seul transporteur d'AdoMet a été
caractérisé et celui-ci a été localisé aussi bien au niveau de l'enveloppe des chloroplastes
qu'au niveau de la membrane des mitochondries.
1.5.4.1 Le transport des folates
Des études antérieures ont montré que les cellules d'Arabidopsis ont la faculté de
puiser certains folates dans le milieu de culture, ce qui suggère l'existence d'un système de
transport des folates au niveau de la membrane plasmique de la cellule (292, 317). Deux
transporteurs appartenant à des familles différentes et localisés au niveau de l'enveloppe du
chloroplaste ont été caractérisés (29, 169). Le premier transporteur, codé par le gène
At2g32040, est un membre de la famille des transporteurs de folate et de la bioptérine
(FBT) (169). La fonction de ce transporteur a été mise en évidence en même temps que
celle du transporteur slr0642 et en utilisant la même stratégie. Les auteurs avaient montré
que les deux protéines transportaient la forme monoglutamylée de folate (ainsi que le
methotrexate) mais pas la forme triglutamylée (169). Il faut préciser qu'en plus du
transporteur At2g32040, le génome d'Arabidopsis thaliana code pour 8 autres membres de
la famille FBT dont 5 ne semblent pas transporter le folate, ce qui suggère un rôle dans le
transport d'autres types de substrats (100).
Le deuxième transporteur plastidial, nommé AtFOLTl, appartient à la famille des
transporteurs mitochondriaux (MCF) (29). La protéine AtFOLTl présente une forte
homologie de séquence (40 % d'identité) avec le transporteur mitochondrial de folate
63
identifié chez l'humain (29). Par la complémentation fonctionnelle des cellules de l'ovaire
du hamster chinois (cellules CHO) auxotrophes pour la glycine (dû à une absence de
transport de folate à l'intérieur de la mitochondrie) ainsi que des cellules d'il, coli
auxotrophes pour le pABA, il a été démontré que AtFOLTl peut médier le transport du
folate (29).
Les mutants déficients pour chacun des deux transporteurs ne diffèrent pas
significativement des plantules sauvages en termes de la croissance, de la morphologie, de
la couleur des feuilles, de la photosynthèse et du contenu en folates dans les chloroplastes.
Ceci indique donc que l'absence d'un transporteur peut être compensée par le deuxième (29,
169). Cependant, on ne peut pas exclure la présence d'autres transporteurs de folate au
niveau du chloroplaste.
Les folates sont aussi présents dans d'autres compartiments de cellules végétales
tels les mitochondries et les vacuoles (134) ce qui implique la présence d'un système de
transport des folates dans ces organelles. Le génome d'Arabidopsis thaliana code pour
plusieurs transporteurs de la famille des protéines de multirésistance aux médicaments
(MRP) et certains membres tels MRP1 et MRP2 ont été localisés au niveau de la membrane
des vacuoles (300). Des expériences de transports effectuées sur des vésicules de
membranes vacuolaires surexprimant le transporteur MRP1 ont permis de montrer que ce
dernier avait la capacité de transporter le folate monoglutamylé et l'antifolate MTX en
utilisant l'ATP comme source d'énergie (300). Par contre, le folate polyglutamylé n'est que
très faiblement transporté par MRP1 (300).
1.5.4.2 Le transport de la 5-adénosylméthionine
Jusqu'à présent les études ont rapporté que les cellules de plantes synthétisent
l'AdoMet dans le cytosol (135), ce qui indique que les organelles doivent importer
l'AdoMet afin qu'il puisse remplir ses fonctions métaboliques notamment les réactions de
methylation. En effet, des études ont mis en évidence l'existence d'un système de transport
de l'AdoMet au niveau des chloroplastes (306) et de l'appareil de Golgi (151). Par la suite,
le transporteur plastidial de l'AdoMet, nommé SAMT1, a été caractérisé (40). Le
64
transporteur SAMT1 appartient à la MCF et sa reconstitution en liposomes permet de
montrer qu'il fonctionne comme un antiporteur AdoMet/AdoMet et AdoMet/AdoHcy (40).
L'inactivation du gène SAMT1 chez les plantes cause un important retard au niveau de la
croissance et a permis de montrer que le transport d'AdoMet par SAMT1 est nécessaire
pour le métabolisme des prényllipides, notamment pour la voie de biosynthèse de la
chlorophylle (40). De façon surprenante, une autre étude menée par le groupe de Palmierie
a révélé que SAMT1, lorsqu'il est fusionné à la protéine fluorescente verte (GFP), a été
localisé au niveau de la mitochondrie chez les protoplastes d'Arabidopsis transformés
transitoirement (267). Bouvier et al. ont fusionné la partie N-terminale (80 premiers acides
aminés) de SAMT1 avec la GFP et ont montré que la protéine chimère est localisée au
niveau du chloroplaste (40) tandis que le groupe de Palmierie a fusionné le gène de la GFP
en C-terminale de la séquence complète de SAMT1 (267). Bien que les différentes
stratégies expérimentales utilisées puissent expliquer ces résultats contradictoires, des
études supplémentaires sont nécessaires pour démontrer sans équivoque que SAMT1
possède une double localisation, à la fois mitochondriale et plastidiale.
1.5.5 Chez les mammifères
Les systèmes de transport des folates sont très bien connus chez les mammifères. En
effet, plusieurs types de transporteurs de folate ont été identifiés et caractérisés. Par contre,
excepté le transporteur mitochondrial de l'AdoMet, jusqu'à présent aucun autre transporteur
d'AdoMet n'a été identifié chez les mammifères.
1.5.5.1 Le transport des folates
Les différents types de transporteurs spécifiques au folate chez les mammifères sont
le transporteur de folate réduit (RFC), les récepteurs de folate (RF), le transporteur de folate
couplé aux protons (PCFT) et le transporteur mitochondrial de folate (MFT).
1.5.5.1.1 Le transporteur de folate réduit
Les formes réduites de folates sont majoritairement transportées par une protéine
nommée transporteur de folate réduit (RFC). Le RFC, nommé également SLC19A1, forme
65
avec deux autres protéines (SLC19A2, SLC19A3) la famille des transporteurs de solutés 19
(SLC19) (107). Même si SLC19A2 (THTR1) et SLC19A3 (THTR2) partagent une bonne
homologie de séquence (environ 40 % d'identité) avec le RFC, ces deux protéines ne
transportent pas les folates. En effet, SLC19A2 (THTR1) et SLC19A3 (THTR2) sont
spécifiquent à la thiamine, tandis que RFC a la capacité de transporter les formes
phosphorylées de la thiamine (86, 301, 416, 417). Le gène codant pour le RFC a été isolé
pour la première fois chez la souris (80) suivi par la caratérisation du RFC du hamster (405)
et du l'humain (295, 404, 409). Le RFC est un transporteur facilité de folate et possède des
affinités différentes avec les différentes molécules de folates. Les RFC humains ont une
forte affinité (Km ~ 2-7 pM) pour les folates réduits (e.g. 5-methyl-THF, 5-formyl-THF) et
le methotrexate comparativement à l'acide folique (K{ ~ 150-200 pM) (119). Le
fonctionnement de RFC ne requiert pas l'énergie résultant de l'hydrolyse de l'ATP, et il
n'est pas dépendant du Na+ ou des protons (118, 137). Par contre, le transport médié par le
RFC est très sensible au gradient transmembranaire d'anions, en particulier le gradient de
phosphate organique. Les phosphates organiques sont fortement concentrés dans les
cellules où ils sont synthétisés dans une réaction ATP-dépendante et sont largement
retenus. La distribution assymétrique de ces ions à travers la membrane fournit la force
motrice de l'influx de folates par les RFCs (118). Le RFC est exprimé dans une grande
variété de tissus autant normaux que cancéreux. Certains organes tels l'intestin et le foie ont
une très forte expression de ce gène alors que pour d'autres (cœur, muscles squelettiques),
celle-ci est beaucoup plus faible (402).
La protéine RCF est constituée de 12 domaines transmembranaires (TMDs) avec
une orientation cytoplasmique des extrémités N- et C-terminales (Fig. 1.16) (49, 102, 192).
Le RCF humain possède un site de N-glycosylation (Asn58) dans la boucle connectant le
TMD1 et le TMD2 (410). La grande boucle qui relie le TMD6 à TMD7 est peu conservée
entre les différentes espèces de mammifères et peut être carrément remplacée par un
domaine non homologue du transporteur SLC19A2 (193). Lorsque les parties TMD1-
TMD6 et TMD7-TMD12 du RFC ont été simultanément surexprimées dans les cellules
humaines RFC1', elles étaient dirigées vers la surface de la membrane plasmique et
restauraient l'activité de transport (408). Par conséquent, le rôle principal de la boucle du
66
TMD6/TMD7 est de fournir l'espace approprié entre les segments TMD1-TMD6 et TMD7-
TMD12 pour un transport optimal (408).
Figure 1.15. Topologie membranaire du transporteur de folate réduit. (Tiré de (419)).
Des études de structure-fonction par mutagénèse dirigée ont permis de montrer
l'importance des résidus conservés, situés dans plusieurs domaines transmembranaires
(TMD1, TMD2, TMD3, TMD4, TMD8, TMD10 et TMD11) dans l'activité de transport
(213). L'utilisation du TV-hydroxysuccinimide de [3H]méthotrexate dans des expériences de
marquage par photoaffinité a montré l'implication de la Lys411 du TMD11 dans la liaison
avec le groupement y-carboxyl du substrat (78). Des études récentes ont suggéré que
certains résidus situés dans les TMDs 4, 5, 7, 8 et 10 sont structurellement ou
fonctionnellement importants pour la formation d'une cavité hydrophile putative de liaison
au substrat (147, 148).
67
1.5.5.1.2 Les récepteurs de folate
Un autre système permettant le transport des folates est composé de trois isofomes
de récepteurs de folate (FRs), désignés RFa, RF|3 et RFy, liant les folates avec une haute
affinité. Ces protéines partagent une forte homologie de séquence (68-79 % d'identité), leur
taille varie entre 229 et 236 acides aminés et elles ont entre 2 et 3 sites de N-glycosylation
(97, 156, 198, 305, 326, 329). Les FRa et FRp sont ancrés à la membrane plasmique par
une molécule de glycosylphosphatidylinositol (GPI) alors que le FRy est sécrété (156, 198,
329, 353). Les FRs ont une très haute affinité pour l'acide folique (Kj 1-10 nM) (154) et
internalisent les folates par un mécanisme classique d'endocytose (156, 157, 198, 320,
329). Le FRa est exprimé dans les cellules épithéliales du rein, du plexus choroïde, de la
rétine, de l'utérus et du placenta (277, 329). Il est aussi exprimé dans les tumeurs,
particulièrement dans les carcinomes ovarien et utérin (277). De son côté, le FRP est
exprimé au cours de la myélopoïèse normale et on le retrouve dans le placenta, la rate, le
thymus, les monocytes CD34+ et dans les cellules de leucémie myéloïde aiguë et chronique
(305, 308, 318, 397). Le FRy, quant à lui, n'est exprimé que dans les tissus
hématopoïétiques (353). Les récepteurs de folate jouent un rôle important dans le transport
de folates au niveau de certains organes comme les reins (36), le placenta (294, 367, 368) et
le plexus choroïde (143, 303, 304, 411).
1.5.5.1.3 Le transporteur de folate couplé aux protons
Le transporteur de folate couplé aux protons (PCFT) a été découvert récemment
(243, 297, 386). Le PCFT (SLC46A1) fait partie de la famille des transporteurs de solutés
SLC46 qui regroupe deux autres membres de fonction inconnue, SLC46A2 et SLC46A3.
Le PCFT a été isolé initialement comme étant le transporteur intestinal pH indépendant de
Thème ayant une faible affinité (Km= 125 pM); il a été désigné sous le nom de HCP1
(heme carrier protein 1) (352). Cependant, des évidences suggèrent que les folates sont les
substrats physiologiques majeurs du PCFT : une affinité plus élevée pour les folates
comparativement à l'hème, une grande spécificité pour le folate (incluant une
stéreospécificité pour le 5-formyl-THF) et l'antifolate MTX et finalement, le rôle
étiologique de la protéine mutée dans le syndrome de malabsorption du folate héréditaire
68
(HFM) (243, 297, 386). Le PCFT est électrogénique, fonctionnerait comme un symporteur
HVfolate et son activité de transport est optimale à pH acide (297, 298, 386, 420)
Le profil d'expression de PFCT dans les différents organes humains fournit des
indices quant à ses rôles fonctionnels. Les niveaux d'ARNm de SLC46A1 sont élevés dans
l'intestin grêle, les reins, le foie, le placenta, la rétine et le cerveau. Dans l'intestin, PFCT
est fortement exprimé dans le jéjunum proximal et le duodénum (152, 297, 298). Les
données sur la structure secondaire du PCFT commencent à émerger. L'analyse du profil
d'hydrophobicité a prédit une protéine avec 12 domaines transmembranaires (TMD) et qui
possède des extrémités N- et C-terminales orientées vers le cytoplasme (Fig. 1.17).
L'analyse par immunofluorescence de la protéine fusionnée à 1'epitope hémagglutinine
(HA) a confirmé la topologie des extrémités N- et C-terminales (298, 387). Les deux sites
de N-glycosylation (N58, N68), situés dans la boucle connectant les TMDs 1 et 2 ne
semblent pas jouer de rôle dans le trafic ou la fonction de la protéine (387).
G65AfsX25 C66X
R113S R113C
P425R
Plasma membrane
COOH
Cytoplasm
Figure 1.16. Structure secondaire prédite du PCFT. (Tiré de (419)). Les positions des mutations provenant de patients avec le syndrome de malabsorption du folate héréditaire (HFM) sont indiquées dans la séquence de PCFT.
69
1.5.5.1.4 Le transporteur mitochondrial de folate
L'existence d'un système de transport de folate à l'intérieur des mitochondries
isolées du rat est connue depuis de nombreuses années (75, 146). Le transporteur
mitochondrial de folate de l'humain (hMFT), caractérisé récemment, est membre de la
MCF (266). Le hMFT a été isolé grâce à l'utilisation des cellules de l'ovaire du hamster
chinois (CHO) auxotrophes pour la glycine (glyB) et incapables de médier le transport des
folates à l'intérieur des mitochondries. En effet, lorsque les cellules CHO glyB ont été
transfectées par une banque d'ADN complémentaire de placenta humain, l'expression d'un
gène codant pour le hMFT complémentait l'auxotrophie pour la glycine (376). D'autres
études ont démontré que la mutation G192E située dans le domaine transmembranaire 4 du
transporteur MFT des cellules CHO glyB inactivait le transport mitochondrial de folate
conduisant ainsi au phénotype glyB (217). La transfection des cellules CHO glyB par
l'ADN complémentaire du MFT de hamster des cellules CHO sauvages entraine une
prototrophic pour la glycine et restaure le transport mitochondrial des folates (217). La
modélisation par homologie basée sur la structure cristallographique du transporteur
mitochondrial d'ADP/ATP bovin et des études de mutagénèse dirigée suggèrent que la
mutation G192E affecte vraisemblablement la liaison au substrat (280). Le mutant
MFT(R249A) était incapable de complementer le phénotype glyB. Ce mutant ainsi que le
mutant MFT(G192E) (glyB) ont montré une déficience sévère dans le transport
mitochondrial de 5-formyl-THF comparativement au MFT sauvage (280). Le fait que les
mitochondries des cellules CHO glyB sont sévèrement déficientes dans le transport du
folate laisse sous-entendre que le MFT est possiblement l'unique transporteur de ce
cofacteur dans cette organelle. La distribution de ce transporteur dans d'autres types de
cellules ou organes n'a pas été rapportée. Une étude avait cependant suggéré la localisation
du transporteur de folate réduit (RFC) au niveau de la membrane de la mitochondrie des
cellules de leucémie humaine (380), mais à ce jour, aucune autre étude n'a montré la
présence d'un tel transporteur au niveau de la mitochondrie chez d'autres cellules ou
organes.
70
1.5.5.1.5 Autres types de transporteurs de folate chez les mammifères
En plus des transporteurs hautement spécifiques pour les folates, il existe aussi
d'autres routes potentielles de transport de ces composés. Certains membres de la famille
SLC21 (transporteurs d'anions organiques (OAT)) et de la famille SLC22 (transporteurs
d'anions et de cations organiques) (130, 171, 347) peuvent aussi transporter les folates et
l'antifolate MTX. Ces deux familles sont exprimées dans plusieurs organes comme
l'intestin, le foie et le rein. Les deux membres de la famille SLC21, OAT-K1 et OAT-K2,
sont localisés spécifiquement dans le rein et sont exprimés au niveau des microvillosités de
la membrane apicale. L'affinité de ces transporteurs pour le MTX et le 5-methyl-THF est
d'environ 2 pM et pourraient jouer un rôle dans la réabsorption des folates dans le tubule
proximal (212). Les transporteurs OAT1, OAT2 et OAT3 appartiennent à la famille SLC22
et sont exprimés dans la membrane basolatérale des tubules rénaux (313). Ces transporteurs
ont généralement une faible affinité (10-700 pM) pour le MTX, dépendamment du système
d'expression utilisé (54, 253, 369, 388, 390).
Il existe aussi des protéines médiant l'efflux des folates et du MTX vers l'extérieur
de la cellule. Les protéines de type ABC (ATP-binding-cassette) telles les protéines de
multirésistance aux médicaments (MRP), MRP1-MRP5 (ABCC1-ABCC5), et la protéine
du cancer du sein impliquée dans la résistance BCRP (ABCG2), auraient une grande
capacité à transporter les folates et le MTX, mais avec une faible affinité (Km ~ 0.2 - 2 mM)
(13, 177, 403). Les MRPs ne transportent pas les substrats polyglutamylés (57, 414) ce qui
démontre l'importance de la polyglutamylation dans la rétention intracellulaire des folates.
La localisation des différentes protéines MRP dans la membrane apicale ou basolatérale des
cellules épithéliales montre la grande implication de ces protéines dans le transport
vectoriel des folates dans différents organes comme le rein, l'intestin et le foie (105, 174,
232,319,336).
1.5.5.2 Le transport de la .S-adénosylméthionine
Bien que plusieurs cellules eucaryotes possèdent un système qui permet de
transporter activement l'AdoMet à l'intérieur de la cellule, aucune étude n'a rapportée
l'existence d'un tel système au niveau de la membrane plasmique des cellules mammifères.
71
Les études pharmacocinétiques ont révélé que l'AdoMet est absorbé par la muqueuse
intestinale chez l'animal ainsi que chez l'humain mais que sa biodisponibilité systémique
est faible (37, 360, 361). Une étude récente a démontré que le transport de l'AdoMet à
travers les cellules épithéliales intestinales (cellules Caco-2) est lent et est assuré par un
mécanisme strictement paracellulaire, et ce sans aucune évidence de l'implication des
transporteurs membranaires (222). Par ailleurs, il n'est pas clair si les cellules du foie
(hépatocytes de rat) transportent l'AdoMet (38, 222). Par exemple, en incubant les
hépatocytes isolés de rat avec 2 ou 50 pM [methyl-1 CJAdoMet, Bontemps et al. ont
observé que celui-ci est utilisé principalement pour la methylation des phospholipides
membranaires sans qu'il soit transporter, quoique moins de 0.2% d'AdoMet radioactif est
retrouvé à l'intérieur des cellules. Ces auteurs concluent que l'AdoMet pénètre
difficilement les hépatocytes, mais qu'il est utilisé pour la methylation des phospholipides à
la surface externe de la membrane plasmique (38). En revanche, McMillan et al., ont
démontré que le transport de l'AdoMet dans les hépatocytes est lent et n'est pas saturable
dans une gamme de concentration de 0.001 à 100 pM. À l'équilibre, la concentration
intracellulaire d'AdoMet radioactif représente moins de 20% de la concentration
extracellulaire (1 pM) (222). Ces résultats suggèrent que les cellules mammifères
dépendent principalement de la voie de biosynthèse pour subvenir à leurs besoins en
AdoMet et n'importent pas des quantités importantes de cette molécule du milieu
extracellulaire.
L'absence de l'enzyme MAT dans les mitochondries des cellules des mammifères
suggère la présence d'un système de transport d'AdoMet dans ces organelles (145). Ce
système a été étudié pour la première fois par Home et al. qui ont révélé que l'entrée de
l'AdoMet à l'intérieur des mitochondries isolées de foie de rat est un processus médié par
un transporteur spécifique puisque le transport est inhibé seulement par la sinéfungine et
l'AdoHcy (145). Le transporteur mitochondrial de l'AdoMet de l'humain (SAMC) a été
identifié par criblage de la banque de séquences ESTs (expressed sequence tag) humains
avec la séquence du transporteur SAM5P de levure (1). La protéine SAMC, composée de
274 acides aminés, est membre de la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF). La
reconstitution de SAMC en liposomes a permis de montrer que celui-ci fonctionne
72
principalement selon un mécanisme d'échange de substrat. Par exemple, ce transporteur
permettrait in vivo d'échanger l'AdoMet cytosolique contre 1'AdoHcy mitochondrial (1).
Le gène codant pour SAMC (SLC25A26) est exprimé dans de nombreux tissus humains,
avec une plus haute expression dans le testicule (1).
1.5.6 Chez le ver nematode Caenorhabditis elegans
Deux orthologues du transporteur humain de folate réduit (hRFC), folt-1 et folt-2,
partageant respectivement 40% et 31% d'identité avec le hRFC, ont été identifiés dans le
génome de C. elegans (21). Le clonage et la caractérisation fonctionnelle de folt-1 et folt-2
a mis en évidence que seul folt-1 permet de transporter l'acide folique. La protéine folt-1 a
une haute affinité pour l'acide folique (Km= 1.23 pM) et une grande capacité de transport à
un pH acide comparativement à un pH neutre ou alcalin (21). Le transport in vivo de l'acide
folique est fortement réduit chez les vers folt-1" comparativement aux nematodes
sauvages, démontrant l'importance de folt-1 dans le transport de folate (21). De plus,
l'inactivation du gène folt-1 entraine la stérilité du C. elegans hermaphrodite (21) dû à des
défauts dans la prolifération des cellules germinales, et réduit aussi les activités
métaboliques et la longévité du nematode (15). Ces résultats indiquent que folt-1 joue un
rôle important dans le développement des cellules germinales et somatiques de C. elegans
(15).
Le gène folt-1 est fortement exprimé dans les organes du système digestif (pharynx,
intestin) comparativement aux autres tissus du vers nematode, et cette expression est
régulée de façon développementale étant plus élevée au stade larvaire comparativement au
stade adulte. Ces résultats ont été corrélés avec l'observation dans l'intestin de nematode
d'une forte expression de la protéine folt-1 fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP)
au cours des premiers stades de développement par rapport aux derniers (21). L'analyse de
la structure secondaire de folt-1 a révélé une protéine de 10 domaines transmembranaires
(TMD) avec une grande boucle cytoplasmique de 58 acides aminés entre les TMDs 5 et 6,
et les deux extrémités N- et C-terminales situées dans la partie intracellulaire (Fig. 1.18). Le
folt-1 de C. elegans possède deux sites potentiels de N-glycosylation (Asn-36, Asn-260)
(Fig. 1.18).
73
Un orthologue du transporteur mitochondrial de l'AdoMet humain (SAMC) a été identifié
dans une banque de données de C. elegans (numéro d'accession Z68160) (1), mais la
caractérisation de cette protéine n'a pas été rapportée jusqu'à présent.
Asn 36—*
NH*
Figure 1.17. Structure secondaire prédite du transporteur folt-1. (Tiré de (21)).
1.6 Le transport des ptéridines et de l'AdoMet chez Leishmania
Le transport cellulaire des ptéridines (bioptérine et folates) et de l'AdoMet chez le
parasite Leishmania est connu depuis plusieurs années, mais seuls les transporteurs des
ptéridines ont été identifiés. Nous avons décrit dans notre laboratoire trois transporteurs de
ptéridines; le transporteur de la bioptérine BT1 et les deux transporteurs de folate (FT5 et
FT1). BT1 et FT1 ont été également décrits par d'autres laboratoires (73, 188). Ces trois
protéines homologues forment une nouvelle classe de transporteurs chez Leishmania; la
famille des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT). Les membres de cette famille
se retrouvent chez les parasites protozoaires, les cyanobactéries, les plantes supérieures
comme Arabidopsis thaliana. Comme indiqué précédemment, la famille FBT a été classée
74
dans la superfamille des facilitateurs majeurs (55). Leishmania compte 13 transporteurs
FBT, mais la fonction de la plupart d'entre eux est inconnue. Déterminer les fonctions des
ces transporteurs nous permettrait de mieux comprendre le rôle de la famille FBT dans le
métabolisme du parasite et d'envisager un jour la possibilité d'exploiter ces protéines dans
un but thérapeutique.
1.6.1 Le transporteur BT1
Le transporteur de la bioptérine BT1 a été isolé par des expériences de clonage
fonctionnel sélectionnant pour la résistance au MTX (179). BT1 est une protéine de 631
acides aminés, comprenant 12 domaines transmembranaires putatifs et localisée au niveau
de la membrane plasmique du parasite. La surexpression de ce transporteur a permis de
montrer qu'il pouvait aussi transporter, dans une moindre mesure, l'acide folique, mais pas
le MTX (179, 188). Cette sélectivité a un impact important sur la résistance au MTX (voir
la section 1.4.1.1). La deletion de BT1 par recombinaison homologue réduit fortement le
transport de la bioptérine démontrant qu'il était le principal transporteur de cette molécule
(179, 188). Le fait que l'ajout de la bioptérine dans le milieu de culture soit obligatoire pour
la survie des souches déficientes en BT1 suggère que celui-ci joue un rôle physiologique
important chez le parasite (74, 179, 188, 272). Chez les promastigotes, l'accumulation de la
bioptérine est plus grande en phase logarithmique de croissance comparativement à la
phase stationnaire où une réduction de plus de 80 % a été observée. De plus, une
augmentation de 30 % dans l'activité de transport ainsi qu'une modification des transcrits
d'ARNm a été observée chez les amastigotes de L. mexicana par rapport aux promastigotes
(73).
1.6.2 Les transporteurs des folates (FT5 et FT1)
La caractérisation du transporteur BT1 a révélé que celui-ci faisait partie d'une
famille multigénique et que certains membres de cette famille étaient délétés chez les
mutants ayant une réduction presque complète de l'influx de l'acide folique et du MTX
(179, 311, 312). L'isolement et le séquençage des fragments d'ADN correspondants a
conduit à la caractérisation de deux transporteurs de folates, nommés FT5 et FT1 (311,
75
312). FT5 est un transporteur de très haute affinité pour l'acide folique (84 nM) mais
possède une faible capacité de transport (311). Les expériences de transport effectuées sur
une souche déficiente en FT5 ont montré que, comparativement à la souche sauvage,
l'influx de Folate/MTX était diminué dans un milieu pauvre en folates (23 nM), mais
aucune différence significative n'a été observée dans un milieu riche en folates (15 pM).
Ces résultats suggéraient donc que FT5 n'était pas le principal transporteur de folate et
qu'un autre membre de la famille multigénique assurait cette fonction. En effet, la
caractérisation de FT1 a montré qu'il correspond à un transporteur de folate de haute
affinité, quoique que moins élevée que FT5, mais possède une grande capacité de transport
(312). L'analyse des mutants de L. infantum déficients en FT1 a montré que près de 75 %
de l'activité de transport de folate était attribuable à FT1 (312). FT1 a également été isolé
chez L. donovani et sa contribution dans l'activité de transport de folate est de 99% (73).
Ceci démontre que FT1 est le principal transporteur des folates chez Leishmania
1.6.2.1 Structure secondaire de FIT
FT1 présente une topologie caratéristique des protéines de la superfamille des
facilitateurs majeurs (MFS) (Fig. 1.14). En effet, la prédiction de la structure secondaire de
FT1 basée sur l'analyse du profil d'hydrophobicité a montré un modèle de 14 domaines
transmembranaires (DTMs) avec une grande boucle cytoplasmique joignant les domaines 6
et 7, et des extrémités N- et C-terminales du côté cytoplasmique. La localisation
cytoplasmique de la partie C-terminale de FT1 a été confirmée expérimentalement (81).
L'analyse de la structure-fonction de FT1 par mutagénèse dirigée des 10 acides aminés
chargés les plus conservés dans l'ensemble des transporteurs de la famille FBT a mis en
évidence le rôle de ces résidus dans la fonction de FT1 (Fig. 1.14). En particulier, plusieurs
résidus situés au niveau des différentes boucles sont soit importants (Kl 16, Kl33, R497,
D529) ou essentiels (D124, R134, E565, D537) pour le transport de l'acide folique. Le
résidu R497 de la boucle cytoplasmique connectant les domaines 10 et 11 est impliqué dans
la liaison au substrat. L'analyse des résidus chargés au niveau des DTMs 4 et 11 a aussi
démontré le rôle essentiel de ceux-ci dans l'activité de transport. L'étude des paramètres
cinétiques des différentes protéines mutées a montré que l'altération de l'activité de
transport est due soit à un changement au niveau de l'affinité (Km) de FT1 pour son substrat
76
ou bien à un changement au niveau de l'efficacité du transport (Vm )̂ (81). Six acides
aminés (Kl 16, D124, D179, R497, D537 et E565) parmi les dix analysés dans cette étude
ont également été mutés dans Slr0642 (respectivement, K85, D93, D149, R309, D348 et
E376), le transporteur de folate de la cyanobactérie Synechocystis (100). Cinq d'entre eux
(K85, D93, D149, R309, D348) sont critiques pour l'activité de transport de slr0642 (100).
Extracellular
Intracellular
Figure 1.18. Topologie membranaire prédite du transporteur FT1. (Tiré de (81)).
FT1 est composé de 14 domaines transmembranaires avec une grande boucle cytoplasmique liant les domaines 6 et 7. Les deux extrémités N- et C-terminales sont localisées dans le cytoplasme. Les résidus étudiés par mutagénèse dirigée sont représentés par des cercles noirs et leur position est indiquée par des chiffres.
1.6.2.2 Régulation de l'expression de FT1
L'activité de FT1 est régulée différentiellement au cours des phases de croissance
chez les promastigotes, ayant une forte activité en phase logarithmique comparativement à
77
la phase stationnaire où l'entrée de folate est fortement diminuée (73, 312). Cette réduction
de l'entrée de folate s'explique par la relocalisation du transporteur de la membrane
plasmique vers un compartiment intracellulaire suivi de sa dégradation spécifique (312).
L'étude du transport de l'acide folique dans les deux stades de vie du parasite
(promastigote et amastigote) a montré qu'il n'y avait pas de différence dans l'activité de
transport. En raison de l'absence d'une sonde spécifique aux transporteurs des folates,
l'établissement d'une corrélation entre le profil d'expression de leur transcrit (par Northern
blot) et la variation dans le transport de l'acide folique s'est révélé être très complexe (73).
1.6.3 Le transport de la S-adénosylmethionine chez Leishmania
Le parasite Leishmania a la faculté de synthétiser de novo l'AdoMet, mais peut
aussi le prélever du milieu extracellulaire (310). Le fait que la biosynthèse de l'AdoMet est
énergétiquement coûteuse (elle consomme une molécule d'ATP), laisse présager que la
contribution du transport dans le pool de l'AdoMet est importante, puisque ça permettrait à
la cellule d'économiser de l'énergie. L'existence d'un système de transport putatif
permettant l'influx de l'AdoMet a été décrit chez plusieurs espèces de Leishmania (17,
186). De plus, il a été démontré que l'AdoMet et la sinéfungine (SNF) partageaient le
même système de transport chez L. donovani (290). Ce système a une haute affinité pour
les deux substrats, présente une cinétique saturable et est dépendant de l'énergie
métabolique et du gradient de protons (17, 186, 290). Contrairement à l'influx de folate qui
est dépendant de la phase de croissance du parasite, le transport de la SNF ne change pas
lors des différentes phases de croissance (186). L'activité constitutive du transporteur
suggère un rôle important dans le métabolisme du parasite. Il est donc important
d'identifier le gène codant pour ce transporteur chez Leishmania.
78
1.7 Problématique, hypothèses et objectifs
1.7.1 Problématique
La leishmaniose constitue un problème de santé majeur dans les pays pauvres du
monde et figure parmi les priorités de l'organisation mondiale de la santé (OMS).
L'absence de vaccin contre cette maladie et les problèmes associés à la chimiothérapie tels
la résistance au traitement, la toxicité et le coût élevé de certaines molécules, ont créé un
besoin urgent de nouveaux médicaments. Il est donc important de trouver de nouvelles
cibles thérapeutiques. La voie métabolique des folates représente une excellente cible
thérapeutique puisqu'elle a déjà été exploitée efficacement, grâce à l'utilisation des
antifolates, dans le traitement de plusieurs maladies comme les infections d'origines
bactériennes, parasitaires, ou néoplasiques. Jusqu'à présent, il n'existe aucune thérapie à
base d'antifolates contre la leishmaniose, mais notre compréhension du métabolisme des
ptérines et des folates chez Leishmania a permis d'identifier plusieurs protéines au potentiel
thérapeutique. En effet, la découverte de la famille des transporteurs de folate et de la
bioptérine (FBT) donne l'espoir que ces protéines puissent être exploitées pour la mise au
point de nouvelles stratégies thérapeutiques.
1.7.2 Hypothèses
Leishmania est auxotrophe pour les ptérines et les folates, mais il a développé un
système de transport qui lui permet de prélever de façon efficace ces cofacteurs du milieu
extérieur et ainsi satisfaire ses besoins métaboliques et physiologiques. Ce système de
transport comprend un transporteur spécifique pour la bioptérine (BT1) et deux
transporteurs spécifiques pour l'acide folique (FT1 et FT5). Ces protéines appartiennent à
la famille des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT). Le génome de Leishmania
code pour 10 autres homologues de ces transporteurs de fonction inconnue.
Puisque le folate et la bioptérine sont les seuls substrats connus de cette famille de
transporteurs, nous avons émis une première hypothèse selon laquelle d'autres membres de
la famille FBT seraient impliqués dans le transport des dérivés du folate ou de la bioptérine
79
et/ou pourraient être différentiellement exprimés chez le parasite. Par ailleurs, puisque les
folates jouent un rôle essentiel dans le métabolisme monocarboné et que celui-ci est
compartimenté chez les cellules eucaryotes, y compris Leishmania, notre hypothèse est
qu'un membre de la famille FBT pourrait correspondre à un transporteur de folate localisé
au niveau de la membrane des organelles telle la mitochondrie. Chez les mammifères le
transport de folates à travers la membrane de la mitochondrie est assuré par un membre de
la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF) et Leishmania possède des orthologues
qui pourraient potentiellement être impliqués dans le transport de folate au niveau de la
mitochondrie du parasite.
Les folates et la 5-adénosylméthionine (AdoMet) sont des donneurs d'unités Cl
dans la cellule. Des études protéomiques et transcriptomiques ont suggéré l'implication de
l'AdoMet dans la résistance à l'antifolate methotrexate (MTX) chez Leishmania. D'un
autre coté, nous avons observé dans le laboratoire une résistance croisée à la sinéfungine
(SNF), un analogue structural de l'AdoMet, chez un mutant sélectionné pour la résistance
au MTX. En raison des réarrangements au niveau des gènes de la famille FBT chez ce
mutant, nous avons émis l'hypothèse que celle-ci aurait probablement un rôle à jouer dans
la résistance à la SNF et qu'un nouveau membre FBT qui est réarrangé chez le mutant
pourrait correspondre à un transporteur de l'AdoMet.
1.7.3 Objectifs
Les travaux présentés dans cette thèse avaient comme objectif principal la
caractérisation de la famille des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT) et plus
spécifiquement :
La première partie (Chapitre II) avait comme objectifs 1) d'identifier toutes les
protéines appartenant à la famille FBT et d'effectuer une analyse phylogénique et 2) de
mesurer l'expression des 14 gènes de la famille FBT aux i) différentes phases de croissance
chez les deux stades de vie du parasite (promastigote et amastigote) et ii) chez des mutants
hautement résistants au methotrexate.
80
La deuxième partie (Chapitre III) avait comme objectif de caractériser la fonction
d'un nouveau membre de la famille FBT qui était réarrangé chez des mutants résistants à la
sinéfungine.
La troisième partie (Chapitre IV) avait comme objectif d'étudier la localisation
subcellulaire des différents membres de la famille FBT du parasite L. infantum ainsi que
quelques protéines de la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF) dans le but
d'identifier et de caractériser les transporteurs de folate et/ou de l'AdoMet qui seraient
localisés au niveau de la membrane de la mitochondrie.
81
Chapitre II. Analyse fonctionnelle et réarrangements géniques complexes des gènes de la famille des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT) chez le parasite protozoaire Leishmania
Le contenu de ce chapitre à fait l'objet d'une publication dans la revue Molecular and
Biochemical Parasitology (2008) 162(2): 155-64.
2.1 Résumé
Le parasite protozoaire Leishmania est auxotrophe pour l'acide folique. Des études
antérieures ont rapporté la caractérisation du principal transporteur de folate (FT1) de
Leishmania. FT1 est membre de la famille des transporteurs de folate et de la bioptérine
(FBT). Parmi tous les organismes séquences, Leishmania est celui qui possède le plus
grand nombre de protéines FBT (codées par 14 gènes). Nous avons développé une
approche par TaqMan RT-PCR en temps réel afin de mesurer l'expression des gènes FBT
de Leishmania infantum lors des différentes phases de croissances et stades de vie du
parasite ainsi que chez certains mutants hautement résistants au methotrexate. Ainsi, nous
avons observé que FT1 est préférentiellement exprimé en phase logarithmique de
croissance, ce qui est en corrélation avec l'accumulation plus élevée des folates au cours de
cette phase. De plus, les niveaux d'ARNm de FT1 semblent répondre à la concentration de
l'acide folique dans le milieu. Plusieurs gènes FBT sont exprimés préférentiellement en
phase stationnaire de croissance, caractérisée par une accumulation minimale d'acide
folique. Cela suggère que ces membres FBT pourraient transportés d'autres substrats. Cette
étude a permis d'associer la résistance au methotrexate à l'inactivation de FT1 et à la
surexpression d'autres gènes FBT. L'inactivation de FT1 est due soit à une deletion génique
médiée par une recombinaison homologue entre les séquences conservées des gènes FBT
ou par conversion génique. Cette étude a mis en évidence la multiplicité des gènes FBT de
Leishmania, leur expression complexe ainsi que de nouveaux événements de
recombinaison géniques associés à l'inactivation de FT1 et à la résistance à l'antifolate.
82
2.2 Article
Functional analysis and complex gene rearrangements of the folate/biopterin
transporter (FBT) gene family in the protozoan parasite Leishmania
Amin Ahmed Ouameur, Isabelle Girard, Danielle Légaré and Marc Ouellette*
Centre de Recherche en Infectiologie du CHUL, Université Laval, Québec, Canada
* Corresponding author : Marc Ouellette Ph.D. Centre de Recherche en Infectiologie du CHUL 2705, Boulevard Laurier Québec, Québec G1V4G2 Tel : 1-418-654-2705 Fax: 1-418-654-2715 Email : [email protected]
Running title: Folate transporters expression profiling in Leishmania
Keywords: Folate transporters; Methotrexate; Homologous recombination; Leishmania; Gene conversion
83
Abstract
The protozoan parasite Leishmania is a folic acid auxotroph. Previous work has led
to the characterization ofthe main folate transporter FT 1. FT 1 is part ofthe folate/biopterin
transporter (FBT) family and Leishmania with its 14 members is, of all sequenced
organisms, the one with the most FBTs. We developed a real-time TaqMan RT-PCR assay
to follow the expression of these FBT genes during growth phases, life cycles and in
methotrexate-resistant mutants of Leishmania infantum. FT1 is expressed preferentially in
the logarithmic phase which is consistent with the higher accumulation of folate in that
stage. FT1 RNA levels even seemed to be related to folate concentration in the medium.
Surprisingly, several ofthe FBT genes were expressed preferentially in the stationary phase
of growth, a stage with minimal folate accumulation. It suggests that these FBT members
may transport other related substrates. Resistance to methotrexate is associated with FT1
inactivation and upregulation of other FBT genes. Inactivation of FT1 is due either to a
gene deletion mediated by homologous recombination between conserved FBT sequences
or by segmental gene conversion. This study highlighted the multiplicity of FBT genes in
Leishmania, their complex RNA expression, and novel gene rearrangements associated
with FT1 inactivation and antifolate resistance.
84
Introduction
Leishmania are protozoan parasites distributed worldwide and, depending on the
species, can cause clinical symptoms encompassing cutaneous, mucocutaneous and visceral
leishmaniasis (1, 2). The treatment regimen relies on chemotherapy with the antiquated
pentavalent antimonials still remaining the mainstay (1, 2). However resistance to
antimonials in some parts of the world is now widespread and alternate treatments are
required (reviewed in 3 and 4). Antifolates have a long success story in the fight against
infectious diseases (5, 6) but this class of molecules, despite some interesting leads (7, 8, 9,
10), is not yet useful against Leishmania. A better understanding of folate metabolism in
this parasite may help in finding better active molecules. Reduced folates are one carbon
donor in cellular metabolism and antifolates alter these pathways including the synthesis of
thymidine. Leishmania is a folate auxotroph and needs to import this molecule to meet its
folate requirements (11, 12).
Most of our understandings of folate (and pterin) metabolism in Leishmania are
derived from studies of the mechanism of resistance to the model antifolate drug
methotrexate (MTX) (reviewed in (11, 12)). Studies of MTX resistance have highlighted
that a common resistance mechanism consisted of a reduction in folate/MTX uptake (13,
14, 15). This reduction can be quite pronounced and, despite their auxotrophy, Leishmania
cells thrive remarkably well in culture flasks even with no measurable folate accumulation.
Functional cloning experiments and selection for MTX resistance has pinpointed a gene
coding for a membrane protein now named BTI, which was found to be the only biopterin
transporter of Leishmania (16, 17). BTI was also showed to be able to transport, albeit
much less efficiency, folic acid but not MTX (16). This ability to selectively transport folic
acid is a likely explanation that the overexpression of BTI, at least in folate-rich medium
(16, 18), can lead to MTX resistance. BTI was found to be part of a large gene family (19,
20) and at least two other members of this gene family have been functionally
characterized. FT5 was shown to be a high affinity and low capacity folate transporter (19)
and FT1 was found to be the main folate transporter of Leishmania (20, 21).
BTI, FT5 and FT1 form a novel class of membrane transporters that are found in
Trypanosomatids, in the Apicomplexan parasites, higher plants, and Cyanobacteria. These
85
proteins are now included in the FBT family which is distantly related to the major
facilitator superfamily. Folate transport is now well established in the Apicomplexa
Plasmodium falciparum (22) and Toxoplasma gondii (23) parasites and it is possible that
members of the FBT family are responsible for these activities as their genomes have
revealed homologues of the Leishmania FBT proteins. The only other member of the FBT
family that was functionally characterized was derived from the plant Arabidopsis
At2g32040 and the Cyanobacteria Synechocystis slr0642. Both proteins were shown to
transport folic acid and the Arabidopsis transporter was localised to the envelope of
chloroplasts (24). The sequences of genomes of several pathogenic Trypanosomatids (e.g.
L. major, T. brucei, and T. cruzi) axe now completed and this has highlighted an expansion
ofthe FBT family in Leishmania. More than 14 homologues are present in L. major and L.
infantum and we present here a detailed comparison of the expression of these genes in
Leishmania and of their complex rearrangements upon resistance to MTX.
Materials and methods
Cell lines and culture conditions
L. infantum (MHOM/MA/67/ITMAP-263) wild-type promastigote cells was grown
in M199 (containing 23 nM folic acid), SDM-79 (15 pM folic acid) (25) and MAA/20 (57
nM folic acid) (26) media at pH 7.0 and 25 °C. L. infantum axenic amastigotes were grown
at 37 °C and 5% CO2 in MAA/20 as described (26). Cell differentiation was confirmed by
measuring the expression of the amastigote-specific gene amastin (27) and the
promastigote-specific gene PFR2 (28) by real-time RT-PCR. Two independent L. infantum
methotrexate (MTX)-resistant mutants were selected in Ml 99 medium in the presence of
increasing concentration of MTX. The cell line L. infantum MTX1000.3 was obtained by
stepwise selection starting with 150 nM MTX, until cells resisted 1000 pM of MTX. The
cell line LinfMTXlOO.l was obtained in two steps: first by growing L. infantum wild-type
with 1 pM MTX for three passages, then the MTX concentration was increased to 100 pM.
Growth curves were done for all cell lines to determine the exact growth phases of the
parasites.
86
Phylogenic analysis
The FBT protein sequences of Trypanosomatids (Leishmania and Trypanosoma)
were obtained from the GeneDB database (http://www.genedb.org/). Apicomplexa
(Plasmodium, Toxoplasma and Cryptosporidium) homologues to Leishmania FBTs were
identified through BLASTp analysis using the Apicomplexan database resources
(http://www.apidb.org/apidb/). Cyanobacteria and plant (Arabidopsis thaliana) sequences
were found in GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Alignment of the FBT proteins of
Leishmania, Trypanosoma, Plasmodium, Toxoplasma, Cryptosporidium, Arabidopsis, and
Cyanobacteria, was made using ClustalW (29) with manual optimization. Sequences were
edited to exclude gaps (if needed) with the BioEdit software (30). The phylogram was
constructed using the Neighbor-Joining method (31) with 1000 bootstrap iterations and the
Poisson correction distance method ofthe MEGA package Version 3.1 (32). Phylograms
were also made with only the most conserved portions of FBT members and this led to
similar results as presented here.
Southern blots
Genomic DNA was isolated from log phase Leishmania promastigotes using
DNAzol reagent (Invitrogen). Southern blotting, hybridization, and washing conditions
were performed following standard methods (33). A DNA probe (573 bp) spanning the
conserved coding sequences ofthe FBT gene family was obtained by PCR with primers 5'-
GTGATTGCGAAGGCCAACGTG-3' and 5'-CAGCGGCAGGTTGTCGTAGTTG-3'.
Ptéridine transport experiments
Cells were grown in M199 medium until mid-logarithmic growth phase, then 4 x
107 cells were washed and resuspended in the folate deficient medium fdDMEL (34) in the
presence of 200 nM of radioactive ptéridine. Transport experiments were performed as
described previously (16, 17). Tritium-labelled [3H]folate (43.2 Ci/mmol) and [3H]MTX
(12 Ci/mmol) were purchased from Moravek Biochemicals. The quantity of accumulated
radioactivity was normalized with Leishmania cells numbers. To measure folate and MTX
transport, the uptake of cells incubated on ice was subtracted.
87
DNA construct and transfections
The LinJlO.0410 gene was amplified from genomic DNA of L. infantum using
primers 5 '-TTCTAG AAC ACCTTACC ACG ATGTCC-3 ' and 5'-
AAAGCTTGCTTCACGCGTTGCC-3 '. The PCR fragment was cloned in the pGEM T-
easy vector (Invitrogen), digested with Xbal and HindlH (underlined), and then cloned into
the Leishmania expression vector pSP72ai/TG« (35) to obtain the pSPaHYGa-LinJ10.0410
construct. The pSPaNEOa-LinJl0.0410-GFP construct was made by first cloning the
enhanced GFP (EGFP) gene between the Xbal and Sail site of pSP72aNEOa. LinJ 10.0410
was then amplified by primers 5 '-GGGATCÇCCTTACC ACG ATGTCC-3' and 5'-
TTCTAGACGCGTTGCC-CTGCAC-3 '. which respectively included the start codon and a
Xbal site replacing the stop codon. The PCR product was then cloned in pGEM T-easy
vector, digested with BamHI and Xbal (underlined) and cloned in-frame upstream of the
GFP gene in pSPaNEOa-GFP. Transfection of pSPaHYGa-LinJlO.0410 and pSPaNEOa-
LinJ 10.0410-GFP into Leishmania promastigotes was as described previously (36).
Leishmania cells expressing the LinJ 10.0410-GFP fusion were analyzed by fluorescence
microscopy as described (21). A similar strategy was used for cloning the gene
LinJl9.0870. The primers 5'-GGATCCGAACTAGCAATGACGTTAGAG-3' and 5'-
TCCTTCTAGAATGCTTGCCG-GC-3 '. with BamHI and Xbal sites (underlined), were
used to make the construct pSPaNEOa-LinJ19.0870-GFP, while the primers 5'-
TTCT AGAGAACTAGC AATGACG-TTAGAG-3 ' and 5'-
GGTCGACTCCTTGTTCAATGCTTGCC-3 '. with Xbal and Sail sites (underlined), were
used for the construct pSPaHYGa-LinJl9.0870.
TaqMan real-time RT-PCR
RNA extraction and cDNA synthesis
RNA was isolated from cells in early-logarithmic phase (day 2), mid-logarithmic
phase (day 3), late-logarithmic phase (day 4), stationary phase (day 5) and late-stationary
phase (day 6). Three to four independent RNA preparations were obtained for each
condition. RNA extractions were carried out according to the manufacturer's instructions
88
using the RNeasy Mini Kit Plus (Qiagen). All samples were DNasel treated using the
DNA-free turbo kit (Ambion) to remove possible traces of genomic DNA. The purity, the
integrity and the amount of RNA were assessed on the Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent
Technologies). The major criterion for RNA integrity was the presence of three clear
ribosomal peaks (18S, 24Sa and 24SP). The RNA samples were then stored at -80 °C until
use.
First-strand cDNA was synthesized from 2 pg of total RNA using the Superscript II
reverse transcriptase enzyme and 01igo(dT)12-18 primers (Invitrogen) according to
manufacturer's instructions. The resulting cDNA samples were stored at -20 °C until use.
A test amplification was carried out using primers from different internal controls (GAPDH
and actin) to test uniformity of cDNA synthesis in different samples.
Primers and TaqMan probe design
Primers and TaqMan probes were designed using the GenRunner software
(http://www.generunner.com). Specific primers were designed for each gene, and six
different TaqMan probes were designed for 14 FBT genes and an endogenous control gene,
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (see Table SI, supplementary
material). The TaqMan probes were obtained from Integrated Device Technology (IDT),
and were dual labelled with 5'FAM/3'BHQ molecules for target genes and 5'TET/3'BHQ
molecules for endogenous control gene (GAPDH). In preliminary experiments, primer
concentrations were tested to optimize PCR amplification in multiplex reactions, with a
constant TaqMan probe concentration (100 nM). The primer concentrations were defined at
60 and 300 nM for amplification of GAPDH and FBT genes, respectively.
PCR amplification and quantification
TaqMan PCR assays were performed in a Rotor Gene-3000 (Corbett Research).
Reactions were performed in a total volume of 20 pL, containing 1 pL cDNA sample, 1 *
TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems), 100 nM of TaqMan probe, 60 and
300 nM of GAPDH and FBT gene primers, respectively. Reactions were carried out with at
least three biological replicates each with two technical replicates. The universal
temperature cycles were as follows: 2 min at 50 °C and 10 min at 95 °C, followed by 35-40
89
cycles of 15 s at 95 °C and 1 min at 60 °C. In addition, we chose four stage-specific genes,
and one internal control gene (actin) which could be used in the normalization process.
PCR amplifications of these genes were performed as described previously (37). The
specificity of the PCR was checked by running the amplicon in an agarose gel and by
sequencing. Controls without reverse transcriptase were run to verify that no contaminating
genomic DNA was present.
Results were quantified by using the relative standard curve method as described in
http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf. The Rotor Gene Analysis
Software (Version 6.0) was used for data analysis. Gene expression levels were measured
in the different samples, and the obtained threshold cycle (CT) values were used to
calculate the initial input amount from the standard curve. The results were normalized to
the endogenous control, GAPDH. For statistical analysis, a Student's t-test and Mann-
Whitney U-test were applied to test for significant differences in gene expression between
samples. The level of significance was set to p < 0.05 in all statistical testing. The
calculations were performed using the software package SPSS for Windows, Version 11.0
(Chicago, IL, USA).
Results
The FBT gene family in Leishmania
Southern blot hybridizations indicated that Leishmania harbours several FBT genes
(19, 20) and the recent completion ofthe L. major (38) and L. infantum (39) genomes has
confirmed this. Multiple searches and Blast analyses have highlighted 14 members part of
the FBT family spread on chromosome 4, 6, 10, 19 and 35 in both sequenced species. A
pseudogene was also present on chromosome 14 of each species (see Fig. 1). Genes are
similarly organized between the two species with usually only one gene per chromosome.
One exception is chromosome 10 with a number of noteworthy features. First, there are two
FBT genes at each telomeric ends. Most interestingly, they are identical, i.e. LmjFl0.0020
is identical to LmjFlO.1310, and are part of a three gene duplication (Fig. 1). This
arrangement was supported by Southern blot analysis that we have carried out (result not
shown). Second, LmjFl0.0350 is listed as a pseudogene in www.genedb.org with two stop
90
codons, while its possible homologue in L. infantum, LinJ 10.0360, is not. While the %
similarity is high between the orthologues of each species (>90%), Lmj 10.0350 and
LinJ 10.0360 are only 70% similar (see Table S2, supplementary material). Third, there is a
cluster of seven FBT genes arranged in tandem in both species (Fig. 1).
The FBT proteins of L. infantum and L. major were aligned with homologous
proteins found in Apicomplexa parasites, Cyanobacteria and plants, and used for
phylogenetic analysis. Of all sequenced organisms, Leishmania is the organism with the
most FBT members. Fig. 2 displays a Neighbor-Joining tree showing the perfect orthology
between the different members in L. major and L. infantum but while homologues of the
FBT family are present in T. brucei and T. cruzi, none could be assigned as orthologous
sequences by phylogenetic analysis (Fig. 2). T. cruzi has notably less FBT transporters than
T. brucei (Fig. 2). The T. gondii FBTs are branching with the kinetoplastid proteins but the
Cryptosporidium and malaria transporters are branching together and are phylogenetically
closer to the plant proteins (Fig. 2). As noted previously (24), the chloroplast A. thaliana
FBT At2g32040 is closer to the Cyanobacteria FBT (Fig. 2).
RNA expression profiling of the Leishmania FBTs
Leishmania has 14 FBTs with only 3 having been functionally characterized. BTI
transports biopterin while FT1 and FT5 transport folic acid with different Vmax and Km.
Folate transport in Leishmania is known to be strongly regulated by the growth phase ofthe
parasite, with maximal transport in actively dividing logarithmic phase promastigotes and
with little transport in stationary phase metacyclic parasites (20, 21, 40). Hybridization
results with non-specific probes also suggest some life cycle specific pattern of gene
expression (20). We developed real-time RT-PCR TaqMan assays for looking at gene
expression ofthe FBT genes from early-logarithmic to late-stationary phases of L. infantum
promastigote and axenic amastigote stages. While there are 14 FBT genes; 12 were studied
by TaqMan assays. Indeed, LinJ 10.0020 and LinJ10.1450 are identical and despite
numerous attempts it has been impossible to generate a gene-specific assay for LinJ 10.0390
(see also below).
91
We measured the expression of control genes to monitor the growth phase and
parasite differentiation (supplementary Fig. SI). As expected, the expression of PTRl (20)
was maximal in logarithmic phase and the expression of META1 (41) was maximal in
stationary phase (supplementary Fig. SI). Similarly and as expected, PFR2 (28) and the
amastin (27) genes were expressed preferentially in the promastigote and amastigote
stages, respectively, as determined by real-time RT-PCR (supplementary Fig. SI).
We initially expected increased expression of several FBT members in actively
dividing parasites. This was clearly only the case for FT1 (LinJ 10.0400), the main folate
transporter (21), and this was true only with the promastigote stage (Fig. 3). The expression
of FT5 (LinJl0.0420) and BTI (LinJ35.5120) were relatively stable between the different
growth stages and life cycles (Fig. 3). There were no FBT genes expressed specifically in
axenic amastigotes, although a two- to threefold higher expression was noted in amastigote-
logarithmic phase for LinJl0.0410 compared to promastigotes. Surprisingly, the expression
of several FBT genes was increased in stationary phase parasites. The most striking
example is for LinJl0.0380 which has 10-fold increased expression in stationary phase of
growth and more than 40-fold increase expression in late-stationary phase (Fig. 3).
We look at the expression in MAA because it allowed us to compare promastigotes
and amastigotes (Fig. 3). Since folate transport activity is dependent on folate concentration
in media, we have checked the expression of the L. infantum FT1, FT5, BTI, and
LinJl 0.0380 genes in other media used for growing Leishmania cells. In general, we
observed the same type of regulation of the different FBT genes in Ml 99 or SDM-79
medium (Fig. 4A). One exception was FT1 in SDM-79 where the difference in expression
between logarithmic phase and stationary phase was less significant (Fig. 4A). This could
be explained because SDM-79 is much richer in folic acid and thus high level expression of
FT1 may not be required under these conditions. For example, at those high concentrations,
BTI could also transport some folic acid (16). To test this, we monitored the expression of
FT1 in M199 medium by adding folic acid. Interestingly, a decrease in FT1 expression was
observed following the addition of 150 nM and 1.5 pM folic acid (Fig. 4B) suggesting that
FT1 expression may respond to the concentration of folic acid within the medium, although
no clear dose response was observed.
92
Expression and rearrangements of FBT genes in MTX-resistant mutants
Studies of resistance mechanisms to MTX have been useful to understand folate
metabolism in Leishmania. Resistance can be due to many genetic alterations including
gene amplifications and gene deletions. The mechanisms of gene amplification have been
well investigated (42, 43) but not the events leading to gene deletion. The development of
TaqMan assays allowing the detection of individual transporter genes has permitted to
monitor the expression of all FBT genes upon the emergence of resistance. Two new L.
infantum MTX-resistant mutants were generated and studied. In both mutants, there was a
marked defect in folic acid and MTX accumulation (Fig. 5A). The expression of all genes
was monitored in L. infantum MTX 100.1 and MTX 1000.3 mutants. In MTX 100.1, we
observed a twofold reduction in FT1 expression, but the absence in expression of
LinJ 10.0380 (Fig. 5B) was even more notable. Some genes were overexpressed; the two
with the highest fold increase were BTI and LinJl9.0870. The expression profiling was
slightly different in MTX1000.3. FT1 expression was not measurable in this mutant and
BTI and LinJl0.0410 were overexpressed (Fig. 5B). The absence of expression of specific
genes in the two mutants could be due either to a marked decrease in RNA levels or to gene
deletion. To test whether gene deletion events were present in these mutants we first
hybridized a Southern blot to a probe covering the conserved regions of FBTs. Clearly,
there was a gene rearrangement event in MTX 100.1 while this could not be demonstrated
for MTX1000.3 (Fig. 6A), a mutant with no measurable FT1 expression (Fig. 5B). Down
regulation in gene expression was affecting selected genes ofthe chromosome 10 locus. We
were not able to generate a TaqMan assay for LinJl0.0390 (Fig. 3) and similarly we could
not design primers for the specific amplification of this gene (Fig. 6C). However, we could
develop primers for the specific amplification of LinJl0.0370, LinJl0.0380, LinJl0.0400
(FT1) and LinJl 0.0410 and PCR bands ofthe expected size were obtained for each gene
when starting with DNA derived from the wild-type cells (Fig. 6C).
For mutant L. infantum MTX 100.1, the LinJl0.0370 and the LinJl0.0410 genes
appeared intact. However, no PCR product was observed for the gene LinJl 0.0380 (Fig.
6C) and some rearrangements seem to have occurred at FT1 since while primers 7-8
(primers used for the TaqMan assay for FT1) gave the expected PCR product, primers 11
93
and 12, amplifying a larger portion of FT1, did not (Fig. 6C). This type of results is
compatible with a deletion of a region between LinJl 0.0380 and FT I. To test this we used
primers 3 and 12 (upstream of LinJl0.0380 and downstream of FT1, respectively) and
indeed we obtained a PCR fragment ofthe expected size in the mutant MTX 100.1 but not
in either WT or MTX1000.3 mutant (Fig. 6C). Our PCR conditions did not allow the
amplification of a fragment >10 kb that would be amplified by primers 3 and 12 in wild-
type cells. We sequenced this fragment (accession number: EU221004) and it was
consistent with a gene deletion event that was mediated by homologous recombination
between stretches of identities (80 bp) between LinJl 0.0380 and FT I (Fig. 6B,
supplementary Fig. S2).
Southern blot analysis of MTX1000.3 did not support a gene deletion event (Fig.
6A). Moreover, the genes LinJlO.0380, FT1 (primers 11-12) and LinJ10.0410 appeared
intact since they gave amplification bands similar to bands obtained from DNA derived
from wild-type cells (Fig. 6C). However, the use of primer pair 7-8 did not lead to a PCR
fragment in this mutant (Fig. 6C). This is consistent with the negative TaqMan assay using
this pair of primers (Fig. 5B). Since FT1 appeared present (Fig. 6A and C with primers 11-
12), the absence of amplification with primers 7-8 may be due to the accumulation of point
mutations spanning sequences recognized by the primers. Sequencing of the PCR
fragments generated with primers 11-12 from wild-type cells and MTX1000.3 indeed
showed the presence of many mutations precluding the annealing of primers 7 and 8 in the
mosaic FT1 gene of mutant MTX1000.3 (supplementary Fig. S3). Examination of the
sequence showed in fact that a stretch of 380 bp derived from LinJ10.0410 had replaced the
corresponding sequence in FT I. This was not the product of a reciprocal double cross-over
exchange since the sequence of LinJ10.0410 in the mutant was intact (supplementary Fig.
S3). Thus the inactivation oiFTl is due to a segmental gene conversion event where a copy
of a segment of LinJlO.0410 replaced a region of FT1 (Fig. 6B and supplementary Fig. S3)
(sequence accession number: EU221005). This conversion event must have occurred at the
level of homologous sequences between FT1 and LinJl0.0410 (supplementary Fig. S3).
This event also explained the increased expression of LinJl 0.0410 in mutant MTX1000.3
(Fig. 5). Indeed, the primers for the qRT-PCR assay for this gene recognized both the
genuine gene but also the mosaic FT1 gene.
94
The LinJ10.0380ILinJ10.0400 fusion protein in L. infantum MTX100.1
(supplementary Fig. S2) or the novel mosaic FT1 protein in L. infantum MTX1000.3
appeared incapable of supporting folate transport as no folic acid accumulation was
observed in these two mutants (Fig. 5A). Similarly, despite that the expression of
LinJ19.0870 in L. infantum MTX100.1 or LinJ10.0410 in L. infantum MTX1000.3 were
increased, there was also no measurable transport of folic acid in these two mutants (Fig.
5 A). The inability ofthe latter two gene products to transport folic acid was formally tested
where both LinJl9.0870 and LinJl0.0410 were cloned in Leishmania expression vectors
and transfected into L. tarentolae MTX 1000.6, a cell line that we use frequently for
studying folate transport. No folate transport could be observed in these two transfectants
under our experimental conditions (supplementary Fig. S4). Longer accumulation times or
higher substrate concentration did not lead to measurable transport as well (not shown).
Transfection of these genes in wild-type cells did not lead to MTX resistance (results not
shown).
Discussion
Leishmania is a folate and pterin auxotroph and it must thus rely on membrane
transporters to meet its folate/pterin requirements. Of all sequenced organisms, Leishmania
has the most FBT members (Fig. 1 and Fig. 2). The main folate transporter is FT1
(LinJ 10.0400) (21) and it is well established that folate accumulation is maximal in actively
dividing parasites (21, 40). The development of gene-specific TaqMan RT-PCR assays has
allowed monitoring the expression of each individual FBT gene. All genes were expressed
in both promastigotes and amastigotes and possibly only LinJl 0.0410 was slightly more
expressed in the axenic amastigote stage compared to the promastigote stage (Fig. 3). We
initially expected several genes to be maximally expressed in log phase but this was only
true for FT1 (Fig. 3). The fold change in gene expression during the growth stages or life
cycles of Leishmania FT5 and BTI genes was not more than twofold (Fig. 3 and Fig. 4A).
The expression of LinJ06.1320, LinJlO.0380, LinJlO.1450 and LinJ19.0870 was increased
at least fivefold in stationary or late-stationary phase of growth. The extreme example was
LinJ 10.0380 which was increased more than 30-fold in late-stationary phase parasite (Fig.
3). There is no measurable folate uptake in this growth stage (21, 40). Provided that the
RNA levels are correlated to protein levels, which admittedly is not always the case for
95
Leishmania (20, 44), it is unlikely that these FBT members, expressed preferentially in
stationary phase, transport folic acid. This appears to be the case also for LinJ 19.0870 and
LinJ 10.0410, two proteins that localise to the plasma membrane (supplementary Fig. S4).
Leishmania is likely to have a folate mitochondrial pathway (37) and we cannot exclude
that some of these transporters are located in the mitochondria and hence explaining the
absence of accumulation as measured with intact cells. We cannot also exclude that some
of these members correspond to efflux rather than influx proteins.
The expression of FT1 is significantly higher in the logarithmic phase of growth in
Leishmania promastigotes (Fig. 3 and Fig. 4A). Since there is little control at the initiation
of transcription in Leishmania, this growth phase specific increased RNA level must occur
at the post-transcriptional level. Interestingly, the FT1 RNA levels seem also to respond to
folate concentration (Fig. 4A and B). Indeed, the concentration of folate in SDM-79 is
significantly higher than in M-199 (or MAA) and in this folate-rich medium, the FT1 RNA
expression was not higher in exponential phase compared to stationary phase (Fig. 4A). To
test this putative folate effect in more details, we added folic acid directly to the M-199
medium and indeed observed a decrease in FT1 expression (Fig. 4B). This observation has
been repeated many times and is reproducible although it seems slow, i.e. the effect is
measurable after one passage and does not directly relate to folate concentration (Fig. 4B).
The recent discoveries of metabolite sensing ribozymes and riboswitches that cells use to
regulate gene expression in response to changes in metabolite concentration (reviewed in
(45)) may be of relevance here and justify further studies. In an organism devoid of
transcriptional initiation control, several novel mechanisms of gene expression may be
uncovered, as exemplified by the recent demonstration of the involvement of ancient
retroposons in RNA instability (46).
Reduced accumulation of MTX is a frequent mechanism of resistance against this
drug in Leishmania (13, 14, 15). The molecular mechanisms behind this transport defect
were unknown although they seemed to correlate with gene rearrangements (19, 21). The
availability of gene-specific probes and primers has allowed the identification ofthe precise
genetic events leading to the inactivation of FT 1. An homologous recombination between
repeated sequences in LinJ 10.0380 and FT1 occurred in mutant L. infantum MTX 100.1.
96
This recombination led to the deletion ofthe C-terminal part of LinJl0.0380 and the N-
terminal part of FT1 to lead to a novel in frame fusion protein (supplementary Fig. S2).
Extrachromosomal gene amplification events always seem to occur by homologous
recombination between repeated sequences but usually these events are conservative with
no loss of chromosomal copies (42, 43, 47). The rearrangement in mutant MTX100.1 is
non-conservative and leads to a diploid deletion. The only other characterization of a non-
conservative gene deletion event that we are aware of, took place in a mutant resistant to
arsenite where a deletion occurred after homologous recombination between the conserved
nucleotide binding domains of two ABC protein genes (42). However, only one allele was
deleted. Remarkably, cells that are reputed folic acid auxotroph thrive well without an
intact FT1 and without measurable folic acid transport (Fig. 5A). A number of FBT genes
have increased expression in the mutants (Fig. 5B) and some may be involved in the
transport of folate-like molecules. For example, we noted that BTI is overexpressed in both
mutants (Fig. 5B) and it has been shown that small amount of folic acid (but not MTX) can
enter the cell through BTI (16).
The mechanism of inactivation of FT1 in mutant L. infantum MTX1000.3 was
different and involved a segmental gene conversion event with sequences derived from
LinJl0.0410, a transporter that cannot transport folic acid (supplementary Fig. S4). The
unidirectional non-reciprocal transfer of nucleotide from LinJl0.0410 to FT1 fits the
definition of a gene conversion event that was facilitated by the long stretches of identities
between the two genes (Fig. S4). Gene conversion and segmental gene conversion are well
documented in a number of pathogenic microorganisms including the African
trypanosomes (reviewed in (48)) and was recently described in the Leishmania GP63 gene
cluster (49). Leishmania has 14 FBTs and rearrangements, as described here, may further
increase the potential of the FBT repertoire. This may be important to further expand the
capacity to transport molecules related but different than folic acid that may be changing in
the various environments that the parasite encounters. The tandem gene array organization
of FBT genes on chromosome 10 is likely facilitating the selection of the type of
rearrangements described here, although this may matter less for gene conversion events.
97
The design of gene-specific primers has allowed the first molecular explanation for
the inactivation of FT1. Interestingly, this can be mediated by a number of different
mechanisms, some of which had never been described in Leishmania. The availability of
these primers has permitted the characterization of a novel family of proteins found in
bacteria, protozoa and plants. Despite extensive similarities (supplementary Table S2) the
FBT members seem to have different functions. This is consistent with their RNA
expression profiles where several genes are more expressed in growth stages not known to
accumulate significantly folic acid. Further efforts should be devoted to find the
physiological function ofthe remaining FBTs.
Acknowledgements
We thank Jean-Michel Ubeda, Larbi Dridi and Wilfried Moreira for critical reading
ofthe manuscript. This work was funded in part by the CIHR group and operating grants to
M.O. A.A.O. is the recipient of a CIHR studentship. M.O. is a Burroughs Wellcome Fund
Scholar in Molecular Parasitology and holds the Canada Research Chair in Antimicrobial
Resistance.
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100
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Legend to figures
Fig. 1. Genomic organization of the members of the FBT gene family in L. major and
L. infantum. The FBT genes (open boxes) are organized similarly in both species. The
larger cluster is present on chromosome 10 with 7 tandemly linked FBT genes. The
numbers above and below the boxes correspond to the annotation of each L. major and L.
infantum FBT gene, respectively. Numbers within the box means that both species are
annotated with the same number. Asterisks indicate the duplicated region in the telomeres
of chromosome 10.
Fig. 2. Phylogenetic analysis of the FBT proteins. Amino acid sequences of all 60 FBT
proteins were aligned using the ClustalW algorithm, and evolutionary trees were
constructed using the Neighbor-Joining method with Poisson correction as implemented in
the MEGA3.1 package. The reliabilities of each branch point were assessed by the analysis
of 1000 bootstrap replicates. The vertical bars delimit the representatives of the FBT
proteins of each type of organism. LinJ, L. infantum; LmjF, L. major; Lmex, L. mexicana;
Ltar, L. tarentolae; Tc, T. cruzi; Tb, T. brucei; Tg, T. gondii; At, A. thaliana; Ch, C.
hominis; Cp, C. parvum; PF, P. falciparum.
Fig. 3. FBT gene expression profile in L. infantum according to the growth phases and
life cycles. RNA was isolated from cells grown for 2 days (early-logarithmic), 3 days (mid-
101
logarithmic), 4 days (late-logarithmic), 5 days (stationary) and 6 days (late-stationary). The
expression of genes was measured by TaqMan real-time RT-PCR assays. The relative
expression data were calculated as described under Section 2. Black bars, promastigotes;
white bars, axenic amastigotes. Average of three biological replicates each with two
technical replicates.
Fig. 4. Comparison of the expression levels of target genes FT1, FT5, BTI and
LinJ 10.0380 of L. infantum in different media. (A) Parasites were grown in MAA, M199
or SDM-79 media. The ordinate represents the ratio between mid-logarithmic and
stationary phase. Average of three biological replicates each with two technical replicates.
(B) Effect of folate concentration on FT1 mRNA levels. L. infantum parasites were
incubated in M199 medium or in Ml 99 supplemented with 150 nM and 1.5 pM folate for
four passages. Average of three biological replicates each with two technical replicates. The
biological and technical replicates were further repeated with essentially the same results.
*p < 0.05; **p< 0.01.
Fig. 5. Analysis of L. infantum methotrexate-resistant mutants. (A) Methotrexate and
folate (insert) accumulation in L. infantum wild-type cells ( • ) and L. infantum MTX100.1
(■) and MTX1000.3 (A). (B) Expression profiles of the FBT genes in methotrexate-
resistant mutants L. infantum MTX 100.1 (white bars) and L. infantum MTX 1000.3 (black
bars). The relative expression data were calculated as described in Section 2. Average of
three biological replicates each with two technical replicates. *p < 0.05.
Fig. 6. FBT gene rearrangements in L. infantum methotrexate-resistant mutants. (A)
Southern blot analysis. Total DNAs of L. infantum cells were digested with PstI or Nhel,
transferred to a nylon membrane, and hybridized to a probe recognizing the FBT genes.
Molecular weights shown on the left were determined using the 1-kb ladder (Bio-Rad). (B)
Organization of the FBT genes LinJ10.0370, LinJ10.0380, LinJlO.0390, FT1
(LinJlO.0400) and LinJ10.0410 on chromosome 10 and suggested mechanism for FT1
inactivation. In mutant MTX100.1 (left side), part of FT1 (LinJlO.0400) was deleted by
homologous recombination with sequences present in LinJ10.0380. In mutant MTX1000.3
(right side) a segmental gene conversion event has introduced a fragment of LinJ 10.0410
into FT1. (C) PCR amplification ofthe FT genes LinJlO.0370, LinJ10.0380, LinJlO.0390,
102
FT1 (LinJlO.0400) and LinJlO.0410 using primers 1-12. All fragments were of the
expected size except with primer pair 5-6. Indeed, despite numerous attempts we failed to
find primers specifically amplifying LinJ 10.0390.
04
06
0020 '/■ 4SS kb -
17 kb
95 k b - / , 31 ' / - 375 kb -//■
1260
1320
1 0 " - m m m W ^ W h r ^ r -0350(tv)0360 0370 0380 0385 0390 0400
JrL_jCZ}O^HZ3{MH»v/-1310
0360 0370 0380 0390 0400 0410 0420 Sskb 1450
. . 561 kb 14 « M ff-
571 kb
366 kb
19 ««—// -355 kb
1997 kb
3 5 **>—// -1965 kb
1355
1440
0920
0870
5150 BT1
5120
50 kb -if «*
320 kb ■if * *» '̂ 7< Telomere
t|i pseudogene
79 kb ./j « ,
Figure 1
103
100
100
46r-LmjF10.0385 ^J i -LmjF io .oago
72i—LinJ10.0410
M ] L- LinJl 0.0400-FT1* LinJ 10.0390 LmjF10.0380
UnJ 10.0380 100
u LmjFl 0.0370 r LinJl 0.0370
ioo L LmjFl 0.0360 ■LinJ19.0870
£
32
lLmjF19.0920
77] i LtarFT5* "—l_r-LinJ10.O420
851- LmjFl0.0400
rLinJ06.0310 ioo*LmjF06.0310 99.— LinJ10.0360
100
74 r, LinJ06.1320 LmjF06.1260
LmexBTI* LinJ35.5120 LmjF35.5150
■ LmjFl 0.0350
100 I—
LW04.0020
91
76|-Tl 100 [~t
l—Tc 93
100 rLmjF04.0020 9HLmjF10.0020 sjLmjFIO.ISIO
TcOO. 1047053508027.40 TcOO.1047053506633.90
Tc00.1047053511575.130 Tb927.8.3620
TD927.8.3630
Leishmania
100 S? 96L
80 100
99! Tb927.8.3650 -Tb10.6k15.1350
rTb927.1.2850 ^ À Tb927.1.2820
571-^927.1.2880 -Tg55.m04868
Tg20.m03988 Tg42.m03408
99, At5g25040 I At5g2505O
At1g79710 At5g 10820
100
Trypanosoma
99 r— At2g33280
— At1g04570 -At1g64890
26
44
76
.At5g54860 MAL8P1.13
PF110172 Ch.EAL37224
^-Cp-CAD98492
99 50
02 100
100" -At2g32040 — Syne<*ocystis-slr0642
Nostoc Syn43cho<XMXus-ABB56229
i— Synecho<x)ccus-ABD02128 t - Synechococcus-ABD00754
Toxoplasma gondi i
Arabidopsis thaliana
Plasmodium falciparum
Cryptosporidium
Cyanobacteria
Figure 2
104
uoissajdxa 3AijE|9y
So -
105
2
ci) o
c o « £ S3. X OJ
>
ce
MAA M199 SDM
Medium
Figure 4
106
1 o E Q. C o
E
K! (U C
I
B
> (fl c
E
U) 2 a x a> > ra a> or
Time (min)
MTX1000.3 MTX100.1
«*' # # A0' A* A° c r cr ^ cr C>* <T
0 0 kO n 0 çû -lO oû x \ . 0 ,<*> «û A 0 ^ \
\> V
* 0 ' * * cr cr
Figure 5
107
B WT / / 0370
X/MTX100.1 NN.MTX1000 .3
S-Tt *•* 0400 0410 0400 0410
, i 7 8
11 -»•♦■ 12 V
0400 0410 [—//
/ / — 0370 0380/0400 0410 / /
s i s i 5 5 5 5
i ï S kb 5 ï S kb 12 M H i ^ H 12
Primer pairs 1-2 3A S-6 7-8 11-12 9-10 3-12 UnJ10. 0370 0380 0300 0400 0400 (WfO 0380/0400
Figure 6
108
Supplemental Tables and Figures
Figure SI. Relative expression levels of control genes. A, Expression of PFR2 and
Amastin genes in promastigotes vs amastigotes. B. Expression of PTRl and META1 genes
in mid-logarithmic phase vs stationary phase of the promastigote stage. The relative
expression data were calculated as described under Material and Methods. Average of three
biological replicates each with 2 technical replicates. *, p<0.05; **, p< 0.01.
B
E < o
a. x cu
PFR2 Amastin PTR1 META1
Figure S2. Sequence ofthe L. infantum chimera gene LinJl 0.0380/0400. The amplified fragment derived from L. infantum MTX 100.1 obtained using primer 3 and 12 (which are underlined) was sequenced. The coding sequence (starting from the ATG) of LinJ 10.03 80 is shaded in gray, the conserved sequence of 80 nucleotides between LinJl0.0380 and LinJl0.400 is not shaded and the sequence of LinJ 10.0400 (FT1) (until the stop codon) is shaded in black. The resulting protein is shown below with the same color code. The sequence of the chimera gene is available under accession number EU221004.
TCACGGTGATCGGAGCTTCTCGCTGCGCATTGCGCCCGCGCA GACACGCTCACAAAACCAAGCGCGC CATGAGCCCTCCCACGACGCCGGGAAGGCGCAGAACAGCGCGCAAGGGTCGCAAGTGACGCAGAAATACTACG TCCATCCGCAGGCAGCCGCCTTGTTCTCTAAGTGGCCGTGGGTGCGACGGGTGCCGATATTTGGTGAGGCTG1 CGAGGGCTACGGGCCCAAGGTCATCGTCGCTCTTGGTACGAGCTACCTGCTCTGCAAGGGCGTCGCGGATCAC ATTCTTACCGGTCAGACGTACGCCATGATGATTGATCGCTACGGCATCAGTGTTCCCCGCTACCAGCGCCTGT CTCCGATTTCGTCCATGGGGTGGTCCATCAAGGCCTTCACAGCGATGCTCTGCGACGGCTTCGCCTTCCTCGG CTACACGAAGCGCTGGTACATGTTCATCTCCTGCGTCGGCGGTGGCGCGTTCGCGCTGATCTACGGCCTCCT1 CCGGCGAAGGAGGCGTCGGCTGATGTGGCAGCCGCCTTCATCTTCCTGTCGACGTGGGGCAAGGCCAACGTGG ATATCCTGTCGGAGGGCCATTACAGTCGACTGATGCGCCAGAACCCGAAGCCTGGCCCGTCCATGGTGAGCTG
109 GATCTGGTTCTGGATCATGGTAGGGGCCATCATCGCGACTGTGATGAACGGCCCGCTCGCGGATGCCGGGAAG CCGCAGATCAGCATCTTCGTGTCTGCCGCGCTGCAG
CGCTGTGGAGTGCTGTGCGAAG TATTGTGGCGCTTGACGGTTGTTGAAAGGGA
MTRSQNQARTHEPSHDAGKAQNSAQGSQVTQKYYVHPQAAALFSKWPWVRRVPIFGEAVEGYGPKVIVALGTS YLLCKGVADQILTGQT YAMMIDRYGISVPRYQRLS PISSMGWSIKAFTAMLCDGFAFLGYTKRWYMFISCVGG GAFALIYGLLPAKEASADVAAAFIFLSTWGKAMVDILSEGHYSRLMRQNPKPGPSMVSWIWFWIMVGAIIATV MNGPLADAGKPQISIFVSAALQH
Figure S3. Segmental gene conversion in FT1 (LinJl0.0400). The amplified fragment
derived from L. infantum MTX 1000.3 obtained using primers 11 and 12 (which are
underlined and at each end) was sequenced and compared to the FT1 and LinJl 0.0410
sequences. Sequences identical to the mosaic FT1 gene found in L. infantum MTX 1000.3
are shaded in gray. Sequences are identical to FT1 for the first 326 nucleotides (#).
Afterwards, there is complete identity for the next 591 nucleotides between FT1, the
mosaic gene and LinJl 0.0410 (first cross-over region); then the sequence ofthe mosaic
gene is identical to LinJl 0.0410 for 385 nucleotides (#); then there is complete identity
between FT1, the mosaic gene and LinJlO.0410 for 185 nucleotide (second cross-over
region) (#); then the sequence is identical to FT1(#). Primers 7 and 8 (which are
underlined) that are used for the TaqMan PCR assay for FT1 are within the mosaic
110
explaining the absence of amplification of FT 1 in L. infantum MTX 1000.3. The sequence
ofthe mosaic gene is available under accession number EU221005.
FT1-WT AGCTGGATGTGGTTTTGCATAATGATTGGCTCACTCATCGCGACTGTGATGAACGGCCCG FT1-MTX1000.3 AGCTGGATGTGGTTTTGCATAATGATTGGCTCACTCATCGCGACTGTGATGAACGGCCCG LinJl0.0410 AGCTGGATCTGGTTCTGGATCATGACCGGCTCACTCATCGCGACTGTGATGAACGGCCCG
******** ***** ** ** **** *********************************
FT1-WT CTCGCGGATGCCGGGAAGCCGCAGATCAGCATCTTCGTGTCTGCCGCGCTGCAGGCCATC
LinJlO.0410 CTCGCGGATGCCGGGAAGCCGCAGATCAGCATCTTCGTGTCTGCCGCGCTGCAGGCCATC ************************************************************
FT1-WT ACCTGCGTCTTCTACCTGTTCAACTGGTACGGGGAGAAGAAGAACCGCGTGCTGCGTTCC FT1-MTX1000.3 ACCTGCGTCTTCTACCTGTTCAACTGGTACGGGGAGAAGAAGAACCGCGTGCTGCGTTCC LinJl0.0410 ACCTGCGTCTTCTACCTGTTCAACTGGTACGGGGAGAAGAAGAACCGCGTGCTGCGTTCC
************************************************************
FT1-WT FT1-MTX1000.3 LinJlO.0410 GAGGACGCGCTGTTTATTCTGGAGGAGACGCGCAAGGAGCGTGAGCGCCTGGGCCTCGAG
************************************************************
FT1-WT GGGGTGAACAACGGCACGGCGGGTGCGCAGCATGGT FT1-MTX1000.3 LinJl0.0410 GGGGTGAACAACGGCACGGCGGGTGCGCAGCATGGTGGTGCGGCGAAGGGGAAGAGGAGC
************************************************************ ♦
FT1-WT CCGCAGCGCTCGCACTCGGATGAGGACGTGGAGGGTGCCGTACGGGATGCCCTCAACGAT FT1-MTX1000.3 CCGCAGCGCTCGCACTCGGATGAGGACGTGGAGGGTGCCGTACGGGATGCCCTCAACGAT LinJl0.0410 CCGCAGCGCTCGCACTCGGATGAAGGCGTGGAGGGTGCCGTACGGGATGCCCTCAACGAT
*********************** * **********************************
FT1-WT GGTCAGCGCGACAACGGTGAACffGTGCÀGGÀCGTCTACGACGÀCGCGTATGACGACGGQ FT1-MTX1000.3 GGTCAGCGCGACAACGGTGAACTTGTGCAGGACGTCTACGACGACGCGTATGACGACGGO LinJl0.0410 GGTCAGCGCGACAACGGTGAACTTGTGCAGGACGTCTACGACGACGCGTATGACGACGGC
************************************************************
FT1-WT GAAGAGGTGGCCGAGGGCGAGGTGTACTACGGCAAGCCGCCGGTGCCGTGCCTGTTCGGG FT1-MTX1000.3 GAAGAGGTGGCCGAGGGCGAGGTGTACTACGGCAAGCCGCCGG LinJl0.0410 GAAGAGGTGGCCGAGGGCGAGGTGTACTACGGCAAGCCGCCC
**********************************************************
FT1-WT CTGTTCGAGGCGAACACGGAGGTGATTTCGAAGAACTGGAAGATCTTCGTGTACAGCGTT FT1-MTX1000.3 CTGTTCGAGGCGAACACGGAGGTGATTTCGAAGAACTGGAAGATCTTCGTGTACAGCGTT LinJl0.0410 CTGTTCGAGGCGAACACGGAGGTGATTTCGAAGAACTGGAAGATCTTCGTGTACAGCGTT
************************************************************
FT1-WT GTCATGACCTGTGCTGTGATCGCGATGCTGTGTGCCÂÀCATCCTGGCCGACACGCTGGGC FT1-MTX1000.3 GTCATGACCTGTGCTGTGATCGCGATGCTGTGTGCCAACATCCTGGCCGACACGCTGGGC LinJl0.0 410 GTCATGACCTGTGCTGTGATCGCGATGCTGTGTGCCAACATCCTGGCCGACACGCTGGGC
************************************************************
FT1-WT CTCCTGGTTGCGTGCGTCGTTGTGTCGACCATCTGCTGCGCCGCGTCCl FT1-MTX1000.3 CTCCTGGTTGCGTGCGTCGTTGTGTCGACCATCTGCTGCGCCGCGTCCTTCTGi LinJl0.0410 CTCCTGGTTGCGTGCGTCGTTGTGTCGACCATCTGCTGCGCCGCGTCCTTCTGGGCCCTG
************************************************************
FT1-WT CCGCTGGTGATTGCGAAGGCCAACGTGTTTGCATACCTGGATAAGGCTGTTTCCÂTCCGT FT1-MTX10 00.3 CCGCTGGTGATTGCGAAGGCCAAeGTGTTTGCATACCTGGATAAGGCTGTTTCCATCCGT LinJ10.0410 CCGCTGGTGATTGCGAAGGCCAACGTGTTTGCATACCTGGATAAGGCTGTTTCCATCCGT
************************************************************
FT1-WT FT1-MTX1000.3 LinJlO.0410
111
GTGAGCGGTCCCCTAAACGCGTTCTACTTGAACACCTACGGCTGCCCCGGCAACCTGCCG GTGAGCGGTCCCCTAAACGCGTTCTACTTGAACACCTACGGCTGCCCCGGCAACCTGCCC GTGAGCGGTCCCCTAAACGCGTTCTACTTGAACACCTACGGCTGCCCCGGCAACCTGCCC *************
FT1-WT FT1-MTX1000.3 LinJlO.0410
AACTTCACCTACACCTTCTACAACACGGTGGCTGGCGTCATCAACACTATCGTTGGTATG AACTTCACCTACACCTTCTACAACACGGTGGCTGGCGTCATCAACACTATCGTTGGTATG AACTTCACCTACACCTTCTACAACACGGTGGCTGGCGTCATCAACACTATCGTTGGTATG ************************************************************
FT1-WT FT1-MTX1000.3 LinJlO.0410
FT1-WT FT1-MTX1000.3 LinJlO.0410
ATTACCGTGACGCTGTTCAACTTCCTGTTCGCGAAGCATGGCTACCGCCTCACCTTCATT ATTACCGTGACGCTGTTCAACTTCCTGTTCGCGAAGCATGGCTACCGCCTCACCTTCATT ATTACCGTGACGCTGTTCAACTTCCTGTTCGCGAAGCATGGCTACCGCCTCACCTTCAT'I! ************************************************************
# GTGACGACAATCATGCAAGTTCTGGCAGCGCTGTTCGACATCATCATTGTGAAGCGCTGG GTGACGACAATCATGCAGG1 GTGACGACAATCATGCAGGTTATGGGTGG ***************** *** *** * **************** ************
FT1-WT FT1-MTX1000.3 LinJlO.0410
FT1-WT FT1-MTX1000.3 LinJlO.0410
AACCTGTACATCGGCATCCCTGACCACGCCATGTACATCTGGGGTGATGCTGTTGTGGGT AACCTGTACATCGGCATCCC ******************************************** ** ***********
7 GAGATCGTGTACATGCTTGGCTTTATGCCGCAGATCGTGCTGCTGTCTCGCCTGTGCCCT GAGCTCGTGTACATGCTCGCCCTTATGCGGCCTGTGGTGCTGCTGTCTCGCCTGTGCCCT GAGCTCGTGTACATGCTCGCCCTTATGCCGCCTGTGGTGCTGCTGTCTCGCCTGTGCCCT
********** :*+***
FT1-WT FT1-MTX1000.3 LinJlO.0410
CGTGGCTCGGAGAGTGTCGTGTATGCGCTGATGGCGGGCTTCGCCCGCCTTGGCCGAACC CGTGGCTCGGAGAGTGTCGTGTATGCGCTGATGGCGGGCTTCGCGAGCCTTGGCCAGACC CGTGGCTCGGAGAGTGTCGTGTATGCGCTGATGGCGGGCTTCGCGAGCCTTGGCCAGACC ******************************************** ********* ***
FT1-WT FT1-MTX1000.3 LinJlO.0410
ACCGCGGCGTCTCTCGGTGCCATCCTTCTGGAGTACGGCCTGCCTGTGTTCAAGACGCAG ACCGCGGCGTCTCTC ^ATCCTTCTGGAGTAC ACCGCGGCGTCTCTCGGTGCCATCCTTCTGGAGTACGGCCTGCCTGTGTTCAAGACGCAG ************************************************************
FT1-WT FT1-MTX1000.3 LinJlO.0410
GATGACGGGTCTCGCTGCAACTACGACAACCTGCCGCTGCTGCTGTTCCTGTGCAGCATG
GATGACGGGTCTCGCTGCAACTACGACAACCTGCCGCTGCTGCTGTTCCTGTGCAACATG ******************************************************* ****
FT1-WT FT1-MTX1000.3 LinJlO.0410
TGCACGCCGCTGCTGGCGATTCCGCTGAGCATAATACTGCTTCCGAAGGCGCGCATCTGC
************** r***********J
FT1-WT FT1-MTX1000.3 LinJlO.0410
GACGATATCGACATTGACGGCAAGGTGGTGCGTCAGGCCGTGGATAAGCAGGTCGCAGC1| GACGATATCGACATTGACGGCAAGGTGGTGCGTCAGGCCGTGGATAAGCAGGTCGCAGCT GAC VTCGACM GGCCC ÎATC ************************************************************
FT1-WT FT1-MTX1000.3 LinJlO.0410
GCTCCGCTGCCGAGCTCCGACTCGGACGCGGTGATGAATGCCGAACCGCTTCATGGGAAC GCTCCGCTGCCGAGCTCCGACTCGGACGCGGTGATGAATGCCGAACCGCTTeATGGGAAC GCTCCGCTGCCGAGCTCCGACTCGGACGCGGTGATGAATGCCGAACCGCTTCATGGGAAC ************************************************************
FT1-WT FT1-MTX1000.3 LinJlO.0410
AAGGCGGATGAGCGCGAGGCAGCGCGCGGGGAGGCGGTGCAGGGCAA-ACG GGCGGG AAGGCGGATGAGCGCGAGGCAGCGCGCGGGGAGGCGGTGCAGGGCAA-ACG GGCGGG AAGGCGGATGAGCGCGAGGCAGCGCGCGGGGAGGCGGTGCAGGGCAAC GCG|TGAtAGCAGA *********************************************** ** ** *
112
FTl-WT FT1-MTX1000.3 LinJlO.0410
CGCTTCAÇ^GAAAfrAqCTGGCGCTGTGGA-GTGCTGTGCGAAGTATTGTGGCGCTTGACG CGCTTClAGAGAAAfrÂqCTGGCGCTGTGGA-GTGCTGTGCGAAGTATTGTGGCGCTTGACG AGCCGTGCGCAGGTAGCGGGGGCGGCGCATGTGCTGTAACCCGTGTGTTCACGGCTGCC-** * **** ** ** * * * ******* ** * * ** ** *
FTl-WT FT1-MTX1000.3 LinJlO.0410
GTTGTTGAAAGGGA GTTGTTGAAAGGGA -TCGCAGCACG * * * * *
Figure S4. Cellular localisation and functional analysis of LinJlO.0410 and
LinJ19.0870. The LinJl0.0410 and LinJl9.0870 genes were fused to the green fluorescent
protein and cloned into Leishmania expression vectors. A. The fusion proteins are located
to the plasma membrane as determined by immunofluorescence microscopy. B. Transport
of folic acid in L. tarentolae wild-type cells (•); in the mutant MTX 1000.6 with no
transport activity (■); in the MTX1000.6mutant transfected with FT1 (□); LinJlO.0410 (o)
and with LinJl9.0870 (A). The same results were obtained with the two FBT genes
unfused to GFP.
LinJ 10.0410-GFP LinJ19.0870-GFP
B
o
o E a. c o
u u <0
4 6 Time (min)
10
# TarWT
■ MTX 1000,6
O MTX1000.6 pSPoNEO.t-LinJ10.0410.GFP
▲ MTX1000.6pSP(tNEOu-LinJ19.0870-GFP
□ MTX1000.6pSPaHYGa-IT1-GFP
113
Table SI. Forward (FW) and reverse (RV) real-time primers and TaqMan probes (TP)
sequences for FBT transporters and other genes ofL. infantum.
Systematic Name' Products Sequence (5'=>3') Amplicon
length (bp)
LinJ04.0020 Ptéridine transporter FW AGGCCAACATCTTCGGATGGTG
159 LinJ04.0020 Ptéridine transporter RV TGGCAGCGTTGCCAATGACA 159 LinJ04.0020 Ptéridine transporter TP1 TGTCCTACATCCTCATCTCCGGCG
159
LinJ06.0310 Ptéridine transporter FW CTACTACCTCGCCTGGATGCCAAC
105 LinJ06.0310 Ptéridine transporter RV CCCAGGTTGCCGAAGCCG 105 LinJ06.0310 Ptéridine transporter TP2 CAGCGCGTACACCATGCTCTC
105
LinJ06.1320 Ptéridine transporter FW CGCGATTGTGTACGAAATCTGCTTTG
135 LinJ06.1320 Ptéridine transporter RV ATCGAATTGCCGGCGCTGTT 135 LinJ06.1320 Ptéridine transporter TP4 TGATGCCGGGGCAGATCCTCATGT
135
LinJ 10.0360 Ptéridine transporter FW CATGCTTAGCACCATGCCGTG
112 LinJ 10.0360 Ptéridine transporter RV CACGGTCTGGCCAAAGTTGGAT 112 LinJ 10.0360 Ptéridine transporter TP3 CCTGTGCCCTCGTGGCTCGGAGA
112
LinJ 10.0370 Ptéridine transporter FW ATGTACATCTGGGGTGCG
161 LinJ 10.0370 Ptéridine transporter RV GACGCGGAAGTCGAGC 161 LinJ 10.0370 Ptéridine transporter TP3 CCTGTGCCCTCGTGGCTCGGAGA
161
LinJ 10.0380 Ptéridine transporter FW TGGGGTGATGCGGTTGTAGC
179 LinJ 10.0380 Ptéridine transporter RV CCGTACTCCATGATGATCGCAG 179 LinJ 10.0380 Ptéridine transporter TP3 CCTGTGCCCTCGTGGCTCGGAGA
179
LinJ 10.0400 FT1; Folate/methotrexate transporter
FW TACATGCTTGGCTTTATGCCGCA 123 LinJ 10.0400
FT1; Folate/methotrexate transporter
RV AGACGCCGCGGTGGTTC 123 LinJ 10.0400 FT1; Folate/methotrexate transporter TP3 CCTGTGCCCTCGTGGCTCGGAGA
123
LinJlO.0410 Ptéridine transporter FW CTCGCCCTTATGCCGCCT
109 LinJlO.0410 Ptéridine transporter RV CGGTGGTCTGGCCAAGGCTC 109 LinJlO.0410 Ptéridine transporter TP3 CCTGTGCCCTCGTGGCTCGGAGA
109
LinJl 0.0420 FT5; folate/methotrexate transporter
FW TTTGCGGTGATGCTGTTGTGTATC 205 LinJl 0.0420
FT5; folate/methotrexate transporter
RV GGGGGTGTGGTGGTGATGCT 205 LinJl 0.0420 FT5; folate/methotrexate transporter TP3 CCTGTGCCCTCGTGGCTCGGAGA
205
LinJlO.1450 Ptéridine transporter FW CGATCATGAAGGCCAACT
144 LinJlO.1450 Ptéridine transporter RV CGACAGTGTTGTAGAATGTCTGA 144 LinJlO.1450 Ptéridine transporter TP1 TGTCCTACATCCTCATCTCCGGCG
144
LinJ19.0870 Ptéridine transporter FW TGTGTTTCAGGTGTGCTACTAT
130 LinJ19.0870 Ptéridine transporter RV CATCGTCTCTCCGAGGTTGGCA 130 LinJ19.0870 Ptéridine transporter TP2 CAGCGCGTACACCATGCTCTC
130
LinJ35.5120 BTI; biopterin transporter
FW GCAATCATCTACGAAGTGTGCGAT 174 LinJ35.5120 BTI; biopterin
transporter RV CCAAATCGTTTCCATCAGCAGGT 174 LinJ35.5120 BTI; biopterin transporter
TP5 CCTGAACATGCCCATGATGATGCTC 174
GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
FW AAGGAGAACTTCGGCATCGAGACTG 255 GAPDH
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
RV CGCGCGGAACGTCAGGTC 255 GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase TP6 TGACCACCATCCACTCCTACACGGCGA
255
LinJ04.1250 Actin FW GCTGTACGGGAACATCGTGCTG 118 LinJ04.1250 Actin RV CGCAACCACCTTCGGCTTTATC 118
LinJ23.0310 PTRl FW CTGTTACCCTCTTCAAGCGC 156 LinJ23.0310 PTRl RV CCCTATCTCCGACACAGGGC 156
LinJ 17.0990 META1 FW GGTGTGACGGTGGAGTTCAAGG 150 LinJ 17.0990 META1 RV GTCGTCGCTGCCCAACATCATC 150
LinJ16.1510 PRF2C FW GAGATCCGCGACGTTGCTATTG 156 LinJ16.1510 PRF2C RV CCGGTCGAAGCTCTTGTTCTCG 156
LinJ34.1020 Amastin FW GATGACACCGAGGGCATGTACG 169 LinJ34.1020 Amastin RV CAACAGAGAGGATGGCAAACGC 169 1 The L. infantum annotations are derived from GeneDB version 3 (www.genedb.org). FW, forward primer; RV, reverse primer; TP, TaqMan probe dual-labeled with 5'FAM /3'BHQ for the FBT genes and 5'TET /3'BHQ for GAPDH. Note that some Taqman probes were useful for more than one target.
114
Chapitre III. Le transporteur de la £-adénos\ Iméthionine de haute affinité localisé au niveau de la membrane plasmique du parasite Leishmania est un membre de la famille des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT)
Le contenu de ce chapitre a fait l'objet d'une publication dans la revue Journal of Biological Chemistry (2010) 285(26): 19767-75
3.1 Résumé
S-Adénosylméthionine (AdoMet) est un donneur du groupement méthyl et joue un
rôle central dans divers processus biochimiques essentiels. Le parasite Leishmania peut à la
fois synthétiser et transporter l'AdoMet. Certaines cellules de Leishmania résistantes à
l'antifolate methotrexate (MTX), dû à un rearrangement au niveau des gènes de la famille
des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT), montrent une résistance croisée à la
sinéfungine (SNF), un analogue structural d'AdoMet. Nous avons également observé un
réarrangement dans les gènes FBT chez des cellules de Leishmania major sélectionnées
pour la résistance à la SNF. Un des gènes FBT réarrangé correspondait au principal
transporteur d'AdoMet de Leishmania et a été nommé AdoMetTl. La fonction
d'AdoMetTl a été déterminée par des expériences de transfection et d'inactivation génique.
AdoMetTl possède une haute affinité pour l'AdoMet, il est localisé au niveau de la
membrane plasmique et est constitutivement exprimé au cours des différentes phases de
croissance du parasite. Nous avons montré que les cellules de Leishmania sélectionnées
pour la résistance ou naturellement insensibles à la SNF avaient une faible expression du
gène AdoMetTl. En conclusion, une nouvelle fonction dans le métabolisme monocarboné,
une voie métabolique au potentiel thérapeutique, est décrite pour cette nouvelle classe de
protéines membranaires retrouvées dans divers organismes.
115
3.2 Article
The high affinity 5-adenosylmethionine plasma membrane transporter of Leishmania
is a member of the folate biopterin transporter (FBT) family.
Larbi Dridi1'2, Amin Ahmed Ouameur1,2 and Marc Ouellette1'*
From the Centre de Recherche en Infectiologie du CHUL, Université Laval, Québec, Canada.
2These authors contributed equally to this work.
* Corresponding author : Marc Ouellette Ph.D. Centre de Recherche en Infectiologie du CHUL 2705, Boul. Laurier Québec, Québec G1V4G2 Tel: 1-418-654-2705 Fax: 1-418-654-2715 E-mail : [email protected]
Running head: S-adenosylmethionine transporter of Leishmania
Keywords: Leishmania, FBT family, S-adenosylmethionine, sinefungin, folic acid,
methotrexate, plasma membrane protein.
116
Abstract
S-Adenosylmethionine (AdoMet) is an important methyl group donor that plays a
central role in many essential biochemical processes. The parasite Leishmania can both
synthesize and transport AdoMet. Leishmania cells resistant to the antifolate methotrexate
due to a rearrangement in folate biopterin transporter (FBT) genes were cross-resistant to
sinefungin, an AdoMet analogue. FBT gene rearrangements were also observed in
Leishmania major cells selected for sinefungin resistance. One ofthe rearranged FBT genes
corresponded to the main AdoMet transporter (AdoMetTl) of Leishmania as determined by
gene transfection and gene inactivation experiments. AdoMetTl was determined to be a
high affinity plasma membrane transporter expressed constitutively throughout the growth
phases of the parasite. Leishmania cells selected for resistance or naturally insensitive to
sinefungin had lower expression of AdoMetTl. A new function in one carbon metabolism,
also a pathway of interest for chemotherapeutic interventions, is described for a novel class
of membrane proteins found in diverse organisms.
117
Introduction
The parasite Leishmania is distributed globally and causes a variety of clinical
symptoms ranging from self-healing cutaneous lesions to visceral infections that are usually
fatal if left untreated (1,2). Current first-line chemotherapy against leishmaniasis relies on
a rather limited arsenal of drugs, including pentavalent antimonials, liposomal amphotericin
B, or miltefosine (2). These drugs are associated with side effects, high costs, and drug
resistance, and therefore, the search for new drugs and targets to control this parasite is
warranted (3, 4).
5-Adenosylmethionine (AdoMet or SAM) is an important biological sulfonium
compound recognized as the universal methyl donor for methylation of lipids, proteins,
nucleic acids, and xenobiotics in living cells (5). AdoMet is also a donor of propylamine
groups for the synthesis of polyamines and participates in the reverse trans-sulfuration
pathway where AdoMet is converted into cysteine and glutathione and in Leishmania in the
spermidine-glutathione conjugate trypanothione (6, 7). AdoMet is also used as a source of
methylene groups, amino groups, and ribosyl groups in the synthesis of fatty acids, biotin,
and the modified nucleoside epoxyqueusine of tRNAs (reviewed in Ref. 8).
Most cells are capable of synthesizing AdoMet from L-methionine and ATP, in a
process requiring the enzyme methionine adénosyltransférase (MAT). The gene coding for
this enzyme is present in most sequenced organisms (reviewed in Ref. 9). However, in
some Rickettsia strains, the MA T gene is inactivated by a mutation (10), and in the fungus
Pneumocystis carinii, no MAT activity has been detected (11). These organisms have the
rare distinction of meeting their AdoMet needs by importing it (12). The Rickettsia
transporter is part ofthe drug/metabolite transporter superfamily (10), and the identity of
the Pneumocystis transporter is not known. Transport of AdoMet across the plasma
membrane does not occur to a significant extent in mammalian cells, but transport of
AdoMet is essential in several organelles. For example, the yeast (13) and human (14)
mitochondrial AdoMet transporters and the Arabidopsis AdoMet plastid (and
mitochondria) transporter (15, 16) have been functionally characterized. They belong to the
118
mitochondrial carrier protein family (MCF), a class of protein mediating the transport of
various substrates (reviewed in Ref. 17).
Other organisms, notably fungus and protozoa, have the ability to both synthesize
and transport AdoMet. The only eukaryotic plasma membrane AdoMet transporter
characterized to date is the Saccharomyces cerevisiae SAM3 protein (18) belonging to the
amino acid permease superfamily. Although SAM3 transports AdoMet, it also transports
polyamines with high affinity (19). Sinefungin (SNF) is an analogue of AdoMet with
antimicrobial activity, and yeast SNF-resistant mutants were shown to have loss-of function
mutations in SAM3 (20). In the protozoan parasites Leishmania (21) and Trypanosoma
brucei (22), SNF and AdoMet were shown, on the basis of substrate competition transport
experiments, to share a common transporter protein. We report here the cloning and
functional characterization of the unique high affinity AdoMet transporter of Leishmania
and show that it belongs to the FBT family, a class of proteins present in diverse organisms.
Materials and Methods
Cell Lines and Culture Conditions
Leishmania cells (Leishmania infantum MHOM/MA/67/ITMAP-263, L. infantum
JPCM5, Leishmania tarentolae, Leishmania major Friedlin, and L. major LV39) were
grown in SDM-79 medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 5
pg/ml hemin, and, when required, 10 pM biopterin (Sigma). The L. tarentolae
methotrexate (MTX)-resistant mutant TarMTXl 000.6 was described previously (23). The
L. tarentolae and L. major LV39 SNF-resistant mutants, named TarSNF.8 and
LV39SNF4000.4, respectively, were selected with SNF in a step-by-step manner as
described in details for other drugs (24). Cell growth was monitored by measuring the
absorbance of culture aliquots at 600 nm in a multiwell scanning spectrophotometer. DNA
transfection into Leishmania promastigotes has been performed as described previously
(25).
119
AdoMetTl Gene Transfection and Inactivation
The AdoMetTl gene of Z,. infantum (LinJ 10.0370) was amplified from genomic
DNA using primer pairs 1-2 and 3^4 (see supplemental Table SI). The PCR fragment was
first ligated into the pGEM T-easy vector (Invitrogen), digested with the appropriate
restriction enzymes, and cloned into the relevant restriction sites within the Leishmania
expression vectors pSP72 ocHYGa (26) and pSPaNEOa-GFP (27). The L. infantum
AdoMetTl null mutant was obtained by targeted gene replacement. The AdoMetTl
inactivation cassettes were generated using a PCR fusion-based strategy as described
previously (28). Primers used to generate the inactivation cassettes are listed in
supplemental Table SI. Briefly, the NEO inactivation cassette was generated by using the
primer pairs 5-6 and 7-8 to amplify DNA fragments of 730 bp upstream and 680 bp
downstream of the AdoMetTl gene, respectively. The neomycin phosphotransferase (NEO)
gene was amplified from the plasmid pSPccNEOa using primers 9 and 10 and then fused to
the upstream and downstream DNA fragments of AdoMetTl using PCR. The same strategy
was used to generate the ZEO cassette; primer pairs 5-11 and 12-8 were used to amplify
the upstream and downstream fragments of AdoMetTl, whereas primers 13 and 14 were
used to amplify the ZEO gene from the pSPaZEOa vector (29).
Cellular Transport Assays
TarMTXl000.6 expressing the AdoMet transporter (AdoMetTl) and the folic acid Q
transporter (FT1) were harvested during the mid-logarithmic phase. 10 cells were washed
and resuspended in folate deficient medium fdDMEL or AdoMet-deficient medium with
115 nM [3H]folic acid (43.2 Ci/mmol) or 60 nM [3H]AdoMet (83 Ci/mmol) (Moravek
Biochemicals), respectively. Accumulation was measured as described previously (30).
Folic acid uptake was normalized to cell number, and the background transport value was
removed by subtracting the accumulation value obtained on ice. The transport kinetic
parameters Vmax and apparent Km values for AdoMet were measured while using different
[3H]AdoMet concentrations (3-3000 nM) during the linear phase of accumulation (5 min).
Transport kinetic parameters were determined by linear regression analysis and Michaelis-
Menten analysis. The transport competition study was performed with 5 x 10
LV39SNF4000.4 cells expressing the AdoMetTl-GFP protein. Briefly, cells were
120
incubated for 10 min in an assay buffer, as described previously (31 ), containing 50 nM
radioactive AdoMet in the presence or absence of various concentrations (100 nM and 1
and 10 pM) of competing molecules. For all transport experiments, the accumulation in
cells incubated on ice was subtracted.
Quantitative Real Time Reverse Transcription-PCR
Three independent RNA preparations were used for each real time PCR experiment.
RNA extractions, cDNA synthesis, and TaqMan quantification of AdoMetTl were
performed as described previously (27). Primers and Taxman probes are listed in
supplemental Table S2. Real time reverse transcription- PCR for the MAT gene was
performed as described previously (32) using GAPDH and actin genes as controls
(supplemental Table S2).
Western Blot Analysis
Total Leishmania proteins (30 pg) were run on 12% polyacrylamide gels and
transferred onto nitrocellulose membranes as described previously (33). The blots were
blocked overnight in 5% skimmed milk in IX phosphate- buffered saline (PBS). A
monoclonal anti-a-tubulin antibody (Sigma) directed against a conserved amino-terminal
peptide of the bovine ct-tubulin or an antibody against the green fluorescent protein (GFP)
(Invitrogen) was diluted 1:3000 in PBS containing 0.1% Tween 20 (PBS/Tween) and
incubated for 1 h with the membranes. The blots were washed three times for 5 min in
PBS/Tween and incubated with horseradish peroxidase- conjugated sheep anti-rabbit IgG
for GFP or sheep anti-mouse IgG for ct-tubulin (Amersham Biosciences) diluted 1:10,000
in PBS/Tween. The blots were washed as above, incubated with ECL Plus
chemiluminescent substrate (Amersham Biosciences), and exposed to x-ray films. The
polyclonal rabbit MAT antibody was kindly provided by Prof. Balana-Fouce (University of
Leon, Spain) and was used as described previously (34).
Southern Analysis
Leishmania total DNAs were isolated using DNAzol reagent as recommended by
the manufacturer (Invitrogen). For Southern blots, genomic DNAs were digested with Pvul
121
to monitor rearrangement events of the FBT family and with PstI for analysis of the
AdoMetTl-nu\l mutant. Southern blots, hybridizations, and washes were performed
following standard protocols (35), and all probes were obtained by PCR. The FBT gene
family was studied with a DNA probe spanning the conserved coding sequences ofthe FBT
genes (27), and AdoMetTl allele replacement was confirmed by using a probe targeting the
3 '-UTR of AdoMetTl.
Fluorescence Microscopy
Live parasites were mounted under poly-L-lysine-coated coverslips. Coverslips were
sealed with nail varnish and air-dried for 15 min. Bright field and fluorescence images were
taken using a Nikon Eclipse TE300 inverted microscope with a Photometries coolSNAPfx
camera. Visualization ofthe GFP fluorophore was achieved using a 460/500- nm excitation
filter and 510/560-nm emission filter with a lOOx objective. The images were processed
using the Image- Pro Plus software (version 5.0).
Results
Leishmania Methotrexate-resistant Mutant Is Cross-resistant to Sinefungin
Folic acid (FA) and AdoMet are the one carbon metabolic donors in cells, and
previous reports have demonstrated that AdoMet metabolism is potentially changed in
Leishmania cells resistant to the FA analogue MTX (29, 36). Indeed, the L. tarentolae
MTX1000.6 mutant is resistant to MTX (Fig. \A) due to decreased accumulation of MTX
or FA (see Fig. 2A and data not shown). This reduced accumulation is due to gene deletion
and rearrangements of the FBT transporter FT1 (37). Surprisingly, this mutant was also
found to be cross-resistant to the AdoMet analogue SNF (Fig. li?). This intriguing
observation led us to further investigate SNF susceptibility in Leishmania cells. L.
tarentolae and L. major wild-type cells were sensitive to MTX (Fig. \A). However,
although L. tarentolae and L. major LV39 were sensitive to SNF, L. major Friedlin was
intrinsically resistant to it (Fig. \B and Table 1). Similarly, whereas the L. infantum 263
strain was highly sensitive to SNF, the genome strain L. infantum JPCM5 was intrinsically
resistant (Table 1). L. tarentolae and L. major LV39 cells were selected in a step-by step
122
fashion for resistance to SNF, and these cells were indeed resistant to SNF (Fig. IB) but not
cross-resistant to MTX (Fig. \A).
Resistance to MTX in L. tarentolae MTX 1000.6 is due to a reduced uptake ofthe
drug (23), which is paralleled by a reduction in the uptake of the analogue FA (Fig. 2A).
Accordingly, we tested whether cross-resistance to SNF in L. tarentolae MTX 1000.6
correlated with a reduced accumulation of AdoMet and whether cells intrinsically resistant
(L. major Friedlin or L. infantum JCPM5) or made resistant to SNF also exhibited a
reduced accumulation of AdoMet. Wildtype L. tarentolae and L. major LV39 accumulated
AdoMet, but all strains not susceptible to SNF, regardless of whether resistance was
intrinsic or acquired, did not (Fig. 2B).
AdoMet Transporter Is a Member of the FBT Family
The L. tarentolae MTX 1000.6 mutant was resistant to both MTX and SNF (Fig. 1),
a phénotype accompanied by a reduced accumulation of FA and AdoMet (Fig. 2). Because
there are rearrangements ofthe FBT gene family in this mutant (30), we hypothesized that
the lack of AdoMet transport in this mutant could be correlated with FBT gene
rearrangements. This was also investigated in L. tarentolae and L. major cells made
resistant to SNF where the genomic DNAs of the mutants were digested with Pvul and
hybridized to a FBT probe. There were no clear rearrangements in the L. tarentolae-
resistant mutant SNF8 (results not shown). However, there was a clear rearrangement of
some of the FBT family members in the L. major-resistant LV39SNF4000.4 mutant
compared with its parental wildtype SNF-sensitive isolate (Fig. 3A). According to the
published genome sequence of L. major, the high molecular weight (>12 kb) rearranged
band most likely encodes three FBT genes (LmjFlO.0350, LmjFlO.0360, and
LmjF10.0370). The corresponding L. infantum orthologues LinJl0.0.0360, LinJl0.0.0370,
and LinJl 0.0.0380 were cloned into expression vectors and transfected in the SNF-resistant
cells L. tarentolae MTX1000.6 and LV39SNF4000.4. Cells transfected with LinJl0.0370
but not the other two constructs became highly sensitive to SNF (Fig. 3B and results not
shown). This transporter clearly did not correspond to FT1 (LinJl0.0400). Indeed, L.
tarentolae MTX1000.6 transfected with FT1 was still highly resistant to SNF (Fig.32?) but
became highly sensitive to MTX (Fig. 3Q. L. tarentolae MTX1000.6 transfected with
123
LinJlO.0370 remained resistant to MTX (Fig. 3C). Because LinJlO.0370 sensitized cells to
SNF, we tested whether it could correspond to a plasma membrane AdoMet transporter.
Plasma membrane localization was examined by fusing the FBT open reading frame
containing the gene of interest to GFP and analyzing the resultant transfectants by
fluorescence microscopy (Fig. 4A). The LV39SNF4000.4 mutant and L. major Friedlin did
not transport AdoMet (Figs. 2B and AB). However, when these cells were transfected with
LinJl0.0370, we observed an accumulation of AdoMet (Fig. AB). These results suggested
that LinJ 10.0370 may catalyze the transport of AdoMet, and it was thus renamed
AdoMetTl. L. tarentolae MTX1000.6 or SNF8 cells did not accumulate AdoMet, but the
same cells transfected with AdoMetTl were capable of transporting AdoMet (Fig. AC).
However, L. tarentolae MTX 1000.6 cells transfected with AdoMetTl did not transport FA,
whereas the same cells transfected with FT1 did (Fig. AD).
To further link AdoMetTl to AdoMet transport, we attempted to generate an L.
infantum AdoMetTl null mutant. Two replacement cassettes were made, which allowed
AdoMetTl to be replaced by either the NEO or ZEO genes (Fig. 5A). These constructs were
transfected independently in wild-type cells and selected for resistance to either G418 or
Zeocin. Leishmania is diploid, and when its DNA is digested with PstI and hybridized to a
3-UTR AdoMetTl probe, the resulting hybridized fragment should be 6.2 kb in length
(Fig. 5v4). Integration of either the NEO or ZEO cassette and digesting with PstI and
hybridizing to the same probe should lead to fragments of 5.5 and 5.7 kb, respectively (Fig.
5A). Analysis of wild-type cells and AdoMetTl/NEO or AdoMetTl/ZEO transfectants
digested with PstI and hybridized with the 3-UTR probe were completely consistent with
the above scenario (Fig. SB, lanes 1-3). The ZEO cassette was introduced in an
AdoMetTl/NEO clone, and molecular analysis of the resulting transfectant was consistent
with the generation of an AdoMetTl null mutant. Indeed, the 6.2-kb band corresponding to
the intact AdoMetTl gene disappeared, whereas bands corresponding to the integration of
NEO and ZEO inactivation cassettes were observed (Fig. 55, lane 4). The L. infantum-263
wild-type cells were sensitive to SNF (Fig. 5 Q and accumulated AdoMet (Fig. 5D).
However, the AdoMetTl/NEO cells exhibited intermediate sensitivity to SNF (Fig. SC) and
accumulated less AdoMet (Fig. 5, C and D). The NEO/ZEO AdoMetTl null mutant was
insensitive to SNF and did not accumulate any measurable AdoMet (Fig. 5, C and D). We
124
confirmed that these phénotypes were indeed due to the lack of AdoMetTl, because
transfection of an episomal add-back construct encoding AdoMetTl into the null mutant
rescued both the susceptibility to SNF and the transport of AdoMet (Fig. 5, C and D).
AdoMetTl Is a Specific High Affinity AdoMet Transporter Expressed Constitutively
The kinetic properties of AdoMetTl were studied, and the Km value was determined
to be in the 150-300 nM range for both L. major and L. infantum (Table 1). The Vm^
values was calculated to be at least 10 times higher in cells sensitive to SNF compared with
cells intrinsically less susceptible to SNF (Table 1). We tested whether AdoMetTl was
specific for AdoMet by challenging the accumulation of [3H]AdoMet with related
substrates. AdoMet itself and SNF were shown to inhibit the accumulation of the
radioactive substrate but neither adenosine nor adenine, cysteine, ornithine, methionine, or
homocysteine competed with AdoMet uptake (Fig. 6). Only 5-adenosylhomocysteine, at a
high concentration, was able to compete with the accumulation of AdoMet (Fig. 6).
The transport of FA mediated by the FBT member FT1 is stage-regulated in
Leishmania, with maximal activity in the logarithmic phase of growth (38). Indeed, during
the progression of the parasite toward its stationary phase, there is increased FT1 protein
degradation (37). We tested whether AdoMetTl and AdoMet transport were under similar
stage regulation. AdoMet transport increased during log phase, but in contrast to FA, it
remained constant during the stationary phase (Fig. 7). Consistent with these results,
AdoMetTl-GFP fusions were not degraded in the stationary phase of growth with the
fusion protein migrating at the expected 100-kDa size. Moreover, AdoMetTl-GFP was at
the level of the plasma membrane in stationary cells as deduced from fluorescence
microscopy (Fig. 7). The same lack of growth stage regulation was observed for both L.
major and L. infantum (Fig. 7 and results not shown).
Molecular Basis for Intrinsic and Acquired Resistance to Sinefungin
L. major Friedlin and L. infantum JPCM5 were intrinsically resistant to SNF,
whereas L. major LV39 and L. infantum-263 were sensitive to it. This correlates with a
decrease in the transport of AdoMet (Fig. 2 and Table 1) and most likely SNF (Fig. 6). We
sequenced the AdoMetTl gene in cells incapable of AdoMet transport, and we found that
125
the coding sequence ofthe gene was identical to the published sequence. We next measured
the expression of AdoMetTl by quantitative reverse transcription-PCR and found that its
expression was 20 times higher in L. major LV39 compared with L. major Friedlin (Fig.
8,4). The expression of the MAT and FT1 genes was similar in the two L. major strains (Fig.
8,4). The expression of AdoMetTl was also higher (3-fold) in the AdoMet-transporting
strain L. infantum-263 compared with L. infantum JPCM5 (Fig. 85). The expression of the
MAT gene was similar in the two L. infantum strains, but the FT1 gene was also expressed
at higher level in L. infantum-263 (Fig. 8B). Incidentally, we found that L. infantum-263
was more sensitive to MTX compared with strain JPCM5 (results not shown), an
observation that could be attributed to the difference in FT1 expression.
We also sequenced the AdoMetTl open reading frame in the SNF-resistant mutant
LV39SNF4000.4, and we compared that sequence with that of the L. major LV39 strain
and found that they were identical (results not shown). However, the expression of
AdoMetTl was down-regulated 11-fold in cells in which resistance was induced compared
with the wild-type cells as determined by quantitative reverse transcription-PCR (Fig. 8Q.
The reduction in AdoMetTl expression correlated with a decrease of the Fmax value in the
transport of AdoMet (Table 1). Unfortunately, this quantitative reverse transcription-PCR
assay could not be applied to SNF-sensitive and -resistant L. tarentolae, possibly because
the sequence of AdoMetTl in this species was too divergent.
Discussion
The first indirect evidence for an AdoMet transporter in Leishmania came from the
observation that SNF, an AdoMet analogue, had inhibitory effects against the parasite (39).
Biochemical evidence was later obtained that demonstrated both the capacity of
Leishmania to accumulate AdoMet (40) and that AdoMet and SNF shared the same uptake
system (21). Our study now identifies the high affinity AdoMet transporter in Leishmania
as AdoMetTl, a membrane protein in the FBT family. The FBT family is a novel class of
membrane proteins, which is part ofthe major facilitator superfamily (41, 42). They were
first characterized in Leishmania (30, 43) but are present also in other kinetoplastid
parasites (27) or in Apicomplexa parasites such as Plasmodium and Toxoplasma (AA, 45),
in plants, and in cyanobacteria (46). So far, the only function attributed to these proteins
126
was the transport of unconjugated (47, 48) or conjugated pterins such as FA (30, 37, 46,
49). With 14 members, Leishmania has the largest number of FBTs, but the function of
only three members, BTI, FT1, and FT5 is known. The remaining 11 Leishmania proteins
in the FBT family are unlikely to correspond to plasma membrane FA transporters (27).
The function of a fourth member of the FBT family, namely AdoMetTl, has now been
revealed. As such, it would be of interest to investigate the role of AdoMetTl homologues
in other organisms containing FBTs, to determine whether they too can transport AdoMet.
This would be particularly important in Trypanosoma brucei, the parasite responsible for
sleeping sickness. Indeed, based on the unique biochemical properties of AdoMet transport
in T brucei, it was suggested that the transporter could serve as a novel route for the
delivery of drugs (50). T. brucei has seven FBT homologues (27) and determining if any of
these functions in AdoMet transport would be an important endeavor. In particular, several
S-adenosylmethionine decarboxylase inhibitors are being developed against parasites (51-
53), and some of these may enter through an AdoMet transporter. Sinefungin, but none of
the individual AdoMet building blocks, can inhibit AdoMet uptake in T. brucei (22), and
this is consistent with our observations for Leishmania AdoMetTl (Fig. 6). The Km value of
the T. brucei AdoMet transport was reported to be in the millimolar range (54) indicating a
lower affinity than Leishmania AdoMetTl, which is in the nanomolar range (Table 1).
FBTs have also been described in plants with nine members in Arabidopsis, one of
which transports FA (46). The plastid AdoMet transporter, named SAMT1, is not a
member of the FBT family but is part of the MCF (15, 16). MCF proteins are also
responsible for AdoMet transport in yeast (13) and human mitochondria (14). Interestingly,
Leishmania also encodes MCF proteins, one of which appears to be an orthologue of the
mitochondrial AdoMet transporter (55). Disruption of the Arabidopsis SAMTl gene led to a
severe growth defect, but because the plants remained viable, it was suggested that other
proteins could be implicated in AdoMet transport (15). It is possible that one ofthe plant
FBTs could be involved as a secondary organellar AdoMet transporter.
The Leishmania AdoMetTl transports AdoMet specifically in the low nanomolar
range, whereas FT1, also a FBT member, exclusively transports FA in the nanomolar range
(37, 43). Other FBTs highly homologous to either AdoMetTl or FT1 transport neither
127
AdoMet nor FA. Because AdoMetTl and FT1 are 80% identical (27), it should be possible
to find key regions and eventually amino acids involved in substrate specificity.
Interestingly, AdoMetTl and FT1 are regulated very differently at the post-translational
level with FT1 being degraded in stationary phase (37), whereas AdoMetTl is expressed
constitutively (Fig. 7). Although the signals implicated in the degradation of FT1 are
unknown, the production of AdoMetTl/FT 1 fusion proteins could aid in identifying motifs
involved in protein degradation in Leishmania.
Sinefungin has been found to be active against several Leishmania species (39, 56)
but also against other parasites, including malaria (57), and the trypanosomes (58). It was
suggested to have the potential to serve as a lead compound for a novel antiparasitic drug
(59). However, some Leishmania strains were found to be intrinsically resistant to SNF
(60), a finding supported here with the intrinsic SNF resistance observed in L. major
Friedlin or L. infantum JPCM5 (Table 1). This phenomenon can now be plausibly
explained by the defect in AdoMet transport (Fig. 2B), which is also related to lower
AdoMetTl expression (Fig. 8) and to a reduced Pmax for AdoMet transport (Table 1). The
disruption of AdoMetTl also leads to SNF resistance (Fig. 5). Interestingly, the selection
for resistance to SNF in Leishmania was also correlated to a decrease in the expression of
AdoMetTl (Fig. 8). The mechanism by which this happens is not yet clear, but it could be
related to the gene rearrangement observed in our study (Fig. 3,4). Reduced RNA levels in
Leishmania are usually due to a decrease in gene copy number (61, 62), although other
mechanisms may also occur (63). Interestingly, in the yeast S. cerevisiae that also
transports AdoMet, resistance to SNF was shown to correlate with loss of function
mutations in the AdoMet transporter Sam3 (20). Although the overexpression of MAT was
shown to confer resistance to SNF in Leishmania (64), it is not involved in the decreased
susceptibility observed here because the expression of MAT was not changed in our
resistant cells at either the RNA (Fig. SC) or protein level (result not shown). The
expression of MA T was also not increased in cells with reduced expression of AdoMetTl
(Fig. 8) or in cells in which AdoMetTl was disrupted (results not shown). Leishmania
strains can be sensitive to SNF in the low nanomolar range (Fig. 1), but several strains
demonstrated no intrinsic susceptibility (Table 1) (60) possibly because of lower
AdoMetTl expression. We could nonetheless envisage using more lipophilic analogues of
128
SNF, which may not require a specific transporter, as novel chemotherapeutic agents
against Leishmania.
Pneumocystis appears to depend exclusively on AdoMet uptake to meet its AdoMet
needs (11), but Leishmania can either synthesize it or salvage it from its environment. We
have inactivated AdoMetTl in L. infantum (Fig. 5), and the resultant cells were viable,
showed no obvious growth defect, and retained the ability to infect macrophages (results
not shown). Several organisms use synthesis as their main source of AdoMet, so the
presence of proteins implicated in the uptake of exogenous AdoMet in major classes of
parasites (kinetoplastids and apicomplexa) is perplexing. Leishmania cycles in various
environments (insect vectors and mammalian hosts) with varying concentrations of
metabolites that could serve as building blocks for AdoMet synthesis. It may thus be
advantageous, under limiting concentrations of metabolic precursors, to import AdoMet
directly from the environment. Leishmania is a purine auxotroph with numerous salvage
pathways (65), and one could envision that under purine-poor conditions, the uptake of
AdoMet could serve as a purine source. Synthesis of AdoMet is energetically expensive
because for each molecule of AdoMet synthesized, the three high energy phosphodiester
bonds of ATP are hydrolyzed (9). When AdoMet is present in the environment, and under
energetic constraint, it may thus be advantageous for the parasite to import AdoMet instead
of synthesizing it. The Leishmania MAT activity is maximal during logarithmic phase of
growth and negligible in the stationary phase (7). If AdoMet is required during other
growth phases of the parasite, it could also be useful for the organism to import it to
compensate for a reduced rate of synthesis. Although cells without AdoMetTl (Fig. 5) or
cells with low AdoMetTl expression (Fig. 8) thrive well under laboratory conditions, it is
possible that under specific conditions they may be at a disadvantage or that the expression
of the gene is induced. The identification of the AdoMet transporter will now allow the
testing of some of these hypotheses in Leishmania and also in other organisms.
Acknowledgments
We thank Dr. Jeremy Mottram for the L. infantum JPCM5 strain and Dr. Balana-
Fouce for the anti-MAT antibody. We also thank Drs. Danielle Légaré, Angana Mukherjee,
Philippe Leprohon, and Jennifer Raven for critical reading ofthe manuscript.
129
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132
Table 1
Susceptibility to sinefungin and kinetic properties ofS-adenosy I methionine transport in Leishmania spp. The IC50 values are 50% inhibitory concentrations of sinefungin. The means ±S.D. of at least three independent experiments are given.
Strains IC50 value of sinefungin
Km ' m a x
nM nM pmol/10 cells/min
L. infantum MHOM/MA/ 80 ±18 167 ±27 0.56 ±0.17 67/ITMAP-263 L. infantum JPCM5 2000 ± 300 180 ±82 0.05 ± 0.01 L. major LV39 50 ± 4 252 ±10 0.57 ±0.13 L. major Friedlin >6000 320 ± 7 0.03 ± 0.01 LV39SNF4000.4 + AdoMetTl-GFP 10 ± 2 284 ± 72 0.58 ± 0.24
Legend to figures
Fig. 1. Sensitivity of Leishmania cells to methotrexate and sinefungin. Leishmania cells
were incubated in SDM medium with varying concentrations of methotrexate (A) and
sinefungin (B), and their growth was monitored at 72 h by measuring the absorbance at 600
nm. # , L. tarentolae wild type; O, L. tarentolae MTX1000.6; A, TarSNF.8; A, L. major
Friedlin; ■, L. major LV39; □, LV39SNF4000.4. The average of triplicate measurements
is shown.
Fig. 2. Folic acid and S-adenosj Imcthioninc accumulation in Leishmania cells. The
accumulation of 115 nM [3H]folic acid (A) and 60 nM 5-[3H]adenosylmethionine (B) was
measured in Leishmania cells. • , L. tarentolae wild type;0, L. tarentolae MTX1000.6; A.
TarSNF.8; A, L. major Friedlin; ■, L. major LV39; □, LV39SNF4000.4. The average of
triplicate measurements is shown.
133
Fig. 3. Identification of the 5-adenosyImethionine transporter (AdoMetTl) of
Leishmania. (A), Southernblot analysis of L. major LV39 and LV39SNF40004. Total
DNAs of Leishmania cells were digested with Pvul, transferred to a nylon membrane, and
hybridized to a 700-bp probe derived from the conserved regions of the FBTs. (B),
susceptibility of Leishmania cells to sinefungin. (C), susceptibility of Leishmania cells to
methotrexate. ♦ , TarMTX1000.6 transfected with AdoMetTl; O, TarMTX1000.6
transfected with FTP, V, LV39SNF4000.4 transfected with AdoMetTl. The average of
triplicate measurements is shown (for B and C).
Fig. 4. Functional characterization of AdoMetTl. (A), fluorescence microscopy analysis
of LV39SNF4000.4 cells expressing AdoMetTl-GFP. LV39SNF4000.4 cells were
transfected with a plasmid where the AdoMetTl gene and the GFP gene were fused in-
frame. Analysis of transfectants by fluorescence microscopy indicated that the fusion
protein was localized mainly in the plasma membrane of the parasite. (B), transport of 60
nM S-[3H]adenosylmethionine inL. major cells. A, L. major Friedlin; ■, L. major Friedlin
transfected with AdoMetTl; □, LV39SNF4000.4; V, LV39SNF40004 transfected with
AdoMetTl-GFP; T , LV39SNF4000.4 transfected with AdoMetTl. (C), transport of 60 nM
S-[3H]adenosylmethionine in L. tarentolae cells. O, TarMTXl000.6 transfected with GFP;
♦ , TarMTXlOOO.6 transfected with AdoMetTl-GFP; O, TarMTX1000.6 transfected with
FTP, A, TarSNF.8; T , TarSNF.8 transfected with AdoMetTl-GFP. (D), transport of 115
nM [3H]folic acid in L. tarentolae cells. ♦ , TarMTXl 000.6 transfected with AdoMetTl-
GFP; O, TarMTX1000.6 transfected with FT1-GFP. The average of triplicate experiments
are shown (B-D).
Fig. 5. Generation and characterization of L. infantum AdoMetTl null mutant. (A),
genomic organization of the AdoMetTl locus. The AdoMetTl upstream and downstream
fragments used for the integration of the NEO and ZEO cassettes are shown. P, PstI. UTR,
untranslated region. (B), Southern blots of L. infantum genomic DNA digested with PstI
and hybridized to a AdoMetTl-3 'UTR probe. Lane 1, L. infantum wild type; lane 2, L.
infantum with one AdoMetTl allele disrupted with the NEO cassette; lane 3, L. infantum
with one AdoMetTl allele disrupted with a ZEO cassette; lane 4, L. infantum AdoMetTl
null mutant with integrated NEO and ZEO cassettes. (C), sinefungin susceptibility of
134
Leishmania cells. (D), transport of 60 nM 5-[3H]adenosylmethionine by Leishmania cells.
# , L. infantum wild type; O, L. infantum AdoMetTl with one inactivated allele; A, L.
infantum AdoMetTl null mutant; A, L. infantum AdoMetTl null mutant transfected with a
add-back AdoMetTl plasmid. The average of triplicate measurements is shown for C and
D.
Fig. 6. Substrate specificity profile of AdoMetTl in L. major. LV39SNF4000.4 cells
expressing AdoMetTl-GFP were co-incubated for 10 min with 50 nM S-
[ H]adenosylmethionine and cold substrate competitors at various concentrations (100 nM
and 1 and 10 pM). Results represent the percent of 5'-[3H]adenosylmethionine accumulation
in competed samples versus the accumulation of a non competed control. The average of
triplicate measurements is shown.
Fig. 7. Growth stage regulation of 5-adenosylmethionine transport activity.
Accumulation of 60 nM S-[3H]adenosylmethionine was measured along the growth phases
(48, 72, 96, and 120 h) for 10 min in L. infantum wild type (white bars), LV39SNF4000.4
transfected with AdoMetTl-GFP (gray bars), and L. major LV39 wild type (black bars).
Average of triplicate measures is shown. Western blot with an anti-GFP antibody or with a
control ct-tubulin antibody to monitor the amounts of proteins layered was carried out with
LV39SNF4000.4 transfected with AdoMetTl-GFP as described under "Materials and
Methods." Cellular localization of AdoMetTl was deduced from fluorescence microscopy
analysis of LV39SNF40004 transfected with the AdoMetTl gene fused in-frame with the
GFP gene. The majority of the fluorescence derived from the AdoMetTl-GFP hybrid
protein was at the level ofthe plasma membrane throughout the various growth stages.
Fig. 8. RNA expression of targeted one-carbon metabolism genes in Leishmania cells.
The expression ofthe genes coding for the AdoMet transporter AdoMetTl, ofthe folate
transporter FT1, and of the methionine adénosyltransférase MAT were measured by
quantitative real time reverse transcription-PCR as described under "Materials and
Methods." The expression was compared in the following: (A), L. major LV39 versus L.
major Friedlin, respectively, sensitive and insensitive to SNF; (B), L. infantum-263 versus
L. infantum JPCM5 (respectively, sensitive and less sensitive to both SNF and MTX); (C),
135
L. major LV39 versus the sinefungin-resistant mutant LV39SNF4000.4. For all bars, mean
of biological triplicates is presented.
B
200 400 600 800 1000 Methotrexate (uM)
0.2 0.4 0.6 0.8 Sinefungin (uM)
Figure 1
136
B 1.4-,
2 4 6 Time (min)
10
2 4 6 Time (min)
10
Figure 2
137
kb
12-
5-4-
1 2
- m*
• §
B 120
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0.2 0.4 0.6 0.8 1 Sinefungin (uM)
•c 80 î o a> 60 o S2 40
20
0
-V- -$
200 400 600 800 1000 Methotrexate (pM)
Figure 3
138
4 6 Time (min)
Figure 4
139
P 1
6.2 kb P 1 ■ ■
M r i 5 UTR AdoMetT l 3 'UTR "> '
P#
r P j
5.5 k b W
r P j 1
f t r 5 'UTR 1 NEO | 3 'UTR
p P*
5.7 k b
p P*
p
— ' — / //-p
1 5 'UTR I Z E O l 3 'UTR p
— ' — /
B „K 1 2 3 4 kb i—:
6 - h * ♦■ AdoMetTl
>-ZEO ♦-NEO
200 400 600 800 1000 1200 Sinefungin (nM)
2 4 6 Time (min)
Figure 5
140
Adenosine
Adenine
Cysteine
Ornithine
Methionine
Homocysteine
S-Adenosylhomocysteine
Sinefungin
S-Adenosylmethionine
10 pM 1 pM
100 nM
10 MM 1 uM
100 nM
10 pM 1 gM
100 nM
10 pM 1pM
100 nM
10 MM 1pM
100 nM
10pM 1 pM
100 nM
10 pM 1 pM
100 nM
10 pM 1pM
100 nM
10 MM 1 MM
100 nM
No inhibitor
Fr
10 20 30 40 50 60 70 80 90
S-Adenosylmethionine uptake (%)
100 110 120
Figure 6
141
48 h 72 h 96 h 120 h
AdoMetTl-GFP
cc-tubulin i ^ ^
100 kDa
55 kDa
Figure 7
142
AdoMetTl AdoMetTl MAT AdoMetTl MAT
Figure 8
143
Chapitre IV. Localisation intracellulaire des protéines de la famille des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT) et de la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF) chez Leishmania.
Une version complète de l'article sera bientôt soumise pour publication
4.1 Résumé
Les folates réduits et la S-adénosylméthionine (AdoMet) sont des donneurs d'unités
à un carbone (Cl) nécessaires pour la synthèse de l'ADN, le métabolisme des acides
aminés et pour les réactions de methylation cellulaire. Chez les parasites trypanosomatides,
le transport cellulaire des folates et d'AdoMet est assuré par certains membres de la famille
des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT), mais le transport de ces metabolites
dans la mitochondrie n'a pas été étudié. Dans cette étude, nous rapportons la localisation
intracellulaire des protéines de la famille FBT de Leishmania en générant des fusions FBT-
GFP. Nous avons déterminé que la plupart des protéines FBT sont localisées au niveau de
la membrane plasmique du parasite, tandis que trois protéines sont localisées au niveau des
compartiments intracellulaires. Chez les eucaryotes supérieurs, les protéines appartenant à
la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF) sont responsables de l'import des
folates et d'AdoMet dans certains organites. Nous avons détecté des orthologues de ces
protéines dans le génome de Leishmania et confirmé leur localisation mitochondrial. Ces
expériences de localisation protéique sont un pré-requis pour déterminer la fonction des
protéines de la famille FBT et celles de la MCF.
144
4.2 Article
Intracellular localization of folate/bioptcrin transporter (FBT) and mitochondrial
carriers family (MCF) proteins in Leishmania.
Amin Ahmed Ouameur, Jean-François Ritt, Danielle Légaré and Marc Ouellette*
Centre de Recherche en Infectiologie du CHUL, Université Laval, Québec, Qc, Canada.
Corresponding author : Marc Ouellette Ph.D. Centre de Recherche en Infectiologie 2705 Boul. Laurier Québec, Qc. Canada GI V 4G2 Tel : 1-418-654-2705 Fax: 1-418-654-2715 E-mail : [email protected]
Running title: The FBT family and the MC family of Leishmania.
Keywords: Leishmania, FBT family, mitochondrial carrier family (MCF), folates, S-
adenosylmethionine, methotrexate, sinefungin.
145
Abstract
Reduced folates and S-adenosylmethionine (AdoMet) are essential one-carbon
donors required for DNA synthesis, amino acids metabolism and methylation reactions. In
trypanosomatid parasites, the cellular uptake of folates and AdoMet is ensured by members
of the folate/biopterin transporters (FBT) family, but transport of these solutes into the
mitochondrion has not yet been studied. In this work, the cellular localization of the FBT
family proteins of Leishmania was investigated experimentally by generating FBT-GFP
fusions. Results revealed that the majority of the FBT proteins are localised at the plasma
membrane while only three were located to the membranes of intracellular compartments.
In higher eukaryotes, members of the mitochondrial carrier family (MCF) are responsible
for uptake of folates and AdoMet into organelles. Orthologous mitochondrial carrier
proteins (MCPs) were detected in the Leishmania sequence databases. Fluorescence
microscopy analyses of cells overexpressing MCP-GFP fusions demonstrated that they
localised to the mitochondrial membranes. These localisation efforts are a prerequisite for
further functional studies of FBT and MCF intracellular membrane proteins.
146
Introduction
Leishmania parasites are responsible for leishmaniasis, a disease with clinical
symptoms that ranges in severity from self-healing skin lesions to visceral infections, the
latter being usually fatal if left untreated (1). Leishmaniasis is endemic in 88 countries and
affects several millions of people each year (http://www.who.int/leishmaniasis). Despite
substantial efforts, no protective vaccine is available for leishmaniasis, and treatment is
based on chemotherapy which relies on a rather limited arsenal of drugs including
pentavalent antimonials, liposomal amphotericin B, pentamidine and miltefosine (1, 2).
Although effective in most cases, many problems have however been associated with anti-
leishmanial chemotherapy, notably side effects, high costs and drug resistance (3, 4). New
drugs and new therapeutic targets for drug and vaccine development are therefore urgently
required.
Historically, the folate metabolic pathway has been successfully exploited for the
treatment of a variety of infectious diseases, with the folic acid-reducing enzyme
dihydrofolate reductase (DHFR) as a common therapeutic target (5-7). Reduced folates
(e.g. tétrahydrofolate (THF) and its derivatives) are essential coenzymes in diverse
metabolic reactions, collectively known as one-carbon metabolism, that involve the transfer
of one-carbon units (Fig. 1) for the synthesis of various important metabolites. In
eukaryotic cells, one-carbon metabolism is compartmentalized between the cytoplasm and
organelles. In the cytoplasm, it is involved in the synthesis of thymidylate and purines, the
serine-glycine interconversion, the reméthylation of homocysteine to methionine and the
biosynthesis of S-adenosylmethionine (AdoMet). In the mitochondria, one-carbon
metabolism is required for the serine-glycine interconversion and the synthesis of
formylated methionyl-tRNA (fMet-tRNA) for mitochondrial protein synthesis (8-10).
Folates are composed of a pterin ring, a p-aminobenzoic acid (pABA) moiety, and a
glutamic acid chain of variable length (Fig. 1). Leishmania parasites are auxotroph for
ptéridines (folates and biopterin) and must acquire them from the environment (11).
The cellular transport of both folic acid and biopterin has been extensively studied
in Leishmania spp. (11) and the plasma membrane transporters (named FT1, FT5 and BTI)
mediating the selective uptake of those molecules were cloned and functionally
147
characterized (12-16) (Fig. 1). These transporters belong to the folate/biopterin transporters
(FBT) family (17) within the major facilitator superfamily (MFS) (18, 19). Members ofthe
FBT family were found in protozoan parasites, cyanobacteria and higher plants, with
Leishmania representing the organism with the largest FBT dataset (14 members) (17). The
two other members of the FBT family shown to transport folate are Slr0642 protein from
the cyanobacterium Synechocystis and its Arabidopsis ortholog At2g32040 which is located
to the chloroplast envelope (20). Recently, a new Leishmania FBT member was
characterised and found to be the main 5-adenosylmethionine transporter (AdoMetTl) (21).
While the plasma membrane transporters involved in the uptake of folates and S-
adenosylmethionine into the cytosol are known, the traffic of those molecules between the
cytosol and the unique mitochondrion has not been studied yet in Leishmania.
The existence of carrier-mediated systems responsible for folates and AdoMet
transport from the cytosol into intact organelles (mitochondria, chloroplast, Golgi vesicles
and vacuoles) has been demonstrated in higher eukaryotic cells (22-26). The genes
encoding the folates and AdoMet organellar transporters have now been cloned and
functionally characterised in humans (folates and AdoMet) (27-30), yeast (AdoMet) (31)
and Arabidopsis (folates and AdoMet) (32-34). All those carrier proteins possess the
characteristic sequence features of the mitochondrial carrier family (MCF), which is
defined as a large and diverse group of structurally related proteins that transport a variety
of substrates across the inner mitochondrial membrane, and other organellar membranes
(35-38). All MCF members exhibit a tripartite structure consisting of three tandemly
repeated homologous domains of about 100 amino acids in length, containing each two
transmembrane alpha-helice domains connected by a hydrophilic loop and a conserved
signature sequence motif. Both the N- and C-termini are located on the cytosolic side (38,
39). Searching genome databases using the sequence features of the MCF proteins has
revealed that the Saccharomyces cerevisiae genome encodes 34 mitochondrial carriers
(MCs) (37), that of Arabidopsis thaliana revealed 58 MCs (38) and the human genome is
encoding at least 49 MCs (35, 36). MCF proteins were also identified in trypanosomatid
parasites (40). In this work, we describe the localization of the remaining uncharacterized
putative members of the FBT family, and the identification and molecular characterization
of several mitochondrial carriers in the protozoan parasite Leishmania.
148
Materials and Methods
Leishmania growth conditions
The Leishmania infantum (strain MHOM/MA/67/ITMAP-263) and Leishmania
tarentolae methotrexate (MTX)-resistant mutant TarMTXl000.6 were cultured as
promastigotes in SDM-79 medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine
serum, and 5 pg/ml hemin. The TarMTXl 000.6 mutant was obtained by stepwise selection
as described previously (41). Cell growth was monitored by measuring the absorbance of
culture aliquots at 600 nm in a multiwell scanning spectrophotometer.
Sequence searches and analyses
Leishmania infantum genome databases (www.genedb.org and
www.ncbi.nlm.nih.gov) were screened with the sequences ofthe functionally characterised
organellar folate transporters (hMFT, AtFOLTl) (28-30, 32), AdoMet transporters (Sam5p,
SAMC, SAMT1/SAMC1) (27, 31, 33, 34) and thiamine pyrophosphate transporters TPC
and TPC1 (42, 43) using the web tool BLASTP. The amino acid sequences obtained were
used for reciprocal BLASTP search to eliminate false positives.
DNA manipulations
The complete coding regions of the FBT family proteins and the identified putative
folate, AdoMet, and thiamine mitochondrial carrier proteins (MCP) were amplified from
genomic DNA of Leishmania infantum strain MHOM/MA/67/ITMAP-263 by PCR using
two pairs of forward (FW) and reverse (RV) primers (see Table SI, supplementary
material). Each FW and RV primers contain unique restriction enzyme site (e.g. Xbal,
Hindlll, BamHI, Bglll, Sail, EcoRI) for the cloning of the wild-type gene into
pSP72 ccHYGa vector (44) or for in-frame cloning with a C-terminal green fluorescent
protein GFP tag using the plasmid pSP12aNEOa-GFP (17). DNA transfection into
Leishmania cells and selection ofthe recombinant cells were performed as described (45).
149
Fluorescence Microscopy
Promastigote cells expressing the green fluorescence protein (GFP)-fusion proteins
were washed with Hepes/NaCl buffer (21 mM Hepes, pH 7.2, 137 mM NaCl, 5 mM KC1,
0.7 mM Na2HPÛ4, 6 mM glucose), immobilized in Hepes/NaCl buffer containing 5%
glycerol, mounted on microscope slides with coverslips and visualised by epifluorescence
microscopy as described (21). Staining with 20 nM MitoTracker Red CMXRos
(Invitrogen-Molecular Probes) was performed in Hepes-NaCl buffer at 24 °C for 30 min
followed by 2 washes in Hepes/NaCl. Visualization of the MitoTracker fluorescence was
achieved using a 532-588 nm excitation filter with a 607-683 nm emission filter. The
images were processed using ImageJ version 1.42 (National Institutes of Health, USA;
http://rsb.info.nih.gov/ij).
Results
Subcellular localization of the putative members of the FBT family in Leishmania
The genome of Leishmania encodes for 13 proteins of the FBT family and to date
only four proteins were functionally characterized namely the biopterin transporter BTI
(13, 14), the two folic acid transporters FT1 and FT5 (12, 15, 16) and the S-
adenosylmethionine transporter AdoMetTl (21). Those proteins along with the two other
functionally uncharacterized proteins LinJlO.0410 and LinJ19.0870 (17) have been
reported to be located at the plasma membrane ofthe parasite. However, the localization of
the remaining Leishmania FBT members is unknown and the identity ofthe mitochondrial
folates and AdoMet carriers remain to be defined. The human reduced folate carrier (RFC)
has been localized at the cell surface membrane as well as in the mitochondrial membrane
(46), suggesting a role for the mitochondrial isoform in the transport of folates. In silico
analysis ofthe L. infantum FBT family proteins using different programs for signal peptide
detection and protein localization failed to predict a mitochondrial localization for these
proteins. However, the prediction results from the PSORT II program
(http://psort.hgc.jp/form2.html) suggested that all Leishmania members of the FBT family
were plasma membrane proteins, with the exception of LinJ04.0020 which was predicted as
an endoplasmic reticulum protein (data not shown). In order to identify putative
150
mitochondrial proteins among the FBT family members, the subcellular localization of the
remaining uncharacterized FBT proteins was verified experimentally. This was done by
fusing to the C-terminal of the coding sequence of each FBT proteins the coding sequence
of the green fluorescence protein (GFP) using the Leishmania expressing vector
pSPaNEOa-GFP (17). A first series of six FBT-GFP fusion constructs (LinJ04.0020,
LinJ06.0310, LinJ10.0360, LinJlO.0370, LinJlO.0390, LinJlO.1450) were transfected in
both L. infantum and L. tarentolae. Since the expression patterns were strictly identical in
both species, the remaining FBT-GFP fusion constructs were transfected in either L.
infantum (LinJ35.5120) or L. tarentolae (LinJ06.1320, LinJ10.0380, LinJlO.0400,
LinJ 10.0410, LinJl0.0420, LinJ 19.0870). The expression patterns presented in figure 2
showed that only three FBT proteins (LinJ04.0020, LinJ06.0310 and LinJl0.0360) were
located in intracellular compartments, while the remaining 10 members were at the plasma
membrane. Indeed, cells overexpressing the LinJ04.0020-GFP protein fusion showed a
GFP fluorescence signal located to the membrane of small intracellular vesicles, cells
overexpressing the LinJ06.0310-GFP protein showed a fluorescence signal located near the
flagellar pocket and cells overexpressing the LinJ10.0360-GFP fusion revealed a
fluorescence signal detected near the flagellar pocket and also to the membrane of small
intracellular vesicles (Fig. 2). The N-terminal GFP fusions were also produced for the three
putative intracellular FBT proteins and these were found to localize into similar
compartments as the C-terminal fusions (result not shown).
Identification of the mitochondrial carriers for folates, AdoMet and thiamine
Proteins belonging to the mitochondrial carrier family (MCF) have been described
to be responsible for the uptake of a variety of molecules across the membrane of different
organelles (e.g. mitochondria, plastid, peroxisomes, endoplasmic reticulum) (39, 47). We
started searching in the Leishmania infantum genome databases for genes encoding putative
orthologs of the previously functionally characterized folate, AdoMet and thiamine MCF
transporters from other eukaryotes (27, 30-34) using BLASTP search and found that
several candidates were putative members of the mitochondrial carrier family. One specific
ortholog was identified for AdoMet or thiamine substrates, namely LinJ32.0110 (37/46 %
identical/similar amino acid with SAMC) and LinJ 19.1090 (27/46 % identical/similar
amino acid with TPC), respectively, while three orthologs were identified as the potential
151
ortholog for the folate transporter, namely LinJ32.1170, LinJ32.1180 and LinJ35.3380
(respectively; 27/49 %, 28/44 % and 31/46 % identical/similar amino acid with AtFOLTl).
However, we cannot exclude that the later transporters could mediate the transport of other
substrates, as they also group with pyrimidine nucleotide and NAD mitochondrial
transporters (Table 1, Fig. SI-supplementary data). During the cloning of the in silico
identified L. infantum MCPs, the trypanosomatid mitochondrial carrier family proteins
were inventoried and classified into functional groups using sequence analysis and
phylogenetic reconstruction (40). In this work, the Arabidopsis database was not taken into
account for BLASTP analysis, although our results are in close agreement with their
conclusions. At the time of writing, the function of all members of trypanosomatid MCF
proteins is unknown. However, it should be noted that the MCF member MCP6 of T.
brucei, a putative ADP/ATP carrier, was cloned but the transport assay suggested that
MCP6 does not function as either an ADP/ATP or ATP-Mg/Pi carrier (48).
Mitochondrial localization of the identified mitochondrial carrier proteins (MCP)
The subcellular localization of the putative mitochondrial transporters for folate,
AdoMet and thiamine pyrophosphate was assessed by producing MCP-GFP constructs
using the same strategy as for the FBT proteins (17). The MCP-GFP constructs were
transfected in Leishmania infantum promastigote cells and the localization of the MCP-
GFP fusions was revealed by epifluorescence microscopy analyses of the recombinant
cells. The expression patterns (Fig. 3) clearly demonstrated that the five tested MCPs
(LinJ32.1170, LinJ32.1180, LinJ35.3380, LinJ32.0110 and LinJ19.1090) localize to the
parasite mitochondrion, as confirmed by the perfect co-localization (Fig. 3, merge panels A
and B) ofthe green fluorescence (Fig. 3, GFP panels) associated to the MCP-GFP fusions
with the red fluorescence (Fig. 3, MitoTraker panels) associated to the MitoTracker Red
probe. As a control, cells overexpressing the GFP protein revealed a fluorescence signal
located throughout the cytoplasm and the flagella (Fig. 3, pSP aNEOa-GFP).
Discussion
Leishmania is a folate-auxotroph organism and relies exclusively on exogenous
folate uptake for cellular and organellar one-carbon metabolism. In contrast, Leishmania is
prototroph for AdoMet and has also the ability to import it (Fig. 1). Only one type of
152
transport system has been characterized for folate and AdoMet in Leishmania; the cellular
uptake ensured by high affinity transporter proteins belonging to the folate/biopterin
transporters (FBT) family (Fig. 1) ((21) and reference therein). In total, 14 different FBT
genes encoding 13 different proteins are predicted in Leishmanial genome (17). The
majority of those proteins are functionally uncharacterized but most of them are found to be
located at the parasite plasma membrane (Fig. 2). Some plasma membrane proteins, like
LinJlO.0410 (97 % similar amino acids with the folate transporter FT1) and LinJ19.0870
(61 % similar amino acids with FT1) do not function as folic acid transporters (17) nor as
biopterin or AdoMet transporters (data not shown), suggesting a putative role of those
proteins in transport of different substrates. Current literature suggests that reduced folate
derivatives (in particular folmyl-THF) and AdoMet are also required for mitochondrion
metabolism in Leishmania (49-52). Hence the hypothesis about the possible localization of
particular FBT members of Leishmania in the mitochondrial membrane. It should be noted
that the Arabidopsis folate transporter At2g32040, within the FBT family, is located into
the chloroplast envelop (20).
The analysis of the Leishmania cells overexpressing the FBT-GFP fusions revealed
that only three proteins (LinJ04.0020, LinJ06.0310 and LinJ 10.0360) among the 13 tested
FBT proteins were localized into intracellular compartments (Fig. 2). While the expression
patterns of those proteins remains to be confirmed by subcellular fractionation and Western
blotting analyses, it seems that their localization pattern is unlikely to be in the
mitochondrion as shown for the MCF proteins (Fig. 3). However, the GFP fluorescence
signals of the three FBT-GFP fusion proteins might correspond to the endoplasmic
reticulum (ER)-Golgi network of the parasite. Indeed, the fusion proteins LinJ04.0020-
GFP, LinJ06.0310-GFP and LinJl0.0360-GFP might define the endoplasmic reticulum
(ER) (at the periphery of the nucleus envelop), the Golgi apparatus (G)/endosomes
(proximal to the flagellar pocket) and the Golgi apparatus/ER, respectively ((53) and
references therein). Interestingly, early biochemical studies demonstrated that in plants,
AdoMet is transported into the Golgi apparatus and endoplasmic reticulum for protein
methylation, but the transporter is yet unknown (24). Inhibition of the nucleotide sugar
transporters of the Golgi apparatus (54) showed little effects on AdoMet transport,
excluding the involvement of these transporters in AdoMet uptake (24). Another
153
transporters family associated with the transport of AdoMet is the mitochondrial carrier
family (MCF) and members of this family are found in different organelles like
mitochondria, plastid, peroxisomes and endoplasmic reticulum (39, 47). However, since
MCF proteins that could be involved in the AdoMet transport into the ER-Golgi apparatus
are not yet identified, we postulate that the three intracellular located FBT proteins revealed
in the present study might be interesting candidates for AdoMet transport studies.
Folate and AdoMet transport activities have been detected previously in purified
mitochondria (22, 23). The genes encoding folate transporters have now been cloned in
human and Arabidopsis (30, 32) while genes encoding AdoMet transporters have been
cloned in yeast, human and Arabidopsis (27, 31, 33, 34). Those proteins belong to the
mitochondrial carrier family (MCF) and members of this family are also found in
trypanosomatids (40). Leishmania genome encodes for at least 32 MCPs which could be
classified into different functional groups (Fig. IS). A genome-based prediction strategy
combining sequence similarity search (Table 1) and phylogenetic analysis (Fig. SI)
revealed that one specific putative MCP could potentially transport AdoMet, another one
thiamine, while three MCPs could potentially transport folates. Molecular analyses of these
MCPs provide evidence that they are putative mitochondrial transporters (Fig. 3). The
functional role of those proteins could be investigated by transport studies using different
approaches: (i) by comparing the transport activity of the purified mitochondria between
cells overexpressing the MCP-GFP fusion proteins, MCP-mutant cells (knock-out cells)
and control cells (expressing only the GFP protein); (ii) by expression of MCP-GFP fusion
proteins into IPTG-inducible E. coli strain; (iii) or by protein purification and reconstitution
into liposomes. Several substrates might be tested for the transport studies, like folic acid
and its 5-CH3-THF and 5-CHO-THF derivatives, methotrexate (structural analogue of folic
acid), biopterin, AdoMet and its structural analog sinefungin, thiamine, pyrimidine and
ATP. These studies would allow to determine the plasma membrane and mitochondrial
transporters for metabolites essential in one carbon metabolism. It also remains of interest
to determine the function (the transported substrate) of the remaining plasma membrane
and intracellular FBTs.
154
Acknowledgments
This work was funded in part by the CIHR group and operating grants to M.O. A. A-O. is
the recipient of a CIHR studentship. M.O. is a Burroughs Wellcome Fund Scholar in
Molecular Parasitology and holds the Canada Research Chair in Antimicrobial Resistance.
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158
Table 1: Percentage identity (Id) and similarity (Sim) between Leishmania infantum mitochondrial carrier proteins (MCPs) with their human, yeast and plant homologs. The % Id/Sim values were obtained through NCBI-BLASTP analyses.
GeneDB Identity Human homolog Id/Sim (%) Yeast homolog Id/Sim
(%) Arabidopsis homolog Id/Sim (%)
LinJ15.0120 SLC25A33 (unknown) 27/44 YBRI92w(RIM2) 27/43 Atlg25380(AtNDT2) 26/48 LinJ19.1090 SLC25A19 (TPC) 27/46 YPROUc (unknown) 24/44 At2g37890 (unknown) 30/49 LinJ23.1630 SLC25A37 (MFRN) 23/42 YJL133w(MRS3) 23/40 At4g39460 (SAMC1/SAMT1) 25/40 LinJ32.0110 SLC25A26 (SAMC) 37/49 YNL003c (PET8/Sam5p) 36/48 At4g39460 (SAMC1/SAMT1) 32/45 LinJ32.1170 SLC25A32 (MFT) 26/46 YEL006w (NAD2) 25/49 At5g66380 (AtFOLTl) 27/49 LinJ32.U80 SLC25A32 (MFT) 24/42 YEL006W (NAD2) 24/43 At5g66380 (AtFOLTl) 28/44 LinJ35.3380 SLC25A17(PMP34) 28/47 YIL134w(FLXl) 22/48 At5g66380 (AtFOLTl) 31/46
Unknown, unknown function; PMP34, peroxisomal membrane protein (ATP transporter in human [55]); MFT, mitochondrial folate transporter [30]; TPC, mitochondrial thiamine pyrophosphate carrier [42]; MFRN, putative iron transporter [56]; SAMC, S-adenosylmethionine mitochondrial carrier protein [27]; RIM2, mitochondrial pyrimidine nucleotide transporter [57]; MRS3, iron transporter [58]; FLX1, mitochondrial flavin adenine dinucléotide (FAD) carrier [59]; PET8/Sam5p, S-adenosylmethionine mitochondrial carrier protein [31]; NAD2, mitochondrial nicotinamide adenine dinucléotide (NAD) transporter [60]; AtFOLTl, chloroplast folate transporter [32]; SAMC1/SAMT1, S-adenosylmethionine mitochondrial and chloroplast carrier proteins [33, 34]; AtNDT2, mitochondrial NAD transporter [61].
Figure Legends
Fig. 1. Structure of monoglutamate folate (F), biopterin (B) and S-adenosylmethionine
(AdoMet) and compartmentation of one-carbon metabolism in Leishmania. The
biosynthetic enzymes of the one-carbon metabolism are indicated by solid arrows. The
cellular and organellar transport systems are indicated by dotted arrows and question
marks. The names ofthe functionally characterized transporters are indicated in the circles.
pABA, j?-aminobenzoic acid; FT1 and FT5, folate transporters; BTI, biopterin transporter;
AdoMetTl, S-adenosylmethionine transporter 1; DHF, dihydrofolate; THF,
tétrahydrofolate; BH2, dihydrobiopterin; BH4, tetrahydrobiopterin; THF-Glun,
tétrahydrofolate polyglutamate; 5,10-CH2-THF, 5,10-Methylene-tetrahydrofolate; FA,
Folic acid; IO-CH3-THF, 10-Methyl-Tetrahydrofolate; 10-CHO-THF, 10-Formyl-
tetrahydrofolate
Fig. 2. Subcellular localization of FBT-GFP fusions in Leishmania. Promastigote cells
overexpressing GFP (pSPaNEOct-GFP) or FBT-GFP fusion proteins were visualised by
epifluorescence microscopy after 48 hours of growth following transfection. Because there
are two identical copies ofthe gene LinJl 0.1450, the localization of 13 (rather than 14)
FBT proteins are shown. The fusion constructs LinJ04.0020-GFP, LinJ06.0310-GFP and
159
LinJl0.0360-GFP were transfected in both L. infantum wild-type (strain
MHOM/MA/67/ITMAP-263) and the methotrexate resistant mutant L. tarentolae
TarMTXl000.6 and showed the same intracellular localization. For these three fusions,
only the expression patterns observed in L. infantum is shown. All other FBT-GFP
constructs were transfected in TarMTXl000.6 promastigote cells only whereas
LinJ35.5120 was solely transfected in L. infantum. DIC, differencial interference contrast;
GFP, fluorescence of GFP; Merge, overlaid of GFP and DIC images.
Fig. 3. Mitochondrial localization of MCP-GFP fusions in Leishmania. Leishmania
infantum promastigote cells overexpressing GFP (pSP aNEOa-GFP) or MCP-GFP fusion
proteins were visualised by epifluorescence microscopy after 48 hours of growth following
transfection. The MitoTracker Red CMXRos (20 nM) was used to locate the mitochondrion
in the cells. The same cells were photographed first with a MitoTracker Red filter followed
by the GFP filter and then with the phase-contrast (DIC) filter. DIC, differencial
interference contrast; GFP, fluorescence of GFP; MitoTracker, fluorescence of MitoTracker
Red CMXRos; Merge A, overlaid of the MitoTracker Red images with the GFP images;
Merge B; overlaid ofthe DIC images with the GFP and mitoTracker fluorescence images.
160
Folate (F)
Biopterin (B)
Pterin
Glutamate
o/^~ COOH
HN-CH-CH,-CH,-COOH
NH,
HOOC
S-adenosylmethionine (AdoMet)
OH OH
Fig.l
161
DIC GFP Merge
pSPaNEOu-GFP 5 Lin J 04.0021)
5
LM06.0310
5
i
LM06.1320
5
LinJ 10.0360
5
LinJlO.0370 (AdoMetTl)
5
LinJlO.0370 (AdoMetTl)
5
U LinJ10.0380
5
" LinJ 10.0390
5
"
LinJlO.0400 (FT1)
5
LinJlO.0400 (FT1)
_ LinJ 10.0410
_ LinJl 0.0420 (FT5)
_ LinJl 0.0420 (FT5)
LinJl0.1450
LinJ19.0870
LinJ3S.5120 (BTI)
Fig. 2
162
DIC GFP Merge DIC GFP
A B
pSPaNEOa-GFP ^ 4 •« >
LM32.1170 4%
>
LinJn.l l HO J J +
LinJ35.3380 ■4
V f*
LinJ32.0110 r
i LinJ 19.1090
K r r
r
i
Fig. 3
163
Supplementary material
Table SI: Forward (FW) and reverse (RV) primers for all FBT family genes and five selected members ofthe MC family ofLeishmania infantum.
Family protein GeneDB systematic name Sequence (5' => 3') References
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LinJ 10.0420 (FT5)b
RV1 AAGCTTCCCCACGCCTCACGCGCGCTT
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LinJ 10.0420 (FT5)b
RV1
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164
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FW2 CGGATCCAGTGCCCATGGATGCGGCAC
•
FW2
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RV2 CGTCTAGACGCGCGCTTCCTCTCTGCTTGC
•
RV2
•
LinJlO.1450
FWI TTCTAGAAGCGACCATGACCGTTGGT
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LinJlO.1450
FWI
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•
LinJlO.1450 RV1 AAGCTTGACGACTACTGCTGCCCCT
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•
LinJlO.1450 RV1
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•
LinJlO.1450 FW2 CGGATCCAGCGACCATGACCGTTG
This work
•
LinJlO.1450 FW2
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•
LinJlO.1450
RV2 CGTCTAGACTGCTGCCCCTCCGAATC
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•
LinJlO.1450
RV2
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• LinJ19.0870
FWI TTCTAGAGAACTAGCAATGACGTTAGAG
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FWI
3 • LinJ19.0870 RV1 GGTCGACTCCTTGTTCAATGCTTGCC
3 • LinJ19.0870 RV1
3 • LinJ19.0870 FW2 GGATCCGAACTAGCAATGACGTTAGAG
3 • LinJ19.0870 FW2
3 • LinJ19.0870
RV2 TCCTTCTAGAATGCTTGCCGGC
3 • LinJ19.0870
RV2
3 •
LinJ35.5120(BTl)c
FWI GCTCTAGATTGCCATCATGCCAGGTCGT
This work
•
LinJ35.5120(BTl)c
FWI
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LinJ35.5120(BTl)c RV1 AAGCTTAATTCGCTAGCTGTCCCGCCTCAT
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LinJ35.5120(BTl)c RV1
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LinJ35.5120(BTl)c
FW2 CGGGATCCTTGCCATCATGCCAGG This work
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LinJ35.5120(BTl)c
FW2 This work
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LinJ35.5120(BTl)c
RV2 CGTCTAGAGCTGTCCCGCCTCATTGTCG
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•
LinJ35.5120(BTl)c
RV2
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LinJ 19.1090
FWI CGTCTAGACTGTCGATGTCCAGC
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LinJ 19.1090
FWI
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LinJ 19.1090 FW2
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LinJ 19.1090
RV2 CGTCTAGAAGGACCCTTCTTCCGC
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LinJ 19.1090
RV2
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LinJ32.0110
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LinJ32.0110
FWI
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LinJ32.0110 RV1 CGAAGCTTCTATAGCGTGTGCTCGC
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LinJ32.0110 RV1
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LinJ32.0110 FW2 CGGATCCGTGTAGATCGTATGGAGTCG
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LinJ32.0110 FW2
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LinJ32.0110
RV2 CGTCTAGATAGCGTGTGCTCGCTTTG
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LinJ32.0110
RV2
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LinJ32.1170
FWI
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LinJ32.1170 RV1 CTAAGCTTCTACGACGACGGATATCGCC
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LinJ32.1170 RV1
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LinJ32.1170 FW2 CCGGATCCGATCTCCATGAATAAGTTA
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LinJ32.1170 FW2
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LinJ32.1170
RV2 CTTCTAGACGACGACGGATATCGCC
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LinJ32.1170
RV2
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LinJ32.1180
FWI CGTCTAGATTGCCATGGCGGAG
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LinJ32.1180
FWI
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LinJ32.1180 RV1 AAGCTTTCAGGGCAAGATGTGCTG
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LinJ32.1180 FW2 GGGATCCTTGCCATGGCGGAG This work
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LinJ32.1180 FW2 This work
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LinJ32.1180
RV2 GTTTCTAGAGGGCAAGATGTGCTGTGC
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LinJ32.1180
RV2
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LinJ35.3380
FWI CGTCTAGATTCGCCATGACGAAAGC
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LinJ35.3380
FWI
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LinJ35.3380 RV1 GTGTCGACCTACTGAAACTGAGGC
This work
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LinJ35.3380 RV1
This work
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LinJ35.3380 FW2 CGGATCCTTCGCCATGACGAAAG
This work
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LinJ35.3380 FW2
This work
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LinJ35.3380
RV2 GTTCTAGACTGAAACTGAGGCTTTCCCAC
This work
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LinJ35.3380
RV2
This work
The primer pairs FW1/RV1 were used to clone the wild-type gene while the primer pairs FW2/RV2 were used for in-frame cloning with C-terminal green fluorescent protein (GFP) tag. Restriction sites are underlined. Start and stop codons and anticodons are in bold. a, this gene is absent in strain MHOM/MA/67/ITMAP-263 ((3) and data not shown) and was amplified from strain JPCM5. and c, these genes are the orthologs of the L. tarentolae folic acid transporter FT5 and L. mexicana biopterin transporter BTI, respectively (3).
165
Fig. SI. Phylogenetic tree of the Leishmania infantum mitochondrial carrier family
(MCF) proteins. The amino acid sequences of the 32 MCF proteins of L. infantum were
aligned with the 46 human (SLC25A) MCF proteins (4, 5), the functionally characterised
organellar Arabidopsis thaliana (At) folate and AdoMet transporters and yeast (Y) thiamine
and AdoMet transporters (6-10). The tree was constructed using MEGA4.1 software (11).
The Neighbor-Joining method (12) was used with Poisson correction, complete deletion of
gap and 1000 bootstrap replicates. Bootstrap values equal or above 55% were indicated at
the relevant nodes. The dark gray surfaces are used to mark the major functional MCF
subgroups. The scale bar represents 10 substitutions per 100 sites.
166
Accession numbers
The accession numbers ofthe 32 L. infantum MCF proteins (LinJ) are given in Figure SI.
The accession number of the 46 members of the human MCF (SLC25A) proteins, and the
selected functionally characterized yeast (Y) and plant (At) mitochondrial carrier proteins
are : SLC25A1 (P53007), SLC25A2 (Q9BXI2), SLC25A3 (Q00325), SLC25A4 (P12235),
SLC25A5 (P05141), SLC25A6 (P12236), SLC25A7 (P25874), SLC25A8 (P55851),
SLC25A9 (P55916), SLC25A10 (Q9UBX3), SLC25A11 (Q02978), SLC25A12 (075746),
SLC25A13 (Q9UJS0), SLC25A14 (095258), SLC25A15 (Q9Y619), SLC25A16 (P16260),
SLC25A17 (043808), SLC25A18 (Q9H1K4), SLC25A19 (Q9HC21), SLC25A20
(043772), SLC25A21 (Q9BQT8), SLC25A22 (Q9H936), SLC25A23 (Q9BV35),
SLC25A24 (Q6NUK1), SLC25A25 (Q6KCM7), SLC25A26 (Q70HW3), SLC25A27
(095847), SLC25A28 (Q96A46), SLC25A29 (Q8N8R3), SLC25A30 (Q5SVS4),
SLC25A31 (Q9H0C2), SLC25A32 (Q9H2D1), SLC25A33 (Q9BSK2), SLC25A34
(Q6PIV7), SLC25A35 (Q3KQZ1), SLC25A36 (Q96CQ1), SLC25A37 (Q9NYZ2),
SLC25A38 (Q96DW6), SLC25A39 (Q9BZJ4), SLC25A40 (Q8TBP6), SLC25A41
(Q8N5S1), SLC25A42 (Q86VD7), SLC25A43 (Q8WUT9), SLC25A44 (Q96H78),
SLC25A45 (Q8N413), SLC25A46 (Q96AG3), YGR096w (AAT93128), YNL003c
(P38921), YEL006w (DAA07645), YIL006W (P40556), At5g66380 (Q4A3R4),
At4g39460 (Q94AG6), Atlg34065 (NP_564436).
References
(1) Dridi, L., A. Ahmed Ouameur, and M. Ouellette, High affinity S-Adenosylmethionine plasma membrane transporter of Leishmania is a member of the folate biopterin transporter (FBT) family. J Biol Chem., 2010. 285(26): p. 19767-75.
(2) Richard, D., et al., Growth phase regulation of the main folate transporter of Leishmania infantum and its role in methotrexate resistance. J Biol Chem., 2004. 279(52): p. 54494-501.
(3) Ouameur, A.A., et al., Functional analysis and complex gene rearrangements ofthe folate/biopterin transporter (FBT) gene family in the protozoan parasite Leishmania. Mol Biochem Parasitol, 2008. 162(2): p. 155-64.
(4) Arco, A.D. and J. Satrustegui, New mitochondrial carriers: an overview. Cell Mol Life Sci., 2005. 62(19-20): p. 2204-27.
(5) Palmieri, F., The mitochondrial transporter family (SLC25): physiological and pathological implications. Pflugers Arch, 2004. 447(5): p. 689-709.
167
(6) Bedhomme, M., et al., Folate metabolism in plants: an Arabidopsis homolog of the mammalian mitochondrial folate transporter mediates folate import into chloroplasts. J Biol Chem., 2005. 280(41): p. 34823-31.
(7) Bouvier, F., et al., Arabidopsis SAMT1 defines a plastid transporter regulating plastid biogenesis and plant development Plant Cell, 2006. 18(11): p. 3088-105.
(8) Kang, J. and D.C. Samuels, The evidence that the DNC (SLC25A19) is not the mitochondrial deoxyribonucleotide carrier. Mitochondrion, 2008. 8(2): p. 103-8.
(9) Marobbio, CM., et al., Identification and functional reconstitution of yeast mitochondrial carrier for 5-adenosylmethionine. EMBO J., 2003. 22(22): p. 5975-82.
(10) Marobbio, CM., et al., Identification and reconstitution of the yeast mitochondrial transporter for thiamine pyrophosphate. EMBOJ., 2002. 21(21): p. 5653-61.
(11) Tamura, K., et al., MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution, 2007. 24: p. 1596-1599.
(12) Saitou, N. and M. Nei, The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol EvoL, 1987. 4: p. 406-25.
168
CHAPITRE V. CONCLUSION GÉNÉRALE
5.1 Discussion
Les molécules utilisées pour traiter la leishmaniose sont limitées et plusieurs
problèmes sont associés à leurs utilisations tel le coût élevé du traitement, la toxicité et
l'émergence des phénomènes de résistance à travers le monde, principalement aux
composés à base d'antimoine qui constituent les molécules de première ligne de défense
depuis plus de 50 ans. Identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour développer des
nouveaux médicaments est donc capital. Suite à la découverte des antifolates et de leur
succès dans le traitement des infections microbiennes comme celles causées par le parasite
Plasmodium, l'agent étiologique de la malaria, les chercheurs se sont intéressés au
métabolisme des folates du parasite Leishmania dans le but de comprendre ses
particularités et de trouver des cibles thérapeutiques potentielles (136, 246, 259).
Le parasite Leishmania, comme les autres parasites de la famille des
Trypanosomatidae, est auxotrophe pour les ptéridines (ptérines et folates) et a donc
développé un système de transport qui lui permet d'importer activement ces cofacteurs du
milieu environnant. Trois protéines, BTI, FT1 et FT5 sont impliquées dans cette activité.
BT1 a été isolé par clonage fonctionnel chez L. donovani (188) et chez L. tarentolae (179)
et correspond au principal transporteur de la bioptérine. Il permet aussi de transporter
l'acide folique avec une faible capacité, mais est incapable de transporter le methotrexate
(179). FT5, isolé chez L. tarentolae, est un transporteur d'acide folique de très haute
affinité (Km= 84 nM), mais de faible capacité (311), tandis que FT1 correspond au
transporteur principal d'acide folique (Km= 410 nM) chez L. infantum et L. donovani (73,
312). FT1 et FT5 transportent aussi l'antifolate methotrexate et la perte de ces deux
transporteurs conduit à la résistance de ce composé toxique (311, 312, 384). La découverte
de ces trois protéines est à l'origine d'une nouvelle classe de transporteurs nommée la
famille des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT). Le génome de L. infantum
code pour 13 protéines différentes appartenant à cette famille, mais la fonction de la plupart
d'entre elles reste inconnue. Caractériser la fonction de ces transporteurs paraît donc
169
essentiel afin de comprendre leurs rôles respectifs dans le métabolisme et la physiologie du
parasite.
Cette caractérisation est également importante pour la découverte de nouvelles
cibles tftérapeutiques et, à travers elles, la possibilité de développer de nouveaux
médicaments contre la leishmaniose. En effet, l'importance du transport de nutriments
essentiels pour la viabilité des parasites laisse croire que l'inhibition de cette activité
pourrait constituer une stratégie thérapeutique efficace. Un exemple d'une telle approche
vient des études sur le paludisme, où des efforts sont déjà en cours pour développer des
inhibiteurs du transporteur d'hexoses chez Plasmonium falciparum. En effet, un des
composés inhibant sélectivement ce transporteur a montré une activité anti-Plasmodium in
vitro et in vivo et a permis de le désigner comme une nouvelle cible thérapeutique (155,
331). Les transporteurs peuvent aussi être exploités pour véhiculer des molécules toxiques à
l'intérieur de la cellule (184). L'existence de tels transporteurs a été démontrée pour
plusieurs molécules antiparasitaires actuellement en cours d'utilisation en clinique telles la
pentamidine, la miltefosine et l'allopurinol (184). Il est donc primordial de connaître la
fonction de tous les autres membres de la famille FBT afin de mettre en place une stratégie
thérapeutique efficace qui exploite ces transporteurs.
Chapitre II. Analyse fonctionnelle et réarrangements géniques complexes des gènes de la famille des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT) chez le parasite protozoaire Leishmania
Multiplicité de la famille FBT
Le séquençage du génome de L. infantum (souche JPCM5) et de L. major (souche
Friedlin) (www.genedb.org) a facilité l'identification des gènes codant pour les protéines de
la famille FBT. Au total, il y a 14 gènes FBT chez L. infantum et 13 (plus un pseudogène;
LmjFl0.0350) chez L. major. La présence de deux copies identiques d'un gène FBT limite
ainsi la famille FBT à 13 membres chez L. infantum et à 12 membres chez L. major. Une
particularité intéressante de l'organisation génomique des gènes FBT chez Leishmania est
la présence sur un même locus de 7 gènes FBT (dont FT1 et FT5) organisés en tandem, ce
170
qui suggère un historique d'événements de duplication génique. Cette hypothèse est
renforcée par le fait que ces protéines partagent une forte homologie de séquence (e.g. il y a
entre 50% et 97% de similarité entre les 13 protéines FBT de L. infantum). La duplication
de gène est un moyen d'évolution particulièrement efficace puisque l'un des gènes
dupliqués peut évoluer vers une nouvelle fonction par sélection naturelle. LmjF 10.0350 est
un pseudogène chez L. major mais pas son orthologue (LinJlO.0360) chez L. infantum. On
ne sait pas encore si LinJ 10.0360 code pour une protéine fonctionnelle, mais si c'est le cas,
il est possible qu'il confère un nouveau phénotype (jusqu'à présent inconnu) chez L.
infantum qu'on ne retrouve pas chez L. major. Le gène LinJlO.0390 semble être absent
chez la souche de L. infantum (MHOM/MA/67/ITMAP-263) étudiée dans ce projet. Des
analyses par Southern blot et par PCR nous ont permis de constater que LinJ 10.0390 est
absent chez MHOM/MA/67/ITMAP-263, mais est présent chez JPCM5 (résultats non
publiés). La culture in vitro de ces deux souches a permis d'observer que la souche
MHOM/MA/67/ITMAP-263 croît plus rapidement que la souche JPCM5. De plus, JPCM5
est plus résistante au methotrexate (MTX) (un analogue de l'acide folique)
comparativement à MHOM/MA/67/ITMAP-263. Ainsi, il faudrait vérifier si LinJlO.0390
correspond à un système d'efflux de folate et cela en déterminant l'impact de la
surexpression ou de la deletion de ce transporteur sur la résistance au MTX.
L'analyse de banques de données de protéines en utilisant la séquence de BT1 ou de
FT1 comme séquence référence a permis d'identifier plusieurs homologues. Ainsi, la
famille FBT est constituée de membres retrouvés uniquement chez des parasites
protozoaires, chez les cyanobactéries et chez les plantes supérieures. Il faut préciser que la
fonction de la plupart de ces transporteurs est inconnue. En effet, les seuls transporteurs de
fonction connue sont FT1, FT5, BT1 de Leishmania, At2g32040 d'Arabidopsis thaliana et
son orthologue slr0642 de la cyanobactérie Synechocystis. Les deux dernières protéines
correspondent aux transporteurs de folates monoglutamylés (169). L'analyse phylogénique
n'a malheureusement révélé aucun orthologue entre Leishmania et les autres organismes
analysés. En effet, la présence d'orthologues indiquerait qu'un FBT donné peut avoir une
fonction similaire entre les différents organismes, ce qui nous aiderait à caractériser cette
protéine chez Leishmania. Par ailleurs, la comparaison des protéines FBT de Leishmania
171
avec celles des Trypanosoma a révélé que la famille FBT a subi une expansion chez
Leishmania après la divergence évolutive de ces deux genres. Cette observation corrèle
avec une analyse génomique qui a démontré que les protéines du système de transport
semblent évoluer plus rapidement chez L. major comparativement à T. brucei (90). Cette
différence au niveau des protéines FBT entre les deux parasites pourrait résulter des
différentes niches qu'ils occupent dans leur hôte et de leurs besoins différents en
nutriments.
Profil d'expression de la famille FBT à la recherche de nouvelles fonctions
L'analyse du profil d'expression de la famille FBT chez Leishmania par TaqMan
RT-PCR en temps réel est une stratégie utilisée pour identifier des gènes exprimés de façon
différentielle, ce qui permet de fournir des indices quant à leur fonction ou leur rôle dans la
biologie du parasite. Nous étions particulièrement intéressés à identifier des gènes exprimés
préférentiellement au stade intracellulaire (amastigote) du parasite Leishmania. Nous avons
observé que l'expression d'un gène (LinJl0.0410) était de 2 à 3 fois plus élevé chez les
amastigotes en phase logarithmique de croissance, comparativement aux promastigotes. Il
serait donc intéressant de confirmer par d'autres analyses si ce transporteur est bel et bien
amastigote-spécifique afin de caractériser sa fonction et de déterminer s'il est essentiel à la
survie du parasite dans le phagolysozome. Par ailleurs, des études de transport effectuées
sur LinJ 10.0410 ont démontré qu'il ne transportait pas les folates à pH physiologique. Si
LinJ 10.0410 est spécifique aux amastigotes cela indiquerait que son activité de transport est
primordiale à pH plus acide, une hypothèse qui pourrait être vérifiée en faisant des études
de transport chez les amastigotes surexprimant ce transporteur.
L'expression de plusieurs gènes FBT (particulièrement LinJ06.1320,
LinJ10.0380, LinJlO.1450, LinJ19.0870) est préférentiellement exprimée en phase
stationnaire de croissance. Le fait que le transport de folate est très réduit chez les parasites
en phase stationnaire de croissance suggère que les transporteurs préférentiellement
exprimés dans cette phase de croissance ne transportent pas les folates. Néanmoins, il
faudrait d'abord confirmer si les niveaux des transcrits sont corrélés avec l'expression de la
protéine, ce qui n'est pas toujours le cas chez le parasite Leishmania (73, 182, 223). Par
contre, nous avons démontré par des études de transport et par des expériences de courbes
172
de croissance que ces protéines ne transportaient pas les folates. Ces résultats
impliqueraient donc un nouveau rôle de ces transporteurs FBT dans le métabolisme du
parasite (Chapitres III et IV).
Régulation développementale et adaptative de l'expression de FT1
En raison du rôle des folates dans la synthèse de l'ADN, il est connu que le
transport de ces cofacteurs est plus élevé chez des parasites en phase logarithmique de
croissance comparativement aux parasites en phase stationnaire où le transport chute
drastiquement (73, 93, 312). En corrélation avec ce constat, nous avons observé que seule
l'expression de FT1 (LinJl0.0400), le principal transporteur de folate (73, 312), a été
trouvée maximale dans la phase logarithmique de croissance. Chez Leishmania, la
régulation de l'expression génique s'effectue au niveau post-transcriptionel et implique
surtout des séquences situées dans la région 3' non-traduite (3'UTR) des gènes (63, 64).
Récemment, deux grandes familles nommées SIDER1 et SIDER2 (Short Interspersed
DEgenerated Retroposons), de courts rétroposons éteints situés presqu'exclusivement dans
les régions 3'UTRs des transcrits, ont été découvertes chez Leishmania (A3, 235). Il a été
observé que les gènes contenant l'élément SIDER2 sont en général faiblement exprimés
comparativement à ceux ne le contenant pas (43, 235). Ces résultats suggèrent la possibilité
que SIDER2 soit potentiellement impliqué dans la régulation développementale des gènes
en dégradant les transcrits (43, 235). L'analyse de la région 3' non-traduite (3'UTR) de FT1
a révélé la présence d'un rétroposon de type SIDER2. Il serait donc intéressant de
déterminer si cet élément joue un rôle dans la régulation développementale de FT1. Ceci
pourrait se faire par exemple en clonant la région 3'UTR contenant SIDER2 en C-terminal
d'un gène rapporteur codant pour la luciférase (LUC) et de vérifier si cela induit une
accumulation des niveaux du transcrit de LUC en phase logarithmique de croissance
comparativement à la phase stationnaire.
L'activité du transport de folate chez Leishmania est également modulée en fonction
des niveaux de folates dans le milieu de culture. En effet, l'incubation des cellules dans un
milieu pauvre en folates augmente fortement l'activité du transport chez celles-ci
comparativement aux cellules maintenues dans un milieu riche en folates (93). Nous avons
constaté que l'expression de FT1 est plus élevée lorsque les niveaux des folates dans le
173
milieu de culture sont faibles. Cette régulation peut être considérée comme une réponse
adaptative aux concentrations extérieures de folate et impliquerait l'existence de
mécanisme(s) contrôlant l'expression du transporteur. Ceci permettrait ainsi d'augmenter la
capacité du parasite à importer les folates lorsqu'ils sont présents en quantité limitée dans le
milieu extérieur. Un phénomène similaire a également été observé pour les transporteurs de
folates chez les mammifères et chez C. elegans (10, 21, 327, 362). Leishmania est un
organisme auxotrophe pour les purines et il est également soumis à une régulation
adaptative de ces transporteurs de nucléobases afin de maximiser le transport de ces
nutriments lorsqu'ils sont présents en faibles quantités (52, 257). Les mécanismes qui
gouvernent l'adaptation à une carence en folates (ou en purines) n'ont pas encore été
définis chez les trypanosomatides. La découverte de SIDER2 dans le 3'UTR de FT1
suggère la possibilité que cet élément joue également un rôle dans la régulation adaptative
du transporteur FT1.
Globalement, ces résultats démontrent l'importance de la régulation de l'expression
du principal transporteur de folate FT1 pour le développement du parasite et pour s'adapter
aux différentes concentrations de folate dans le milieu de culture.
Modulation de l'expression de FT1 en présence de l'antifolate methotrexate
La réduction du transport du MTX est un moyen de résistance fréquemment
remarqué chez Leishmania (95, 159, 271). Chez des mutants résistants aux MTX montrant
une suppression complète de l'entrée de l'inhibiteur, un réarrangement génique au niveau
des transporteurs de la famille FBT menant à la deletion des transporteurs de folate/MTX a
été constaté chez plusieurs espèces de Leishmania (311, 312, 384). Chez un mutant de L.
tarentolae hautement résistant au MTX (TarMTXl 000.6), dont l'influx de folate est
sévèrement réduit, la surexpression du transporteur de la bioptérine BT1 a été observé
(179). Grâce à la surexpression de BT1, le parasite peut transporter avec une faible capacité
le folate, mais pas le MTX (179). Ainsi, les cellules dont le système de transport de folate
est fortement réduit surexpriment BT1 et arrivent à importer suffisamment de folate pour
répondre à leur besoin malgré la présence du MTX.
174
L'analyse du profil d'expression de la famille FBT chez des mutants de L. infantum
résistants au MTX nous a permis de comprendre comment le parasite module l'expression
de certains transporteurs de cette famille afin d'empêcher le MTX d'entrer à l'intérieur de
la cellule. En effet, nos résultats montrent qu'en présence du MTX, le parasite module
l'expression de FT1 en utilisant des événements de recombinaison génique menant à un
réarrangement au niveau de FT1. Dans une étude menée en parallèle dans notre laboratoire
chez un mutant de L. major résistant au MTX, il a été observé que la modulation de
l'expression de FT1 résulte également des événements de recombinaison génique
conduisant à la deletion de celui-ci (311, 312, 384). Nous avons aussi confirmé la
surexpression de BT1 chez ces mutants, démontrant ainsi le rôle important de ce
transporteur comme moyen de compensation à l'inactivation du système primaire du
transport de folate. Le fait que FT1 est situé sur un locus avec 6 autres gènes FBT organisés
en tandem semble faciliter la sélection des événements de recombinaison génique
impliquant les séquences conservées de ces gènes. Ces recombinaisons géniques peuvent
être importantes pour moduler la fonction des gènes situés en tandem sur le chromosome.
Par exemple, il est possible que la chimère LinJ 10.03 80/0400 engendrée suite à la
recombinaison homologue entre les séquences conservées de FT1 et de LinJl 0.0380 que
nous avons mis en évidence soit fonctionnelle et qu'elle transporte des molécules
différentes de l'acide folique.
En conclusion, la famille FBT est une nouvelle classe de protéines membranaires
retrouvées chez les cyanobactéries, chez les parasites protozoaires et chez les plantes. Nous
avons élaboré une approche par TaqMan RT-PCR en temps réel afin de déterminer le profil
d'expression de chacun des 13 transporteurs de la famille FBT de Leishmania. Cette étude
nous a permis de constater que malgré leur forte homologie de séquence, les membres de
cette famille semblent avoir des fonctions différentes. Ceci est en corrélation avec le fait
que plusieurs gènes FBT sont préférentiellement exprimés en phase stationnaire de
croissance où le transport de folate est très faible. Des études dans notre laboratoire sont en
cours (Chapitre IV) afin de déterminer la fonction des autres membres de la famille FBT.
175
Chapitre III. Le transporteur de la 5-adénosylméthionine de haute affinité localisé au niveau de la membrane plasmique du parasite Leishmania est un membre de la famille des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT)
Identification et caractérisation du transporteur de la .S'-adénos\[methionine
(AdoMet) chez Leishmania
L'existence d'un transporteur commun pour l'AdoMet et la sinéfungine (SNF), son
analogue structural, a été suggérée par des études biochimiques. Les expériences de clonage
fonctionnel effectuées dans le laboratoire n'ont pas permis d'isoler le transporteur de
l'AdoMet chez Leishmania, mais nos études sur les mutants résistants au MTX avaient
suggéré un rôle du métabolisme de l'AdoMet dans la résistance à l'antifolate (83, 127).
D'un autre coté, nous avons observé qu'une souche de L. major sélectionnée pour la
résistance à la sinéfungine (SNF) était environ 2.5 fois plus résistante au MTX (résultats
non publiés). Par la suite nous avons été surpris par le fait que le mutant hautement résistant
au MTX, TarMTXl000.6, montrait une résistance croisée à la SNF. Ces résultats ont mené
à la découverte de l'existence de souches de Leishmania intrinsèquement résistantes à la
SNF et que cette résistance était aussi liée à un défaut dans le transport de l'AdoMet. De
façon intéressante, le mutant TarMTXl 000.6 est non seulement résistant au MTX et à la
SNF, mais est également incapable de transporter l'acide folique et l'AdoMet. En raison
des réarrangements au niveau des gènes de la famille FBT chez TarMTXl000.6 (311),
nous avons émis une hypothèse selon laquelle un membre FBT supprimé ou réarrangé
chez ce mutant pourrait potentiellement transporter l'AdoMet.
Nos travaux ont permis de confirmer que Leishmania possède un transporteur de
haute affinité (Km= 284 nM) pour la 5-adénosylméthionine localisé au niveau de la
membrane plasmique du parasite. Ce transporteur nommé AdoMetTl est également
impliqué dans le transport de la SNF, l'analogue structural de l'AdoMet. AdoMetTl est
codé par un gène FBT (LinJl0.0370 de L. infantum et son orthologue LmjFl0.0360 de L.
major) qui fait partie d'un groupe de 7 gènes FBT en tandem sur le chromosome 10. Ces
résultats suggèrent que ce groupe de gènes FBT en tandem semble avoir évolué suite à des
événements de duplication génique afin de créer de nouvelles fonctions. En effet, le gène
176
codant pour le principal transporteur de folate FT1 et pour l'orthologue du transporteur de
folate de haute affinité FT5 de L. tarentolae sont également situés sur ce locus. D'un autre
côté, cette organisation en tandem semble faciliter le contrôle de l'expression des
transporteurs par des événements de recombinaison génique. En effet, nous avons observé
que le gène AdoMetTl est réarrangé ou délété chez un mutant sélectionné pour la résistance
à la SNF.
Régulation de l'AdoMetTl et de FT 1 en fonction du stade de croissance
Contrairement à l'activité de transport de folate qui est régulée en fonction de la
phase de croissance du parasite, l'activité de transport de l'AdoMet ou de la SNF (186)
n'est pas dépendante de la phase de croissance. Nous avons pu démontrer, grâce à la
génération d'une protéine AdoMetTl fusionnée avec la protéine fluorescente verte (GFP),
que cette chimère était produite durant les différentes phases de croissance et également
qu'elle se localisait au niveau de la membrane plasmique. En corrélation avec ces résultats,
nous avons également observé que l'ARNm d^AdoMetTl était exprimé de façon
constitutive (Figure 3, Chapitre II). D'autre part, nous avons déjà observé que la protéine
FT1 est produite en phase logarithmique de croissance, mais subit une dégradation en phase
stationnaire de croissance (312). Le fait que seule la séquence codante de FT1 a été clonée
dans un vecteur d'expression permettant l'expression constitutive des gènes suggère qu'un
mécanisme post-traductionnel est impliqué dans le contrôle de l'expression de la protéine
FT1 (312). Notre hypothèse est que la voie de dégradation ubiquitine-dépendante soit
impliquée dans cette régulation. En effet, chez les cellules eucaryotes l'ubiquitination joue
un rôle important dans l'internalisation des protéines membranaires suivi par leur
dégradation spécifique dans le lysosome (revue dans (141, 231, 357)). L'ubiquitine est une
petite protéine (76 acides aminés) dont la séquence est hautement conservée chez les
eucaryotes. Elle se fixe de façon covalente aux protéines cibles, ce qui permet leur
acheminement vers le lysosome par endocytose. Nous avons identifié dans le génome de
Leishmania les gènes codant pour l'ubiquitine et les enzymes de la machinerie
d'ubiquitination. Des essais d'immunoprecipitation sur la protéine FT1 fusionnée avec la
GFP suivi de la détection de l'ubiquitine par Western blot pourraient démontrer si
l'ubiquitination est responsable de la régulation post-traductionnelle de FT1. Des
177
expériences de fusion entre l'AdoMetTl et FT1 pourraient contribuer à l'accroissement de
nos connaissances sur le sujet en permettant d'identifier la portion impliquée dans la
degradation de FT1. Malgré la grande homologie de séquence entre l'AdoMetTl et FT1
(80 % de similarité), les deux protéines transportent différents substrats. Cette différence
fonctionnelle peut être attribuée aux domaines contenant des acides aminés divergents entre
les deux protéines. Ainsi, la génération de transporteurs chimères en échangeant des
domaines spécifiques entre les deux transporteurs pourrait également aider à l'identification
de la région impliquée dans la discrimination entre l'AdoMet et l'acide folique.
Rôle de l'AdoMetTl dans la résistance à la sinéfungine (SNF)
La sinéfungine (Fig. 1.9, Chapitre I) est un antibiotique à forte activité
leishmanicide in vitro et in vivo (18, 20, 247, 270). Elle a également montré une forte
activité contre d'autres parasites comme Plasmodium (378), Cryptosporidium parvum (41)
et les trypanosomes (84). Pour toutes ces raisons, il a été suggéré que la SNF pourrait servir
de molécule modèle pour le développement de nouveaux médicaments anti-parasitaires
(249). La littérature a rapporté l'existence de souches intrinsèquement résistantes à la SNF
(16) et nous avons également observé ce phénomène chez deux souches de laboratoire (L.
infantum JPCM5 et L. major Friedlin). Cette résistance était liée à une réduction du Fmax du
système de transport de l'AdoMet (186, 290). Nos résultats permettent d'expliquer cette
résistance par une sous-expression de l'ARNm du transporteur primaire d'AdoMet. Le
mécanisme responsable de cette régulation n'est pas encore connu, mais il pourrait être lié à
un réarrangement au niveau des gènes FBT. Par ailleurs, la suppression du gène AdoMetTl
par des expériences d'inactivation génique a conduit à une forte résistance à la SNF. Chez
la levure S. cerevisiae, la résistance à la SNF est dû à une mutation qui inactive directement
le transporteur d'AdoMet SAM3 (421). Globalement, ces résultats démontrent que la
modulation de l'expression de l'AdoMetTl a un impact profond sur la sensibilité à la SNF.
Pourquoi Leishmania possède un transporteur d'AdoMet ?
Leishmania a la faculté de synthétiser l'AdoMet mais il possède également un
transporteur de haute affinité au niveau de sa membrane plasmique qui lui permet
d'importer activement cette molécule. Par contre, la présence des souches intrinsèquement
178
déficientes dans le système de transport de l'AdoMet, mais qui peuvent se multiplier
normalement dans nos conditions de culture, suggère que le parasite ne nécessite pas la
présence du transporteur AdoMetTl pour subvenir à ses besoins. En effet, la souche de L.
infantum délétée du gène AdoMetTl ne diffère pas de la souche sauvage en termes de
croissance et de capacité à infecter les macrophages et de se multiplier à l'intérieur des
phagolysosomes (résultats non publiés). D'autres types de cellules, comme celles des
mammifères, dépendent principalement de la voie de biosynthèse pour subvenir à leurs
besoins en AdoMet et n'importent que très peu cette molécule du milieu extracellulaire (38,
222). Jusqu'à présent, le seul organisme qui dépend exclusivement d'une source exogène
d'AdoMet pour survivre est Rickettsia prowazekii. Cette bactérie possède une enzyme
MAT non fonctionnelle, mais dispose d'un transporteur (SAM) de haute affinité pour
l'AdoMet qui lui permet de compenser ce défaut et de survivre en absence de l'enzyme
MAT (82, 381). Le parasite se multiplie à l'intérieur de l'intestin de l'insecte vecteur et le
phagolysosome des macrophages (les parasites infectent principalement ces cellules) de
l'hôte vertébré. Les niveaux de nutriments peuvent variés considérablement dans ces deux
niches au cours de l'infection et le parasite doit faire face à ces changements pour survivre.
Par exemple, les parasites peuvent se retrouver dans un environnement riche en nutriments
dans l'intestin de l'insecte vecteur lorsque celui-ci digère son repas sanguin et se nourrit de
la sève des plantes (riche en sucres). À certains moments, ces nutriments peuvent
gravement s'appauvrir et les parasites métacycliques (en phase stationnaire de croissance)
qui se trouvent dans la partie supérieure de l'intestin peuvent être privés de nutriments.
Chez l'hôte mammifère, les parasites peuvent faire face à une limitation des nutriments au
cours de la phagocytose par des neutrophiles (286) puisque les phagolysosmes de ces
cellules immunitaires sont considérés comme pauvres en éléments nutritifs (e.g. acides
aminés) (323). Il serait donc possible que le parasite favorise le système de transport plutôt
que la voie de biosynthèse lorsque les concentrations en molécules précurseurs d'AdoMet
(e.g. methionine, ATP) sont limitées. Par ailleurs, le parasite est auxotrophe pour les
purines (51) et pourrait se servir du transporteur de l'AdoMet comme source de ces
molécules lorsque celles-ci se trouvent en faible concentration. Il a été démontré que
l'expression de l'enzyme MAT2 ainsi que son activité sont élevées en phase logarithmique
de croissance et diminuent fortement en phase stationnaire (282). Le transport d'AdoMet
179
n'est pas dépendant des phases de croissance. Ceci suggère que, lorsque l'activité de
synthèse est réduite et que le substrat est disponible dans le milieu, le parasite peut importer
l'AdoMet. La découverte d'AdoMetTl va nous permettre de tester certaines de ces
hypothèses. Par exemple, il serait intéressant de voir si le transporteur peut complementer
un mutant où le gène MAT est inactivé, car chez d'autres organismes le gène MAT est
essentiel (82, 401).
Chapitre IV. Localisation intracellulaire des protéines de la famille des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT) et de la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF) chez Leishmania.
Le séquençage du génome de Leishmania a facilité les études sur les enzymes du
métabolisme monocarboné chez ce parasite. Certaines études ont même fourni des
évidences que ce métabolisme est compartimenté entre le cytoplasme et la mitochondrie
(106, 237, 344, 393). Il a été suggéré que le dérivé de folate 10-folmyl-THF, un metabolite
synthétisé exclusivement dans le cytoplasme chez L. major, pourrait être transporté vers la
mitochondrie pour remplir ses fonctions métaboliques (240, 393). L'AdoMet est un
donneur universel de groupement méthyl et doit être transporté vers les différents
compartiments de la cellule pour des réactions de methylation cellulaire. Puisque le
transport de folate et de l'AdoMet à travers la membrane plasmique du parasite est assuré
par deux membres de la famille des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT), il est
possible que d'autres membres de cette famille soient impliqués dans le transport de ces
molécules du cytosol vers la mitochondrie. Nous avons donc étudié la localisation des 13
protéines de la famille FBT dans le but d'identifier les transporteurs mitochondriaux. Nos
résultats montrent que trois protéines FBT sont localisées dans des compartiments
intracellulaires alors que les dix autres sont localisées au niveau de la membrane plasmique
du parasite. Il est peu probable que les protéines intracellulaires soient localisées au niveau
de la membrane de la mitochondrie si on les compare aux protéines appartenant à la famille
des transporteurs mitochondriaux (MCF). Des expériences de co-localisation avec des
fluorophores spécifiques pour certains compartiments (noyau, reticulum endoplasmique,
appareil de Golgi, mitochondrie) devraient fournir l'information nécessaire afin de
180
déterminer les organites où sont localisées les protéines FBT intracellulaires. Toutefois, il
serait aussi important de confirmer le profil d'expression de ces protéines par des
techniques de Western blot et de fractionnement subcellulaire.
Chez les mammifères le transport de folate et de l'AdoMet à travers la membrane de
la mitochondrie est assuré par des protéines appartenant à la famille des transporteurs
mitochondriaux (MCF) (1, 217, 376). Le génome de Leishmania code pour au moins 32
protéines de la MCF (67). Grâce à une analyse phylogénique et à la recherche de similarité
par BlastP nous avons identifié des protéines qui pourraient potentiellement être impliquées
dans le transport des substrats d'intérêts (e.g. folate, AdoMeT, thiamine, pyrimidine). La
fonction de ces protéines, ainsi que celle des protéines FBT intracellulaires, sera mise en
évidence par des études de transport sur des organites purifiés. On pourrait éventuellement
avoir recours à des expériences d'expression en systèmes hétérologues (e.g. bactéries,
ovocyte de Xenopus) ou de reconstitution en protéoliposomes pour caractériser la fonction
de ces protéines.
Qu'elle est la fonction des transporteurs FBT localisés au niveau de la membrane
plasmique ?
Sur les 10 transporteurs FBT de L. infantum localisés au niveau de la membrane
plasmique du parasite, on distingue le principal transporteur de folate FT1 (LinJ 10.0400), le
principal transporteur de la S-adénosylméthionine AdoMetTl (LinJlO.0370) et les deux
protéines orthologues de FT5 et de BT1 (respectivement, LinJlO.0420 et LinJ35.5120). La
fonction des six autres FBT est jusqu'à présent inconnue, mais nous pourrions tester
quelques hypothèses de travail pour identifier leur substrat. La transfection de chaque gène
de façon indépendante, chez un mutant ne transportant pas l'acide folique ont permit de
voir si ceux-ci transportent l'acide folique. En effet, des expériences de courbe de
croissance en présence du MTX ont permis de constater que ces protéines ne transportent
pas l'acide folique (résultats non montrés). De plus, des études de transport de l'acide
folique et de certains dérivés du tétrahydrofolate (THF) comme le 10-Methyl-THF et le 5-
Formyl-THF ont permis de confirmer que certaines de ces protéines (LinJ06.1320,
LinJl0.0380, LinJ 10.0410, LinJ 19.0780) ne transportent pas ces substrats, contrairement à
FT1 (notre contrôle positif). Toutefois les concentrations de substrat utilisées étaient de
181
l'ordre du nanomolaire (< 400 nM) ce qui n'exclu pas que ces transporteurs pourraient
avoir une faible affinité pour les folates. Nous allons donc vérifier si ces protéines sont des
transporteurs de faible affinité en utilisant des concentrations élevées de folates.
Puisque le folate, la bioptérine et l'AdoMet étaient les seuls substrats identifiés de la
famille FBT, nous avons fait une recherche par structure dans des bases de données (e.g.
DrugBank database, the human metabolome database (HMDB), chemical abstract service
(CAS)) afin de trouver des molécules dont la structure ressemble aux trois substrats
identifiés de la famille FBT. Parmi les molécules obtenues par cette analyse nous avons
porté un intérêt particulier sur des metabolites essentiels tels les vitamines (en particulier de
la classe B; folate, pyridoxine, riboflavine, cobalamine, thiamine) et certains cofacteurs
(e.g. NAD, FAD, AMPc, Acétyl-CoA). En effet, Leishmania est auxotrophe pour plusieurs
metabolites essentiels tels les acides aminés, les purines, les vitamines et l'hème et doit
donc les importer de l'extérieur (218). Des études de transport avec des substrats marqués
au tritium ou des expériences de courbe de croissance avec des analogues structuraux à
activité leishmanicide sont en cours afin de déterminer si la famille FBT est impliquée dans
le transport de ces metabolites, particulièrement les vitamines.
Chez les procaryotes, une nouvelle classe de transporteurs de vitamines a
récemment été décrite (316). En combinant une analyse du contexte génomique avec la
reconstruction de réseaux métaboliques, plusieurs substrats (principalement des vitamines)
ont été prédits pour les différents transporteurs de cette classe. La fonction de certains
d'entre eux a même été validée expérimentalement (e.g. transporteur de folate, thiamine,
riboflavine, biotine) (316). L'organisation de certains gènes FBT en tandem ainsi que la
caractérisation fonctionnelle de FT1 et de l'AdoMetTl suggèrent que ce locus pourrait
coder pour des gènes qui sont impliqués dans le même sentier métabolique, celui du
métabolisme des folates et de l'AdoMet. Il est possible que les autres membres en tandem
soient impliqués dans le transport de cofacteurs utilisés par certaines enzymes de ce sentier
métabolique comme la pyridoxine (cofacteur de la serine hydroxyméthyltransférase, la
cystathionine p-synthase et la y-cystathionase) et le cobalamine (cofacteur de la methionine
synthase).
182
Les antifolates et particulièrement les inhibiteurs de la dihydrofolate reductase
(DHFR) ont été exploités pour traiter plusieurs maladies comme le cancer, les infections
bactériennes et la malaria (173). La DHFR est une cible thérapeutique potentielle chez les
parasites trypanosomatidés (e.g. Leishmania, Trypanosoma) et même si les inhibiteurs de
cette enzyme ont été développés (60, 112, 160, 289), il n'existe malheureusement pas de
traitement à base d'antifolates pour traiter les maladies causées par ces trypanosomatidés.
La raison est que ces parasites possèdent une autre enzyme, PTRl, qui leur permet de
résister aux antifolates (30, 136, 245, 276). En effet, PTRl, dont le rôle principal est la
réduction de la bioptérine, peut également réduire le DHF en THF lorsqu'elle est
surexprimée, conférant ainsi aux parasites un moyen de surpasser l'inhibition de la DHFR
(245). Ces observations suggèrent que la double inhibition de PTRl et de la DHFR serait
une bonne stratégie thérapeutique (136, 246). Récemment, beaucoup d'efforts ont été
déployés pour développer des inhibiteurs ciblant ces enzymes et certains composés ont
généré un enthousiasme important (53, 356, 382). Etant donné le rôle joué par les
transporteurs FBT dans le transport de l'antifolate MTX, il serait intéressant de déterminer
si les nouveaux antifolates désignés pour inhiber spécifiquement la PTRl-DHFR de
Leishmania empruntent les transporteurs FBT pour entrer dans la cellule. Cela permettrait
de prévoir les mécanismes de résistance potentiels à ces molécules impliquant les
transporteurs FBT.
5.2 Conclusions
En conclusion, le parasite protozoaire Leishmania possède une nouvelle classe de
transporteurs de metabolites. Les premiers membres caractérisés de cette classe (FT1, FT5
et BT1) transportent les ptéridines (bioptérine, folate) et forment ainsi la famille des
transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT). Le génome de Leishmania code pour
plusieurs homologues de ces protéines de fonction inconnue et notre objectif principal était
de caractériser cette famille et de déterminer la fonction des autres membres. Les travaux
présentés dans cette thèse ont révélé les différences au niveau des profils d'expression des
membres de la famille FBT suggérant ainsi de nouvelles fonctions. Par exemple,
l'expression de plusieurs gènes FBT était élevée chez les parasites en arrêt de
multiplication (phase stationnaire de croissance) ce qui a permis de spéculer que ces
183
transporteurs importent possiblement d'autres molécule que les folates. De plus,
l'expression développementale et adaptative du principal transporteur de folate FT1
démontre l'importance de celui-ci dans la biologie du parasite. Aussi, nous avons expliqué
la corrélation entre la résistance à l'antifolate MTX et le réarrangement des gènes FBT par
des événements de recombinaison génique inactivant le transporteur FT1. Nos études ont
aussi permis de caractériser la fonction d'un autre membre (AdoMetTl) de la famille FBT.
La protéine AdoMetTl a une haute affinité pour l'AdoMet et correspond au transporteur
primaire de cette molécule. En raison de l'importance de l'AdoMet dans les réactions de
methylation, Leishmania importe ce donneur d'unité monocarboné pendant toutes les
phases de croissance. Nous avons aussi montré que cette accumulation non-dépendante de
la phase de croissance était corrélée avec l'expression de l'AdoMetTl. La caractérisation
d'AdoMetTl a également permis d'associer la résistance à la sinéfungine avec les bas
niveaux d'expression de ce transporteur. Enfin, nous avons étudié la localisation de tous les
membres de la famille FBT et identifié d'autres protéines (appartenant à la famille des
transporteurs mitochondriaux (MCF)) comme étant des transporteurs potentiels de folate et
de l'AdoMet chez Leishmania. Finalement, ces études de localisation vont nous permettre
d'évaluer le transport de plusieurs substrats d'intérêt afin de trouver de nouvelles fonctions
aux protéines FBT. La caractérisation fonctionnelle de la famille FBT est nécessaire afin de
comprendre le rôle de chacun de ces membres dans la biologie du parasite et pourrait peut-
être un jour conduire à l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques impliquant ces
transporteurs.
184
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