Cancérologie fondamentale

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Cancérologie fondamentale Place de l’Anatomie et Cytologie pathologiques et Apport de la Biologie Moléculaire. H. Sevestre B. Gubler. Les plateformes hospitalières de génétique moléculaire des cancers (1). La Biologie moléculaire: une nécessité - PowerPoint PPT Presentation

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Diapositive 1

Cancrologie fondamentale

Place de lAnatomie et Cytologie pathologiques et Apport de la Biologie MolculaireH. SevestreB. GublerLes plateformes hospitalires de gntique molculaire des cancers (1)Plateformes hospitalires de gntique molculaireRegroupent:- Service dAnatomopathologie- Service de cytogntique- Laboratoire(s) dOncobiologie Molculaire- Peuvent appartenir au mme tablissement ou des tablissements diffrents.- Depuis 2006, 28 plateformes soutenues par lINCa et la DGOS.INCa: Institut National du Cancer- Agence sanitaire et scientifique de ltat.- Dveloppe lexpertise et finance des projets dans le domaine des cancersMesure 21 du plan Cancer 2009-2013: Garantir un accs gal aux traitements et aux innovations.- Action 21.2: Dvelopper les plateformes de gntique molculaire des cancers et laccs aux tests molculaires. La Biologie molculaire: une ncessit Ce nest pas (plus) un luxe dans la prise en charge des patient atteints de cancer

Plateformes hospitalires de gntique molculaire des cancersAmiensVocation: - Ralisation des tests molculaires innovants pour lensemble des patients de la rgion, quel que soit ltablissement o ils sont pris en charge, CHU, CLCC, CH ou tablissements privs. - Organisation dun maillage territorial suffisant pour que les prlvements tumoraux parvenant dans les laboratoires habituels danatomopathologie ou dhmatocytologie puissent tre pris en charge rapidement dans une plateforme avec laquelle il existe des liens organiss.Activit des plateformes Activits regroupes en fonction de lutilisation des marqueurs dans la prise en charge des patients:1- les marqueurs prdictifs dterminant laccs une thrapie cible;2- les marqueurs orientant le processus diagnostique;3- les marqueurs participant au diagnostic, en complmentarit de paramtres cliniques, morphologiques, biologiques ;4- les marqueurs pronostiques orientant la stratgie de traitement du patient;5- les marqueurs permettant le suivi de la maladie rsiduelle.Les plateformes hospitalires de gntique molculaire des cancers (2)Associe diffrente technologie - PCR - Electrophorse - Analyse de fragment - Digestion enzymatique - Squenage - Snapshot - Micropuces (transcriptome, CGH-, methyl- miR-array)Dfinition: La biologie molculaire: Discipline consacre ltude des molcules porteuses du message hrditaire (ADN, ARN) de leur structure, de leur synthse et de leur altration. La biologie molculaire dsigne galement lensemble des techniques de manipulation dacides nucliques, aussi appeles techniques de gnie gntiqueLa biologie molculaire = outilAcides nuclquesADNARNLa Biologie Molculaire

OrganeClinicienChirurgien

Tissue CelluleAnatomopathologiste

Noyau chromosomesCytognticien

Biologiste molculaireADNARNPlace de la Biologie Molculaire

Tissue CelluleAnatomopathologiste

Noyau chromosomesCytognticien

Biologiste molculaireADN/ARNExcrse, biopsie, -biopsie, ponctionIdentificationNature - ClassificationOrigine tissulaireImmunohistochimieExpression de marqueur- Dtection et caractrisation de translocations chromosomiques (BCR/ABL, M, m, )- Dtection danomalies infra-chromosomique Mutation de gne. Suivi et quantification de la MRD.Caryotype: - Anomalies de nombre - Anomalies de structureFISH - Dltion / Duplication - Translocation

Mdecin patient - Examen - Investigations

OrganeClinicienChirurgienPlace de la Biologie Molculaire dans la chronologie des explorations6Le gnome Humain - 46 chromosome (44+XX ou 44+XY) - 30 000 gnes - 3,2x 109 paire de base (6,4x109/cellule diplode)Amplifier la cible (gne dintrt) pour pouvoir lindividualiser et lanalyserLimites et Echecs - Quantit de matriel (-biopsie) - % de cellules tumorales - Htrognit des cellules tumoralesAccessibilit de la cible

PCR (raction de polymrisation en chaine) - toute analyse de BM dbute par un tape damplification2n copies de la rgion ciblen cyclesLa BM identifie1- les marqueurs diagnostiques et ou pronostiques orientant la stratgie de traitement du patient2- les marqueurs participant au diagnostic3- les marqueurs dterminant laccs une thrapie cible4- les marqueurs permettant le suivi de la maladie rsiduelle.1) Les marqueurs diagnostiques et ou pronostiques orientant la stratgie de traitement du patientObjectif des analyses de Biologie Molculaire en cancrologie La LMC est une noplasie myloprolifrative caractrise par la prsence du chromosome Philadelphie (ch22) t(9 22)(q34;q11) lorigine dun transcrit de fusion (ARNm BCR-ABL) La protine code par ce transcrit a une activit tyrosine kinase constitutivement drgule directement responsable de la transformation leucmique. La protine est la cible dun inhibiteur de tyrosine kinase (ITK), limatinib (inhibiteur comptitif de lATP), dont lefficacit thrapeutique importante a profondment transform la prise en charge thrapeutique et le pronostic de cette hmopathie.88 % des patients sont dsormais en vie 6 ansExemple princeps: Imatinib et traitement des leucmie mylode chronique (LMC). Lidentification daltrations gntiques au sein des cellules cancreuses a permis la mise en vidence de nouveaux biomarqueurs molculaires. Ces paramtres sont aujourdhui indispensables pour le diagnostic, la classification, le choix et la surveillance du traitement La mise en vidence de ces altrations a permis didentifier de nouvelles cibles thrapeutiques, puis de dvelopper des thrapies cibles contre celles-ci.Marqueurs orientant la stratgie de traitement du patientCaryotype et marquage FISH: Exemple de t(4;11)(q21;q23)1) Isolement des cellules du patient 2) Culture court terme3) Blocage des division en promthaphase ou mtaphase par addition de colchicine4) Choc hypo-osmotique: clatement des cellules

Caryotype t(4;11)(q21;q23): MLL-AF4- 50-70% des LAL du nourisson- 10% des LAL-B de ladulte = LAL haut risque pronostic trs sombre intensification de traitement et allogreffe (HSCT) la premire remission complte. Mediane de survie < 1an - Consquences molculaires : gense dun transcrit de fusion et traduction dune protine

t(4;11)(q21;q23)Avant translocationAprs translocation

FISH MLL-AF4MLL + AF4Utilisation de sondes spcifiques de gnes pour lidentification de translocations

ADN:5' MLL-3' AF4; Points de cassure variablesARN:Transcript de 12kbProtine de Fusionex: 2319 aa; 240 kDa rsultat de la fusion de la rgion amino terminal de MLL avec la rgion carboxy-terminale de AF4

Fonction: Activateur transcriptionnel (protine de forte mobilit qui se lient lADNFonction: activateur transcriptionnelStructure du gne AF4 :

Structure du gne MLL :Caryotype et marquage FISH: Exemple de t(4;11)(q21;q23) (suite)Dtection: - par PCR Gnomique (rarement) - par RT-PCRMLL (ALL-1)AF4Primer MLLPrimer AF4PCRt(4;11)(q21;q23)MLL (ALL-1)AF44q2111q23Chromosome 4Chromosome 11ADNARN2- Le suivi de la Maladie rsiduelle (MRD) ou quantification des cellules tumorales persistantes Primer spcifique MLLRQSonde Taqman AF4Primer AF4R1) Activit PolymraseRQ1) Activit ExonuclaseQPRINCIPE- Isolement des cellules nucles (sang, moelle)- Extraction des ARN- Reverse transcription- Ralisation de PCR quantitative avec sonde taqmanSuivi du transcrit MLL-AF4 par qRT-PCR avec sonde TaqmanSuivi du traitement: Quantifiation de la MRD1) courbe talonDiagnosticBlastes = 85 to 99%10-21/1010-31/1010-41/1010-51/10Mix (3 5) ADN polyclonal10-5 10-4 10-3 10-2 10-1Log CtQuantityX10-1Echantillon du patient Jour = X% de blastes = ?2) QuantificationQuantification de la maladie rsiduelle par RQ-PCR

Sensibilit des techniques de Biologie molculaire pour le suivi de la MRDLe suivi de la MRD par PCR quantitative en temps rel (qRT-PCR) permet- dobjectiver la rponse thrapeutique- danticiper la rechute 3- les marqueurs participant au diagnostic HPS

HPS 2

IMMUNOMUM1 CD30

IMMUNOCD15 CD20

HPS LEVRE

IMMUNO CD30 PANLEUCO

HIS EBER

CD117

HPS BOM

BOM IMMUNOCD30 CD20

B.O.M. HIS EBER

IMMUNOCD30 CD3

Lymphocytes BIg membranaire (BcR)Lymphocytes TTcRAnticorps Ig solublesPlasmocytesActivation Maturation ProlifrationIsotype kappaIsotype lambdaIgHIgLSous types et lociIsotype M, D, G, A, ESous populationsSous populations corcepteur - T CD8+ - T CD4+TCRabTCRgdSous types et lociCytologiste ou pathologiste - Morphologie - Isotype - Marqueurs membranaires ou intracellulaires3 loci: rarrangements IGH, IGK et IGLBiologistemolculaire4 loci: rarrangements TCRA, TCRB, TCRG et TCRDBiologistemolculaireMarqueurs participant au diagnostic: Exemple du diagnostic de clonalit lymphode1) Polyclonal109 1012 lymphocytes diffrents qui se distinguent par lIg ou le TCR quils synthtisent2) OligoclonalitLymphocytose ractionnelle - Infection - Chronicit3) Monoclonalit3) Monoclonalit au sein dune population PolyclonaleA surveillerClonalit lymphode lchelle de lorganismeRSSRSSTRGV2GerminalForward Primer TCRGVReverse Primer JGJ1Absence damplificationRecombinForward Primer TCRGVReverse Primer JG120kb2J112345P678A910B115JP1JPJ1JP2J2C1C235VAmplificationProduit de PCRPRINCIPE- Isolement des cellules nucles (sang, moelle, biopsie, LCR ) Extraction de lADN Ralisation de PCR multiplex ciblant les locus des Igs et TCRIdentification des rarrangements des gnes du TCRg par PCR12345P678A910B115JP1JPJ1JP2J2C1C235V1) Multiplicit des gnes V et JPCR Multiplex :Amorces sens: Consensus V (TRGV)Amorces antisens: Consensus J (TCRG JG + TCRG JP)2) Multiplicit des combinaisons possiblesV1J1; V1J2; V1JP; V1JP1; V1JP2,V2J1; V2J2 Ect.3) Diversit jonctionnelleInsertionnucleotidesInsertion 0+1+2+3ectAddition alatoire de nuclotides (TdT)Variation de la taille des produits de PCR = 15 45 pb Analyse en agarose non aproprie Analyse sur Genetic Analyzer (squenceur) et Sizing PAGE