Calorimétrie isotherme appliquée à l’hydrolyse enzymatique de substrats solides pour la détermination de constantes cinétiques.

D. TAFOUKT1, A. SORIC1, J-C. SIGOILLOT2, J-H. FERRASSE1

Mail to: jean-henry.ferrasse@univ-amu.fr

1 Aix Marseille Univ, CNRS, Cent Marseille, M2P2, Marseille, France

2 Aix Marseille Univ, INRA, BBF, Marseille, France

Les Biocarburants

19

puisqu’ils comprennent aussi bien les sous-produits de l’agriculture telle que la paille de blé

mais aussi les déchets des industries agro-alimentaire et ceux des papeteries [13][14] [15].

Cette biomasse présente plusieurs avantages, elle est abondante, renouvelable et bon marché.

La matière lignocellulosique est constituée principalement de trois polymères, la

lignine, la cellulose, l’hémicellulose ainsi que de plusieurs autres composés inorganiques (K +,

Mg2+, Ca2

+…) [16].

La cellulose et l’hémicellulose représentent plus de 70% de la biomasse totale et sont

étroitement liées à la lignine par des liaisons covalentes et hydrogènes [16]. Cela confère à la

matière lignocellulosique une grande résistance à la dégradation.

Fondamentalement, la cellulose forme un squelette qui est entouré par l'hémicellulose

et la lignine (Figure I. 1).

Figure I. 1. Représentation de la structure de la biomasse lignocellulosique [18]

La composition des fibres lignocellulosiques diffère d’une provenance à l’autre. Le

Tableau 1 résume la composition des principales biomasses lignocellulosiques utilisées pour

la production des biocarburants de 2ème génération.

Tableau 1 : Proportion massique en cellulose, hémicellulose et lignine de différentes biomasses lignocellulosique.

Endoglucanase

Exoglucanase

β-glucosidase

Rôle de l’Hydrolyse enzymatique:

q Calorimétrie: mesure de chaleur

Mise en contact différée: Cellule de mélange

Moteur

Agitateur

Tampon + enzymeS (15 µL de SP188, 30 µL de GC220, 15µL de CDH)

Membrane

Paille

• Substrat hétérogéne• Réaction lente• Chaleur faible

q Mesure de cinétiques par des techniques calorimétriques

-0,1 0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 20 40 60 80 100

Flux

de

chal

eur(

mW

)

Temps (min)

Etalonnage avec de la cellobioseSoustraction d’un blanc

-

=

q Valeur de la littérature (1): Qth = -2,34� 0,12 kJ/mol;q Pas d’influence de la température (2);

(1) Y. B. Tewari,(1989), (2) L. Murphy, (2010)

m (mg) 50 85 100

Chaleur (J) 0,339 0,589 0,697

Chaleur molaire(kJ/mol)

2.323 2.373 2.386

T (�C) 25 33 45

Chaleur (J) 0,594 0,589 0,591

Chaleur molaire(kJ/mol)

2.396 2.373 2.381

Etalonnage avec de la cellobiose

q Effet de la température sur les chaleurs mesurées

Q45�C > Q50�C> Q55�C> Q40�C

-0,1 -0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 0,5 1 1,5

Hea

t flo

w (m

W)

Time (h)

40°C

45°C

50°C

55°C

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1,1

40 45 50 55

Cha

leur

(J)

Température

Résultat pour l’hydrolyse de la paille micronisée

q Effet de la température sur la teneur en sucres réducteurs

22

23

24

25

26

27

28

29

30

40 45 50 55

Sucr

es (m

g)

Temperatures (°C)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

40°C 45°C 50°C 55°C

Cha

leur

/g s

ucre

Temperature

C45�C > C50�C> C55�C> C40�C Q/g45�C ~ Q/g50�C ~ Q/g55�C ~ Q/g40�C

Q45�C > Q50�C> Q55�C> Q40�C

q Exploitation de la mesure calorimétrique ?

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40

Cha

leur

(J)

Sucres (mg)

(125mg, 40°C) (125mg, 45°C) (125mg, 50°C) (125mg, 55°C) (75mg, 45°C) (100mg, 45°C) (137.5mg, 45°C) (150mg, 45°C)

La chaleur mesurée est proportionnelle aux sucres produits

Valeur moyenne pour l’hydrolyse de 32,18 � 3,18 J/g [5.78 kJ.mol-1 ]

Un modèle simple: Michaelis-Menten

1K

1K-E + S ES E +P2K

Avec la linéarisation de Lineweaver and Burk :Mm

m

VSVK

v1)

][1(1

+=

q Mesure de la cinétique d’hydrolyse

[ ]app

t

HV

dtSS

D

W-=ò.0

0

ò=

=

=Df

i

tt

ttapp dt

dQn

H 1

dtdQ

HVv

app

..1

0 D=

q Hypothèse: Proportionnalité de la chaleur et de l’avancement de la réaction (1,2)

(1) P. E. Morin et E. Freire, Biochemistry (Mosc.), 1991

(2) S N Olsen, Thermochimica Acta, 2006

Résultats de la mesure calorimétrique

0

1

2

3

4

5

6

0 20 40 60 80

Rat

e(m

M/m

in)

[Cellobiose] mM

Essai 3 ( 80 mg/L) Essai 4 (80 mg/L) Run 1Run 2

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

1/V

(min

/mM

)

1/S (mM-1)

Constantes de Michaelis-Menten :Km=35,15 � 0,95 mM

Vmax= 7,36 � 0,62 mM/min

q Retour à la cellobiose (1/2)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 20 40 60 80 100 120

Rat

e (m

M/m

in)

[cellobiose] (mM)

Essai 1

Essai 2

Run 1

Run 2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

1/V

(min

/mM

)

1/S (mM)

Méthode du « point par point »

Michaelis-Menten constant: Km=34,01� 0,55 mMMaximal rate: Vmax= 8,42� 0,38 mM/min

Michaelis-Menten constant Km=35,15 � 0,95 mMVmax= 7,36 � 0,62 mM/min

q Retour à la cellobiose (2/2)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,04 0,06 0,08

v (m

M/m

in)

[S]

40°C

45°C

50°C

55°C

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

13 18 23

1/V

1/S

45°C

50°C

55°C

40°C

q Courbe sigmoide

q Valeurs négatives

La méthode ne s’applique pas directement

q Application à la paille de blé (1/3)

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 0,002 0,004 0,006 0,008

V M

m/m

in

[S]

40°C

45°C

50°C

55°C

-0,1 -0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 0,5 1 1,5

Hea

t flo

w (

mW

)

Time (h)

40°C

45°C

50°C

55°C

Le plateau est choisi comme ligne de base

ü Allure conforme

ü Valeurs positives ET …

q Application à la paille de blé (2/3)

0

5

10

15

20

25

0 1000 2000 3000 4000

1/V

(mM

-1.m

in)

1/S ( mM-1)

40°C

45°C

50°C

55°C

ü Corrélation température optimale / valeur de vitesse maximale (à 45�C)

ü La constante de Michaelis varie peu avec la température

V (mM/min) Km mM

40�C 0,216 1,231

45�C 0,291 1,22

50�C 0.268 1.26

55�C 0.23 1.26

q Application à la paille de blé (3/3)

q Impact de la CDH (1/2)

ü Qcellulases + CDH > Qcellulases

ü Ccellulase + CDH ~ Ccellulases

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 10 20 30 40 50 60

Flux

de

chal

eur (

mW

)

Temps (min)

Cellulase+CDH

Cellulase

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Cellulases+CDH Cellulases

Suc

res

rédu

cteu

res

(mg)

Cha

leur

dég

agée

( J)

q Impact de la CDH (2/2)

ü Le cocktail cellulases + CDH produit +18,7 % de xylose et +81,8 % d’acide gluconique

üLa chaleur d'oxydation du glucose en acide gluconique calculée est de 69,14 kJ/mol (80-120 kJ/mol)

0

2

4

6

8

10

12

Glucose Xylose Cellobiose Acide gluconique

Car

bohy

drat

e(m

g)

Cellulases+CDH

Cellulases

q Conclusions

ü Méthode complémentaire à des analyses destructivesü Application en milieu homogèneü Mesure d’une chaleur d’hydrolyseü Cinétiques

ü Mécanismes à compléter (rhéologie, sels, plateaux…)

q Perspectives

ü Amélioration des cellules et amplification du signalü Amélioration des lois cinétiques et prédictivitéü Changement d’échelle pour études procédés (hydrolyse

+fermentation) en SSF SHF

Merci !

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