BIOTECHNOLOGIE PHARMACEUTIQUE De léprouvette au produit final La totalité du matériel présenté...

BIOTECHNOLOGIE PHARMACEUTIQUE De lprouvette au produit final La totalit du matriel prsent est disponible ladresse web: http://www.gch.ulaval.ca/agarnier/ PHA 2501: Sciences Pharmaceutiques II Alain Garnier, Laboratoire doptimisation des bioprocds (LOB), gnie chimique, PROTEO, Hiver 2010

Dfinition et contexte Biotechnologie: lapplication de la science et de la technologie aux organismes vivants, dautres matriaux vivants ou non vivants, pour la production de savoir, biens et services. (source: OCDE) Traditionnelle: Utilisation de micro-organismes et denzymes slectionns pour produire des agents dintrt; Isolation d'agents partir de sources biologiques. Contemporaine: Utilisation de micro-organismes et denzymes modifis, directement ou non, pour produire des agents dintrt.

Les mdicaments d'origine biologique Traditionnels: D'origine animale: produits sanguins, hormones, strodes, catcholamines, prostaglandines, anticorps, insuline, vaccins D'origine vgtale: alcalodes, flavonodes, mthylxanthines, terpnodes, glycosides cardiotoniques et coumarines, ac salicylique D'origine microbienne: antibiotiques, enzymes, protases, vaccins, D'origine virale: vaccins

Les mdicaments d'origine biologique (suite) Biopharmaceutique: substance utilise des fins thrapeutiques ou diagnostiques, base d'acides nucliques ou de protines, produites par des moyens autre que l'extraction directe d'une source biologique non-modifie. Exemples: Facteurs sanguins (facteurs VIII et Factor IX) Agents trombolytiques (activateur tissulaire du plasminogne) Hormones (insuline, hormone de croissance, gonadotrophine, etc) Facteurs de croissance (cytokines, interfrons (IFN), interleukines (IL), rythropotine (EPO), facteur de croissance des colonies, ) Vaccins (mningocoque, influenza, antigne de surface de l'hpatite B, ) Anticorps monoclonaux Autres (facteur de ncrose tumorale, plasmides, vecteurs viraux, microARN, ARNi, )

Seulement 12% des nouveaux mdicaments sont produits par synthse/extraction % de mdicaments approuvs ou en essais cliniques en 2000 (Odum, Pharma. Eng., 2001)

Plan Cibles Sources Produits/caractrisques Mthodes analytiques Dveloppement de systmes de production Construction/slection Procds de production Procds de sparation

Cibles des biopharmaceutiques Francis Crick, 1958 (source: NCBI) traduction PROTINE ARN ADN Dpistage/ thrapie gnique Transcriptome/ ARNi Protome/ Anticorps, hormones DIAGNOSTIC/THRAPIE Syst immunitaire/vaccin Mtabolisme/ Thrapie cellulaire

Sources de biopharmaceutiques Virus Bactries Levures Moisissures Cellules animales Invertbrs Mammifres Primates non-humains Humaines Lignes tablies Cultures primaires Cellules souches

Les virus Influenza Herpes Adenovirus Vaccins ou vecteurs de thrapie gnique Vaccins - exemples: Influenza (GSK) Adnovirus 4 & 7 (Wyeth Pharma pour DoD, 10 5- 10 6 doses Aussi: variole, rubole, rougeole, oreillons, varicelle, hpatite, polio, rage, fivre jaune, encphalite japonaise, cancer, etc

Maladies traites par thrapie gnique

Vecteurs utiliss

Type de gnes employs

Phases cliniques

La thrapie gnique Adnovirus Rtrovirus La thrapie gnique consiste traiter une maladie par le transfert de matriel gntique. Les virus sont particulirement bien adapts pour accomplir cette tche.

Adnovirus: cycle dinfection

Adnovirus: les gnes B Massie, IRB

Adnovirus: volution des vecteurs B Massie, IRB

Adnovirus: construction R. Gilbert, IRB

Adnovirus: production et utilisation B Massie, IRB

Rtrovirus - Rtrovirus sinsre dans le gnome de la cellule hte - 3 familles de gnes: gag = capside, pol = polymrase, env = enveloppe - On manipule la protine denveloppe pour altrer le tropisme du virus

Rtrovirus: cycle de rplication

Rtrovirus: construction de ligne de production

Les autres outils gntiques Diagnostic Patron de digestion par enzymes de restriction Squenage Hybridation FISH Gene chip qRT-PCR Autres phnomnes pigntique ARNi

Techniques analytiques: Lidentification de squences d'ADN La digestion de l'ADN avec des enzymes de restriction, suivi d'une lectrophorse permet une identification par la diffrence de taille des fragments Tir de Microbiology 101, WSU

Lidentification de squences (suite) En ralisant des PCR sur des fragments d'ADN en prsence de dsoxynuclotides et une alternance de didsoxynuclotides, on parvient compltement squencer l'ADN

Hybridation fluorescente in situ (FISH) LE FISH est une technique de biologie molculaire d'hybridation in situ utilisant des sondes marques l'aide d'un marqueur fluorescent et utilises sur des coupes en microscopie. Ces sondes peuvent tre utilises sur de l'ADN ou de l'ARN (sonde ADN), ou sur des protines (sonde anticorps). Le FISH est une technique de cytogntique permettant de voir des lments l'intrieur de la cellule.

L'expression des gnes: les biopuces 1- Comparaison de lexpression gntique de 2 chantillons cellulaires 2- Extraction de l ARN 3-Rverse transcription avec des nuclotides marqus par des fluorochromes diffrents 4- Hybridation comptitive sur des lamelles contenant des milliers doligonuclotides diffrents connus 5- Lecture des lamelles 6- Analyse des rsultats

Les biopuces (suite) Joe DeRisi et al., Stanford U., 6116 gnes (cliquez sur les images pour une explication dtaille).

quantitative (RT)-PCR (qRT-PCR) Cliquez sur l'image pour un lien vers une simulation de la PCR

quantitative (RT)-PCR (qRT-PCR)

pigntique Le terme pigntique dfinit les modifications transmissibles et rversibles de l'expression des gnes ne s'accompagnant pas de changements des squences nuclotidiques. Les changements peuvent se produire spontanment, en rponse l'environnement, la prsence d'un allle particulier, mme si celui-ci n'est plus prsent dans les descendants Certains caractres pigntiques hrits pouvaient tre transmis lors de la rplication cellulaire (miose), voire subsister d'une gnration l'autre pour des organismes multicellulaires. Les phnomnes pigntiques constituent un programme qui dciderait quels gnes activer ou inhiber. Lenvironnement influence ces signaux pigntiques qui peuvent ainsi subir de petits changements. Ces pimutations sont plus frquentes que les mutations classiques de lADN. Phnomnes pigntiques Paramutations Bookmarking Imprinting Gene silencing X chromosome inactivation Position effect Reprogramming Transvection Effet maternel

LARN anti-sens, interfrent, micro-ARN (Pour plus de dtails, cliquez ici)dtails

Exemple 1: Infectio Diagnostic Originalement Infectio Diagnostic, puis GeneOhm Sciences et maintenant Becton Dickinson (BD) Diagnostics Qubec: Identification gntique de bactries pathognes, de gnes de toxines et de gnes de rsistance (Strep B, SARM, ) Bas sur la sensibilit, la spcificit et l'ubiquit de l'amorce PCR Temps du test 1 hr

Exemple 2: Diagnocure La plate-forme technologique PCA3, un gne dont l'ARN messager est dtect dans la majorit des cancers de la prostate chez l'humain. Le mme ARN messager n'est exprim qu' un trs faible niveau dans la prostate normale et est absent des autres tissus normaux. PCA3 peut donc servir de marqueur tumoral et les molcules drives de sa squence, ARN messager ou peptide, peuvent servir la mise au point de divers produits de diagnostic ou de thrapie. La dcouverte du gne PCA3 est le fruit d'une collaboration entre DiagnoCure et l'Universit de Nijmegen et DiagnoCure dtient des droits mondiaux sur cette plate-forme technologique. La technologie DiagnoGeneMC est l'association de technologies pour la dtection d'acides nucliques et de squences de gnes spcifiques au cancer. Les produits drivs de cette plate-forme technologique contiennent trois trousses utilises selon un protocole en trois phases. Une trousse contient des billes de silice pour la purification des acides nucliques de la prparation cellulaire analyse. Une autre trousse contient des amorces, des squences d'acides nucliques spcifiques au cancer investigu, et les ractifs ncessaires l'amplification isothermique des ARNs messagers isols avec la premire trousse et complmentaires aux amorces fournies. La troisime trousse sert la dtection immunoenzymatique du produit amplifi. Cette plate-forme technologique peut donc servir la mise au point de trousses de dtection de tout cancer pour lequel on connat une squence spcifique. Dans le cadre de l'accord de licence avec Organon Teknika, DiagnoCure dtient des droits mondiaux sur les technologies Boom et NASBA, pour tous les cancers.

Les protines recombinantes (PR) 1re: insuline dans E. coli (1982, Ely Lilly) 73 sur le march en 2004, >80 en essais cliniques Croissance de 65% entre 2004 et 2010 (52G$/2010) Insuline+EPO+IFN = 57% du march Protines glycosyles = 60% du march des PR, principalement mAb

Les anticorps Les anticorps sont des protines produites par le systme immunitaire pour ragir avec un antigne donn. Ce sont des molcules de 150kDa, composes de 2 paires de polypeptides, lune de 25kD (chane courte, domaine variable), lautre de 50 kDa (chane longue, domaine constant). La chane courte est responsable de la spcificit de lanticorps pour son antigne

Anticorps monoclonaux - applications 37% des nouvelles molcules thrapeutiques biologiques Identification/diagnostic Thrapeutique: Contre cancer, Crohn, Asthme, Psoriasis, SIDA,... Dirigs contre une protine spcifique, ils peuvent bloquer une interaction rcepteur-ligand ou dclencher une rponse immunitaire. Ils peuvent aussi tre lis un agent chemothrapeutique, radioactif ou autre pour augmenter leur effet.

Exemple: Agent anti-angiogntique (Laboratoires Aeterna) Le processus de langiognse, soit la formation de nouveaux vaisseaux, joue un rle important dans le dveloppement de la tumeur cancreuse. Certains agents peuvent inhiber ce processus. Les agents isols par Aeterna proviennent de laileron de requin. La prochaine tape consiste isoler les gnes responsables de la synthse de ces agents et de les cloner dans des micro-organismes.

Les cellules thrapeutiques Cellules du sang: cellules souches hmatopotiques, Lymphocytes, Mgakaryocytes, plaquettes (Hema-Qubec) Cellules musculaires (myoblastes, Jacques Tremblay, CHUL) Cellules pithliales (peau, vaisseaux sanguins, Hopital du Saint- Sacrement, LOEX) Cellules souches d'adulte et embryonnaire (Rseau canadien sur les cellules souches, http://www.stemcellnet.ca): travaux sur le traitement du diabte, la maladie de Parkinson, l'insuffisance cardiaque, la dystrophie musculaire, la ccit, etc

Les cellules souches hmatopotiques

Les cellules souches embryonnaires

Les cellules souches adultes

Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) Prvalence: 1 garon/3500 Esprance de vie 20 ans

Thrapie cellulaire de la DMD Essais cliniques phase 1 3x10 10 cellules/kg traiter quivalent: 100g muscle donneur /kg traiter Multiplication in vitro incontournable Volumes de culture: 30L/kg traiter Prrequis: Milieu de culture efficace et scuritaire Bioprocd grande chelle (en dveloppement)

Caractristiques des protines: pissage Source: U Miami, cours BIL150 Exemple: Nyman et al (1998), "Identification of nine interferon-a subtypes produced by Sendai virus induced human peripheral blood leucocytes". Biochem J, 329:295-302.

Caractristiques des protines: structure Thse PhD, Franois GUILLONNEAU, 2002

Caractristiques des protines: les modifications post-traductionnelles Clivage Pont S mthylation, phosphorylation, glycosilation conformation ajout de ligands spcifiques (lipid anchor) Tir de PHK

Analyses protique et cellulaire Analyse de protines activit ELISA lectrophorse 1D, 2D, capillaire Chromatographie liquide (HPLC) Spectromtrie de masse Analyse cellulaire: Immuno-histo-chimie Cytomtrie en flux Imagerie cellulaire en temps rel Systmes robotiss

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

lectrophorse sur gel SDS-PAGE Transfert sur membrane de nitrocellulose et rvlation avec marqueur spcifique: Western: EP + anticorps spcifiques protines Southern: EP + ADN marqu Northern: EP + ARN marqu

Tir de Segura, Garnier et al (2007). Figure 2. Fractionation of purified retroviral vector preparations by 1D Gel Electrophoresis Purified virus preparations with (a) and without (b) subtilisin treatment were fractionated on a 4-12% Tris-Glycine polyacrylamide gel (Invitrogen) run under reducing conditions and visualized by silver staining. Protein bands from gel b were excised and subjected to in- gel tryptic digestion prior to MS/MS analysis. Bands containing statistically significant peptide identifications (A-L) are indicated on gel b. Figure 2c shows the protein profiles of samples a (green) and b (blue) superimposed. The theoretical migration positions of all MoMLV viral-encoded proteins are indicated in figure c. lectrophorse SDS-PAGE

Gel dlectrophorse 2-D (chantillon de srum sanguin, Gygi et al., 2000)

High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) Rservoir de Phase mobile Pompe chantillon Colonne chantilloneur Dtecteur Collecteur de fraction change dions Tamis molculaire Interaction hydrophobe Phase inverse lectrophorse En fonction de la colonne Gradient UV/visible Fluorescence Infra-rouge Indice de rfraction Conductivit Spectromtrie de masse Automatique Rfrigr

Hydrolysat trypsique de la BSA

Spectromtrie de masse (MS) - interface L'lectro-atomisation (electro-spray ionisation, ESI) "Make elephants fly", Prix Nobel de Chimie 2002: John B Fenn

MS domaines d'application L'lectro-atomisation pression atmosphrique (API-electrospray) permet l'analyse de protines

MS - analyseurs Constitu de: 1)une source d'ionisation 2)un ou plusieurs analyseurs qui sparent les ions produits selon leur rapport m/z 3)un dtecteur qui compte les ions et amplifie le signal 4)un systme informatique pour traiter le signal Secteur magntique

MS - Quadrupole m/z 10-4000 Prcision :~m/z 0.1-0.2 Vitesse de balayage: 5000 m/z par sec Le temps de vie dun ion de sa formation sa dtection ~40- 100 s. www.bris.ac.uk

MS - Temps denvol (TOF) Lincorporation dun rflectron dans le tube du TOF ou une extraction ionique dlaye (Cornish et Cotter, 1994; Cotter et al., 2004) TOF est communment employ avec MALDI, il peut aussi tre utilis avec un ESI (Boyle et Whitehouse, 1992) www.chemistry.adelaide.edu.au

LCMS exemple d'appareil Agilent 1100 MSD: API-ES, quadrupole

MS exemple de rsultat Myoglobine, MM= 16951 Da Le rsultat obtenu est un spectre de masse reprsentant les rapports m/z des ions dtects sur l'abscisse et l'abondance relative de ces ions sur l'ordonne Le spectre est le rsultat de la distribution de charges sur la population molculaire Permet d'analyser qualitativement et quantitativement la protine d'intrt

Analyse de protines par MSMS (Yates, 1998; Westermeier et Naven, 2002; Graves, 2002) MS spectrum MS/MS ion spectrum m/z Nomenclature de la dissociation en fragments propose par Roepstorff, 1984

Exemple d'analyse MSMS Albumine Protine majeure du srum sanguin (20-30 g/L), souvent utilise en milieu de culture de cellules de mammifres

Exemple d'analyse MSMS Albumine Informations obtenues sur Expasy (www.expasy.org) >P02769|ALBU_BOVIN Serum albumin - Bos taurus (Bovine). MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPF DEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEP ERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYY ANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVA RLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKE CCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRR HPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEK LGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLIL NRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLP DTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVV STQTALA Number of amino acids: 594 Molecular weight: 68026.9 Theoretical pI: 5.77

positionmasspeptide sequencepositionmasspeptide sequence 25-28500,2463DTHK300-3091177,5591ECCDKPLLEK 29-34712,3736SEIAHR310-3181015,4877SHCIAEVEK 37-44974,4577DLGEEHFK319-3361955,9596DAIPENLPPLTADFAEDK 45-652435,2427GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK341-346752,3573NYQEAK 66-751163,6306LVNELTEFAK347-3591567,7427DAFLGSFLYEYSR 76-881349,546TCVADESHAGCEK361-3711283,7106HPEYAVSVLLR 89-1001362,6722SLHTLFGDELCK375-3861388,5708EYEATLEECCAK 101-105545,3405VASLR387-3991497,6314DDPHACYSTVFDK 106-1171364,4803ETYGDMADCCEK402-4121305,7161HLVDEPQNLIK 118-122658,3155QEPER413-4201011,42QNCDQFEK 123-130977,4509NECFLSHK421-4331479,7954LGEYGFQNALIVR 131-138886,4152DDSPDLPK438-4511511,8427VPQVSTPTLVEVSR 139-1511519,7461LKPDPNTLCDEFK460-4681052,4499CCTKPESER 157-160537,282FWGK469-4821667,8131MPCTEDYLSLILNR 161-167927,4934YLYEIAR483-489841,46LCVLHEK 169-1831888,9268HPYFYAPELLYYANK490-495660,3563TPVSEK 184-1971633,6621YNGVFQECCQAEDK499-5071024,455CCTESLVNR 198-204701,4014GACLLPK508-5231823,8996RPCFSALTPDETYVPK 205-209649,3338IETMR524-528609,2878AFDEK 212-218703,4097VLASSAR529-5441850,8993LFTFHADICTLPDTEK 223-228649,3338CASIQK549-5571014,6193QTALVELLK 229-232508,2514FGER558-561509,3194HKPK 236-241689,3729AWSVAR562-568818,4254ATEEQLK 249-256922,488AEFVEVTK569-5801399,6926TVMENFVAFVDK 257-263789,4716LVTDLTK581-587725,2593CCAADDK 267-2801578,5981ECCHGDLLECADDR588-5971050,4924EACFAVEGPK 281-285517,298ADLAK598-6071002,583LVVSTQTALA 286-2971386,6206YICDNQDTISSK Albumine: fragments trypsiques

Analyse LC et MS1 de l'albumine trypsique ANALYSE MS2, cliquez ici Identification de protine, cliquez ici (Logiciel Mascot, Matrix Science)

Protomique du srum sanguin Tirumalai et al., 2003 60 80 g/L de protine (Tirumalai et al., 2003) 10 000 protines diffrentes 22 protines = 99% de la quantit protinique du srum (Zhang et al., 2005) 12 log de variation de concentration (Anderson et Anderson, 2002; Zhang et al., 2005) 325 protines identifies en 2003 (Pieper et al., Proteomics, 3: 1345-1364) 3020 protines identifies en 2005 (Omenn et al., Proteomics, 5:)

Protomique du srum sanguin Anderson et Anderson, 2002

Analyse cellulaire Le compteur de Coulter enregistre un signal provoqu par une modification du champ lectrique tabli au travers dun orifice au travers duquel un fluide contenant les particules est aspir. Ce signal est proportionnel au volume des particules. Exemple: distribution de tailles de particules pour deux chantillons diffrents

Immuno-histo-chimie Technique utilisant des anticorps spcifiques lis des fluorochromes pour mettre en vidence une protine prsente sur une cellule ou un tissu. L'chantillon est par la suite observ en microscopie fluorescence Distribution d'histones, de peroxisomes, et d'actine dans une culture de cellules Vero, Olympus

Cytomtrie en flux Technique permettant d'analyser des cellules grande vitesse en les faisant passer une une dans le faisceau d'un laser. La lumire r-mise (par diffusion ou fluorescence) permet de classer la population suivant plusieurs critres et de les trier.laser En anglais: Flow cytometry ou Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS)

Exemple de cytomtrie en flux

Imagerie cellulaire en temps rel Chambre thermostate, humidifie et concentration en CO 2 controle, monte sur la platine du microscope Exemple: suivi de la division et de la polyplodisation de cellules mgakaryocytaires sur 12 hrs (cliquez ici)

Sytmes robotiss Composs: D'units de gestion des liquides (Liquid handling stations) De bras robotiss D'incubateurs automatiss De lecteurs (Systme Xiril, cliquez ici)

Dveloppement de systmes de production tablissement de lignes cellulaires Construction/slection Procds de production Procds de sparation

Types de cellules animales Culture primaire: Culture initiale de cellules qui viennent dtre prleves dun tissu. Diffrencie. Gnralement attachement obligatoire (ADC). Culture secondaire: Propagation dune culture primaire. Cration dune ligne cellulaire. Peut tre cultiv en suspension. Peut tre indiffrenci. Dure de vie limite (30-50 divisions). Ligne immortelle ou stable. Ligne cellulaire transforme. Peut tre cultive en suspension. Dure de vie illimite.

Diffrentes lignes MRC5, W138: secondaires, fibroblastes, poumons humains, adhrentes, vaccins HeLa: cancer cervical humain (Helen La...), stable, adhrentes, recherche CHO: ovaire de hamster chinois, stable, adhrente/suspension, versatile Vero: reins de singe verts africains, stable, adhrente, versatile Sf9, Spodoptera frugiperda, stable, systme dexpression baculovirus HEK-293: embryon de rein humain, transforme par fragment dadnovirus, stable, hte dadnovirus, adapte la suspension (293S)

Exemple: historique du dveloppement de la ligne HEK-293 Graham, et al., J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977

La construction d'un systme d'expression transformation/transfection/transduction Introduction d'ADN exogne sous la forme d'un plasmide dans des cellules procaryotes (transformation) ou eucaryotes (transfection) Les cellules manipules pour accepter un ADN tranger sont dites comptentes Diffrentes mthodes: Phosphate de Calcium Liposomes Polycations (ex: polythylne imine, PEI; DEAE-Dextran) lectroporation Gene gun Transduction: introduction d'ADN exogne par le biais d'un virus (procaryote) STABLE OU TRANSITOIRE Access Excellence

La cassette d'expression Compos de un ou plusieurs gnes et des squences contrlant leur expression Promoteur (constitutif; inductible: lac, cumate, T, etc; tissu spcifique) Phase ouverte de lecture (Open reading frame) Squence de polyadnylation (PolyA) Transactivateurs Gnes de rsistance ou reporteur (LacZ, GFP, ) Des Internal Ribosome Entry Sites (IRES) peuvent tre intercals entre plusieurs ORFs

Autre exemple: la co-transfection dun plasmide et dun adnovirus dans la ligne cellulaire 293 pour produire un adnovirus recombinant: B. Massie, IRB

Slection (Screening) Commencer par une expression transitoire Slectionner en fonction: Rsistance l'agent de slection Le niveau d'expression du gne reporteur ou de la protine d'intrt La stabilit de l'expression La qualit du produit (analyse crystalographique, RMN, MS, patrons de glycosylation, activit, stabilit, pharmacocintique)

Les systmes dexpression Bactries (1-3 um) Levures Fungi Cellules animales (10-20 um) Modifications post- traductionnelles + pousses Produit plus stable Milieu de culture + complexe + grande fragilit des cellules Cots + levs Produits + haute valeur ajoute Critre de slection: choisir le systme le plus simple qui va faire le travail!

Exemple de milieu de culture de cellules de mammifres: Dulbecco Modified Eagle medium (DMEM) Sels (mg/L) CaCl 2 200.00 Fe(NO 3 ) 3.9H 2 O0.10 KCl400.00 MgSO 4 97.67 NaCl6400.00 NaHCO 3 3700.00 NaH 2 PO 4.H 2 O125.00 Acides amins (mg/L) Arginine84.00 Cystine.2HCl63.00 Glutamine584.00 Glycine30.00 Histidine42.00 Isoleucine105.00 Leucine105.00 Lysine.HCl 146.00 Mthionine30.00 Phenylalanine66.00 Srine 42.00 Mthionine30.00 Phenylalanine66.00 Serine42.00 Thronine95.00 Tryptophane16.00 Tyrosine.2Na.2H 2 O104.00 Valine94.00 Vitamines (mg/L) Ca.pantothnate4.00 Chlorure de choline4.00 Acide folique4.00 Inositol7.20 Niacinamide4.00 Riboflavine0.40 Thiamine.HCl4.00 Pyridoxine.HCl4.00 Autres (mg/L) Glucose4500.00 Rouge de phnol15.00 Na.Pyruvate110.00 + composants non-dfinis: srum sanguin (5-15%), cocktail de facteurs de croissance, etc.

Comparaison des diffrents systmes dexpression

Difficult supplmentaire Temps de division augmente avec la taille: Les cellules animales ncessitent des conditions dasepsie trs strictes Adhsion obligatoire: Certaines lignes de cellules de mammifres ncessitent un support pour tre viables. Cela: pose un problme de mise l chelle les rend particulirement susceptibles au cisaillement Ex: tapis cellulaire de myoblastes Culture sur microporteurs

Exemple: Culture de myoblastes - test de diffrents microporteurs Boudreault, P., Tremblay, J.P., Ppin, M.F.,Garnier, A. (2001), "Scale-Up of a Myoblast Cell Culture Process". J. Biotechnol., 91 (1):63-74.

Culture de myoblastes - transfert de particule particule Boudreault, P., Tremblay, J.P., Ppin, M.F.,Garnier, A. (2001), "Scale-Up of a Myoblast Cell Culture Process". J. Biotechnol., 91 (1):63-74.

La production Le bioracteur Les paramtres Les cintiques de croissance des micro-organismes et de production Les modes de production

Bioracteurs Gracieuset B.Braun Laboratoire doptimisation des bioprocds (LOB, U. Laval)

Bioraction: les paramtres Temprature pH composition du milieu Agitation Aration Asepsie

Contrle des paramtres

Optimisation des paramtres

T=32CT=35CT=37CT=39C Effet de la temprature sur la production dadnovirus recombinant en 293S 0 20 40 60 80 100 020406080 time (hpi) Relative titer Jardon et Garnier, 2000

Les cintiques de croissance et de production Le modle le plus simple: (bilan sur les cellules) (bilan sur le substrat) (cintique de Monod) (modle de Luedeking-Piret pour le produit) X: concentration cellulaire; S: concentration en substrat limitant; P: concentration en produit dintrt; : taux spcifique de croissance; max et K s : paramtres de l expression de Monod; Y x/s : coefficient de rendement cellule/substrat;, : coefficient de la relation de Luedeking-Piret. S 0 et X 0, sont les concentrations en substrat et en cellules initialement. Xmax = Yx/s * S 0 +X 0. La solution

Simulation partir dun modle simple Cuve, MAX = 1,16h -1, K S = 4 g/L, Y X/S = 0,5 g/g, = 0,4 g/g, = g/(g.h)

Autres cintiques Inhibition par le substrat: Inhibition par le produit:...

Les modes dopration filtrat Perfusion Chemostat Cuve-alimente (fedbatch) Cuve (batch) X, P

Culture en perfusion Figure 4. Fluorescence of 293S cells during infection with adenovirus:, Control;, B1 Perfusion 35 o C;, B2 Perfusion 35 o C;, B3 Perfusion 37 o C; X, T-flask. Cortin et al., 2002

Le traitement en aval (downstream processing) Les tapes sparation homognisation concentration purification

Sparation/Clarification Objectif: sparer les cellules du surnageant et conserver la fraction dintrt selon que le produit est intracellulaire ou extracellulaire Les mthodes usuelles: centrifugation micro-filtration (0,1-0,45 um) Filtres fibres creuses (AG tech) Principe de centrifugation en continu Grande chelle = filtration tangentielle

Homognisation Objectif: briser les cellules pour rcuprer un produit intra-cellulaire Moyen: Gel/dgel Ultrason contraintes (stress) hydrodynamiques

Concentration Objectif: rduire le volume Moyens: Prcipitation Ultra-centrifugation Ultra-filtration (5kDa - 500kDa) AG technologies

Purification Objectif: Isoler le produit dintrt Moyen: chromatographie Access Excellence

Purification (suite) 3 types de chromatographie: Access Excellence

Le contrle de qualit Les molcules biopharmaceutiques sont soumises aux mmes normes que la fabrication de molcules de synthse: Bonnes pratiques de fabrication (GMP) Protocoles dopration normaliss (SOP) Validation des procds Documentation Ces normes sont appliques de faon encore plus stricte pour les produits biologiques tant donn que les ractions menant la formation du produit (le mtabolisme cellulaire) ne sont pas bien dfinies.

Le contrle de qualit (suite) Toute une srie de normes, lignes directrices et de points considrer sont mis par le Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) de la Food &Drug Administration (FDA) http://www.fda.gov/cber/ Les sections 210, 211 et 600 du titre 21 du "Code of Federal Regulations" (CFR) "Guidelines" et "point to consider particulirement pertinents: - "Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy" - "Point to consider on Plasmid DNA Vaccines for Preventative Infectious Disease Indications" - A proposed Approach to the Regulation of Cellular and Tissue- based Products

Le contrle de qualit (suite) Classent le processus de production GMP en 7 catgories: Installation quipement Personnel Matriels Protocoles Tests Documentation

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