BIOPATHOLOGIE TISSULAIRE : ILLUSTRATIONS ET …©lévements… · – 6 x 2h de cours magistraux...

BIOPATHOLOGIE TISSULAIRE : ILLUSTRATIONS ET MOYENS D'EXPLORATIONS – Gestion des prelevementstissulaires et cellulaires, bio-collections.

09/11/15PARENT Maud L2CR : Kévin BOUÉBTIMES. GARCIA26 pages

Gestion des prélèvements tissulaires et cellulaires, bio-collections.

L'enseignement en anatomie pathologie :

– 6 x 2h de cours magistraux

– 2x 2h de TP obligatoires (qui auront lieu au deuxième semestre).

Attention : Le prof a insisté qu'il n'y aurait pas de changement de groupe de TP possible !!

Contrôle de connaissance :

– Fin d'année : Epreuve de 30 min avec 20 QCMs sur tous les cours du module (pas uniquement del'anatomie pathologie) (2/3 de la note finale)

– TP 10 QCM en fin de séance (1/3 de la note finale)

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Plan

A. Les techniques élémentaires I. Histologie

1) Les techniques histologiques2) Les types de prélèvements3)Les colorations

II. Cytologie1) Techniques morphologiques de bases : la cytologie par étalement ou étalement simple2) La cytologie mono-couche

B. Les techniques complémentaires I. Colorations spéciales II. Immunohistochimie III.Hybridation in situ IV. Biologie moléculaire non morphologique

C. Gestion des prélèvements : la phase pré-analytiqueI. Notion de pré-analytiqueII. Choix du fixateurIII. Le bon de demandeIV. Orientation des pièces opératoires

D. L'examen extemporane


Objectifs du cours :

– Connaitre les principes de base de réalisation des techniques morphologiques utilisées dans un serviced'anapath

– Connaitre les modalités de transmission de ces prélèvements.

Cours de mise en ambiance, avec des notions très générales.

Ce cours fait écho à un cours que l'on aura dans 2 ans, qui est un item d'ECN (item 290 : le médecin préleveurde cellules et de tissus).

Cet enseignement n'a pas pour but d'apprendre l'anapath, mais nous aurons tous dans notre profession uncontact avec l'anapath : on sera préleveur ou lecteur de compte rendu d'anapath, et il y a donc un socle deconnaissance à connaître qui sont des données transversales.

On va beaucoup parler de la cacérologie bien que l'anapath ne se réduise pas à cette discipline. Tous lesmédecins vont avoir un contact avec des patients atteints de cancer.

Qu'est ce que l'anatomie pathologie (anapath) ?

Qui sont les anapaths ? En quoi consiste cette spécialité ?

C'est un discipline médicale (ce ne sont pas des biologistes).

L'anatomie pathologique étudie les lésions macroscopiques et microscopiques de tissus ou cellules prélevéessur des êtres vivants malades ou décédés (99% des prélèvements se font sur des patients vivants).

On travaille sur des pièces opératoires qui sont des fragments de patient vivant.

Macroscopie : examen à l'oeil nu d'une pièce opératoire, sur une paillasse.

Microscopie : examen de préparation histologique ou cytologique au microscope photonique (« àtransmission »).

Quand on parle de microscopie, on parle de microscope à fond claire, c'est à dire à lumière transmise. Leprincipe est qu'on envoie un faisceau de lumière qui va traverser la lame histologique (on va donc regarder cettelame histologique à travers le faisceau lumineux).

A. Les techniques élémentaires

I. Histologie

L'histologie c'est l'étude des tissus.

Un tissu est un ensemble complexe de cellules qui interagissent les unes avec les autres (quand le patient estvivant).

1) Les techniques histologiques

Le prélèvement d'un fragment peut être extrêmement petit ou extrêmement gros.

Toutes les cellules qu'on prélève sur le sujet va en anapath (dans l'amphi, il y a probablement la moitié despersonnes qui ont déjà confiées des cellules à un anapath).

Les modes de prélèvements sont infinis : biopsies instrumentales, pièces opératoires...

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Après le prélèvement (dans un cabinet ou un bloc opératoire) il va falloir fixer (avec du formol à températureambiante) puis transmettre.

Avant qu'il ne soit arrivé dans le service d'anapath, le prélèvement est sous la responsabilité du préleveur. (Ilarrive que des prélèvements se perdent..)

2) Les types de prélèvements

Biopsie : fragment de petite taille (généralement).

L'objectif principal d'une biopsie c'est d'être un échantillon, soit d'une tumeur (ex :nodule dans le foie, biopsie de quelques millimètres, c'est un échantillonnage de latumeur) mais pas forcément tumorale (coloscopie : on prélève un peu de la muqueusecolique. Ce fragment en censé représenté la totalité du colon.)

La biopsie est la seule donnée que l'anapath a sur le patient. Il est donc extrêmementimportant de communiquer avec lui des données cliniques.

Exérèse : prélèvement emportant la totalité d'une lésion (quelques centimètres pourune lésion cutané à l'organe entier).

A partir du moment ou on est dans une logique d'ablation d'une lésion, on va renter dans la deuxième logiquequi est propre à l'anapath qui est la macroscopie.

On va décrire la lésion (ex : ce prélèvement cutané mesure 2cm de grand axe , il est centré sur un nodule quimesure 15x8 mm)

La macroscopie peut être simple ou compliqué. CR : La mascropie est l'étape pendantlaquelle l'anapath décrit, éxamine et échantillonne une pièce opératoire.

Tumeur appendue au poumon (3-4 cm, jaune, bien délimité, un peu d'hémorragie). Il y a peude choses à dire.

Tumeur de l'utérus (cancer de l'endomètreprobablement) : on va peser la pièce, décrire la lésion (très hétérogène,occupe la totalité de la cavité, partiellement nécrosé...)

On ne connait pas la patiente, mais quand le médecin lira le compte rendu,l'anapath dira tout ce qu'il à vu sur l'échantillon. En échange, on attends dumédecin qu'il communique comment il est arrivé au diagnostic, lesantécédents...

Exemple de description macroscopique d'une pièce opératoire (pas à apprendre)

Le prélèvement est une lobectomie pulmonaire supérieure droite. Elle pèse154g, mesure 12 cm de grand axe. Elle emporte une tumeur située àproximité des recoupes vasculaires et bronchiques (5mm) et à distance dela plèvre (2cm) Elle mesure 15x12x8 mm, est blanchâtre, mal limitée,tatouée d’anthracose. Elle est unique. Des prélèvements ont été réalisée auniveau de la lésion, des limites d’exérèse, de l’interface avec la plèvre etde façon systématique sur le parenchyme pulmonaire adjacent. Il n’a pasété retrouvé de ganglion lymphatique. 10 blocs ont été réalisés.

La plèvre est assez loin et on va faire toute un série de prélèvements.

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Le nombre de prélèvements est complètement corrélé à la complexité de la pièce opératoire.

On va chercher des secteurs de tumeurs hétérogènes, des angio-invasions...

Quand on cherche quelque chose en macro, on va faire un bloc (contenant le prélèvement).

Fonctionnement du service d'anapath :

Le matin : examen macroscopique, et prélèvement de toutes les pièces opératoires qui arrivent.

En fin de journée, ces pièces opératoires doivent finir en coupe histologique, sur une lame. Il faut faire untraitement chimique .

Il faut faire deux choses pour pouvoir couper les tissu de manière extrêmement mince (pour que la lumièrepuisse traverser la lame. Si la lame fait 1 cm d'épaisseur , la lumière ne va pas pouvoir traverser).

L'objectif est d'obtenir des tissus de consistance homogène permettant la réalisation de coupes régulières de4-5 μm maximum.

On va donc inclure le tissu en paraffine (dans un bloc de paraffine qui enrobe le prélèvement tissulaire). Al'aide d'un automate.

Toute la journée, on a fait des cassettes (qui sont des petites boites contenant des petits bouts de tissus). En finde journée on mets la totalité des cassettes dans une machine, qui est un automate à inclusion.

Pour pouvoir mettre de la paraffine dans un tissu, il faut dans un premier temps enlever l'eau puisque laparaffine est du gras donc hydrophobe.

Pour déshydrater le tissu, il suffit de mettre de l'alcool. Il y a donc des bains d'alcools dans la machine (alcoolà 70° puis à 90° puis à 100° plusieurs fois, pendant plusieurs heures à chaque fois, de manière à ce qu'a bout de5-6h le tissu soit complètement déshydraté).

Ensuite pour que la paraffine rentre, il faut enlever le gras (clarification) qu'il y a dans le tissu pour faire de laplace à la paraffine. On met donc le tissu en contact avec du xylène (qui est un solvant). La machine pompe lexylène dans la cuve. Il y a plusieurs bains, de plus en plus concentré. Ce processus dure toute la nuit.

En fin de nuit, les tissus déshydraté et dépourvus de graisse vont être inclus dans la paraffine liquide (qui vaalors imbibé complètement le tissu). Ce processus dure 12h-13h.

On va ensuite créer les blocs de paraffine. On ouvre la cassette contenant la paraffine liquide, on met l'objet eton pose la cassette sur une plaque de froid. La paraffine se fige immédiatement. On recouvre, on complète avecun peu de paraffine et on mets sur une plaque réfrigéré pour refroidir. Une fois que c'est refroidi on démoule, eton obtient l'objet inclus dans la paraffine et près à être couper.

On découpe avec un appareil appelé microtome. A chaque tour de manivelle on fait un ruban qui fait4 µm d'épaisseur (ruban de paraffine mais d'objet également). C'est extrêmement minutieux.

On dépose ce fragment de paraffine qui contient l'objet sur une lame que l'on mets sur une plaque chauffante.Le liquide va s'évaporer et on obtient un lame blanche (si on l'observait au microscope, on ne verrait rien, letissus sont incolores, invisibles à l'oeil)

La cassette c'est quand l'objet n'est pas inclus. La cassette sert à faire un bloc (où le tissu est inclus). Le bloc sertà faire les lames blanches, qui sont la plus petite unité fonctionnelle du service d'anapath. C'est à partir de cettelame blanche que l'on va travailler.

Le bloc est l'archive et la lame blanche est l'outil de travail.

Même une biopsie qui fait un ou deux millimètres on travaille sur des échantillons de 5 µm. Ce bloc peut servirà faire énormément de lame. En biopsie on peut être amené à être limité en quantité de tissu à force de s'enservir mais en pièce opératoire, on a largement de quoi travailler.

Cette lame blanche sert de diagnostic aux techniques complémentaires et à la biologie cellulaire.

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3) Les colorations

La coloration standard en anapth est la coloration HES ou HPS (P pourPhloxine qui est l'équivalent de l'Eosine).

– L'hématoxyciline est un colorant bleu violet très sombre qui colorele noyau.

– L'Eosine est un colorant rose pour le cytoplasme.

– Le Safran colore en orange le collagène.

C'est une coloration trichromique.

Les anglosaxons font juste de l'HE (ils n'utilisent pas de safran).

100% des lames vont être colorés par cette coloration HES puis vont être examinées au microscope. Lacoloration permet de retrouver l'objet sur la lame blanche.

C'est 90% de l'activité du service d'anapath. Tout ce qui est tissu passe par cette filière.

II. Cytologie

Il va y a avoir une deuxième filière qui est celle de cytologie.

Cette fois, il n'y a pas de fragments, ce sont des cellules isolées.

On va voir que la façon qu'on a de recueillir des cellules isolées données est extrêmement variable : des frottis,des grattages, des ponctions, des lavages, analyse d'urine, LCR, ponction de kyste, de nodule.... Il yaénormément de possibilités. Et à chaque technique son mode de transmission.

Exemples de cytologies :

– Frottis cervico-vaginal

– Lavage bronchio-alvéolaire : on fait une fibroscopie. Quand on est dans une bronche distale, on instilledu sérum physiologique (un certain volume) puis on le ré-aspire, ça fait un lavage, ça va ramener lescellules qui sont dans les bronches, dans les alvéoles, le contenu de l'alvéole et d'une partie des parois eton va avoir un échantillonnage de cellules du poumon.

– Cytologie urinaire : soit c'est l'urine mictionelle (dans un bocal) soit c'est de l'urine par lavage(instillation dans la vessie, puis lavage et on récupère les cellules).

Que ce soit le lavage broncho-alvéolaire ou l'urine, ce sont des épanchements que l'on étudie.

On peut aussi être amener à ponctionner un organe. Ce geste est de plus en plus fait par les radiologues.

– Ponction percutanée d'un nodule thyroïdien : la thyroïde est un organe superficiel, très facile. Onplante une aiguille dans le nodule, on aspire ce qu'il y a dans notre lésion.

– Il y a aussi des ponctions plus compliquées, par exemple l'écho-endoscopie. C'est un endoscope (dugasto-entérologue) couplé à une sonde d'échographie qui est au bout de l'endoscope et ça permetd'explorer non pas ce qu'il y a dans la lumière digestive (ce pour quoi on a pas besoin d'un endoscopemais simplement d'un opérateur visuel) mais ce qu'il y a dans la paroi. On fait une échographie, parexemple trans-oesophagienne, on va chercher une adénopathie médiastinale et on exerce la ponction.

– Cytoponction du pancréas sous écho-endoscopie.

C'est un champ infini. Certaines ponctions relèvent de techniques extrêmement sophistiquées.

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1) Techniques morphologiques de bases : la cytologie par étalement ou étalement simple

Exemple d'une ponction thyroïdienne : on a ponctionner un nodule thyroïdien, on a notre seringue avecl'aiguille et un petit prélèvement qui pour nous est d’intérêt. On étale l'échantillon liquide sur une lameinstantanément sinon l'échantillon va coaguler dans la seringue ce qui est inutile.

On dépose quelques gouttes de liquide sur une lame, on va l'étaler doucement à l'aide d'une lame très fine et onle fait sécher à l'air libre pour le déshydrater.

On a donc des cellules fraiches, séchées sur une lame. C'est une autre coloration que l'HES (qui est pour lestissus inclus dans la paraffine). Sur des cellules fraiches on fait un coloration MGG (May Grundval Giemsa).

Si lors de la ponction on a ramené des bouts (biopsie), on les mets dans le formol. (ils ne peuvent pas être traitésen cytologie).

Le défaut de cette technique est que la matériel est excessivement fragile. Quand on étale sur la lame, il ne fautpas racler (les cellules ne peuvent pas résister à la pression que l'on applique). Le geste doit être délicat.

Un des modèles que nous seront peut être amené à faire, c'est le myélogramme (ce n'est pas de l'anapath maisde l'hémato). Le principe est le même. On ponctionne, on mets une goutte et on étale très doucement.

C'est très important de sécher à l'air car sinon les cellules vont pourrir instantanément. Lorsqu'elles sontfraiches, le simple fait de les sécher les déshydrate, sans les fixer.

Cette lame est très fragile. Chaque lame est unique. Si l'on fait trois lames il peut y avoir des cellules tumoralessur la première mais pas sur la dernière. On ne va rien pouvoir faire d'autre que les regarder.

Il n'y a pas de technique complémentaire.

2) La cytologie mono-couche

Depuis quelques années on a perfectionné cette cytologie avec une technique : la cytologiemono-couche ou cytologie en couche lisse ou cytologie en phase liquide.

Le geste c'est le même sauf qu'au lieu d'étaler les cellules sur une lame, on vide le contenu dela seringue dans un liquide (équivalent à un fixateur, bien que ça n'en soit pas un).

Qu'est ce que ça change ?

L'anapath va recevoir un liquide et un liquide se centrifuge si on veut que les cellules soient sur la lame. On vadonc centrifuger et obtenir un culot de centrifugation.

C'est beaucoup plus facile à lire, car quand on étale un produit de ponction, il y en partout sur la lame. Il vadonc falloir chercher dans tous les recoins de la lame les cellules. Alors que là, les cellules sont toutes déposéesau même endroit.

Les échantillons sont également moins fragiles.

C'est plus propre dans le sens ou le sang, les cellules inflammatoires ont sédimenté. Le sang va lyser. Lescellules détruites vont disparaître dans ce fixateur qui contient différents composantes, et donc à lire, on aurapratiquement que les cellules.

De plus, le système de centrifugation permet que les 3 ou 4 lames que l'on fera avec les liquides seront toutesidentiques les unes des autres : on homogénéise le liquide et on le dépose sur les lames.

Biensûr la cellule qu'il y a sur la lame A n'est pas sur la lame B, mais s'il y a 10% de cellules tumorales dansl'échantillon, alors il y aura 10% de cellules tumorales sur la lame A et 10% sur la lame B.

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Des examens complémentaires sont possibles (coloration spécifique, immunohistochimie)

Cette technique a révolutionné la prise en charge des cellules et ça a considérablement améliorer lesperformances de cette technique.

Le développement de la cytologie monocouche a été le frottis.

L'ancienne technique du frotti était faite avec une spatule d'ayre, que l'on frottait au col et le gynécologue étalaitles cellules sur une lame de verre.

On a ensuite développé une nouvelle technique : on brosse le col, on dépose la brosse dans un liquide et onenvoie le tout à l'anapath.

Cette méthode a considérablement changé la prise en charge, non pas du frottis spécifiquement mais de lacytologie en général.

Coupe histologique d'un épithélium malpighien :

On peut voir sur l'échantillon une assise basale et un épithélium qui contient plusieurs couches. Les couchesdeviennent matures avec des cellules de plus en plus plates (c'est un épithélium pavimenteux).

C'est une coupe de tissu, en histologie. Lorsque l'on réalise un frotti on obtient que les cellules superficielles etau lieu de voir en coupe, on voit les cellules à plat. Quand on regarde un frotti, on regarde les amas de cellulesqui sont superficielles.

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Il existe donc une différence fondamentale entre une coupe histologique (avec laquelle on est tous à l'aise carc'est ce sur quoi on nous a appris, la forme, la couleur nous est familière) et la cytologie.

On va continuer à améliorer cette cytologiemonocouche au matériel de cytoponctions, c'est àdire qu'on s'est aperçu que dans un certains nombrede cas on a des petits bouts dans ces fragments, etnormalement quand on a des petits bouts, on fait dela cytologie (pour les cellules prélevées) mais ausside l'histologie.

Pour un même élément, on va avoir un traitementtissulaire (inclusion en paraffine) et un traitementcytologique.

L'histologie permet de savoir comment les cellulessont articulées les unes avec les autres ce qui est trèsimportant pour le diagnostic alors que lorsqu'on ades cellules dissiminées sur une lame (cytologie), onne connait pas sur le patient comment elles sontagencées les unes par rapport aux autres : il nousmanque donc le volet architecture du tissu.

B. Les techniques complémentaires

Pour une même lésion on peut avoir plusieurs types d'images, plusieurs manière de regarder la lésion (c'estcomme lorsque pour un même malade on va faire une échographie, un scanner, un IRM. Chacun des examensnous amènent des critères qui sont complémentaires. CR : Dans le cas de l'anapath, on aura trois approchesdifférentes qui sont complémentaires : l'étalement simple, la cytologie mono-couche, et l'inclusion en paraffine.

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Gauche: coupe histologique. Droite: cytologie


I. Colorations spéciales

Le terme de « spécial » permet simplement d 'opposer ces colorations à la coloration dite de standard, l'HPS.

Le principe des ces colorations spéciales est de caractériser les substances présentes sur la coupe histologique,en reposant sur des propriétés physico-chimiques de certains colorants.

Toutes ces colorations, y compris l'HPS, sont basées sur l' affinité de certains colorants pour certainescomposantes cellulaires.

Par exemple, l'hétoxyciline de l'HPS a un tropisme pour les bases. C'est un colorant basophile. Comme basedans les cellules, on a l'ARN, c'est pourquoi le noyau est coloré par l'hématoxyciline.

Il existe des tas d'autres colorants qui ont des affinités pour d'autres composantes cellulaires, mais ces colorants,on ne les utilise pas en routine. On va regarder les lames et repérer un détail que l'on ne sait pas caractériser. Onva donc faire une coloration spéciale pour mieux caractériser ce que l'on a sous les yeux, que l'on voit en HPSmais dont on ne connait pas la nature avec précision.

Les indications sont donc variables et dépendent de l'examen initial de la lame HES.

La liste ci-dessous n'est bien sûr pas exhaustive :

– MPS (CR : Mucopolysaccharides) → coloration P.A.S

– Mucine (présente dans les mucus) → Bleu alcian

– Amylose → Rouge congo

– Hémosidérine → Perls

– Bactéries → Gram, Zielh

Il existe au moins une vingtaines de colorations spéciales, chacune est spécifique de quelque chose.

Ses prescriptions : on a l'HPS, on voit qu'il y par exemple un filament mycélien à la surface d'une biopsieoesophagienne mais on ne voit pas très bien. On va donc demander un P .A.S (CR : pour avoir la certitude quece que l'on voit est bien un filament mycélien) qui va colorer les mucopolysaccharides de l'enveloppemycélienne et on va donc beaucoup mieux voir le filament.

Il faut remplir un bon en demandant un nouvel échantillon et une nouvelle lame blanche.

De gauche à droite, de bas en haut : 1) coloration Perth colore en bleu. 2) Reticuline, coloration de la fibrose enrouge. 3) Bleu alcian pour colorer le mucus et donc caractériser les cellules muco-sécrétantes 4) colorationP .A.S

C'est quelque chose que l'on demande pour éclairer l'image histologique en coloration standard.

Revu en TP.

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II. Immunohistochimie

Cette technique se développe depuis une trentaine d'années et prends aujourd'hui une place indispensable dansles services d'anapath.

Immunohistochimie : Réaction immunitaire (donc différent des colorants qui mettent en jeu des propriétésphysico-chimiques). On sous-entend que sur la lame blanche il y a un antigène et on veut confirmer la présencede cet antigène sur la coupe histologique à l'aide d'un anticorps couplé à un chromogène.

On a donc dans un premier temps une lame avec coloration HPS. Si on a besoin d'un renseignement sur le typede cellules par exemple, on demande à la technicienne de reprendre le bloc pour avoir une nouvelle lame surlaquelle on va faire une réaction immunohistochimique.

Il y a deux indications:

– pour valider un diagnostic :

Ex : en voyant la lame on se dit que ce que l'on voit doit être unemétastase d'un cancer de la thyroïde mais on ne reconnaît pas bien lathyroïde. Or la thyroglobuline est spécifique de la cellule thyroïdienne.Si on met en évidence la présence de thyroglobuline sur cette cellule,alors on pourra être certains que la cellule est une cellule thyroïdienne.On va donc mettre un anticorps anti-thyroglobuline sur la coupe.

Comment ça marche ? la coupe est bleu du fait de la coloration. Ensupposant qu'il y a de la thyroglobuline sur la coupe, on va utiliser unanticorps de souris anti-thyroglobuline. Cependant si on fait que ça,on ne va rien voir (la simple fixation de l'anticorps sur le tissu ne suffit pas à visualiser la protéine d'interêt).

On va donc utiliser un anticorps anti souris sur lequel on a accrocher énormément de sites colorés. Pour unsignal, on a 5 000 à 10 000 signaux colorés lumineux disponibles. C'est à ce moment-là que on va pouvoirvisualiser.

On travaille avec des grossissements qui vont jusqu'à 400, donc des grossissements qui ne sont pas énormes, etpour voir quelque chose, il faut que ce soit un phénomène relativement significatif.

Si on amplifie pas le signal, on ne pourra pas visualiser.

Tous les immunomarquages ont cet aspect : un fond bleu (dû à la coloration pour voir la coupe) et une réactioncolorée qui est généralement marron (elle peut aussi être rouge mais dans des cas plus rares).

Cette coloration brunâtre peut être dans le noyau, dans le cytoplasme...

Cette technique sert essentiellement à trois choses :

– Typage cellulaire (c'est ce pourquoi cette technique a été inventée). Cela renvoi à la différenciationd'une tumeur. Une cellule tumorale a normalement un aspect particulier. Le problème est que dans lestissus tumorales, en se transformant, les cellules subissent des transformations morphologiques.

Une cellule tumorale thyroïdienne peut donc parfaitement ne pas ressembler à une cellule thyroïdienne.Elle peut même ressembler à un autre type cellulaire (cellule épithéliale mais aussi potentiellement àune cellule conjonctive ou lymphoïde). Ce qui fait qu'à un moment donné on a une cellule, on est sûrqu'elle est tumorale mais on ne sait plus ce que c'est comme type cellulaire .(une cellule tumorale a unaspect particulier. Les modifications génétiques des cellules tumorales modifient aussi sa forme. Ellepeut donc ressembler à n'importe quoi.

On va donc chercher dans cette cellule des marqueurs de ligné : carcinome, sarcome, lymphome, unethyroglobuline, une PSA pour la prostate, kératine, marqueurs mélanocytaires.. (il existe des centainesde marqueurs). C'est ce typage cellulaire qui a justifié l'explosion de l'immunohistochimie en anapath.

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Avant on faisait de la microscopie électronique pour aller chercher des granules neuro-endocrines, desmélanosomes, toutes ces structures intracellulaires que l'on voyait au microscope. Le problème, c'étaitque pour faire de la microscopie électronique, on ne peut pas faire moins que 1 mois de technique, cequi est complètement inadapté à la prise en charge des patients. C'est une technique qui est trèscomplexe (les anapaths ne font maintenant plus de microscopie électronique, c'est un examen qui estrévolu, qui ne sert plus qu'à la recherche ou à des très rares exceptions).

L'immunohistochimie au contraire, est une analyse qui va très vite : on a le résultat le lendemain.

– Facteurs pronostics : la cancérologie a fait des progrès considérables mais maintenant il ne suffit pasdire à une patiente qu'elle a un cancer du sein mais on veut savoir quel cancer du sein, qu'est ce que 'lonva proposer à la patiente, est ce que l'on va lui faire une radiothérapie, est ce que l'on va lui proposer unechimiothérapie...

Evidemment il y a la notion de taille tumorale mais on peut avoir deux patientes de même âge, avecune même taille tumorale, mais on va avoir dans une tumeur des marqueurs d'agressivité et dansl'autre tumeur l'absence de ces marqueurs d'agressivité : une patiente va donc relever d'unechimiothérapie alors que l'autre patiente sera simplement sous surveillance. La conduite à suivre estdirectement corrélé à la présence de certains marqueurs.

Ex : Ki67 est un marqueur de prolifération qui est le critère pronostic des tumeurs neuro-endocrines. Sidans une tumeur neuro-endocrine, le patient a ce marqueur en quantité élevé, il aura une chimiothérapie.

– Cibles thérapeutiques :On est encore plus avancer qu'avec les facteurs pronostics, c'est à dire qu'on vase demander : quelle chimiothérapie pour cette patiente qui a un cancer du sein ? Le cancer du sein estun cancer hormonodépendant et quand les cellules tumorales se transforment, elles peuventsauvegarder les récepteurs hormonaux de la cellule initiale ou elles peuvent le perdre. Quand on a uncancer qui contient ces récepteurs hormonaux, on va pouvoir donner des anti-hormonaux à la patiente,ce qui va avoir une action sur les cellules tumorales. Ces médicaments sont biensûr inutiles si cesrécepteurs sont absents, car le médicament sera inactif.

On voit depuis 4 / 5 ans une explosion des ces cibles thérapeutiques.

Pour la moitié des tumeurs on est amené à faire de l'immunohistochimie, pas tellement parce que l'on ne saitpas ce que c'est comme tumeur, mais pour avoir une indication sur les traitements à mettre en place.

Les récepteurs hormonaux sont dans les noyaux, on adonc un marquage marron dans le noyau. On peut avoirdes tumeurs avec 20% des cellules marquées et on peutavoir des tumeurs avec 70% des cellules marquées. Biensûr ce n'est pas neutre pour la patiente.

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Un autre marqueur qui est lui membranaire, également dansle cancer du sein : CerbB2.

Si on a le marquage intense, niveau 3, circulairemembranaire, on sait que la patiente va répondre à untraitement par Herceptine®

Si le marquage est moins intense (niveau 2), dans lecytoplasme, le traitement ne sera pas efficace et que l'ondonne le traitement par Herceptine® à cette patiente, il serainutile.

L'Herceptine® est un traitement qui coute environ5 000€ / mois. Donc non seulement on donnerait à lapatiente un traitement qui ne lui sert à rien mais en pluscouteux.

Si le marquage était nul, la lame serait complètement bleue.

Ces analyses ont donc un gros impact sur la prise en charge des patients.

Pourquoi c'est important ?

Si on a laissé le tissu trainer sur la paillasse sans fixation, les AG vont pourrir (car le site de prélèvement aurapourri) et quand on va essayer de faire les tests, rien ne va marcher. Ce n'est donc absolument pas neutre, ça vaimpacter complètement sur la prise en charge du patient.

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III. Hybridation in situ

Au lieu de chercher un antigène sur la lame, on va aller dans l'ADN, ouvrir l'ADN et on va appliquer une sondefluorescente qui ont des intérêts variables. Contrairement à précédemment où on avait une techniqued'amplification qui permettait de regarder ces images au microscope, cette fois ci on est à une échelle qui rendcette technologie impossible. On passe donc à la fluorescence.

La fluorescence permet de voir un signal extrêmement petit. On utilise un microscope à fluorescence. Ce n'estpas la lumière qui vient d'en dessous et qui traverse l'objet, mais c'est une lumière UV qui vient d'au-dessus etqui va traverser, taper la lame et qui va renvoyer, à travers un filtre qui a une longueur d'onde précise et lefluorochrome que l'on a couplé à l'ADN va renvoyer un signal qui lui aussi a une longueur d'onde spécifiqueet donc une couleur spécifique.

En fluorescence, on colore le noyau en bleu, c'est une coloration qui marque la chromatine puis on utilise descouleurs qui vont être spécifiques d'un gène.

Il n'y a pas un très grand choix, généralement c'est vert et rouge.

On regarde la lame sous l'angle du vert, puis sous l'angle du rouge, et contrairement à la longueur transmise, ilne laisse passer q'une longueur d'onde précise (ce qui est dans le vert ne va pas passer dans le rouge).

Si on a la chance d'avoir un ordinateur brancher au microscope, on va pouvoir restituer l'image.

C'est une technique qui est beaucoup plus longue.

La lecture est beaucoup plus compliqué, beaucoup plus lente. Les applications sont donc limitées, du fait ducoût (c'est très cher) et de la durée.

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Exemple : Translocation responsable d'un cancer du poumon.

On recherche la translocation d'un gène, l'EML4-ALK. On fait une lame blanche au bloc et comme on chercheune translocation on insère notre gène (de part et d'autre) avec deux sondes, une verte et une rouge.

Si notre cellule est normale, puisque notre gène est normal, les deux sondes vont être l'une à coté de l'autre (onva donc voir soit les deux boules, soit on voit quelque chose de fusionner, jaune). La couleur jaune corresponddonc à un signal normal.

Si le gène est réarrangé, les signaux sont séparés. Les signaux rouges et verts sont largement séparés.

Autre type de signaux : l'amplification de cmet

La question qui se pose est : au sein d'un chromosome, aulieu d'avoir une copie d'un gène, on va en avoir 4,5,6. Leproblème est que les cellules tumorales sont volontierspolysomiques. Au lieu d'avoir 2n chromosomes, elles vont enavoir 4n, 5n (ce qui est déséquilibré).

Si on marque juste le gène d'interêt et que l'on a trois, quatrecopies, on est pas capable de dire si cette cellule contient 3 ou4 chromosomes normaux ou si on a qu'un seul chromosomequi porte 4 fois le gène.

Il faut donc deux sondes : une sur le gène d'interêt et une surle centromère du chromosome que l'on étudie.

On va donc raisonner en ratio : on compte le nombre de centromères et on compte le nombre de signaux. Si leratio est de 1 ou proche de 1, c'est de la polysomie (présence de plusieurs chromosomes à la place des deux quiforment normalement la paire). Sinon, s'il y a un déséquilibre, c'est de l'amplification.

Les signaux sont distants (le centromère et le gène ne sont pas à coté l'un de l'autre). On a un nuage de pointsverts et très peu de points rouges (qui marquent le centromère). Il y a donc bien une amplification.

Ces patients la reçoivent un traitement adapté à leur transmutation ou à leur amplification. Ces traitements sontà 5 000€ par semaine, voir par comprimé. Plus la médecine avance et se sophistique, plus elle devient chère etplus on a interêt à identifier des cibles caryotypes. En échange de ce prix exorbitant, les patients répondent tousà leur traitement. Les tumeurs vont disparaître sous traitement médicamenteux (quand on a une molécule quisait identifier l'anomalie).

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IV. Biologie moléculaire non morphologique

Ce que l'on vient de voir correspond à de la biologie moléculaire mais morphologique : on regarde l'anomalieque dans les cellules tumorales. Il faut donc impérativement savoir ou elles sont. Il n'y a qu'une personne quisait où sont les cellules tumorales, c'est l'anapath. Sur la coupe de tissus, on va avoir de la bronche, des vaisseaux, des éléments inflammatoires, des alvéolesnormales... et des cellules tumorales. Si on cherche l'anomalie n'importe ou sans savoir ou elle est, on neregarde pas au bon endroit.

Par opposition à la biologie moléculaire non morphologique : le principe est different. On a une anomalie parexemple la mutation du gène kiras. Cette mutation n'est que dans les cellules tumorales. Ca nous autorise àprendre notre biopsie bronchique, à ne pas se soucier des cellules normales, des éléments inflammatoires car lamutation kiras ne sera que dans les cellules tumorales. Il n'est donc plus nécéssaire d'identifier histologiquementles échantillons.Il existe des dizaines et des dizaines de méthodes pour détecter une anomalie de type mutation.Le challenge a été très longtemps que l'on en savait pas extraire l'ADN des blocs de paraphine. Ca ne faut pastrès longtemps que l'on sait faire ça. Avant on y arrivait avec un rendement qui était calamiteux. Maintenant ony arrive beaucoup mieux et les techniques qui permettent de détecter les anomalies ont augmenter leursensibilité de façon incroyable. On est maintenant quasiment capable de séquencer une cellule.Le fait qu'il y ait 10% de cellules tumorales dans un fragment tissulaire n'est plus un problème pour détecter uneanomalie à condition que le prélevement n'ait pas trainé sur une paillasse pendant deux heures.Plus on avance dans ces techniques, plus c'est sensible.

On est maintenant capable de détecter à peu près n'importe quoi à partir de blocs de paraffine.Le bloc de paraffine est le cœur de la prise en charge des patients dans le service d'anapath.

À Marseille, c'est une exception car ce ne sont pas des services d'anapath qui s'occupent de cette technique làmais le service de biologie moléculaire du Professeur L'Houssine Ouafik. Les deux services d'anapath et celuide cytologie envoie dans ce service les prélèvements.

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Ce sont des lames colorés, et encerclées, les zones tumorales. La technicienne fait des lames blanches au bloc eton repère sur les lames blanches les zones. Il est évidemment dommage si il n'y a que deux foyers de 3mm surcette lame par exemple d'extraire la totalité car on appauvrit l'échantillon en cellule tumorale alors qu'encerclant on l'enrichit artificiellement.

Dans le service, ils vont récuperer la paraffine sur lame et ils vont faire leur extraction. On peut aussi puncherle bloc, c'est-à-dire au lieu de faire une lame étalée, on peut faire une lame de type carotte à l'aide de machinesqui font des forages dans le bloc. Toujours pareil, par rapport au repérage de la coupe histologique on va faireune biopsie du bloc pour transmettre un petit cylindre au service de biologie moléculaire.

C. Gestion des prélèvements

I- Notion de pré-analytique

La gestion des prélèvements c'est ce qu'on appelle la phase pré-analytique (les anapaths n'aiment pas trop ceterme car ils ne font pas trop d'analyse mais des examens, ils manipulent les pièces opératoires. C'est unedémarche médicale même s'ils travaillent sur un « bout » de malade).

La phase pré-analytique nous concerne directement avec les choix du fixateur, comment on va transmettrel’échantillon, on a la charge du remplissage du bon et éventuellement de repérer les pièces opératoires.

Cette phase pré-analytique c'est tout ce qui précède le moment où on met la lame sous le microscope.

Il y a donc une partie de la phase pré-analytique qui est interne au service et une part qui concerne le chirurgien.

Cette phase va tout conditionner.

On a trois grosses phases quand on examine un prélèvement tissulaire :– il y a la morphologie qui est le diagnostic de base– L'Immunogénicité : la conservation des immunos (antigènes) car dans un nombre significatif de cas les

immunos sont indispensables au diagnostic tumoral et indispensable à la prise en charge des patient :facteurs pronostics, marqueurs cytothérapeutiques.

– Intégrité de l'ADN : De plus en plus il faut que l'ADN dans ces blocs soit bien conservé (que ce soitpour la biologie moléculaire morphologique ou non).

Plus on avance, plus les critères de qualité requis sont importants.Si on laisse un tissu sur une paillasse, pour la morphologie ca peut passer, ca passera éventuellement pas pourl'immuno et c'est rédhibitoire pour l'examen de l'ADN.

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On fait également des fois des biopsies uniquement pour avoir des éléments cytothérapeutiques ou de biologiemoléculaire.

Un prélèvement n'est jamais anodin. Des patients meurent à cause d'une biopsie pulmonaire. Quand on estopérateur, il faut limiter un maximum les gestes invasifs. L'objectif est que l'anapath puisse faire un diagnostic àpartir du prélèvement.

Les parties prélèvement et transport incombent au chirurgien. Quand le prélèvement arrive dans le serviced'anapath, il va y avoir une phase d'enregistrement, une phase de fixation, d'enrobage, de coupe.

Transposé au laboratoire de biologie moléculaire il va y avoir la phase d'extraction de l'ADN et de l'ARN.

Toutes ces étapes correspondent à la phase pré-analytique.

Il y a une régulation précise et fine à faire dans le réglage des automates du service, dans comment on réalise lacoupe...

Ensuite il y a la phase analytique. Pour la biologie moléculaire c'est les machines qui font le séquençage. Pourl'anapath, c'est le corps médical qui fait l'examen au microscope.

En post analytique, il faut rendre un compte rendu qui comporte des parties d'anapath et des parties de biologiemoléculaire

II) Choix du fixateur

Un fixateur sert à empêcher qu'un tissu pourrisse en créant des ponts entres les protéines. Il en existe plein.

Le problème c'est que plus on ponte les protéines, plus on les dégrade.

On rentre dans une balance entre quelque chose qui est très pontant et qui va nous donner une morphologieidéale (c'est tellement fixé que les structures histologiques sont parfaites) et on plus on ponte, plus les antigèneset plus l'ADN va être dégradé, les protéines n'étant plus accessibles.

Il y a eu une longue période pendant laquelle on a essayer de jongler entre ces deux propriétés qui vont àcontre-sens l'une de l'autre : soit on a une belle morphologie, soit on a une bonne conservation des protéines.

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Le fixateur qui offre le meilleur compromis c'est le formol : c'est le fixateur historique, toutes les images quel'on a vu son issues de tissus fixés dans le formol. Si on fixe une thyroide dans le formol ou bien dans un autrefixateur qui s'appelle l'assa, le noyau n'a pas le même aspect.

Quand on change de fixateur, il faut réapprendre à lire les images, qui changent en fonction du fixateur.

Tout l'industrie de l'Immunohistochimie a toujours travailler sur des échantillons formolés. Tous les réactifsont été designés pour être adaptés aux éléments formolés. Quand le tissu est trop fixé, on sait défixer le tissupour rendre accessible ses antigènes. Le formol coûte peu cher.

On a l'obligation légale de garder un bloc de paraffine pendant 30 ans. Il apparaît maintenant des nouveauxtraitements tous les ans. Si on a une patiente qu'on a opéré d'un cancer du sein il y a 15 ans, et qu'on pensaitqu'elle était guérie, si elle revient avec une récidive de cancer du sein, à l'époque il y avait de l'Herceptine® oupas. On veut savoir si on peut lui donner de l'Herceptine®. On prend le bloc de paraffine et on prescrit uneindication thérapeutique à partir de ce prélèvement. Ce bloc sert au flux, il revient dans la boucle de travail trèsrégulièrement. Cependant cet archivage a des limites (on a jamais fait d'immunohistochimie sur desprélèvements d'il y a 30 ans car on pense que c'est beaucoup) mais l'idée est que ce bloc de paraffine est unearchive et le formol donne des archives à peu près acceptables.

La préservation des acides nucléiques : ça a été la cause lorsque la biologie moléculaire est arrivée en anapath,on ne savait pas bien extraire de l'ADN, on ne sait toujours pas extraire de l'ARN d'un bloc de paraffine et il y adonc eu des études qui sont lancées, tournées dans cette optique d'extraction des acides nucléiques des blocs deparaffine. C'est trop compliqué et cette recherche a été abandonnée par les labos.

Toxicité : le formol est classé cancérigène. Dans les labos d'anapath, dans toutes les pièces ou on manipule duformol, c'est aspiré, ce sont des pièces sous dépression...

Si on ne sait pas quoi faire d'un prélèvement, qu'on opère un malade en urgence qui est venu par exemple pourun ulcère perforé, et qu'il y a une tumeur que l'on ne connait pas, on met le prélèvement dans le formol. Cen'était peut être pas l'idéal pour ce cas précis, mais par défaut ça ne sera jamais rédhibitoire.

Par exemple, il y a 20 ans, on était obligé de congeler les tissus lymphomatiques car l'immunohistochimie nemarchait pas en paraffine. Maintenant, on a des anticoprs qui marchent bien en paraffine.

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Durée de fixation :

Evidemment que on ne fixe pas de la même façon une biopsie et un poumon entier.

Une biopsie se fixe très rapidement (pour certaines en mois de 6h). La durée moyenne pour une biopsie estcomprise entre 6 et 24h. Il existe un risque de sur-fixation. Si on la laisse 3 mois dans le formol, le formol vaponter, et on va être en sur-fixation. La sur-fixation est embêtante car elle modifie l'immunogénécité du tissumais c'est quelque chose contre lequel on est relativement équipé. On sait faire, on a des traitements quirégénèrent les antigènes quand ils sont présents.

La sur-fixation est donc embêtante mais pas rédhibitoire.

Pour une pièce opératoire, quand on mets un poumon ou un foie entier dans un bocal, d'abord il faut que lebocal ait une taille adaptée. Il faut que le formol puisse recouvrir la pièce. Le délais de fixation pour une pièceopératoire est de 36 à 72h. Il y a un risque de sous-fixation.

Quand on a des organes entiers, pleins, il faut les ouvrir afin de permettre la pénétration du formol dans tous lestissus car si on n'ouvre pas l'organe, l'intérieur va être pourri. Dans le service d'anapth, on va donc ouvrir lescolons, taillader la paroi, inciser l'organe pour faciliter la pénétration du formol. Sinon le formol ne pénètre qued'1 cm par 24h dans le tissu, et quand on a un organe plein, le temps qu'il arrive au centre de l'organe, le tissu apourri.

La sous-fixation est elle rédhibitoire. C'est évident que si le centre de la rate (par exemple) a fini par pourrir,aucun résultat ne pourra être obtenu.

Dans ces deux blocs contenant une prostate, on voit bien que le premier est parfaitement lisse, on a réussi àfixer, alors que dans le deuxième la prostate n'était pas assez fixée, le dessus a continué de pourrir, la paraffine acommencé à partir : c'est un tissu insuffisamment fixé et on va être incapable de faire une coupe sur ce bloc(pour faire une coupe ici, il va falloir faire une coupe de 10-15µm, ce qui va être compliqué à faire et à lire).

Le geste du chirurgien va juste être de mettre le prélèvement dans un pot contenant suffisamment de formolpour que le prélèvement soit dans de bonnes conditions.

Si on a un truc énorme mais qu'on a pas de pots, on envoie le prélèvement frais à l'anapath, et l'anapath sechargera du traitement au formol.

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III- Le bon de demande

Une fois qu'on a mis l'iléoctomie dans le bocal, il va falloir remplir un bon.

Lorsque le service d'anapath va recevoir le bocal, il ne connait pas l'histoire du patient et donc le remplissagedu bon est quelque chose d' absolument fondamental.

Sur le bon :

– L'entête du service : Dans cet exemple, on est dans une institution où il y a deux services d'anapath.. Sion est médecin libéral, on peut adresser le prélèvement à plusieurs laboratoires d'anapath.

– L'identité du patient : fondamental et ses coordonnés (notamment pour être payé)

– Le prescripteur : également indispensable.

Si on est gastro-entérologue et que c'est un collègue dermatologue qui nous a adressé le patient pourqu'on lui fasse une fibroscopie, on est l'opérateur sur un patient que l'on ne connait pas vraiment. On vaquand même recevoir un compte rendu mais il faut aussi que le médecin qui a demandé l'examenreçoive également le compte rendu. C'est la différence entre le prescripteur et celui qui réalise l'examen.Ce n'est pas forcément la même personne, et ce n'est pas forcément la même équipe soignante .

– Le type de prélèvement : biopsie, exérèse, pièce opératoire, cytologie, congélation...

– Le type de conditionnement : Quand on fait une lobectomie pulmonnaire avec un curage intestinal, onfait la lobectomie et puis on va faire les sites ganglionnaires 2R, 4R, 7, 9 … Sur le bon il faut la listeprécise de tous les prélèvements qu'on a réalisé . Quand les prélèvements arrivent dans le service, il fautimpérativement qu'il y ait : la liste avec l'intitulé et le bon nombre de pots. La première chose quand unprélèvement arrive dans le laboratoire, c'est la vérification du bon nombre de pots.

– La liste des prélèvements réalisés

– Les renseignements cliniques

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Exemple de bon bien rempli :

Il a été fait au CHU Nord, dans le bloc étoile, le n° d'UF, dans telle salle, avec le numéro de téléphone de lasalle, par le Dr …. C'est un prélèvement qui est fixé, un pot intitulé « colectomie droite ».

Sur le bon il y a aussi l'histoire du patient (patient de 29 ans, qui a été opéré d'un cancer du côlon et dont lamère a été opéré d'un cancer du colon à 45 ans et dont la tante est morte d'un cancer du colon à 26 ans. Ce n'estdonc pas n'importe quel cancer du côlon. C'est un sujet jeune ).

Il est donc important de préciser sur le bon l'histoire familiale. L'anapath va donc chercher sur le prélèvementles instabilités et les marqueurs, non seulement d'un cancer lambda du colon mais aussi spécifiques etfamiliaux. S'il manque des informations sur le bon, l'napath risque de ne pas faire tous les examens qui seraientnécessaires.

IV- Orientation des pièces opératoires

Il y des pièces opératoires qui sont faciles à identifier.

C'est facile de définir l'orientation de certains organes, commela prostate par exemple.

Au contraire, lorsque l'on fait une tumerectomie, on fait uneincision la plus petite possible.

La question, lorsque l'on a la tumeur, est de savoir s'il s'agit d'unsein droit ou d'un sein gauche. On ne peut pas savoir avec lapièce opératoire seule (elle n'est pas reconnaissable).

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Il faut impérativement sur ce type de lésion que le chirurgien fasse un repérage de la pièce opératoire. Cerepérage est obligatoire et indispensable et il doit être fait tout de suite.

Après fixation et traitement, il est quasiment impossible de reconnaître l'orientation d'une pièce opératoire.

On peut mettre un fil au pôle supérieur. Ca ne suffit pas.

On peut mettre deux fils au bord extérieur. Cependant, on ne sait toujours pas ou estl'avant ou l'arrière de la pièce.

Pour orienter une pièce extraite d'un cancer du sein, il faut trois marqueurs : sur lecoté, et deux autres plans de l'espace. Il faut que ce soit fait directement, aprèsl'extraction, sur le champ opératoire.

Après dissection de la pièce, on ne retrouvera pas les fils. Ils permettent juste de poser la pièce opératoirecorrectement sur le plan de travail.

Il y a également la possibilité d'encrer la pièce opératoire, en utilisant de l'encre de chine. Les colorationsdépendent des services, avec l'existence de codes couleurs selon les services.

Reconnaitre la face superficielle est facile quand il y a la peau mais plus complexe lorsqu'il n'y a pas la peau.L’intérêt est que l'encre va rester sur la coupe histologique. Quand on va regarder la coupe au microscope, on vavoir que le tissu est tatoué d'encre, et si l'encre est bleue par exemple, on sait qu'on est au bord supérieur de lapièce.

L'encrage est à la charge de l'anath mais l'orientation initiale de la pièce opératoire est incontestablement à lacharge du chirurgien.

Il faut bien penser que la pièce opératoire va être modifiée en labo. Lorsque l'on coupe un œsophage parexemple, il va se rétracter sous l'effet de la contraction des muscles et il va être difficile à identifier. L'ajout duformol peut également modifier la couleur de la pièce qui devient marron.

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D. L'examen extemporané

La biopsie exérèse est un examen qui est un petit peu à part . Elle se fait en situation d'urgence, mais c'est uneurgence programmée.L'examen extemporané est un avis donné par un pathologiste à partir d'un fragment tissulaire frais, nécessaire àl'optimisation d'un geste chirurgical en cours.Lorsque le chirurgien est en salle opératoire et qu'il a besoin d'un renseignement pour compléter son geste.

L'anapath reçoit un fragment, une biopsie en général (le chirurgien peut donner la pièce opératoire mais c'estplus rare) qui a été repéré à l'aide d'un fil. Le chirurgien attends la réponse de l'ananpath pour continuer songeste.

On pose 3 types de questions à l'anapath :

– la question la plus évidente mais qui est en train de diminuer : le type histologique.

Dans l'exemple d'un poumon, quand quelqu'un a besoin d'une image radiologique, on peut faire unefibroscopie. La fibroscopie ne va pas jusqu'au bout, elle s'arrête à la deuxième ramification. Si la tumeurse situe plus loin que ça, l'endoscope ne peut pas y aller, il n'y a donc pas de possibilité de biopsie. Si latumeur est plaquée contre la paroi, les radiologues peuvent y avoir accès en faisant une ponction trans-thoracique.

Si c'est trop loin dans le parenchyme pulmonaire, c'est plus difficile. Dans le poumon, il y a un espècede no man's land entre ce que peuvent attraper les radiologues et ce que peut attraper une fibroscopie.

Le chirurgien démarre son intervention en disant : c'est très probablement un cancer mais sans en êtresûr. Si c'est une lésion tuberculeuse, calcifiée... théoriquement, il n'y a pas d'indication tumorale et iln'est pas nécessaire de faire à un patient atteint de la tuberculose une lobectomie avec curageganglionnaire. Puisqu'on a pas d'autres moyens diagnostics, on va enlever la lésion et c'est tout. Si c'estun cancer, on va faire un geste carcinologique, en l'occurence une lobectomie. La diagnostic porté parl'anapath va permettre de choisir le geste que l'on va faire : lobectomie ou raclage.

La biopsie exérése a donc un but diagnostic. C'est en diminution car les possibilités d'investigationssont de plus en plus sophistiquées et le nombre de patients qui vont à la chirurgie sans diagnosticdiminue. Avant on faisait des extemporannées sur toutes les tumeurs du sein, tandis que maintenant,95% sont biopsisé. Le chirurgien sait donc qu'il opère un cancer du sein avant. C'est pendant l'opération,en fonction de si le cancer était bénin ou malin, que le chirurgien décide de poursuivre ou non son geste.

– Confirmer la qualité des limites d'exérèse. Il y a des conditionsdans lesquelles on fait une tumerectomie du sein. On ne va pasestropier une patiente sous prétexte qu'elle a un cancer de 1 cm, etque la possibilité de guérison est extrêmement élevée. On ne vapas délabrer son enveloppe corporelle alors que ce n'est pasnécessaire. L'idée est de faire la juste chirurgie, faire ce qu'il fauten carcinologie, mais sans impacter sur la vie future de la patiente.On enlève juste ce qu'il faut. Dans l'idéal ce que l'on veut obtenir,c'est une tumeur entière avec le tissu autour. Des fois, on obtientune biopsie qui n'est pas centrée, et qui ne contient pas forcémentl'intégralité de la tumeur. À ce moment là, ce que l'on va se demander c'est si est ce que la tumeur est aucontact direct de la limite, au quel cas on va enlever un petit peu plus de tissu.

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– Avis sur la représentativité du matériel prélevé. Cette indication concerne les patients qui ont étéponctionnés à plusieurs reprises et sur lesquels à chaque fois, on a pas réussi à faire de diagnostic. C'estle cas de certaines tumeurs très spécifiques, sur lesquelles on aurait pas assez de matériel, et donc surlaquelle on a pas pu faire toute l'immunohistochimie. Il y a des situations extrêmement complexes, ou ilfaut quand même porter un diagnostic. C'est généralement des tumeurs rares et très importantes, que l'onne peut pas enlever. L’objectif de la chirurgie est donc de prendre un prélèvement sur lequel on vapouvoir faire un diagnostic.On ne demande pas un diagnostic extemporanément mais est ce que lematériel extrait est suffisamment important pour la pose du diagnostic.

La technique standard d'anapath ne permet pas de produire une lame histologique en moins de 18h-24h.

Cette fois il faut le faire en ¼ d'heure. On va donc devoir couper le bout. Le seul moyen que l'on a est decongeler le bout à l'aide d'un cryostat. C'est exactement comme un microtome sauf que le bout est dans uneenceinte réfrigérée à -20°C. À chaque fois que l'on fait un tour de manivelle, on fait une petite coupe (onarrivera pas à couper à 5µm mais on aura des coupes de 6, 7 ou 8 µm).

On a pas le temps de faire une coloration HPS. On va donc faire une coloration bleue.

L'examen extemporané correspond à l'examen où le stress de l'anapath est le plus élevé.

Il y a 3 minutes de techniques pour que la coupe puisse être regardée au microscope. Le problème, c'est que lesimages que l'on va avoir n'ont rien à voir en terme de qualité. C'est un exercice périlleux.

Coupe bronchique : la tumeur est au ras du bout. On ne conçoit pas derefermer le malade sans avoir enlever la totalité de la tumeur. L'examend'anapath permet d'examiner l'anneau cartilagineux et de dire parexemple : la tumeur est proche de la limite de la biopsie, mais la limite estsaine donc le prélèvement est suffisant ou s'il est nécessaire de compléterle gestes (il n'y a évidement rien à voir pour le patient entre unelobectomie et une pneumonectomie totale en terme de morbidité et dedécès post opératoires).

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Les limites de la biopsies exérèse sont nombreuses, c'est une technique d'urgence :

• Liés à la technique : Vite et bien ne font pas bon ménage.

- Coupes réalisées de moins bonne fiabilité que en technique standard.

- Prélèvement difficile à couper (gras, calcifications, notamment s'il est un peu ossifié…).

• Liés au prélèvement

- Absence de lésion palpable (si le prélèvement est trop petit, et que la lésion dépasse sur la pièceopératoire. Le prélèvement peut ne pas inclure la lésion recherchée)

- Lésion trop petite (<5mm)

• Liés à la lésion

- Lésions d’interprétation difficile en extemporané voire même au définitif. En fonction de la naturetumorale. Il y a des tumeurs qui sont de diagnostic facile, et il y a des tumeurs que le spécialiste n'aurajamais vu, et l'analyse sera impossible en extemporané. Si on ne sait pas, le chirurgien doit prendre sadécision : soit il considère que c'es bénin et il arrête le geste opératoire en attendant le résultat final, soitil considère que c'est malin et poursuit le geste opératoire. Quand on hésite, les anapaths préfèrentsupposer que c'est bénin, car il est plus facile de revenir sur un malade.

• Liées à l’indication

- Lésions primitive ou métastatique ? Certaines questions ne peuvent pas avoir de réponse enextemporané, car on a besoin d'immunohistochimie par exemple.

La priorité absolue est le contrôle histologique qui est l'examen maître. Il faut s'efforcer de conserver dumatériel intact (non congelé) pour un examen morphologique fiable après fixation.

La probabilité d'arriver à faire un bon prélèvement diminue avec la complexité. Plus on insiste en biopsieexérèse, moins il restera de choses pour le contrôle histologique qui lui est essentiel (on ne fait l’extemporanéequ'à condition que l'on puisse faire l'examen histologique après).

L'archivage des tissus pour les travaux de recherche :

La recherche est entrée de plein pied en cancérologie. L'ADN fait partie du diagnostic des tumeurs des patients(on ne sait toujours pas faire avec l'ARN ni avec les protides) :

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Il y a deux formes d'archivage :

– la paraffine, qui est une technique que l'on maitrise bien. Il suffit d'avoir une pièce à températureambiante, à température maitrisée pour stocker la paraffine.

– L'azote liquide. Cette technique est beaucoup plus compliquée. Si l'on devait congeler des tumeurs lestumeurs dans de l'azote, ça couterait très cher et c'est très difficile à archiver. Il y a encore quelquesdémarches de CRB (Centre de Recherche Biologiques), il y a de l'archivage congelé mais c'est rare.Biensûr la qualité de l'archivage n'a rien à voir : on peut faire de l'ARN, des fois des protéines mais cesont deux mondes qui sont très séparés, le monde de la paraffine étant accessible à tous tandis que lemonde de la congélation est plus compliqué.

Maintenant qu'on a accès au génome des patients, il y a la nécessité absolue de recueillir le consentement écritdes patients pour congeler leur prélèvement et pour l'archivage.

En conclusion :

Il y a un gros enjeu sur le prélèvement tissulaire, ils sont de plus en plus lourds, de plus en plus complexes. Ilsfournissent de plus en plus d’informations indispensables à la prise en charge des patients. L'idée est detendre vers une médecine personnalisée, de donner un maximum de renseignements sur un prélèvementtissulaire donner de manière à évidemment avoir un diagnostic (c'est le minimum) mais également à avoird'autres renseignements (le traitement qui convient à ce patient donné). Tout ça est centré sur le prélèvementréalisé par le chirurgien, qui a donc une part de responsabilité sur la qualité du prélèvement.

Il n'y a pas beaucoup de contraintes à respecter lors d'un prélèvement : remplissage du bon, fixation correcte ettransmission au laboratoire dans de bonnes conditions.

Ils doivent faire l’objet de grandes précautions dès leur réalisation.

Dédicace tout d'abord à ma VP son et image sans laquelle ce ronéo aurait été un enfer ! Pensée spéciale à marelectrice préférée (qui ne me relit même pas!) et à mini-chériiiiiie pour ces moments de cuisine géniaux (vousme sauvez!). A ma coloc d'amour (que je n'ai pas oubliée) pour cette année superbe et enfin au bus del'amour ! (Carpache lalalala <3)

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BIOPATHOLOGIE TISSULAIRE : ILLUSTRATIONS ET …©lévements… · – 6 x 2h de cours magistraux...

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