Clonage Molculaire

DfinitionsClonage:Obtenir un morceau dADN partir de la source originale (Gnome) et lintroduire dans un vecteur dADNSous-clonage:Transfre dune insertion dADN clon ou une partie de ce dernier dun vecteur un autre vecteurPlasmide recombinant:Vecteur dans lequel un ADN tranger a t introduitOrganisme recombinantOrganisme dans lequel un vecteur recombinant a t introduit

*Pourquoi cloner?Sparer, identifier, manipuler ou exprimer un fragment spcifique dADN

tape 1- SparerDeux approches:Fragmenter/digrer lADN gnomiqueGnre un trs grand nombre de fragmentsPeut-tre difficile de retrouver le fragment dintrtAmplification par PCRBeaucoup moins de fragments Beaucoup plus facile de retrouver la squence dintrt

1 plasmide/1 celluleCloner

Amplification des Plasmides Recombinants

Criblage et Identification de Clones Recombinants PlasmidiquesCartographie de restrictionHybridationPCR

ExpressionPourquoi?Produire la protine dans un systme htrologueProduire la protine en grande quantitPurifier la protinetudier lactivit de la protine

Amplification, Mutagense, Clonage & Expression de LacZ Projet IIPartie IAmplification & mutagense par PCR du gne LacZPartie IIClonage de LacZ dans pUC19Partie IIIEsai enzymatique des protines recombinantes

Purification & Digestion de l Amplicon Mel 1Purification par QiaQuickPermet de retirer le tampon, sels, etc.Permet de retirer les amorcesPermet de retirer lenzymeDigestionSites de restriction BamHI et EcoRI ont t ajouts la squence de lampliconAbsent dans la squence de Mel 1Prsent dans le site de clonage multiple du vecteur dexpression (pRS424)Permet le clonage dirig