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Biologie Cellulaire &
Biologie Moléculaire
L3 UE 5.2 EP1 2014-‐2015
Cours n° 5 : Mercredi 17 septembre 14h-‐16h Chap. II Chromosome, épigénéFque, réparaFon, domaines régulateurs
Variabilité de lecture des modificaFons post-‐traducFonnelles
100 Nat Struct Mol Biol. 2012 Dec;19(12):1218-‐27. doi: 10.1038/nsmb.2436. Perceiving the epigeneFc landscape through histone readers. Musselman CA1, Lalonde ME, Côté J, Kutateladze TG.
ReproducFon effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisaFon du C.F.C -‐ 20, rue des Grands AugusFns –75006 Paris
Conséquences : entraine une variabilité des actions moléculaires résultantes Permet une dynamique spatio-temporelle des actions sur la chromatine
PHD CD Tudor
BD
14.3.3
• Domaine structural de reconnaissance des histones acétylées
• Présent dans les : – histone acétyltransférases – sous-‐unités ATPase de certain complexes de remodelage des nucléosomes
• Exemple : reconnaissance de H4K16ac, H3K4ac
• NoFon de reconnaissance régulatrice plus élaborée telle qu’une « Double interacFon ».
Owen DJ EMBO J. 2000 November 15; 19(22): 6141–6149. 101
InteracFon coopéraFve avec 2 acétylaFons (H4K5acK8ac)
102 ReproducFon effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisaFon du C.F.C -‐ 20, rue des Grands AugusFns –75006 Paris
Combinatoire de « lecture » du « code histone »
103 Nat Struct Mol Biol. 2012 Dec;19(12):1218-‐27. doi: 10.1038/nsmb.2436. Perceiving the epigeneFc landscape through histone readers. Musselman CA1, Lalonde ME, Côté J, Kutateladze TG. ReproducFon effectuée par l’Université François Rabelais de Tours
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Gain de précision, de spécificité et de contrôle spatio-temporel
Lecture : Typologie des modes de reconnaissance ex. Facteur HP1
Ruthenburg et al. (2007) Nature Reviews Molecular Cell Biology 8:983-‐994.
facteur HP1 : Hétérochromatine protéine 1 Chromodomaine/H3K9me3 Action de formation et de propagation de l’hétérochromatine
Outils d’étude de la dynamique chromatinienne
« Code Histone » : huit « MPT » marquantes MéthylaFon • H3K4me3 Promoteurs acFvement transcrits, en parFculier juste après le site
d’iniFaFon. La déméthylaFon entraine l’exFncFon de l’expression (silencing de la région génomique)
• H3K36me3 Gène acFfs au plan transcripFonnel
• H3K9me3 Gènes consFtuFvement réprimés (hétérochromaFne consFtuFve ) • H3K27me3 Gènes facultaFvement réprimés
(Couplage :
H4K20me3 avec H3K9me3, H3K27me3
AcétylaFon • H3K9ac Promoteurs acFfs.
• H3K14ac Promoteurs acFfs • H4K16ac ChromaFne transcripFonnellement acFve
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Déchiffrage du fonctionnement de ce code : Technique 3 :Immuno-précipitation de la chromatine
Dans le cadre d’un Modèle expérimental
Sce I
H. M. O’Hagan, PLoS Genet 4(8): e1000155. doi:10.1371/journal.pgen.1000155
R
R
1 Gène acFf 2 Répresseur exprimé
3 Gène Sce I réprimé
4 Tétracycline = inducteur
R 5 Gène Sce I exprimé
Cellules MDA-‐MB-‐231
7 coupure ADN double brin
9 Réponse cellulaire : préparaFon à la réparaFon
6 Gène acFf
8 Expression de HSVTK abolie
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Indu
Modèle : Système rapporteur inducFble de clivage double brin unique : « Double Strand Breaks »
Induction (par la tétracycline) de l’expression de l’endonucléase I-SceI sous forme de protéine de fusion avec l’hémaglutinine A ou HA
Induit une coupure unique au niveau d’un gène chimérique : promoteur CDH1/HSVTK
I-SCeI-HA
Thymidine kinase virale exprimée
Modèle « DSB » : Analyse des modificaFons des histones au site de coupure
• Présence d’isoforme d’Histone (H2AX)
• Présence de modificaFons épigénéFques – H2AX – H4K16 – H3K9 – H3K27
• FixaFon d’une dé-‐acétylase • FixaFon d’ADN méthyltransférase
Technique : ImmunoprécipitaFon de la chromaFne
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Technique 3 : ImmunoprécipitaHon de la ChromaHne
ChIP Chroma5n Immunoprecipita5on
1 Traiter éventuellement les cellules par un agent de réHculaHon protéines-‐ADN
2 PurificaFon de la chromaFne naFve (ou réFculée)
3 FragmentaFon de la chromaFne (ultrasons : 0,2 à 1 kpb)
4 Immuno-‐précipitaFon par un anFcorps spécifique d’une protéine (ou d’une modificaFon de protéine : acétylaFon, méthylaFon, phosphorylaFon, …)
5 PurificaFon de l’ADN immuno-‐précipité (après chauffage si réHculaHon)
6 Analyse par : PCR et électrophorèse (ou puces ADN approche globale, ou séquençage pour idenFficaFon)
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Objectif de la technique : Identifier la présence d’une protéine ou d’une modification post-traductionnelle sur une séquence spécifique d’un génome. (étude globale ou gène spécifique)
Enchainement de deux techniques IP et PCR ?
ChIP Principe
PCR et électrophorèse ReproducFon effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisaFon du C 20 rue des Grands AugusFns 75006 Paris . F. C.
• QuanFficaFon/Séquence • Spécifique/Global
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IP
2 : PCR couple d’amorce pour le promoteur (ou la séquence ADN) étudié
1 : AnFcorps pour le phénomène étudié
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ChIP Deux éléments majeurs
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Types d’immunoprécipitaFon
Non Histone ChIP Histone ChIP
Etude en plusieurs expériences (certaines facultaFves) 111
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Mécanisme Modification épigénétique
1-‐ « DSB » : InducFon de phosphorylaFon de H2AX près du site de clivage ADN par « ChIP »
H. M. O’Hagan, PLoS Genet 4(8): e1000155. doi:10.1371/journal.pgen.1000155
ChIP Amorces
AnEcorps
Contrôle
Contrôle
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Analyse
Distance d’analyse par PCR avec le site de coupure variable
amorces
Immuno-‐PrécipitaFon de la ChromaFne (ChIP)
Dynamique du nucléosome:(6) Variants d’Histones
CENP-‐A : centromère H3.1 : RéplicaFon H3.3 EuchromaFne : gènes acFfs
H2A.X (réparaFon ADN) H2A.Z (zones transcrites) MacroH2A (répression transcripFon)
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localisaFon Histone macroH2A
Thèse CMC Doyen 114
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Technique 4 : Western blot
western blot : détecEon de protéines
•1• DénaturaFon des protéines cellulaires (ou de l’échanFllon) •2• Electrophorèse en gel de poly-‐acrylamide SDS •3• Transfert sur membrane (ex. nitrocellulose) •4• IncubaFon avec un anFcorps spécifique •5• RévélaFon
Contrôles : Coloration d’un gel témoin (bleu de Coomassie : quantités protéiques identiques) Coloration de la membrane (validation transfert : Rouge Ponceau) Incubation de la membrane avec une anticorps spécifique d’une protéine à taux cellulaire constant (validation dépôt et transfert).
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2-‐ DétecFon : phosphorylaFon histone H2AX
H. M. O’Hagan, PLoS Genet 4(8): e1000155. doi:10.1371/journal.pgen.1000155
Western blot
AnEcorps anE :
Contrôle
AnEcorps anE HemagluEnine A
« CriFcal for recogniFon and repair of DNA damage » 116
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Contrôle
Western blot
A. P. Tabancay Jr. , S. L. Forsburg EukaryoEc DNA ReplicaEon in a ChromaEn Context Current Topics in Developmental Biology Volume 76 2006 129 -‐ 184
Chaperon Moléculaire d’Histones
Les chaperons moléculaire d’histones amènent et échangent des paires d’histones pendant la réplicaHon,
la transcripHon ou la réparaHon :
ASF1 pour la paire H3/H4 Echange et éliminaFon d’histones (AnH-‐silencing funcHon protein 1)
Aussi uHle pour acétylaHon de H3K9 et H3K56 ReproducFon effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisaFon du C 20 rue des Grands AugusFns 75006 Paris . F. C.
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3-‐ Statut de H4K16 et fixaFon de SIRT1 au site de coupure
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H. M. O’Hagan, PLoS Genet 4(8): e1000155. doi:10.1371/journal.pgen.1000155
ChIP
SIRT1 : H4K16ac déacétylase
H4K16ac : gène acFf
118 contrôle
Immuno-‐PrécipitaFon de la ChromaFne (ChIP)
4 -‐ Analyse de marqueurs de « Silencing »
H. M. O’Hagan, PLoS Genet 4(8): e1000155. doi:10.1371/journal.pgen.1000155
ChIP
anFcorps
Signal de base non spécifique
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Fin du cours n° 5
Immuno-‐PrécipitaFon de la ChromaFne (ChIP)