Biologie Moléculaire LIVRE

of 204/204
Université Paris-VI Biologie Moléculaire Objectifs au cours de Biochimie PCEM1 2006 - 2007 Pr. C. Housset ([email protected]) Pr. A. Raisonnier ([email protected]) Mise à jour : 16 juin 2006 Relecture : Pr. A. Raisonnier
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  • Universit Paris-VI

    Biologie Molculaire

    Objectifs au cours de

    Biochimie PCEM1

    2006 - 2007

    Pr. C. Housset ([email protected])Pr. A. Raisonnier ([email protected])

    Mise jour : 16 juin 2006Relecture : Pr. A. Raisonnier

  • 2/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

  • Plan du cours

    Plan du cours2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 3/204

    3 Plan du cours

    9 Objectifs PCEM1 commun DHU Paris-Est

    15 Partie I : La structure des acides nucliques

    17 Chapitre 1 : Molcules simples

    18 1.1 Phosphates19 1.2 Ribose, dsoxyribose20 1.3 Purine, Pyrimidine21 1.4 Bases puriques22 1.5 Bases pyrimidiques23 1.6 Nuclosides et nuclotides24 1.7 Nomenclature des units nuclotidiques25 1.8 Adnosine26 1.9 Dsoxyguanosine27 1.10 Uridine MonoPhosphate28 1.11 Dsoxythymidine MonoPhosphate29 1.12 Adnosine Tri Phosphate30 1.13 Dsoxycytidine Tri Phosphate31 1.14 Liaisons hydrogne32 1.15 Hybridation A - T33 1.16 Hybridation G - C

    35 Chapitre 2 : Les acides nucliques

    36 2.1 Acide ribonuclique37 2.2 Les extrmits 5 et 3 dun acide nuclique38 2.3 Structure secondaire du RNA39 2.4 Acides ribonucliques40 2.5 Acide dsoxyribonuclique41 2.6 La double hlice (modle rubans)42 2.7 La double hlice (travers)43 2.8 La double hlice (axe)44 2.9 Surenroulement45 2.10 Nuclosome46 2.11 Fibre de chromatine47 2.12 Condensation et hydrolyse des nuclotides48 2.13 Complmentarit des bases

  • Plan du cours

    49 Partie II : Biosynthse des macromolcules4/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    53 Chapitre 3 : DNA Dfinitions

    54 3.1 La double hlice55 3.2 Squence dun gne (apoA-II)56 3.3 Gne57 3.4 Expression dun gne

    59 Chapitre 4 : La transcription

    60 4.1 Transcription61 4.2 Promoteur62 4.3 Brins sens et antisens63 4.4 Rgulation de lexpression64 4.5 Cis et trans rgulateurs66 4.6 DNA binding proteins67 4.7 Interaction Protine DNA68 4.8 Rcepteurs nuclaires69 4.9 Rgulation du jene70 4.10 Rgulation de leffort71 4.11 RNA polymrase II72 4.12 Initiation de la transcription73 4.13 Liaison TFIID sur le DNA74 4.14 Rgulation de la RNA polymrase75 4.15 Elongation de la transcription76 4.16 Elongation de la transcription77 4.17 Discontinuit des gnes78 4.18 Exon79 4.19 Exon 180 4.20 Fin de la transcription81 4.21 Modifications du transcrit82 4.22 Enzyme coiffante83 4.23 Coiffe dun messager84 4.24 Queue polyA85 4.25 Le transcrit primaire86 4.26 Excision - pissage87 4.27 Formation du lasso88 4.28 Epissages alternatifs89 4.29 Maturation des RNA ribosomiques90 4.30 Stabilit du messager91 4.31 Messager

  • Plan du cours

    93 Chapitre 5 : La traduction

    94 5.1 Traduction2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 5/204

    95 5.2 Expression dun gne96 5.3 Signifiants97 5.4 Codon98 5.5 Code gntique99 5.6 Code gntique100 5.7 Code dgnr101 5.8 Ribosome eucaryote102 5.9 Polyribosome103 5.10 RNA de transfert (trfle)104 5.11 RNA de transfert (ruban)105 5.12 Activation dun acide amin106 5.13 Srine tRNA synthtase107 5.14 Cystine tRNA synthtase108 5.15 Initiation de la traduction109 5.16 Cadre de lecture110 5.17 Elongation de la traduction111 5.18 Incorporation dun acide amin112 5.19 Transfert du peptide113 5.20 Translocation des codons114 5.21 Liaisons riches en nergie115 5.22 Terminaison de la traduction116 5.23 Signal-peptide117 5.24 Polyribosomes lis118 5.25 Carboxylation de lacide glutamique119 5.26 Modifications post-traductionnelles

    121 Chapitre 6 : La rplication

    122 6.1 Rplication123 6.2 Le cycle cellulaire124 6.3 Chromatine et ADN125 6.4 Rplication semi-conservative126 6.5 Synthse et hydrolyse du DNA127 6.6 DNA polymrase128 6.7 DNA polymrase (exonuclase 35)129 6.8 DNA polymrase : fonction ddition130 6.9 Boucle de rplication131 6.10 Fourche de rplication132 6.11 Topoisomrase I133 6.12 Primase134 6.13 DNA ligase135 6.14 Tlomrase

  • Plan du cours

    137 Chapitre 7 : La rparation

    138 7.1 Rparation6/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    139 7.2 Bases endommages140 7.3 Excision de base141 7.4 Msappariements142 7.5 Transmission du msappariement143 7.6 Excision de fragment long144 7.7 Modle Holliday145 7.8 Crossing-over

    147 Partie III : Les vnements gntiques

    149 Chapitre 8 : Substitutions

    150 8.1 Substitution151 8.2 Somatique, germinale152 8.3 Faux-sens, non-sens153 8.4 Polymorphisme Xba I de lapoB154 8.5 Marqueur gntique

    155 Chapitre 9 : Mutations

    156 9.1 Mutation157 9.2 Mutation Arg3500Gln de lapoB-100

    159 Chapitre 10 : Insertions - dltions

    160 10.1 Dltion161 10.2 Dcalage du cadre de lecture162 10.3 Dltion Phe 508 de CFTR163 10.4 Dltion de lexon 9 de la lipoprotine-lipase164 10.5 Mutation dun site dpissage165 10.6 Insertion

    167 Chapitre 11 : Transpositions

    168 11.1 Transposition169 11.2 Squence Alu170 11.3 Virus171 11.4 Cycle dun rtrovirus172 11.5 Duplication de gne173 11.6 Pseudogne

  • Plan du cours

    174 11.7 Conversion de gne2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 7/204

    175 Partie IV : Lvolution

    177 Chapitre 12 : Divergence

    178 12.1 Divergence

    179 Chapitre 13 : Familles de gnes

    180 13.1 Famille de gnes181 13.2 Gnes des -globines182 13.3 Famille des -globines

    183 Partie V : Le DNA au laboratoire

    185 Chapitre 14 : Mthodes dtude

    186 14.1 Extraction et purification du DNA187 14.2 Synthse dun cDNA188 14.3 Electrophorse de DNA189 14.4 Hae III (enzyme de restriction)190 14.5 EcoR I191 14.6 Polymorphisme de restriction192 14.7 Polymorphisme Msp I de lapoA-II193 14.8 Cartes de restriction194 14.9 Hybridation dune sonde195 14.10 Calcul de la Tm196 14.11 Sonde hybride197 14.12 Sonde spcifique dallle (ASO)198 14.13 Southern blot200 14.14 PCR201 14.15 Didsoxyadnosine triphosphate202 14.16 Raction de squence203 14.17 Squenage dADN204 14.18 Gel de squence

  • Plan du cours8/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

  • Objectifs PCEM1 commun DHU Paris-Est

    Objectifs PCEM1 commun 2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 9/204

    DHU Paris-EstBiologie molculaire : tude des acides nucliques

    Objectifs Gnraux1. Sur la base dune bonne connaissance de la structure et des proprits des acides nu-

    cliques, ltudiant doit avoir assimil les grands principes de base impliqus dans latransmission et la rparation du matriel gntique, ainsi que lexpression des gneset sa rgulation.

    2. Ltudiant doit tre capable dinterprter des rsultats exprimentaux obtenus par lestechniques les plus courantes de biologie molculaire appliques la recherche bio-mdicale ou lexploration de matriel gntique par les laboratoires de biologie m-dicale.Ltudiant doit ainsi avoir acquis les bases ncessaires la comprhension ultrieuredes mcanismes molculaires de la physiopathologie ou de laction des mdicaments.

    Structure et fonction des acides nucliques

    Connatre la structure des acides nucliques, savoir reconnatre1 les molcules sim-ples dont ils sont constitus, les classer daprs leurs proprits ou leurs fonctions.

    Cette partie ncessite la reconnaissance des structures de lacide phosphorique, du riboseet du dsoxy-ribose, des bases puriques et pyrimidiques.Ltudiant doit savoir reconnatre nimporte quelle base, nucloside, nuclotide ou nuclo-side polyphosphate. Il doit savoir identifier les liaisons riches en nergie des nuclosidespolyphosphates et distinguer les groupements phosphates (, , ) prsents dans ces mol-cules.Il doit savoir interprter et manipuler les diffrentes reprsentations de la structure primairedu DNA et du RNA, prciser la nature des liaisons impliques dans lenchanement des nu-clotides, distinguer une extrmit 5 dune extrmit 3 et manipuler les units de taille(kb, kpb, Mpb...).Sur des schmas qui lui seront prsents, il doit savoir reconnatre les liaisons impliquesdans la complmentarit des bases ainsi que les lments structuraux essentiels dune dou-ble hlice de DNA, de la chromatine ou des diffrentes espces de RNA.Connaissant la composition en bases de deux DNA de mme taille, il doit savoir prdire lesdiffrences de temprature de fusion et expliciter les raisons de leur choix.

    1. Savoir reconnatre

    corps chimique : nommer un corps dont on voit la formule dveloppe ;raction : dsigner lenzyme au vu de lquation chimique ;voie mtabolique : dsigner la voie mtabolique au vu de son bilan chimique.

  • Objectifs PCEM1 commun DHU Paris-Est

    Mthode dtude des acides nucliques Connatre les mthodes permettant dtudier le DNA des malades (obtention, purifi-10/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    cation, conservation) y compris dans leur aspect thique. Dcrire lactivit de quelques enzymes qui permettent ltude des acides nucliques et

    tre capable de montrer leffet de ces enzymes sur un exemple dtaill (squencedacide nuclique). Cet objectif comprend au moins les activits des endonuclases derestriction, les polymrases, les ligases et les topoisomrases.

    Expliquer le mcanisme de lamplification du DNA par PCR (il ne sagit pas des m-thodes ou des techniques, seulement du principe qui est utilis).

    Expliquer le principe de la PCR et de la RT-PCR Enumrer les principaux constituants du milieu de raction dune PCR Citer un exemple dapplication de la PCR en diagnostic mdical

    Donner un exemple1 de diagnostic fond sur une variation de longueur de fragmentsdacides nucliques (RFLP).

    Enumrer les facteurs qui permettent lhybridation de deux brins dacides nucliques. Savoir interprter2 les rsultats dune technique dhybridation avec une sonde

    (Southern ou Northern blots, puces DNA) et son application un diagnostic. Expliquer le mcanisme dun squenage dacide nuclique. Donner un exemple de prparation et dutilisation dun DNA complmentaire.

    Sans avoir mmoriser les dtails des modes opratoires, ltudiant doit avoir acquis la no-tion que des mthodes simples permettent dextraire et de purifier, partir de cellules euca-ryotes, les diffrentes formes de DNA et de RNA quelles renferment. Il doit avoir acquisla notion des problmes thiques soulevs par la constitution dune banque de DNA gno-mique humain.Il doit savoir reconnatre/reprsenter le mode daction des principales enzymes impliquesdans la manipulation du DNA : endonuclases, incluant les endonuclases de restriction,ligases, DNA polymrases.Il doit tre capable dinterprter des donnes exprimentales obtenues par les mthodescouplant lectrophorse et hybridation sur filtre (Southern blots).Ayant acquis la notion doligonuclotides de synthse (sans aucun dtail sur les mthodesmises en uvre), de cDNA, de vecteurs plasmidiques ou phagiques, il doit savoir expliquerles grands principes de ltude du DNA gnomique, en matrisant la notion de clonage.Il doit savoir lire un gel de squence et, laide de la table de code gntique, convertir unesquence nuclique en squence peptidique, manipulant ainsi les notions de brin sens etnon-sens et de cadre de lecture. Sur des squences compares, il doit savoir identifier desmutations, ponctuelles ou tendues, et leurs consquences fonctionnelles (arrt prmaturde la traduction, dcalage du cadre de lecture). La connaissance ainsi acquise du squen-age doit lui permettre de matriser les notions de discontinuit des gnes, en distinguant

    1. Donner un exemple : choisir, dcrire et expliquer une situation dans laquelle un concept ou un corps dfini joue le rle principal et met en vidence ses proprits essentielles.

    2. Savoir interprter un examen : savoir les valeurs usuelles (95 % de la population adulte saine), savoir les circonstances physiopathologiques des variations du paramtre, savoir faire la critique de la valeur dun rsultat en fonction des conditions de son prlvement ou de sa mesure.

  • Objectifs PCEM1 commun DHU Paris-Est

    les exons et les introns, et de modifications post-transcriptionnelles, incluant pose de lacoiffe, pissage et polyadnylation.Ltudiant doit savoir interprter des rsultats exprimentaux obtenus par une technique2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 11/204

    damplification gnique (PCR), quil sagisse danalyse du gnome, dtude dexpressionde gne ou de prparation de matriel pour un clonage ultrieur.

    Transcription et rgulation de lexpression des gnes Dfinir1 les termes : gne, transcription, brin sens, promoteur, exon, intron, coiffe,

    queue poly-A, excision-pissage. Montrer le mcanisme2 de la transcription dun gne, en distinguant les tapes dini-

    tiation, dlongation et de terminaison. Montrer les mcanismes de la rgulation de la transcription. Donner un exemple de

    rgulation dun gne eucaryote sous le contrle dune grande voie endocrinienne(exemples : CREB, GlucocorticoidRE).

    Enumrer et dcrire les principales modifications post-transcriptionnelles : enzymecoiffante, polyadnylation, dition, excision-pissage. Donner un exemple dexpres-sion alternative dun gne eucaryote.

    Ltudiant doit tre capable de dfinir un certain nombre de termes indispensables la com-prhension de la transcription : brin sens et brin antisens, RNA polymrase, promoteur, ini-tiation de la transcription, longation, terminaison. Il doit savoir dcrire le mcanismebiochimique de la RNA polymrase et mentionner les rles spcifiques des trois types depolymrases impliques dans la transcription chez les eucaryotes.Il doit savoir commenter un schma rsumant de faon intgre la rgulation dun gnedont la transcription est sous le contrle dun messager agissant sur un rcepteur membra-naire (exemple de CREB) ou dun messager interagissant avec un rcepteur nuclaire (hor-mones strodiennes).En ce qui concerne les modifications post-transcriptionnelles, il doit simplement pouvoirdfinir ce quest une coiffe, une polyadnylation ou lpissage (ventuellement alternatif)en identifiant et en explicitant les mcanismes molculaires mis en jeu.

    Traduction

    Dfinir les termes : traduction, codon et anticodon, polyribosome, signal-peptide. Montrer le mcanisme de la traduction dun messager, en distinguant les tapes dini-

    tiation, dlongation et de terminaison. Montrer les mcanismes de la rgulation de la traduction. Donner un exemple dan-

    tibiotique intervenant sur la rgulation de la traduction des procaryotes. Enumrer et dcrire les principales modifications post-traductionnelles (en compl-

    ment de ce qui aura t trait dans le thme 2)

    Ltudiant doit tre capable de dfinir un certain nombre de caractristiques ou de termesindispensables la comprhension de la traduction : aminoacyl-tRNA synthtase, sens de

    1. Dfinir : prciser dans une phrase concise lessence dun objet ou les limites dun concept en excluant toute notion trangre et en comprenant toutes les variations possibles de lobjet ou du concept cern.

    2. Montrer le mcanisme (dune raction) ouDcrire les tapes (dune voie mtabolique) : dfinir les corps chimiques en prsence, crire et quilibrer la (les) raction(s) ; faire le bilan chimique et nergtique.

  • Objectifs PCEM1 commun DHU Paris-Est

    la traduction, codon, anticodon, codon dinitiation, code gntique, ribosomes, polyriboso-mes.Sur un schma synthtique dcrivant le mcanisme de la traduction, il doit tre capable12/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    didentifier et dexpliciter les grandes tapes mises en jeu.Il doit avoir la notion que chacune des tapes de la traduction chez les procaryotes peut trela cible dantibiotiques, mais aucune connaissance spcifique ne peut lui tre demande,sauf des exercices de rflexion o ces donnes lui seraient rappeles.Il doit pouvoir expliquer en termes simples la diffrence entre les protines localisationcytoplasmique et celles qui empruntent la voie de scrtion, en prcisant les notions de pep-tide-signal et de modifications post-traductionnelles.

    Rplication et rparation du DNA

    Dfinir les termes : rplication, rparation. Montrer le mcanisme enzymatique dune fourche de rplication. Dcrire les diffrentes ractions catalyses par les DNA polymrases. Dcrire un exemple de mcanisme de rparation des msappariements. Dcrire la rplication du DNA linaire et le rle dune tlomrase. Dcrire lactivit de la transcriptase inverse et donner un exemple de ses consquen-

    ces physiopathologiques.

    Ltudiant doit pouvoir citer et expliciter les grandes caractristiques de la rplication :semi-conservative, continue/discontinue selon le brin, dbutant une mme origine. Il doitpouvoir citer les principales protines impliques successivement dans la rplication chezles eucaryotes et prciser leur rle : hlicases, protines de liaison au DNA simple brin, to-poisomrases, primase, DNA polymrases, ligase.Ltudiant doit savoir illustrer la notion de fidlit de la rplication en explicitant les prin-cipaux mcanismes mis en jeu (activit 3-exonuclasique des DNA polymrases, rpara-tion des msappariements).Il doit tre capable de rsoudre le problme pos par la rplication des DNA linaires enexpliquant le rle des tlomrases.Il doit savoir dcrire les proprits de la transcriptase inverse sans entrer dans les dtails dela rplication des rtrovirus.

    Donner un exemple de rparation du DNA ls.

    En appliquant ses connaissances acquises des principales enzymes agissant sur le DNA,auxquelles seront ajoutes loccasion les glycosylases, ltudiant doit savoir reconnatresur un schma les interventions successives des enzymes impliques dans la rparation parexcision de nuclotides.RecombinaisonSans avoir reproduire le modle de Holliday qui lui aura t prsent, ltudiant doit trecapable de dfinir le processus dchange de segments de DNA homologues sur des sch-mas simples et de mentionner limplication de la recombinaison dans des phnomnes fon-damentaux tels que le crossing-over .

    Les vnements gntiques

    Dfinir les termes : variation (= substitution ou mutation silencieuse), mutation (= ex-prime), dltion/insertion, rptition.

  • Objectifs PCEM1 commun DHU Paris-Est

    Donner des exemples parmi les vnements gntiques suivants qui aboutissent unepathologie : mutation ponctuelle, dltion (avec ou sans dcalage du cadre de lectu-re), pissage dfectueux, rptitions de triplet.2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 13/204

    Dfinir les termes : transposition, pseudogne, conversion de gne, famille ou super-famille de gnes.

    Donner un exemple de lvolution dune famille de gnes.

    Grce des exemples de famille de gnes et de leur volution ; ltudiant devra expliciterle rle des vnements gntiques (duplications, conversions de gnes, inactivations de g-nes) dans la diversification du patrimoine gntique des espces, et montrer quels avanta-ges slectifs les espces acquirent avec ces changements pour ladaptation leurenvironnement.

  • Objectifs PCEM1 commun DHU Paris-Est14/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

  • La structure des acides nucliques

    Partie I 2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 15/204

    La structure des acides nucliquesRappel des objectifs

    Structure et fonction des acides nucliques

    Connatre la structure des acides nucliques, savoir reconnatre1 les molcules sim-ples dont ils sont constitus, les classer daprs leurs proprits ou leurs fonctions.

    Cette partie ncessite la reconnaissance des structures de lacide phosphorique, du riboseet du dsoxy-ribose, des bases puriques et pyrimidiques.Ltudiant doit savoir reconnatre nimporte quelle base, nucloside, nuclotide ou nuclo-side polyphosphate. Il doit savoir identifier les liaisons riches en nergie des nuclosidespolyphosphates et distinguer les groupements phosphates (, , ) prsents dans ces mol-cules.Il doit savoir interprter et manipuler les diffrentes reprsentations de la structure primairedu DNA et du RNA, prciser la nature des liaisons impliques dans lenchanement des nu-clotides, distinguer une extrmit 5 dune extrmit 3 et manipuler les units de taille(kb, kpb, Mpb...).Sur des schmas qui lui seront prsents, il doit savoir reconnatre les liaisons impliquesdans la complmentarit des bases ainsi que les lments structuraux essentiels dune dou-ble hlice de DNA, de la chromatine ou des diffrentes espces de RNA.Connaissant la composition en bases de deux DNA de mme taille, il doit savoir prdire lesdiffrences de temprature de fusion et expliciter les raisons de leur choix.

    Mthode dtude des acides nucliques

    Connatre les mthodes permettant dtudier le DNA des malades (obtention, purifi-cation, conservation) y compris dans leur aspect thique.

    Dcrire lactivit de quelques enzymes qui permettent ltude des acides nucliques ettre capable de montrer leffet de ces enzymes sur un exemple dtaill (squencedacide nuclique). Cet objectif comprend au moins les activits des endonuclases derestriction, les polymrases, les ligases et les topoisomrases.

    Expliquer le mcanisme de lamplification du DNA par PCR (il ne sagit pas des m-

    1. Savoir reconnatre

    corps chimique : nommer un corps dont on voit la formule dveloppe ;raction : dsigner lenzyme au vu de lquation chimique ;voie mtabolique : dsigner la voie mtabolique au vu de son bilan chimique.

  • La structure des acides nucliques

    thodes ou des techniques, seulement du principe qui est utilis).

    Expliquer le principe de la PCR et de la RT-PCR16/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    Enumrer les principaux constituants du milieu de raction dune PCR Citer un exemple dapplication de la PCR en diagnostic mdical

    Donner un exemple1 de diagnostic fond sur une variation de longueur de fragmentsdacides nucliques (RFLP).

    Enumrer les facteurs qui permettent lhybridation de deux brins dacides nucliques. Savoir interprter2 les rsultats dune technique dhybridation avec une sonde

    (Southern ou Northern blots, puces DNA) et son application un diagnostic. Expliquer le mcanisme dun squenage dacide nuclique. Donner un exemple de prparation et dutilisation dun DNA complmentaire.

    Sans avoir mmoriser les dtails des modes opratoires, ltudiant doit avoir acquis la no-tion que des mthodes simples permettent dextraire et de purifier, partir de cellules euca-ryotes, les diffrentes formes de DNA et de RNA quelles renferment. Il doit avoir acquisla notion des problmes thiques soulevs par la constitution dune banque de DNA gno-mique humain.Il doit savoir reconnatre/reprsenter le mode daction des principales enzymes impliquesdans la manipulation du DNA : endonuclases, incluant les endonuclases de restriction,ligases, DNA polymrases.Il doit tre capable dinterprter des donnes exprimentales obtenues par les mthodescouplant lectrophorse et hybridation sur filtre (Southern blots).Ayant acquis la notion doligonuclotides de synthse (sans aucun dtail sur les mthodesmises en uvre), de cDNA, de vecteurs plasmidiques ou phagiques, il doit savoir expliquerles grands principes de ltude du DNA gnomique, en matrisant la notion de clonage.Il doit savoir lire un gel de squence et, laide de la table de code gntique, convertir unesquence nuclique en squence peptidique, manipulant ainsi les notions de brin sens etnon-sens et de cadre de lecture. Sur des squences compares, il doit savoir identifier desmutations, ponctuelles ou tendues, et leurs consquences fonctionnelles (arrt prmaturde la traduction, dcalage du cadre de lecture). La connaissance ainsi acquise du squen-age doit lui permettre de matriser les notions de discontinuit des gnes, en distinguantles exons et les introns, et de modifications post-transcriptionnelles, incluant pose de lacoiffe, pissage et polyadnylation.Ltudiant doit savoir interprter des rsultats exprimentaux obtenus par une techniquedamplification gnique (PCR), quil sagisse danalyse du gnome, dtude dexpressionde gne ou de prparation de matriel pour un clonage ultrieur.

    1. Donner un exemple : choisir, dcrire et expliquer une situation dans laquelle un concept ou un corps dfini joue le rle principal et met en vidence ses proprits essentielles.

    2. Savoir interprter un examen : savoir les valeurs usuelles (95 % de la population adulte saine), savoir les circonstances physiopathologiques des variations du paramtre, savoir faire la critique de la valeur dun rsultat en fonction des conditions de son prlvement ou de sa mesure.

  • Molcules simples

    Chapitre 1 2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 17/204

    Molcules simples

  • Molcules simples

    1.1 Phosphates18/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 01

    Les molcules biologiques qui contiennent linformation gntique sont les acides nucliques. Les acides nucliques sont composs de molcules simples comme lacide phosphorique

    (PO4H3), des oses 5 carbones (pentoses) et des bases azotes (purines ou pyrimidines). Le phosphate inorganique est un ion stable form partir de lacide phosphorique PO4H3. On

    lcrit souvent Pi. Des esters de phosphate peuvent se former entre un phosphate et un groupement hydroxyle

    libre (alcool, nol, phnol...). La condensation dun phosphate et dun autre acide, par exemple un autre phosphate, donne

    un anhydride. Il y a aussi des anhydrides mixtes avec les acides carboxyliques par exemple. Le pyrophosphate est un ion driv de lacide pyrophosphorique (P2O7H4), qui est lui mme

    un anhydride dacide phosphorique.

  • Molcules simples

    1.2 Ribose, dsoxyribose2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 19/204

    BM 01/1

    Le ribose est un pentose de la srie D, dont tous les hydroxyles sont orients droite (repr-sentation de Fisher). Dans les acides ribonucliques (RNA), il est cyclis en ribofuranose :anomre spcifiquement.

    Le dsoxyribose, composant des acides dsoxyribonucliques (DNA) est driv du ribose parune rduction de la fonction alcool secondaire du carbone n2. Le dsoxyribose confre cetacide nuclique une plus grande stabilit propre sa fonction de conservation de linformationgntique.

  • Molcules simples

    1.3 Purine, Pyrimidine20/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 02

    Les bases azotes des acides nucliques appartiennent deux classes de molcules selon lenoyau aromatique qui en constitue le squelette.

    Le noyau pyrimidine est le plus simple : cest un noyau aromatique six atomes, quatre car-bones et deux azotes ; les deux azotes en position mta (n 1 et 3).

    Le noyau purine est constitu de deux noyaux htrocycliques accols, un de six atomes etlautre de cinq atomes, ayant deux carbones en commun au milieu. Par rapport ces carbonescommuns, les azotes occupent des positions symtriques (n 1 et 3 gauche, n 7 et 9 droite).

    Les diffrentes bases rencontres dans les acides nucliques en drivent selon les substituantsque portent les atomes de ces noyaux. De nombreux mdicaments appartiennent aussi cesdeux classes de bases azotes.

  • Molcules simples

    1.4 Bases puriques2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 21/204

    BM 02/1

    Les bases azotes sont des molcules aromatiques dont le noyau est soit une purine (bases pu-riques), soit une pyrimidine (bases pyrimidiques).

    Les bases puriques sont au nombre de 2 : ladnine et la guanine. Les purines ont un double noyau aromatique comportant gauche un cycle hexagonal de

    4 carbones et 2 azotes et droite un cycle pentagonal de 3 carbones (dont 2 communs avec leprcdent) et 2 azotes.

    Ladnine est constitue dun noyau purine dont le carbone 6 est substitu par une fonctionamine. Elle est la seule des bases nucliques dont la formule ne contient pas datome doxy-gne.

    La guanine est constitue dun noyau purine dont le carbone 2 est substitu par une fonctionamine et le carbone 6 par une fonction ctone.

  • Molcules simples

    1.5 Bases pyrimidiques22/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 02/2

    Les bases pyrimidiques sont au nombre de 3 : la cytosine, luracile et la thymine. Les pyrimidines ont un noyau aromatique hexagonal de 4 carbones et 2 azotes. La cytosine est constitue dun noyau pyrimidine dont le carbone 4 est substitu par une fonc-

    tion amine et le carbone 2 par une fonction ctone. Luracile est constitue dun noyau pyrimidine dont les carbones 2 et 4 portent des fonctions

    ctone. La thymine est aussi constitue dun noyau pyrimidine dont les carbones 2 et 4 portent des

    fonctions ctone, mais dont le carbone 5 est substitu par un mthyl.

  • Molcules simples

    1.6 Nuclosides et nuclotides2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 23/204

    BM 03

    Les sucres (ribose ou dsoxyribose) se lient aux bases azotes par des liaisons impliquant undes azotes de la base (azote n1 des pyrimidines ou azote n9 des purines) et le carbone n1de lose (carbone rducteur ou fonction semi-actalique). Ce sont des liaisons N-osidiques.

    La liaison dune base azote avec un des sucres donne un nucloside. Un nucloside est doncform dune base et dun sucre lis par une liaison N-osidique. Dans un nucloside, on num-rote les atomes de la base par des chiffres : 1, 2, 3, etc... et pour les distinguer, les carbones dusucre sont numrots 1, 2, 3, etc...

    La liaison dun nucloside avec un phosphate se fait par une estrification de la fonction al-cool primaire (carbone n5) du sucre et une des trois fonctions acides du phosphate.

    Lester obtenu est un nuclotide. Un nuclotide est donc form dune base azote, lie par uneliaison osidique avec un sucre, lui-mme li par une liaison ester avec un phosphate.

    Dans le mtabolisme des acides nucliques interviennent des substrats riches en nergie, lesnuclosides triphosphates. Un nucloside triphosphate est un nuclotide dont le phosphate estlui-mme li un ou deux autres phosphates par des liaisons anhydride dacides.

  • Molcules simples

    1.7 Nomenclature des units nuclotidiques24/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 03/1

    Les bases azotes sont conventionnellement dsignes par une initiale et par une couleur :ladnine par A et la couleur verte, la guanine par G et la couleur jaune, etc...

    Chaque base peut entrer dans la structure de deux nuclosides, selon que le sucre est un riboseou un dsoxyribose.

    Chaque nucloside peut tre li un, deux ou trois phosphates. On les dsigne par des siglesconventionnels : GMP pour guanosine monophosphate, CDP pour cytidine diphosphate, ATPpour adnosine triphosphate, etc...

    On dsigne par nuclotides les nuclosides monophosphates : AMP ou acide adnylique,dTMP ou acide dsoxythymidylique, etc...

    Les nuclosides polyphosphates sont des diphosphates : ADP ou GDP... ou encore des tri-phosphates, les plus riches en nergie : ATP ou GTP ; etc...

    Les acides nucliques sont forms par une polycondensation de nuclotides AMP, CMP,GMP et UMP pour les acides ribonucliques, dAMP, dCMP, dGMP et dTMP pour les acidesdsoxyribonucliques.

  • Molcules simples

    1.8 Adnosine2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 25/204

    BM 04

    Un nucloside est une molcule compose dun pentose (-D-ribose ou 2-dsoxy--D-ribose)li par une liaison N-osidique une base azote.

    Les nuclotides sont des esters phosphoriques des nuclosides. Les autres ribonuclosides sont : la guanosine, la cytidine et luridine.

  • Molcules simples

    1.9 Dsoxyguanosine26/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 04/5

    Un nucloside est une molcule compose dun pentose (-D-ribose ou 2-dsoxy--D-ribose)li par une liaison N-osidique une base azote.

    Les nuclotides sont des esters phosphoriques des nuclosides. Les autres dsoxyribonuclosides sont : la dsoxyadnosine, la dsoxycytidine et la dsoxy-

    thymidine, souvent appele thymidine tout court.

  • Molcules simples

    1.10 Uridine MonoPhosphate2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 27/204

    BM 05/3

    Un nuclotide est une molcule compose dun nucloside li par une liaison ester un acidephosphorique.

    Les acides nucliques sont des macromolcules rsultant de la condensation de trs nombreuxnuclotides, lis par des liaisons phosphodiester.

    Luridine mono phosphate (UMP) ou acide uridylique est un exemple de nuclotide. Les autres ribonuclotides sont : lAMP, le GMP et le CMP.

  • Molcules simples

    1.11 Dsoxythymidine MonoPhosphate28/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 05/7

    Un nuclotide est une molcule compose dun nucloside li par une liaison ester un acidephosphorique.

    Les acides nucliques sont des macromolcules rsultant de la condensation de trs nombreuxnuclotides, lis par des liaisons phosphodiester.

    Le thymidine monophosphate (dTMP ou TMP) ou acide thymidylique est un exemple de nu-clotide. La thymine tant toujours lie un dsoxyribose on nglige souvent de prciser d-soxythymidine monophosphate ou dTMP.

    Les autres dsoxyribonuclotides sont : le dAMP, le dGMP et le dCMP.

  • Molcules simples

    1.12 Adnosine Tri Phosphate2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 29/204

    BM 06

    Ladnosine triphosphate est un nuclotide compos. Sa structure comporte une base azote,ladnine, lie par une liaison N-osidique au -D-ribose et trois phosphates.

    Les fonctions acides des acides phosphoriques distaux sont fortement ionises au pH physio-logique. Les liaisons anhydrides unissant les acides phosphoriques sont des liaisons riches ennergie (G 31 kJ/mol).

    LATP est un des substrats des RNA-polymrases. Le coenzyme ATP/ADP est un coenzyme transporteur dnergie universel. Les enzymes utilisant un nucloside triphosphate comme substrat ou comme coenzyme, n-

    cessitent en mme temps la prsence du cation Magnsium comme cofacteur. Les autres nuclosides triphosphates sont en fonction du sucre ou de la base quils

    contiennent : le GTP, le CTP, lUTP, le dATP, le dGTP, le dCTP (voir BM 06/6) et le dTTP.

  • Molcules simples

    1.13 Dsoxycytidine Tri Phosphate30/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 06/6

    Le dsoxycytidine-triphosphate est un nuclotide compos. Sa structure comporte une baseazote, la cytosine, lie par une liaison N-osidique au -D-ribose et trois phosphates.

    Les fonctions acides des acides phosphoriques distaux sont fortement ionises au pH physio-logique. Les liaisons anhydrides unissant les acides phosphoriques sont des liaisons riches ennergie (G 31 kJ/mol).

    Le dCTP est un des substrats des DNA-polymrases. Les enzymes utilisant un nucloside triphosphate comme substrat ou comme coenzyme, n-

    cessitent en mme temps la prsence du cation Magnsium comme cofacteur. Les autres nuclosides triphosphates sont en fonction du sucre ou de la base quils

    contiennent : lATP (voir BM 06), le GTP, le CTP, lUTP, le dATP, le dGTP et le dTTP.

  • Molcules simples

    1.14 Liaisons hydrogne2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 31/204

    BM 07

    Une liaison hydrogne est une liaison de faible nergie entre deux atomes attirs lun verslautre pour des raisons lectrostatiques lun tant riche en lectrons donc nuclophile etlautre nayant que les protons de son noyau donc lectrophile.

    Ainsi latome dhydrogne, dont lunique lectron est par ncessit dans lorbitale qui unit cetatome au reste de la molcule, ne peut qutre lectrophile et comme tel attir par les atomesayant des doublets lectroniques libres.

    Les atomes dazote et surtout doxygne possdent respectivement deux et quatre lectronsde leur couche priphrique qui ne participent pas aux orbitales des liaisons covalentes de lamolcule. Ceci leur confre un caractre nuclophile qui leur permet dexercer une attractionsur les atomes lectrophiles voisins, en particulier les atomes dhydrogne : cette attractionconstitue une liaison hydrogne.

    Lorsque les orbitales qui unissent dun ct latome dhydrogne la molcule de gauche etde lautre ct les doublets lectroniques libres avec latome nuclophile sont dans le mmeaxe, la liaison hydrogne est plus forte.

  • Molcules simples

    1.15 Hybridation A - T32/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 07/1

    Lorsquun acide nuclique est en solution les molcules forment des liaisons hydrognes as-sociant les nuclotides deux par deux, de sorte quun nuclotide adnine se lie avec un nu-clotide thymine (ou uracile dans un RNA) et un nuclotide guanine avec un nuclotide cytosine.

    On dsigne cette liaison sous le terme dhybridation. Lhybridation adnine-thymine est moins stable (2 liaisons hydrogne, -21 kJ) que celle entre

    guanine et cytosine.

  • Molcules simples

    1.16 Hybridation G - C2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 33/204

    BM 07/2

    Lorsquun acide nuclique est en solution les molcules forment des liaisons hydrognes as-sociant les nuclotides deux par deux, de sorte quun nuclotide adnine se lie avec un nu-clotide thymine (ou uracile dans un RNA) et un nuclotide guanine avec un nuclotide cytosine.

    On dsigne cette liaison sous le terme dhybridation. Lhybridation guanine-cytosine est plus stable (3 liaisons hydrogne, -63 kJ) que celle entre

    adnine et thymine.

  • Molcules simples34/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

  • Les acides nucliques

    Chapitre 2 2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 35/204

    Les acides nucliques

  • Les acides nucliques

    2.1 Acide ribonuclique36/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 08

    Pour former un acide ribonuclique les nuclotides (GMP, AMP, UMP, CMP), sont conden-ss les uns sur les autres avec des liaisons phosphodiester entre le carbone 3 dun premier nu-clotide et le carbone 5 du nuclotide suivant.

    De sorte que ces liaisons dfinissent un sens la molcule : le dbut tant le nuclotide dontle phosphate en 5 ne serait li aucun autre nuclotide et la fin correspond au nuclotide dontla fonction alcool en 3 nest pas estrifie.

    Selon leurs fonctions, on distingue plusieurs espces dacides ribonucliques :

    rRNA = acide ribonuclique ribosomique, qui participe la structure des ribosomes ; tRNA = acide ribonuclique de transfert, transporteur des acides amins activs pour la

    traduction ; mRNA = acide ribonuclique messager, produit de la transcription dun gne qui porte

    linformation traduire.

  • Les acides nucliques

    2.2 Les extrmits 5 et 3 dun acide 2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 37/204

    nuclique

    BM 08/1

    Le premier nuclotide de la chane porte, par une liaison ester sur le carbone 5 de son riboseun phosphate dont les deux autres fonctions acides ne sont pas estrifies. Cest lextrmit5-phosphate terminale de lacide nuclique, quon dsigne par convention comme le dbutde la squence ou du fragment dacide nuclique.

    Le dernier nuclotide de la chane porte une fonction alcool sur le carbone 3 de son ribose.Cette fonction alcool nest pas pas estrifie. Cest lextrmit 3-OH terminale de lacide nu-clique, quon dsigne par convention comme la fin de la squence ou du fragment dacidenuclique.

  • Les acides nucliques

    2.3 Structure secondaire du RNA38/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 09/1

    Le RNA diffre du DNA par plusieurs caractres :

    1. il est plus court (70 10 000 nuclotides)2. le squelette de pentoses et de phosphates contient du ribose la place du dsoxyribose3. parmi les bases azotes luracile (U) remplace la thymine (T)4. Les RNA sont simple brin mais certaines rgions sont apparies sur une courte distance

    par leurs bases complmentaires selon un ajustement au hasard (pingles cheveux).

  • Les acides nucliques

    2.4 Acides ribonucliques2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 39/204

    BM 10

    Il existe de nombreuses molcules dacides ribonucliques dans presque tous les comparti-ments de la cellule et ayant des fonctions varies.

    Certains (rRNA) font partie de la structure des ribonucloprotines du ribosome, particule res-ponsable de la synthse des protines.

    Dautres sont des coenzymes transporteurs dacides amins pour la synthse des protines, cesont les tRNA.

    Certains, beaucoup plus rares, participent la structure de ribonucloprotines diverses, res-ponsable de lexcision-pissage des transcrits, de la slection des polyribosomes lis pourladressage des protines ou encore dautres activits enzymatiques du mtabolisme (ex. : -ALA synthtase).

    Enfin les mRNA sont les produits de la transcription des gnes, grce auxquels les ribosomesreoivent linformation ncessaire la synthse des protines.

  • Les acides nucliques

    2.5 Acide dsoxyribonuclique40/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 11

    Les molcules dacide dsoxyribonucliques sont formes de deux chanes dont les nucloti-des sont hybrids deux deux sur toute la longueur.

    Les deux chanes sont antiparallles, cest dire que lextrmit 5 de lune est du ct de lex-trmit 3 de lautre.

    Pour que tous les nuclotides puissent shybrider ; il faut que lordre dans lequel ils sont lisensemble soit complmentaire de la chane oppose.

    Les bases azotes lies par les liaisons hydrognes sont tournes vers lintrieur, tandis queles riboses et les acides phosphoriques, hydrophiles sont tourns vers lextrieur.

    La chaleur peut dissocier les deux chanes : cest la fusion du DNA. Cette fusion estrversible : les deux chanes peuvent shybrider nouveau.

  • Les acides nucliques

    2.6 La double hlice (modle rubans)2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 41/204

    BM 11/1

    La structure secondaire du DNA est telle que les deux brins sont enrouls lun autour delautre. Chacun des deux brins est orient (53) dans le sens oppos celui de lautre brin(35). On dit quils sont antiparallles.

    Les bases azotes sont tournes vers lintrieur de la double hlice de faon ce que chacuneshybride avec une base de lautre brin (A avec T, C avec G, etc..). On dit que les bases suc-cessives de chacun des brins sont complmentaires.

    La double hlice a un pas de 3,4 nm cest dire quil y a environ 10 paires de nuclotidespour chaque tour dhlice.

  • Les acides nucliques

    2.7 La double hlice (travers)42/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 11/2

    Une vue perspective de la double hlice montre bien comment les bases azotes sont parall-les entre elles, leurs noyaux empils comme des assiettes au centre de la double hlice.

  • Les acides nucliques

    2.8 La double hlice (axe)2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 43/204

    BM 11/3

    Lorsquon reprsente la double hlice selon son axe, on met en vidence deux particularits. Lensemble des dsoxyriboses et des phosphates se trouve lextrieur de la molcule et les

    fonctions acides des phosphates sont orientes vers lextrieur. Les bases azotes sont tournes vers lintrieur de la double hlice et unies la base compl-

    mentaire par des liaisons hydrogne. Les nuclotides complmentaires ntant pas tout faitdiamtralement opposs, laxe de lhlice est vide.

  • Les acides nucliques

    2.9 Surenroulement44/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 12

    Lors de la transcrition ou de la rplication, lhlice du DNA est ouverte par une topoisomrase(hlicase) qui permet aux enzymes laccs au brin modle.

    Le fait de sparer les bases complmentaires et les deux brins de la double hlice sur plusieursdizaines de nuclotides se traduit par un resserrement des tours dhlice de part et dautre dela boucle ainsi ouverte.

    Ce surenroulement ncessite lintervention dune topoisomrase qui va desserrer les toursdhlice en coupant un brin ou les deux brins du DNA, puis en les faisant tourner lun autourde lautre jusqu revenir 10 nuclotides par tour dhlice.

    Des protines de stabilisation du DNA simple brin viennent se fixer sur la partie droule pourprotger la molcule.

  • Les acides nucliques

    2.10 Nuclosome2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 45/204

    BM 12/1

    Le DNA a besoin dtre protg par des protines lorsquil nest pas utilis comme modlepour lexpression des gnes ou la rplication.

    Cette protection se fait par enroulement autour de protines basiques (cationiques) capablesde se lier avec le DNA qui est un polyanion. Des octamres dhistones sont au centre de par-ticules quon trouve tous les 200 nuclotides et autour desquels le DNA senroule. La struc-ture voque un collier de perles .

    Le DNA ainsi li aux histones est protg contre laction des enzymes. Une endonuclase peutdigrer le DNA entre les perles et dtacher des particules de 11 nm de diamtre appelesnuclosomes.

    Chaque nuclosome est constitu dun fragment de DNA de 145 paires de nuclotides et dehuit molcules dhistones.

  • Les acides nucliques

    2.11 Fibre de chromatine46/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 12/2

    Le DNA qui entoure chaque nuclosome et le relie en collier de perles aux nuclosomessuivants, forme la trame dune structure hlicodale qui enroule les colliers de perles sur eux-mmes. On dcrit aussi cette structure comme un solnode.

    Le diamtre de cette hlice est de 30 nm et forme une grande partie de la chromatine dite compacte o le DNA nest pas accessible.

    Toutefois, des squences reconnues spcifiquement par des protines de liaison au DNA in-terrompent de place en place cette structure compacte.

  • Les acides nucliques

    2.12 Condensation et hydrolyse des 2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 47/204

    nuclotides

    BM 13

    La croissance des brins dacides nucliques se fait toujours par leur extrmit 3-OH termina-le.

    La condensation se fait partir dun substrat activ : un des nuclosides triphosphates.Lhydrolyse des deux derniers phosphates fournira lnergie ncessaire la condensation. Lenucloside monophosphate restant sera estrifi par une fonction acide de son phosphate surla fonction alcool libre du carbone 3 du ribose qui constitue lextrmit de lacide nuclique.Une molcule deau sera te.

    Inversement, en ajoutant une molcule deau sur cette liaison ester, on provoquera une rac-tion dhydrolyse qui dtachera le dernier nuclotide et librera le carbone 3 du nuclotideprcdent.

  • Les acides nucliques

    2.13 Complmentarit des bases48/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 13/1

    Lhybridation des nuclotides complmentaires peut se faire sur toute la longueur dun brindacide nuclique : par des liaisons hydrogne, on associe systmatiquement les C avec desG et les G avec des C, les A avec des T et les T avec des A.

    En runissant tous les nuclotides ainsi associs par des liaisons phosphodiester on constitueune squence complmentaire de la squence originale. Ces deux squences sont obligatoire-ment orientes dans des sens opposs : on dit quelle sont antiparallles.

    De cette faon, grce des enzymes spcifiques, une squence dacide nuclique dite originale est capable de diriger la synthse dune squence dacide nuclique complmen-taire.

    Dans un second temps, cette squence complmentaire isole, sera elle aussi capable de diri-ger la synthse de la squence originale dont elle est le complment.

  • Biosynthse des macromolcules

    Partie II 2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 49/204

    Biosynthse des macromolculesRappel des objectifs

    Transcription et rgulation de lexpression des gnes

    Dfinir1 les termes : gne, transcription, brin sens, promoteur, exon, intron, coiffe,queue poly-A, excision-pissage.

    Montrer le mcanisme2 de la transcription dun gne, en distinguant les tapes dini-tiation, dlongation et de terminaison.

    Montrer les mcanismes de la rgulation de la transcription. Donner un exemple dergulation dun gne eucaryote sous le contrle dune grande voie endocrinienne(exemples : CREB, GlucocorticoidRE).

    Enumrer et dcrire les principales modifications post-transcriptionnelles : enzymecoiffante, polyadnylation, dition, excision-pissage. Donner un exemple dexpres-sion alternative dun gne eucaryote.

    Ltudiant doit tre capable de dfinir un certain nombre de termes indispensables la com-prhension de la transcription : brin sens et brin antisens, RNA polymrase, promoteur, ini-tiation de la transcription, longation, terminaison. Il doit savoir dcrire le mcanismebiochimique de la RNA polymrase et mentionner les rles spcifiques des trois types depolymrases impliques dans la transcription chez les eucaryotes.Il doit savoir commenter un schma rsumant de faon intgre la rgulation dun gnedont la transcription est sous le contrle dun messager agissant sur un rcepteur membra-naire (exemple de CREB) ou dun messager interagissant avec un rcepteur nuclaire (hor-mones strodiennes).En ce qui concerne les modifications post-transcriptionnelles, il doit simplement pouvoirdfinir ce quest une coiffe, une polyadnylation ou lpissage (ventuellement alternatif)en identifiant et en explicitant les mcanismes molculaires mis en jeu.

    Traduction

    Dfinir les termes : traduction, codon et anticodon, polyribosome, signal-peptide.

    1. Dfinir : prciser dans une phrase concise lessence dun objet ou les limites dun concept en excluant toute notion trangre et en comprenant toutes les variations possibles de lobjet ou du concept cern.

    2. Montrer le mcanisme (dune raction) ouDcrire les tapes (dune voie mtabolique) : dfinir les corps chimiques en prsence, crire et quilibrer la (les) raction(s) ; faire le bilan chimique et nergtique.

  • Biosynthse des macromolcules

    Montrer le mcanisme de la traduction dun messager, en distinguant les tapes dini-tiation, dlongation et de terminaison.

    Montrer les mcanismes de la rgulation de la traduction. Donner un exemple1 dan-50/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    tibiotique intervenant sur la rgulation de la traduction des procaryotes. Enumrer et dcrire les principales modifications post-traductionnelles (en compl-

    ment de ce qui aura t trait dans le thme 2)

    Ltudiant doit tre capable de dfinir un certain nombre de caractristiques ou de termesindispensables la comprhension de la traduction : aminoacyl-tRNA synthtase, sens dela traduction, codon, anticodon, codon dinitiation, code gntique, ribosomes, polyriboso-mes.Sur un schma synthtique dcrivant le mcanisme de la traduction, il doit tre capabledidentifier et dexpliciter les grandes tapes mises en jeu.Il doit avoir la notion que chacune des tapes de la traduction chez les procaryotes peut trela cible dantibiotiques, mais aucune connaissance spcifique ne peut lui tre demande,sauf des exercices de rflexion o ces donnes lui seraient rappeles.Il doit pouvoir expliquer en termes simples la diffrence entre les protines localisationcytoplasmique et celles qui empruntent la voie de scrtion, en prcisant les notions de pep-tide-signal et de modifications post-traductionnelles.

    Rplication et rparation du DNA Dfinir les termes : rplication, rparation. Montrer le mcanisme enzymatique dune fourche de rplication. Dcrire les diffrentes ractions catalyses par les DNA polymrases. Dcrire un exemple de mcanisme de rparation des msappariements. Dcrire la rplication du DNA linaire et le rle dune tlomrase. Dcrire lactivit de la transcriptase inverse et donner un exemple de ses consquen-

    ces physiopathologiques.

    Ltudiant doit pouvoir citer et expliciter les grandes caractristiques de la rplication :semi-conservative, continue/discontinue selon le brin, dbutant une mme origine. Il doitpouvoir citer les principales protines impliques successivement dans la rplication chezles eucaryotes et prciser leur rle : hlicases, protines de liaison au DNA simple brin, to-poisomrases, primase, DNA polymrases, ligase.Ltudiant doit savoir illustrer la notion de fidlit de la rplication en explicitant les prin-cipaux mcanismes mis en jeu (activit 3-exonuclasique des DNA polymrases, rpara-tion des msappariements).Il doit tre capable de rsoudre le problme pos par la rplication des DNA linaires enexpliquant le rle des tlomrases.Il doit savoir dcrire les proprits de la transcriptase inverse sans entrer dans les dtails dela rplication des rtrovirus.

    Donner un exemple de rparation du DNA ls.

    En appliquant ses connaissances acquises des principales enzymes agissant sur le DNA,

    1. Donner un exemple : choisir, dcrire et expliquer une situation dans laquelle un concept ou un corps dfini joue le rle principal et met en vidence ses proprits essentielles.

  • Biosynthse des macromolcules

    auxquelles seront ajoutes loccasion les glycosylases, ltudiant doit savoir reconnatresur un schma les interventions successives des enzymes impliques dans la rparation parexcision de nuclotides.2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 51/204

    RecombinaisonSans avoir reproduire le modle de Holliday qui lui aura t prsent, ltudiant doit trecapable de dfinir le processus dchange de segments de DNA homologues sur des sch-mas simples et de mentionner limplication de la recombinaison dans des phnomnes fon-damentaux tels que le crossing-over .

  • Biosynthse des macromolcules52/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

  • DNA Dfinitions

    Chapitre 3 2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 53/204

    DNA Dfinitions

  • DNA Dfinitions

    3.1 La double hlice54/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 21

    Lacide dsoxyribonuclique (ADN ou DNA) est constitu de deux chanes de nuclosidesmonophosphates lis chacun par une liaison ester entre son carbone 3 (alcool secondaire) etle carbone 5 (alcool primaire) du nuclotide suivant.

    Ces deux chanes de nuclotides sont unies entre elles par des liaisons hydrognes pour formerun hybride en forme de double hlice (modle de J.D. Watson et F.H.C. Crick, 1953) dont lesdeux brins sont :

    antiparallles : lun est constitu dun enchanement commenant gauche et se pour-suivant vers la droite, lautre commenant droite et se poursuivant vers la gauche ;

    complmentaires : chaque adnine (A) dun des deux brins est lie par deux liaisons hy-drogne avec une thymine (T) de lautre brin, et chaque guanine (G) dun brin est liepar trois liaisons hydrogne avec une cytosine (C) de lautre brin.

    De sorte que si on dsigne les nuclotides par les lettres A, C, G et T en fonction des basesazotes quils contiennent, on peut lire sur cette figure le texte suivant :

    ...AGAGTCGTCTCGAGTCA...

    ...TCTCAGCAGAGCTCAGT...

  • DNA Dfinitions

    3.2 Squence dun gne (apoA-II)2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 55/204

    BM 22

    Ecrire la suite les lettres A, C, G et T dans lordre o on rencontre les nuclotides sur lundes brins du DNA de lextrmit 5 lextrmit 3 aboutit un texte indchiffrable (voirlimage).

    Pourtant sur cette diapositive le texte ainsi transcrit contient toute linformation ncessairepour la synthse dune protine (lapolipoprotine A-II). Cest pourquoi on appelle ce brin deDNA le brin sens . Lautre brin est le brin complmentaire ou brin antisens .

    Lensemble de linformation gntique transmise par chacun des parents un enfant (gnomehaplode) peut scrire ainsi en 3 milliards de lettres (une bibliothque de 7000 livres de300 pages chacun !)

    Les protines du noyau savent chercher sur les brins de la double hlice du DNA des suitesde lettres (squences) sur lesquelles elles se fixent spcifiquement. Les effets de cette fixationde protines sur le DNA vont permettre lexpression de linformation contenue dans le DNApour faire vivre un individu.

  • DNA Dfinitions

    3.3 Gne56/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 23

    Pour permettre la biosynthse dune protine, il doit y avoir dans la structure du DNA dunsujet, une squence de nuclotides qui constitue le gne de cette protine.

    Dans la squence du gne on distingue des squences en amont (lments rgulateurs, promo-teur), un site dinitiation de la transcription, une suite variable dexons et dintrons : exonsnon-traduits ou traduits, introns comportant ventuellement dautres squences rgulatrices,et enfin la fin de la transcription la fin du dernier exon.

    Lensemble des mcanismes qui partir de la squence du gne conduisent la productiondun acide ribonuclique ou dune protine est dsign sous le terme dexpression de ce gne.

  • DNA Dfinitions

    3.4 Expression dun gne2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 57/204

    BM 23/1

    Lexpression dun gne est une suite de synthses chimiques et de ractions aboutissant laproduction dun acide ribonuclique ou dune protine.

    Dans un premier temps a lieu la synthse dun acide ribonuclique, dont la squence est com-plmentaire dun des deux brins du gne donc identique celle de lautre brin : cest la trans-cription.

    La squence de lacide ribonuclique est identique celle du brin sens et oriente dans lemme sens. Elle se construit de 5 vers 3 en complmentarit de celle qui est lue sur lebrin antisens.

    Aprs des ractions de maturation le transcrit primaire (RNA) devient RNA messager (mR-NA) et sort du noyau vers le cytoplasme.

    Dans le second temps, le RNA messager est lu par groupe de trois nuclotides (lettres) gr-ce un RNA complmentaire qui porte lacide amin correspondant.

    La lecture du mRNA se fait de 5 vers 3 et la synthse de la protine se fait en mmetemps de lextrmit NH2 terminale vers lextrmit COOH terminale.

    Aprs des ractions de maturation, la protine mature est prte remplir sa fonction dansla cellule.

  • DNA Dfinitions58/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

  • La transcription

    Chapitre 4 2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 59/204

    La transcription

  • La transcription

    4.1 Transcription60/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 24

    Lexpression du gnome aboutit la synthse dans les cellules de macromolcules acides nu-cliques et protines, dont la structure primaire est dtermine par celle du DNA.

    Cette expression se fait par deux mcanismes principaux :

    la structure primaire du DNA sexprime dabord par la synthse dacides ribonucliquesdont la structure primaire est parallle celle du DNA. Cest la transcription.

    la structure transcrite sur certains RNA, dits messagers , sexprime enfin par la syn-thse de protines dont la structure primaire traduit en acides amins linformation por-te par la structure primaire du DNA. Cest la traduction.

    La transcription est conduite par plusieurs enzymes :

    RNA-polymrase I qui synthtise les RNA cytoplasmiques : RNA ribosomiques (18 S-5,8 S- 28 S)

    RNA-polymrase II qui synthtise les RNA messagers qui contiennent linformationdestine la traduction et certains des snRNA

    RNA-polymrase III qui synthtise les petits RNA (tRNA, rRNA 5 S, snRNA, 7SL-RNA).

  • La transcription

    4.2 Promoteur2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 61/204

    BM 25

    La dernire ligne de cette image (en bleu) est la squence du premier exon du gne delapolipoprotine A-II.

    Les 900 nuclotides qui prcdent contiennent de nombreuses squences reconnues par desprotines nuclaires qui permettent le dbut de la transcription ou la rgulation de cette tape.

    On distingue en particulier :

    vers -20 -30 (20 30 nuclotides en amont de lexon 1 en direction de lextrmit 5 dubrin sens) une squence TATATA appele bote TATA , qui est spcifiquement re-connue par la protine TFIID, cofacteur de la RNA-polymrase II ;

    vers -80 une squence GGCCCATCCAT la fois bote CAT ou CAAT et boteGC , sur laquelle viennent se fixer dautres protines de la transcription (CTF et Sp-1) ;

    de nombreuses autres squences (en jaune) o se fixent des protines rgulatrices de latranscription. Par exemple, une squence TRE (TGACTCA) au dbut de la troisime li-gne de cette image, sur laquelle vont se fixer des protines de la famille AP-1 pour acti-ver la transcription.

  • La transcription

    4.3 Brins sens et antisens62/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 25/1

    Les gnes sont situs sur les deux brins du DNA, de gauche droite ou de droite gauche,indiffremment. Ainsi les gnes des apolipoprotines A-I et C-III qui sont voisins sont orien-ts en sens opposs. Le dbut du message (exon 1) est gauche pour lapoA-I et droite pourlapoC-III. Le message cod doit tre lu en commenant par le dbut donc dans un sens dif-frent pour ces deux gnes.

    Pour servir de modle la transcription doit faire la copie de la squence dun brin de DNA,qualifi de brin sens ; lautre brin en est le complmentaire on le dit antisens . La trans-cription se fait en synthtisant un RNA complmentaire de la squence du brin antisens, doncidentique celle du brin sens.

    Lors de la formation du complexe dinitiation de la transcription la fixation de TFIID sur labote TATA se fait en premier et sur les deux brins de faon symtrique. Lors de la fixationdes autres protines du complexe (NF-I ou NF-Y sur la bote CAAT) il y a un brin sur lequella bote TATA est en aval (ct 3) de la bote CAAT, cest le brin sens qui contient lemessage et un brin sur lequel la bote CAAT est en aval (ct 3) de la bote TATA, cest lebrin antisens qui doit servir de modle pour la transcription.

  • La transcription

    4.4 Rgulation de lexpression2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 63/204

    BM 26

    La rgulation de toute voie mtabolique se fait principalement la premire raction pour nepas synthtiser dintermdiaires inutiles.

    Pour lexpression dun gne, la rgulation lieu quatre niveaux :

    1. lors de la transcription2. lors de la maturation du transcrit3. lors de la traduction4. lors de lactivation de la protine mature.

    Le point de contrle principal est la transcription : la RNA polymrase est lenzyme-cl delexpression dun gne.

  • La transcription

    4.5 Cis et trans rgulateurs64/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 26/1

    Les squences de nuclotides du promoteur (facteurs cis-rgulateurs) sont reconnues par uneclasse de protines spcifiques (facteurs trans-rgulateurs) dont la structure permet une liaisonavec le DNA (DNA binding proteins).

    Les facteurs trans-rgulateurs ont des effets sur la vitesse de la transcription : activateurs (s-quences enhancer) ou inhibiteurs (squences silencer). Leur liaison avec le DNA dpend leplus souvent de circonstances physiologiques qui induisent ou rpriment lexpression du g-ne.

    Il existe des lments essentiels et prsents dans la plupart des gnes :

    lment principal comme la bote TATA, lments de base comme loctamre reconnu par le facteur OCT-1 prsent dans presque

    toutes les cellules.

    Il existe des lments qui rpondent des facteurs dont la prsence dpend des signaux quiparviennent la cellules, principalement les hormones comme linsuline ou les second mes-sagers comme lAMP cyclique.

    Il y a encore des lments spcifiques dun type cellulaire permettant lexpression diffrentedes gnes dans chaque tissu.

    Ainsi, le promoteur de la lipoprotine lipase contient la bote TATA, des lments du promo-teur de base, des lments de rponse aux hormones et des lments dexpression tissulairespcifique. Dans le promoteur des gnes il y a souvent 20 ou 30 sites de fixation pour des fac-

  • La transcription

    teurs trans-rgulateurs dont beaucoup ont un effet inducteur ou rpresseur sur lexpression dugne.2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 65/204

  • La transcription

    4.6 DNA binding proteins66/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 26/2

    Les protines qui reconnaissent et se lient au DNA (DNA binding proteins) sont des enzymes,des protines de structure, des facteurs de transcription et des lments trans-rgulateurs.

    Dans la structure spatiale de ces protines, on reconnat des domaines propres cette liaisonspcifique :

    Le domaine hlice-boucle-hlice permet le lien spcifique des hlices avec les nuclotidesdans le grand sillon sur une longueur de 10 paires de bases environ.

    Les doigts de Zinc sont des domaines forms dun ion Zn++ ttracoordonn avec deux histi-dines (H) et deux cystines (C) de la protine. Chaque doigt de Zinc se lie cinq nuclotidesdans le grand sillon du DNA. Il y a souvent plusieurs doigts de Zinc la suite dans la mmeprotine.

    Certaines protines ont un domaine riche en acides amins basiques (K,R) qui se lie aux phos-phates des nuclotides. Ces protines se lient des squences rptes inverses sur le DNA,lorsquelles sont associes en dimres par la liaison hydrophobe de deux domaines riches enleucine (fermeture Eclair leucines).

  • La transcription

    4.7 Interaction Protine DNA2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 67/204

    BM 26/21

    Les protines rgulatrices (facteurs trans-rgulateurs) ont la capacit de se lier de faon sp-cifique de courtes squences de DNA et de rguler de faon positive ou ngative la trans-cription dun gne.

    Dans la plupart des cas la protine sinsre dans le grand sillon de lhlice et ralise une sriede contacts molculaires avec les paires de bases. La liaison avec le DNA se fait par linter-mdiaire de plusieurs types interactions (liaisons hydrogne, liaisons ioniques ou interactionshydrophobes).

    Ici on a reprsent un point de contact entre un rsidu asparagine dune protine rgulatriceet une adnine dun brin du DNA.

    Linteraction DNA-protine comporte 10 20 de ces points de contact, impliquant chacun unacide amin.

  • La transcription

    4.8 Rcepteurs nuclaires68/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 26/22

    Les hormones strodes, thyrodiennes et les rtinodes se lient des protines quon appellercepteurs nuclaires. Ces rcepteurs nuclaires forment une famille de protines homologuesse liant au DNA.

    Lensemble hormone-rcepteur constitue un facteur trans-rgulateur. Les squences de DNA quils reconnaissent (lments cis-rgulateurs) sont des rptitions de

    six nuclotides directes (dans le mme sens) ou inverses, spares par quelques nuclotides.

  • La transcription

    4.9 Rgulation du jene2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 69/204

    BM 26/3

    Au cours du jene le taux de glucose dans le sang diminue (hypoglycmie). Le cerveau dontle nutriment majeur est le glucose ragit en faisant scrter par lhypophyse une stimuline : lacorticotrophine (ou ACTH). Celle-ci provoque la scrtion dune hormone par les surrnales :le cortisol.

    Le cortisol agit dans le foie en se liant avec une protine spcifique : le rcepteur du cortisol.Cette protine lie lhormone constitue un facteur trans-rgulateur.

    Le facteur transrgulateur va dans le noyau des hpatocytes se lier au DNA au niveau du pro-moteur de certains gnes qui ont un lment cis-rgulateur spcifique : le GRE (glucocorti-coid responsive element).

    La liaison du facteur trans-rgulateur (protine + hormone) sur la squence de llment cis-rgulateur (squence AGAACA) va activer la transcription du gne en aval de ce promoteur,do une synthse accrue de messager.

    Les messagers ainsi produits vont induire la synthse denzymes appartenant la voie de lagluconognse. Laugmentation du taux de ces enzymes dans les hpatocytes va permettrela transformation des acides amins en glucose qui sera scrt dans la circulation et gagnerale cerveau : la glycmie va remonter.

  • La transcription

    4.10 Rgulation de leffort70/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 26/4

    Les stress provoquent la mise en veil de lorganisme et sa prparation leffort physique quincessite lutilisation du glycogne pour la contraction musculaire. Le cerveau active les m-dullosurrnales par voie nerveuse pour produire de ladrnaline. Si le taux de glucose dans lesang est bas (hypoglycmie), le pancras scrte du glucagon.

    Ces deux hormones agissent sur les muscles et sur le foie en activant la synthse de lAMPcyclique. Ce dernier est un activateur de la protine kinase A qui est capable de phosphorylerla CREB (cyclic AMP responsive element binding protein). La CREB phosphoryle constitueun facteur trans-rgulateur.

    Le facteur trans-rgulateur (CREB-P) va dans le noyau des cellules se lier au DNA au niveaudu promoteur de certains gnes qui ont un lment cis-rgulateur spcifique : le CRE (cyclicAMP responsive element).

    La liaison du facteur trans-rgulateur (CREB phosphoryle) sur la squence de llment cis-rgulateur (squence TGACGTCA) va activer la transcription du gne en aval de ce promo-teur, do une synthse accrue de messager.

    Les messagers ainsi produits vont induire la synthse denzymes appartenant la voie de laglycognolyse. Laugmentation du taux de ces enzymes dans les muscles va permettre latransformation du glycogne en nergie qui sera utilise pour la contraction musculaire.

  • La transcription

    4.11 RNA polymrase II2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 71/204

    BM 27

    La RNA polymrase II est lenzyme de la transcription des gnes exprims sous forme de pro-tines. Elle est inhibe spcifiquement par un poison extrait de lAmanite phallode, l-ama-nitine.

    Elle est prsente dans tous les noyaux cellulaires. Sa masse molculaire est de 500000 daltonspour 10 sous-units.

    La transcription quelle catalyse ncessite des ribonuclosides triphosphates comme substrats(ATP, CTP, GTP et UTP), plusieurs cofacteurs protiniques (transcription factors TFIIA TFIIJ). Lnergie de la raction est fournie par lhydrolyse des liaisons riches en nergie desnuclosides triphosphates.

  • La transcription

    4.12 Initiation de la transcription72/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 28

    Linitiation de la transcription sur un promoteur humain implique plusieurs facteurs de trans-cription, connus sous les noms de TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH et TFIIJ en plusde la RNA polymrase II elle-mme.

    Au centre de ce mcanisme initial, il y a lassociation de TBP, la sous-unit reconnaissant leDNA du facteur TFIID, avec la bote TATA du promoteur. Ladjonction successive de TFIIBet de RAP30, petite sous-unit de TFIIF, sont ensuite ncessaires pour la fixation de la poly-mrase et dterminent la fois le brin transcrit et le sens de la transcription. A ce complexeDNA-TFIID-TFIIB-RAP30-polymrase II, sajoutent encore successivement la grand sous-unit de TFIIF (RAP74), TFIIE et TFIIH. Alors la transcription peut commencer si les ribo-nuclosides substrats sont prsents.

    Le complexe dinitiation de la transcription recouvre une squence denviron 100 nuclotidesdu brin antisens du DNA. TFIIH provoque louverture et le droulement partiel de la doublehlice cet endroit.

    La transcription commence environ 22 nuclotides de la bote TATA en direction oppose celle des lments GC-CAAT et se poursuit en remontant le brin antisens en direction deson extrmit 5.

    La formation de ce complexe est active ou inhibe par les facteurs trans-rgulateurs lis auxsquences cis-rgulatrices du mme promoteur.

  • La transcription

    4.13 Liaison TFIID sur le DNA2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 73/204

    BM 28/1

    La fixation du facteur TFII D sur la bote TATA est la premire tape de la constitution ducomplexe dinitiation de la transcription.

    La bote TATA est symtrique, cest dire quelle est identique sur les deux brins antiparal-lles et complmentaires du DNA.

    La protine TFII D se fixe sur le DNA, en reconnaissant llment TATA et dforme la doublehlice de faon importante en se fixant.

    Cet ensemble va servir de point dancrage pour les autres facteurs dinitiation de la transcrip-tion.

  • La transcription

    4.14 Rgulation de la RNA polymrase74/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 28/2

    Les activateurs ou inhibiteurs de la transcription (facteurs trans-rgulateurs) sont des proti-nes produites par dautres gnes qui interviennent pour activer ou pour inhiber la RNA poly-mrase II et par suite induire ou rprimer lexpression du gne transcrire.

    Ces facteurs trans-rgulateurs se lient au DNA (DNA binding proteins) dans la rgion du gnesitue en amont de la partie transcrite. Les sites de fixation de ces facteurs trans-rgulateurssur le DNA sont des squences spcifiques appeles lments cis-rgulateurs.

    Le couple lment cis-rgulateur plus facteur trans-rgulateur li entre en contact avec lecomplexe dinitiation de la RNA polymrase par lintermdiaire dun ensemble de protinesappel mdiateur.

    La RNA polymrase peut donc dmarrer la transcription lorsquelle est active par les fac-teurs de transcription dont certains sont lis ces lments comme les botes TATA ou CAATet lorsque par lintermdiaire du mdiateur elle reoit un signal dactivation ou dinhibition.Ce signal dpend de la prsence dun facteur trans-rgulateur li un autre lment du pro-moteur. La liaison du rgulateur et du mdiateur ncessite un repliement du DNA du promo-teur pour permettre la liaison de ces protines.

  • La transcription

    4.15 Elongation de la transcription2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 75/204

    BM 29

    Chaque nucloside triphosphate est choisi spcifiquement pour tre complmentaire de labase du brin antisens qui va lui faire face. La liaison riche en nergie entre le premier phos-phate estrifiant le carbone 5 du ribose et les deux autres phosphates est hydrolyse, librantun pyrophosphate qui sera hydrolys ensuite par une pyrophosphatase. Le phosphate restantest li par une liaison ester au carbone 3 libre du dernier nuclotide du transcrit en cours desynthse.

    La RNA polymrase construit un RNA hybrid avec le brin antisens du DNA, dont la squen-ce primaire est la copie du brin sens mais compose de ribonuclotides au lieu des dsoxyri-bonuclotides et duracile la place des thymines.

    Au cours de cette longation la RNA polymrase II est accompagn dune srie de facteursdlongation qui modifient la chromatine pour permettre lavance de lenzyme, empchentla formation dobstacles comme des pingles cheveux ou facilitent lavance de la polycon-densation.

  • La transcription

    4.16 Elongation de la transcription76/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 29/1

    La transcription commence au point dinitiation (environ 25 nuclotides avant la bote TATAsur le brin antisens) par lhybridation et la condensation des premiers ribonuclotides dutranscrit primaire (futur mRNA).

    La double hlice est ouverte en une boucle o se place la RNA polymrase II. Le transcrit primaire reste hybrid sur quelques nuclotides avec le brin antisens puis sen d-

    tache pour permettre la double hlice de se reformer aprs le passage de la polymrase. Lex-trmit 5 du transcrit primaire libre se condense en diverses structures secondaires(pingles cheveux).

    Les substrats de la RNA polymrase sont les quatre ribonuclosides triphosphates. La polymrase lit le brin antisens en allant dans le sens 3 5. Elle poursuit la synthse du

    transcrit primaire en condensant les ribonuclotides jusqu ce quelle rencontre les signauxde terminaison.

    A la rencontre des signaux de terminaison, la polymrase se dtache du DNA, libre le trans-crit primaire et la double hlice se referme.

  • La transcription

    4.17 Discontinuit des gnes2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 77/204

    BM 30

    Les molcules de DNA de chaque chromosome sont trs longues : jusqu plusieurs centainesde millions de paires de nuclotides et contiennent plusieurs milliers de gnes. Chez lhomme,les gnes sont trs disperss et ne reprsentent que 10 % du DNA gnomique total.

    Chaque gne comprend des rgions qui contiennent les squences codes qui seront traduites,les exons ; mais aussi, des rgions de rgulation comme le promoteur et des rgions non tra-duites appeles introns qui sparent les exons. Un gne peut ne contenir quun seul exon etpas dintron, mais il y a des gnes de plus de cent exons.

    Aprs la transcription le RNA produit de la RNA polymrase ou transcrit primaire contientencore les introns et les exons, mais pas le promoteur.

    Aprs lexcision des introns et lpissage des exons, le messager ne contient plus que lesexons runis en une seule squence codante.

  • La transcription

    4.18 Exon78/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 30/1

    Les exons sont des fragments de squence primaire dun gne qui seront recopis dans lastructure primaire du RNA messager, aprs lpissage.

    Il existe des exons de longueur trs variable : courts (34 nuclotides pour lexon 1 de lapoA-II) longs (7572 nuclotides pour lexon 26 de lapoB).

    Un exon code le plus souvent pour un domaine fonctionnel de la protine ou une partie duntel domaine, de sorte que les protines des eucaryotes formes de plusieurs domaines, sont co-des par des gnes possdant au moins autant dexons.

    Au cours de lvolution le gne peut tre modifi par la substitution, linsertion ou la dltiondun exon entier (conversion de gnes) ce qui modifie, apporte ou retire la protine un do-maine fonctionnel en entier.

  • La transcription

    4.19 Exon 12006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 79/204

    BM 31

    Aprs la fixation de la RNA-polymrase sur la bote TATA par lintermdiaire du facteurTFIID, la transcription va commencer 23 nuclotides au del de cette bote.

    A ce point, la squence du brin sens est 5AGGCACAGA...3, celle du brin antisens est donc3TCCGTGTCT...5 (complmentaire et antiparallle).

    En choisissant comme substrats les ribonuclotides complmentaires de ce brin antisens, laRNA-polymrase va composer 5AGGCACAGA...3 qui sera le dbut de la squence duRNA transcrit. Lorsque la polymrase rencontre un A sur le brin antisens, elle incorpore unnuclotide Uracile dans le mRNA : 5...GCUGGCUAG...3.

    La squence du RNA transcrit recopie donc celle du brin sens du DNA. La transcription se poursuit alors tout au long du brin antisens en incorporant 1329 nuclotides

    dans le RNA transcrit de lapoA-II.

  • La transcription

    4.20 Fin de la transcription80/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 32

    La transcription du gne de lapoA-II se poursuit donc durant 1329 nuclotides. Vers la fin du gne des facteurs lis la RNA-polymrase reconnaissent sur le brin antisens

    une squence 3-TTATTT-5 suivie dans la plupart des gnes dun autre signal 3-ATA-CAAAC-5 qui librent la RNA polymrase. La transcription sarrte en effet peu aprs lepremier signal et la fin du transcrit scrit 5-AAUAAAUGCUGAAUGAAUCC-3OH.

    La RNA-polymrase ayant libr le DNA et le transcrit primaire qui contient la copie de lin-formation gntique qui va permettre lexpression du gne sous forme de protine.

  • La transcription

    4.21 Modifications du transcrit2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 81/204

    BM 33

    Chapeau : une enzyme ajoute un nuclotide Guanine sur les phosphates du Carbone 5 dupremier nuclotide du transcrit et transfre des radicaux mthyl sur les premiers nuclotides.Ces modifications font un dbut commun tous les transcrits primaires, prcurseurs des RNAmessagers.

    Queue poly-A : une enzyme coupe le transcrit environ 10 20 nuclotides au del de la s-quence AAUAAA et synthtise sur le Carbone 3 libre du dernier nuclotide du transcrit res-tant une longue chane de 500 2000 nuclotides Adnine polycondenss.

    Edition : Des enzymes peuvent diter (au sens anglais du terme) la structure primaire dutranscrit en modifiant certaines bases (exemple : CU par une cytosine dsaminase spcifi-que dans les apolipoprotines B).

    Excision - pissage : les parties non codantes de la structure primaire du transcrit sont coupeset les parties codantes rassembles.

  • La transcription

    4.22 Enzyme coiffante82/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 33/1

    Lorsque llongation du transcrit primaire commence, lextrmit COOH terminale de la po-lymrase est phosphoryle. Cette phosphorylation permet de librer les protines du comple-xe dinitiation et de commencer aussitt les modifications sur la partie du RNA qui est djtranscrite.

    Pour ajouter la coiffe, un complexe multienzymatique exerce trois activits :

    1. lhydrolyse du phosphate du nuclotide 5 terminal du transcrit primaire2. le transfert sur le phosphate restant dun guanylate partir dun GTP3. la mthylation de ce guanylate sur lazote n7.

    Les deux premires activits sont catalyses par une protine de 68 kDa et la mthylation parune autre sous-unit de 57 kDa.

  • La transcription

    4.23 Coiffe dun messager2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 83/204

    BM 33/2

    Les RNA messagers sont dtruits par des ribonuclases dans le cytoplasme. Leur hydrolyselibre des nuclotides qui seront remploys la synthse de nouveaux acides nucliques.

    Pour protger les RNA messagers de ce catabolisme, une structure particulire dissimule lex-trmit 5 terminale de ces RNA aux exonuclases spcifiques de cette partie du RNA. Cettestructure est appele coiffe du messager (cap).

    Au minimum, il y a fixation dun GMP sur le deuxime phosphate du nucloside triphosphatequi se trouve lextrmit 5 du transcrit. Ce GMP est mthyl sur son azote n7.

    Si le nuclotide initial comprend une adnine celle-ci peut tre mthyle sur lazote n6. Lesriboses des nuclotides initiaux sont quelquefois mthyls sur loxygne de la fonction alcoolen 2.

  • La transcription

    4.24 Queue polyA84/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 33/3

    Des signaux de fin de transcription se retrouvent la fin de la plupart des gnes desMammifres : TATGTTTC.

    A la lecture de ces signaux la RNA polymrase II sarrte de transcrire et quitte le DNA enlibrant le transcrit primaire.

    Aussitt une endonuclase coupe la fin du transcrit environ une quinzaine de nuclotidesaprs un autre signal : AAUAAA dit bote de polyadnylation (ou bote polyA).

    Sur lextrmit 3OH de cette coupure, une polyA polymrase va condenser un grand nombrede nuclotides, tous adnine. Le transcrit primaire se trouve allong dune queuepoly(A) de plus de mille nuclotides.

    Cette queue polyA est indispensable la maturation et lactivit du RNA messager qui laporte. Elle sera lentement digre par les exonuclases du cytoplasme lorsque le messagersera actif. Lorsquelle sera rduite quelques centaines de nuclotides le messager vieilli seradtruit totalement pour tre remplac par un messager neuf.

  • La transcription

    4.25 Le transcrit primaire2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 85/204

    BM 34

    Le transcrit primaire de lapoA-II contenait donc 1329 nuclotides. Il a reu une coiffe (cap), GMP mthyl qui se fixe sur le phosphate de lATP en 5 du trans-

    crit primaire. Il reoit une queue poly-A synthtise en 3 aprs la fin du transcrit. Trois introns vont tre exciss : ils seront reconnus par

    un site donneur GU en 5 de chaque intron, suivi dune squence riche en purines un site receveur AG en 3 de chaque intron, prcd dune squence riche en pyrimidi-

    nes.

    Aprs cette maturation le transcrit primaire devenu RNA messager sera transport vers le cy-toplasme pour la traduction.

  • La transcription

    4.26 Excision - pissage86/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 35

    Les introns, parties non codantes des gnes des eucaryotes, sont coups (excision) de la struc-ture primaire des RNA au cours de la maturation des messagers.

    Les exons, parties codantes, sont ensuite lis entre eux bout bout (pissage), pour tablir lasquence primaire du RNA messager.

    Lexcision et lpissage reprsentent donc laction denzymes et de ribozymes qui catalysentla coupure du RNA (endoribonuclase) et la fermeture de la brche (RNA ligase).

    Lpissage peut tre alternatif, cest dire peut conduire plusieurs structures de RNAm : lesRNAm alternatifs ont chacun en propre certains exons ainsi que des exons en commun.

  • La transcription

    4.27 Formation du lasso2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 87/204

    BM 36

    Lexcision des introns et lpissage des exons est ltape la plus importante de la maturationdu transcrit dans le noyau cellulaire.

    Elle fait appel des facteurs spcifiques : ribonucloprotines contenant des petits RNA (snR-NP), ribozymes (RNA ayant des proprits catalytiques), enzymes spcifiques (maturases)...

    La structure secondaire du transcrit met en contact trois squences de lintron : la squence dudbut de lintron (extrmit 5 ou site donneur), la squence de la fin de lintron (extrmit 3ou site accepteur) et un nuclotide adnine (A du branchement) environ 40 nuclotides avantle site receveur.

    Le site donneur commence habituellement par un nuclotide guanine dont le phosphate estdtach de lexon prcdent pour tre transfr sur le carbone 2 de lA du branchement. Ledernier nuclotide du site accepteur, aussi une guanine, est dtach de lexon suivant, dont lepremier nuclotide est li par son phosphate 5 au carbone 3 du dernier nuclotide de lexonprcdent.

    Lintron, libr sous forme de lasso, est dtruit par des nuclases. Le transcrit perd successi-vement tous ses introns et les exons pisss constituent la squence codante du messager.

  • La transcription

    4.28 Epissages alternatifs88/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 36/1

    Du fait de la prsence de protines rgulatrices sur le transcrit primaire, lpissage peut quel-quefois se faire de faon diffrente dune cellule lautre.

    Il est possible de garder alternativement soit lexon 3 soit lexon 4 du gne de la troponine T(exemple n2). Si lexon 3 est conserv on obtient l-troponine T et si lexon 4 est conservon obtient la -troponine T. Cet pissage alternatif est lorigine de nombreuses protines iso-formes.

    Il est aussi possible (exemple n1) de faire dpendre lexpression dun gne de deux promo-teurs diffrents, rpondant des rgulations diffrentes. Chacun de ces promoteurs est li un exon 1 ou 1bis qui seront pisss alternativement avec la suite du transcrit.

    On peut encore (exemple n3) avoir plusieurs exons la fin du gne contenant des codonsStop en phase. Dans ce cas lpissage alternatif donnera des protines de longueurs diffren-tes.

  • La transcription

    4.29 Maturation des RNA ribosomiques2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 89/204

    BM 36/2

    Pour transcrire les RNA des ribosomes, la RNA polymrase I synthtise un transcrit primairede 13000 nuclotides (nt), et la RNA polymrase III synthtise le petit rRNA 5 S de 120 nt.

    La maturation du transcrit primaire prcurseur des rRNA se fait par excision de troisfragments : le rRNA 28 S de 4718 nt, le 18 S de 1874 nt et le 5,8 S de 160 nt.

    Les rRNA 28 S, 5,8 S et 5 S vont sassocier avec 49 protines pour former la grande sous par-ticule. Le rRNA 18 S formera la petite sous-particule avec 33 protines.

  • La transcription

    4.30 Stabilit du messager90/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

    BM 36/3

    Lacide ribonuclique messager est une copie de travail du gne destin diriger la traductioncatalyse par les ribosomes.

    Son extrmit 5-phosphate est protge par la coiffe sans laquelle le RNA est dgrad ds latranscription par des 5 exonuclases.

    Son extrmit 3-OH est constitue dune longue queue poly(A) qui est lentement digre pardes 3 exonuclases. Lorsque cette hydrolyse est avance, le messager est alors inapte la tra-duction et sera dtruit par les endonuclases.

    Les messagers qui portent peu de ribosomes (parce que linitiation de la traduction