Biochimie Tp

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2010-2011

Introduction

Les titrages complexométriques sont des méthodes titrimétriques basées sur la formation de complexes. Ces

complexes sont constitués d'un ion central et de particules (chargées ou neutres) appelées ligands ou

coordinats. Les Ligands, couramment utilisés pour effectuer le dosage des cations, doivent posséder au

moins un pair d’électrons non liants disponible pour former la liaison avec l’ion central. Le nombre de

liaisons qu’un cation peut former avec des donneurs d’électrons est son nombre de coordination. La stabilité

des complexes dépend de plusieurs facteurs, notamment : la nature du métal central et du ligand et de la

composition du milieu (pH, solvant, ions étrangers, etc.).

Les acides amino-carboxyliques sont des excellents agents complexant; le plus utilisé d'entre eux est l'acide

éthylène diamine et l'EDTA.

Cette méthode est basée essentiellement sur les propriétés de l’acide éthylène-diamine-tétra acétique, sel

disodique et de ces complexes métalliques. On le note H2Y.

Ayoub HATEB 2eme Année

Le dosage du calcium et du magnésium par complexométrie dans l’eau

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A. Introduction aux dosages complexometriques

I. Action du complexon iii sur les ions Ca2+¿¿et M g

2+¿ ¿

1. Le complexon III (acide éthylène diamine tétra acétique sel disodique)

Il cristallise avec 2molécules d’eau ; il est très soluble dans l’eau

Na ,+¿CO2

−¿ ¿¿ CH 2 Na+¿ ¿,CO2

−¿¿ CH 2

N CH 2 CH 2 N

HO2C CH 2

CO2H CH 2

On le symbolise par : EDTA Na2 ,2 H 2O OU Na2H 2Y ,2 H 2O

Dans l’eau Na2H 2Y 2Na+¿+¿¿

2. Réaction avec les cations (complexation)L’atome d’azote possède un doublet libre capable de réaliser une liaison donneur-accepteur avec un cation.

D’autre part les H des fonctions acide carboxylique(-CO2H ) peuvent partir et il peut se former deux liaisons avec le cation

EQUATION-BILAN : [H 2 Y ] ²¯ +Ca2+¿ ¿ [CaY ] ²¯ +2 H−¿ ¿

Remarque :

- Le donneur de doublé dans un complexe est appelé « ligand ».

Dans le cas présent, le ligand donne plusieurs doublés ; le calcium semble saisi entre les pinces de l’ion complexant (ligand). Le complexe obtenu est un chélate.

II. DETERMINATION DES DIFFERENTES DURETES D'UN EAU PAR COMPLEXOMETRIE

1. Définitions de quelques concepts Dureté totale : C’est la concentration en ions calcium et en ion magnésium d’une eau.

Dureté calcique : C’est la concentration en ion Ca2+ d’une eau.

Dureté magnésienne : c'est la concentration en ion Mg2+ d'une eau.


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Dureté permanente : C’est la concentration en ion Ca2+ et en ion Mg2+ d’une eau après ébullition

prolongée et filtration.

Dureté temporaire : C’est la concentration en ions magnésium et calcium enlevé par filtration.

III. Détermination expérimentale des différentes duretés d'une eau par complexométrie

1. ButLa détermination de la dureté d’une eau par complexométrie est une technique permettant d’avoir une idée

sur la potabilité d’une eau .Cette manipulation permet de connaître la teneur en ion calcium Ca 2+ et

magnésium Mg2+ d’une eau ; en effet elle permet de voir si l’eau mousse bien pour des utilisations

industrielles ou ménagères.

2. PRINCIPEIl s’agit d’un dosage direct de la solution de sel disodique de l’EDTA par Ca 2+ en présence du réactif de

PATTON et REEDER selon la réaction suivante :

H2Y2-+Ca2+ CaY2-+2H+

H2Y2--+Ca.Ind CaY2-+2H++Ind2- (en fin de dosage)

Rouge (H2Ind bleu)

3. Mode opératoire

Matériels Becher de 600 ml ou ballon à fond plat (500ml ou 1l)

Burette

Eprouvette de 10 ml

Fiole jaugée (de 250 ml, 1l); fiole jaugée de 1 l.

Pipette de 50 ml de classe A;

Pipette jaugée de 10 ml

Entonnoir et papier filtre

Erlenmeyer de 250 ml

Spatule

Trépied+toile+bec Bunsen


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Produits : Solutions à environ 0.01 du sel disodique de l’EDTA

Une solution calcique étalon à environ 0,01 molaire préparée à partir de CaCO3

chimiquement pur

Eau à analyser et eau distillée

Solution de la soude à environ 2 mol/l

Réactif de Patton et Reeder, si possible en dilution solide dans NaCl à 1% en masse

Tampon ammoniacal à pH=10

Noir ériochrome T en pastilles ou en solution dans l’alcool à 95° GL (0,8g dans

200ml)

Solution du complexe magnésien de l’EDTA à environ 10g/l

Carbonate de calcium pur pour analyse.

IV. Manipulation

1. Étalonnage d'une solution d'EDTA

Réactifs Une solution d'environ 0,01 molaire du sel disodique de l'EDTA.

Une solution calcique étalon 0,01 molaire préparée à partir de CaCO3 chimiquement pur.

De la soude à environ 2 mol.l-1.

De l'acide chloridrique dilué au demi.

L'indicateur de Patton et Reeder en dilution solide, à raison de 1 g de réactif intimement mélangé à

100 g de chlorure de sodium, chimiquement pur et finement pulvérisé.

2. Détermination de la dureté de l’eau

1. PrincipeIl s’agit d’un dosage direct de la solution de sel disodique de l’EDTA par Ca

2+ en présence du réactif de PUTTON et de

REEDER selon la réaction :H 2Y2−¿+C a2+ ¿¿¿ CaY

2−¿+2 H+¿¿ ¿

H 2Y2−¿+C aind ¿ CaY

2−¿+2 H+¿+ ind2−¿¿¿¿


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2. Mode opératoire

a. Préparation de la solution calcique étalonOn prépare 1000ml de solution à 0,0100mol/L ; on part de CaCO3 chimiquement pur et sec qui est le sel de calcium auquel on peut accorder le plus de confiance.

Déterminer la masse de CaCO3 à peser (masse molaire=100,09g.mol−1) ?

Faire passer cette masse avec le minimum d’eau dans une fiole jaugée de 1000ml. Ajouter HCl au ½ goutte à goute jusqu’à fin d’effervescence et dissolution totale du carbonate de calcium (utiliser un minimum d’acide chlorhydrique).

Ajuster au trait de jauge à l’eau distillée.

DOSAGE :

CEDTA=?

H 2Y2−¿¿ V 1=8,8ml

CCaCO3=0,01mol .L−1

CaCO3 V Ca=10 ml

+N aOH à 2M, 10ml et 1 pincée de Patton de Reeder

3. Résultats :

A l’équilibre on a :nEDTA=nCaCO3

CEDTA×V 1=CCaCO3×V CaCO 3 Avec V 1=8,8ml

AN :


CEDTA=CCaCO3×V CaCO 3

V 1

CEDTA=0 ,01×10.10¯ ³

8,8.10¯ ³=0.011mol/ l

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3. Determination de la durete totale d’une eau

a. Définition :

C’est un concept ancien utilisé pour décrire la teneur en ions Ca2+¿¿et M g

2+¿ ¿ des eaux.

b. Dosage

Préparation de la solution Dans un erlenmeyer de 250ml on met :

50 ml d’eau à analyser

2,5ml de tampon pH=10

une pincée de l’indicateur coloré NET

1 ml de complexons magnésien

Dans une burette on met de l’H2Y2-, le volume versé est V2.

CEDTA=0.011mol/ l

H 2Y2−¿¿ V 2=15ml

CCaM g=¿ Dureté totale

V eau=50ml

On dose immédiatement en agitant constamment.

On vers rapidement au début du dosage puis lentement vers la fin

On ajoute la solution de sel disodique de l'EDTA goutte à goutte dés que la couleur de la solution

commence à virer du rouge au bleu.

La couleur ne doit plus changer par addition d'une goutte supplémentaire de solution titrante,


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A l’équilibre on a la couleur bleue et V 2=15ml

On a nEDTA=nCa M g CEDTA ∙V 2=CCa M g

∙V eau

4. Détermination de la dureté calcique

Préparation de la solutionDans une fiole jaugée de 50 ml on met :

50 ml d’eau à analyser

10ml de NaOH à 2M

Une pincée de Patton et Reeder

1 ml de complexons magnésien

CEDTA=0,011mol/ l

V 3=14

CCa=¿ Dureté calcique

V eau=50ml

A l’équilibre on a une coloration bleue et V 3=14 ml


CCaM g=CEDTA ∙V 2

V eau

AN: CCaM g=0.011∗15.10¯ ³

50.10¯ ³=3,3.10−3mol/ l

DT =33F

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On a:nEDTA=nCa CEDTA ∙V 3=CCa

∙V eau

5. Détermination de la dureté magnésienne

6. Détermination de la dureté permanente

a. Préparation de l’eauDans un bécher de 600ml, on met 250 ml d’eau à analyser

Mettre à bouillir cette eau 20 à 30 min de façon à réduire le volume initial d'environ 1/3

Refroidir à la température ordinaire

Filtrer sur l matériel sec

Laisser égoutter le bécher sur le filtre sans le rincer ni rincer le filtre

Transvaser quantitativement le filtrat dans une fiole jaugée de 250 ml

Ajuster au trait de jaugé à l'eau distillée


CCa=

CEDTA ∙V 3

V eau

AN:

CCa=0,011 ∙10¯ ³∗14.10¯ ³

50.10¯ ³=3,08.10−3mol /¿

D’où DCa=30,8F

DMagné sienne=DTotale−DCalcique

AN : DMagné sienne=¿33-30,8

D’où DMg=2 ,2F

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Bouillir l’eau jusqu’au point de repérage Filtrer l’eau bouillie

b. Dosage

On prépare sur une prise d'essai de 100 ml du filtrat ainsi obtenuY ajouter 5 ml de tampon pH=10,02g (ou 2 ml) d'indicateur Net ou 1 ml de Mg Y2- à 10 g/lPrécision du dosage:2,8 %

CEDTA =0,011 mol/l

V 4=8,3ml

C permanante=?

V eau=100ml

A l’équilibre on a V 4=8,3ml

nEDTA=npermanant CEDTA ∙V 4=C permanante ∙V eau

Ayoub HATEB 2eme Année C permanante=CEDTA ∙V 4

V eau

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7. Détermination de la dureté temporaire

B. Dosage des chlorures par argentimétrie

I. Methode de charpentier volhar

1. But : Déterminer la concentration en Cl.

2. PrincipeIl s’agit d’un dosage en retour c'est-à-dire que les ions chlorures contenus dans la solution à titrée sont mis en présence d’un excès d’AgNO3 et seront titré par une solution de thiosulfate de potassium ou d’ammonium de concentration connue en présence d’un indicateur coloré : l’alun de fer et d’ammonium.

3. Mode opératoire

3.1 Minéralisation E=10 ml de lait

XClˉ=?

10 ml de AgNO3 (TAg= 0,1 M , E1=10ml)

10 ml de HNO3 concentré

5 ml de KMnO4 solution saturé


AN: C permanante=0,011.10−³×8,3

100.10−³ =8,75. 10−4mol / l

DP=9,13 F

DT=Dtotale−D permanant

AN: DT=33−9,13

DT=¿23,87F

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Dans un Erlenmayer on ajoute dans la solution 20ml d’eau robinet on aura donc une solution claire.

On l’a bouille pendant 15mn à feux doux ensuite on ajoute 3ml d’indicateur coloré + 30ml d’eau distillée.

3.2 Dosage de l’excès d’Ag

Préparation de la solution On laisse refroidir la solution précédente. on ajoute 50ml d’eau distillée à l'aide d'une éprouvette et 3 ml d'indicateur coloré.

KSCN ( CSCNˉ,V1 =7,5 )

+50 ml d'eau distillée

+3 ml d'alun de fer

3.3 Etalonnage de la solution de thiocyanate


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Préparation de la solutionDans un erlenmeyer de 250ml,

on introduit TA=0,1 mol/l de solution de nitrate d’argent. 50ml d’eau distillée. 10ml d’acide nitrique concentré 2 ml de solution( alun de fer et d'ammonium).

Ensuite on titre rapidement par SCN puis on note le volume V2 correspondant au volume versé avant d’atteindre l’équivalence.

KSCN ( CSCNˉ,V2 =18 )

+ 50 ml d'eau distillée

+AgNO3( TAg=0,1 M, E2=10 ml )

+ 10 ml de HNO3

+3 ml d'alun de fer

4. Resultats

A l’équivalence exprimer XCl en fonction de V1 ; V2 ; E1, E2 ,TAg, E.

A l’équivalence on a :

nAg =nSCN + nCl

Tag*E1 =CSCN*V1+XCl*E

XCl*E=TAg*E1-TAg∗E2

V 2∗V 1

XCl=V 2∗TAg∗E1−TAg∗E2∗V 1V 2∗E


XCl=TAg(V 2∗E1−V 1E2)

V 2∗E

AN : XCl =0.1 ((18 .10❑3∗10. 10❑3)−(7,5∗10❑3))

18.10¯ 3∗10.10¯ ³=0,058mol / l

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C. Dosage des protéines d’un blanc d’œuf par clorimétrie par la méthode du Biuret

Introduction

Au cours des différentes manipulations faites durant notre séance de travaux pratiques le dosage des

protéines par colorimétrie par la méthode du Duret été l'un des objectifs de cette séance, le présent rapport

nous donne une idée générale sur les différentes démarches ainsi que les résultats obtenus.

I- ButLe but de ce dosage est la détermination de la concentration en protéines totale dans un blanc d'œuf.


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1ml

Eau 9ml

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II- PrincipeTout composé possédant au minimum deux liaisons peptidiques va développer en milieu alcalin et en

présence d'ion Ca2+ une coloration bleu violet caractéristique dont la teinte est fonction du nombre de liaison

peptidique. En milieu alcalin, les composés contenants au moins deux groupements

-CONH- ou -CONH2 voisins forment avec les ions Cu2+ un complexe bleu violet (coloration du biuret

H2N-CO-NH-CO-NH2). Cette coloration est ainsi caractéristique des peptides et des protides qui possèdent

la liaison peptidique –CONH-.

La vitesse de développement de la coloration, sa teinte, et son intensité dépendent de :

l’alcanité et du [Cu2+]. On utilise le réactif de Gornall (sulfate de cuivre II + tartrate double de

sodium et de potassium + soude) pour solubiliser les protéines, même dénaturé.

la température

la nature de la protéine.

Le maximum d’absorption se situe vers 530-540nm et varie avec le nombre de

Liaisons peptidiques. L’intensité de coloration est proportionnelle à ce nombre.

On utilise un sérum contenant un mélange de protéine, comme étalon un sérum de commerce connu.

III- Mode opératoire

1. Etalonnage du spectrophotomètre

1.1. DilutionsA partir d’un sérum étalon à 50g / l, on procède à une préparation de 5ml des dilutions suivantes, à l’aide

d’eau physiologique (NaCl 0,9%) : 1/10 ; 1/20 ; 1/40 ; 1/80


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5ml 5ml 5ml 5ml à

Rejeter

5ml sérum étalon

1/10 1/20 1/40 1/80

1ml 1ml 1ml 1ml

1ml eau

Distillée

Tubes N°0 N°1 N°2 N°3 N°4

4ml de RG 4ml de RG 4ml de RG 4ml de RG 4ml de RG

RG= Réactif de Gornall

Vt= volume total

On ajoute dans les différents tubes 4ml de réactif de Gornall ; on mélange puis on attend 20mn, à

température ambiante, à l’obscurité. La coloration est stable plusieurs heures après.

La gamme d’étalonnage sera présentée dans un tableau récapitulatif des différentes données.

La coloration est stable plusieurs heures après.

La gamme d’étalonnage sera présentée selon un tableau en précisant la quantité de protéines en mg par

tube.

1.2. Lecture au spectrophotomètre

On lit la densité optique de chaque tube contre le blanc à λ=540 nm

2. Dosage des protéines totales

2.1. Dilution du blanc d'œuf au 1/20


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1/20 E1 E2

1ml 1ml

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0.5ml de blanc d’œuf

Plus 9.5ml d’eau

VE1 = VE2 = 5ml

On prend un tube à eau, on met 0,5 ml du blanc d'œuf et 9,5 ml d'eau physiologique, on homogénéise, on prend ensuite un autre tube et on met 1 ml du premier tube, après on ajoute 4 ml de Gornall et on incube pendant 20 min et on lit au spectrophotomètre.

1. Questions Donner le tableau de composition des tubes. Tracer la courbe d’étalonnage A=f (g proteines.dm-3) Déterminer la protéinémie du sérum analysé exprimée en g/l

3. Résultat

3.1. Courbe d'étalonnage

Calculons les quantités en mg de protéine par tube

m = C x V x dilution

Ainsi pour les différents tubes nous avons :

Tube 1: m1 = 50 x 1 x1/10 = 5 mg


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Tube 2: m2 = 50 x 1 x 1/20= 2,5mg

Tube 3: m3 = 50 x 1 x1/40 = 1,25mg

Tube 4: m4 = 50 x 1 x 1/80 = 0,625mg

Gamme d'étalonnage : tableau récapitulatif

Nº TUBE 0 1 2 3 4 PTEau distillée 1SE au 1/10 1SE au 1/20 1SE au 1/40 1SE au 1/80 1Blanc d'œuf 1Réactif de Gornall 4 4 4 4 4 4Masse des protéines par tube en mg

0 5 2,5 1,25 0,625 3,2

Absorbance 0 0,382 0,262 0,181 0,017 0,248

Tableau récapitulative des données absorbance et masses de protéines

Tube 0 1 2 3 4 PTMasse de protéines/tube

0 5 2,5 1,25 0,625 3,2

Absorbance 0 0,382 0,262 0,181 0,017 0,248

on trace la courbe des absorbances en fonction des masses de protéines par tube.

mx est trouvé par projection de Ax sur l'axe des abscisses.

mx = 3,2 mg/ml

Cp= mx*20

Cp= (3.2*20) g/l

AN: Cp= 64 g/l


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Courbe d'étalonnage


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