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UNIVERSITE DE RENNES I

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FACULTE DE MEDECINE

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DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLECULAIRE

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PCEM 1

Biochimie Structurale

ENZYMES

CO-ENZYMES

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Pr Marc Denis Année Universitaire 2007-2008

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E N Z Y M O L O G I E 1. GENERALITES

1.1. Définitions 1.1.1. Enzyme 1.1.2. Substrat – Produit 1.1.3. Site actif

1.2. Mode d’action

Diagramme d'une réaction catalytique qui montre l'énergie (E) requise à différentes

étapes suivant l'axe du temps (t). 1.3. Caractéristiques

O OCH2OH CH 2OH

OHO RR OH++ H2Oβ

β Galactosidase

β D Galactoseβ D Galactoside 2. CLASSIFICATION DES ENZYMES

2.1. Oxydo-réductases – EC1 2.2. Transférases – EC2 2.3. Hydrolases – EC3 2.4. Lyases – EC4 2.5. Isomérases – EC5 2.6. Ligases (ou synthétases) – EC6

3/22 3. CINETIQUE DES REACTIONS ENZYMATIQUES A UN SUBSTRAT -

MODELE DE MICHAELIS

3.1. Généralités 3.1.1. Influence de la concentration en enzyme

v

[E]E E

v

v

1 2

1

2

3.1.2. Influence de la concentration en substrat a) Variation de [S], [P] et [ES] au cours du temps

A B Temps

S

P

ES

0 t t

Con

cent

ratio

ns

b) Variation de la vitesse en fonction de [S]

[S]

v

VMEnzyme saturé

COURBE DE SATURATION

4/22

3.2 . Aspect théorique – Equation de Michaelis

v =VM S[ ]S[ ]+ KM

3.3. Signification des paramètres cinétiques

3.3.1 Constante de Michaelis KM

3.3.2 Vitesse maximale VM

3.4. Détermination des paramètres cinétiques

Représentation de Lineweaver et Burk

1v

=KMVM

1S[ ]

+1

VM

ENZYME SUBSTRAT CONCENTRATION (µM)

KM (µM)

Glucose phosphate isomérase Glucose-6-phosphate 450 700 Aldolase Fructose1,6-diphosphate 32 100 Triose phosphate isomérase Glycéraldéhyde-3-

phosphate 3 460

Glycéraldéhyde-3-phosphate deshydrogénase

Glycéraldéhyde-3- phosphate

3 70

Phosphoglycérate kinase 3-Phosphoglycérate 60 1200

5/22 3.5. Activité enzymatique

3.5.1. Définitions et unités 3.5.2. Activité spécifique 4. EFFECTEURS DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE

4.1. Influence de la température 4.1.1. Effet de la température sur la vitesse 4.1.2. Inactivation thermique des enzymes 4.1.3. Résultante des deux effets

Act

ivité

enz

ymat

ique

θopt

ACTIVITE ENZYMATIQUE EN FONCTION DE LA TEMPERATURE

Température

Activation

Dénaturation

4.2. INFLUENCE DU pH

Act

ivité

enz

ymat

ique

pHpH opt

ACTIVITE ENZYMATIQUE EN FONCTION DU pH

4.3. INFLUENCE DES IONS METALLIQUES 4.4. INHIBITEURS DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE

4.4.1. Inhibition compétitive

I

SE ES

+ S

+ IEI

E + PE

6/22

v =VM S[ ]

S[ ]+ KM 1 +I[ ]

KI

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟

K'M = KM 1+

I[ ]KI

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟

1v

=1

VM+

KMVM S[ ]

1+I[ ]

KI

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟

4.4.2. Inhibition non compétitive simple

SE

IE ES

+ S

+ IEI

E + P+ I

+ SESI

7/22

v =VM S[ ]

KM + S[ ]( ) 1 +I[ ]

KI

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟

V'M =

VM

1+I[ ]

KI

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟

1v

=1

VM1+

I[ ]KI

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟ 1 +

KMS[ ]

⎛

⎝ ⎜ ⎞

⎠ ⎟

⎧ ⎨ ⎩

⎫ ⎬ ⎭

4.4.3. Autres types d'inhibitions

4.5. Modèle allostérique

Forme Forme R

8/22 4.6. Rôle biologique des effecteurs enzymatiques

NH2

COOH

Acide p-aminobenzoïque

SO2

NH2

NH2

Sulfamide

N

N NH

N

NH 2

Adénine

N

N NH

N

SH

6 mercaptopurine

5. LES ISOENZYMES 6. LE SITE ACTIF

6.1. Topologie du site actif

R153

R152 R151 R150R149

R31

R32

R33

R170

R34

R35

R36R37

R38

39R40 S

Substratliaison devant être coupée

Squelette peptidique de l'enzyme

chaines latérales des acides aminés

R

REPRESENTATION SCHEMATIQUE DU SITE ACTIF

R

9/22

6.2. Nature de l'interaction enzyme-substrat 6.2.1. Interactions hydrogène 6.2.2. Transfert de charge

6.3. Mise en évidence du site actif 6.3.1. Réactifs de groupes 6.3.2. Marquage par le substrat ou ses analogues 7. REGULATION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE

7.1. Contrôle génétique de la synthèse des enzymes

7.2. Régulation par modification structurale de l'enzyme 7.2.1. Systèmes réversibles a) Phosphorylation - déphosphorylation : Ser, Thr, Tyr

ADP

Enz—Ser—OH

ATP

Enz—Ser—O—PO3H2

b) Adénylylation - désadénylylation : Tyr

PPi

Enz—Tyr—OH Enz—Tyr—O—AMP

ATP

c) Méthylation - déméthylation : Glu

R—CH3 R

Enz—Glu—COOH Enz—Glu—CO—O—CH3 d) MonoADP-ribosylation : Arg, Asn, Lys, Cys

NAD Nicotinamide

Enz—Arg—ribosyl—ADPEnz—Arg 7.2.2. Systèmes irréversibles a) Activation des proenzymes en enzymes par protéolyse limitée. b) Activation des proenzymes par addition de coenzymes

7.3. Régulation au niveau du site catalytique

7.3.1. En fonction de KM et de la concentration en substrat 7.3.2. Inhibiteurs et activateurs

10/22 7.4. Régulation allostérique

7.4.1. Inhibition par le produit final

A B C D PE1 E2 E3 E4 E5

E

7.4.2. Activation par le précurseur

A B C D PE1 E2 E3 E4 E5

E

+

7.4.3. Activation ou inhibition par des métabolites 8. UTILISATION DES ENZYMES EN BIOLOGIE

8.1. Enzyme de Conversion de l'Angiotensine (ECA) 8.2. Amylase 8.3. Créatine phosphokinase (CPK) 8.4. Lactate-déshydrogénase (LDH) 8.5. Phosphatases alcalines (PAl)

11/22

LES COENZYMES 1. DEFINITION ET PROPRIETES 2. CLASSIFICATION

COENZYMES DE TRANSFERT DE GROUPES 1. PYRIDOXAL PHOSPHATE (PLP)

1.1. Structure

R = H R =

Pyridoxal

Pyridoxal phosphate

P

OH

O

OH

CHO

H

HO

H3 C

CH2 O—R

N+

1

5

1.2. Source 1.3. Réactivité

1.3.1. Transamination entre un α aminoacide et un α cétoacide

R1 CHCOOH

NH 2

R2

COOHR2 CH

COOH

NH 2

R1 CCOOH

O++

OC

1.3.2. Décarboxylation 1.3.3. Racémisation

12/22 2. PYROPHOSPHATE DE THIAMINE (TPP)

2.1. Structure

N

N

CH 2

H3 C S

CH3

CH2 CH 2 OR

O

P O P OH

OH OH

NH 2

+

12

4

5

1'

2'3'

4'

5'6' N3

R = H

R =

Thiamine

Pyrophosphate de thiamine

O

2.2. Source

2.3. Principaux types de réactions catalysées 2.3.1. Décarboxylation d'acides α cétoniques 2.3.2. Réactions de transcétolisation 3. BIOTINE

3.1. Structure

HN NH

S

HH

(CH 2 ) 4 COOH

O

12

3 4

5

10

1'

2'

3'

3.2. Réactivité 3.2.1. Carboxylation

3.2.2. Décarboxylation 3.2.3. Transcarboxylation

13/22 4. FOLATES (vit B9)

4.1. Structure

N

N

N

NOH

H2 N

CH 2 NH CR

OH

NH CH (CH 2 )2

COOH

COOH

O

12

34 5

6

78

9 10

1'

2'3'

4'

5' 6'

R =

R =

Acide ptéroïque

Acide ptéroyl glutamique

4.2. Source 4.3. Réactions catalysées

14/22 5. COBALAMINE (vitamine B12)

5.1. Structure

- le cobamide coenzyme B12 R = — 5' désoxyadénosine - les vitamines B12 : R = — CN pour la cyanocobalamine (vit B12) R = — OH pour l'hydroxycobalamine (vit B12a) R = — CH3 pour la méthylcobalamine (méthyl B12)

5.2. Source 5.3. Types de réactions où intervient le coenzyme B12

5.3.1. Isomérisations 5.3.2 Transfert de groupe CH3

15/22 6. COENZYME A

6.1. Structure

(CH 2)2 SHNH

CH

CH3C

H C2

OH

CH3

Cystéamineβ Alanine

Acide pantoïque

3' 5' diphospho adénosine

N

N N

N

NH 2

1

3

7

9

H PO2 3

Acide pantothénique

Pantéthéine

OH2COPO

OH

O

1'

2'3'

4'

5'

O OH

PO

OH

O

CO CO (CH2)2NH

6.2. Réactions catalysées 6.2.1. Réactions d'acylation

R CO

O AMPR C

O

SCoA+ AMP+ CoASH

Acyl AMP

Acyl CoA

6.2.2. Réactions de condensation 7. NUCLEOSIDES 5' MONO ET POLYPHOSPHATES

7.1. Structure de l'ATP

N

N N

N

O

NH 2

H2 COPOPOHO

OH OH OH

O OO

P

1

3

7

9

1'

2'3'

4'

5'

γ

ATP

ADP

AMP

OH OH

αβ

Adénosine

liaison ester

liaisons anhydrides

16/22 6.2. Propriétés de l'ATP

6.2.1 Hydrolyse de l'ATP

R O P O P O P OH

OH OH OH

O O O

H OH°°α β γ

ou

6.2.2. Complexation

6.3. Principaux types de réactions ou intervient l'ATP

6.3.1. Transfert de phosphate

Adénine-ribose — P — P — P + R — OH R — OP + ADP

6.3.2. Transfert de pyrophosphate

Adénine-ribose — P — P — P + R — OH R — O — P — P + AMP

6.3.3. Transfert d'adénosine monophosphate

Adénine-ribose — P — P — P + R R — AMP + Ppi

ATP + R CO

OH

R CO

O P ribose-adéninePP i

Acyl AMP

ATP + R CHCOOH

NH2

R CHCO

NH2

O P ribose-adénine

PP i

Aminoacyl AMP

6.4. Autres nucleosides phosphates

6.4.1. Nucléosides diphospho – oses 6.4.2. Nucléosides monophosphate cycliques

17/22

N

N N

N

O

NH2

O

H2 CO

PHO

O

AMP cyclique

3'

5'

Membrane plasmique

Récepteur de l'hormone

Adénylate cyclase

Protéine kinase inactive

Protéine kinase active

Enzyme déphosphorylé inactif

Enzyme phosphorylé actif

H

responsable des effets biologiques

+

+

+

MODE D'ACTION DE L'AMP CYCLIQUE SECOND MESSAGER HORMONAL

Hormone

extérieur

intérieur

ATP 3'5' AMP

18/22

COENZYMES D'OXYDO-REDUCTION 1. COENZYMES NICOTINIQUES

1.1. Structure

1.1.1. Nicotinamide adénine dinucléotide NAD+

C

NH 2

NO

N

N N

N

O

NH2

O — R

O

O

O

H2P C

O

+

12

3

9

5' +

1

23

5'

4

AMP

Nicotinamide nucléotide

HO O

O

H2P C

HO

NAD NADP+

R = — H R = — PO H

3 2

2'

1.1.2. Le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate NADP+

COH

N

OC

OH

N

O

19/22

N

H

C

R

O

NH 2

N

HC

R

O

NH 2

Hion hydrure°°

H−

44Attaque

nucléophile

+

N N

R R

+ H++ 2 H+ + 2 e-

H H H

+

Ox RedE' = - 0,32 V°

1.2. Sources 1.3. Propriétes optiques des coenzymes pyridiniques

260 340 420

Abs

orpt

ion

λ (nm)

NADH

NAD+

1.4. Principaux types de réactions catalysées par les coenzymes pyridiniques

1.4.1. Oxydation d'alcools primaires

R — CHOR — CH2OH

NAD + NADH + H +

1.4.2. Oxydation d'alcools secondaires

OH

R — CH — R' R — C — R'

O

NAD + NADH + H +

20/22

1.4.3. Oxydation d'aldéhydes hydratés

H

OR C

H

OHOH

R CO

OHR — C 2

NAD + NADH + H +

+ H O

1.4.4. Transformation d'amines primaires en cétones

R C R'

O

R C R'

NH

R CH R'

NH 2 H O2 NH 3

imine

NAD + NADH + H +

2. COENZYMES FLAVINIQUES

2.1. Structure

H3C

H3C

CH 2

(CHOH)3

CH 2

O

P O P OOH

O O

OH

N

N N

N

O

NH 2

H2 C

6

7

95'

FMN

FAD

Rib

ofla

vine ON

N

N

NH

O

12

3

45

8 9

10

O

2.2. Sources 2.3. Réactions catalysées par les coenzymes flaviniques

N

N

N

N

H

H

H

H

Ox Red

+ 2 H + + 2 e -

E' = - 0,20 V°

1

10

1

10

21/22 2.2.1. Hydrogènes provenant d'un substrat réduit XH2

FAD FADH 2

XH X2

H2C COOH

H2C COOH CHHOOC

HC COOH

Acide succinique Acide fumarique (trans)FAD FADH 2 2.2.2. Hydrogènes issus de coenzymes nicotiniques réduits

XH NADH + H FADH Cytochrome red

X NAD FAD Cytochrome ox

22+

e-+

3. COENZYMES QUINONIQUES

O OH

OH

+ 2 H + + 2 e −

E' = + 0,10 V°

OOx Red

4. ACIDE LIPOIQUE

(CH2)4— COOH

HS SH+ 2 H+ + 2 e-

Acide lipoïque oxydé

Acide lipoïque réduit

S S

E' = - 0,29 V°

(CH2)4— COOH

CH2

CH3

H3 CO

H3 CO

CHC

CH2

CH3

H

On

avec 4 < n < 10

O

CH2

CH3

H3 CO

H3 CO

CHC

CH2

CH3

H

On

avec 4 < n < 10

O

22/22 5. ACIDE ASCORBIQUE

+ 2 H + + 2 e −

E' = + 0,06 V°

C

C

C

HC

C

CH2OH

O

O

O

HO

O

Acide L déhydro ascorbique

C

CH2 OH

HO

Acide L ascorbique

C

C

C

HC

O

OH

OHO

HH

6. LE GLUTATHION

H2 NCH

(CH 2)2C

NCH

C CH2COOH

CH 2O

OAcide glutamique Cystéine Glycine

HOOC

SH

H

NH

G—S—S—G + 2 H+ + 2 e- 2 G—SH