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BIOCHIMIE STRUCTURALE– Biotech 1

Chapitre 6

Enzymologie

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SOMMAIRE

1. Généralités 1.1. Classification des enzymes 1.2. Spécificité de la réaction enzymatique

2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique

3. La cinétique enzymatique simple 3.1. Influence de la concentration en enzyme 3.2. Influence du pH 3.3. Influence de la température 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten 3.5. Mesure de l’activité enzymatique 3.6. Influence des inhibiteurs

4. Contrôle de l’activité enzymatique 4.1. La protéolyse ménagée 4.2. Modifications covalentes réversibles 4.3. Les enzymes allostériques

5. Les cofacteurs et coenzymes

6. Les isoenzymes

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SOMMAIRE

1. Généralités 1.1. Classification des enzymes 1.2. Spécificité de la réaction enzymatique

1.2.1. Modèle de Fischer 1.2.2. Modèle de Koshland

2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique

3. La cinétique enzymatique simple 3.1. Influence de la concentration en enzyme 3.2. Influence du pH 3.3. Influence de la température 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten 3.5. Mesure de l’activité enzymatique 3.6. Influence des inhibiteurs

4. Contrôle de l’activité enzymatique 4.1. La protéolyse ménagée 4.2. Modifications covalentes réversibles 4.3. Les enzymes allostériques

5. Les cofacteurs et coenzymes

6. Les isoenzymes

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1. GÉNÉRALITÉS

- réaction chimique = transformation : A + B → C + D

- dans nos cellules : des milliers de réactions chimiques en permanence → nécessité de catalyseurs pour :

- accélérer la réaction - contrôler la réaction

CO2 H20 +

Réaction très lente (années/siècles) Libération de chaleur « inutilisable »

Saccharose (sucre courant)

02 +

Catalyseurs et catalyse (1)

Notion de catalyse. Propriétés des catalyseurs biologiques

Les catalyseurs biologiques sont les enzymes

- ils agissent à 37°C, dans un milieu à pH spécifique - ils ont une STRUCTURE PROTEIQUE, souvent globulaire

- ils ont une grande SPECIFICITE : choix du substrat et présentation (site actif)

- ils ont des CAPACITES DE REGULATION

E6

Muqueuse intestinale (contenant la saccharase et les enzymes de la glycolyse aérobie)

Réaction très rapide (secondes) Production d’énergie

utilisable (ATP)

saccharose

+ O2 CO2 + H2O

réaction très lente (années / siècles)

réaction très rapide (secondes) → production d’énergie utilisable

muqueuse intestinale (saccharase + enzymes glycolyse)

- catalyseurs biologiques : enzymes (E) = protéines (sauf ribozymes)

→ transformation d’un substrat S en produit P S PE

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1. GÉNÉRALITÉS

DÉFINITIONS

- ENZYME : protéine présentant des propriétés de catalyse spécifique d’une réaction chimique du métabolisme

- SUBSTRAT : molécule qui entre dans la réaction pour y être transformée grâce à l’activité catalytique d’une enzyme

- PRODUIT : molécule qui apparaît au cours d’une réaction catalysée par une enzyme

- LIGAND : corps chimique ayant une liaison spécifique avec une protéine

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1. GÉNÉRALITÉS

- métabolisme = ensemble des réactions chimiques d’une cellule

- réactions organisées en voies (séquences ou chaînes) métaboliques : - suite ordonnée de réactions biochimiques permettant des transformations

successives de substrats en produits → le produit d’une réaction devient substrat de la suivante

- chaque étape est catalysée par une enzyme spécifique - l’absence d’une enzyme ou d’un substrat perturbe en général l’ensemble de la voie

précurseur

métabolite 1

métabolite 2

...

produit

E1

E2

E3

Ex

10 10

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Introduction à l’étude du métabolisme

z Métabolisme : processus au travers duquel le monde vivant acquiert et utilise l’énergie libre requise pour exécuter ses diverses fonctions

z Voies métaboliques : succession d’étapes catalysées par des enzymes résultant en produits spécifiques

Ö Catabolique

Ö Anabolique

Ö Amphibolique

schéma simplifié du métabolisme

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1.1. Classification des enzymes

1. GÉNÉRALITÉS

- classification des enzymes selon une nomenclature internationale : E.C.

- 6 classes principales selon la nature de la réaction catalysée :

classe action

E.C.1 oxydo-réductases transfert d’électrons

E.C.2 transférases transfert de groupes chimiques

E.C.3 hydrolases réaction d’hydrolyse : transfert de groupes fonctionnels à l’eau

E.C.4 lyases addition de groupes sur double liaison ou formation de double liaison par soustraction de groupe

E.C.5 isomérases transfert de groupes à l’intérieur d’une molécule pour former un isomère

E.C.6 ligases formation de liaison C-C, C-S, C-O ou C-N par réaction de condensation. Nécessite un apport d’énergie (ATP)

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1.1. Classification des enzymes

1. GÉNÉRALITÉS

- chaque type de réaction est divisé en classes puis en sous-classes

- chaque enzyme possède un matricule à 4 chiffres :

X - X - X - X

réaction chimique

classe

sousclasse

caractéristique de l'enzyme

ex : chymotrypsine EC.3.4.4.5 - 3 (hydrolase) - 4 (hydrolyse de peptide) - 4 (protéase à sérine) - 5 (chymotrypsine)

- nom usuel : nom du substrat et/ou de la réaction + suffixe “ase”

Exemples : saccharase → hydrolyse du saccharose lactate déshydrogénase → oxydation réversible du lactate en pyruvate

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1.2. Spécificité de la réaction enzymatique

1. GÉNÉRALITÉS

- enzymes étroitement spécifiques (≠ catalyseurs chimiques) : - UNE réaction chimique donnée - sur UN substrat ou UN type de substrats défini

EXEMPLES :- trypsine et chymotryspine = peptidases

reconnaît résidus basiques chargés >0

(Lys, Arg)

reconnaît résidus aromatiques

(Tyr, Phe, Trp)

- hexokinase et glucokinase = kinases

phosphoryle les hexoses (glucides à 6C)

phosphoryle le glucose (6C)

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1.2. Spécificité de la réaction enzymatique

1. GÉNÉRALITÉS

- spécificité due à l’adéquation entre les structures site actif / substrat

Mécanisme d ’action des sérines protéases : cas de la chymotrypsine (1) La chymotrypsine appartient à la superfamille des sérines protéases, avec notamment la trypsine, l’elastase, la subtilisine… Ces enzymes catalysent une réaction d’hydrolyse de la liaison peptidique. Ce sont des endopeptidases

- C - C

Rn

-NH

H

- C – CO-

Rn+1

N

H O

H

H2O + - C - C

Rn

-NH

H O

- OH - C – CO-

Rn+1

NH2

H

+

La chymotrypsine est une protéine de 25 kDa, globulaire de forme ellipsoïde

Le repliement de la protéine génère un site actif dans lequel 3 acides aminés particuliers vont jouer un rôle majeur : H57, D102, S195. Ils forment la triade catalytique. substrat

Site actif

Il s’agit en fait de trois chaînes polypeptidiques (A,B,C) réunies par des ponts disulfure interchaînes et stabilisées par des ponts disulfure intrachaînes

A B C

Mécanismes d’action des enzymes (1)

site actif (acides aminés) substrat

- site actif : - site de reconnaissance : reconnaît le substrat (en 3D) → formation liaisons faibles entre acides aminés du site actif et substrat

- site catalytique : transforme le substrat → fonctions chimiques nécessaires à la réaction présents sur les chaînes latérales des

acides aminés

SITE ACTIF : partie protéique - composé d’acides aminés parfois

éloignés dans la structure primaire - fonctions chimiques portées par les

chaînes latérales des acides aminés

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- tout acide aminé nécessaire à l’activité enzymatique appartient au site actif

- site actif petit : < 5% de la surface protéique

- si le substrat est une macromolécule : seule la partie à transformer entre en contact avec le site actif

Mécanisme d ’action des sérines protéases : cas de la chymotrypsine (1) La chymotrypsine appartient à la superfamille des sérines protéases, avec notamment la trypsine, l’elastase, la subtilisine… Ces enzymes catalysent une réaction d’hydrolyse de la liaison peptidique. Ce sont des endopeptidases

- C - C

Rn

-NH

H

- C – CO-

Rn+1

N

H O

H

H2O + - C - C

Rn

-NH

H O

- OH - C – CO-

Rn+1

NH2

H

+

La chymotrypsine est une protéine de 25 kDa, globulaire de forme ellipsoïde

Le repliement de la protéine génère un site actif dans lequel 3 acides aminés particuliers vont jouer un rôle majeur : H57, D102, S195. Ils forment la triade catalytique. substrat

Site actif

Il s’agit en fait de trois chaînes polypeptidiques (A,B,C) réunies par des ponts disulfure interchaînes et stabilisées par des ponts disulfure intrachaînes

A B C

Mécanismes d’action des enzymes (1)

site actif (acides aminés) substrat

1.2. Spécificité de la réaction enzymatique

1. GÉNÉRALITÉS

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1.2. Spécificité de la réaction enzymatique 1.2.1. Modèle de Fischer

1. GÉNÉRALITÉS

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substrat

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MODÈLE DE FISCHER (CLÉ-SERRURE)

pré-existence de la complémentarité de forme entre l’enzyme et le substrat

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1. GÉNÉRALITÉS

1.2. Spécificité de la réaction enzymatique 1.2.2. Modèle de Koshland

MODÈLE DE KOSHLAND (AJUSTEMENT INDUIT)

déformation de l’enzyme pour s’adapter à la structure du substrat → les acides aminés s’orientent de façon à permettre la fixation du substrat

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SOMMAIRE

1. Généralités 1.1. Classification des enzymes 1.2. Spécificité de la réaction enzymatique

2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique

3. La cinétique enzymatique simple 3.1. Influence de la concentration en enzyme 3.2. Influence du pH 3.3. Influence de la température 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten 3.5. Mesure de l’activité enzymatique 3.6. Influence des inhibiteurs

4. Contrôle de l’activité enzymatique 4.1. La protéolyse ménagée 4.2. Modifications covalentes réversibles 4.3. Les enzymes allostériques

5. Les cofacteurs et coenzymes

6. Les isoenzymes

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2. MÉCANISMES GÉNÉRAUX

- pour avoir lieu, une réaction doit être thermodynamiquement favorable → énergie de l’état final plus faible que celle de l’état initial

- ∆G (ou dE, ou ∆E) : différence d’énergie libre entre l’état final et l’état initial - ∆G < 0 : réaction exergonique, spontanée - ∆G > 0 : réaction endergonique → n’aura lieu que si elle est couplée à une réaction exergonique qui apporte l’énergie

(ex : hydrolyse d’ATP)

RÉACTION CHIMIQUE ET ÉNERGIE

Effet de la température

2002 - 2003 Enzymologie élémentaire - Pr A. Raisonnier 123/131

9.4 Energie d’activation

EE 61

• Au cours de la réaction enzymatique les corps en présence, enzyme, substrats, cofacteurs,etc... échangent donc de la chaleur avec les autres molécules de ce milieu : on dit qu’il y aéchange d’énergie libre entre le complexe enzyme-substrat et le milieu.

• On représente sur un graphe l’énergie interne de ce complexe en fonction du temps au coursdes phases de la réaction, dans l’hypothèse où l’énergie interne du complexe enzyme substrat(A) est supérieure à celle du complexe enzyme-produit (B) ce qui revient à dire que la réactionlibèrera en fin de compte de la chaleur dans le milieu.

• Pour que cette réaction soit possible, le complexe enzyme-substrat va d’abord recevoir du mi-lieu une quantité de chaleur (dEA énergie d’activation) qui portera ce complexe à un état ac-tivé (A*) où la réaction va pouvoir se produire en libérant dans le milieu une quantité dechaleur (dEB) égale à l’énergie d’activation (dEA) augmentée de la chaleur de la réaction pro-prement dite (dE).

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2. MÉCANISMES GÉNÉRAUX

- lors d’une réaction chimique, formation d’un état de transition → énergie plus élevée que celle de S ou P

- énergie d’activation (Ea, dEA) : énergie nécessaire à la formation de l’état de transition = barrière énergétique entre état initial et état final

ÉTAT DE TRANSITION ET ÉNERGIE D’ACTIVATION

Effet de la température

2002 - 2003 Enzymologie élémentaire - Pr A. Raisonnier 123/131

9.4 Energie d’activation

EE 61

• Au cours de la réaction enzymatique les corps en présence, enzyme, substrats, cofacteurs,etc... échangent donc de la chaleur avec les autres molécules de ce milieu : on dit qu’il y aéchange d’énergie libre entre le complexe enzyme-substrat et le milieu.

• On représente sur un graphe l’énergie interne de ce complexe en fonction du temps au coursdes phases de la réaction, dans l’hypothèse où l’énergie interne du complexe enzyme substrat(A) est supérieure à celle du complexe enzyme-produit (B) ce qui revient à dire que la réactionlibèrera en fin de compte de la chaleur dans le milieu.

• Pour que cette réaction soit possible, le complexe enzyme-substrat va d’abord recevoir du mi-lieu une quantité de chaleur (dEA énergie d’activation) qui portera ce complexe à un état ac-tivé (A*) où la réaction va pouvoir se produire en libérant dans le milieu une quantité dechaleur (dEB) égale à l’énergie d’activation (dEA) augmentée de la chaleur de la réaction pro-prement dite (dE).

dEA = énergie d’activation

- si Ea trop élevée, réaction quasi-impossible dans la cellule

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2. MÉCANISMES GÉNÉRAUX

RÔLE DE LA CATALYSE (chimique ou biologique)

- diminuer l’énergie d’activation de la réaction

- formation d’un ou plusieurs intermédiaires plus stables : Ea plus faible

- catalyse enzymatique : intermédiaire(s) = complexe(s) enzyme-substrat ES

stabilisé(s) par des liaisons non covalentes entre E et S

- plus Ea est faible, plus la réaction est rapide

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CATALYSE ENZYMATIQUE

2. MÉCANISMES GÉNÉRAUX

E + S ⇄ ES (⇄ EP) ⇄ E + P

- étape 1 : formation complexe enzyme-substrat stéréospécifique de l’affinité et de la complémentarité des structures

- éventuellement formation d’autres complexes intermédiaires EP

- étape 2 : décomposition du complexe en enzyme libre et substrat transformé en produit

E + S ⇄ ES ⇄ E + P

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2. MÉCANISMES GÉNÉRAUX

un catalyseur agit EXCLUSIVEMENT sur la vitesse, pas sur l’équilibre!

énergies inchangées

- cinétique accélérée : Ea plus faible - thermodynamique inchangée : ∆G identique

CATALYSE ENZYMATIQUE

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→ une réaction "non faisable" ne deviendra pas "faisable" en présence d’enzyme

- plusieurs possibilités :

- réversible

- irréversible

- éventuellement nécessité d’un cofacteur

enzyme 1

enzyme 2substrat produit

substrat produit

enzyme 1

enzyme 1+ cofacteur

substrat produit

enzyme 1

enzyme 2substrat produit

substrat produit

enzyme 1

enzyme 1+ cofacteur

substrat produit

enzyme 1

enzyme 2substrat produit

substrat produit

enzyme 1

enzyme 1+ cofacteur

substrat produit

2. MÉCANISMES GÉNÉRAUX

CATALYSE ENZYMATIQUE

un catalyseur agit EXCLUSIVEMENT sur la vitesse, pas sur l’équilibre!

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2. MÉCANISMES GÉNÉRAUX

CATALYSE ENZYMATIQUE

- modification de la vitesse, pas de la thermodynamique :

→ formation d’intermédiaires (ES, EP), d’Ea basse → accélération de la vitesse (x 106) → constante d’équilibre de la réaction inchangée → enzyme inchangée en fin de réaction

- diminution de l’Ea grâce à :

- effet de proximité : rapprochement E-S - catalyse acide /base : acide donneur de protons, électrophile

base accepteur de protons, nucléophile - interactions E/S : électrostatiques, liaisons hydrogène - catalyse covalente : formation liaison temporaire entre résidus polaires non chargés

(E : Cys, Ser) → intermédiaires plus réactifs

- changements conformationnels, flexibilité

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CATALYSEURS BIOLOGIQUES = ENZYMES

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2. MÉCANISMES GÉNÉRAUX

!

- accélèrent la vitesse de réaction

- sont retrouvées inchangées en fin de réaction

- agissent en petites concentrations

- ne modifient pas l’équilibre d’une réaction réversible

- l’équilibre final est le même qu’en absence d’enzyme… mais obtenu plus rapidement

→ modification de la cinétique, pas de la thermodynamique

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SOMMAIRE

1. Généralités 1.1. Classification des enzymes 1.2. Spécificité de la réaction enzymatique

2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique

3. La cinétique enzymatique simple 3.1. Influence de la concentration en enzyme 3.2. Influence du pH 3.3. Influence de la température 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten 3.5. Mesure de l’activité enzymatique 3.6. Influence des inhibiteurs

3.6.1. Inhibitions “irréversibles” : exemple des AINS 3.6.2. Inhibitions réversibles

4. Contrôle de l’activité enzymatique 4.1. La protéolyse ménagée 4.2. Modifications covalentes réversibles 4.3. Les enzymes allostériques

5. Les cofacteurs et coenzymes

6. Les isoenzymes

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3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

CINÉTIQUE ENZYMATIQUE

- analyse et quantification de la catalyse

- influencée par différents facteurs : - ceux contenus dans la relation E + S ⇄ ES ⇄ EP ⇄ E + P

- ceux liés à l’environnement de la réaction : - pH - température - ions - coenzymes et autres composés que S et P

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S1

3

S2

6

S3

- mesure de la vitesse de réaction transformant S en P, catalysée par l’enzyme E : [P] = f (t)

vitesse de réaction v = - d[S]dt

=d[P]dt

(mol.L-1.s-1)

- v tangente à la courbe - v varie au cours du temps

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25

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

CINÉTIQUE ENZYMATIQUE

- phase très brève (invisible) - liaison rapide et réversible E + S - [ES]↑ - v croissante

- toutes les E sont sous forme ES

- [ES] constante - v maximale et constante

tant que [S] ≫ [P]

- [P] ↑ - la réaction réverse P → S

commence à se produire - v diminue

Effet de la concentration d’enzyme

30/131 Enzymologie élémentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

3.3 Phases de la réaction

EE 10

• Revenons à notre échelle, en mesurant la concentration du produit P en fonction du temps.Dans un milieu où il n’y a au temps 0 que des molécules de l’enzyme et du substrat, la réactionse déroule de façon non uniforme.

• On distingue une première phase très brève, au cours de laquelle la vitesse de la réaction estcroissante. Durant cette phase, les molécules de substrat se lient avec l’enzyme : la concentra-tion du complexe enzyme-substrat augmente.

• Lorsque toutes les molécules de l’enzyme sont occupées par des molécules du substrat la vi-tesse de la réaction est maximum et reste constante tant que la concentration du substrat estgrande et celle du produit petite. C’est ce qu’on observe lors des premières mesures.

• Lorsque la concentration du produit augmente, la réaction inverse commence à concurrencercelle qu’on mesurait : la vitesse diminue.

• Enfin dans une dernière phase, tardive, la vitesse de la transformation inverse devient égale àcelle de départ : les concentrations ne changent plus, on est à l’équilibre.

- vitesse réaction directe = vitesse réaction réverse

- équilibre - [S] et [P] constantes - v nulle et constante

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26

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

CINÉTIQUE ENZYMATIQUE

En enzymologie, TOUJOURS étude de :

- la phase stationnaire “conditions de vitesse initiale”

- vitesse initiale (Vi, V0) → vitesse la plus grande de toutes les

vitesses mesurables → variation linéaire → efficacité catalytique maximale

Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie

26

Effet de la concentration d’enzyme

30/131 Enzymologie élémentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

3.3 Phases de la réaction

EE 10

• Revenons à notre échelle, en mesurant la concentration du produit P en fonction du temps.Dans un milieu où il n’y a au temps 0 que des molécules de l’enzyme et du substrat, la réactionse déroule de façon non uniforme.

• On distingue une première phase très brève, au cours de laquelle la vitesse de la réaction estcroissante. Durant cette phase, les molécules de substrat se lient avec l’enzyme : la concentra-tion du complexe enzyme-substrat augmente.

• Lorsque toutes les molécules de l’enzyme sont occupées par des molécules du substrat la vi-tesse de la réaction est maximum et reste constante tant que la concentration du substrat estgrande et celle du produit petite. C’est ce qu’on observe lors des premières mesures.

• Lorsque la concentration du produit augmente, la réaction inverse commence à concurrencercelle qu’on mesurait : la vitesse diminue.

• Enfin dans une dernière phase, tardive, la vitesse de la transformation inverse devient égale àcelle de départ : les concentrations ne changent plus, on est à l’équilibre.

- toutes les E sont sous forme ES

- [ES] constante - v maximale et constante

tant que [S] ≫ [P]

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

CINÉTIQUE ENZYMATIQUE

En enzymologie, TOUJOURS étude de :

- la phase stationnaire

- vitesse initiale (Vi, V0) → vitesse la plus grande de toutes les

vitesses mesurables → efficacité catalytique maximale

!

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27

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.1. Influence de la concentration en enzyme

Effet de la concentration d’enzyme

32/131 Enzymologie élémentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

3.5 Concentration de l’enzyme

EE 12

• Examinons l’évolution de la réaction lorsqu’on change la concentration de l’enzyme.• Les mesures de la concentration du produit en fonctions du temps sont différentes pour cha-

cune des concentrations de l’enzyme essayées. Lorsque la concentration de l’enzyme est gran-de (par exemple E3) la vitesse initiale est plus grande que lorsque la concentration del’enzyme est petite (par exemple E1).

Effet de la concentration d’enzyme

34/131 Enzymologie élémentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

3.7 Dosage enzymatique

EE 13

• Représentons cette fois ces vitesses initiales en fonction des concentrations E1, E2 et E3 del’enzyme. Il apparaît que les vitesses mesurées sont linéairement proportionnelles aux con-centrations de l’enzyme utilisées.

• Cette constatation est le fondement du dosage enzymatique : en effet, la vitesse initiale d’uneréaction enzymatique dans un milieu où la concentration de l’enzyme est inconnue est pro-portionnelle à cette concentration. En comparant cette vitesse initiale (qu’on appelle dosageenzymatique) à celles d’autres milieux de concentration en enzyme connues, on peut évaluerla concentration en enzyme qu’on cherchait. Ces dosages enzymatiques sont des mesuresd’activités catalytiques qu’on exprime dans le Système International en Katal, unité qui repré-sente une quantité d’enzyme capable de catalyser la transformation d’une mole de substrat enune seconde. En pratique médicale, le microkatal et le nanokatal sont les sous-multiples cor-respondant à l’ordre de grandeur des activités mesurées. Pour exprimer des concentrationsd’enzyme on rapporte au volume considéré et l’unité devient le nanokatal par litre par exem-ple.

• L’Unité Internationale est une ancienne unité de mesure représentant la quantité d’enzyme ca-pable de catalyser la transformation d’une micromole de substrat en une minute. Une UnitéInternationale égale 15 nanokatal.

- [E] variable, tous autres paramètres constants

- [S] ≫ [E]

- mesure de V0 pour différentes [E], conditions de Vi

→ V0 varie linéairement avec [E]

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28

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.2. Influence du pH

Effet du pH

114/131 Enzymologie élémentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

8.1 Dénaturation

EE 54

• L’enzyme, les substrats, les cofacteurs sont les corps chimiques qui interviennent obligatoi-rement dans la réaction enzymatique.

• Parmi les facteurs qui interviennent il y a aussi des facteurs physiques : le pH et la températurepar exemple. Le pH intervient de deux manières différentes : soit en modifiant la structure se-condaire ou tertiaire de l’enzyme, soit en modifiant les charges électriques des radicaux desacides aminés du site actif.

• Lorsqu’une enzyme est conservée dans un milieu dont le pH est défavorable au maintien desa structure, elle va subir une dénaturation.

• Examinons cet effet sur un graphe représentant l’activité résiduelle d’une enzyme qui a étéconservée pendant 24 heures à une température de 30°C., en fonction du pH de ce milieu deconservation.

• A pH 3 cette enzyme a été conservée dans des conditions optimales et son activité résiduelleest la plus grande : 100%. A pH 6 l’enzyme a subi une dénaturation partielle si bien qu’aubout de 24 heures son activité n’est plus que de la moitié de ce qu’elle aurait été si on l’avaitconservée à pH 3. A pH 9 ou bien en dessous de pH 3, cet effet dénaturant est encore plusmarqué.

Effet du pH

116/131 Enzymologie élémentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

8.3 pH optimum

EE 56

• Les enzymes de la digestion des protéines ont des pH optimums différents pour s’adapter auxconditions de pH qui règnent dans la lumière aux différents étages du tube digestif. Ainsi l’ac-tivité de la pepsine est maximum pour un milieu très acide comme celui de l’estomac où elleest secrétée. Au contraire les enzymes pancréatiques comme l’amylase et la trypsine, ont unpH optimum d’action plus alcalin car dans le duodénum où elles exercent leur activité le pHest normalement proche de 8.

- pH variable, tous autres paramètres constants

- modification de l’état d’ionisation des acides aminés (site actif ou non)

- dénaturation de l’enzyme (perte structure 3D)

- vitesse de formation ou de dissociation de ES affectée

→ pH optimum caractéristique de chaque enzyme

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29

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.3. Influence de la température

Effet de la température

120/131 Enzymologie élémentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

9.1 Température optimum

EE 58

• Examinons maintenant l’effet de la température du milieu sur la réaction enzymatique qui s’ydéroule.

• Le graphe qui représente les quantités de produit transformées par une enzyme (A) en fonctionde la température (θ) du milieu d’incubation, est une courbe ascendante jusqu’à une tempéra-ture (ici 45°C.) où l’activité de l’enzyme est la plus grande, puis rapidement descendante.

- augmentation de la température → accélération de la vitesse de réaction (loi d’Arrhénius) - puis dénaturation progressive de l’enzyme → température d’inactivation spécifique

de chaque enzyme - dénaturation négligeable pour θ < 30°C, appréciable pour θ > 40°C - enzymes biologiques : température optimale 37°C - cas particulier : certaines bactéries thermophiles (Taq polymérase θoptimale = 75-80°C)

- température variable, tous autres paramètres constants

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30

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten

- [S] variable, tous autres paramètres constants

- [S] ≫ [E]

- mesure de Vi pour chaque [S] (tangentes)

- lorsque [S] augmente, V0 augmente

- report des V0 sur un graphe V0 = f([S])

Effet de la concentration de substrat

36/131 Enzymologie élémentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

4.1 Concentration du substrat

EE 14

• Examinons à nouveau l’évolution de la réaction lorsqu’on change cette fois-ci la concentra-tion du substrat.

• Les mesures de la concentration du produit en fonction du temps sont différentes pour chacu-ne des concentrations de substrat essayées. Lorsque la concentration du substrat est grande(par exemple S10) la vitesse initiale est plus grande que lorsque la concentration du substratest petite (par exemple S1).

• On peut mesurer ces vitesses initiales en calculant la différence de concentration de produitau cours d’un temps donné, pour chaque concentration du substrat.

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31

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten

!- hyperboles - axes différents - signification des graphes et des tangentes différentes

[P] = f(t) Vo = f([S])

Effet de la concentration de substrat

36/131 Enzymologie élémentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

4.1 Concentration du substrat

EE 14

• Examinons à nouveau l’évolution de la réaction lorsqu’on change cette fois-ci la concentra-tion du substrat.

• Les mesures de la concentration du produit en fonction du temps sont différentes pour chacu-ne des concentrations de substrat essayées. Lorsque la concentration du substrat est grande(par exemple S10) la vitesse initiale est plus grande que lorsque la concentration du substratest petite (par exemple S1).

• On peut mesurer ces vitesses initiales en calculant la différence de concentration de produitau cours d’un temps donné, pour chaque concentration du substrat.

Effet de la concentration de substrat

2002 - 2003 Enzymologie élémentaire - Pr A. Raisonnier 37/131

4.2 Cinétique michaélienne

EE 15

• Représentons cette fois ces vitesses initiales en fonction des concentrations du substrat quenous avons essayées.

• Les vitesses mesurées croissent en fonction des concentrations du substrat. Mais cette relationn’est pas linéaire : le graphe de cette fonction est une hyperbole (tirets longs).

• Lorsque la concentration du substrat est nulle la vitesse est évidemment 0, donc l’hyperbolepasse par l’origine du graphe. La fonction n’a pas de sens en dessous de cet origine. Lorsquela concentration du substrat tend vers l’infini, l’hyperbole se rapproche de son asymptote ma-térialisée par les tirets courts.

• Pour définir complètement une telle courbe il suffit d’indiquer un de ses points et l’asymptote.Nous savons en plus que la courbe passe par l’origine. L’asymptote correspond à la vitesseinitiale qu’on observerait si la concentration du substrat était infinie, c’est à dire à la vitessemaximum possible. Définissons le point de la courbe pour lequel l’ordonnée est égale à lamoitié de celle de l’asymptote. L’abscisse de ce point est une concentration de substrat pourlaquelle on peut mesurer une vitesse initiale égale à la moitié de la vitesse maximum. On ap-pelle cette concentration la constante de Michaelis.

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32

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten

COURBE DE MICHAELIS-MENTEN → ENZYMES MICHAELIENNES

Détermination des 2 paramètres cinétiques de l’enzyme :

- vitesse initiale maximale Vmax (Vm) : activité enzymatique maximale lorsque l’enzyme est saturée en substrat ([S] → ∞)

- constante de Michaelis Km : concentration de S qui permet d’obtenir Vmax/2

courbe Vo = f([S]) de Michaelis-Menten hyperbolique

Effet de la concentration de substrat

2002 - 2003 Enzymologie élémentaire - Pr A. Raisonnier 55/131

4.20 Hyperbole de Michaelis-Menten

EE 27

• Le graphe représentant cette fonction dans tout le domaine où elle a un sens physique, confir-me ces conclusions mathématiques.

• Le calcul de la vitesse initiale à partir de concentrations de substrat égales à des multiples en-tiers de Km aboutit à des fractions entières de la vitesse maximum. On trace une hyperbole àpartir des points obtenus, qui permet de voir la signification réelle des paramètres géométri-ques Km et Vmax que nous avons choisis au début de cette étude.

• Vmax est une vitesse initiale que la réaction aurait si la concentration du substrat était infinie.• Km est la concentration du substrat pour laquelle on observe une vitesse égale à la moitié de

la vitesse maximum.• Malheureusement, l’extrapolation d’une hyperbole à partir de quelques points n’est pas facile

et ne permet pas de faire le tracé d’une telle courbe à partir des mesures de vitesses initialesfaites réellement au cours d’expériences avec des concentrations de substrat différentes.

!! !

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33

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten

ÉQUATION DE MICHAELIS-MENTEN

E + S ES E + Pk+1

k-1

k+2

k-2

état pré-stationnaire état stationnaire → k-2 est négligée

E + S ES E + Pk+1

k-1

k+2

constantes de vitesse k

- étape 1 → formation réversible complexe ES, état pré-stationnaire

- étape 2 → toutes les enzymes sont complexées → état stationnaire : [ES] constante et [S] ≫ [P] → réaction réverse P → S négligée → k+2 = constante catalytique (= constante de vitesse de la réaction enzymatique)

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34

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten

ÉQUATION DE MICHAELIS-MENTEN : ÉQUATION DE LA COURBE V0 = f[S]

Vo = Vm [S]

Km + [S]Km =

k−1+ k

+2

k+1

avec !

Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie

32

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten

COURBE DE MICHAELIS-MENTEN → ENZYMES MICHAELIENNES

Détermination des 2 paramètres cinétiques de l’enzyme :

- vitesse initiale maximale Vmax : activité enzymatique maximale lorsque l’enzyme est saturée en substrat ([S] → ∞)

- constante de Michaelis Km : concentration de S qui permet d’obtenir Vmax/2

courbe Vo = f([S]) de Michaelis-Menten hyperbolique

Effet de la concentration de substrat

2002 - 2003 Enzymologie élémentaire - Pr A. Raisonnier 55/131

4.20 Hyperbole de Michaelis-Menten

EE 27

• Le graphe représentant cette fonction dans tout le domaine où elle a un sens physique, confir-me ces conclusions mathématiques.

• Le calcul de la vitesse initiale à partir de concentrations de substrat égales à des multiples en-tiers de Km aboutit à des fractions entières de la vitesse maximum. On trace une hyperbole àpartir des points obtenus, qui permet de voir la signification réelle des paramètres géométri-ques Km et Vmax que nous avons choisis au début de cette étude.

• Vmax est une vitesse initiale que la réaction aurait si la concentration du substrat était infinie.• Km est la concentration du substrat pour laquelle on observe une vitesse égale à la moitié de

la vitesse maximum.• Malheureusement, l’extrapolation d’une hyperbole à partir de quelques points n’est pas facile

et ne permet pas de faire le tracé d’une telle courbe à partir des mesures de vitesses initialesfaites réellement au cours d’expériences avec des concentrations de substrat différentes.

!! !

- hyperbole équilatère - si [S] → ∞ alors Vo → Vm - si [S] → 0 alors Vo → 0 - si Vo = Vm/2 alors Km = [S]

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35

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten

ÉQUATION DE MICHAELIS-MENTEN

- Km (mol.L-1) : - caractéristique fondamentale couple E / S - ne dépend pas de [E] - indicateur de l’affinité de E pour S - assimilée à KD du complexe ES

- Vm (mol.L-1.s-1) : - Vo maximale - dépend de [E] - Vm = kcat [ET]

- cte catalytique kcat (= k2) = nombre de turn-over = nombre de molécules de S transformées /sec / molécule de E

- efficacité catalytique kcat/Km

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32

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten

COURBE DE MICHAELIS-MENTEN → ENZYMES MICHAELIENNES

Détermination des 2 paramètres cinétiques de l’enzyme :

- vitesse initiale maximale Vmax : activité enzymatique maximale lorsque l’enzyme est saturée en substrat ([S] → ∞)

- constante de Michaelis Km : concentration de S qui permet d’obtenir Vmax/2

courbe Vo = f([S]) de Michaelis-Menten hyperbolique

Effet de la concentration de substrat

2002 - 2003 Enzymologie élémentaire - Pr A. Raisonnier 55/131

4.20 Hyperbole de Michaelis-Menten

EE 27

• Le graphe représentant cette fonction dans tout le domaine où elle a un sens physique, confir-me ces conclusions mathématiques.

• Le calcul de la vitesse initiale à partir de concentrations de substrat égales à des multiples en-tiers de Km aboutit à des fractions entières de la vitesse maximum. On trace une hyperbole àpartir des points obtenus, qui permet de voir la signification réelle des paramètres géométri-ques Km et Vmax que nous avons choisis au début de cette étude.

• Vmax est une vitesse initiale que la réaction aurait si la concentration du substrat était infinie.• Km est la concentration du substrat pour laquelle on observe une vitesse égale à la moitié de

la vitesse maximum.• Malheureusement, l’extrapolation d’une hyperbole à partir de quelques points n’est pas facile

et ne permet pas de faire le tracé d’une telle courbe à partir des mesures de vitesses initialesfaites réellement au cours d’expériences avec des concentrations de substrat différentes.

!! !

Vo = Vm [S]

Km + [S]!

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3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten

- exploitation difficile de la représentation de Michaelis-Menten : - tracé délicat à partir des valeurs expérimentales (hyperbole) - sous-estimation de Vmax (il faudrait [S] → ∞) - Km déterminée graphiquement à partir de Vmax → sous-estimée

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3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten

COURBE DE MICHAELIS-MENTEN → ENZYMES MICHAELIENNES

Détermination des 2 paramètres cinétiques de l’enzyme :

- vitesse initiale maximale Vmax : activité enzymatique maximale lorsque l’enzyme est saturée en substrat ([S] → ∞)

- constante de Michaelis Km : concentration de S qui permet d’obtenir Vmax/2

courbe Vo = f([S]) de Michaelis-Menten hyperbolique

Effet de la concentration de substrat

2002 - 2003 Enzymologie élémentaire - Pr A. Raisonnier 55/131

4.20 Hyperbole de Michaelis-Menten

EE 27

• Le graphe représentant cette fonction dans tout le domaine où elle a un sens physique, confir-me ces conclusions mathématiques.

• Le calcul de la vitesse initiale à partir de concentrations de substrat égales à des multiples en-tiers de Km aboutit à des fractions entières de la vitesse maximum. On trace une hyperbole àpartir des points obtenus, qui permet de voir la signification réelle des paramètres géométri-ques Km et Vmax que nous avons choisis au début de cette étude.

• Vmax est une vitesse initiale que la réaction aurait si la concentration du substrat était infinie.• Km est la concentration du substrat pour laquelle on observe une vitesse égale à la moitié de

la vitesse maximum.• Malheureusement, l’extrapolation d’une hyperbole à partir de quelques points n’est pas facile

et ne permet pas de faire le tracé d’une telle courbe à partir des mesures de vitesses initialesfaites réellement au cours d’expériences avec des concentrations de substrat différentes.

!! !Vo = Vm [S]

Km + [S]

ÉQUATION DE MICHAELIS-MENTEN

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3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten

REPRÉSENTATION DE LINEWEAVER ET BURK

- transformation de Lineweaver et Burk (doubles inverses) : 1/V0 = f(1/[S]) - obtenue en prenant la double inverse de l’équation de Michaelis-Menten - droite, plus facile à extrapoler et à exploiter (régression linéaire)

1Vo

= KmVm

1

[S] +

1Vm

- ordonnée à l’origine = 1/Vm - pente = Km/Vm - par prolongation, intersection avec

axe des abscisses = -1/Km

!

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38

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.5. Mesure de l’activité enzymatique

2

260 300 340 380 λ (nm)

εεεεNAD+

Spectre UV des coenzymes nicotiniques

NADH

NADH

N

O

CH2 O P O P O CH2 O

N

NN

N

NH2

NH2

O

OO

O- O-OHHO

OH OH

HN

lampe diaphragme

Io

Cellule Vmètre

I

Cuve contenant

E et S

l

Do = ε.l.[P]

Do = fonction de Io et I

DO en fonction du temps (f [NADH,H+])

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40

temps

[NADH,H+]

temps Do0 0

2,5 2,55 510 1015 1520 18,525 21,530 2340 25

Inhibition par PConsommation de SDégradation de EEquilibre ....

Seule cette partieEst interprétable

Les mécanismes de l’inflexion sont multiples

- dosage par spectrophotométrie : absorbance (DO) à λ donnée loi de Beer-Lambert : A = ε.l.[P] → concentration de P

- dosage direct de S ou P

- dosage indirect : substrat ou produit d’une réaction couplée

A B

NAD+ NADH, H+

EXEMPLE : réaction d’oxydo-réduction

- 2 réactions couplées : - oxydation de A en B - réduction de NAD+ en NADH, H+

- NAD+ et NADH, H+ absorbent à 260 nm - absorption spécifique du NADH, H+ à 340 nm → dosage NADH, H+ réduit → vitesse d’apparition du NADH, H+ → vitesse réaction

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Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie

39

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.5. Mesure de l’activité enzymatique

UNITÉS DE MESURE

- UI : unité internationale = quantité d’enzyme transformant 1 µmole (10-6 M) de substrat par minute (µmol/min)

dans les conditions standard (température et pH)

- Katal (kat) : unité SI (catalyseurs) = quantité d’enzyme transformant 1 mole de substrat par seconde (mole/s)

- activité molaire spécifique ou nombre de rotation ("turn-over number") = nombre de molécules de substrat transformées / sec / molécule d’enzyme

- activité spécifique (AS) utilisation pour le suivi de la purification d’une enzyme = activité enzymatique par unité de masse de protéines totales (UI/mg) traduit le degré de pureté de l’enzyme

AS = activité enzymatique / masse totale de protéines

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Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie

40

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.5. Mesure de l’activité enzymatique

UNITÉS DE MESURE

protéines totales

E

protéines totales

E

purification

- indice de purification (sans unité) = degré d’enrichissement en enzyme après purification par rapport à l’extrait de départ

- rendement = pourcentage d’enzyme récupérée par rapport à la quantité de départ

enrichissement = AS de la fraction / AS de l’extrait de départ

R = (activité totale extrait final / activité totale extrait initial) x100

dans l’idéal : enrichissement le plus grand possible rendement 100 %

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Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie

41

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.6. Influence des inhibiteurs

- molécules de natures diverses

- interfèrent avec une étape de la catalyse - soit en l’accélérant : activateurs - soit en la ralentissant : inhibiteurs

- irréversibles - réversibles

→ très utiles pour compréhension des mécanismes enzymatiques et en thérapeutique

EFFECTEURS

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42

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.6. Influence des inhibiteurs 3.6.1. Inhibitions “irréversibles” : exemple des AINS

- liaison covalente à l’enzyme : “inhibiteurs suicides”

- destruction d’un groupement essentiel à l’activité → enzyme incapable de fixer ou transformer le substrat

- pas d’inhibition irréversible dans l’organisme, mais intérêt thérapeutique

COOH

O

O

acide acétylsalicylique

- classe des AINS (AntiInflammatoires Non Stéroïdiens)

- inhibition des COX (cyclo-oxygénases) → liaison covalente avec une sérine → encombrement stérique

- empêche acide arachidonique d’entrer dans le canal - pas de production de prostaglandines

EXEMPLE : l’aspirine

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Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie

43

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.6. Influence des inhibiteurs 3.6.2. Inhibitions réversibles

- 3 types :

- inhibition compétitive

- inhibition non compétitive

- inhibition incompétitive

- fixation sur l’enzyme par liaisons faibles → formation et rupture faciles et rapides → mécanismes différents

INHIBITION RÉVERSIBLE DES ENZYMES MICHAELIENNES

Influence des inhibiteurs (1) Modélisation des réactions enzymatiques : la cinétique enzymatique simple (6)

Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent par leur mécanisme d’action

Inhibiteur compétitif Inhibiteur non compétitif Inhibiteur incompétitif

E+S E+P ES

S

ES

E+S E+P ES

S

ES

E+S E+P ES

S

ES

+ Inc

ESI

K ’I

ESI

+ Iic

ESI

K ’I

Iic

ESI

+ Ic

EI

KI

Ic

EI

+ Inc

EI+ S

KI

Inc

EI

E19

Influence des inhibiteurs (1) Modélisation des réactions enzymatiques : la cinétique enzymatique simple (6)

Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent par leur mécanisme d’action

Inhibiteur compétitif Inhibiteur non compétitif Inhibiteur incompétitif

E+S E+P ES

S

ES

E+S E+P ES

S

ES

E+S E+P ES

S

ES

+ Inc

ESI

K ’I

ESI

+ Iic

ESI

K ’I

Iic

ESI

+ Ic

EI

KI

Ic

EI

+ Inc

EI+ S

KI

Inc

EI

E19

Influence des inhibiteurs (1) Modélisation des réactions enzymatiques : la cinétique enzymatique simple (6)

Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent par leur mécanisme d’action

Inhibiteur compétitif Inhibiteur non compétitif Inhibiteur incompétitif

E+S E+P ES

S

ES

E+S E+P ES

S

ES

E+S E+P ES

S

ES

+ Inc

ESI

K ’I

ESI

+ Iic

ESI

K ’I

Iic

ESI

+ Ic

EI

KI

Ic

EI

+ Inc

EI+ S

KI

Inc

EI

E19

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Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie

44

INHIBITION COMPÉTITIVE

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.6. Influence des inhibiteurs 3.6.2. Inhibitions réversibles

- analogie structurale avec le substrat → fixation au niveau du site actif, à la place du substrat

!

15

thromboxane, qui est vasoconstricteur et favorise l’agrégation plaquettaire et la thrombose.

L’aspirine à faible dose est ainsi un traitement préventif secondaire efficace de l’infarctus du

myocarde et des accidents vasculaires cérébraux.

7.2 Inhibitions réversibles

Les inhibiteurs réversibles des enzymes sont des molécules qui vont interférer avec une étape

de la catalyse. Ils sont très utiles pour la compréhension des mécanismes enzymatiques ; ils

peuvent être aussi, nous venons de le signaler pour les AINS (sauf l’aspirine), des

médicaments importants. Les inhibiteurs réversibles se fixent sur l'enzyme à l'aide de liaisons

faibles. Celles-ci se forment rapidement et peuvent être rompues facilement.

Selon le mécanisme d’action de la molécule inhibitrice, il existe trois types d’inhibition

enzymatique réversible : compétitive, incompétitive et non compétitive.

7.2.1 Inhibition compétitive (E)

Un inhibiteur compétitif se fixe sur la forme libre de l’enzyme, au niveau du site actif, en lieu

et place du substrat avec lequel il a, le plus souvent, une parenté structurale (qui lui permet de

prendre la place du substrat). La fixation d'un inhibiteur (I) sur (E) aboutit à la formation d'un

complexe binaire (EI) complètement déplaçable en présence d'un excès de substrat.

Autrement dit, il est possible de décrocher l'inhibiteur fixé sur l'enzyme et de le remplacer par

16

le substrat. Donc, la Vmax déterminée en présence de I ne changera pas par rapport à celle

obtenue en absence de I. En revanche, la fixation de I sur E déplace l'équilibre E +S <----> ES

en faveur de E, dont la concentration augmente aux dépens de celle de ES. Donc, le KM

(apparent) augmente en présence de I. L'affinité apparente de l'enzyme pour S diminue (figure

ci-dessous).

V

Vmax

Vmax 2

KM[S]

KM'

inhibiteur compétitifV

Vmax

Vmax 2

KM[S]

KM'

Vmax 2

V

Vmax

KM[S]

Vmax'

Vmax' 2Vmax'

Vmax' 2

Représentation de Michaelis-Menten

inhibiteur incompétitif inhibiteur non compétitif

1/V

1/Vmax

-1/KM 0-1/KM'

inhibiteur compétitif1/V

-1/KM 0-1/KM'

1/V

-1/KM 0

1/Vmax'

1/Vmax'

1/Vmax1/Vmax

Représentation de Lineweaver-Burk

inhibiteur incompétitif inhibiteur non compétitif

1/[S] 1/[S] 1/[S]

7.2.2 Inhibition incompétitive (ES)

L'inhibiteur incompétitif ne peut se fixer que sur l'enzyme préalablement complexé au

substrat (ES). Cette fixation aboutit à la formation d'un complexe ternaire ESI, non productif.

La fixation de I sur ES déplace l'équilibre E +S <---> ES en faveur de ES dont la

concentration augmente. Donc KM diminue : l'affinité apparente de l'enzyme pour son substrat

augmente. Comme une partie de l'enzyme reste piégée sous forme de ESI, la Vmax est

!

15

thromboxane, qui est vasoconstricteur et favorise l’agrégation plaquettaire et la thrombose.

L’aspirine à faible dose est ainsi un traitement préventif secondaire efficace de l’infarctus du

myocarde et des accidents vasculaires cérébraux.

7.2 Inhibitions réversibles

Les inhibiteurs réversibles des enzymes sont des molécules qui vont interférer avec une étape

de la catalyse. Ils sont très utiles pour la compréhension des mécanismes enzymatiques ; ils

peuvent être aussi, nous venons de le signaler pour les AINS (sauf l’aspirine), des

médicaments importants. Les inhibiteurs réversibles se fixent sur l'enzyme à l'aide de liaisons

faibles. Celles-ci se forment rapidement et peuvent être rompues facilement.

Selon le mécanisme d’action de la molécule inhibitrice, il existe trois types d’inhibition

enzymatique réversible : compétitive, incompétitive et non compétitive.

7.2.1 Inhibition compétitive (E)

Un inhibiteur compétitif se fixe sur la forme libre de l’enzyme, au niveau du site actif, en lieu

et place du substrat avec lequel il a, le plus souvent, une parenté structurale (qui lui permet de

prendre la place du substrat). La fixation d'un inhibiteur (I) sur (E) aboutit à la formation d'un

complexe binaire (EI) complètement déplaçable en présence d'un excès de substrat.

Autrement dit, il est possible de décrocher l'inhibiteur fixé sur l'enzyme et de le remplacer par

16

le substrat. Donc, la Vmax déterminée en présence de I ne changera pas par rapport à celle

obtenue en absence de I. En revanche, la fixation de I sur E déplace l'équilibre E +S <----> ES

en faveur de E, dont la concentration augmente aux dépens de celle de ES. Donc, le KM

(apparent) augmente en présence de I. L'affinité apparente de l'enzyme pour S diminue (figure

ci-dessous).

V

Vmax

Vmax 2

KM[S]

KM'

inhibiteur compétitifV

Vmax

Vmax 2

KM[S]

KM'

Vmax 2

V

Vmax

KM[S]

Vmax'

Vmax' 2Vmax'

Vmax' 2

Représentation de Michaelis-Menten

inhibiteur incompétitif inhibiteur non compétitif

1/V

1/Vmax

-1/KM 0-1/KM'

inhibiteur compétitif1/V

-1/KM 0-1/KM'

1/V

-1/KM 0

1/Vmax'

1/Vmax'

1/Vmax1/Vmax

Représentation de Lineweaver-Burk

inhibiteur incompétitif inhibiteur non compétitif

1/[S] 1/[S] 1/[S]

7.2.2 Inhibition incompétitive (ES)

L'inhibiteur incompétitif ne peut se fixer que sur l'enzyme préalablement complexé au

substrat (ES). Cette fixation aboutit à la formation d'un complexe ternaire ESI, non productif.

La fixation de I sur ES déplace l'équilibre E +S <---> ES en faveur de ES dont la

concentration augmente. Donc KM diminue : l'affinité apparente de l'enzyme pour son substrat

augmente. Comme une partie de l'enzyme reste piégée sous forme de ESI, la Vmax est

- levée de l’inhibition par excès de substrat : déplacement de l’équilibre entre EI et E

- Vmax inchangée - Km augmente → diminution de l’affinité

apparente pour S

Influence des inhibiteurs (1) Modélisation des réactions enzymatiques : la cinétique enzymatique simple (6)

Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent par leur mécanisme d’action

Inhibiteur compétitif Inhibiteur non compétitif Inhibiteur incompétitif

E+S E+P ES

S

ES

E+S E+P ES

S

ES

E+S E+P ES

S

ES

+ Inc

ESI

K ’I

ESI

+ Iic

ESI

K ’I

Iic

ESI

+ Ic

EI

KI

Ic

EI

+ Inc

EI+ S

KI

Inc

EI

E19

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Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie

45

INHIBITION NON COMPÉTITIVE

- pas d’analogie structurale avec le substrat → fixation sur un site distinct du site catalytique

- changements de conformation → diminution de la vitesse de catalyse

- se fixe avec la même affinité sur forme libre E et forme complexée ES → indépendamment de S → fixation simultanée de I et S possible

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.6. Influence des inhibiteurs 3.6.2. Inhibitions réversibles

!

15

thromboxane, qui est vasoconstricteur et favorise l’agrégation plaquettaire et la thrombose.

L’aspirine à faible dose est ainsi un traitement préventif secondaire efficace de l’infarctus du

myocarde et des accidents vasculaires cérébraux.

7.2 Inhibitions réversibles

Les inhibiteurs réversibles des enzymes sont des molécules qui vont interférer avec une étape

de la catalyse. Ils sont très utiles pour la compréhension des mécanismes enzymatiques ; ils

peuvent être aussi, nous venons de le signaler pour les AINS (sauf l’aspirine), des

médicaments importants. Les inhibiteurs réversibles se fixent sur l'enzyme à l'aide de liaisons

faibles. Celles-ci se forment rapidement et peuvent être rompues facilement.

Selon le mécanisme d’action de la molécule inhibitrice, il existe trois types d’inhibition

enzymatique réversible : compétitive, incompétitive et non compétitive.

7.2.1 Inhibition compétitive (E)

Un inhibiteur compétitif se fixe sur la forme libre de l’enzyme, au niveau du site actif, en lieu

et place du substrat avec lequel il a, le plus souvent, une parenté structurale (qui lui permet de

prendre la place du substrat). La fixation d'un inhibiteur (I) sur (E) aboutit à la formation d'un

complexe binaire (EI) complètement déplaçable en présence d'un excès de substrat.

Autrement dit, il est possible de décrocher l'inhibiteur fixé sur l'enzyme et de le remplacer par

16

le substrat. Donc, la Vmax déterminée en présence de I ne changera pas par rapport à celle

obtenue en absence de I. En revanche, la fixation de I sur E déplace l'équilibre E +S <----> ES

en faveur de E, dont la concentration augmente aux dépens de celle de ES. Donc, le KM

(apparent) augmente en présence de I. L'affinité apparente de l'enzyme pour S diminue (figure

ci-dessous).

V

Vmax

Vmax 2

KM[S]

KM'

inhibiteur compétitifV

Vmax

Vmax 2

KM[S]

KM'

Vmax 2

V

Vmax

KM[S]

Vmax'

Vmax' 2Vmax'

Vmax' 2

Représentation de Michaelis-Menten

inhibiteur incompétitif inhibiteur non compétitif

1/V

1/Vmax

-1/KM 0-1/KM'

inhibiteur compétitif1/V

-1/KM 0-1/KM'

1/V

-1/KM 0

1/Vmax'

1/Vmax'

1/Vmax1/Vmax

Représentation de Lineweaver-Burk

inhibiteur incompétitif inhibiteur non compétitif

1/[S] 1/[S] 1/[S]

7.2.2 Inhibition incompétitive (ES)

L'inhibiteur incompétitif ne peut se fixer que sur l'enzyme préalablement complexé au

substrat (ES). Cette fixation aboutit à la formation d'un complexe ternaire ESI, non productif.

La fixation de I sur ES déplace l'équilibre E +S <---> ES en faveur de ES dont la

concentration augmente. Donc KM diminue : l'affinité apparente de l'enzyme pour son substrat

augmente. Comme une partie de l'enzyme reste piégée sous forme de ESI, la Vmax est

!

15

thromboxane, qui est vasoconstricteur et favorise l’agrégation plaquettaire et la thrombose.

L’aspirine à faible dose est ainsi un traitement préventif secondaire efficace de l’infarctus du

myocarde et des accidents vasculaires cérébraux.

7.2 Inhibitions réversibles

Les inhibiteurs réversibles des enzymes sont des molécules qui vont interférer avec une étape

de la catalyse. Ils sont très utiles pour la compréhension des mécanismes enzymatiques ; ils

peuvent être aussi, nous venons de le signaler pour les AINS (sauf l’aspirine), des

médicaments importants. Les inhibiteurs réversibles se fixent sur l'enzyme à l'aide de liaisons

faibles. Celles-ci se forment rapidement et peuvent être rompues facilement.

Selon le mécanisme d’action de la molécule inhibitrice, il existe trois types d’inhibition

enzymatique réversible : compétitive, incompétitive et non compétitive.

7.2.1 Inhibition compétitive (E)

Un inhibiteur compétitif se fixe sur la forme libre de l’enzyme, au niveau du site actif, en lieu

et place du substrat avec lequel il a, le plus souvent, une parenté structurale (qui lui permet de

prendre la place du substrat). La fixation d'un inhibiteur (I) sur (E) aboutit à la formation d'un

complexe binaire (EI) complètement déplaçable en présence d'un excès de substrat.

Autrement dit, il est possible de décrocher l'inhibiteur fixé sur l'enzyme et de le remplacer par

16

le substrat. Donc, la Vmax déterminée en présence de I ne changera pas par rapport à celle

obtenue en absence de I. En revanche, la fixation de I sur E déplace l'équilibre E +S <----> ES

en faveur de E, dont la concentration augmente aux dépens de celle de ES. Donc, le KM

(apparent) augmente en présence de I. L'affinité apparente de l'enzyme pour S diminue (figure

ci-dessous).

V

Vmax

Vmax 2

KM[S]

KM'

inhibiteur compétitifV

Vmax

Vmax 2

KM[S]

KM'

Vmax 2

V

Vmax

KM[S]

Vmax'

Vmax' 2Vmax'

Vmax' 2

Représentation de Michaelis-Menten

inhibiteur incompétitif inhibiteur non compétitif

1/V

1/Vmax

-1/KM 0-1/KM'

inhibiteur compétitif1/V

-1/KM 0-1/KM'

1/V

-1/KM 0

1/Vmax'

1/Vmax'

1/Vmax1/Vmax

Représentation de Lineweaver-Burk

inhibiteur incompétitif inhibiteur non compétitif

1/[S] 1/[S] 1/[S]

7.2.2 Inhibition incompétitive (ES)

L'inhibiteur incompétitif ne peut se fixer que sur l'enzyme préalablement complexé au

substrat (ES). Cette fixation aboutit à la formation d'un complexe ternaire ESI, non productif.

La fixation de I sur ES déplace l'équilibre E +S <---> ES en faveur de ES dont la

concentration augmente. Donc KM diminue : l'affinité apparente de l'enzyme pour son substrat

augmente. Comme une partie de l'enzyme reste piégée sous forme de ESI, la Vmax est

- Vmax diminue - Km inchangée → affinité pour S inchangée

Influence des inhibiteurs (1) Modélisation des réactions enzymatiques : la cinétique enzymatique simple (6)

Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent par leur mécanisme d’action

Inhibiteur compétitif Inhibiteur non compétitif Inhibiteur incompétitif

E+S E+P ES

S

ES

E+S E+P ES

S

ES

E+S E+P ES

S

ES

+ Inc

ESI

K ’I

ESI

+ Iic

ESI

K ’I

Iic

ESI

+ Ic

EI

KI

Ic

EI

+ Inc

EI+ S

KI

Inc

EI

E19

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Biotech 1 - 2016-2017 Enzymologie

46

INHIBITION INCOMPÉTITIVE

3. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE SIMPLE

3.6. Influence des inhibiteurs 3.6.2. Inhibitions réversibles

!

15

thromboxane, qui est vasoconstricteur et favorise l’agrégation plaquettaire et la thrombose.

L’aspirine à faible dose est ainsi un traitement préventif secondaire efficace de l’infarctus du

myocarde et des accidents vasculaires cérébraux.

7.2 Inhibitions réversibles

Les inhibiteurs réversibles des enzymes sont des molécules qui vont interférer avec une étape

de la catalyse. Ils sont très utiles pour la compréhension des mécanismes enzymatiques ; ils

peuvent être aussi, nous venons de le signaler pour les AINS (sauf l’aspirine), des

médicaments importants. Les inhibiteurs réversibles se fixent sur l'enzyme à l'aide de liaisons

faibles. Celles-ci se forment rapidement et peuvent être rompues facilement.

Selon le mécanisme d’action de la molécule inhibitrice, il existe trois types d’inhibition

enzymatique réversible : compétitive, incompétitive et non compétitive.

7.2.1 Inhibition compétitive (E)

Un inhibiteur compétitif se fixe sur la forme libre de l’enzyme, au niveau du site actif, en lieu

et place du substrat avec lequel il a, le plus souvent, une parenté structurale (qui lui permet de

prendre la place du substrat). La fixation d'un inhibiteur (I) sur (E) aboutit à la formation d'un

complexe binaire (EI) complètement déplaçable en présence d'un excès de substrat.

Autrement dit, il est possible de décrocher l'inhibiteur fixé sur l'enzyme et de le remplacer par

16

le substrat. Donc, la Vmax déterminée en présence de I ne changera pas par rapport à celle

obtenue en absence de I. En revanche, la fixation de I sur E déplace l'équilibre E +S <----> ES

en faveur de E, dont la concentration augmente aux dépens de celle de ES. Donc, le KM

(apparent) augmente en présence de I. L'affinité apparente de l'enzyme pour S diminue (figure

ci-dessous).

V

Vmax

Vmax 2

KM[S]

KM'

inhibiteur compétitifV

Vmax

Vmax 2

KM[S]

KM'

Vmax 2

V

Vmax

KM[S]

Vmax'

Vmax' 2Vmax'

Vmax' 2

Représentation de Michaelis-Menten

inhibiteur incompétitif inhibiteur non compétitif

1/V

1/Vmax

-1/KM 0-1/KM'

inhibiteur compétitif1/V

-1/KM 0-1/KM'

1/V

-1/KM 0

1/Vmax'

1/Vmax'

1/Vmax1/Vmax

Représentation de Lineweaver-Burk

inhibiteur incompétitif inhibiteur non compétitif

1/[S] 1/[S] 1/[S]

7.2.2 Inhibition incompétitive (ES)

L'inhibiteur incompétitif ne peut se fixer que sur l'enzyme préalablement complexé au

substrat (ES). Cette fixation aboutit à la formation d'un complexe ternaire ESI, non productif.

La fixation de I sur ES déplace l'équilibre E +S <---> ES en faveur de ES dont la

concentration augmente. Donc KM diminue : l'affinité apparente de l'enzyme pour son substrat

augmente. Comme une partie de l'enzyme reste piégée sous forme de ESI, la Vmax est

!

15

thromboxane, qui est vasoconstricteur et favorise l’agrégation plaquettaire et la thrombose.

L’aspirine à faible dose est ainsi un traitement préventif secondaire efficace de l’infarctus du

myocarde et des accidents vasculaires cérébraux.

7.2 Inhibitions réversibles

Les inhibiteurs réversibles des enzymes sont des molécules qui vont interférer avec une étape

de la catalyse. Ils sont très utiles pour la compréhension des mécanismes enzymatiques ; ils

peuvent être aussi, nous venons de le signaler pour les AINS (sauf l’aspirine), des

médicaments importants. Les inhibiteurs réversibles se fixent sur l'enzyme à l'aide de liaisons

faibles. Celles-ci se forment rapidement et peuvent être rompues facilement.

Selon le mécanisme d’action de la molécule inhibitrice, il existe trois types d’inhibition

enzymatique réversible : compétitive, incompétitive et non compétitive.

7.2.1 Inhibition compétitive (E)

Un inhibiteur compétitif se fixe sur la forme libre de l’enzyme, au niveau du site actif, en lieu

et place du substrat avec lequel il a, le plus souvent, une parenté structurale (qui lui permet de

prendre la place du substrat). La fixation d'un inhibiteur (I) sur (E) aboutit à la formation d'un

complexe binaire (EI) complètement déplaçable en présence d'un excès de substrat.

Autrement dit, il est possible de décrocher l'inhibiteur fixé sur l'enzyme et de le remplacer par

16

le substrat. Donc, la Vmax déterminée en présence de I ne changera pas par rapport à celle

obtenue en absence de I. En revanche, la fixation de I sur E déplace l'équilibre E +S <----> ES

en faveur de E, dont la concentration augmente aux dépens de celle de ES. Donc, le KM

(apparent) augmente en présence de I. L'affinité apparente de l'enzyme pour S diminue (figure

ci-dessous).

V

Vmax

Vmax 2

KM[S]

KM'

inhibiteur compétitifV

Vmax

Vmax 2

KM[S]

KM'

Vmax 2

V

Vmax

KM[S]

Vmax'

Vmax' 2Vmax'

Vmax' 2

Représentation de Michaelis-Menten

inhibiteur incompétitif inhibiteur non compétitif

1/V

1/Vmax

-1/KM 0-1/KM'

inhibiteur compétitif1/V

-1/KM 0-1/KM'

1/V

-1/KM 0

1/Vmax'

1/Vmax'

1/Vmax1/Vmax

Représentation de Lineweaver-Burk

inhibiteur incompétitif inhibiteur non compétitif

1/[S] 1/[S] 1/[S]

7.2.2 Inhibition incompétitive (ES)

L'inhibiteur incompétitif ne peut se fixer que sur l'enzyme préalablement complexé au

substrat (ES). Cette fixation aboutit à la formation d'un complexe ternaire ESI, non productif.

La fixation de I sur ES déplace l'équilibre E +S <---> ES en faveur de ES dont la

concentration augmente. Donc KM diminue : l'affinité apparente de l'enzyme pour son substrat

augmente. Comme une partie de l'enzyme reste piégée sous forme de ESI, la Vmax est

- fixation sur forme ES déjà complexée au S → équilibre E + S ⇌ ES déplacé en faveur de ES

→ affinité apparente de E pour S augmente → Km ↓

- complexe ESI n’évolue pas → Vm ↓

Influence des inhibiteurs (1) Modélisation des réactions enzymatiques : la cinétique enzymatique simple (6)

Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent par leur mécanisme d’action

Inhibiteur compétitif Inhibiteur non compétitif Inhibiteur incompétitif

E+S E+P ES

S

ES

E+S E+P ES

S

ES

E+S E+P ES

S

ES

+ Inc

ESI

K ’I

ESI

+ Iic

ESI

K ’I

Iic

ESI

+ Ic

EI

KI

Ic

EI

+ Inc

EI+ S

KI

Inc

EI

E19

- Vmax diminue - Km diminue → augmentation de l’affinité

apparente pour S

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47

SOMMAIRE

1. Généralités 1.1. Classification des enzymes 1.2. Spécificité de la réaction enzymatique

2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique

3. La cinétique enzymatique simple 3.1. Influence de la concentration en enzyme 3.2. Influence du pH 3.3. Influence de la température 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten 3.5. Mesure de l’activité enzymatique 3.6. Influence des inhibiteurs

4. Contrôle de l’activité enzymatique 4.1. La protéolyse ménagée 4.2. Modifications covalentes réversibles 4.3. Les enzymes allostériques

4.3.1. Caractéristiques structurales 4.3.2. Caractéristiques cinétiques des enzymes allostériques 4.3.3. Les deux modèles de l’allostérie

5. Les cofacteurs et coenzymes

6. Les isoenzymes

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48

4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

4.1. La protéolyse ménagée

- concentration, localisation des enzymes : biosynthèse, dégradation, trafic intracellulaire

- environnement : pH, [cofacteurs], [substrats], [inhibiteurs]… - activation irréversible par protéolyse ménagée - modifications covalentes réversibles : phosphorylation, formation ou rupture de

ponts disulfures… - régulation allostérique - association possible de plusieurs modes de contrôle

NOMBREUX PROCESSUS DE CONTRÔLE

Contrôle de l ’activité des enzymes (2)

Contrôle de l’activité enzymatique par protéolyse ménagée La protéolyse ménagée est un mode d’activation courant des enzymes en particulier les enzymes digestives et les enzymes de la cascade de la coagulation du sang. On appelle zymogène le précurseur inactif d’une enzyme activée par protéolyse.

Il existe plusieurs modalités d’activation par protéolyse :

Exemple de la chymotrypsine

Chymotrypsininogène (inactif)

Chymotrypsine S�(active)

Chymotrypsine D�(active)�

Chymotrypsine�

Trypsine �

A� B� C�

Exemple de la cascade de la coagulation du sang

E22

- modification covalente (lyse) irréversible

- mode d’activation courant (enzymes digestives, cascade de coagulation du sang)

- précurseur inactif = zymogène

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49

4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

4.2. Modifications covalentes réversibles

- interactions covalentes avec groupement chimique

- liaison et clivage catalysés par enzymes différentes → chaque réaction est irréversible → processus global réversible

- exemples : ribosylation, acétylation / désacétylation, ubiquitination, phosphorylation / déphosphorylation…

PHOSPHORYLATION / DÉPHOSPHORYLATION

- la plus fréquente

- activation ou inhibition temporaire de l’enzyme

- ajout / retrait de groupements phosphates sur résidus alcool (Ser, Thr, Tyr) - kinases / phosphatases

- le plus souvent en réponse à un signal extracellulaire

- kinases souvent AMPc-dépendantes : liaison avec AMPc (2nd messager) pour activation

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50

4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

4.2. Modifications covalentes réversibles

PHOSPHORYLATION / DÉPHOSPHORYLATION

OH ATP ADP

kinase

O P

O

O-

O-

groupement phosphate

fonction alcoollibre

fonction alcoolphosphorylée

O P

O

O-

O-

groupement phosphate

fonction alcoolphosphorylée

phosphatase

OH

fonction alcoollibre

+ P O-

O

O-

-O

phosphate inorganique(Pi)

- phosphorylation = ajout d’un groupement phosphate, catalysé par une protéine kinase

phosphorylation / déphosphorylation → régulation de très nombreuses protéines impliquées dans des voies de signalisation

- déphosphorylation = retrait du groupement phosphate, catalysé par une phosphatase

!

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51

4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

- RÉPONSE RAPIDE, FINE ET ADAPTÉE aux conditions intracellulaires - leur cinétique ne suit pas l’équation de Michaelis-Menten

4.3. Les enzymes allostériques 4.3.1. Caractéristiques structurales

ENZYMES ALLOSTÉRIQUES = PROTÉINES ALLOSTÉRIQUES

1) protéines complexes, multimériques (plusieurs sous-unités)

2) plusieurs sites de fixation pour un ou plusieurs ligands → liaison d’un effecteur par des liaisons faibles, sur un site régulateur distinct du

site catalytique → site régulateur et site catalytique sur même sous-unité ou sous-unités différentes

3) la fixation d’un premier ligand modifie la liaison des autres ligands → liaison d’un effecteur provoque un changement conformationnel

= transition allostérique (forme active R ⇌ forme inactive T)

→ modifie la fixation du substrat ou d’autres modulateurs → coopérativité modulateur et/ou substrat pour l’activité

!

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52

4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

4.3. Les enzymes allostériques 4.3.1. Caractéristiques structurales

- catalysent étapes-clé des chaînes métaboliques → régulation fine et rapide

- régulation positive : activateur(s), en particulier substrat lui-même

- régulation négative : inhibiteur(s), en particulier produit final de la voie = rétro-inhibition, rétro-contrôle négatif

2015-2016 Biochimie Biotech 1

phosphatases (pour la suppression de groupements phosphates). Chaque réaction est irréversible, mais l'ensemble du processus est réversible.

Les kinases sont souvent AMPc-dépendantes : l’AMPc (AMP cyclique) est le second messager intracellulaire de nombreux signaux extracellulaires (par exemple, en réponse à la liaison du glucagon ou de l’adrénaline sur leurs récepteurs spécifiques).

4.3. Les enzymes allostériques

Les enzymes allostériques permettent une réponse rapide, fine et adaptée aux variations des conditions intracellulaires. La cinétique des enzymes allostériques ne suit plus l'équation de Michaelis-Menten.

4.3.1. Caractéristiques structurales

Ce sont des protéines allostériques, elles en partagent les propriétés : - ce sont des protéines complexes, qui possèdent généralement plusieurs sous-unités

(protomères). - la fixation d'un modulateur allostérique (par des liaisons faibles réversibles) entraine un

changement conformationnel (transition allostérique) de la protéine, ce qui modifie la fixation du substrat ou d'autres modulateurs. Il existe une coopérativité du modulateur et/ou du substrat pour l'activité.

- il existe au moins un site de fixation pour le substrat (site catalytique, ou site actif) et au moins un site de fixation pour un modulateur (site régulateur). Le changement conformationnel est aussi appelé "transition allostérique".

Le site catalytique et le site régulateur peuvent être sur la même sous-unité protéique, ou sur des sous-unités différentes. Les modulateurs peuvent jouer le rôle d'activateurs ou d’inhibiteurs, et chaque modulateur peut posséder son propre site.

Les enzymes allostériques catalysent très souvent les étapes clé des chaînes métaboliques, qui doivent être finement régulées, par exemple de façon : - positive par un ou plusieurs activateurs, en particulier par le substrat lui-même - négative par un ou plusieurs inhibiteurs, en particulier par le produit final de la voie

métabolique : on parle alors de rétro-inhibition ou de rétro-contrôle négatif. L’enzyme se transforme (modification conformationnelle) de sa forme active R en forme inactive T.

Ainsi, la voie métabolique entière est activée par la présence du substrat initial et inhibée quand son produit final est abondant.

La cinétique des enzymes allostériques ne suit plus l'équation de Michaelis-Menten. Elle est tout à fait comparable à celle de fixation de l'oxygène sur l'hémoglobine. La courbe de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat est une sigmoïde, qui traduit le phénomène de coopérativité : les changements dans la structure d'une sous-unité protéique se traduisent par des changements dans la structure des autres sous-unités, à la suite d'interactions non covalentes à l'interface entre les sous-unités.

effet effecteur particularité

homotrope positif substrat S de l’enzyme favorise sa propre transformation

hétérotrope positif

activateur allostérique A de l’enzyme pas d’analogie structurale avec S

hétérotrope négatif

inhibiteur allostérique I de l’enzyme pas d’analogie structurale avec S

Enzymologie -! -14

→ si le produit final de la voie métabolique est abondant, la voie entière sera inhibée par inhibition des étapes clé (dont étape d’engagement)

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53

4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

4.3. Les enzymes allostériques 4.3.2. Caractéristiques cinétiques des enzymes allostériques

- cinétique allostérique ≠ cinétique michaelienne

- comparable à la fixation de O2 sur Hb (≠ enzyme)

- courbe sigmoïde : phénomène de coopérativité → transmission des changements conformationnels d’une sous-unité à l’autre → grâce aux interactions non covalentes à l’interface entre les sous-unités

2 types d’enzymes allostériques :

- système V : rares → V = f([S]) hyperbole (≃ enzymes michaeliennes) → Vmax varie en présence d’effecteur

- système K : les plus fréquentes → V = f([S]) sigmoïde → K1/2 varie en présence d’effecteur

!

19

8. ENZYMES ALLOSTERIQUES

Ces enzymes ne sont autres que des protéines allostériques présentant des propriétés

semblables à celles de l’hémoglobine.

Les enzymes allostériques font intervenir une liaison réversible, non covalente, d’une

molécule régulatrice appelée modulateur, ou effecteur, allostérique. Le terme allostérique

vient du grec allos, autre, et stereos, forme. Les enzymes allostériques prennent une autre

forme (une autre conformation) à la suite de la liaison du modulateur. Ce sont des protéines

complexes possédant généralement plusieurs sous-unités. Il existe au moins un site de fixation

pour le substrat (site actif, catalytique) et au moins un site de fixation (spécifique) pour un

modulateur (site régulateur). Dans certains cas, le site régulateur et le site actif sont sur des

sous-unités différentes. Les modulateurs des enzymes allostériques peuvent être des

inhibiteurs ou au contraire des activateurs.

Nous ne traiterons pas ici le cas, assez rare, des enzymes allostériques dits du système V, pour

lesquels l’expression de V = f([S]) est représentée par une hyperbole (comme dans le cas des

enzymes michaeliens). Pour la plupart des enzymes allostériques (enzymes du système K), si

on trace V en fonction de S, on obtient, non pas une hyperbole, mais une courbe sigmoïde,

comme celle qui correspond à la liaison de l’oxygène sur l’hémoglobine. La saturation est tout

de même obtenue pour des concentrations de S suffisantes. Bien qu’il existe sur la courbe

sigmoïde de saturation une concentration en substrat pour laquelle la vitesse est égale à la

moitié de la vitesse maximale, il n’est pas correct de l’appeler KM, puisque l’enzyme n’est pas

michaelien. On utilisera les expressions S0,5 ou K0,5 (K1/2) pour désigner cette concentration de

substrat donnant pour un enzyme allostérique une vitesse de réaction égale à la moitié de la

vitesse maximale (figure page suivante).

Une cinétique sigmoïde reflète en général des interactions coopératives entre plusieurs sous-

unités protéiques. En d’autres termes, des changements dans la structure d’une sous-unité se

traduisent par des changements dans la structure des autres sous-unités, à la suite

d’interactions non covalentes à l’interface entre les sous-unités.

Les principes et les modèles sont semblables à ceux qui sont présentés à propos de la liaison

coopérative de l’oxygène à la protéine non enzymatique hémoglobine, avec un état tendu (T)

et un état relaché (R). Le modèle tout ou rien ou symétrique, et le modèle séquentiel, peuvent

être rassemblés. En effet, les deux modèles ne s’excluent pas mutuellement. De fait, le modèle

20

symétrique peut être considéré comme un cas limite, tout ou rien, du modèle séquentiel. En

réalité, le mécanisme précis des interactions allostériques n’a pas été établi.

R"active"

T"inactive"

V

Vmax

Vmax 2

K1/2[S]

V

Vmax

Vmax 2

K1/2[S]

S + A S + I

enzyme allostérique du système K

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ENZYMES ALLOSTÉRIQUES DE TYPE K

4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

4.3. Les enzymes allostériques 4.3.2. Caractéristiques cinétiques des enzymes allostériques

2015-2016 Biochimie Biotech 1

!

La fixation d’une molécule de substrat à un site de liaison modifie la conformation de l’enzyme et facilite la liaison des molécules de substrat suivantes. Il existe deux types d’enzymes allostériques : - enzymes du système V : assez rares, leur cinétique V = f([S]) est représentée par une

hyperbole (comme dans le cas des enzymes michaeliennes) - enzymes du système K : V = f([S]) est une courbe sigmoïde, leur cinétique ne suit plus

l’équation de Michaelis-Menten.

4.3.2. Caractéristiques cinétiques des enzymes allostériques

4.3.2.1. Les enzymes allostériques de type K

Lorsque l'enzyme est saturée, la vitesse de catalyse est maximale (Vmax). K1/2 est la concentration de substrat qui permet d'atteindre la moitié de la vitesse maximale : c’est l’équivalent du Km des enzymes michaeliennes.

En absence de substrat, l’état T prédomine (T possède peu d’affinité pour S). Le substrat joue le rôle de modulateur positif : il favorise sa propre fixation. La liaison d'un activateur ou d'un inhibiteur allostérique modifie l'affinité de l'enzyme pour son substrat (et donc le K1/2) : l’affinité pour le substrat diminue en présence d’un inhibiteur allostérique (K1/2 augmente), elle augmente en présence d’un activateur allostérique (K1/2 diminue). Lorsque les concentrations d’activateurs sont fortes, la courbe peut parfois devenir hyperbolique (dite "pseudo-hyperbolique").

! De très faibles variations de la concentration en substrat permettent une adaptation très fine de la réponse enzymatique pour les enzymes allostériques par rapport aux enzymes michaeliennes. La vitesse maximale Vmax est inchangée.

!

19

8. ENZYMES ALLOSTERIQUES

Ces enzymes ne sont autres que des protéines allostériques présentant des propriétés

semblables à celles de l’hémoglobine.

Les enzymes allostériques font intervenir une liaison réversible, non covalente, d’une

molécule régulatrice appelée modulateur, ou effecteur, allostérique. Le terme allostérique

vient du grec allos, autre, et stereos, forme. Les enzymes allostériques prennent une autre

forme (une autre conformation) à la suite de la liaison du modulateur. Ce sont des protéines

complexes possédant généralement plusieurs sous-unités. Il existe au moins un site de fixation

pour le substrat (site actif, catalytique) et au moins un site de fixation (spécifique) pour un

modulateur (site régulateur). Dans certains cas, le site régulateur et le site actif sont sur des

sous-unités différentes. Les modulateurs des enzymes allostériques peuvent être des

inhibiteurs ou au contraire des activateurs.

Nous ne traiterons pas ici le cas, assez rare, des enzymes allostériques dits du système V, pour

lesquels l’expression de V = f([S]) est représentée par une hyperbole (comme dans le cas des

enzymes michaeliens). Pour la plupart des enzymes allostériques (enzymes du système K), si

on trace V en fonction de S, on obtient, non pas une hyperbole, mais une courbe sigmoïde,

comme celle qui correspond à la liaison de l’oxygène sur l’hémoglobine. La saturation est tout

de même obtenue pour des concentrations de S suffisantes. Bien qu’il existe sur la courbe

sigmoïde de saturation une concentration en substrat pour laquelle la vitesse est égale à la

moitié de la vitesse maximale, il n’est pas correct de l’appeler KM, puisque l’enzyme n’est pas

michaelien. On utilisera les expressions S0,5 ou K0,5 (K1/2) pour désigner cette concentration de

substrat donnant pour un enzyme allostérique une vitesse de réaction égale à la moitié de la

vitesse maximale (figure page suivante).

Une cinétique sigmoïde reflète en général des interactions coopératives entre plusieurs sous-

unités protéiques. En d’autres termes, des changements dans la structure d’une sous-unité se

traduisent par des changements dans la structure des autres sous-unités, à la suite

d’interactions non covalentes à l’interface entre les sous-unités.

Les principes et les modèles sont semblables à ceux qui sont présentés à propos de la liaison

coopérative de l’oxygène à la protéine non enzymatique hémoglobine, avec un état tendu (T)

et un état relaché (R). Le modèle tout ou rien ou symétrique, et le modèle séquentiel, peuvent

être rassemblés. En effet, les deux modèles ne s’excluent pas mutuellement. De fait, le modèle

20

symétrique peut être considéré comme un cas limite, tout ou rien, du modèle séquentiel. En

réalité, le mécanisme précis des interactions allostériques n’a pas été établi.

R"active"

T"inactive"

V

Vmax

Vmax 2

K1/2[S]

V

Vmax

Vmax 2

K1/2[S]

S + A S + I

19

8. ENZYMES ALLOSTERIQUES

Ces enzymes ne sont autres que des protéines allostériques présentant des propriétés

semblables à celles de l’hémoglobine.

Les enzymes allostériques font intervenir une liaison réversible, non covalente, d’une

molécule régulatrice appelée modulateur, ou effecteur, allostérique. Le terme allostérique

vient du grec allos, autre, et stereos, forme. Les enzymes allostériques prennent une autre

forme (une autre conformation) à la suite de la liaison du modulateur. Ce sont des protéines

complexes possédant généralement plusieurs sous-unités. Il existe au moins un site de fixation

pour le substrat (site actif, catalytique) et au moins un site de fixation (spécifique) pour un

modulateur (site régulateur). Dans certains cas, le site régulateur et le site actif sont sur des

sous-unités différentes. Les modulateurs des enzymes allostériques peuvent être des

inhibiteurs ou au contraire des activateurs.

Nous ne traiterons pas ici le cas, assez rare, des enzymes allostériques dits du système V, pour

lesquels l’expression de V = f([S]) est représentée par une hyperbole (comme dans le cas des

enzymes michaeliens). Pour la plupart des enzymes allostériques (enzymes du système K), si

on trace V en fonction de S, on obtient, non pas une hyperbole, mais une courbe sigmoïde,

comme celle qui correspond à la liaison de l’oxygène sur l’hémoglobine. La saturation est tout

de même obtenue pour des concentrations de S suffisantes. Bien qu’il existe sur la courbe

sigmoïde de saturation une concentration en substrat pour laquelle la vitesse est égale à la

moitié de la vitesse maximale, il n’est pas correct de l’appeler KM, puisque l’enzyme n’est pas

michaelien. On utilisera les expressions S0,5 ou K0,5 (K1/2) pour désigner cette concentration de

substrat donnant pour un enzyme allostérique une vitesse de réaction égale à la moitié de la

vitesse maximale (figure page suivante).

Une cinétique sigmoïde reflète en général des interactions coopératives entre plusieurs sous-

unités protéiques. En d’autres termes, des changements dans la structure d’une sous-unité se

traduisent par des changements dans la structure des autres sous-unités, à la suite

d’interactions non covalentes à l’interface entre les sous-unités.

Les principes et les modèles sont semblables à ceux qui sont présentés à propos de la liaison

coopérative de l’oxygène à la protéine non enzymatique hémoglobine, avec un état tendu (T)

et un état relaché (R). Le modèle tout ou rien ou symétrique, et le modèle séquentiel, peuvent

être rassemblés. En effet, les deux modèles ne s’excluent pas mutuellement. De fait, le modèle

20

symétrique peut être considéré comme un cas limite, tout ou rien, du modèle séquentiel. En

réalité, le mécanisme précis des interactions allostériques n’a pas été établi.

R"active"

T"inactive"

V

Vmax

Vmax 2

K1/2[S]

V

Vmax

Vmax 2

K1/2[S]

S + A S + I

+ activateur + inhibiteur

Enzymologie -! -15

- Vmax : vitesse maximale à saturation de l’enzyme - K1/2 : [S] qui permet d’atteindre Vmax/2 (équivalent Km pour les enzymes michaeliennes)

- en absence de substrat : forme T prédominante (faible affinité pour S)

- liaison d’un effecteur → modification de l’affinité (et du K1/2)

- inhibiteur : affinité ↓ K1/2 ↑

- activateur : affinité ↑ K1/2 ↓

- forte activation : “pseudo-hyperbole”

- dans tous les cas : Vmax inchangée

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55

MODÈLE DE L’ASPARTATE TRANSCARBAMYLASE ATCase (type K) (E. Coli)

4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

4.3. Les enzymes allostériques 4.3.2. Caractéristiques cinétiques des enzymes allostériques

- étape clé synthèse des bases pyrimidiques

carbamoyl-phosphateaspartate carbamoyl-L aspartate+ bases pyrimidiquesATCase

Pi

- inhibée par CTP (pyrimidique, produit final de la voie) → Vmax inchangée diminution affinité pour substrats

- activée par ATP (purique) → il faut rétablir l’équilibre entre nucléotides

bases pyrimidiques C, T, U

bases puriques A, G

ATP, GTP, CTP, TTP et UTP doivent être disponibles en quantités équivalentes dans la cellule

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56

MODÈLE DE L’ASPARTATE TRANSCARBAMYLASE ATCase (type K) (E. Coli)

4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

4.3. Les enzymes allostériques 4.3.2. Caractéristiques cinétiques des enzymes allostériques Mécanisme d’‛action de l’aspartate transcarbamoylase (ATCase) (2)

Comme l’hémoglobine, l’ATCase présente deux états extrêmes. Un état T et un état R et un grand nombre d’états intermédiaires. L’état précis de l’enzyme dépend des rapports de concentrations des substrats, de l’ATP et du CTP.

La fixation sur une sous-unité régulatrice d’un modulateur positif écarte les sous unités catalytiques en les faisant pivoter autour d’un axe de symétrie 3. Ce changement conformationnel les rend plus actives. La fixation d’un modulateur négatif a l’effet inverse.

C

R

C

R

L’état T est défavorable à la catalyse et est stabilisé par le CTP.

état T état R

L’ état R est favorable à la catalyse et est stabilisé par l’ATP ou les substrats.

Contrôle de l ’activité des enzymes (7) Les enzymes allostériques (4)

E27

- 12 sous-unités : - 6 sous-unités catalytiques : fixation des substrats - 6 sous-unités régulatrices : fixation ATP ou CTP (sites distincts)

- 2 états extrêmes (grand nombre d’intermédiaires)

- état tendu T : défavorable à la catalyse, stabilisé par CTP - état relâché R : favorable à la catalyse, stabilisé par ATP

→ liaison ATP (activateur) : les sous-unités pivotent autour d’un axe et s’écartent → liaison CTP (inhibiteur) : effet inverse

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57

4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

4.3. Les enzymes allostériques 4.3.2. Caractéristiques cinétiques des enzymes allostériques

ENZYMES ALLOSTÉRIQUES DE TYPE V �!"#$!%&$!&'()*&$!#++,$-./012&$!%&!!"#$%&%

11

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13

!

- passage d’une forme à l’autre sans changement d’affinité pour le substrat - Vmax diminue, K1/2 pratiquement constant

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58

4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

4.3. Les enzymes allostériques 4.3.3. Les deux modèles de l’allostérie

2 états

2 modèles pour la transition allostérique

- modèle du “tout ou rien” (ou modèle symétrique, transition concertée) modèle de Monod, Wyman et Changeux

- modèle séquentiel (modèle de Koshland)

état tendu T état relâché R

RT

RT

T T

TT

R R

RR

O2 R

RR

O2 O2

RR

O2 O2

O2O2

O2 O2

O2R

T T

TT

T

TT

O2

TT

O2O2

T

O2O2

O2

O2 O2

O2O2

RT

T T

TT

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RR

O2 R

RR

O2 O2

RR

O2 O2

O2O2

O2 O2

O2R

T T

TT

T

TT

O2

TT

O2O2

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O2O2

O2

O2 O2

O2O2

!

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L’ALLOSTÉRIE EN BREF

4. CONTRÔLE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

4.3. Les enzymes allostériques

- les critères de l’allostérie : - la protéine possède plusieurs sous-unités, elle est multimérique - il existe plusieurs sites de liaison pour un ou plusieurs ligand(s) - la fixation d’un premier ligand modifie la liaison des autres ligands

- tout effecteur d’une enzyme allostérique qui modifie l’équilibre entre R et T est un effecteur allostérique de l’enzyme allostérique

- tout effecteur d’une enzyme allostérique qui laisse cet équilibre inchangé est un effecteur non allostérique de l’enzyme allostérique

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SOMMAIRE

1. Généralités 1.1. Classification des enzymes 1.2. Spécificité de la réaction enzymatique

2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique

3. La cinétique enzymatique simple 3.1. Influence de la concentration en enzyme 3.2. Influence du pH 3.3. Influence de la température 3.4. Influence de la concentration en substrat : équation de Michaelis-Menten 3.5. Mesure de l’activité enzymatique 3.6. Influence des inhibiteurs

4. Contrôle de l’activité enzymatique 4.1. La protéolyse ménagée 4.2. Modifications covalentes réversibles 4.3. Les enzymes allostériques

5. Les cofacteurs et coenzymes 5.1. Les deux types de coenzymes 5.2. Exemples de coenzymes d’oxydoréduction 5.3. Exemples de coenzymes de transfert de groupements

6. Les isoenzymes

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5. LES COFACTEURS ET COENZYMES

2 TYPES DE COFACTEURS

coenzymes petites molécules

organiques, souvent dérivées de vitamines

cofacteurs inorganiques = ions métalliques

(métallo-enzymes) : cations divalents

(Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+,…) activateurs ou inhibiteurs font partie du site actif

obligatoirement

éventuellement

+

partie protéique apoenzyme

pour certaines enzymes, cofacteur non protéique

nécessaire à l’activité

holoenzyme

- transporte ou complète un substrat - accepte un produit - participe à la structure de l’enzyme

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5. LES COFACTEURS ET COENZYMES

5.1. Les deux types de coenzymes

interviennent dans des réactions : - d’oxydoréduction : transfert d’électrons et de protons (oxydoréductases) - de transfert de groupements : mono-carbonés, amines (transférases) - de formation de liaisons covalentes (ligases) - éventuellement d’isomérisation (isomérases)

coenzymes petites molécules

organiques, souvent dérivées de vitamines

coenzymes libres = cosubstrats

- dissociation du site actif à chaque réaction catalysée

- stoechiométrique : [coenzyme] ≃ [substrat] - régénérés dans une réaction annexe - 1 fonction spécifique : 1 type de réaction,

même coenzyme pour plusieurs apoenzymes - ex : NAD+ (accepteur d’électrons)

coenzymes liés = groupements prosthétiques

- liés de façon permanente à l’apoenzyme - ne quittent pas la protéine après la catalyse - régénérés au cours de la réaction - catalytique :

[coenzyme] ≃ [enzyme] ≫ [substrat] - ex : FAD accepteur d’électrons)

il existe plus de 1000 enzymes différentes, mais seulement une vingtaine de coenzymes

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5. LES COFACTEURS ET COENZYMES

5.2. Exemples de coenzymes d’oxydoréduction

transferts de protons et d’électrons

2015-2016 Biochimie Biotech 1

• Exemple : le FAD est également un accepteur d'électrons utilisé par diverses enzymes d'oxydo-réduction.

• À retenir : il existe 2 types de cofacteurs enzymatiques : - inorganiques : ce sont les ions métalliques - organiques : ils sont appelés coenzymes. On distingue :

- les coenzymes libres qui se dissocient du site actif de l’enzyme à la fin de la réaction : ils sont appelés cosubstrats

- les coenzymes liés qui restent associés à l’enzyme après la catalyse : ils sont appelés groupements prosthétiques.

5.2. Exemples de coenzymes d’oxydo-réduction

Ils catalysent le transfert de protons et d’électrons.

5.3. Exemples de coenzymes de transfert de groupements

Selon le coenzyme, les groupements transférés peuvent être : - un groupement carboné - un groupement amine - un groupement phosphorylé.

nom transfert type caractéristiques

nicotinamides NAD+ et NADP+ 2 e- et 2 H+ libres

- cosubstrats des déshydrogénases - NADH pour les réactions du catabolisme - NADPH pour les réactions de biosynthèse

flavines (FAD, FMN) 2 e- et 2 H+ lié- oxydoréduction - coenzymes des flavo-protéines, cytochromes

acide lipoïque 2 e- et 2 H+ lié coenzyme des décarboxylations oxydatives

ubiquinone (CoQ) 2 e- et 2 H+ libre chaîne respiratoire mitochondriale

hème 1 e- liécoenzyme des hémoprotéines

(ex : hémoglobine, cytochromes)

nom transfert type caractéristiques exemples d’enzymes

nucléosides phosphates

- phosphate - base + ribose - base + ribose

monoP - base + ribose diP

librephosphotransférases

nucléotidyl-transférases ligases

coenzyme A groupement acyle libreacyltransférases CoA-transférases

thiamine pyrophosphate

résidus aldéhydes lié vitamine B1 (Béribéri) porc, graines, poisson

décarboxylases oxoacide

déshydrogénases transcétolases

phosphate de pyridoxal

groupements amines lié

vitamine B6 viande, graines,

légumestransaminases

biotine CO2 librevitamine H

oeufs, foie, légumes carboxylases

acide tétrahydrofolique

groupements monocarbonés

vitamine B9 légumes C1 transférases

Enzymologie -! -19

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• Exemple : le FAD est également un accepteur d'électrons utilisé par diverses enzymes d'oxydo-réduction.

• À retenir : il existe 2 types de cofacteurs enzymatiques : - inorganiques : ce sont les ions métalliques - organiques : ils sont appelés coenzymes. On distingue :

- les coenzymes libres qui se dissocient du site actif de l’enzyme à la fin de la réaction : ils sont appelés cosubstrats

- les coenzymes liés qui restent associés à l’enzyme après la catalyse : ils sont appelés groupements prosthétiques.

5.2. Exemples de coenzymes d’oxydo-réduction

Ils catalysent le transfert de protons et d’électrons.

5.3. Exemples de coenzymes de transfert de groupements

Selon le coenzyme, les groupements transférés peuvent être : - un groupement carboné - un groupement amine - un groupement phosphorylé.

nom transfert type caractéristiques

nicotinamides NAD+ et NADP+ 2 e- et 2 H+ libres

- cosubstrats des déshydrogénases - NADH pour les réactions du catabolisme - NADPH pour les réactions de biosynthèse

flavines (FAD, FMN) 2 e- et 2 H+ lié- oxydoréduction - coenzymes des flavo-protéines, cytochromes

acide lipoïque 2 e- et 2 H+ lié coenzyme des décarboxylations oxydatives

ubiquinone (CoQ) 2 e- et 2 H+ libre chaîne respiratoire mitochondriale

hème 1 e- liécoenzyme des hémoprotéines

(ex : hémoglobine, cytochromes)

nom transfert type caractéristiques exemples d’enzymes

nucléosides phosphates

- phosphate - base + ribose - base + ribose

monoP - base + ribose diP

librephosphotransférases

nucléotidyl-transférases ligases

coenzyme A groupement acyle libreacyltransférases CoA-transférases

thiamine pyrophosphate

résidus aldéhydes lié vitamine B1 (Béribéri) porc, graines, poisson

décarboxylases oxoacide

déshydrogénases transcétolases

phosphate de pyridoxal

groupements amines

liévitamine B6

viande, graines, légumes

transaminases

biotine CO2 libre vitamine H oeufs, foie, légumes

carboxylases

acide tétrahydrofolique

groupements monocarbonés

vitamine B9 légumes C1 transférases

Enzymologie -! -19

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5. LES COFACTEURS ET COENZYMES

5.3. Exemples de coenzymes de transfert de groupements

transferts de groupements carbonés, amine, phosphates

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SOMMAIRE

1. Généralités

2. Mécanismes généraux de la catalyse enzymatique

3. La cinétique enzymatique simple

4. Contrôle de l’activité enzymatique 4.1. La protéolyse ménagée 4.2. Modifications covalentes réversibles 4.3. Les enzymes allostériques

5. Les cofacteurs et coenzymes 5.1. Les deux types de coenzymes 5.2. Exemples de coenzymes d’oxydoréduction 5.3. Exemples de coenzymes de transfert de groupements

6. Les isoenzymes 6.1. Définition 6.2. Propriétés : exemple de la LDH 6.3. Importance médicale

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6. LES ISOENZYMES

6.1. Définition

enzymes de structures différentes, qui catalysent la même réaction chimique : - séparables par électrophorèse ou chromatographie - spécifiques des tissus chez les eucaryotes - propriétés différentes (affinité pour le substrat)

→ permettent une régulation fine du métabolisme

6.2. Propriétés : exemple de la LDH

C

CH3

O

CO O-

pyruvate

HC

CH3

OH

CO O-

lactate

NAD+NADH, H+

lactatedéshydrogénase

LDH

- catalyse étape cytosolique du métabolisme du glucose en conditions anaérobies : - réduction réversible du pyruvate en lactate - couplée à l’oxydation d’un NADH, H+ en NAD+

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6. LES ISOENZYMES

6.2. Propriétés : exemple de la LDH

- 4 chaînes polypeptidiques - 2 types de chaînes : H dans le coeur, M dans le muscle - 5 formes possibles selon le développement ou les organes

- LDH1 coeur : H4 - LDH2 : H3M - LDH3 : H2M2 - LDH4 : HM3 - LDH5 muscle squelettique, foie : M4

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6.3. Importance médicale

→ utilisation de certaines isoenzymes comme marqueurs de pathologies

Exemple : augmentation de LDH2 et LDH3 en cas d’infarctus du myocarde