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Biochimie et Machines Moléculaires James Sturgis 1 Biochimie et Machines Moléculaires Kinésine Un moteur linéaire
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Biochimie et Machines Moléculaires
Kinésine
Un moteur linéaire
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Introduction – Kinésine
● La kinésine est une protéine capable d'utiliser l'énergie chimique de l'hydrolyse d'ATP pour generer une force mécanique.
● En présence d'ATP, la kinesine peut se lier aux microtubules et se deplacer.
● A cause de sa capacité de se transloquer sur le réseau des microtubules elle est classifier comme protéine moteur des microtubules.
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Introduction – Kinésine
● Les Kinésines jouent plusieurs roles importants dans les cellules.
– Transport des organites et vesicules
– Deplacements des spindles et chromosomes
Kinesine est importante pour le transport de vesicules lysozomes, filaments intermediaires, pigments... dans la cellule.
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Introduction – Kinésine
● Les Kinésines jouent plusieurs roles importants dans les cellules.
– Transport des organites et vesicules
– Deplacements des spindles et chromosomes
The BimC subfamily kinesins function in centrosome or spindle pole body separation, necessary for bipolar spindle assembly.
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Introduction – Kinésine
● Les Kinésines jouent plusieurs roles importants dans les cellules.
– Transport des organites et vesicules
– Deplacements des sindles et chromosomes
Confocal image of Xenopus XL177 cultured cells stained for microtubules (green) and Xklp1 (red). Xklp1 is nuclear in interphase. It is associated with the chromosomes (at the spindle poles in the anaphase spindle shown) throughout mitosis and also accumulates at the spindle midzone during anaphase. See related paper by Vernos, I., Raata, J., Hirano, T., Heasman, J., Karsenti, E. and Wylie, C. 1995 Cell 81:117127.
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Introduction – Structure
● Les Kinésines forment une grande famile
– Saccharomyces cerevisiae 6
– Caenorhabditidis elegans 25
– Drosophila melanogaster ~23
– Homo sapiens~50
Plusieurs variantes de la structure canonique....
Moteur Cterminal (enplace de Nterminal)Tertamerique chaine lourdeSans chaine legere,Sans coiledcoil.Monomerique
LCHC
HC – Chaine lourde,LC – Chaine legère
DomaineMoteur
DomaineCoiledcoil
DomaineQueue
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Introduction – Conformation
● Les queues ont deux conformations distinctes
– Compacte et repliée
– Allongée
● La forme compacte est moins active
– ATP'ase
– Liaison aux microtubules
● Decompaction favorisée par:
– Charges et protéines d'echafaudage
– Phophorylation des chaines legères.
Deux structures mises en evidence par Ultracentrifugation analytique.
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Introduction – Structure 3D
● La structure du moteur de kinésine humaine est connue depuis 1996.
– Une fleche 75 x 45 x 45Å.
– ADP dans une crevasse de surface
– Feuillet b 8 brins avec 3 hélices sur chaque surface
● La structure du moteur Ncd est très semblable.
● La structure est egalement semblable à la myosine
● Et aux petits protéines G.
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Introduction – Structure 3D
● La structure du moteur de kinésine humaine est connue depuis 1996.
● La structure du moteur Ncd est très semblable.
– Ncd progresse dans le sens inverse
– Les coeurs ont une rmsd de 1.21Å
● La structure est egalement semblable à la myosine
● Et aux petits protéines G.
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Introduction – Structure 3D
● La structure du moteur de kinésine humaine est connue depuis 1996.
● La structure du moteur Ncd est très semblable.
● La structure est egalement semblable a la myosine
● Et aux petits protéines G.
– Comme les protéines moteurs un cycle d'hydrolyse est lié à des changements de conformation.
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Questions
● Comment fonctionne le moteur?– C'est quoi le cycle actif qui genere de la force?– Comment optimisée la livraison des cargos?
● Comment est regulée l'activité?– Comment eviter une sur transportation des
charges?
● Comment sont triés les charges?– Quelles charges sont acheminés par quels
moteurs?– Triage ou anarchie?
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Les microtubules
● Si kinesine est un moteur il lui faut des rails....
● Pour avancer il faut pousser contre quelque chose!
● Les kinesines poussent contre les microtubules.
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Les microtubules
● Les microtubules (MT) sont des tubes creux fait de dimers de la tubuline
© 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.
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Les microtubules
● Les microtubules (MT) sont des tubes creux fait de dimers de la tubuline
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Les microtubules
● Les microtubules (MT) sont des tubes creuses fait de dimers de la tubuline
● Les MT forment un reseau complexe et dynamique dans des cellules eucaryote.
● Les MT, in vitro, peuvent s'assembler et desassembler a partir de leurs deux extrémités
● l'extrémité '–' qui pousse moins vite
● l'extrémité '+' qui pousse plus vite
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Les microtubules
● Les microtubules (MT) sont des tubes creuses fait de dimers de la tubuline
● Les MT forment un reseau complexe et dynamique dans des cellules eucaryote.
● Les MT, in vitro, peuvent s'assembler et desassembler a partir de leurs deux extrémités
● l'extrémité '–' qui pousse moins vite
● l'extrémité '+' qui pousse plus vite
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Les microtubules
● Dans des cellules
● les extrémités '-' sont normalement
● soit stabilisé
● soit des sites de dépolymérisation.
● Les extrémités '+' explorent l'espace cellulaire changeant rapidement entre croissance et decroissance dans une comportement appelet instabilité dynamique.
© 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.
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Interaction avec des microtubules
● Il est possible de faire des images des kinesines sur les microtubules.
– Image de microscopie electronique à transmission de Rob Cross
– Et faire une filtrage pour mieux voir la structure.
● Une traitement d'image permet de proposer des structures à basse resolution.
– A partir de telles images des modèles de la Kinesine sur les microtubules ont été proposés.
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● Il est possible de faire des images des kinesines sur les microtubules.
– Image de microscopie electronique à transmission de Rob Cross
– Et faire une filtrage pour mieux voir la structure.
● Une traitement d'image permet de proposer des structures à basse resolution.
– A partir de telles images des modèles de la Kinesine sur les microtubules ont été proposés.
Interaction avec des microtubules
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Interaction avec des microtubules
● Il est possible de faire des images des kinesines sur les microtubules.
– Image de microscopie electronique à transmission de Rob Cross
– Et faire une filtrage pour mieux voir la structure.
● Une traitement d'image permet de proposer des structures a basse resolution.
– A partir de telles images des modèles de la Kinesine sur les microtubules ont été proposés.
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Le cycle catalytique
● La Kinesine montre des cinétiques Michaelis-Menten.
– Hackney 1994 a mesuré les parametres pour la catalyse une Km pour ATP de 30 µM et une kcat d'environ
100 sec-1 en presence de microtubules.
– Le cycle catalytique est relativement bien connu avec la liberation d'ADP et Phophate limitant, et 10000 fois plus lente en absence de microtubules.
– ADP et Pi agissent comme des inhibiteurs competitifs (ils changent l'affinité pour ATP apparente mais pas la vitesse maximale.
● Pas evident de predire tout:– Couplage avec deplacements.
– Cooperativité entre les tetes dans des systèmes dimériques.
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Le cycle catalytique
MtK
MtKATP
MtK ADPKADP
MtK ADPPi
● La Kinesine montre des cinétiques Michaelis-Menten.
– Hackney 1994 à mesuré les parametres pour la catalyse une Km pour ATP de 30 µM et une kcat d'environ
100 sec-1 en presence de microtubules.
– Le cycle catalytique est relativement bien connu avec la liberation d'ADP et Phophate limitant, et 10000 fois plus lente en absence de microtubules.
– ADP et Pi agissent comme des inhibiteurs competitifs (ils changent l'affinité pour ATP apparente mais pas la vitesse maximale. Avec des Ki d'environ 9 et 16 µM.
● Pas evident de predire tout:– Couplage avec deplacements.
– Cooperativité entre les tetes dans des systèmes dimériques.
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Un moteur processif
● Une microtubule glisse sur un kinesine.– Howard et al. 1989 : Les kinsines sont fixées sur une lamelle et sont
capable de déplacer des microtubules qui sont posés sur elles. Avec une vidéo-microscope il est possible de mesurer des deplacements de microtubules de 1-3 µm de longeur.
● Un charge est transporté des longues distances sans dissociation
● Plusieurs ATP sont hydrolysé avant dissociation.
● Il faut deux tetes pour la processivité
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● Une microtubule glisse sur un kinesine.● Un charge est transporté des longues
distances sans dissociation– Block et al. 1990 : Une bille de silice attaché a une molécules de
kinesine se déplace sur des microtubules immobilisées en pas de 8 nm, la kinesine fait des centaines de pas avant de se detacher. Ceci peut etre mesuré avec des pinces optiques.
● Plusieurs ATP sont hydrolysé avant dissociation.
● Il faut deux tetes pour la processivité
Noter: mesure sur molécule individuelle
Un moteur processif
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Un moteur processif
● Une microtubule glisse sur un kinesine.● Un charge est transporté des longues
distances sans dissociation– Yajima et al. 2002 : Mesure de deplacement d'une filament d'actine
fluorescente par vidéo-microscopie a fluorescence. (A) Schematique (B) Image de la microtubule-bodipy .(C) Sequence d'images d'une complexe. Echème 2 µm.(D) Traces des déplacements.(E) Fluctuations de position en présence de 2 mM AMP-PNP.(F) Histogram des displacements en (E).
● Plusieurs ATP sont hydrolysé avant dissociation.
● Il faut deux tetes pour la processivité
Noter: mesure sur molécule individuelle
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Un moteur processif
● Une microtubule glisse sur un kinesine.● Un charge est transporté des longues
distances sans dissociation● Plusieurs ATP sont hydrolysé avant
dissociation.– Hackney 1995 : La cintétique après addition d'ATP montre une phase
rapide du à l'hydrolyse d'ATP par des kinesines sur des microtubules suivi par une phase lente quand les kinesines dissocient. Etude par Quenched flow.
● Il faut deux tetes pour la processivité SecondesRad
ioac
tivité
Hydrolyse de ATP35S
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Un moteur processif
● Une microtubule glisse sur un kinesine.● Un charge est transporté des longues
distances sans dissociation● Plusieurs ATP sont hydrolysé avant
dissociation.● Il faut deux tetes pour la processivité
– Hancock and Howard 1998 : Les kinesines avec une tete sont beaucoup moins efficaces dans les differentes mesures et ne sont plus processives. Ici ils sont 10 fois plus lente et beucoup moins efficace dans le deplacement des microtubules.
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Un moteur processif
● Une microtubule glisse sur un kinesine.● Un charge est transporté des longues
distances sans dissociation● Plusieurs ATP sont hydrolysé avant
dissociation.● Il faut deux tetes pour la processivité
– Hancock and Howard 1998 : Les kinesines sont capables de deplacer des microtubules meme si ils ne sont pas processives parce qu'ils le deplacent tous dans la meme direction et plusieurs kinesines a une tete fonctionnent ensemble. Ceci est semblable aux kinesines monomeriques comme KIF1 qui peut deplacer ainsi des mitochondries.
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Un moteur fort
● Les mesures de force avec des pinces optiques ou des nano-manipulateurs
– Coppin et al. 1997. avec des pinces optiques ont mesurer les relations entre force et vitesse. Une kinesine est capable de generer entre 5 et 6 pN de force ou dispenser environ 300 iW. 1 g de kinesine (Mr 376kD) peut generer 10 MN (monter 1000 tonnes) ou dispenser 1W.
– Toutefois elle est capable de resister des forces plus important sans dissocié ou etre abimé.
– La taille des pas ne change pas avec la force appliquée.
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Un moteur fort
● Les mesures de force avec des pinces optiques ou des nano-manipulateurs
– Coppin et al. 1997. avec des pinces optiques ont mesurer les relations entre force et vitesse. Une kinesine est capable de generer entre 5 et 6 pN de force ou dispenser environ 300 iW. 1 g de kinesine (Mr 376kD) peut generer 10 MN (monter 1000 tonnes) ou dispenser 1W.
– Toutefois elle est capable de resister des forces plus important sans dissocié ou etre abimé.
– La taille des pas ne change pas avec la force appliquée.
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Un moteur fort● Les mesures de force avec des pinces
optiques ou des nano-manipulateurs– Elle peut aussi reculer dans des bonnes conditions....
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Choix d'un mecanisme
● Couplage entre cycle enzymatique et generation de force.
– Pour mesurer la couplage avec des forces il faut mesurer la cinétique enzymatique en presence de forces connues!
– Block et al. 2003 ont fait des mesures de de KM et k
cat en fonction de
[ATP] et de force appliqué [il faut modifier l'equation un peu] ce qui a permis d'étabilr un modele pour les couplages des reactions avec les deplacements.
● Mecanisme de processivité.
– Main sur main symétrique
– Main sur main assymétrique
– Chenille
8.2 nm/pas
Inhibition compétitivepar ADP et Pi. Keq ~ 4.9 105 M
~100 sec1 ~30 µM
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Choix d'un mecanisme
● Couplage entre cycle enzymatique et generation de force.
– Pour mesurer la couplage avec des forces il faut mesurer la cinétique enzymatique en presence de forces connues!
– Block et al. 2003 ont fait des mesures de de KM et k
cat en fonction de
[ATP] et de force appliqué [il faut modifier l'equation un peu] ce qui a permis d'étabilr un model pour les couplages des reactions avec les deplacements.
● Mecanisme de processivité.
– Main sur main symétrique
– Main sur main assymétrique
– Chenille
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Choix d'un mechanisme
● Couplage entre cycle enzymatique et generation de force.
– Pour mesurer la couplage avec des forces il faut mesurer la cinétique enzymatique en presence de forces connus!
– Block et al. 2003 ont fait des mesures de de KM et k
cat en fonction de
[ATP] et de force appliqué [il faut modifier l'equation un peu] ce qui a permis d'étabilr un model pour les couplages des reactions avec les deplacements.
● Mecanisme de processivité.
– Main sur main symétrique
– Main sur main assymétrique
– Chenille
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Choix d'un mecanisme
● Couplage entre cycle enzymatique et generation de force.
– Pour mesurer la couplage avec des forces il faut mesurer la cinétique enzymatique en presence de forces connus!
– Block et al. 2003 ont fait des mesures de de KM et k
cat en fonction de
[ATP] et de force appliqué [il faut modifier l'equation un peu] ce qui a permis d'étabilr un model pour les couplages des reactions avec les deplacements.
● Mecanisme de processivité.
– Main sur main symétrique
– Main sur main assymétrique
– Chenille
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Choix d'un mecanisme
● Couplage entre cycle enzymatique et generation de force.
– Pour mesurer la couplage avec des forces il faut mesurer la cinétique enzymatique en presence de forces connus!
– Block et al. 2003 ont fait des mesures de de KM et k
cat en fonction de
[ATP] et de force appliqué [il faut modifier l'equation un peu] ce qui a permis d'étabilr un model pour les couplages des reactions avec les deplacements.
● Mecanisme de processivité.
– Main sur main symétrique
– Main sur main assymétrique
– Chenille
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Choix d'un mécanisme
● Couplage entre cycle enzymatique et generation de force.
– Pour mesurer le couplage avec des forces il faut mesurer la cinétique enzymatique en presence de forces connues!
– Block et al. 2003 ont fait des mesures de KM et k
cat en fonction de
[ATP] et de force [il faut un peu modifier l'equation] ce qui a permis d'etabilr un modèle pour les couplages des reactions avec les deplacements.
● Mecanisme de processivité.
– Main sur main symétrique
– Main sur main assymétrique
– Chenille
Asbury, Current Opinion in Cell Biology 2005
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Un modèle...
file:///home/james/tmp/Kinesine1.mov
http://valelab.ucsf.edu/research/res_mec_overv.html
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Le necklinker
● Rôle important des changements de conformation du « neck-linker »
● Conformation change avec hydrolyse d'ATP.
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Le necklinker
● Rôle important des changements de conformation du « neck-linker »
● Conformation change avec hydrolyse d'ATP.
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Le Modèle
● Un grand changement de structure de
« neck linker »
● Configuration du linker avec microtubule
evite de reculer.
● L'attachement projète l'autre tête 16 nm
en avant.
● La coordination est faite par geometrie
et pas par interactions entre têtes.
● L'état préponderant est avec deux têtes
liées.
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Le Modèle
Sans ATP le « neck linker » est desordonné, quand l'ATP est lié le « linker » s'ordonne le long de la tête. Le changement de conformation depend de la liaison d'ATP. Liaison d'ATP depend de la présence des microtubules.
● Un grand changement de structure de
« neck linker »
● Configuration du linker avec microtubule
evite de reculer.
● L'attachement projète l'autre tête 16 nm
en avant.
● La coordination est faite par geometrie
et pas par interactions entre têtes.
● L'état préponderant est avec deux têtes
liées.
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Le Modèle
Quand le « neck linker » est ordonné il se dirige vers l'extremité + du microtubule et l'accroche. Le détachement dans la forme ADP evite le recule.
+
● Un grand changement de structure de
« neck linker »
● Configuration du linker avec microtubule
evite de reculer.
● L'attachement projète l'autre tête 16 nm
en avant.
● La coordination est faite par geometrie
et pas par interactions entre têtes.
● L'état préponderant est avec deux têtes
liées.
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Le Modèle
L'attachement du « neck linker » à la microtubule projete l'autre tête vers l'extremité + dans une mécanisme « mainsurmain » asymetrique.
+
● Un grand changement de structure de
« neck linker »
● Configuration du linker avec microtubule
evite de reculer.
● L'attachement projète l'autre tête 16 nm
en avant.
● La coordination est faite par geometrie
et pas par interactions entre têtes.
● L'état préponderant est avec deux têtes
liées.
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Le Modèle
Pour une conformation avec deux têtes liées les deux « necklinkers » doivent etre dans deux différentes conformations et arrivent juste à ecarter les têtes de 8 nm. Donc l'un dans un état ADP ou sans nucléotide et l'autre dans un état ATP ou ADPPi.
+
● Un grand changement de structure de
« neck linker »
● Configuration du linker avec microtubule
evite de reculer.
● L'attachement projète l'autre tête 16 nm
en avant.
● La coordination est faite par geometrie
et pas par interactions entre têtes.
● L'état préponderant est avec deux têtes
liées.
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Le Modèle
Une fois les deux têtes liées la protéine fait un pas rapide avant d'etre a nouveau doublement attaché:
+
● Un grand changement de structure de
« neck linker »
● Configuration du linker avec microtubule
evite de reculer.
● L'attachement projète l'autre tête 16 nm
en avant.
● La coordination est faite par geometrie
et pas par interactions entre têtes.
● L'état préponderant est avec deux têtes
liées.
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Les preuves
● Mesures de la position
du « neck linker » dans
les différents états:
– Rpe
– FRET
– Cryo-ME
Tête moteur
Neck linker
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● Mesures de la position
du « neck linker » dans
les différents états:
– Rpe
– FRET
– Cryo-ME
Les preuves
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● Mesures de la position
du « neck linker » dans
les différents états:
– Rpe
– FRET
– Cryo-ME
Les preuves
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● Mesures de la position
du « neck linker » dans
les différents états:
– Rpe
– FRET
– Cryo-ME
Les preuves
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● Mesures de la position
du « neck linker » dans
les différents états:
– Rpe
– FRET
– Cryo-ME
Les preuves
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● Mutagenese du « neck
linker » arrete les
mouvements mais
change peu l'hydrolyse
d'ATP.
Les preuves
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● Le coiled-coil (hélice
sur-enroulée) ne se
deroule pas pour la
motilité...● Structure du dimère
incompatible avec deux têtes liées... – déroulement de
« coiled coil »– ou « neck-linker »
Les preuves
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● Le coiled-coil (hélice
sur-enroulé)ne se
deroule pas pour
motilité...
● Introduction de ponts S-S
Les preuves
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● Le coiled-coil (hélice
sur-enroulé)ne se
deroule pas pour
motilité...
● Introduction de ponts S-S
Les preuves
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● Le coiled-coil (hélice
sur-enroulé)ne se
deroule pas pour
motilité...
● Mais ses interactions electrostatiques sont importants pour la processivité
Les preuves
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● Deux mutants dans le
site actif...● L'un permet
l'attachement du
« neck-linker » et le
changement de la
position de la tête
partenaire et échange
de son nucléotide,
l'autre non.
Les preuves
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● Information cristallographique de
l'importance de l'hélice « switch »
dans l'attachement / détachement
du « neck linker »
Les preuves
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● Obeservation « direct »
du mouvement main-
sur-main.
Les preuves
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● Obeservation « direct »
du mouvement main-
sur-main.
Les preuves
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● Obeservation « direct »
du mouvement main-
sur-main.
Les preuves
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● Obeservation « direct »
du mouvement main-
sur-main.
Les preuves
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Un modèle...
file:///home/james/tmp/Kinesine1.mov
http://valelab.ucsf.edu/research/res_mec_overv.html
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Les questions
● La dissociation d'une tête est elle aidée par l'autre tête?
● Les liens entre conformation du « neck-linker » et cycle catalytique?
● Peut on observer les changements dans le « neck linker »?
● Comment les charges changent elles le cycle catalytique?
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Les dernières nouvelles
● Series de pas en reculant sont possible... Il faut de l'ATP!
Carter and Cross, 2005, Nature 435
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Les dernières nouvelles
● Séries de pas en reculant sont possible... Il faut de l'ATP!
Carter and Cross, 2005, Nature 435
Bleu/Cyan beaucoup d'ATPRouge/Orange peu d'ATP
Toujours 8 nmRapport dépend de façon exponentiel sur la force
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Les dernières nouvelles
● Séries de pas en reculant sont possible... Il faut de l'ATP!
Carter and Cross, 2005, Nature 435
Bleu beaucoup d'ATPRouge peu d'ATP
En avant solide,En arrière creuse.
Les deux sont sensible a [ATP]
Exponential et pente similaire dans tous les cas.... meme barrière d'activation
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Les dernières nouvelles
● Séries de pas en reculant sont possible... Il faut de l'ATP!
Carter and Cross, 2005, Nature 435
Rouge/Orange beaucoup d'ATPBleu peu d'ATP
Rapport entre force et velocité...
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Les dernières nouvelles
● Séries de pas en reculant sont possible... Il faut de l'ATP!
Carter and Cross, 2005, Nature 435
Une seule étape rapide...
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Les dernières nouvelles
● Séries de pas en reculant sont possible... Il faut de l'ATP!
Carter and Cross, 2005, Nature 435
Etat 0, une tete lié et l'autre n'arrive pas a une nouvelle site, elle ne peut pas marcher.Liaison d'ATP permet attachement de l'autre tete en avant ou derriere (1) le choix depend de la force exercé. A une calle les probablités sont equivalent.
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Régulation de l'activité
● Le plupart de la kinesine de la cellule est non-chargée et inactive.
– Elle ne se lie pas aux microtubules
– Et est inactive à cause de sa queue et de ses chaines legeres...
– Elle peut etre activée par des charges
– Ceci demande deux regions charnieres.
Coy et al.1999. Nature Cell Biol. 1: 288292
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Régulation de l'activité
● Le plupart de la kinesine de la cellule est non-chargée et inactive.
– Elle ne se lie pas aux microtubules
– Et est inactive à cause de sa queue et de ses chaines legeres...
– Elle peut etre activée par des charges
– Ceci demande deux regions charnieres.
Friedman et Vale 1999. Nature Cell Biol. 1: 293297
