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Biochimie des protéines membranaires ou l’importance de

la bonne concentration de détergent

Atelier « cristallisation des protéines membranaires »Carry le Rouet 26-29 Novembre 2007

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Plan

0. Rappels

• Solubilisation des membranes

• Stabilité des protéines membranaires en détergent

• Liaison et échange de détergent

• Concentration de protéine et de détergent

• Les détergents dans les cristaux

0. La Concentration Micellaire Critique

a

a

b

b

c

c

Detergent phenomena in membrane protein crystallisation. (1991) M. Zulauf

0. Comment manipuler les protéines membranaires en solution?

??

Agrégation du fait de "l'effet hydrophobe"

0. La bouée de détergent autours de la protéine

Pebay-Peyroula et al. (1995) Structure 3,1051 Penel et al. (1998). Biochimie 80, 543

1. Solubilisation d'une membrane par un détergent

III. Solubilisation totale de la membrane

I. Partition du détergent dans la membrane II. Solubilisation sélective de lipides puis de protéines

OG

CholateTX100

1,25mM lip

10mM lip

5mM lip

2,5

1,25

[Detsat] = Dw + Rsat[lip]

[Detsol] = Dw + Rsol[lip]TX100 OG Cholate

cmc (mM) 0,18 18 3Rsat 0,64 1,3 0,3Rsol 2,5 3,6 0,9Dw (mM) 0,18 17 2,8/3,7K (mM-1) 3,5 0,09 0,11

1. Solubilisation d'une membrane par un détergent

Paternostre et al., 1988 Biochem. 27, 2668

détergent àcmc élevée

(e.g. CHAPS,cholate,octylglucoside,MEGA-8…)

cmc du cholatedans l’eau: 9-15 mM,P ≈ 103

détergent àfaible cmc

(e.g. Tween 20,Triton X-100,dodecylmaltoside,Lubrol PX…)

cmc du Lubrol PX~0.1 mM,P ≈ 5.105

Détergent

lipides 1 g/l

conditions standard

X = 0.1

X = 0.1

[détergent]tot = 5.7 mM[détergent]eau = 5.56 mM(97.5% dans l’eau)

[détergent]tot = 0.15 mM[détergent]eau = 11 µM(7% dans l’eau)

lipides 2 g/l

2 fois plus de lipides

X = 0.098

X = 0.052

[détergent]tot = 5.7 mM[détergent]eau = 5.42 mM

[détergent]tot = 0.15 mM[détergent]eau = 5.8 µM

lipides 0.5 g/l

2 fois plus de tampon

X = 0.051

X = 0.093

[détergent]tot = 2.85 mM[détergent]eau = 2.8 mM

[détergent]tot = 0.077 mM[détergent]eau = 10 µM

Diapo de JL Popot

2. Biochimie des protéines membranaires

Gradient de saccharose

Diverses colonnes (échange d'ions, affinité, tamis moléculaire…)

Méthodes de purification classiques :

Gels d'acrylamide dénaturants, natifs,

d'isoélectrofocalisation...

Etudes fonctionnelles en détergent

Reconstitution dans des membranes pour études fonctionnelles

Cristallisation (3D, 2D)

Une fois solubilisé, le complexe protéine/détergent se manipule comme une protéine soluble. Mais il faut TOUJOURS être en présence de détergent au-dessus de

sa CMC.

Perte d'un cofacteur stabilisateur(lipides, sous-unités, groupes

prosthétiques…)

Perturbation directe de la région transmembranaire de la protéine

2. Mécanismes moléculaires de l'inactivation de protéines par les détergents

détergent

lipideProtéine active

Protéine inactive

2. Les différents détergents ne sont pas équivalents

Gel natif 2D Digitonine/DDM

3ième dim. gel SDS : sép. des sous-unités de chaque complexe

Isolation de "supercomplexes" de mitochondrie

2. Exemple : la purification du b6 f en DDM (cmc = 0.17mM)

Solubilisation des membranes à 4,5mg/ml lip en 12mM DDM

Colonne d’échangeuse d’anions (pour délipider un peu et améliorer la fixation sur la colonne Ni) : équilibre en 1mM DDM,

lavage et élution en 0.5mM DDM

Colonne Ni : Equilibration, lavage et élution en 0.2mM DDM

Dessalage en 0.2mM DDM

Cristallisation en 0.2mM DDM

0.2 mM dodecylmaltoside

3 mM dodecylmaltoside

Rieske

bas haut

bas hautBreyton et al., J. Biol. Chem. 272:21892 (1997)

dimère actif

chlorophylle libre + Rieske

monomère inactif

2. Sensibilité du b6 f au détergent

2. Purif de FhuA

Cassage des cellules par Presse de FrenchCentri basse vitesse pour virer les cellules non casséesCentri haute vitesse pour récupérer les mbs (interne et externe) Solubilisation à 2% OPOE : solubilise la mb interneCentri pour récupérer la mb externeSolubilisation 1% LDAO, 2%OG, ou 0,5%DDMColonne d’affinité 0,1% LDAO lavage extensif pour délipider,Colonne d’échange d’anions 0,05% LDAO (cmc = 0,023%)

LPS 2 ug, fractions Q

2. Exemple de la Na,K-ATPase

cmc = 20mM

cmc = 3-20mM

cmc = 0,02mMcmc = 1-5mM

Brotherus et al., 1979Biochem 18, 5043

incub. 10-15 minincub. 1 semaine

3. Détermination de la quantité de détergent lié par chromatographie

Gel de silice (3000SW) Superose 620mM Tes pH7

100 mM NaCl

1mM DDM

0.08g/g lipids(11-12mol/mol)

0.92g/g DDM/prot

0.8g/g DDM qd délipidé.

Moller et le Maire (1993) JBC 268

3. Attention si on passe en dessous de la cmc!0,14mM0,18mM

Chromato à 0,18mM DDM (= cmc)

0,89 (0,92) g DDM/g prot

0,04-0,05 g lip/g prot (6-7 mol/mol)

Chromato à 0,14mM DDM

0,7 (0,65)g/g monomère

0,4 (0,5) g/g oligomères

0,04-0,05 g/g lip (6-7 mol/mol)

Dépôt : Ca2+ATPase délipidée en 1,8mM DDM


3. Liaison de détergent aux protéines


b6f

260

FhuA

1,38g

3. Quelle concentration de détergent utiliser ?

Basse cmc Haute cmcEx. DDM, cmc = 0,17 mM3 cmc = 0,51 mM, 0,34mM de det sous forme de micelles

Ex. OG, cmc = 20 mM3 cmc = 60 mM, 40mM de det sous forme de micelles

[Prot] = 5μM, ~ 150 det/prot => 750 μM de det lié



[Prot] = 5μM, ~ 150 det/prot => 0,75 mM de det lié




[Prot] = 5μM, ~ 150 det/prot => 0,75 mM de det lié

NE PAS RAISONNER EN "xCMC" MAIS EN CONCENTRATION AU DESSUS DE LA CMC


4. Concentration de la protéine par ultrafiltration = concentration du détergent

1. Bien choisir le MWCO

2. La taille de la micelle peut varier : micelles + lipides plus grosses => concentration des micelles

3. Bien entendu, le détergent lié à la protéine est concentré avec la

protéine

La membrane de filtration laisse passer les monomères de détergent, le problème se pose pour la micelle!MMicelle DDM ~ 50 000 Da (mais agrégat dynamique)


1. Bien choisir le MWCO

2. La taille de la micelle peut varier : micelles + lipides plus grosses => concentration des micelles

3. Bien entendu, le détergent lié à la protéine est concentré avec la

protéine

Il est très difficile de connaître [det] après concentration => toujours

faire la même chose…

La membrane de filtration laisse passer les monomères de détergent, le problème se pose pour la micelle!MMicelle DDM ~ 50 000 Da (mais agrégat dynamique)

1. 2. 3.

4. Taille d’une micelle

Manip de SEC

Vm Vt

Ve = 1,47 ml => Rs = 3,3 nm (courbe de calibration)

Chromatographie d’exclusion de taille (ou tamis moléculaire), superose 12 :injection de 10μl de 20mM DDMtampon de colonne : 20mM Tris pH 8, 250mM NaCl, 0,2mM DDMNagg = 98 monomère dans une micelle

Données F. Lebaupain


daCosta and Baezinger (2002) Acta Cryst D

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0.1 0.5%LDAO

FhuA0.1%

FTav apconcent

cmc LDAO = 0.023%

5. La cristallisation 3D

Solubilisation,Purification

Cristallisation Type II

Type I

5. Méthode de cristallisation 3D :Diffusion de vapeur

Agent cristallisant [+++]

goutte pendante2-10 μl

ProtéineAgent cristallisant [+]

Méthode de la goutte suspendue

[agent cristallisant][p

roté

ine]

précipitation

nucléation

zone métastable

Diapo de D. Picot

5. Diagrammes de phase de la cristallisation de protéines membranaires

[agent cristallisant]

[pro

téin

e]

Protéine Détergent

[agent cristallisant]

cmc

[dét

erge

nt]

L1’ + L1’’

L1

M

précipitation

nucléation

zone métastable

Diapo de D. Picot

5. Rôle du détergent dans la formation des cristaux

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QuickTime™ et undécompresseur TIFF (LZW)


C10DAO

OG

Pebay-Peyroula et al. (1995) Structure 3,1051

Penel et al. (1998). Biochimie 80, 543

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