BACTERIOLOGIE GENERALE

BACTERIOLOGIE GENERALE (1)3E CANDIDATURE

J. MAINIL

2004/20051. Prsentation des bactries

1.1. La place des bactries dans le monde vivant

Les premires descriptions attestes dorganismes vivants invisibles lil nu (micro-organismes) ont t faites par un drapier hollandais, Antoni van Leeuwenhoek au cours des annes 1670 et 1680. De trs nombreux micro-organismes furent dcrits durant le 18me sicle et des tentatives de classification furent proposes. Mais ce nest que durant le 19me sicle quelles aboutirent vritablement, aprs de nombreux essais. Tous les micro-organismes unicellulaires furent officiellement regroups sous le nom de protistes, qui signifie les tout premiers (protistos) en grec (E. Haeckel, 1866). Cependant, ds le 18me sicle, il tait apparu que deux grands groupes pouvaient tre dcrits: les micro-organismes pourvus dun noyau, tout comme nos propres cellules (ou protistes eucaryotes), et les micro-organismes sans noyau (ou protistes procaryotes: pro = avant; karyon = noyau, en grec). Les premiers furent dnomms protozaires, qui signifie premier ou primitif (prots) et animal (zon) en grec (O.F. Mller, 1786; reconnu officiellement en 1920). Les protistes procaryotes furent, de leur ct, dnomms bacterium en 1872 par F. Cohn. Bacterium est un driv latinis dun terme franais bactridie (C.J. Davaine, 1850), signifie lui-mme bton ou btonnet (baktrion) en grec. Enfin, le mot microbe (mikros: petit; bios: vie; en grec) fut propos en 1878 par C.E. Sdillot, pour dsigner tous les micro-organismes invisibles lil nu. Microbe et protiste sont en quelque sorte des quivalents, mme si aujourdhui la science de la microbiologie inclut les bactries et virus, lexclusion des protozoaires. Aujourdhui, les protistes comprennent non seulement des tres unicellulaires simples et syncitiaux, mais aussi des tres pluricellulaires cellules indiffrencies. Beaucoup plus rcemment (dans les annes 1970), un troisime type de cellules fut dcrit ct des cellules eucaryotes et des procaryotes classiques (ou eubactries): les archaebactries (archae: ancien) (C. Woese, 1970). Les cellules des archaebactries, bien que dpourvues de vritable noyau et formant donc des cellules procaryotes, ne sont ni des cellules eucaryotes, ni des eubactries. Par rapport aux cellules eucaryotes, les cellules procaryotes nont pas de membrane nuclaire, pas de noyau diffrenci, pas dappareil de Golgi, pas de protines histones, pas de mitochondries, ni de chloroplastes. Ces deux dernires organelles drivent dailleurs de bactries ancestrales qui ont dvelopps une relation symbiotiques avec les cellules eucaryotes. Les cellules procaryotes possdent un chromosome sous forme dune molcule circulaire dacide dsoxyribonuclique et des ribosomes avec une valeur de sdimentation 70S (ceux des cellules eucaryotes ont une valeur de sdimentation 80S). De plus, les (eu)bactries possdent une structure externe la membrane plasmique, qui sappelle la paroi (mis part les mycoplasmes et les chlamydies), qui forme dune molcule particulire appele le peptidoglycan, que lon ne retourve pas dans la paroi de archaebactries. Dautres diffrences entre cellule eucaryotes, (eu)bactries et archaebactries sont reprises dans le tableau 1. Les archaebactries forment un groupe de bactries primitives, telles quelles devaient exister au temps de latmosphre primitive de la terre. Elles ne comprennent aucune espce dintrt mdical, mais sont dun trs grand intrt biologique en gnral, car elles vivent dans des conditions extrmes (bactries extrmophiles): sources deau bouillante, abysses des ocans, mer Morte, lacs acides,...

TABLEAU 1: Caractres diffrentiels gnraux des cellules eucaryotes, des bactries et des archaebactries.

CaractristiquesEucaryotesArchae(bactries)(Eu)bactries

Paroi bactrienneAbsenteAbsente ou prsente sans peptidoglycanPrsente avec peptidoglycan

Lipides membranairesChanes droites unies au glycrol par des liaisons esterChanes ramifies unies au glycrol par des liaisons therChanes droites unies au glycrol par des liaisons ester

Gnome2n chromosomes linaires dans le noyauUn chromosome circulaire libreUn chromosome circulaire libre

Introns dans les gnesOui?Non

Protines histonesOuiNonNon

Gnes ARNr18S, 5.8S, 28S16S, 23S, 5S16S, 23S, 5S

Taille ribosomes80S70S70S

Sensibilit ribosomale (td, cyclo, cmp)toxine diphtrique (td), cycloheximide (cyclo)toxine diphtrique (td)Chloramphnicol (cmp)

Boucle dARNr se liant aux protines ribosomalesNonNonOui

Squence commune aux ARNtOui (Gua-Thy-Psduridine-Cyt-Gua)NonOui (Gua-Thy-Psduridine-Cyt-Gua)

Codon dinitiationMthionineMthionineFormylmthionine

ReproductionMitoseScissiparitScissiparit

1.2. Formes et aspects au microscopeLe monde des (eu)bactries est riche en formes diffrentes, visibles au microscope optique. Non seulement chaque cellule bactrienne prsente une forme particulire (coque, btonnet, vibrion, filament,), mais aussi les cellules filles drives dune cellule mre peuvent-elles sassembler de manires particulires (amas, chanettes,). Certaines espces nont cependant pas de forme fixe au cours de leur cycle vital et sont dites pliomorphes (actinomyctes, mycoplasmes, ...). En fait, les formes et assemblages typiques de chaque genre ou famille de bactries sont surtout observs chez lanimal. Lors de culture en milieu liquide, ils pourront parfois tre observs, mais trs rarement aprs culture sur milieu solide. Ces diffrents formes et assemblages varient selon lespce et la souche bactriennes, bien sr, mais aussi selon le milieu, lge et les conditions de culture pour la mme espce bactrienne.

Par exemple, lensemble des genres et espces formant la famille Enterobacteriaceae se prsentent sous forme de courts btonnets (coccobacilles) tel point quil est extrmement difficile de les diffrencier les uns des autres au microscope aprs coloration de Gram. Cependant, des variations sont observes selon lespce et, lintrieur dune mme espce, selon la souche (longueur des btonnets). De plus, selon que lon examine une culture en bouillon, sur glose au sang ou sur glose slective, la longueur des btonnets varie aussi. Enfin, une culture jeune est surtout compose de courts btonnets tandis que leur taille est plus grande dans une culture ge. Certains bactriologistes ont tent de dfinir des critres de taxonomie partir des formes et dimensions des bactries. Ces critres sont valables dans des conditions bien standardises et reproductibles, mais sans plus.

1.2.1. CoquesLes coques sont des bactries de type sphrique (coccus = grain, baie). Il sagit dun nom gnrique qui na aucune valeur de nomenclature, mais aide lenseignement et la classification en gnral. Toutes les bactries cocciformes nont pas une forme sphrique parfaite: certaines sont allonges, dautres prsentent une face aplatie, etc. Les coques se multiplient selon un, deux ou trois plans de division. Les formes qui en rsultent sont respectivement des chanettes, des ttrades ou des amas. La taille moyenne des coques est de 0,8 1 m avec des extrmes de 0,5 2 m .

1.2.1.1. Diplocoques (Diplo = deux)

Les diplocoques sont forms de deux coques assembls: Streptococcus pneumoniae, Neisseria spp.

1.2.1.2. Streptocoques (Streptus = pliable, flexible)

Les streptocoques sont forms de chanettes de coques. Ces chanettes sont plus ou moins longues: Streptococcus spp., Enterococcus spp.

1.2.1.3. TtradesLes ttrades sont des amas de quatre bactries forms suite lexistence de deux plans de division cellulaire.

1.2.1.4. Sarcines (Sarcina = un paquet)

Les sarcines sont des amas rguliers en trois dimensions de huit cellules bactriennes suite lexistence de trois plans de division cellulaire se succdant de manire ordonne: Sarcina spp.

1.2.1.5. Staphylocoques (Staphylo = grappe de raisin)

Les staphylocoques sont des amas irrguliers de bactries forms suite lexistence de trois plans de division cellulaire se succdant de manire anarchique: Staphylococcus spp., Micrococcus spp.

1.2.2. Bacilles ou btonnets

Les bacilles sont des bactries allonges dont un axe est de toute vidence plus grand que lautre. Il ny a pas toujours une limite bien nette et franche entre les btonnets et les coques: certains coques sont allongs; certains btonnets sont trs courts et extrmits arrondies (coccobacilles). La longueur du btonnet peut varier dans certaines limites selon les conditions et lge de la culture pour une souche donne, comme il a dj t dit.

Les btonnets ne prsentent quun seul plan de division cellulaire: mdian. Dans une culture en multiplication, les btonnets sont isols, en paires (diplobacilles), en chanettes plus ou moins longues (streptobacilles), en amas plus ou moins irrguliers (en lettres chinoises) selon les espces, les souches et les conditions de culture.

1.2.2.1. CoccobacillesIl sagit de la forme typique dun grand nombre de bactries pathognes telles les pasteurelles et apparentes (famille Pasteurellaceae) et les entrobactries (famille Enterobacteriaceae). Ces bactries ne sont pas beaucoup plus longues que larges et les extrmits sont arrondies.

1.2.2.2. Bacilles corynformes (coryne = une massue)

Il sagit de courts btonnets de forme irrgulire prsentant une extrmit paissie sous forme de massue ou de baguette de tambour. En gnral, cette extrmit apparat colore plus intensment. Il sagit de la forme typique du bacille de la diphtrie (Corynebacterium diphteriae). Par analogie, les bactries avec cette morphologie ont t appeles btonnets corynformes ou diphtrodes, bien que toutes ne soient par rattaches lespce C. diphteriae taxonomiquement.

1.2.2.3. Vrais bacillesLes vrais bacilles ont des tailles variables. Leur forme est rgulire, leur longueur est bien plus grande que leur largeur. Un trs grand nombre de bactries peuvent tre reprises dans ce groupe: Clostridium spp., Bacillus spp., Listeria spp., Bacteroides spp., Pseudomonas spp. Leur taille varie de 0,5 m sur 0,2 m (Erysipelothrix spp.) 15 m sur 1 m (Clostridium septicum). Les extrmits sont, en gnral, moins arrondies que chez les coccobacilles.

1.2.2.4. Bacilles filamenteuxLes bacilles filamenteux sont de trs longs btonnets. Certaines espces de bacilles peuvent tre qualifies de btonnets filamenteux dans certaines conditions de croissance (Clostridium septicum). Ce caractre filamenteux peut dailleurs tre rapidement perdu en culture.

1.2.2.5. Bacilles fusiformes (fusus = un fuseau)

Les bacilles fusiformes sont des btonnets plus ou moins longs qui ont des extrmits effiles (Fusiformis spp.) En subculture, ces formes typiques disparaissent et des formes bacillaires classiques apparaissent.

1.2.2.6. Bacilles ramifisCertaines bactries peuvent former des ramifications un moment au moins de leur cycle. Cette forme les fait ressembler des mycliums, do leur nom dactinomyctes (aktinos = rayon; mykes = champignon) qui comprennent les genres Mycobacterium spp., Actinomyces spp., Nocardia spp., Rhodococcus spp. et Dermatophilus spp. Dautres genres comme Bifidobacterium spp. montrent aussi des formes ramifies typiques, mais plus courtes. Selon les espces, les conditions et lge de la culture, les formes ramifies sont plus ou moins abondantes par rapport aux btonnets simples.

1.2.3. Courbes

Ces bactries sont, en fait, des btonnets qui ne sont pas droits, mais courbs et qui forment des tours de spires. Deux groupes sont distingus selon leur longueur.

1.2.3.1. Vibrions (vibrio = qui bouge rapidement)

Les vibrions sont des btonnets recourbs en virgule ou en vis. Ces btonnets sont courts (< 5 m) et ne prsentent quun deux tours de spire. Dans une culture, des formes droites peuvent aussi tre observes. Les genres de vibrions dintrt mdical sont: Vibrio spp., Campylobacter spp., Helicobacter spp.

1.2.3.2. Spirilles (spirillum = petite spirale)

Les spirilles sont des btonnets recourbs en longues spirales (jusqu 20 m et plus, car certains spirochtes atteignent 0,5 mm de longueur!) prsentant de nombreux tours de spire. Ils sont fins tels les spirochtes (spira = un tour; chaeta = un cheveu) avec les genres Treponema spp., Brachyspira spp. et Serpulina spp. spires troites et rgulires, Borrelia spp. spires larges et rgulires et Leptospira spp. spires troites et irrgulires, ou trs pais tel le genre Anaerobiospirillum spp.

2. Structure des bactriesLa morphologie dtaille des procaryotes ne fut rvle que grce au microscope lectronique car, vu leur petite taille (ordre de grandeur du m), le pouvoir de rsolution du microscope optique se rvla bien trop faible. Les cellules bactriennes sont en fait constitues, comme les cellules eucaryotes, dun contenu, le cytoplasme et les organelles, et dun contenant, la membrane cytoplasmique et la paroi bactrienne. Cette dernire est, cependant, un constituant unique des bactries. Des structures extrieures aux membranes existent aussi tels la capsule, les cils, les flagelles, les fimbriae.

Enfin, des formes particulires seront prsentes, dont la spore bactrienne qui est une forme de rsistance particulire aux genres Clostridium et Bacillus, parmi les bactries dintrt mdical.

2.1. Le matriel gntiqueLe matriel gntique dune cellule bactrienne se rpartit entre le chromosome bactrien ou nuclode, les lments extra-chromosomiques indpendants (plasmides) et les lments ports par le chromosome ou un plasmide, mais jouissant dune certaine autonomie (phages, transposons, squences dinsertion, transposons conjugatifs, lots de pathognicit et de rsistance).

2.1.1. Le nuclode

2.1.1.1. Prsentation gnraleLe matriel gntique de la bactrie est constitu dune molcule dacide dsoxyribonuclique (ADN) de composition classique, circulaire, bicatnaire et replie sur elle-mme de multiples fois, afin de tenir dans la cellule bactrienne dont la grandeur est de lordre du micron, alors quelle-mme fait un mm de longueur si on ltale (classiquement de 2000 3000 Mdaltons, soit 3000 5000 kilopaires de bases ). Cette pelote dADN, appele chromosome bactrien, est compose dune zone centrale fortement condense o les gnes sont inactifs et de zones priphriques formes de boucles dADN o se dploient les gnes actifs recouverts de polysomes. Cette molcule dADN ne fait pas partie dune structure diffrencie comme chez les eucaryotes. Le terme de noyau est donc impropre et il vaut mieux utiliser celui de nuclode. LADN chromosomique nest pas associ des protines histones, mme si certaines protines pouvant jouer un rle similaire, ressemblant fortement en cela aux nucloplasmes des mitochondries et des chloroplastes.

Cette molcule, ce chromosome, est porteuse de toute linformation gntique ncessaire au mtabolisme bactrien (dgradations, synthses) et la reproduction de la cellule bactrienne (rplication de lADN, synthse de nouvelles membranes et parois, division proprement dite). Toute la squence dADN du chromosome nest cependant pas codante. En effet, les gnes sont spars par des rgions intergniques qui ne possdent aucune fonction particulire reconnue ce jour. Avant la division cellulaire, deux copies du chromosome sont prsentes dans la bactrie (= rplication semi-conservative par le mcanisme des fourches). Ces deux copies vont ensuite sgrger vers les deux futures cellules filles (= partition). La rplication et la partition sont sous contrle gntique strict et sont intimement couples la division bactrienne, elle-mme sous contrle gntique (voir chapitre 4). Certains antibiotiques agissent sur la rplication de lADN (novobiocine, quinolones) (voir chapitre 8).

Linformation prsente sur le chromosome bactrien permet de rechercher les profils mtaboliques des bactries afin den dfinir lappartenance lune ou lautre espce et afin de diffrencier les souches dune mme espce dans une optique pidmiologique (= biotype) (voir laboratoire).

Chez les bactries pathognes, le chromosome peut aussi tre porteur de linformation gntique ncessaire la synthse de facteurs de virulence (adhsines, toxines, ) (voir chapitre 7). Chez dautres bactries, il est aussi porteur dinformation gntique pour les rsistances des mtaux lourds ou des antibiotiques (rsistances dorigine chromosomique par rapport celles dorigine plasmidique) (voir chapitres 8 et 9). Ces informations sont classiquement prsentes sur des fragments dADN nouvellement acquis. Cest ainsi que lon considre quune souche pathogne dEscherichia coli possde 20 % dinformation gntique supplmentaire par rapport une souche commensale non pathogne.

Alors que, pendant des dcennies, le dogme du chromosome bactrien a rgn, il apparat que certaines bactries possdent deux chromosomes (certaines souches de Brucella melitensis, Vibrio cholerae par exemple). Cette situation peut cependant tre une consquence accidentelle de remaniements gntiques, telles que recombinaisons lgitimes (RecA-dpendantes) ou illgitimes (RecA-indpendantes). La recombinaison lgitime est base sur les homologies de squences et dpend du gne recA, tandis que la recombinaison illgitime est peu comprise.

Un autre dogme qui a aussi disparu rcemment est celui du chromosome bactrien circulaire. Certaines bactries (comme Borrelia burgdorferi) possdent en effet un chromosome linaire, dont les extrmits comprennent des squences inverses rptes, linstar de certains virus. Le mcanisme de rplication est inconnu, mais diffre de celui des chromosomes des cellules eucaryotes.

2.1.1.2. Structure du gne bactrienUn gne bactrien est compos dune squence dADN dite codante (= gne de structure) dbutant par un codon start ATG ou GTG (il en existe dautres plus rares) qui code pour la formyl-mthionine et se terminant par un codon stop TAA, TAG ou TGA. Jusqu il y a quelques annes, les introns navaient pas t dcrits dans les gnes bactriens. Cest maintenant chose faite, mme si de tels gnes restent peu frquents. Suite la dgnrescence du code gntique et lvolution, les diffrentes espces bactriennes possdent des taux dusage des codons qui leur sont propres et, en consquence, une composition en bases puriques et pyrimidiques particulire (G+C %). Ces diffrences ont aussi leur importance dans lexpression de gnes clons dans une souche dune autre espce bactrienne. Dans le groupe des mycoplasmes par exemple, le codon TGA nest pas un codon stop, mais code pour le tryptophane. La connaissance des squences des gnes bactriens permet donc:

a) dapporter un lment danalyse supplmentaire lidentification dune souche bactrienne;

b) de reconnatre lorigine trangre de certains gnes (comme ceux qui codent pour des fonctions de virulence ou de rsistance) dans une espce bactrienne particulire.

Le gne de structure proprement dit est prcd dune rgion de liaison de lARN polymrase DNA-dpendante, appele promoteur, dont la position en amont du gne de structure et la composition de base est commune la majorit des gnes bactriens. Ce promoteur est lui-mme prcd, ou partiellement intgr, dans une zone qui joue un rle dans la rgulation de lexpression du gne, loprateur. En aval du gne de structure, se trouve un site de terminaison de la transcription, cest dire une squence dADN qui reprsente le site de dtachement de lARN polymrase DNA-dpendante. Plusieurs gnes de structure peuvent tre sous la dpendance dun seul promoteur et dun seul site de terminaison: ils forment un opron et sont transcrits en un seul ARN messager.

2.1.1.3. Expression du gne bactrienLexpression du gne bactrien est soumise aux influences positives et ngatives de nombreux facteurs externes (composition du milieu de croissance, temprature, atmosphre, prsence de toxiques) qui agissent, directement ou indirectement (via une cascade de gnes intermdiaires) sur loprateur. Selon que cette action sur loprateur soit celle dun rpresseur ou dun activateur, la liaison de lARN polymrase DNA-dpendante au promoteur est contrarie ou favorise. Lactivit du rpresseur ou de lactivateur est elle-mme sous la dpendance de sa liaison, ou de labsence de celle-ci, une autre molcule comme un substrat (rappelez-vous de la rgulation de lopron lactose) ou le produit cod par un des gnes intermdiaire de la cascade de rgulation.

Lorsque lexpression dun gne intermdiaire dans une cascade influence elle-mme lexpression de nombreux autres gnes, tous les gnes de cette cascade sont regroups sous le terme de rgulon. De tels rgulons sont dcrits dans les fonctions de virulence par exemple, dont lexpression nest bnfique pour la bactrie qu lintrieur de certains compartiments de lhte (voir chapitre 7). Il est, par exemple, inutile, et ventuellement nfaste, dexprimer des fonctions de colonisation de lintestin lorsque la bactrie se trouve hauteur du cerveau.

La traduction de lARN messager commence, hauteur du codon start par la formyl-mthionine. Cependant, lorsque ce mme codon se retrouve lintrieur de la squence codante, il code pour un acide amin classique. Le codon start doit donc tre prcd dune squence particulire de reconnaissance. En effet, en amont de cette squence codante, dans la partie leader non codante de lARN messager, se trouve une squence appele Shine-Dalgarno, complmentaire dune partie de la squence de lARN ribosomial 16S. Cette squence Shine-Dalgarno permet donc la liaison ARN messager/ribosome. Diffrentes squences Shine-Dalgarno ont t dcrites, mais certains ARN messagers en paraissent dpourvus (dans ltat actuel des connaissances). Labsence de membrane nuclaire permet la traduction de dbuter avant mme que la transcription ne soit termine (couplage transcription/traduction).

Dans un opron, les traductions des diffrentes squences codantes prsentes sur un seul ARN messager peuvent tre indpendantes ou couples. Dans le cas de traduction couple, la fin de la traduction dun gne situ en amont peut initier le dbut de celle du gne situ en aval et, ainsi de suite, en chane. Ce couplage entrane, bien entendu, labsence de traduction du (ou des) gne(s) situ(s) en aval, lors de la prsence dune mutation entranant la suppression de la traduction du gne en amont (effet polaire dune mutation). Que les traductions des gnes dun opron soit ou non couples, elles peuvent soprer des squences diffrentes: un gne A peut tre traduit x fois plus ou x fois moins, frquemment que le gne B du mme opron, selon laffinit des squences Shine-Dalgarno de chacun des gnes (voir les toxines deux sous-units; chapitre 7).

La traduction de lARN messager se termine ds que le ribosome rencontre un codon stop, mme sil ne sagit pas du dernier codon de lARN messager. La terminaison de la traduction demande lintervention de nombreux facteurs bactriens, regroups sous le nom de facteurs de relchement.

2.1.1.4. Chromosome et typage des bactriesLes chromosomes bactriens diffrent en taille, selon les genres, les espces et, mme, les souches: celui de Escherichia coli avoisine 4700 kpb et celui de Clostridium perfringens, 3500 kpb. Un des plus petits chromosomes dune cellule doue de vie indpendante est celui de Mycoplasma pneumoniae: 600 kpb.

Les chromosomes bactriens diffrent aussi en squences permettant le dveloppement de tests didentification et de typage molculaire (voir aussi chapitre 5). Les dterminations de taux prfrentiel dusage des codons et du G+C % (voir ci-dessus), par exemple, sont utilises comme techniques complmentaires didentification. Mais, les principales techniques actuelles de typage molculaire reposent sur des profils, ou empreintes, de restriction, damplification, ou combinant les deux.

Les profils de restriction sont obtenus par lemploi denzymes dite de restriction, qui coupent lADN hauteur de squences, plus ou moins longues, trs spcifiques. Comme ces squences sont rparties de manire alatoire non uniforme sur le chromosome bactrien, les fragments dADN gnrs auront des tailles diffrentes. Il ne reste qu les sparer par lectrophorse en gel dagarose pour pouvoir comparer les profils de restriction. Lorsque les fragments de restriction sont de taille normale, la technique dlectrophorse est classique et le profil obtenu est appel RFLP ou Restriction Fragment Length Polymorphism; lorsque les fragments de restriction sont de trs grande taille suite lutilisation denzymes qui coupent rarement lADN chromosomique, la technique dlectrophorse est celle du champ puls et le profil obtenu est appel PFGE ou Pulse Field Gel Electrophoresis.

Les profils damplification sont obtenus par lapplication de la technique de PCR ou Polymerase Chain Reaction. Diverses variantes existent: PCR cible base sur lutilisation de primers correspondant des squences connues de gnes connus, RAPD ou Random Amplified Polymorphic DNA base sur lutilisation de primers choisis au hasard, ERIC-PCR ou rep-PCR base sur lamplification de fragments partir de squences rptes hauteur du gnome bactrien, Ici aussi, les fragments dADN obtenus sont de tailles diffrentes, seront spars par lectrophorse en gel et les profils compars par la suite.

Cette approche peut tre couple la premire, si lon soumet en plus les fragments amplifis dADN laction denzymes de restriction: PCR-RFLP. De plus, nimporte quel profil en gel peut tre hybrid avec une sonde gntique particulire correspondant un gne (codant pour les ARN ribosomiaux = ribotypage; codant pour un gne de virulence ou rsistance aux antibiotiques; etc) ou une squence rpte que lon veut tudier.

Ces techniques permettent de comparer le(s) profil(s) dune souche bactrienne non identifie avec ceux des souches de rfrence de diverses espces connues pour apporter un lment didentification, ou de deux souches de la mme espce bactrienne isoles de deux sources diffrentes afin dtablir un ventuel lien de transmission (= lien pidmiologique). Elles sont ainsi appliques dans de nombreuses infections zoonotiques (comme celles par Escherichia coli O157:H7 ou Salmonella enterica) et dans des problmes purement vtrinaires (comme les infections par Brucella abortus ou Mycobacterium bovis chez les bovins).

2.1.2. Les plasmides

Les plasmides constituent des molcules circulaires dADN bicatnaire, quoique des plasmides non circulaires aient t dcrits, indpendantes du chromosome pour la rgulation de leur rplication, mme si elles utilisent la machinerie enzymatique code par le chromosome. Les plasmides sont prsents en un nombre dtermin de copies par copie du chromosome (n). Trois groupes sont dcrits:

a) les plasmides bas nombre de copies: il sagit de grands plasmides (> 20 Mdaltons), prsents en un ou deux exemplaires par copie de chromosome;

b) les plasmides haut nombre de copies: il sagit de petits plasmides (< 10 Mdaltons), prsents plus de 10 exemplaires par copie de chromosome;

c) les plasmides nombre intermdiaire de copies et taille intermdiaire.

Avant la division cellulaire, le nombre de plasmides aura doubl de telle sorte que chaque cellule fille recevra un nombre, sinon identique, du moins trs proche de copies. Le mcanisme de rplication semi-conservative est soit celui des fourches, soit celui du rolling circle. Cette rplication et cette rpartition ou sgrgation dans les cellules filles sont sous la dpendance de diffrents mcanismes molculaires extrmement complexes et stricts, surtout pour les plasmides bas nombre de copies.

Une autre proprit de certains plasmides est la conjugaison, cest--dire la possibilit de se propager horizontalement dune cellule lautre dans une culture. La cellule donneuse conserve un exemplaire du plasmide, la cellule receveuse en acquire un. Le mcanisme de rplication est celui du rolling circle. De cette manire, les gnes prsents sur ce plasmide se propagent trs rapidement dans les populations bactriennes. Le meilleur rendement de la conjugaison apparat lorsque le transfert se fait entre deux souches de la mme espce bactrienne, mais des transferts plasmidiques sont observs entre espces bactriennes parfois trs loignes (entre Gram positives et Gram ngatives par exemple). Mme si le plasmide transfr est instable et perdu par la suite, ces gnes peuvent stablir de manire stable dans les bactries rceptrices par recombinaison lgitime due la prsence de squences dinsertion (voir chapitre 2.1.4) identiques sur le plasmide et le chromosome ou par recombinaison site-spcifique grce la prsence dun transposon sur le plasmide (voir chapitre 2.1.4).

Une autre proprit est celle de pouvoir sintgrer dans le chromosome bactrien ( nouveau par recombinaison lgitime ou site-spcifique) et de pouvoir sen exciser. Lors de cette excision, le plasmide emporte parfois un bout de chromosome, quil peut ensuite propager dans dautres bactries par conjugaison.

Les plasmides codent, en gnral, pour des fonctions qui ne sont pas vitales pour la bactrie en dehors de toute pression slective. Les plasmides qui ne codent pour aucune fonction connue sont appels cryptiques. Ces fonctions sont:

a) rsistance des antibiotiques et des mtaux lourds,

b) synthse de facteurs de virulence,

c) dgradation de molcules organiques,

d) fermentations,

e) bactriocines,

En dehors de ces fonctions naturelles, les plasmides sont bien utiles au gnticien molculaire, car ils lui permettent de cloner, de squencer et dexprimer des gnes, mme dorigine non bactrienne. De plus, des souches dune mme espce peuvent possder des contenus plasmidiques diffrents en nombre et en taille, quil est possible de comparer aprs extraction et sparation par lectrophorse en gel, ventuellement aprs une restriction (= profil plasmidique). Ces plasmides ont donc fourni un outil de typage complmentaire.

2.1.3. Les prophages

A ct des plasmides, une cellule bactrienne peut aussi renfermer de lADN phagique. Les phages sont les virus des bactries. Soit ils tuent la bactrie aprs lavoir infecte et stre reproduits, soit ils cohabitent sans problme, jusqu ce quun lment extrieur vienne rompre cet tat dquilibre. Les phages de la seconde classe sont dits phages temprs, et les bactries qui les hbergent sont dites lysognes. LADN du phage se trouve le plus souvent intgr dans un site particulier du chromosome bactrien (= prophage) par recombinaison site-spcifique le plus frquemment (voir chapitre 2.1.4). Il sen excise lors dun stress, une irradiation aux UV par exemple. Lors de cette excision, tout comme le plasmide, le phage peut emporter avec lui un morceau de chromosome et le transmettre dautres cellules bactriennes (transduction). Dautres prophages seront prsents sous forme plasmidique et leur comportement est en tout point celui dun plasmide.

Les phages peuvent tre porteurs de gnes codant pour des toxines et, dans ce cas, jouer un rle dans la virulence bactrienne. Ils sont aussi trs utiles dans le typage de souches bactriennes appartenant la mme espce des fins pidmiologiques (= lysotypie) (voir laboratoire).

2.1.4. Les transposons et squences dinsertion ou gnes sauteurs

Un troisime type de molcules gntiques dans les cellules bactriennes sont les transposons (Tn) et les squences dinsertion (IS) qui sont insrs sur dautres molcules dADN. Certains phages ont des comportements qui les feront ressembler des transposons (phage MU). Les transposons sont porteurs de gnes codant pour des rsistances aux antibiotiques, pour des facteurs de virulence, pour des fermentations Par contre, les squences dinsertion ne portent pas de gnes donnant un phnotype la bactrie.

Les transposons et squences dinsertion sont des fragments linaires (et non des molcules circulaires) dADN bicatnaire qui ne peuvent se transmettre verticalement aux cellules filles que si la molcule porteuse (chromosome, plasmide ou phage) sest rplique. Par contre, les transposons peuvent se transmettre horizontalement dans la bactrie du chromosome un plasmide, vice-versa, dun plasmide lautre ou mme dun endroit du chromosome un autre (= gnes sauteurs) par des mcanismes de recombinaison site-spcifique. Ce mcanisme de recombinaison est indpendant dhomologie de squences dADN, mais dpend dune machinerie enzymatique code par le transposon lui-mme. Lors de ces sauts, ils peuvent provoquer des remaniements du matriel gntique: excision, dltion, inversion. Les transposons sont donc des outils gntiques naturels trs importants dans lvolution et les remaniements gntiques dans le monde des bactries. Autrement dit, les bactries font des manipulations gntiques depuis bien plus longtemps que lhomme!

2.1.5. Les transposons conjugatifs

Des transposons dous de proprits de conjugaison ont aussi t dcrits dans les bactries Gram+. Il sagit de molcules qui se comportent comme des transposons, mais sont aussi capables de raliser la conjugaison, comme les plasmides, et donc de se transmettre horizontalement, dautres cellules bactriennes. Elles portent des gnes codant pour des rsistances des antibiotiques.

2.1.6. Les lots gnomiquesLes lots gnomiques reprsentent des zones bien dfinies du chromosome bactrien qui possdent des proprits diffrentes de celles qui caractrisent et dfinissent lespce bactrienne en question: G+C %, taux prfrentiel dusage des codons par exemple sont diffrents. Ils reprsentent donc une information gntique dorigine trangre, acquise au cours dchanges gntiques par transformation, transduction et/ou conjugaison, et intgre de manire plus ou moins stable dans le chromosome bactrien, ou sur un plasmide. Certains lots gnomiques sont cryptiques, cest dire ne codent pour aucun phnotype reconnu ce jour, mais la plupart codent pour des informations de nature biochimique, de virulence (lots de pathognicit) ou de rsistance (intgrons).

2.1.6.1. Les lots de pathognicit

Les lots de pathognicit (Pathogenicity Islands ou Pai) sont des fragments linaires dADN intgrs sur le chromosome bactrien, parfois sur un plasmide, par un mcanisme de recombinaison site-spcifique. Il arrive que deux lots de pathognicit diffrents possdent le mme site dinsertion la base prs sur le chromosome. Ils se comportent comme des blocs indissociables et rpondent aux dfinitions suivantes:

a) ils comprennent divers gnes codant pour des facteurs prouvs ou potentiels de virulence ;

b) ils sont prsents dans certaines souches pathognes, mais pas dans les souches non pathognes de la mme espce bactrienne ;

c) leur taille varie entre 10 et 200 kpb ;

d) leur contenu en G+C % est diffrent de celui de la bactrie hte, attestant dune origine trangre ;

e) ils sont souvent encadrs par de courtes squences rptes directes ;

f) ils sont associs des gnes codant pour des ARN de transfert (site dintgration) ;

g) ils contiennent aussi des gnes cryptiques ou exprims codant pour des fonctions dintgrases, ou de transposases, et des squences dinsertion entires ou partielles ;

h) ils sont souvent instables et sexcisent en bloc des frquences variables selon le Pai. Lorsquils sexcisent, toutes les fonctions pour lesquelles ils codent sont perdues.2.1.6.2. Les lots de rsistance ou intgronsLes lots de rsistance, ou intgrons, reprsentent des sites privilgis du chrosomome bactrien qui sont capables dintgrer, par des mcanismes de recombinaison site-spcifique grce lintervention dintgrases code par le chromosome bactrien et de manire cumulative, des fragments dADN codant pour diverses fonctions, dont, dans ce cas prcis, des rsistances des antibiotiques et antiseptiques (voir chapitres 8 et 9). Ces rgions, ou sites dintgration, peuvent ou non possder des gnes intgrs et le nombre de gnes intgrs varie dun site lautre (le maximum dcrit ce jour est sept). Contrairement aux Pais, les intgrons ne sont donc pas des blocs indissociables dADN. Quatre classes diffrentes dintgrons ont t dcrites ce jour, dont les deux premires sont, de loin, les plus frquentes.

Parfois, un site dintgration peut se retrouver sur un plasmide, ou mme sur un transposon (voir chapitre 2.1.3). Dans lexemple du transposon Tn7, les gnes de rsistance non seulement saccumulent hauteur du site dintgration, mais bnficient, en plus, de la mobilit confre par le pouvoir de transposition du Tn7. Si le Tn7 se retrouve sur un plasmide transfrable, tous ces gnes de rsistance peuvent aussi se dissminer dans dautres cellules de la mme espce bactrienne, voire despces bactriennes diffrentes (voir le chapitre 2.1.2).

2.2. Les autres constituants cytoplasmiquesLes autres constituants cytoplasmiques sont peu nombreux compars une cellule eucaryote: les ribosomes et les inclusions granulaires.

2.2.1. Les ribosomes

Les ribosomes bactriens sont soit libres dans le cytoplasme, soit attachs la membrane plasmique. Tout comme les ribosomes des cellules eucaryotes, ils sont engags dans la synthse protique et sont souvent prsents sous forme de polysomes ou polyribosomes. De plus, vu labsence de compartiment nuclaire diffrenci, ces polysomes sont accrochs au chromosome bactrien lui-mme (couplage transcription-traduction). Certains antibiotiques agissent sur la transcription directement (rifamycines) ou non (quilonones). Cependant, ces ribosomes bactriens sont plus petits que leurs homologues des cellules eucaryotes (valeur de sdimentation: 70S au lieu de 80S). Cette diffrence permet laction slective de certains antibiotiques (aminoglycosides, macrolides, chloramphnicol) sur les ribosomes bactriens et non eucaryotes.

Leur morphologie et leur constitution molculaire sont cependant semblables celles des ribosomes eucaryotes. Ils sont composs de deux sous-units: 30S et 50S. Ces deux sous-units sont constitues de protines nombreuses et de trois acides ribonucliques, appels 5S, 16S et 23S ARNr. La sous-unit 30S comprend lARNr 16S et 21 protines tandis que la sous-unit 50S comprend les ARNr 5S et 23S et 34 protines. Les gnes qui codent pour ces ARN ribosomiaux sont regroups en un opron, prsent en un plus de 10 exemplaires sur le chromosome bactrien. Le nombre de copies de cet opron est en relation avec le temps de gnration (voir chapitre 4). Ces oprons sont aussi la base de la technique de typage appele ribotypage (voir chapitre 2.1.1.4).

2.2.2. Les inclusions granulaires

Les inclusions sont des formations cytoplasmiques transitoires rvles par des colorations particulires. De 0,1 0,1 m de dimension, elles sont constitues de substances nergtiques ou mtaboliques mises en rserve par la cellule bactrienne (glycogne chez Escherichia coli; lipidiques chez les mycobactries; etc). Elles ne sont pas observes dans les bactries en multiplication rapide, mais apparaissent ds que la croissance ralentit. La privation de nutriments (fin de croissance pour une culture) en entrane la disparition.

Dans certaines espces bactriennes, ces granules ne sont pas une marque de richesse, mais de spcialisation. Il en existe divers types:

a) de soufre chez les sulfo-(thio-)bactries;

b) de fer chez les sidrobactries;

c) de carbonate de calcium chez des bactries autotrophes;

d) de bta-hydroxybutyrate chez certaines bactries sporulantes;

e) de polyphosphates.

Ces dernires sont des inclusions doues de proprits mtachromatiques (basophiles la coloration de Giemsa). Elles pourraient tre responsables de la coloration bipolaire des pasteurelles (espce Pasteurella multocida) chez lesquelles elles saccumulent aux ples (voir laboratoire).

2.3. Les membranes bactriennesDe mme que la cellule eucaryote, la cellule bactrienne est entoure dune membrane cytoplasmique. Des couches plus externes, reprsentant la paroi bactrienne, existent aussi: celles des bactries Gram positives sont constitues dune paroi paisse de peptidoglycan et celles des bactries Gram ngatives, dune paroi plus mince de peptidoglycan et dune membrane externe. Les rles de la paroi bactrienne sont dassurer une structure rigide la bactrie, de lui donner sa forme typique, de lui permettre de rsister la pression osmotique interne leve et de jouer un rle de filtre vis vis du milieu extrieur.

2.3.1. La membrane cytoplasmique

2.3.1.1. Composition et structure

La membrane plasmique des bactries est semblable celle des cellules eucaryotes et joue le mme rle: limiter le cytoplasme. Elle est identique pour lensemble des eubactries. Sa structure est familire: une double couche (8 nm) de lipides (30 40 %) avec insertion de protines (60 70 %) tournes soit vers la face interne, soit vers la face externe, ou prsentes dans lentiret de son paisseur. Cette structure est bien sr dynamique, au contraire de ce quelle semble tre dans des reprsentations schmatiques.

Les phospholipides qui la composent reprsentent 75 % de la teneur cellulaire totale en lipides. Elle contient aussi plusieurs centaines de types diffrents de protines qui reprsentent 6 9 % de la teneur cellulaire totale en protines. Les protines membranaires interviennent dans de nombreux processus de la vie de la cellule bactrienne: ractions enzymatiques, transports actifs, relais dhormones et de toxines qui ne peuvent la franchir. Certains antibiotiques (les polymyxines), divers antiseptiques et des toxines bactriennes (colocines, bactriocines) ont pour lieu daction la membrane plasmique.

2.3.1.2. Fonction(s)Son rle essentiel est dtre une barrire hydrophobe et osmotique. Leau et certaines petites molcules hydrophiles diffusent librement, tandis que les plus grosses molcules hydrophiles la franchissent par lintermdiaire de transporteurs protiques (permases). Si cette impermabilit fonctionnelle est perturbe (polymyxines, colicines) par cration de pores, les grosses molcules diffuseront librement et la mort cellulaire sensuivra. Inversment, les protines scrtes doivent la traverser pour atteindre le priplasme et le milieu extrieur.

Divers composants de la chane respiratoire qui assurent le transport dlectrons et les phosphorylations oxydatives (voir chapitre 3) sont aussi localiss dans la membrane cytoplasmique. Les enzymes de synthse du peptidoglycan y sont aussi localiss.

2.3.1.3. BiogenseLa biogense de la membrane plasmique se fait de manire indpendante pour les lipides et les protines. Lassemblage se fait selon des mcanismes encore mal connus et mal compris.

Les phospholipides sont synthtiss par des enzymes localiss dans la membrane cytoplasmique elle-mme. Ils sont ensuite insrs dans son feuillet interne et, suivant un mcanisme actif et rgul, ventuellement incorpor dans son feuillet externe.

Les protines membranaires sont synthtises classiquement dans le cytoplasme. Leur squence contient linformation de leur future destination (voir 2.6). Entre autres, les protines localisation membranaire contiennent une squence signal NH2 terminale hydrophobe (15 30 acides amins) et un ou plusieurs autres domaines hydrophobes leur permettant de sinsrer dans la bicouche lipidique de la membrane cytoplasmique. Aprs un ou deux acides amins chargs, une squence dacides amins hydrophobes suit (de 15 30 AA) qui permet linsertion de la protine dans la membrane interne. Selon leur structure primaire, ces protines seront donc tournes vers lintrieur ou lextrieur de la membrane cytoplasmique, ou dans son paisseur (protines transmembranaires).

2.3.1.4. Les msosomesIl sagit dinvaginations multidigites de la membrane cytoplasmique observes chez les bactries Gram positives. Aucune fonction particulire na pu leur tre attribue et leur rle nest, en fait, pas encore connu. Certains travaux mettent leur existence fortement en doute et pour certains auteurs, celle-ci est totalement artfactuelle. Les msosomes se formeraient lors de la fixation de la bactrie. Mais personne ne peut expliquer pourquoi ces invaginations se forment certains endroits particuliers de la cellule bactrienne.

Leurs rles potentiels sont les suivants: les msosomes latraux pourraient intervenir dans les processus enzymatiques et de scrtion (accroissement de la surface de la membrane) tandis que les msosomes septaux, localiss prs du septum de division cellulaire comme leur nom lindique, interviendraient dans la synthse des parois, dans la rplication du chromosome bactrien et la sgrgation des deux copies de ce chromosome lors de la division cellulaire.

2.3.2. La paroi bactrienne

Lenveloppe bactrienne externe la membrane plasmique sappelle la paroi bactrienne. Ses rles principaux consistent donner une forme la bactrie, la protger des agents extrieurs et maintenir une pression osmotique intracellulaire trs leve. Ces rles sont surtout dvolus une substance complexe qui est dcrite ci-dessous, le peptidoglycan (PDG).

Sur base de la composition et de la structure de la paroi, deux groupes de bactries sont en fait dcrits, les Gram+ et les Gram-, donnant ainsi une base et une explication molculaires une observation empirique vieille de prs dun sicle (coloration de Gram; voir laboratoire). Les bactries structure de paroi Gram+ ont reu le nom de FIRMICUTES (firmus = fort; cutis = peau) et font partie de la division II du royaume des procaryotes; celles structure de paroi Gram- le nom de GRACILICUTES (gracilis = mince; cutis = peau) et font partie de la division I du royaume des procaryotes. La paroi des bactries Gram+ est paisse (20 80 nm) et offre un aspect homogne. Elle est compose essentiellement du peptidoglycan associ des carbohydrates, dont le plus connu est lacide teichoque. Lespace situ entre la membrane plasmique et la paroi sappelle le priplasme. Dans certaines espces de bactries Gram+, une couche de protines ou de polysaccharides recouvre la paroi (= couche S; glycocalyx; capsule; zoogle).

La paroi des bactries Gram- est plus fine et plus complexe. La couche de peptidoglycan ne dpasse pas 5 nm. Elle est entoure dune membrane externe similaire la membrane plasmique dans laquelle se trouvent ancrs divers antignes, dont lantigne somatique de nature lipopolysaccharidique. Lespace entre la membrane plasmique et la membrane externe sappelle le priplasme. Extrieure la membrane externe des bactries Gram- se retrouve une couche protique ou polysacharridique (= la couche S; le glycocalyx; la capsule; la zoogle). Les constituants et rles de ces diffrentes couches vont maintenant tre dtaills.

2.3.2.1. La molcule de peptidoglycan2.3.2.1.1. Composition et structure

La molcule de peptidoglycan (PDG) est un complexe polymre tridimensionnel qui entoure toute la cellule bactrienne. Ce polymre comprend deux sucres amins et au moins quatre acides amins diffrents. Ces six molcules forment lunit du polymre: le muropeptide. La composition du muropeptide et la structure exacte du PDG diffrent selon les bactries.

Chez Escherichia coli, une bactrie Gram ngative, le muropeptide est form de:

a) N-actylglucosamine;

b) acide N-actylmuramique (= N-actylglucosamine liant lacide lactique par une fonction ther en C3);

c) un oligopeptide comprenant dans lordre la L-alanine, lacide D-glutamique, lacide diaminopimlique (DAP) et la D-alanine.

Les deux hydrates de carbone sont lis par un lien 1-4, tandis que la fonction carboxyle de lacide lactique fix sur le C3 de la N-actylglucosamine se lie la L-alanine. Une unit de muropeptide est ainsi forme. Des modifications peuvent tre apportes ce muropeptide, modifications qui varient dune espce bactrienne lautre.

Parmi les autres bactries Gram- et parmi les bactries Gram+, des diffrences dans la composition de lunit de muropeptide sont observes. Par exemple pour Staphylococcus aureus, le DAP est remplac par de la L-lysine, et chez dautres bactries par de lornithine ou de lacide glutamique.

Une trentaine dunits de muropeptides sunissent pour former une chane de glycan. Dans cette chane, les molcules dactylglucosamine et dacide actylmuramique alternent. La chane ainsi forme est une sorte dhlice de laquelle les ttrapeptides irradient dans toutes les directions permettant la formation de ponts dans les trois dimensions.

Les chanes de glycan dE. coli sassemblent, pour former un plan, par des ponts entre la fonction carboxyle du DAP et la fonction amine de la D-alanine 80 % ou bien entre les fonctions carboxyle et amine de deux molcules de DAP 20 %. De 30 50 % des muropeptides forment ainsi des liens doubles et environ 10 % des liens triples. Chez les bactries Gram+, les chanes de glycan sont unies par un pentapeptide de glycine (Staphylococcus aureus), un dipeptide de L-alanine (Streptococcus pyogenes), ou encore un pentapeptide compos de trois molcules de glycine et de deux de L-srine (Staphylococcus epidermidis). Dautre part chez Staphylococcus aureus, les liens stablissent entre tous les muropeptides adjacents, hauteur de lacide glutamique en position 2 ou de la L-lysine en position 3 dune part et la D-alanine en position 4 dautre part.

Le PDG des bactries Gram- est forme de deux trois plans et celui des bactries Gram+ dune dizaine de plans superposes. Les variations en composition chimique et en nature des liens covalents sont plus grandes parmi les bactries Gram+ que parmi les bactries Gram-. Les analyses de paroi ont ainsi une grande valeur taxonomique pour ces dernires.

2.3.2.1.2. Elments associs au peptidoglycan

La paroi des bactries Gram+ se caractrise, en outre, par la prsence dautres molcules, lipides, hydrates de carbone et protines. Une remarque pralable, cependant, est ncessaire. En effet, il nest pas toujours facile daffirmer une localisation dans la paroi pour une molcule, car la paroi est aussi un endroit de passage pour toute molcule exporte dans le milieu extrieur ou importe du milieu extrieur.

Les acides teichoques sont des polymres de ribitol phosphate, de glycrol phosphate ou de mannitol phosphate, voire de N-actylglycosamine phosphate ou de N-actylgalactosamine phosphate. Les groupes phosphates sont ioniss. Ces acides teichoques nont t dcrits que dans la paroi des bactries Gram+. Des hydrates de carbone, des sucres amins ou des acides amins voisins sont fixs sur les groupes hydroxyles des ribitols et des glycrols. Ce type dassociation peut aussi avoir valeur taxonomique. Ces acides teichoques se fixent sur le PDG par lintermdiaire des groupes phosphates et des acides muramiques. Leur fonction nest pas connue.

Les acides teichuroniques sont des acides uroniques contenant des polysaccharides. Il sagit aussi de polymres anioniques suite la prsence du groupe carboxyl- sur lacide uronique. Il ny a pas de structure type, ni dattachement type au peptidoglycan (direct ou avec intermdiaire). Leur fonction reste hypothtique (rgulation dactivits enzymatiques)

Des polysaccharides neutres sont prsents dans certaines parois, telles celles des streptocoques (antignes de Lancefield; voir aussi 2.3.3), ou les arabinogalactanes des genres Nocardia et Mycobacterium. Ils sont en gnral lis de manire covalente au PDG.

Les acides lipoteichoques sont des molcules amphiphiles prsentes dans et la surface du peptidoglycan. Ils consistent en un polyglycrophosphate attach un diglycride ou un glycolipide. Les longueurs de chanes varient fortement. Ces acides lipoteichoques peuvent former des micelles grce leur nature amphiphile. Dautres conformations et des associations avec dautres composants de surface, telle la protine M de certains streptocoques sont aussi observes.

Dautres molcules amphiphiles sont dcrites dans certaines espces bactriennes, mais on en connat peu de proprits. Par exemple, le genre Micrococcus contient des lipomannanes, et le genre Mycobacterium des lipoarabinomannanes.

Ces groupes particuliers de bactries Gram+ que sont les genres Mycobacterium et Nocardia possdent jusqu 60 % de lipides dans leur paroi. Ces lipides consistent, en partie, en longues chanes dhydroxyacides (acides mycoliques) en liaison ester avec un polysaccharide darabinogalactane li de manire covalente au peptidoglycan sous-jacent. Une autre partie est constitue de glycolipides non lis. Cette composition particulire est la base, pense-t-on, des proprits de coloration particulires de ces genres (coloration acido-rsistante de Ziehl-Neelsen).

La paroi des bactries Gram+ contient aussi des protines au peptidoglycan. Bien que leur quantit paraisse ngligeable (de < 1 % jusque 16 %), leur importance biologique ne peut tre mise en doute. Cependant, la fonction et le mode dattachement (liaisons covalentes, interactions) nest pleinement connu que pour un petit nombre. Nombre de ces protines servant de rcepteurs (immunoglobulines, fibronectine, fibrinogne, collagne) sont exposes vers le milieu extrieur. Dans certains cas, ces protines sont organises en projections, formant des fibrillae ou des fimbriae: protine M de certains streptocoques lie des acides lipoteichoques, par exemple.

2.3.2.1.3. Fonction(s)

La molcule de PDG assure la rigidit et la forme cellulaire. Elle est ainsi capable dendurer des stress extrmement levs dus la diffrence entre la pression osmotique du cytoplasme et celle du milieu extrieur la bactrie. Si cette notion est dinterprtation facile pour les bactries Gram+, elle lest moins pour les bactries Gram- chez lesquelles le PDG est rduit deux ou trois couches. Cependant, chez ces bactries Gram-, une structure supplmentaire existe: la membrane externe, qui pourrait pallier la relative minceur du PDG, en intervenant comme un premier filtre. De plus, entre la membrane plasmique et la membrane externe existe un espace appel espace priplasmique, pouvant servir en quelque sorte de sas.

Lorsque la paroi cellulaire, et en particulier le PDG, est amoindrie, ou lorsque sa synthse est bloque, et lorsque cette bactrie est place dans un milieu hypotonique, la membrane cytoplasmique clate et la cellule meurt. Cependant, la cellule peut aussi se transformer sous certaines conditions favorables. Elle donne alors naissance des sphroplastes, des protoplastes ou des formes L.

Dans le cas o le milieu extrieur a une pression osmotique plus leve (milieu hypertonique), la plasmolyse se produit et le protoplaste se ramasse sur lui-mme lintrieur de la paroi.

Dans le cas de bactries Gram+, les couches internes de peptidoglycan se retrouvent externes la fin du cycle vital. Les tensions seraient extrmes, tant donn quelles doivent couvrir en fin de cycle une plus grande surface, si des enzymes autolytiques ne cassaient certains liens covalents. Ces autolysines sont responsables de la sparation des cellules filles aprs la compltion du septum de division cellulaire (voir division cellulaire; chapitre 4).

2.3.2.1.4. Biogense

La synthse des prcurseurs du muropeptide se passe en grande partie dans le cytoplasme et sachve dans la membrane plasmique. Lassemblage en muropeptides ainsi que la formation des chanes et des plans de glycan se passent dans lespace priplasmique. Les chanes nouvellement synthtises sinsrent dans des plans existants de glycan aprs lyse (par certaines autolysines) de certains liens covalents. La nosynthse de PDG lors de la division cellulaire et la formation du septum de division (voir chapitre 4) se produisent selon les mmes principes gnraux, mais sont sous la dpendance dautres enzymes de synthse.

Cette synthse est sensible quatre classes dantibiotiques: les cyclosrines dans le cytoplasme, la bacitracine lors du transport au travers de la membrane plasmique, la vancomycine lors des premires tapes de lassemblage en chanes et les pnicillines et cphalosporines lors des dernires tapes de lassemblage (voir chapitre 8).

2.3.2.2. La membrane externe2.3.2.2.1. Composition et structureLa membrane externe est une structure particulire aux bactries Gram ngatives. Comme son nom lindique, elle est localise lextrieur de la molcule de PDG. Au microscope lectronique, elle apparat constitue de deux couches comme la membrane cytoplasmique, laquelle elle est aussi apparente par une composition chimique semblable. Il sagit dune membrane en bicouche lipidique contenant de nombreuses protines fonctions diverses, ainsi que des lipopolysaccharides. Elle est relie la membrane plasmique par des jonctions appeles ponts de Bayer, jonctions hauteur desquelles les couches lipidiques des deux membranes fusionnent. La structure des enveloppes dune bactrie Gram- est donc: membrane plasmique (7,5 nm) priplasme interne (4 nm) PDG (2 nm) priplasme externe (1,5 nm) membrane externe (7,5 nm).

Les lipides sont trs semblables ceux de la membrane interne et ne seront pas plus dtaills.

Les protines (Outer Membrane Proteins ou OMP) sont trs diffrentes par contre de celles de la membrane interne, tant sur la nature que sur la fonction. Elles se divisent en trois groupes: la lipoprotine, les porines et un troisime groupe constitu de protines fonctions structurales, enzymatiques ou de conjugaison.

La structure du lipopolysaccharide (LPS) est assez complexe. La partie proximale, insre dans la membrane externe, est hydrophobe et est connue sous le nom de lipide A ou endotoxine (voir chapitre 7); la partie distale est hydrophile, de nature polysaccharidique, mais de composition variable selon les espces et les souches. Cette partie distale qui stend dans le milieu extrieur reprsente le vritable antigne somatique ou antigne O (= premier antigne impliqu dans la srotypie des bactries Gram-; voir laboratoire). La partie centrale, dnomme le core ou noyau, est un oligosaccharide hydrophile dans sa partie distale, hydrophobe dans sa partie proximale et fort semblable pour des espces bactriennes proches. Selon la nature des hydrates de carbone le composant, le core est dit homosaccharidique ou htrosaccharidique. Certaines espces bactriennes (Brucella) possdent deux LPS diffrents leur surface. La rpartition de ces deux LPS confrent les proprits antigniques particulires (antigne A et M) des espces et souches de ce genre.

2.3.2.2.2. Fonction(s)

La fonction gnrale de la membrane externe est dassurer un contact avec lenvironnement et de protger la bactrie contre des influences nfastes: protection contre la phagocytose par la prsence dans le LPS et ailleurs de chanes polysaccharidiques charges ngativement, exclusion de composs hydrophobes et de composs de haut poids molculaire, protection contre des changement brutaux de pression osmotique dans le milieu extrieur, variation dans le systme antignique qui est peru par le systme immunitaire de lhte, ancrage des adhsine, fimbriae et capsules Une partie de ces fonctions, avec celles de lespace priplasmique, permet de pallier la minceur relative de la couche de PDG chez les bactries Gram ngatives.

La lipoprotine, dont un tiers des molcules, assure chez E. coli des liens covalents avec le PDG, donne une stabilit la membrane externe. Les protines TolA et OMPA sont galement trs importantes dans la stabilisation de la membrane externe et dans la formation des paires lors de la conjugaison plasmidique.

Les porines (OmpA, OmpF, OmpC, OmpD, LamB, PhoE) forment des pores ou canaux relativement peu spcifiques permettant le passage de petites molcules hydrophiles, y compris les antibiotiques! Nombre de ces protines servent aussi de rcepteurs des phages ou des toxines bactriennes (bactriocines). Certaines protines de la membrane externe (Intimine, Afa, AIDA) servent aussi dadhsines aux cellules eucaryotes (voir chapitre 7).

Le LPS a un rle antignique. Sa partie distale reprsente lantigne somatique ou antigne O (Ohne Kapsule). Les souches des bactries Gram- qui produisent cet antigne complet donnent des colonies lisses sur milieu glos (souche S pour smooth); les souches mutes qui ne synthtisent plus au minimum la partie distale donnent des colonies rugueuses (souches R pour rough). Certains mutants R profonds ne synthtisent plus la partie distale hydrophile du core. Ces mutants sont sensibles des toxines hydrophobes. Des mutants qui ne synthtisent plus les lipides A sont ltaux sous certaines conditions. En plus de porter lantigne O, la membrane externe sert aussi dancrage dautres antignes tels lantigne commun des entrobactries, lantigne capsulaire K Le lipide A du LPS est aussi important en pathologie dans le choc endotoxinique (voir chapitre 7).

2.3.2.2.3. Biogense

En ce qui concerne les phospholipides, des changes bidirectionnels ont lieu entre les membranes interne et externe hauteur des ponts de Bayer.

Le LPS est synthtis dans le cytoplasme en lments spars (lipide A, core et antigne O) qui franchissent la membrane plasmique de manire concerte. Lassemblage final se fait dans lespace priplasmique probablement.

Les protines de la membrane externe sont bien sr synthtises dans le cytoplasme. Leur position finale est dtermine dans leur structure primaire, cest--dire gntiquement dans leur squence dacides amins. Tout comme les protines de la membrane cytoplasmique, celles de la membrane externe prsentent dans la partie NH2 terminale une squence signal. Aprs un ou deux acides amins chargs, une squence dacides amins hydrophobes suit (de 15 30 AA) qui permet le franchissement de la membrane interne par la protine qui se droule la manire dun fouet. Une squence signal mute ne permet plus le passage de la membrane cytoplasmique par les protines de la membrane externe. La squence signal est ensuite coupe hauteur dun site bien dtermin (processing site). Le reste de la squence contient linformation gntique permettant linsertion de la protine dans la membrane externe (squences hydrophobes), soit dans son paisseur, soit tournes vers lintrieur ou lextrieur.

2.3.2.3. Lespace priplasmiqueLe priplasme est lespace compris entre les membranes interne et externe des bactries Gram ngatives et est donc en partie compris dans les mailles du PDG. Il sy trouve des protines qui assurent le transport de nutriments et dautres molcules, la biogense de lenveloppe cellulaire, la dtoxification de molcules Ces protines sont attaches lune des deux membranes ou sont libres. Le cheminement des protines priplasmiques est semblable celui des protines de la membrane externe jusqu la coupure hauteur du processing site. La protine mature se retrouve dans lespace priplasmique ou dans les mailles de PDG. Pour certaines protines, cette coupure nexiste pas: ces protines flottent dans lespace priplasmique accroche par leur extrmit NH2 terminale la membrane cytoplasmique. Sy trouvent aussi des petites molcules (polysaccharides par exemple) qui aident tamponner les changements de pression ionique et osmotique de milieu environnant. Normalement, le priplasme est isotonique avec le cytoplasme. Il nen est plus de mme lors de changements dans le milieu extrieur.

2.4. Elments extrieurs la paroi2.4.1. La couche S

La couche S consiste en une couche de quelques nm dpaisseur forme dun ou de deux types de polypeptides, parfois lis des hydrates de carbone, arrangs en rseau daspect crystallin carr, hexagonal ou oblique (aspect comparable celui de la cotte de mailles des chevaliers). Cette couche est rsistante aux dtergents et aux protases. Chez les bactries Gram+, la couche S se retrouve lextrieur du peptidoglycan auquel elle nest pas lie de manire covalente, tandis que chez les bactries Gram-, elle se retrouve lextrieur de la membrane externe. Le lipopolysaccharide (LPS) joue un rle dans lancrage de la couche S. La couche S sert, pense-t-on, de filtre excluant aussi bien lentre que la sortie des molcules trop grosses, mais pourrait aussi possder des fonctions antiphagocytaires (Aeromonas salmonicida; voir chapitre 7) et antibactriophage. Une des raisons de ces rles de dfense serait que la couche S masque les charges lectriques ngatives de la cellule bactrienne, lui confrant des proprits hydrophobes. Sa formation se ferait par auto-assemblage des protines qui la composent.

2.4.2. Le glycocalyx

Le glycocalyx est une couche de matriel glatineux constitu de polysaccharides fibrillaires et qui entoure la paroi cellulaire. Il sagit dun constituant universel du monde bactrien, non visible au microscope lectronique, perdu rapidement aprs passage en culture in vitro. Le glycocalyx constitue pour les bactries un lment qui leur permet dadhrer entre elles et de former des microcolonies la surface des muqueuses ou de matriel inerte (cathters, chirurgie orthopdique).

2.4.3. La capsule

La capsule bactrienne reprsente une couche hypertrophie de glycocalyx, ralisant autour du corps bactrien une vritable aurole, en contact direct avec la paroi et visible au microscope optique. La capsule est mise en vidence par coloration ngative (encre de Chine par exemple) ou positive (Giemsa par exemple) (voir laboratoire). Certaines bactries vont produire un glycocalyx tellement important et hydrat en primoculture quil en devient visible loeil nu: colonies mucodes ou pleureuses. Il en rsulte des modifications antigniques ainsi que de sensibilit certains antibiotiques (discordance entre lantibiogramme du laboratoire et le rsultat du traitement clinique), aux bactriocines et aux phages.

Sa composition varie selon les bactries: compose de polysaccharides complexes (une ou plusieurs sortes) auxquels sont adjointes des protines (Streptococcus pneumoniae) ou dacide D-glutamique sous forme de polypeptides (Bacillus anthracis). La capsule nexiste en fait que chez des bactries pathognes (Clostridium perfringens, Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Klebsiella pneumoniae). La capsule est dveloppe dans lorganisme vivant, mais sa production se perd aprs cultures rptes sur milieux inertes. Sa production est donc fonction de lenvironnement dans lequel la bactrie crot. Sa fonction essentielle in vivo est en effet une protection contre la phagocytose et sa production est donc lie au pouvoir virulent (antigne K1 de souches neuropathognes dE. coli; capsule de Streptococcus pneumoniae).

Rappelons que cest sur des souches acapsules de Streptococcus pneumoniae que fut ralise la premire exprience de transformation au moyen dADN provenant de souches capsules. Cette exprience fut la premire montrer que lADN est le support de linformation gntique. Auparavant, les scientifiques considraient lADN comme ayant une structure trop simple que pour tre porteur dune information aussi complexe!

La capsule est antignique (antignes K ou antignes de Kauffman de diffrentes bactries Gram- = deuxime antigne de la srotypie de ces bactries) et son dveloppement peut cacher certains autres antignes de paroi ou de membrane externe (antignes O = Ohne Kapsel).

2.4.4. La zoogle

La zoogle est une formation plus ou moins volumineuse, parfois macroscopique, daspect glaireux, constitue damas de bactries englobes dans une sorte de gele due au dveloppement norme et la fusion de leurs couches glatineuses (ou glycocalyx) respectives. Dautres microorganismes peuvent y tre associs. Ces structures macroscopiques peuvent jouer un rle dans certaines pathologies (= botryomycose du cheval). Elle reprsente aussi une dfense vis--vis des antibiotiques qui ne diffusent pas ou trs peu lintrieur de la formation.

Des exemples sont le grain de botryomycose = zoogle de Staphylococcus aureus; le grain de Kfir (lait ferment du Caucase) = zoogle de Lactobacillus caucasicus; la gomme de sucreries = zoogle de Leuconostoc mesenteroides. Il ne faut pas confondre la zoogle avec les ractions tissulaires la base de la formation de granulomes inflammatoires lors dinfections par des actinophytes (= actinophytomes) et par les mycobactries (= tubercules) (voir chapitre 7).

2.5. Appendices de surfaceAu-del de ces couches externes se trouve le milieu extrieur. Cependant, certaines structures bactriennes supplmentaires ancres dans les membranes sont en contact direct avec ce milieu extrieur et permettent la bactrie dentrer en relation avec les constituants de milieu extrieur: les cils ou flagelles, les fimbriae et fibrillae et les pili sexuels.

2.5.1. Les cils ou flagelles

Les cils (ou flagelles) sont des filaments trs tnus (0,01 m 0,05 m dpaisseur), onduleux et de longueur variable (jusque 80 m) qui prennent naissance dans le cytoplasme hauteur dun corps basal. La protine qui les compose, la flagelline, est proche de la myosine. Les cils sont les organes locomoteurs des bactries et sont anims de mouvements hlicodaux trs rapides.

Pour les observer, il faut recourir divers artifices:

a) examen microscopique frais en liquide visqueux: les cils ralentis dans leurs mouvements senchevtrent et forment des torsades plus ou moins paisses;

b) des colorations (voir laboratoire);

c) la microscopie lectronique.

Toutes les bactries cilies, cest--dire mobiles, ne possdent pas le mme nombre de cils et ceux-ci prsentent des arrangements divers autour de la bactrie. Les bactries monotriches possdent un cil une extrmit du btonnet (Pseudomonas aeruginosa); les bactries amphitriches ou cphalotriches possdent un cil chaque extrmit (certains spirochtes); les bactries lophotriches possdent une touffe de cils une extrmit ou aux deux (certains spirochtes); les bactries pritriches possdent beaucoup de cils sur toute leur surface (Proteus spp., Clostridium tetani, Cl. chauvoei, Cl. septicum); les bactries pritriches dgnres possdent peu de cils rpartis sur toute leur surface (Bordetella bronchiseptica).

Les cils prennent naissance hauteur du corps basal, traversent les membranes et sont libres dans le milieu extrieur. Ce nest pas le cas pour les spirochtes (amphitriches ou lophotriches). Les cils prennent naissance chaque extrmit du btonnet, mais restent dans la membrane externe et se rejoignent au centre de la bactrie. Les cils forment ainsi le filament axial (voir chapitre 2.6.6.).

La mobilit est visible au microscope contraste de phase. Les bactries mobiles traversent le champ trs rapidement (Pseudomonas spp., Proteus spp.) ou plus lentement (Campylobacter spp., Bordetella bronchiseptica surtout), en ligne droite (Proteus spp., Pseudomonas spp.), en mouvements spirals (Campylobacter spp., spirochtes) ou en mouvements enrouls (cumulets de Bord. bronchiseptica). Les cils sexpriment mieux lors de cultures en milieux liquides que sur milieux solides.

La mobilit est aussi dtecte dans des tubes glose molle (0,3 %) comprenant une cloche renverse. Les bactries sont ensemences lextrieur de la cloche. Seules les bactries mobiles rejoindront lintrieur de la cloche. La mobilit est visible en glose molle aussi aprs ensemencement en piqre droite. La bactrie immobile poussera uniquement le long du trait de piqre, la bactrie mobile sen cartera. Sur glose au sang, la mobilit peut aussi tre observe lors de ltalement, plus ou moins prononc, des colonies (Pseudomonas aeruginosa et Salmonella enterica par exemple). Le cas extrme est constitu par lespce Proteus mirabilis qui peut envahir en moins de 48 heures toute la surface de la bote de Ptri sous forme de vagues.

Les cils et flagelles sont porteurs dantignes (antignes H) qui sont importants dans lidentification srologique de certaines bactries: Salmonella enterica, Escherichia coli.

2.5.2. Les pili, fimbriae et fibrillae

Les pili (ou poils) sont des appendices priphriques visibles seulement au microscope lectronique. Seules certaines bactries en sont dotes. Ils se rpartissent en divers groupes. La terminologie est assez mouvante mais actuellement le terme pili est rserv aux pili sexuels. Les autres types de pili sont appels fimbriae sils sont rigides, courts et pais (6-7 nm de diamtre) ou fibrillae sils sont longs, flexibles et fins (2-3 nm de diamtre). Certains fimbriae sassemblent en torsades et formant une structure semblable celle dune corde tresse (fimbriae de type IV).

Les pili sexuels (pili F, I) sont synthtiss par des gnes de lopron de conjugaison des plasmides conjugables (plasmide F par exemple). Les bactries qui possdent ces pili sont dites bactries mles. Grce ces pili, elles tablissent hauteur de la protine OmpA un contact avec les bactries qui en sont dpourvues et le plasmide peut ainsi passer de la bactrie donneuse la bactrie rceptrice, par un mcanisme de rplication de type rolling circle. Celle-ci devient bien sr une bactrie mle. Les bactries mles produisent en plus, partir du plasmide conjugatif lui-mme, des protines qui masquent OmpA de telle sorte quil ny a pas dchange de plasmides entre des bactries mles.

Les pili somatiques, ou fimbriae de type 1, sont au nombre de plusieurs centaines sur E. coli, ils couvrent la surface des cellules. Ils permettent aux bactries dadhrer des rcepteurs cellulaires, mais cette adhsion est dite sensible au mannose, car ces rcepteurs contiennent des rsidus mannose (voir aussi chapitre 7). Ils sont antigniques (F1) et diviss en plusieurs sous-groupes. Ils pourraient intervenir dans certaines pathologies. Ils ont un diamtre de 7 nm, mais leur longueur varie entre 0,2 et 2 microns.

Les pili spcifiques dadhrence sont des fimbriae pais et creux (5-7 nm de diamtre) ou des fibrillae fins et pleins (2-3 nm de diamtre) qui permettent aux bactries de saccrocher des rcepteurs cellulaires de natures chimiques diverses, mais ne contenant pas de rsidus mannose (adhrence dite rsistante au mannose) et, chez lhte, dviter dtre emportes par le transit intestinal, la miction ou le transit respiratoire. Nombre dentre eux sont des facteurs de virulence (voir chapitre 7). Tout comme les pili sexuels et les pili somatiques, les pili dadhrence sont antigniques. Cependant, leur nomenclature nest pas fixe. Il y a tendance les appeler antignes F, mais les premires descriptions les ont assimils des antignes capsulaires sur base de proprits physiques (do les dnominations K88 pour F4 et K99 pour F5). Leur nature chimique est cependant protique et non polysaccharidique (contrairement aux vrais antignes K de la capsule). Ils sont importants dans la reconnaissance des souches pathognes. Malheureusement leur expression in vitro peut tre difficile et de nombreux faux ngatifs existent.

Les fimbriae et fibrillae typiques sont constitus dune protine majeure de structure (sous-unit majeure ou piline), de diverses protines mineures de structure (sous-units mineures) et dune protine fonctionnelle (adhsine). Ladhsine est parfois un domaine de la sous-unit majeure (voir chapitre 7).

2.5.3. Biogense

Les protines des flagelles, pili et fimbriae doivent tre excrtes au-del de la membrane externe chez les bactries Gram-. Divers mcanismes existent, mais , en gnral, ces protines comprennent dans leur squence, en plus des informations ncessaires au passage de la membrane cytoplasmique et du transport dans le priplasme, linformation ncessaire ce franchissement de la membrane externe.

2.6. Lexcrtion des protinesAprs leur synthse, les protines dE. coli sont transportes vers leur destination: le cytoplasme, la membrane cytoplasmique, le priplasme, la membrane externe, le milieu extrieur. Les protines qui franchissent la membrane cytoplasmique sont dites exportes; celles qui franchissent la membrane externe sont dites scrtes. A ce jour, quatre systmes de scrtion ont t dcrits.

Dans le systme de type I, la protine est scrte au travers dun canal qui lui permet de franchir en une seule tape les membranes cytoplasmique et externe. Le canal est form de trois protines dont deux sont synthtises par des gnes qui font partie de lopron qui comprend le gne de structure de la protine. La troisime protine, TolC, est code par un gne chromosomique indpendant. La scrtion de la protine est sous la dpendance dune activation par une quatrime protine, dont le gne fait partie du mme opron, et de sa propre squence amino- ou carboxy-terminale, qui ne subit pas de clivage protolytique aprs le passage.

Les systmes de scrtion de types II et IV comprennent deux tapes, dont la premire est commune.

Le systme de scrtion de type II est aussi appel le systme de scrtion gnral ou le systme de scrtion dpendant de la machinerie sec, qui code pour diverses protines chaperonnes assurant le transport correct des protines non matures dans le cytoplasme, afin dviter un reploiement prcoce inadquat. Le passage de la membrane cytoplasmique est sous la dpendance du peptide signal, une vingtaine dacides amins hydrophobes prsents lextrmit amino-terminale, qui subit un clivage protolytique aprs le passage. Dans le systme de scrtion de type II proprement dit, le passage de la membrane externe se fait au travers dun pore membranaire form par des protines codes par des gnes faisant partie ou non du mme opron que le gne de structure de la protine.

Dans le systme de scrtion de type IV, les protines traversent la membrane externe au travers dun pore form par leur propre extrmit carboxy-terminale, qui subit son tour un clivage protolytique.

Le systme de scrtion de type III est certainement le plus complexe. Il est form dun appareil compos dune vingtaine de protines localises essentiellement dans la membrane cytoplasmique, mais aussi dans la membrane externe et dans le cytoplasme, permettant la scrtion des protines en une tape. Linformation pour la scrtion via ce systme rside dans lextrmit amino-terminale qui ne subit aucun clivage protolytique. Les gnes qui codent pour ce systme de scrtion de type III forment un ou plusieurs oprons qui nincluent pas le gne de structure de la protine, mais en sont physiquement proches (sur le mme lot de pathognicit, par exempl.2.7. Les formes particuliresEn plus des structures des bactries classiques dj prsentes, dautres formes existent. Certaines sont accidentelles, dautres induites in vivo ou in vivo.

2.7.1. Protoplastes et sphroplastes

Lorsque la paroi des bactries se rompt ou lorsque sa synthse est interrompue, les bactries peuvent survivre in vitro si elles se trouvent dans un milieu iso- voire hypertonique. Dans un milieu hypotonique, elles clatent. Les bactries Gram positives donnent naissance des cellules entoures de la membrane plasmique: les protoplastes. Les bactries Gram ngatives donnent naissance des cellules entoures de la membrane plasmique et de la membrane externe: les sphroplastes. Un traitement la pnicilline ou au lysozyme peut rsulter en ce genre de transformation. Les protoplastes et sphroplastes peuvent tre mtaboliquement actifs, mais ne peuvent se multiplier.

2.7.2. Les formes L (Institut Lister)

Les formes L se forment partir de bactries Gram+ ou Gram-, spontanment ou suite lexistence de divers stimuli (choc osmotique, choc de temprature, prsence de pnicillines qui inhibent la synthse du peptidoglycan ), qui ont pour consquence linhibition partielle ou totale de la synthse de peptidoglycan. Dans le cas de la prsence de pnicillines, la transformation en forme L permet aux bactries dchapper lactivit antibactrienne de ces antibiotiques. Les formes L sont des protoplastes ou sphroplastes qui, non seulement survivent, mais aussi se multiplient. Leur culture in vitro est possible et leur colonie a un aspect en uf sur le plat. Cependant, leur croissance est trs lente. Normalement, ces formes L sont capables de dmarrer une nouvelle synthse de PDG lorsque lagent (pnicillines) ou les conditions inhibitrices disparaissent. Dans certains cas, les formes L sont stables et dfinitives (origine gntique). Les formes L nont cependant rien en commun avec les mycoplasmes.

Les formes L ont cependant subi certains changements par rapport aux protoplastes et sphroplastes afin daugmenter leur chance de survie. Par exemple, la membrane plasmique est moins fluide suite laccumulation dacides gras saturs au dpens des acides gras insaturs.

Elles proviennent de diverses espces de bactries telles que celles des genres Streptococcus, Proteus, Vibrio, Bacteroides, Streptobacillus moniliformis et les entrobactries. Les formes L sont certainement produites par les bactries lors de la culture in vitro. La question de leur production in vivo chez lorganisme hte est encore dbattue, de mme que celle de leur rle dans la maladie. Jusqu prsent, il nexiste aucune vidence quelles soient pathognes par elles-mmes. Elles pourraient cependant reprsenter une forme de dormance pour certaines espces bactriennes qui formeraient, lintrieur de lhte, un rservoir de cellules capables de resynthtiser une paroi ds que lantibiothrapie cesse et de provoquer une rcidive de la maladie. Mais ceci reste une hypothse lheure actuelle.

2.7.3. Les mycoplasmes (mykes = champignon et plasma = forme ou moule)

Les mycoplasmes diffrent des bactries en gnral par labsence de paroi et de peptidoglycan. La cellule est entoure dune simple membrane plasmique qui contient des strols, fait unique dans le monde des procaryotes. De nombreuses espces de mycoplasmes exigent dailleurs du cholestrol comme facteur de croissance dans leurs milieux de culture. Certaines espces produisent une capsule dhydrate de carbone. Leur taille est rduite (0,100 0,150 m) et ils franchissent les filtres bactriologiques les plus grossiers (do la confusion initiale avec les virus).

Le matriel gntique des mycoplasmes est petit. Il reprsente de un cinquime la moiti du gnome dune bactrie classique (de 500 1300 kilopaires de bases versus plus de 4500 kpb pour Escherichia coli).

Dautres diffrences gntiques concernent les ADN et ARN polymrases, les oprons pour les ARN ribosomiaux et la longueur de lARNr5S. Dautre part, le codon UGA, codon stop dans les eubactries classiques, code pour le tryptophane chez de nombreux mycoplasmes. Retenons aussi la rsistance de lARN polymrase la rifamycine, bien quil sagisse de bactries Gram+ fondamentalement (voir chapitre 8).

Les mycoplasmes prsentent un cycle volutif au cours de leur vie. La forme la plus simple est le corps lmentaire de 100 150 m. Pendant sa croissance, ce corps lmentaire sallonge, se ramifie et forme un myclium plus ou moins tendu. Dans ce myclium apparaissent des granulations qui sont lorigine de nouveaux corps lmentaires. La proportion entre ces formes varie selon lespce dans une culture pure. Certains mycoplasmes prsentent mme une forme hlicodale une certaine tape de leur cycle. Les colonies sur milieux gloss sont minuscules (0,1 mm) et montrent un aspect en uf sur le plat.

Le terme franais mycoplasme dsigne lensemble de ces organismes bien que la nomenclature officielle rserve ce terme pour un seul des diffrents genres (Mycoplasma) du groupe (voir chapitre 5). Les mycoplasmes font partie de la division III du royaume des procaryotes, celle des Tnricutes (voir chapitre 1.1), qui comprend une seule classe, celle des MOLLICUTES (mollis = mou et cutis = peau); ce terme tant, aujoudhui, aussi utilis de manire gnrique pour dsigner lensemble du groupe. Un autre terme utilis dans le pass, T-mycoplasmas pour Tiny (minuscule)-mycoplasmas, dsignait les membres du genre Ureaplasma, dont les colonies taient encore plus petites que celles des mycoplasmes. Un terme, toujours utilis, dsigne des structures observes ressemblant des mycoplasmes, mais non cultives: mycoplasma-like organisms ou MLOs.

Les premiers mycoplasmes avoir t dcrits par Nocard et Roux en 1898 sont les agents responsables de pleuropneumonies chez les bovids. Le nom des autres mycoplasmes dcrits par la suite fut longtemps celui de PPLO pour Pleuro-pneumoniae-like organisms.

Pendant trs longtemps, la taxonomie et la nomenclature de ce groupe dorganismes fut floue et anarchique. La plus grande confusion rgna aussi longtemps quant leur caractre viral ou non, car il sagit dagents filtrables. Mais dans les annes 30, la vritable nature des virus fut lucide et il devint vident que les mycoplasmes taient diffrents.

Par la suite, une longue polmique naquit sur la relation entre formes L et mycoplasmes. De nombreux chercheurs tenaient les mycoplasmes pour des formes L stabilises in vitro. La biologie molculaire montra que les mycoplasmes forment en fait un groupe de bactries part entire.

La dernire polmique concerne le statut volutif des mycoplasmes: forme bactrienne primitive ou forme de dgnrescence. Des tudes de gntique molculaire sur les ARN ribosomiaux ont montr que les mycoplasmes sont proches de la branche des bactries Gram+ des eubactries et notamment des genres Lactobacillus et Clostridium. Fondamentalement, il sagirait donc de bactries Gram+ bien que leur coloration soit Gram- au microscope vu labsence de paroi et de peptidoglycan. Elles se colorent en fait mieux au Giemsa (voir laboratoire), surtout dans les tissus et organes.

Retenons dj que nombre de mycoplasmes sont suspects dtre des agents primaires de diverses affections des muqueuses et de la mamelle, au mme titre que des virus: toux des chenils (Mycoplasma cynos), shipping fever du btail (Mycoplasma spp.). Dans certains cas, il sagit dagents pathognes directs: pleuropneumonie contagieuse des bovids et des caprins (Mycoplasma mycoides), agalactie contagieuse de la chvre (Mycoplasma agalactiae), pneumonie enzootique du porcelet (Mycoplasma hyopneumoniae).

2.7.4. Les bactries acido-rsistantesParmi les bactries Gram+, les genres Mycobacterium et Nocardia, essentiellement, se caractrisent par la prsence dans leur PDG darabinogalactanes en liaison ester avec des lipides (acides mycoliques; voir chapitre 2.3.2.1). Cette constitution particulire leur confre des degrs varis dacido-rsistance (coloration de Ziehl-Neelsen).

Il faut ajouter le genre Brucella, compos de bactries Gram-, qui possdent un trs faible degr dacido-rsistance li aux lipides prsents dans la membrane externe. Ce lger degr dacido-rsistance est suffisant pour avoir permis le dveloppement de la coloration de Kster, trs importante dans le diagnostic prsomptif des affections brucelliques.

Les mycobactries sont responsables, entre autres, de la tuberculose chez diverses espces animales et chez lhomme, de la paratuberculose des ruminants et de la lpre chez lhomme; les Nocardia, daffections cutanes et de la plvre chez les chiens; les Brucella, daffections gnitales (infertilit, avortement) chez diffrentes espces animales (voir chapitre 5).

2.7.5. Les bactries intracellulairesLes bactries intracellulaires obliges sont reprsentes par deux ordres: les Rickettsiales et les Chlamydiales. Ces deux groupes taient runis dans le pass sous le nom unique de Rickettsiales. Mais de nombreuses diffrences de cycle de vie et molculaires permettent de dgager lexistence de deux groupes.

Historiquement, ces bactries furent considres comme des intermdiaires entre les bactries et les virus, puis des tudes sur leur composition et leur structure ont montr quil sagit bien de bactries, rapprocher des bactries Gram-.

Diverses colorations peuvent les mettre en vidence dont le Giemsa et le Koester (voir laboratoire).

2.7.5.1. Les rickettsiesLes rickettsies ont des caractristiques communes: pathognes intracellulaires obligs des cellules sanguines et des vaisseaux sanguins, prsence chez des mammifres et des arthropodes (poux, puces, tiques ) qui sont les vecteurs de la maladie La transmission se fait de larthropode au mammifre ou vice-versa par piqre, et dun arthropode un autre par voie transovarienne.

Chez larthropode vecteur, ces bactries se retrouvent dans lintestin o elles se multiplient lintrieur des entrocytes. En gnral, il ny a pas de dommage pour larthropode. Deux espces sont connues pour ne pas ncessiter darthropode vecteur. La premire, Coxiella burnetii, est caractrise par une phase intracellulaire sous forme sporogne rsistante dans le milieu extrieur (voir chapitre 2.8.2). La seconde, Neorickettsia helminthoeca, parasite un trmatode, la douve du foie de saumon.

Les rickettsies sont de minuscules coccobacilles (0,3 0,5 m de diamtre sur 0,3 0,4 m de long) isols en paires ou plus rarement en chanes. Ces cellules comportent des enveloppes extrieures composes, entre autres, dune paroi typique de celle des bactries Gram ngatives, avec une membrane externe porteuse dun LPS et un PDG contenant du DAP. De plus, une couche glatineuse est prsente dans certaines espces.

Les rickettsies se multiplient par division binaire transversale dans une vsicule qui les protge des lysosomes. Elles sont libres soit par lyse de la cellule hte, soit par une vsicule via la membrane cellulaire.

Des exemples de maladies causes par des rickettsies sont la fivre Q des ruminants (Coxiella burnetii), la Rocky Mountain spotted fever des humains et des chiens (Rickettsia rickettsii), les anaplasmoses bovines (Anaplasma centrale et Anaplasma marginale) et la Potomac horse fever des quids (Ehrlichia risticii). Deux genres, Haemobartonella et Eperythrozoon, ont rcemment t reclasss dans le groupe des mollicutes et, plus particulirement, dans le genre Mycoplasma (voir chapitre 5).

2.7.5.2. Les chlamydiesLes chlamydies sont des pathognes intracellulaires obligs de trs nombreux types de cellules eucaryotes. Elles se diffrencient des rickettsies par diverses proprits caractristiques, dont celle de possder un cycle de vie comprenant une priode intracellulaire, lintrieur de vsicules cytoplasmiques (inclusions), et une priode extracellulaire. Les chlamydies sont dpendantes de la cellule hte pour le mtabolisme nergtique. Elles possdent des mcanismes leur permettant dexploiter diverses fonctions cellulaires, dont, bien sr, la production dnergie, et de pntrer dans les diffrents compartiments cellulaires.

Ces bactries sont entoures denveloppes caractristiques de celles des bactries Gram ngatives mais se remarquent par labsence de PDG (voir chapitre 2.8.2). La membrane externe nest donc spare de la membrane plasmique que par lespace priplasmique. La membrane externe porte un LPS, des porines et peut-tre des fimbriae.

Le cycle de vie alterne entre le corps lmentaire (0,3 m), qui peut survivre hors de la cellule hte et qui est infectieux, et le corps rticul (( 1 m) qui est impliqu dans la vie et la multiplication intracellulaire. Le cycle prend peu prs 24 heures et aprs 3 jours en moyenne, la cellule eucaryote meurt en librant les corps lmentaires nouvellement forms.

Le corps lmentaire (0,200 0,300 m) comprend une membrane ri