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SOMMAIRE I-REMERCIEMENTS

II-DEFINITIONS-GENERALITES

III-OPERATIONS ET MODALITES TECHNIQUES

INDISPENSABLES AU LABORATOIRE DE

BACTERIOLOGIE

IV-HEMOCULTURE

V-EXAMEN CYTOBACTERIOLOGIQUE DES URINES

V-EXAMEN CYTOBACTERIOLOGIQUE DU

PRELEVEMENT VAGINAL

VII-LES PRELEVEMENTS DIVERS

VIII-DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE

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MES REMERCIEMENTS VONT D’ABORD AU PROFESSEUR GHAFFOR

CHEF DE SERVICE DU LABORATOIRE CENTRAL DE BIOLOGIE AU

CHU DE BENI MESSOUS, QUI M’A PERMIS DE POURSUIVRE AVEC

MOTIVATION MON STAGE DANS SON SERVICE.

MA RECONNAISSANCE EXCEPTIONNELLE AU DOCTEUR : AMMARI

POUR M’AVOIR ENCADRE DURANAT MON STAGE DE

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I-DEFINITIONS-GENERALITES

1- Définition de la bactériologie :

La bactériologie est cette partie de la microbiologie qui étudie les

bactéries, leurs structures, leurs fonctions, leurs Conditions de vie et leurs

propriétés utiles ou nuisibles. Elle est divisée en :

- Bactériologie médicale : Cet aspect de la bactériologie n’englobe qu’une

minime fraction de la bactériologie globale. Son étude porte essentiellement

sur les bactéries pathogènes pour l’humain, sur les facteurs influençant

l’initiation et l’évolution d’une maladie infectieuse, sur les mécanismes de

défense de l’organisme humain.

- Bactériologie industrielle : les notions de bactériologie sont alors mises à

profit dans l’industrie. Ainsi, certaines bactéries jouent un rôle dans la

formation des hydrocarbures dans le sol.

- Bactériologie alimentaire : cette bactériologie traitera des bactéries en regard

des produits alimentaires : modes de conservation, fabrication de la bière, des

vins et alcools, fromages etc…

- Bactériologie des sols : les notions de bactériologie sont fort utiles dans

l’étude de la transformation des sols, étude de la fertilisation, étude et

traitement des infections des plantes.

- Bactériologie générale : elle traite des propriétés générales des bactéries, qui

éventuellement fourniront des données scientifiques utilisables par les

bactériologistes plus spécialisés. C’est le domaine de la recherche

fondamentale.

2- Définition de la bactérie :

Un être généralement unicellulaire, appartenant au groupe des protistes

inférieurs, les bactéries jouent un rôle fondamental dans la nature et également

chez l’homme, la présence d’une flore bactérienne normale est indispensable,

mais de nombreux germes sont pathogènes et elles ont également un rôle très

important dans l’industrie.

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STRUCTURE BACTERIENNE

La bactérie est une cellule vivante constituée d’éléments obligatoires et

d’éléments facultatifs :

Les éléments obligatoires sont :

- l’appareil nucléaires ou chromosome

- le cytoplasme

- la membrane cytoplasmique

- la paroi

Les éléments facultatifs sont :

- la capsule

- les cils ou flagelles : organes locomoteurs

- les pilis

- les plasmides ou matériel génétique extra chromosomique

*PAROI BACTERIENNE :

La paroi bactérienne est une structure rigide retrouvée de manière quasi

constante. Seuls les Mycoplasmes ( espèce bactérienne naturellement dépourvue

de paroi) n’en possèdent pas.

STRUCTURE

La coloration de Gram ( coloration par le violet de gentiane, suivie

d’une décoloration à l’alcool puis d’une recoloration à la fuschine) permet de

distinguer deux types de bactéries :

- celles qui gardent la coloration par le violet de gentiane et qui

apparaissent bleues ou violettes au microscope, elles sont dites à Gram

positif.

- Celles qui perdent la coloration par le violet de gentiane et qui

apparaissent roses car elles n’ont gardé que le dernier colorant (fuschine).

L’étude en microscopie électronique de la paroi bactérienne permet de voir le

support de cette différence tinctoriale.

En effet de très nettes différences entre bactéries à Gram positif et à Gram

négatif s’observent :

- la paroi des bactéries à Gram positif est généralement épaisse mesurant de

200 à 500 A° (20 à 50 millimicron).

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- La paroi des bactéries à Gram négatif est plus mince mesurant 100 à 150

A (10 à 15 mu). Sa structure est stratifiée avec une membrane externe à

trois feuillets et une couche profonde dense.

La membrane externe peut être accolée à la couche profonde ou séparée de

celle-ci et ondulée.

Malgré ces différences d’aspect, un élément structural essentiel est retrouvé

chez toutes les bactéries (sauf les mycoplasmes car dépourvu de paroi) : le

peptidoglycane ou muréine.

Ce peptidoglycane comporte 3 éléments :

- Des chaînes polysaccharidiques faites de l’alternance régulière de sucre

aminés et acétylés, la N-acétyl-glucosamine (G) et l’acide N-acétyl-

muramique (M)

- Des chaînes tétrapeptidiques liées à l’acide N-acétyl-muramique.

Chez Staphylococcus aureus, la séquence est : L-ALA – Acide D-Alanine.

- Des liaisons ou ponts inter peptidiques unissant le dernier acide aminé

d’un pont constitué de 5 molécules de glycine. La liaison inter peptidique

est l’élément indispensable à la rigidité de la paroi.

- Caractères particuliers à la paroi des bactéries à Gram positif :

Le peptidoglycane représente 40 à 95% de la paroi avec une

épaisseur de 100 à 150 A° .

Des acides téichoiques retrouvés chez la plupart des Gram positif, constituant

20 à 60% de la paroi.

Chez certaines bactéries à Gram positif on retrouve des polysaccharides et

des protéines ( Streptocoque par exemple).

- Caractères particuliers à la paroi des bactéries à Gram Négatif : Le peptidoglycane se présente en couche mine d’environ 20 A°

d’épaisseur (20% environ de la paroi).

La membrane est de nature glucido-lipido-protéique. L’ensemble de ces trois

éléments constitutifs et particulièrement la fraction lipo-polysaccharides

représente l’endotoxine. La lyse bactérienne massive à l’intérieur de l’organisme

entraîne la libération de cette endotoxine qui sera responsable des phénomènes

toxiques observés pouvant aller jusqu’au choc.

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OPERATIONS ET MODALITES TECHNIQUES

INDISPENSABLES AU LABORATOIRE DE

BACTERIOLOGIE

Schéma général des étapes de l’analyse bactériologique

Prélèvement

Examen cytologique Examen bactériologique

Quantitatif

Qualitatif Isolement Enrichissement

Culture pure Reisolement

Conservation Identification Antibiogramme

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LES PRELEVEMENTS EN BACTERIOLOGIE :

I-Introduction :

Les conditions de prélèvement et d’acheminement du produit biologique

vers le laboratoire jouent un très grand rôle dans le diagnostic bactériologique ;

La réalisation du prélèvement avec le plus grand soin et le respect de certaines

règles élémentaires constituent un moyen sûr et unique sans lequel le résultat

final du diagnostic bactériologique n’a aucune valeur

II- Prélèvement en général :

II -1- Types de prélèvements :

Les types de prélèvements sont différents selon le type et le lieu

d’infection

suspectés .

1- Prélèvement mono microbien :

Produits biologiques normalement stériles :

Sang

Urines : le diagnostic d’une infection urinaire repose sur la

numération des germes et la cytologie

LCR : sa cytologie et sa biochimie peuvent orienter le diagnostic

Produits biologiques issus d’une cavité néoformée ou préformée : Exemple : Pus d’abcès fermé , liquide de séreuse

Dans les deux cas , le germe retrouvé est responsable de l’infection

2- Prélèvement poly microbien :

Produits biologiques possédant déjà une flore normale :

Selles

Prélèvement pharyngé ; gynécologique ; urétraux

Dans ces cas, seuls certains types de germes sont responsables de

l’infection.

Produits biologiques néoformés dus à l’a action associée de différents types de germes (infection mixte ) :

Pus d’abcès ouvert, dans ce cas, tous les germes doivent être

identifiés et le diagnostic bactériologique devra prendre en considération

certains facteurs :

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Etat du malade : femme enceinte, mariée, immunodéprimée,

malade hospitalisé..Etc.

Suspicion d’un germe particulier.

Présence de fièvre.

D’ou l’importance de la fiche de renseignements qui doit

obligatoirement

accompagner le prélèvement et doit indiquer :

- Nom et prénom du malade.

- Maladie.

- Traitement préalablement reçu.

- Signes cliniques (en particulier ).

II-2- Conditions de prélèvement :

- Stérilité.

- Asepsie rigoureuse par des antiseptiques (alcool iodé, alcool 90° )

- Récipient stérile.

- Instruments stériles.

- Le prélèvement doit être effectué avant toute antibiothérapie dans le

cas contraire ; faire une fenêtre thérapeutique de 48 h à 3 jours.

- Connaître l’évolution et la localisation du germe à des moments précis

de manière à augmenter les chances d’isolement du germe.

II-3- Conservation du prélèvement :

Tout produit biologique pour examen bactériologique doit être acheminé

rapidement vers le laboratoire dés sa réalisation.

Si l’acheminement est retardé, on doit prendre des précautions selon le

germe recherché et la nature du prélèvement :

- Il faut le placer dans un milieu de transport.

- Il faut garder à température adéquate :

- + 4°c pour les prélèvements poly microbiens

- +37°c pour les prélèvements mono microbiens sauf les urines à + 4°c.

- Il faut le mettre dans un récipient hermétiquement fermé et emballé

parfaitement

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Examen microscopique :

L’examen microscopique est la première étape de l’investigation micro

biologique bien conduite.

- Dans le cas de produits naturels ou pathologiques, les bactéries

présentent au sein même de leur milieu, une morphologie beaucoup plus

caractéristique qu’en culture ; de plus elles peuvent être accompagnées

d’éléments cellulaires ou minéraux dont la présence peut éclairer le

diagnostic ; et en cas de flore complexe seul l’examen microscopique

direct peut rendre compte de la prédominance d’une ou de plusieurs

espèces bactériennes.

- Dans le cas d’une souche bactérienne pure,seul l’examen

microscopique va permettre l’orientation de l’identification ,ce n’est

qu’en fonction de ces résultats que pourront être judicieusement choisies

les méthodes d’identification et mettre en œuvre le milieu de culture.

Mais d’abord on fait un «frottis » qui consiste a étaler un mince film

sur la lame en verre une parcelle du produit pathologique a examiner :

pus ,selle , urine,,,,

puis on procède à l’examen microscopique selon 2 techniques

- Examen a l’état frais.

- Examen après coloration :effectuée le plus souvent sur des frottis

séchés et fixés

1- l’examen a l’état frais :

but : l’examen a l’état frais permet l’observation des bactéries vivantes en

l’absence de toute fixation ou coloration ; cette méthode permet

d’observer :

* la morphologie des bactéries.

* le mode de groupement.

* la mobilité.

* il est également possible d’apprécier la quantité approximative de

bactéries par champs microscopique, ce renseignement peut être

important en particulier lorsqu’un isolement doit être effectué à partir du

produit examiné.

Le frottis n’est ni fixé, ni coloré, simplement recouvert d’une mince

lamelle, puis examiné au grossissement x10.

Les bactéries sont toujours vivantes, il est alors possible d’en étudier

la morphologie et la mobilité.

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L’examen a l’état frais permet d’émettre une hypothèse quant à la

ciliature (arrangement des flagelles autours de la bactérie ). Ainsi,

un déplacement sinusoïdal permet la suspicion d’une ciliature péritriche

(les flagelles sont présents tout autours de la bactérie ; c’est le cas de

nombreuses bactéries (des Enterobacteriaceae ) ; tandis qu’un

déplacement rectiligne permet la suspicion d’une ciliature polaire ( un

flagelle unique à l’une des extrémités de la bactérie : c’est le cas du vibrio

)

Une bactérie est dite mobile si elle se déplace avec un mouvement qui

lui est propre.

En conséquence, si on observe des «bancs » de bactéries qui se

déplacent dans la même direction, ce mouvement est dû à l’entraînement

des bactéries dans le flux de liquide.

On ne peut dire que la bactérie est mobile.

2- Frottis coloré :

Le frottis est d’abords fixé à la chaleur ou à l’alcool, puis coloré.

Plusieurs

colorations existent :

- Coloration simple Au bleu de méthylène après séchage, on fait une lecture à

l’immersion au x100 ;

Elle nous renseigne sur la nature des cellules : polynucléaires,

leucocytes, cellules épithéliales.

Coloration au Gram :

- Violet de Gientiane pendant 1 minute, il faut inonder la lame

- Chasser avec le lugol pendant 30 secondes

- Rincer à l’eau

- Ajouter l’alcool pendant 5 à 10 secondes

- Rincer à l’eau

- Ajouter la fushine pendant 30 secondes à 1 minute

- Rincer à l’eau

- Sécher à l’aide de papier buvard

Résultat de la coloration au gram

- Mettre 1 goutte d’huile de vaseline

- La lecture se fait au grossissement x 100

- Faire la mise au point

Cette coloration permet d’apprécier les caractères tinctoriales de la batterie

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Résultats :

Si il ya une coloration violette de la bactérie on répond : GRAM +

Si il y a une coloration rose de la bactérie on répond : GRAM –

Ex : Coccies gram + en ammas → Staphylocoques

Coccies gram + en chainettes au diplocoques → Streptocoques Bacilles gram - → Enterobacteries, Pseudomonas……

Isolement :

va nous permettre d’isoler un type de bactérie ( et inhibe la poussé d’autre

bactéries) en choisissant un milieu de culture approprié ( Gelos nutritive,

Hektoen…..)

Parmis ces techniques : Technique des cadrans

L’isolement se fait par plusieurs techniques.

Consiste à diviser la boite de pétri en 4 Cadrans de la façon suivantes :

Cadrant( I) : à l’aide d’une anse de platine chargée de la suspension bactérienne

Faire des stries très serrées et rapprochées

Cadrant (II) : Faire des stries toujours serrées sans toucher le cadrant (I)

Cadrant (III) : faire des stries moins serrées que le précédant

Cadrant (IV) : Faire des Stries encore moins serrées que le précédant (III)

Cette technique va nous permettre d’obtenir des Colonies isolées.

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La Galerie Biochimique :

- Le but de toute analyse bactériologique que ce soit d’un prélèvement

pathologique ou autre est l’identification du ou des germes qui s’y

trouvent

- La classification des bactéries et leur identification sont basées

essentiellement sur l’étude de leurs caractères biochimiques et

physiologique cette étape de diagnostic est donc la plus importante et il

convient de l’effecteur avec soin :

1) on ne doit entamer l’identification d’une bactérie que si l’on a une

souche à l’état pur, c'est-à-dire constituée par un seul clone bactérien.

Toute étude biochimique effectuée sur un mélange de germes n’a

aucune valeur.

2) Ne pouvant en pratique courante étudier tous les caractères d’une

bactérie il faut se limiter aux caractères principaux qui permettent une

identification rapide et sûre.

1- Etude des enzymes respiratoires :

recherche Oxydase

On place un disque d’oxydase imbibé d’eau physiologique sur un

couvercle d’une boite de pétri (ou sur une lame) on rajoute sur les disques

une petites quantité de bactéries ayant poussées sur Hektoen ( ou gélose

nutritive)

Si la couleur du disque vire au violet oxydase +

Si la couleur n’a pas changé oxydase-

Remarque : le disque utilisé est déjà imprégné de réactif

Catalase :

c’est une enzyme qui dégrade le H2O2

On dépose sur une lame une goutte de H2O2 + une petite quantité de

culture prélevée sur gélose nutritive

La bactérie possédant une catalase va entraîner un dégagement O2 sous

forme de bulles, donc :

Dégagement de bulles réaction +

Pas de dégagement de bulles Réaction –

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Remarque : Ne jamais rechercher la catalase sur gélose au sang car les globules

rouges ayant leur propre catalase risque de fausser les résultats.

Nitrate réductase

C’est une enzyme qui catalyse la réduction des nitrates en nitrites NO2

Sa recherche se fait sur du bouillon nitrate que l’on ensemence avec les bactéries

à étudier, on incube à 37°C pendant 18 à 24 h

Après incubation on rajoute 1 goutte de nitrate (I) (acide sulfanilique + acide

acétique ) + une goutte de nitrate (II) ( alpha naphtylamine + acide acétique)

Après addition du nitrate (I), (II) on obtient :

coloration rouge Réaction +

Si il n’y a pas de changement on rajoute de la poudre de Zinc (réducteur) :

Si coloration rouge Réaction –

Si pas de coloration Réaction +

2 – Etude des diverses sources de carbone

le milieu utilisé Citrate de simmons ( qui contient une source d’azote =

phosphate d’ammonium + source de carbone = citrate de sodium + indicateur

coloré = bleu de bromothymol)

Ce milieu est vert.

On ensemence ce milieu à partir d’une culture prélevé sur gélose, on ensemence

une partie de la pente l’ autre partie servira de témoin. Incubation à 37°C

pendant 18 à 24h

Si virage du vert au bleu Réaction +

Qui signifie que la bactérie utilisé le citrate comme source de carbone

3 – Etude du métabolisme des glucides

- Etude de la voie d’attaque des glucides

Le milieu utilisé : MEVAG – HUGS et leifson qui contient le sucre à étudier +

rouge phénol

Le milieu se présente en culot rouge

Il faut ensemencer deux tubes par piqûre centrale à partir d’un bouillon

Un des deux milieux est recouvert de vaseline stérile fondue pour mettre en

évidence le rôle du O2

Incubation à 37°C pendant 18 à 24h

Lecture : si seule la partie supérieure du tube sans huile est acidifié (virage au

jaune) il s’agit d’une germe oxydatif

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- S’il ya acidification des deux tubes , c'est-à-dire qu’il y a eu virage du rouge au

jaune dans 2 tubes il s’agit d’un germe fermentaire

- S’il ya aucun virage dans les 2 tubes souche inactive, elle n’utilise pas

le sucre employé

Détermination de la voie fermentaire :

Les voies que l’on recherche :

- Voie des acides mixtes mise en évidence par les test RM ( Rouge

Méthyle)

- Voie du butylène glycol mise en évidence par la réaction de Voges

Proskauer VP

Le milieu utilisé est le milieu Clark et Lubs qui est ensemencé et incubé à

37°C pendant 24h

Après incubation, on reparti le milieu en deux tubes dans le 1er tube ajoute

quelque goutte de RM

- Coloration rouge RM +

- Coloration jaune RM –

Dans le 2ème

tube on ajoute une goutte de VP (I) et VP (II) on laisse pendant

10 minutes agir à température ambiante.

- Coloration rouge VP +

- Pas de coloration VP –

4- Milieu de diagnostic rapide

TSI = Tri Sugar iron

Le milieu est rouge

Il contient 3 sucre : lactose , saccharose, glucose

Contient aussi sulfate ferreux, thiosulfate de sodium

La pente renferme la lactose + saccharose

Le culot renferme le glucose

On ensemence la pente par stries serrées, et le culot par piqûre centrale. Il ne

faut pas visser les tubes à fond.

- Incubation à 37°C pendant 18 à 24 H

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5 Caractères sont recherchés :

- Fermentation du glucose

- Fermentation du lactose- saccharose

- Production de H2S (tâche noir)

- Production de gaz

Lecture au niveau du culot :

- Fermentation du glucose si il y a virage du rouge vers jaune

- Production de gaz s’il y a de collement de gélose

- Production de H2S, s’il y a noircissement du milieu

Lecture au niveau de la pente

Lactose saccharose (-)…….pente rouge

Lactose saccharose (+)……pente jaune

Mannitol-mobilité

Ce milieu contient du mannitol,nitrates et rouge phénol

Ce milieu se présente en culot rouge qu’il faut regenerer en chauffant la gélose

pour chasser l’O2 ceci pour obtenir des résultats de mobilité fiables.

-Il faut laisser refroidi la gélose puis ensemencer par piqûre centrale avec la

souche bactérienne

-Incubation à 37°C pendant 24h

Lecture :

Pour le mannitol

Milieu jaune…….réaction+ donc fermentation de mannitol

Milieu rouge…….réaction- donc pas de fermentation de mannitol

Pour la mobilité

S’il y a culture le long de la piqûre centrale seulement donc mobilité –

S’il y a trouble de toute la masse donc mobilité +

5-Etude de la dégradation des acides aminés

Recharche de l’urease , tryptophane désaminase , tryptophanase

Le milieu utilisé c’est le milieu Ferguson qui est de couleur jaune orangé.

Ce milieu permet la recherche de l’urée , TDA , Indole

-On ensemence le milieu à l’aide d’une culture de TSI

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-Incubation à 37°C pendant 24h.

*Si il y a virage du milieu au rouge violacé ……. Urée +

*Si il n’y a aucun virage ……….urée –

A partir du même milieu on rajoute le réactif COVACS

* Si il y’a formation d’un anneau rouge à la surface …….indole +

ceci signifie que la bactérie possède une tryptophanase capable de dégrader le

tryptophane pour donner l’indole.

La recherche de l’indole peut se faire sur eau peptonée exempt d’indole

Pour la recherche de la TDA :on travaille sur le milieu utilisé pour la recherche

de l’urée mais dans ce cas on rajoute quelques gouttes de perchlorures de fer

*Si coloration rouge brun……. TDA+

*Si coloration jaune ………….TDA-

Recherche de ADH (argenine déhydrogénase),ODC(ornitinedecarboxylase)

,LDC ( lysine decarboxylase )

les milieux utilisés sont des milieux de Moeller Palkow

On utilise 4 tubes contenant chacun un acide aminé + glucose + pourpre de

Bromocrésol

Ces milieux sont de couleur violet

1er

tube :c’est le témoin qui contient du glucose uniquement

2éme tube : contient glucose + ornitine

3 éme tube : glucose + arginine

4 éme tube : glucose + lysine

On ensemence les 4 tubes avec de la culture bactérienne et on rajoute de la

vaseline stérile fondue.

-Incubation à 37°C pendant 24h

-Après incubation ,le témoin vire au jaune cela valide la réaction cela signifie

que la bactérie a dégradé le sucre .

-Si un des tubes est coloré en jaune comme le témoin on considère que c’est ( -)

-Si l’un des tubes est coloré en violet on considère qu’il dégrade l’acide aminé

contenu dans le tube.

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Principe de la coagulase :

Préparer une suspension de staphylocoque dans un bouillon BHIB mettre 6

gouttes de ce bouillon +6 gouttes de plasma de lapin pendant 24h

à37°C………si obtention d’un liquide visqueux donc…… coagulase (+)

37C° ceci se fait pour déceler la présence de staphylococcus aureus

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Choix de la galerie biochimique

Le choix de la galerie se fera selon le résultat du gram

Cocci gram(+) : Le premier test à faire Catalase

*Si Catalase (+), c’est en faveur d’un Staphylocoque donc on va choisir la

galerie suivante :

-MEVAG

-Coagulase

-Nitrate réductase

-Mannitol mobilité

*Si Catalase (-), c’est en faveur d’un Streptocoque on va mettre notre souche

bactérienne dans un bouillon Todd-Hewitt (milieu d’enrichissement) et on va

faire après 24h d’incubation à 37C° une agglutination.

Bacille gram (-)

On doit d’abord effectuer le test de l’oxydase

si oxydase(+) on suspecte Vibrio Cholerae, brucella mais le plus souvent

Pseudomonas aeriginosa .

Dans le cas de suspicion de pseudomonas aeruginosa la galerie choisie est :

-Citrate de simmons

-TSI

-King A

-King B

Si Oxydase(-) , on suspecte les entérobactéries donc la galerie choisie:

-TSI

-Citrate de simmons

-Indole

-Urée

-TDA

-Nitrate réductase

-Mannitol- mobilité

-Acides aminés (ODC, LDC, ADH).

Bactérie RM (+)

Selon urée :

Si urée (+) on suspecte Proteus donc pour différencier les Proteus entre eux on a

recourt à l’indole.

Si indole (+) Proteus Vulgaris

Si indole (-) Proteus mirabilis

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Il faut savoir que tous les Proteus sont résistants à la Colistine, avec H2S (+),

lactose-Saccharose (-).

Si urée (-) un grand nombre de bactéries est suspectés donc on a recourt au

Selon le TSI

Si lactose-Saccharose (-) avec H2S (-) on suspecte une Shigelle

Si lactose-Saccharose (-) avec H2S (+) et TDA (-) on suspecte une Salmonelle

Si lactose-Saccharose (-) avec H2S (+) et TDA (+) il s’agit de Providencia.

Si lactose-Saccharose (+) glucose (+), H2S (-) gaz (+) on suspecte Escherichia

coli avec citrate simmons (-) indole (+).

Bactérie VP (+)

On suspecte : Klebsiella, entérobacter, sératia .

*Si mobilité (-) on suspecte une Klebsiella pour différencier entre les espaces de

Klebsiella les plus couramment retrouvées on a recourt à l’indole.

-Si indole (-) il s’agit de Klebsiella pneumoniae qui sera confirmée par

l’antibiogramme car il présente une résistance naturelle à la ticarcilline et

ampicilline.

-Si indole (+) il s’agit deKlebsiella Oxytoca.

*Si mobilité (+)

-) avec résistance à la colistine il s’agit du genre Seratia .

-) avec sensibilité à la colistine il s’agit du genre Entérobacter.

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Test de Sensibilité au Antibiotique par la Méthode de Diffusion en Milieu Gélosé ou Antibiogramme :

Définition :

un antibiogramme est un test de détermination de la sensibilité d’une bactérie

aux antibiotiques, effectué en milieu solide .

Il s ‘agit d’un examen quotidien du laboratoire de bactériologie. Ce test est

pratiqué sur toute souche isolée d’un prélèvement pathologique. Il a un intérêt

double : thérapeutique ( il permet de confirmer et ou adapter une

antibiothérapie) et épidémiologique (surveillance de la résistance bactérienne

aux antibiotiques).

Technique : (technique Kibry- Bauer recommandée par l’OMS)

-Préparer une suspension bactérienne de la souche à étudier, de densité égale à

0,5 Mc Farland (DO : 0,08 – 0,10 à 625 nm).

-Cet inoculum est ensemencé à l’aide d’un écouvillon sur la surface d’un milieu

gélosé Mueller Hinton (ce milieu sera enrichi selon l’exigence de la bactérie ;

par exemple : rajouter du sang de mouton si la bactérie étudiée est S.

pneumoniae).

-Appliquer les disques d’antibiotiques sur la surface de la gélose :

Le choix des antibiotiques à tester est en fonction de l’espèce bactérienne

étudiée ; il est basé sur les molécules habituellement actives sur le germe en

question.

-Ces disques se présentent en cartouche ; ils ont des charges bien définis, et

doivent être correctement conservés (conformément aux recommandation du

fabricant).

-On peut tester jusqu’à 6 antibiotiques différents sur une même boite.

Incuber les boites à 35°C en atmosphère appropriée (adaptée à la culture du

germe étudié).

-La lecture des boites se fait en mesurant les diamètres des zones d’inhibition et

en les comparant aux diamètres critiques. Ceci se fait manuellement à l’aide

d’un pied à coulisse ou d’une règle graduée. Il existe des systèmes de caméra

permettant la lecture automatisée des diamètres.

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Exemple de résultat d’antibiogramme :

Souche étudié : P. aeruginosa

Antibiotique Charge

du disque

Lecture

Diamètre

(mm)

Valeurs

Critiques

(mm)

Interprétation

Ticarcilline 75µ g 6 14-15 R

Amikacine 30µ g 15 15-16 I

Gentamicine 10µ g 21 13-14 S

Contrôle de qualité: Le contrôle de qualité permet d’assurer la fiabilité des

réactifs, la reproductibilité du test et de valider la technique utilisée.

Il est réalisé en utilisant des souches témoins dites : souches de référence, qui

sont testées dans les mêmes conditions que la souche test. La pratique du

contrôle de qualité doit être régulière (une fois par semaines au moins).

Une souche de référence est une souche dont le profil de sensibilité est connu

(les diamètre d’inhibition sont connus d’avance). Il existe plusieurs collections

dans le monde.

Exemple : souche ATCC = American Type Culture Cells (S. aureus ATCC

25923) ; ou encore les souches CIP (Collection Institut Pasteur).

Un contrôle de qualité non conforme ne valide pas le test d’antibiogramme et le

rend in interprétable .

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HEMOCULTURE

Introduction :

Le sang est un liquide biologique normalement Stérile donc toute décharge de

bactéries dans le sang va entraîner soit :

Une bactéremie : qui est un passage transitoire de bactérie dans le sang.

Septicemie : qui est un état pathologique dû à la multiplication de micro-organismes

dans le sang .

Cet état pathologique est toujours lié à des signes clinique qui sont le plus souvent .

-Fièvre importante

-Frisson

-Hypothermie

-Choc Septique

- Ou encore signes rénaux, signes cardio-pulmonaire………

Il faut savoir que la quantité de bactérie qui passe dans le sang est faible d’ou la

nécessité de faire une Hémoculture pour l’enrichir.

I-Definition de l’hémoculture

l’hémoculture est la culture du sang qui permet de mettre en évidence un micro-

organisme qui a provoqué un septicémique qui a motiver le prélèvement .Donc

l’hémoculture permet le diagnostique d’une Septicémie.

L’hémoculture est indiquée dans :

- Fièvre inexpliquées associées à un terrain favorisant

- Infection localisée sévère

- Etat de choc inexpliqué.

2)-Germe recherchés dans une hémoculture

les germes responsables des septicémie sont classée de façon suivante :

Bactérie pathogène spécifique

Salmonella typhi

Brucella

Streptococcus pneumoniae

Lystéria monocytigène

23

Bactérie potentiellement pathogènes

Escherichia coli

Proteus

Staphyloccus aureus

Klebsiella, entérobactérie , seratia,

Streptocoques …….

Bactérie Opportunistes

Acïnetobacter

Staphylococcus épidermidis

Pseudomonas aeriginosa

Bactérie contaminants le prélèvement

Corynebacter

Prélèvement :

Les prélèvements de sang sont mis dans les flacons en générale sous pression

réduite avec un opercule en caoutchouc.

Il faut toujours que la quantité de sang soit d’un volume de 60ml ou 100ml.

En général les flacons contiennent le sang du malade + citrate (bouillons

d’enrichissement) .

Dans le cas d’un adulte

On prélève 10ml de sang / flacon de 100ml par ponction veineuse .

Dans le cas d’un nouveau né

On prélève 1 ml de sang /flacon de 60 ml (micro culture) soit le sang du cardon

ou par ponction fontanelle ou par ponction jugulaire.

Conditions de prélèvement

Le prélèvement doit s ‘effectuer dans des conditions d’asepsie rigoureuse, en

effet la zone de prélèvement et les doigts du prélèveur sont désinfectés par 2

applications par l’alcool iodé ou alcool à 70°.

-Le prélèvement de sang doit être fait avant toute antibiothérapie .

-Faire le prélèvement au moment des pics thermique ou frissons.

-Répéter le prélèvement : 6 à 8 flacons d’hémoculture en 48 h .

-Le prélèvement d’hémoculture se fait au niveau d’une veine donnée à un

moment donnée.

-Tous prélèvement doit être muni d’une fiche de renseignement correctement

rempli.

-L’acheminement du prélèvement doit être rapide.

- Ne jamais conserver une hémoculture à +4C°.

24

Etape de l’hémoculture au laboratoire a) Signe de positivité :

Dés la réception des flacons au laboratoire ils seront incubés à 37C° à l’etuve et

seront observés chaque jour à la recherche des signes de positivité qui sont :

- Production de Gaz

- Hémolyse du sang

- Trouble

La durée de positivité est de 2 à 3 jours dans la majorité des cas.

La durée maximale d’hémoculture et de 15 jours sauf s’il y a suspicion de

brucellose ou il faut conserver les flacons pendant environ 6 semaines

(maximum) .

b) Examen microscopique :

- Consiste à faire un état frais à la recherche de bactéries et leur mobilité .

- Coloration de gram permet de recherche des bactéries et leur affinité

tinctoriale.

Remarque : La coloration de gram s’effectue après obtention de colonies après

mise en culture.

C) Mise en culture :

La culture s’effectue sur gélose au sang cuit et gélose au sang frais.

Mettre 1 goutte de sang prélevé du flacon à l’aide d’une seringue au bord de la

gélose et faire un isolement (par des stries serrés) .

-Incubation à 37C° pendant 24h sous CO2.

Le lendemain faire la lecture de la boite ; si il y a présence de colonie faire un

gram , galerie biochimiques et antibiogramme.

d) Identification biochimique

le choix de la galerie biochimique se fait en fonction du résultats des cultures,

gram et test d’orientation : catalase oxydase.

e) Test de sensibilité au antibiotiques :

Interprétation de l’hémoculture

- Si la bactérie isolée est une bactérie à pouvoir pathogène spécifique donc

l’interprétation est facile.

En effet il suffit de la détection de ces bactéries dans un seul flacon pour

considérer que s ‘est (+) .

-Si la bactérie isolée est pathogène opportuniste donc l’interprétation se fera

selon le contexte, il faut s’assurer qu’il ne s’agit pas de souillure donc une

discutions avec le clinicien est indispensable.

En effet pour reprendre (+) il faut que cette bactérie soit retrouver dans tous les

flacons, si on la retrouve dans un seul flacon on n’en tient pas compte.

25

Examen cyto- bactériologique des urines (ECBU) :

1-les infections urinaires :

L’arbre urinaire est contaminé soit par voie ascendante ou par voie

hematogene.

L’infection urinaire évolue vers une guérison rapide ou vers une

extension avec une atteinte du parenchyme rénal, d’où risque de septicémie,

et de néphrite.

Origine :

Les principales espèces responsables des infections urinaires sont :

- Bactéries commensales que l’on peut trouver dans l’urine normale,

Entérobactéries ( E. coli , Klebsiella , Proteus )

Pseudomonas aeroginosa

Streptocoque D, Staphylocoque

- Bactéries que l’on ne retrouve pas dans l’urine normale :

Mycobacteries,

Leptospire …

Le diagnostic d’une infection urinaire se fait par un examen

cytobacteriologique des urines ( ECBU)

A- Le prélèvement :

A pour but de recueillir un échantillon d’urine aussi identique que

possible que l’urine vésicale. Tout risque de contamination par des

cellules ou bactéries d’origine vaginale doit être évité

Les conditions de prélèvement jouent un rôle essentiel dans la valeur

des résultats fournis par l’examen cytobactériologique

Les conditions varient avec l’âge et le sexe. → Chez l’homme et le petit garçon :

Recueillir les urines matinales après lavage soigneux avec du dakin .

Eliminer la première partie de la miction et recueillir le milieu du jet dans

un flacon stérile muni d’un bouchon à vis.

26

→ Chez la femme et la fillette :

Ici la difficulté est plus grande du fait des risques de contamination

d’origine vaginale

Après nettoyage soigneux, il est possible de prélever l’urine au cours

de la miction après élimination du 1er jet.

→ Chez le nourrisson :

Il est nécessaire d’utiliser des collecteurs après désinfection correcte

de la région intéressée et qu’ils doivent être changés au bout de 15 à 20

mn. S’il n’y a pas d’émission d’urine. Il faut faire très attention à la

contamination fécale. → Chez le porteur de sonde :

Réaliser une ponction à partir de la tubulure après désinfection a

l’alcool iodé. → Ponction sus pubienne :

Représente la méthode la plus aseptique, utilisée lorsque le recueil de

l’urine du milieu du jet est impossible.

B- Acheminement au laboratoire :

Le transport de l’urine doit être rapide et à température ambiante ou à

(+ 4 °c ) si le transport a dépassé 30mn.

Chaque prélèvement doit être muni de sa fiche de renseignements

comportant : l’âge, le sexe, motif de la demande du prélèvement,

antécédents d’infections urinaires et le diagnostic et le traitement

éventuellement déjà institué.

C- Conservation de l’urine :

Lorsque les conditions idéales ne se présentent pas, les urines sont

stockées à +4°c quelques heures seulement, car à +4°c, il peut se produire

une précipitation gênante pour la suite des examens et surtout une altération

importante des cellules.

27

D- Conduite a tenir au laboratoire :

Tout d’abord, on observe l’aspect macroscopique des urines qui peut

être limpide, trouble, clair, jaune, sanglant, comme il peut contenir des

filaments. D-1- Faire un examen à l’état frais :

Dans lequel on recherche la présence de germes, de levures

d’hématies, de leucocytes de cristaux ou de parasites tels que Trichomonas

vaginalis .

L’état frais est effectué sur une cellule de Nageotte à partir du tube

d’urine non dilué ; on prend 2 gouttes avec une pipette pasteur stérile ;

on dépose 2 gouttes sur la Nageotte et on observe à l’objectif x40 les

éléments cités.

A-

D-2-

Ensuite ,on fait une dilution dans de l’eau physiologique ; puis on

dépose 2 gouttes de cette dilution sur une gélose nutritive et on incube 24

h à 37°c.

D-3-

Dés l’apparition des colonies sur les boites d’isolement , faire des

examens microscopiques , oxydase,catalase .Suivant ces derniers , faire

- une identification biochimique , antigenique

- un antibiogramme . ** l’Antibiogramme:

Toute infection urinaire confirmée par les tests précédents sera

accompagnée d’un antibiogramme pour vérifier la sensibilité du germe

incriminé aux différents antibiotiques auxquels il est normalement sensible

et ceci dans le but de rendre le résultat au médecin qui pourra alors

prescrire un traitement efficace.

On remarque en réalisant différents antibiogrammes que les infections

de la ville sont très facilement traitées car les germes sont sensibles aux

antibiotiques, tandis que l’infection hospitalière est très difficile à soigner

du fait de la résistance de ces germes à un ou à plusieurs antibiotiques.

28

L’antibiogramme se fait sur la souche isolée et correctement identifiée

sur gelose Mueller-Hinton si la bactérie n’est pas exigeante, et Mueller-

Hinton au sang pour les autres cas.

Les diamètres d’inhibition sont mesurés et comparés aux valeurs

critiques correspondants au germe en question et de là on pourra affirmer

selon le résultat obtenu si le germe est sensible ou résistant et à quel (s)

antibiotique (s).

Ces résultats seront directement communiqués au clinicien.

NB : En general les germes retrouvés sont soit des Enterobacteries ou des

streptocoques ; dont les galeries biochimiques sont respectivement :

* Entérobactéries : TSI , citrate de simmons , Eau peptonée

exempte d’indole , bouillon Clark lubs , urée , .

* Streptocoque : Mannitol , 2 , bouillon nitraté , coagulase

!

29

ECB du Prélèvement vaginal :

l’anatomie de l’appareil génital de la femme permet de differencier deux

compartiments :

-L’appareil génital bas : vulve, vagin, exocol et normalement

contaminé, il est en rapport étroit avec la peau et l’anus, il n’est pas muni

de moyens efficacesde fermeture. Il est tapissé d’un épithélium

malpighien pavimenteux, contaminé en permanence par de nombreuses

espèces bactériennes.

La flore vaginale peut être classée en 4 types :

o Type I: présence exclusive de bacilles de Doderlein

o Type II : prédominance nette de bacilles de Doderlein

o Type III : présence de bacilles de Doderlein, mais prédominance

d’autres bactéries

o Type IV : absence de bacilles de Doderlein et présence d’une flore

mono ou polybactérienne

La flore de Doderlein : bacilles et coccobacilles Gram+

appartenant à de nombreuses espèces de lactobacilles : L acidophilus, L

casei, ... Elle est immédiatement identifiée après coloration de Gram. Par

culture, principalement sur gélose au sang en anaerobiose, elle se

reconnaît en donnant de nombreuses colonies punctiformes souvent

hémolytiques.

-L’appareil génital haut : endocol, cavité utérine, trompes, ovaires sont

bactériologiquement stérile.

Les deux parties, basse et haute, sont séparées par l’endocol qui est

une cavité fusiforme réelle sécrétant en permanence, grâce à des glandes

muqueuses, la glaire cervicale.

La flore vaginale normale est constituée de bactéries aéroanérobies

autant que de bactéries anaérobies, parmi elles :

Lactobacillus (bacilles de Doderlein)

Corynebactérium

Streptocoque alpha hémolytique, B et D

Entérobactéries

Mycoplasme

Candida

Staphylocoque coagulase négative ou positive

30

a- Le prélèvement :

1- La fiche de renseignement : doit contenir en plus des prélèvements

précédents :

la présence ou non de fièvre, brûlures mictionnelles, changement

d’aspect ou d’écoulement des leucorrhées chez la femme, d’un prurit et

des signes cliniques éventuels chez le partenaire

- Date des dernières règles

- Notion de grossesse en cours

- Le moyen de contraception

- Le traitement local préalable

1- Prélèvement :

Il doit être effectué sur une table gynécologique à l’aide de

spéculum en dehors de la période des règles, sans toilette intime

vaginale préalable, ni prise d’ovule depuis 48 heures, en absence de

rapport sexuel et de traitement local.

Le prélèvement doit être orienté : - cul de sac vaginal (recherche des germes) - col utérin (recherche du Gonocoque) - Vagin (recherche de levures et Trichomonas)

b- Technique de diagnostic :

1-Examens microscopiques :

→ Etat frais : l’écouvillon contenant le prélèvement vaginal est

essoré sur une lame bien dégraissée. Déposer une lamelle et observer au

microscope (G x 40). Cet examen est d’une importance capitale et doit

être fait le plus rapidement possible afin de permettre la mise en évidence

du Trichomonas vaginalis (germe parasite très mobile et très fragile qui

ne résiste pas longtemps aux conditions de vie extérieure).

Cet examen permet aussi selon le lieu de prélèvement la mise en

évidence des levures (Candida albicans). Ces deux germes suscités sont

considérés comme responsables de vaginites et d’urétrites spécifiques :

infections génitales majeures. Cet examen permet de voir et d’apprécier la

richesse du prélèvement en micro-organismes.

31

→Après coloration : - Au bleu de méthylène : permet d’apprécier les germes

intracellulaires et surtout le Neisseria gonorrhée pour le prélèvement du

col.

- Le Gram : donne l’aspect morphotinctorial des germes retrouvés.

2- Mise en culture : à 37°c pendant 24 à 48 heures

* En cas de présence de levures, on ensemence un sabouraud plus

chloramphinicol.

* De plus il faut ensemencer :

- une GSC + V C N+ polyvitex à incuber sous CO2

- une GSF

- une GSC

- un milieu Hectoen

- un chapman

3-Identification :

En cas de présence de Trichomonas vaginalis on ne fait qu’observer

s’il y a déséquilibre de la flore normale.

- Sabouraud + Chloramphinicol : après incubation de 24 à 72h si

culture positive, on fait un test de filamentation dans le sérum pour

observer les chlamydospores et protochlamydospores spécifiques du

Candida albicans.

- GSC + VCN + polyvitex sous 10 de CO2 : il permet la culture du

gonocoque; s’il y a culture; on fait un gram; le germe paraîtra en

diplocoque en grain de café; le gram est alors négatif. On fait aussi une

oxydase (positif).ce germe est egalement considéré comme responsable

d’infections génitales spécifiques.

- GSC+chapman +GS : ces 3 milieux permettent lors de l’absence

des trois germes suivants Parasite : Trichomonas vaginalis - Levures :

Candida albicans - Bacterie : Neisseria gonorrhea - de mettre en

évidence un déséquilibre de la flore génitale. Seront alors considérés

comme responsables de l’infection génitale, les germes dont les colonies

sur les trois milieux seront préponderantes.

On fait alors pour les colonies suspectes un état frais et un gram. On

lancera ensuite une galerie biochimique qui sera en fonction du gram.

32

4-Antibiogramme :

Pour chaque germe identifié (bactérie) comme étant responsable de

l’infection génitale, on fera un antibiogramme sur Mueller-Hinton. En cas

de gonocoque, il se fera sur Mueller-Hinton au sang cuit.

33

Les prelevements divers

Au niveau de ce poste, pour tout les différents

prélèvements(pus,aspiration bronchique, crachats, prélèvements

d’oreilles,,,,,,,) ;on ensemence 5 milieux qui sont :

- Gelose nutritive.

- Gelose au sang frais.

- Gelose au sang cuit.

- Milieu hektoen.

- Milieu chapman.

Puis on incube 24h à 37° c et on observe le lendemain la culture (forme

et couleur des colonies) sur les différents milieux en faisant en parallèle un

gram et une oxydase pour s’orienter vers telle ou telle bactérie pour ensuite

choisir les colonies suspectes pour préparer une suspension afin de faire une

galerie biochimique et un antibiogramme ;pour enfin le 3 éme jour faire la

lecture de la galerie et l’antibiogramme pour en conclure le germe incriminé .

I/ Analyse bactériologique du liquide d’ascite :

A/ Généralités :

Ce liquide est retrouvé entre les deux feuillets du péritoine. A l’état

normal, il s’appelle liquide péritonéal et son volume est toujours inférieur à

100 ml. Toutefois ce volume peut atteindre des litres lorsqu’il s’agit de

liquide d’ascite (dans les conditions pathologiques). L’infection péritonéale

possède une origine hématogène.

B/ Prélèvement :

Le liquide d’ascite est prélevé à l’aide d’une seringue stérile par un

personnel qualifié, et est acheminé directement au laboratoire accompagné

d’une fiche de renseignements mentionnant les signes cliniques.

C/ L’étude cytobacteriologique :

2- Etude macroscopique :

Ce liquide est d’ordinaire clair mais les états pathologiques entraînent

une modification de son aspect. Ainsi il peut être :

Purulent.

34

Hémorragique.

Ictérique.

Lactescent (tuberculose péritonéale).

2- Etude microscopique :

A l’état frais : cet examen se réalise sur cellule de Mallassez afin de

quantifier les éléments cellulaires, d’apprécier la présence de bactéries et

noter leur forme et leur mobilité.

Après coloration : on réalise un MGG pour déterminer l’équilibre

leucocytaire dont le résultat oriente vers une origine virale (plus de

lymphocytes) ou bactérienne (plus de PN).

Un Gram peut également être réalisé s’il y a présence de germes lors

de l’examen direct, pour noter l’aspect morphotinctorial des germes s’il

s’agit d’une infection bactérienne.

Si on suspecte une tuberculose péritonéale on réalise une coloration de

ZIEHL. 3- Culture :

Selon le résultat de l’examen microscopique on ensemence les

milieux de culture adéquats :

- GSF.

- GSC.

- HEKTOEN.

- GELOSE DE LOWENSTEIN JENSEN.

Les milieux seront incubés à 37°c . A l’apparition des colonies on

identifie le germe par une galerie biochimique et l’étude de ses différents

caractères. Une fois le germe identifié on réalise un antibiogramme.

II/ ECB du liquide de poche

L’ECB de ces prélèvements se fait de la même façon que pour le

liquide d’ascite, les milieux utilisés sont : la GSC (surtout), GSF. Pour le

liquide de poche, et pour les liquides purulants, on ensemence un

sabouraud. Pour tous les prélèvements on doit ensemencer un milieu

d’enrichissement.

35

/ ECB des pus d’abcès :

a) Formation de l’abcès :

L’infection d’un tissu mou donne naissance à une inflammation aiguë

avec hyperthermie, œdème infiltration leucocytaire mais sans nécrose ni

suppuration. Dans un second temps les bactéries provoquent la nécrose,

l’accumulation des leucocytes et débris cellulaires, la suppuration et collection

du pus et formation d’abcès.Il y aura ensuite propagation vers les zones de

moindre résistance. L’abcès peut être superficiel ou profond.

b) Prélèvement :

Si l’abcès est superficiel, le pus est prélevé à l’aide d’un écouvillon

stérile, ce prélèvement sera toujours contaminé par la flore cutanée.

Si l’abcès est profond le pus sera prélevé à l’aide d’une seringue stérile.

c) Culture :

Le prélèvement sera ensemencé dans des milieux adéquats :

- Gélose au sang cuit

- Gélose HEKTOEN

- Un sabouraud+ chloramphénicol: pour la recherche des levures

Ces milieux sont incubés une nuit à 37°c

Le lendemain on effectue :

- Un gram

- Une galerie biochimique

Une fois le germe identifié un antibiogramme sera réalisé. Cette

méthode sera la même s’il s’agit d’un pus provenant de l’infection d’une

plaie.

EXAMEN CYTOBACTERIOLOGIQUE DU LIQUIDE CEPHALO-RACHIDIEN ( LCR):

Le rôle du laboratoire est primordial, car l’examen du LCR permet

d’établir le diagnostic de méningite bactérienne (cytologie, formule ) et de

s’orienter vers un diagnostic étiologique (examen direct, recherche

d’antigènes solubles ) et par conséquent de choisir un traitement le mieux

adapté sans attendre les résultats de la culture et de l’antibiogramme.

36

Différents syndromes biologiques observés après étude des paramètres

biochimiques, cytologiques et bactériologiques du LCR :

LCR normal Méningite

purulente

Méningite

tuberculeuse

Méningite

virale

Aspect Eau de roche Trouble Clair Clair

Cellules/

mm3 2 > 1000 100-500 100

Type de

cellules Mononuclées Polynucléaires Lymphocytes Lymphocytes

Présence de

bactéries

Examen

direct

Néant Présente Présente :coloratio

n de Ziehl Néant

Présence de

bactéries

culture

Néant Présente Positive sur milieu

de Jensen Néant

b- Prélèvement :

Le prélèvement du LCR est un acte médicale qui doit se faire par un

personnel qualifier au lit du malade il se fait par ponction entre les apophyses

épineuses L4-L5 ou L3-L4 au niveau de la colonne vertébrale aseptiquement

, le LCR est recueilli dans des tubes stériles étiquetés au nom du malade .

c- Conduite à tenir au laboratoire :

→ Examen macroscopique :

- LCR clair : soit normal, soit une méningite.

- LCR trouble : « eau de riz » infiltration leucocytaire.

- LCR hémorragique : accident vasculaire ou hémorragie cerebrale.

- LCR jaune : icterique .

→ Examen microscopique :

37

A l’état frais : C’est une numération cellulaire sur cellule de Nageotte

qui permet d’apprécier les hématies, bactéries leucocytes et les

parasites.

On compte les éléments d’une bande puis on effectue la moyenne qu’on

multiplie par le facteur de correction ou on compte les éléments qui se

trouvent dans un champ puis multiplie par 20. ( VN : 2 éléments / mm3)

- Le gram montre l’aspect tinctorial des germes.

- Mise en culture sur gelose au sang cuit et sur gelose au sang frais,

incuber à 37°c en anaerobiose pendant 24 à 48 heures.

- A partir des cultures :

- Identification des germes,

- Lecture de l’antibiogramme,

- Identification antigenique et test d’orientation.

Liste des bacteries susceptibles d’être à l’origine de méningites :

Neisseria meningitidis Bacillus anthracis

Streptocoque pneumoniar

Haemophilus influenzae

Mycobacterium tuberculosis

Listeria

38

DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE

On procède d’abord à

Examen microscopique :

Donne une preuve rapide de l’infection une fois le prélèvement arrivé au

laboratoire il est muni d’une étiquette mentionnant : le nom et prénom du

malade et accompagné d’une ordonnance mentionnant également le nom et le

prénom, nature du prélèvement.

Le technicien doit toujours s’assurer que le nom mentionné sur le prélèvement

est le même mentionné sur l’ordonnance. Ensuite il numérote le prélèvement et

l’ordonnance ainsi que la lame cette dernière et numéroté avec un graveur donc

prélèvement, ordonnance, lame doivent avoir le Même numéro.

Sous la hotte, prés du bec benzène le technicien va confectionner son

frottis, en choisissant la partie muco-purulente ou hémorragique de l’aspiration

bronchique qu’il dépose sur la lame numérotée (au centre) ensuite il effectue des

mouvements circulaires tout en séchant au bec benzène.

Remarque :

Un prélèvement ne suffit pas il faut 3 à 7 prélèvements, une foie le frottis

confectionné le technicien passe à la coloration.

COLORATION DE ZIEH NEELSEN :

Coloration effectuée pour le Mycobacterium tuberculosis

1ère

étape : coloration

Coloration à la Fuschine phéniquée de Ziehl à chaud

- On inonde la lame du Fuschine on chauffe jusqu’a émission de vapeur.

- On refait encore l’opération 2 fois (toutes les 3 minutes)

- On jette le colorant et on rince à l’eau

2ème

étape : Décoloration

- Par l’acide sulfurique (H2SO4) à 25% pendant 3 Min

- Rincer à l’eau

- Ajouter l’alcool = Ethanol pendant 5min

3ème

étape : Contre Coloration

- par le Bleu de Methylène 30s à 1 min puis rincer à l’eau

- il faut secher la lame par du papier buvard ajouter 1 goutte d’huile à

imersion puis observer au grossissement : 100

- Faire la mise au point

Résultat de la coloration = Bacilles roses sur fon bleu

39

Lecture d’une lame BK

La lame est divisée en 3 parties ( une fois sous microscope)

- la premiere partie se lie dans le sens

- la deuxième est lue dans le sens inverse

- la troisième est lue dans le sens que la première

C’est la lecture en créneau La lecture sera donc

*Une longueur ( ) correspondant à 100 Champs

*Une lame entière correspondant à 300 champs

*Noter le nombre exact de Baar Observer sur 20, 100 ou 300 Champs

Expression des résultats

▪> lame riche > 1 Baar / champs

Moyenne de 10 à 20 Champs si répartit uniforme

▪> lame moyennement riche 9-99 Baar/100 champs

La somme totale des 100 champs

▪> lame pauvre < 9 Baar/ 300 Champs

▪> lame négative aucun Baar/ 300 Champs

▪> lame douteuse < 5 Baar / 300 Champs

Relire et refaire une autre frottis.

CULTURE :

La Culture se fait sur des prélèvements décontaminés.

- La culture du BK s’effectue sur un milieu spécial LOWENSTEIN

JENSEN à base de sels minéraux, glycérine, vert de malachite, fécule de

pomme de terre et d’œufs coagulé, asparagine

- L’incubation se fait à 37°C

- Etant donné la lenteur de croissance du BK c'est-à-dire qu’ils se divise

toutes les 20 h c’est ce qui explique l’apparition des 1er colonies vers la

3ème

-4ème

samaine. Les colonies de BK ont un aspect typique : ceux sont

des colonies rondes opaques crème beige ave un aspect rugueux dites

Colonies en choux Fleur.

- On retire la culture au 28ème

jour si il y a absence de colonies on reincube

à 37°C pendant 14jours

- On retire au 42éme jour si il y a toujours absence de colonie on reincube

pendant 30jours

- On retire au 72ème

jour si il y a absence de colonies on jette les tubes et on

répond négatif

Si présence de colonies au répond +

40