Automatisation de l'Hémogramme

NFS

CYTOLOGIE HEMATOLOGIQUE

L’HEMOGRAMME englobe:

-les numérations des éléments figurés

-le dosage de l’Hémoglobine

-la mesure de l’Hématocrite

-le calculs des constantes érythrocytaires et plaquettaires

-l’établissement de la formule leucocytaire

Prélèvement: sang veineux sur EDTA (ou citrate de Na), éventuellement sang capillaire

L’Hémogramme est automatisé complètement ou partiellement dans les laboratoires

•Numérations: GR, GB, Plaquettes.

•Valeurs et constantes:

érythrocytaires:

-Taux Hémoglobine sanguin Hb

-Hématocrite Ht

-Volume Globulaire Moyen VGM

-Concentration Corpusculaire Moyenne en Hb CCMH

-Taux Corpusculaire Moyen en Hb TCMH

-Indice de Distribution des Rouges IDR

plaquettaires:

-Thrombocrite THT

-Volume Plaquettaire Moyen VPM

Indice de Distribution Plaquettaire IDP

leucocytaire: NFS Numération Formule (leucocytaire) Sanguine

•Formule leucocytaire: répartition des différentes sous-populations de leucocytes: PN, PE,PB,L,M

-FL manuelle par lecture microscopique de frottis coloré au MGG (100 à 200 leucocytes répertoriés), si anomalie de FL automatisée

-FL automatisée (5000 à 10000 leucocytes répertoriés)

Les résultats sont rendus en valeur relative % et en valeur absolue par mm3, mais l’interprétation n’est valable que sur les valeurs absolues

•GR, Hb, Hte,VGM,TCMH,IDR: orientation du diagnostic des anémies

•Plaquettes: diagnostic des pb d’hémostase primaire

•GB, FL: diagnostic des pb infectieux, inflammatoires, leucémiques

  Anciennes unités

Facteur x

Unités internationales

Globules rouges

106 par mm3 106 T/L (téra, 1012)

Hémoglobine g/100 ml0,621

mmol/L

Hématocrite % ou dl/dl 0,01 L/L

VGM µ3 

F/L (femto,10-15)

TCMH pg 0,062 fmol (femto,10-15)

CCMH % ou g/100ml 0,062 mmol/L

Globules blancs

103 par mm3 106 G/L (giga, 109)

Plaquettes 103 par mm3 106 G/L (giga, 109)

GR Homme 4,5 à 6 .106 /mm3

Femme 3,8 à 5,5 .106 /mm3

Hématocrite Homme 40 à 54 %Femme 37 à 47 %

Hémoglobine Homme 13 à 17 g/100ml Femme 12 à 16 g/100ml

VGM 82 à 98 fl

CCMH 32 à 36 %

TCMH > 27 pg

IDR <15 %

Plaquettes 150 000 à 450 000 /mm3

GB 5000 à 10 000 /mm3

Granulocyte neutrophile 1500 à 7000 /mm3

Granulocyte éosinophile 0 à 400 /mm3

Granulocyte basophile 0 à 100 /mm3

Lymphocyte 1500 à 4000 /mm3

Monocyte 200 à 800 /mm3

Défaut Paramètres Excès

Erythropénie GR Polyglobulie

Hemodilution Hématocrite Hemoconcentration

Anémie Hémoglobine

Microcytose VGM (Normocytose) Macrocytose

Hypochromie CCMH*

HypochromieTCMH

(Normochromie)

IDR Anisocytose

Thrombopénie Plaquettes HyperThrombocytose

Leucopénie GB Hyperleucocytose

NeutropénieGranulocyte neutrophile

Polynucléose neutrophile

Granulocyte éosinophile

Hyperéosinophilie

Granulocyte basophile

Basocytose

Lymphopénie Lymphocyte Hyperlymphocytose

Monocytopénie Monocyte Monocytose

*La CCMH est considérée comme un indice moins sensible de l’hypochromie que la TCMH dans les anémies, en effet la TCMH diminue avant la CCMH dans l’installation d’un cas d’anémie

Pentra 120 Retic Horiba-ABX

Pentra 60 Horiba-ABX

CELL-DYN 3700 Abbot Laboratories

CELL-DYN SMS Abbot Laboratories

ACT 5DIFF Beckman Coulter

Coulter HMX Beckman Coulter

Sysmex XT

LH 1500 Series Automation Beckman Coulter

CELL-DYN WorkCell Abbott Laboratories

Deux principes très différents:LA NUMERATION DES TROIS LIGNEES GR, GB, PLT

•La Variation d’impédance

Principe Coulter du nom des inventeurs (Wallace and Joe Coulter- 1953), Méthode de référence, la plus répandue. Utilisée pour les numérations, et la formule leucocytaire approchée.

•La mesure optique

Associe les principes de bases de la Cytométrie en Flux (1977):

-focalisation hydrodynamique

-diffraction lumineuse recueillie à différents angles /incidence

Utilisée surtout pour la numération des GB associée à la FL, cependant quelques automates utilisent la mesure optique pour les numérations des 3 lignées GR, GB, PLT (Bayer automate ADVIA 120, Sysmex automate XT2000)

Numération des Globules Rouges Les paramètres calculés

• L'IDR ou RDW (Red Cell Distribution Width)

L'IDR est une valeur statistique correspondant au CV % calculé sur la distribution des rouges = coefficient d'anisocytose.

50 100 200 100 20050 50 100 200IDC Normal< 15% IDC Elevé 18 % IDC très Elevé 35 %

Double population

• Ht = Hématocrite Ht = (GR 10 6/mm3 x VGM fl ) / 10

• TCMH = Teneur cellulaire moyenne en hémoglogine.

TCMH en pg = (Hb g/100 ml / Nb GR) x 10

• CCMH = Concentration cellulaire moyenne en hémoglobine.

CCMH en % = (Hb en g/100 ml / Nb GR 10 6/mm3 x VGM) x 1000

Numération des Plaquettes Histogramme des PLT et paramètres calculés

VMP

Grandes Plaquettes > 20 fl

Petites plaquettes, débris ? < 2 fl

• Le Thrombocrite– TCT ou THT %= (VMP fl x Nb de

Plaquettes 10 3/mm3 ) x 1000• L'IDP ou PDW

– Indice de distribution plaquettaire CV % sur la distribution volumétrique des PLT= coefficient d’anisocytose plaquettaire

LA FORMULE LEUCOCYTAIRE automatiséeTROIS POPULATIONS ou CINQ POPULATIONS (5 Diff)

•La formule leucocytaire 3 populations ou formule approchée, (GRA / Lympho / Mono): pour la majorité des automates, elle est réalisée par analyse par variation d’impédance des volumes cellulaires des globules blancs, après lyse des GR, et action différentielle d’une lyse ménagée sur les GB, lyse qui modifie leur volume.

Cette FL approchée n’a pas de valeur légale, et très peu de valeur fonctionnelle, un automate de ce type décharge l’automate principal du passage de sangs de patients sans anomalie

•La FL complète ou 5 populations, permet en associant plusieurs principes technologiques, l’analyse des GN, GE, GB, M, L, et le repérage facilité de populations anormales du sang (lymphocytes atypiques, cellules immatures précurseurs, érythroblastes…)

Il est des circonstances où il faut effectuer obligatoirement une formule au microscope, et ne pas se contenter de la formule de l’automate:

FL du nouveau-né

Premier examen d’un malade avec nettes anomalies de numération

Variations brutales et inexpliquées par rapports aux NF antérieures

Incohérence avec le contexte clinique ou thérapeutique

Alarmes de l’automate pour lesquelles il n’y a pas d’explication évidente au vu du dossier et/ou des examens antérieurs

Alarmes de l’automate pour distribution cellulaires inhabituelles sur les graphes

•Analyse automatisée individuelle des caractéristiques cellulaires naturelles ou modifiées d’un seul leucocyte PERFORMANCE

•Analyse sur un nombre élevé de leucocytes (5000 à 10000): PRECISION de la FL automatisée par rapport à FL microscopique

•Circulation des GB , après hémolyse des GR, individuellement, séparés, dans un système liquide de flux laminaire: Focalisation Hydrodynamique ou gainage cellulaire, principe de base de la technologie de CytoMétrie en Flux (CMF)

•Apparition successive des GB indivualisés dans un ensemble de mesure, permettant une analyse optique simultanée de plusieurs paramètres naturels (volume cellulaire, présence de granulation, hétérogénéité du noyau) ou modifiés (coloration, fluorescence) de la cellule.

(CFM = FACS « Fluorescence Activated Cell Sorter »)

Formule Leucocytaire 5 populations

Formule 5 Populations : critères de reconnaissance Les automates associent divers principes technologiques permettant

l’accès à divers critères de reconnaissance Variation Impédance (= Volume cellulaire)

Principe Coulter pour le volume, ou mesure optique pour la taille Diffraction lumineuse (= taille cellulaire et Granularité)

Diffraction de la lumière par la cellule (différents angles) Cytochimie sélective

Coloration d’un élément de la cellule, par simple affinité (ex:coloration des granulations éosinophiles) ou par activité enzymatique chromogène sélective (ex: peroxydase des granulations)

Conductivité (opacité) Courant Radio Haute Fréquence (RF)Structure de la cellule par un conduction courant haute fréquence

Cytolyse Lyse sélective de populations. Ex: tous les GB sauf PB.

(évidemment dans tous les cas de FL complète automatisée, la lyse de GR est obligatoire

Détermination de la formule 5 populationsChaque société sur ses automates combine plusieurs technologies et

donc plusieurs critères de reconnaissance

Impédance + Conductivité HF + Diffraction lumineuseBeckmanCoulter Automates MAXM, HmX, GenS, LH500, LH750

Impédance + Cytolyse + Cytochimie (Actvité peroxydasique)BayerDiagnostics Automates Advia120, Technicon H2, H3

Impédance + Cytolyse + Cytochimie (Coloration des granulationsEo.)HoribaAbx Automates Pentra60, Pentra80, Pentra120BayerDiagnostics Automates Advia70 BeckmanCoulter Automates ACT 5Diff

Diffraction lumineuse + Cytochimie (Eosino) + CytolyseSysmex SF3000, XE2100

Diffraction lumineuse multi-angulaire sans cytolyseAbbottDiagnostics Automates CELL-DYN 3200, 3700, 4000

Exemple d’hémogramme complet sur Pentra Horiba ABX

Exemple d’hémogramme complet sur Beckman Coulter HmX

RéticulocytesNouveau bleu de méthylène

LA NUMERATION AUTOMATISEE DES RETICULOCYTES

Exemple sur automate Pentra 120Rétic Horiba ABX

Marquage fluorescent des ARN résiduels

Fluorochrome: Thiazole orange

Focalisation dans cellule de mesure, d’une dilution sanguine 1/3000 dans diluant isotonique + thiazole orange

2 informations recueillies:

- comptage et volume par impédance (saphir)

- signal d’intensité de fluorescence OFL émise à 530 nm, déclenché par excitation transitoire, recueillie à 90° du trajet optique

Matrice Réticulocytes Pentra 120 Horiba ABX

Volume

OFL Intensité Fluorescence

GR matures

Réticulocytes à fluorescence élevée

Réticulocytes à fluorescence moyenne

Réticulocytes à fluorescence faible

PATHOLOGIE LEUCOCYTAIREI - Polynucléoses neutrophiles

Definition: •=> neutrophiles >7-8000/mm3

II - Myélémies 

Definition:

présence dans le sang d'éléments immatures de la lignée granuleuse

myélémie pure ou associée à une érythoblastémie

 

Etiologies:

1- Réactionnelles: (< 10 %)

sepsis sévère

tuberculose aigue

syndrome inflammatoire

2- Régénératives:

hémorragie aigue

hémolyse

sortie d'aplasie, agranulocytose

corticothérapie

facteur de croissance

3- Un syndrome myéloprolifératif:

leucémie myéloide chronique

leucémie myélo-monocytaire chronique

thrombocythémie essentielle

polyglobulie rarement

4- Une myélofibrose:

splénomégalie myéloide: splénoM + erythroblastémie++

myélofibrose aigue primitive

myélofibrose II à un envahissement médullaire (sans PNose):

LA lymphoblastique type L3

myélodysplasie

Hodgkin, Lymphome

cancers

tuberculose

III - HyperéosinophiliesDefinition:

Eosinophiles >350-500-800/mm3 sur pls examens successifs

Etiologies:

1) Parasitoses:

parasites à migration tissulaire=> l'Eosinophile joue un role dans les défenses contre le parasite: Eosinophilie fluctuante en coup d'archer.

Quelle parasitose?

Europe:

ascaris, taenia, distomatose, oxyurose, larva migrans, hydatidose

Antilles:

bilharziose, anguillulose, ankylostomose

Afrique:

filariose, loase, onchocercose

2) Allergiques:

car les enzymes du P.Eosinophile limitent la réaction anaphyllactique

terrain atopique personnel ou familial:

asthme, rhinite, conjonctivite...

cutané: urticaire, eczéma

alimentaire...

vascularite allergique

medicaments : penicillines, sulfamides , protéines injectables (extrait de foie) vaccins , produit de contraste iodé 

3) Cancers et Hemopathies:

Hodgkin

LMC à forme hyperEo

LAM2 Eo

LAI

Lymphomes malins (sécrétion ESF)

cancers à nécrose tumorale

III - Hyperéosinophilies

III - Hyperéosinophilies

4) Collagenoses• vascularites : Périartérite noueuse, LED, angéites allergiques (Churg-

Strauss,Wegener.......) • LED, dermatopolymyosite, PR • fasciites à éosinophiles (Shulman) • sarcoïdose, oedème angioneurotique 

5) Dermatoses prurigineuses• parasitose (gales) • pemphigus, dermatite herpétiforme • toxidermie

6) Causes diverses• irradiation • brûlure • splénectomie • pancréatite aigue

Sd d'HyperEosinophilie Essentielle

definition:

Eosinophilie > 1500/mm3 pendant > 6 mois

idiopathique

  risque à complications multiviscérales graves liées à la toxicité des Eo dans les tissus

• pulmonaire

• neurologique (neuropathie périphérique)

• myosite et fasciite

• cardiaque (Endocardite de Loëffler)

IV - Lymphocytoses isolées

Définition :

lymphocytes > 4000/mm3 chez l’adulte

> 6000/mm3 chez l’enfant

> 11000/mm3 chez le NNé

Eliminer:

1- les fausses  hyperlymphocytoses "inversion de formule "

2 - les lymphocytes anormaux

• leucoblastes

• cellules de Sezary

• cellules lymphomateuses

• tricholeucocytes

• sd MNI

Lymphocytoses isoléesDiagnostic étiologique: se discute selon l'âge

à chez l'enfant :à BENIGNES

• Viroses : oreillons, rougeole, rubéole, varicelle, HV Coqueluche

• Hyperlymphocytose bénigne de CARL-SMITH

• Post-vaccinale, ou réaction immuno-allergique médicamenteuse.

à chez l'adulte : Rarement bénin

aigues : Infections brucellose, typhoïde

Chroniques: allergies médicamenteuses , insuffisance surrénalienne, hypophysaire, Addison

thyréotoxicose , asplénie fonctionnelle , maladies auto-immunes , tabac (F age moyen, HLADR7, Lympho binucléés)

à trés souvent: Hémopathies malignes+++ leucémie lymphoide chronique Waldenström lymphome malin leucémisé :

V- Syndromes mononucléosiques

Définition : présence dans le sang de grandes cellules mononucléées: grands lymphocytes activés hyperbasophiles +++ = lymphocytes T cytotoxiques contre des:

– cellules infectées (Virus, Bactéries, Parasites)

– cellules étrangères (Reaction de rejet)

– Ag étrangers (penicilline)

Ex. : MNI : les lymphocytes B sont infectés par EBV puis lysés par les T cytotoxiques activés

Diagnostic + : reconnaître le sd mononucléosique sur NFS - grands lymphocytes bleutés +++  5 à 90 % , +/- hyperlymphocytose 10 à 25000/mm3

GR et plaquettes normaux

Diagnostic différentiel :

sur la NFS :

• présence de lymphoblastes (LAL)

• grands lymphocytes non basophiles

Quelle est sa cause?1) Causes infectieuses :

Virales * MNI (EBV):

85 % des sd mononucléosiques: fièvre + asthénie + angine + rash

Dg : MNI test+ Paul Bunnel + IgM EBV

* CMV : 5 % asymptomatiques post-transfusionnel

*primo-infestation HIV

Parasitaires* Toxoplasmose :

< 1 % (contact avec des chats ou viande mal cuite)

adénopathies cervicales +++ sans angine

* paludisme

Autres causes infectieuses:Viroses diverses: (HVB, HSV, HIV, rubéole, VZV, rougeole, oreillons...)

infections à germes intracellulaires à Rickettsiose, brucellose,  typhoïde, syphilis

2) R. immunologiques:

– immuno-allergiques (péni,sulfamides)

– greffes

– maladies autoimmunes : LED