Biologie du développement (2)

Aspects cellulaires et moléculairesdu développement précoce

chez l’amphibien

Frédéric TOURNIER

Maître de ConférencesUniversité Paris Diderot – Paris 7

Etude du développement des organismes (nombreux modèles)

INTRODUCTION

spécialisations tissulairesembryologie

Prolifération / différenciation / migration/ mort cellulaire

Données physiologiques Données physiopathologiques

Chez l’adulte Renouvellement des tissus

altérations Réparation: Prolifération / différenciation / migration/ mort cellulaire

Caenorhabditiselegans (nématode)

drosophilepoulet

souris

homme

Invertébrés Vertébrés

Poissonzèbre

Mammifères

xénope

En fonction de la question posée….

CHOIX DU MODELE !

Propriétés communes entre des modèles, mêmetrès éloignés évolutivement

Mais…. aussi propriétés différentes dans des modèles « proches » ! !

Voir plus loin: comparaison de la fécondation chezla souris et chez l’homme

Le plan d’organisationde l’embryon est commun à différentes espèces de Vertébrés

2 segmentation

3

gastrulation

4

neurulationet

organogenèse

métamorphose

1fécondation

Fécondation: - Rétablissement de la ploïdie- Réaction d’équilibration et réaction corticale- Divisions embryonnaires (opposées à somatiques)

Les principales étapes

Segmentation:- Permet de passer du stade unicellulaire (ovocyte fécondé = zygote) au stade pluricellulaire (blastula)- Mise en place d’une cavité (le blastocèle).

La gastrulation:- mise en place des 3 feuillets fondamentaux: ectoderme, mésoderme, endoderme.

La neurulation:- mise en place d’un tube creux (le tube neural) dans la région dorsale.- début du « modelage » de l’embryon, allongement selon l’axe antéro-postérieur.

Et.... L’organogenèse: - exemple de la formation des muscles

Ovogenèse

- Dans l’ovaire: Ovogonies: entrée en méiose

ovocytes I (blocage en prophase de 1ère division de méiose)

hormone: progestérone

reprise de la méiose blocage en métaphase II ponte

Rappel: fécondation interne chez les mammifères!

Externe chez l’amphibien

1) La fécondation

Ovocytes II pondus

- Les ovocytes sont orientés dans tous les sens - Gonflement des ganguesau contact de l’eau

Un pôle animal (région pigmentée): PATâche de maturation

Un pôle végétatif (région non pigmentée): PV

Donc un axe animal / végétatif

PV

PA

Ovocyte non fécondé: distribution hétérogène des constituants

rôle du spermatozoïde lors de la fécondation

acrosome noyau haploïde

centrioleproximal

centrioledistal

flagelle

OvocyteMétaphase II

Fécondation:

apport d’un centrosome par le spermatozoïde

Centriole père

Matériel péri-centriolaire

Centriole fils

Centriole: 9 triplets puis 9 doublets de microtubules…… et nombreuses protéines associées!

Cycle de duplication du centrosome

ATTENTION ! Cycle somatique = croissance + division4 phases: G1, S, G2, M

La question des centrioles du spermatozoïde…!

Conversion fonction axonémale (établissement d’un cil ou d’un flagelle) et fonction centrosomique (organisation du réseau microtubulaire)

Centriole distal (9+0)

axonème du flagelle (structure 9+2)

Centriole proximal

Zone de transition > rupture après fécondation

spermaster

4Nduplication

xénope ……….. homme

- Migration des noyaux- Duplication de l’ADN- Duplication des centrioles du spermatozoïde

NN

1ère divisionde segmentation

2 blastomères(2N)

4N

Mais pas chez la souris !

Probablement pas chez les rongeurs.

Divisions acentriolaires (sans centrioles) jusqu’au stade 16/32 cellules

2) Comment les centrioles disparaissent dans toutes les espèces au cours de l’ovogenèse?

Deux questions - non résolues - se posent:

1) Comment apparaissent les centrioles au stade16 ou 32 cellules chez la souris?

Intérêt?

Duplication du centrosome => mitose « normale »

Réaction d’équilibration Rotation corticale

Réaction d’équilibration: après fécondation, le décollement de la membrane de fécondation de la membrane plasmique de l’ovocyte fécondé lui permet d’être libre dans sa gangue

orientation tel un « culbuto », due à la densité des plaquettesvitellines dans l’hémisphère végétatif

tous les ovocytes fécondés sont orientés PA vers le haut.

Rotationd’environ

30°

Pôle animal

Pôle végétatif

Croissantgris

ovocyte fécondé

Réaction corticale, formation du croissant gris

spermatozoïde

ovocyte non fécondé

Pôle végétatif

Pôle animal

Etablissement d’un nouvel axe: dorso-ventral

VD

Réaction corticale: rôle du spermaster

Interprétation:

Le croissant gris (ou dépigmenté) apparaît à la suite de la rotation du cytoplasme par rapport au cortex. Le spermaster (« lourd ») serait responsable de ce mouvement relatif.

- passage du stade unicellulaire (zygote = ovocyte fécondé) au stade pluricellulaire,

- les premières divisions aboutissent à la formation de la morula.

micromères

2) La segmentation

macromères

A la fin de la segmentation, l’embryon est au stade blastula

MPF (Maturation Promoting Factor) faible en S (synthèse de cycline B) et élevé en M (dégradation de la cycline B): phosphorylation de substrats. ex:-Histone H1-Lamines

Cycles embryonnaires de segmentation

Division mais pas croissance

Pas de phases G1 et G2: alternance de phases de synthèse (S) et de divisions mitotiques (M)

Pas de transcription jusqu’à la transition blastuléenne(environ 6000 cellules ou blastomères): reprise des phases G1 et G2

Utilisation d’extraits cytoplasmiques d’ovocytes de

xénope

Application:

MPF ______ (activité)

Cycline B - - - - -(ARN ou protéine) Stade 2

blastomèresStade 4

blastomères

0 10 60 90 120temps (min)

fécondation

1er clivage 2ème clivage

3) Extraits « cyclants »- 60 min environ après « l’activation »des ovocytes- Activité MPF faible. Mais le niveaude cycline mitotique endogène permet l’activation du MPF (cycle(s) « in vitro ») t

MPF

t

MPF1) Extraits « mitotiques »- Au temps 0: à partir d’ovocytes matures, pondus, bloqués en métaphase de 2ème division de méiose.- Activité MPF élevée constante

t

MPF

2) Extraits interphasiques- 10 min environ après « l’activation »des ovocytes- Activité MPF faible constante

Exemples d’expériences ?

Pôle animal

Pôle végétatif

blastocèle

micromères

macromères

En fin de segmentation se forme la blastula,creusée d’une cavité, le blastocèle

Cohésion des cellules ?

Rôle du cytosqueletteet de la matrice extra-cellulaire

Macromères et micromères

Cadhérines: permettent les jonctions inter-cellulaires,liens avec le cytosquelette.

MEC:Lamininefibronectine

Hétérodimèresrécepteurs à

la fibronectine

Passage des ionset petites molécules

Protéines de jonctions:Fusion entre membranes

Revenons à la mise en place de l’axe dorso-ventral

… en absence de croissant gris, pas d’axe dorso-ventral, ni de système nerveux.

Hans Spemann (1938)

Expérience: coupure viable du zygote avant la première segmentation

Cellules épidermiques, mésenchyme et cellules endodermiques. Mais…

PA PA

DVLes cellules sontséparées au stade 2

Conclusion: des cellules qui « paraissent identiques » ont déjà des destinées différentes au stade blastula

Expériences dePeter Nieuwkoop (1980)

Au stade blastula, les cellules de la zone marginale ont déjà reçu une information pour les orienter vers une différenciation en:- chorde (mésoderme dorsal)- cellules musculaires (mésoderme intermédiaire)- cellules sanguines (mésoderme ventral)

Régulations moléculaires complexes

Inductions

Cellules inductrices > cellules compétentes

Mise en évidence par l’expérimentation

1- Si on marque les blastomères animaux: les cellules mésodermiques sont marquées

2- Si on marque les blastomères végétatifs: les cellules mésodermiques ne sont pas marquées

PV

Expérience: marquage des cellules avec un composé fluorescent Stade 32 blastomères

Expériences de Dale et Slack (1987)

Régionalisation de l’induction (1)

Régionalisation de l’induction (2)

Conclusion: 1) les blastomères végétatifs induisent les cellules adjacentes à

fonder les lignées mésodermiques.2) La régionalisation de cette induction est déjà déterminée.

Carte des territoires présomptifs au stade blastula:Régionalisation des blastomères en fonction de leur devenir en fin de gastrulation.

En résumé:

Des cellules inductrices envoient une information. Elle synthétisent et sécrètent une ou plusieurs molécules.

Les blastomères végétatifs envoient une information vers des micromères de la zone marginale > Induction du mésoderme

Des cellules compétentes sont capables de recevoir l’information. Elles possèdent des récepteurs et des messagers intracellulaires capables d’agir au niveau génomique.

mouvements de cellules à partir de la blastula qui aboutissent àla mise en place des 3 feuillets fondamentaux qui donneront tous les organes:

- Ectoderme (et Neurectoderme)- Mésoderme- Endoderme

3) La gastrulation

Les cellules migrent en surface et rentrent à l’intérieur de l’embryon en constituant une nouvelle cavité: l’archentéron(futur intestin)

Future région ventrale

Future région dorsale

Lèvre dorsale du blastopore Blastopore

Stade du bouchon vitellin

Utilisation de la technique des marques colorées: pour mettre en évidence la mise en place des 3 feuillets et les mouvements de la gastrulation

Coloration de quelques cellules dans des régions d’intérêt.On repère à différents stades les cellules qui portent la coloration (coupes histologiques, observation au microscope)

Les cellules commencent àentrer par la lèvre dorsale du blastopore (localisée dans la région du croissant gris)

Stades du bouchon vitellin

4) La neurulation - Allongement selon l’axe D-V- Dans la région dorsale, formationdu tube neural

Mouvements complexesdes cellules:

Rôle du cytosquelette

Allongement et stabilisation des microtubules

Contraction des faisceaux d’actine

Interactions entre celluleset matrice extra-cellulaire(MEC)

Contractions à l’apexdes cellules > mouvement« d’enroulement » du tubeneural

Après la neurulation, le plan d’organisation primaire commun à tous les vertébrés est réalisé.

Les 3 feuillets sont en place:Externe (ectoderme)Moyen (mésoderme)Interne (endoderme)

Les 3 axes sont en place:- Antéro-postérieur- Dorso-ventral- Médiolatéral

Endoderme: intestin, foie, poumons

Ectoderme: peau, système nerveux

Mésoderme: squelette, muscle, rein, cœur, vaisseaux