Infec&onsbroncho-pulmonaires:Duprélèvementaudiagnos&cau

laboratoire

Anne-LaureRouxHôpitalAmbroiseParé,BoulogneBillancourt

Indica&onsdesprélèvementspourlediagnos&cd’uneinfec&onbroncho-pulmonaire

•  Modifica?ondelapriseenchargethérapeu?que•  Situa?onscliniquesoùlesprélèvementsprésententlameilleuresensibilité

à Lechoixdutypedeprélèvementestfonc?ondessymptômes

à Bilansystéma?quedespa?entsimmunodéprimés

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Quelprélèvementpourquelmicroorganisme?

•  Prélèvementsrespiratoires«invasifs»àbactériesetchampignons

•  Sécré?onsnasalesoutrachéo-bronchiquesàvirus

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Performancesdesprélèvementsrespiratoires

•  Absencedetraitementan?-infec?euxpréalable

•  Rapiditédutransport

•  Rapiditédepriseenchargeaulaboratoire

•  Qualitéduprélèvement

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Délaid’acheminementdesprélèvementsrespiratoires

•  Moinsde2heuresàT°ambiante

•  Conserva?onà+4°Caumaximumpendant24h

•  Excep?onpourlesmycobactéries/Legionella:maximum72hà+4°C

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Lesexpectora&ons

•  Prélèvementrarementcontribu?fetsourced’erreur

•  Contamina?onpardelasalivedansplusde50%descas

•  Indica?ons:–  Surinfec?ondebronchitechronique–  Infec?onsàmycobactérie–  Infec?onschezpa?entsa\eintsdemucoviscidose,BPCO

–  RecherchedePneumocys/sjiroveciiparPCR6

Lavagebroncho-alvéolaire

•  Indica?ons:– Documenta?ondespneumopathiesacquisessousven?la?onmécanique(PAVM)

– Documenta?ondespneumopathiesaiguëscommunautaireschezlespa?entsimmunodéprimésouencasd’échecdutraitementempirique

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Brossagebronchique

•  Mêmesindica?onsqueleLBA

•  Meilleureprélèvementpourlesculturesviralesetlacytologie

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Traitementdesprélèvementsaulaboratoiredebactériologie

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TYPE DE PRELEVEMENT DILUTIONS MILIEUX USUELS MILIEUX COMPLEMENTAIRES COLORATIONS

EXPECTORATION ASPIRATION BRONCHIQUE ASPIRATION TRACHEALE

1ösede100µl(2gouttes)prélèvementdeladilution10-39mlEPT10-310-5EPT=EauPhysiologiqueStérile

AérobieCOSDRIGAnaérobieCOSCO2PVXSCG(REA)Culture:100µlenrâteau(saufDDB)

ANCCANDMSACETRICEPPVX

ProtocoleDDBPur10µLenquadrant

LAVAGE BRONCHO-ALVEOLAIRE

1mlde100µlprélèvementdeladilution10-19mlEPT10-110-3

AérobieCOSAnaérobieCOSCO2PVXSCG(REA)

DRIGANCCAND

PRELEVEMENT DISTAL PROTEGE BROSSE

1ml2gouttesEPTdupur18gouttesEPTPUR10-1

AérobieCOSAnaérobieCOSCO2PVXSCG(REA)

DRIGANCCAND

GRAMObjx100

MGGObjx10

GRAMObjx100

MGGObjx10

GRAMObjx100

MGGObjx10

Colora&ondeMayGrunwaldGiemsa

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Colora&ondeGram

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Choixdesmilieuxdeculture/atmosphères

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Défini&ondesseuilsdesignifica&vité

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REMIC,2015

Interpréta&ondesrésultatsdeculture

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Recherchesspécifiques

•  Legionellasppàimmunofluorescence+miseenculturesurmilieuspécifique

•  Nocardiasppetautresac?nomycètesàexamenbactériologiquestandard+conserva?onpluslonguedesmilieuxdeculture

•  Aspergillussppàexamenmycologiquestandard•  Pneumocys/sjiroveciiàimmunofluorescence+PCR•  Mycobactériesàexamenmycobactériologique•  HistoplasmoseàleLBAestleprélèvementleplusadapté

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Legionellaspp

•  Immunofluorescencedirecte:techniqueu?lisantdesan?corpsmonoclonauxreconnaissanttouslessérogroupes

•  Culturedeslégionelles:lente(ledélaideréponseestde10jours)etdifficile.

•  Bactériesexigeantes,nécessitantl'u?lisa?ondemilieuxspécialisésàmilieuBCYE.LeslégionellessontdesbactériesaérobiesstrictesdontlacroissanceestfavoriséeparlaprésencedeCO2(2,5%).aspectcaractéris?quedescoloniesditen“verrefriMé”

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Legionellaspp

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Coloniesen«verrefri\é»surmilieuBCYE

Nocardiasppetac&nomycètes

•  Diagnos?cexclusivementdirect•  Examendirectetmiseenculture

–  BacillesàGramposi?framifiésavecunaspectmouchetéou?gré–  Culturesurmilieuxstandards(géloseausang,gélosechocolat)enaérobioseou

sous5%deCO2.

!Nécessitédeprolongerl’incuba&ondesmilieuxaumoins10joursü  30%deculturesposi?vesen48heuresü  50%après5jours

DemandespécifiéeparleclinicienderecherchedeNocardiaobligatoire!!!

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Nocardiasppetac&nomycètes

Aspergillusspp,examenmicroscopique

•  Miseenévidencedefilamentsmycéliensde«typeaspergillaire»•  Entrelameetlamelle,ilsmesurentde2à4µmdediamètre,apparaissenthyalins,cloisonnés,etparfoisramifiés(dichotomieavecanglesaigusà45°)•  U?lisa?ondeméthodesdemarquage(noirchlorazol)oudecolora?onspécifiques(Gomori-Groco\)

Aspergillusspp:Cultureetiden&fica&on

• Milieufongiquespécifique(Sabouraud+/-an?bio?ques)èiden?fica?onprécisedugenreetdel’espèceduchampignon.Aspergilluspousseen3à5joursà37°C.L’aspectmacroscopiqueestrasàpoudreux,veloutéparfoiscotonneux,etdecouleurvariéeenfonc?ondel’espèce•  Examendirectàpar&rdelaculture!orienta&ondiagnos&que•  Iden&fica&onparspectrométriedemasse

Aspergillusspp:autrestechniques

•  Biologiemoléculaire– Techniquesd’amplifica?ongéniquespécifiquesd’Aspergillus– Sérum,prélèvementsrespiratoires–  Intérêt:bonnevaleurprédic?venéga?vedanslesérum– Limites:•  Equipementspécifique•  Trèssensiblesèdis?nc?onentrecolonisa?on(portageasymptoma?que)etinfec?onplusdifficile

Pneumocys6sjirovecii

•  Intérêtdelacolora?ondeMGGpourvoirlesformesvégéta?ves

•  Immunofluorescencedirecte

•  LaPCRquipermetdedétecterdefaibleschargesfongiques

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Lediagnos&cdelatuberculoseaulaboratoire:étapesprincipales

Méthodesclassiques

ü examenmicroscopique

ü culture

ü iden?fica?on

ü an?biogramme

Méthodesgéné&ques

ü amplifica?ond’ADN/ARNmycobactériendansleprélèvement

ü iden?fica?onparsondegéné?que

ü iden?fica?ondesmuta?onsconférantlarésistanceauxan?bio?quesdanslesgènescibles

Lesprélèvements:quelquesprincipes

ü  Onpeutchercherlesmycobactériesdanstouslesprélèvements! avecplusoumoinsdesuccès!

ü  Emissionirrégulièredesbacillestuberculeux→nécessitéderépéterlesprélèvements

ü  10à30%descasdetuberculosesontdiagnos?quésuniquementsurlaclinique

ü  Crachatspontané,lema?nàjeunsipossible(2à3mlminimum)ü  Crachatinduitü  Tubagegastrique

→àrépéterdeux(outrois)jourssuccessifsDansun2èmetemps:ü  Aspira?onbronchiqueü  Lavagebroncho-alvéolaire

Prélèvementspulmonaires

Hygièneetsécurité

ü  Lesespècesducomplexetuberculosisàl’excep?ondelasouchevaccinaleBCGàbactériesdugroupederisquebiologique3

→protec&onadéquatedespersonnelsetdel’environnement:mesuresdeconfinementd’unniveau3(laboratoireL3)

Laboratoire L3

Accès sécurisé via un sas

Pression négative

Masque FFP2 en permanence

Manipulation sous Poste de Sécurité

Microbiologique

Sécurisé, couteux et contraignant

Laboratoire L3

Accès sécurisé via un sas

Pression négative

Masque FFP2 en permanence

Manipulation sous Poste de Sécurité

Microbiologique

Sécurisé, couteux et contraignant MasqueFFP2 PSM2

Etapededécontamina&on=étapeessen&elle

ü Elimina?ondelafloreoro-pharyngéedanslesprélèvementsrespiratoires

ü Elimina?ondelafloredanslesprélèvementsurinairesetdiges?fs

→méthodedeKubica:Nacétyl-L-cystéine/citratedesodium/NaOH

éliminelaflore,maisaussiunepar?edesBAAR!

Méthodesclassiques

ü examenmicroscopique

ü culture

ü iden?fica?on

ü an?biogramme

Méthodesgéné&ques

ü amplifica?ond’ADN/ARNmycobactériendansleprélèvement

ü iden?fica?onparsondegéné?que

ü iden?fica?ondesmuta?onsconférantlarésistanceauxan?bio?quesdanslesgènescibles

Lediagnos&caulaboratoire:étapesprincipales

ü  Colora?ondeZiehl-Neelsen(méthodederéférence)

ü  Colora?onàl’auraminefluorescente=méthodedeDegommier

ü  Nonspécifique

ü  Peusensible:5.103à104bacilles/ml

ü  RendudesrésultatsennombredeBAARparlameouparchamps

Examenmicroscopique

Résultatsrendus

BAARvusàlacolora&on

Résultatsrendus Fluorescence

X250 x400

AucunBAARdétecté 0 0

PrésencedeBAARentrèsfaiblenombre

1-2 1-2

+ 1-9(lame) 1-9(lame)

++ 1-9(1champ) 4-36(10champs)

+++ 1-90(1champ) 4-36(1champ)

++++ >90(1champ) >36(1champ)

REMIC,2015

Colora&ondeZiehl-Neelsen

Diagnos?cen15min

Colora&onàl’auraminefluorescente

Diagnos?cen3min

èLestestscommercialisésnesontvalidésquepourlesprélèvementsrespiratoires!

1.  EnhancedAmplifiedMycobacteriumtuberculosisDirectTest(E-AMTDT)

2.  AmplicorMycobacteriumtuberculosisTest3.  Inno-LiPA-Rif.TBTest4.  GenoTypeMycobacteriaDirectTest5.  GeneXpertMTB/RIF(recommandéparl’OMS)

Méthodesgéné&ques:PCRdirectessuréchan&llons

ü  Détec?onducomplexeM.tuberculosis

ü  Détec?ondemuta?onsdanslegènerpoBconférantlarésistance

àlarifampicine

→directementàpar?rd’unprélèvement

→sansextrac?onpréalable

→complètementautoma?sée

ü  Extrac?on,amplifica?onetdétec?onparlatechniquedePCRen

tempsréeldansuneseulecartouche

PrincipedutestXpert®MTB/RIF

Tempsdeprépara&ondel’échan&llon:20minutes

ProtocoledutestXpert®MTB/RIF

MaislaPCRnerésoutpastout…

Tuberculose Sensibilité Spécificité

M+ 98% 98%

M- 72% 96%

Extra-respiratoire

(M-)

30% 98%

VPP:98%etVPN:90%

UnePCRnéga?venepermetpasd’exclureunetuberculose

Méthodesclassiques

ü examenmicroscopique

ü culture

ü iden?fica?on

ü an?biogramme

Méthodesgéné&ques

ü amplifica?ond’ADN/ARNmycobactériendansleprélèvement

ü iden?fica?onparsondegéné?que

ü iden?fica?ondesmuta?onsconférantlarésistanceauxan?bio?quesdanslesgènescibles

Lediagnos&caulaboratoire:étapesprincipales

ü  SurmilieudeLöwenstein-Jensen

ü  Aspectdescoloniescaractéris?quepourcertainesespèces

ü  sensibilitéde102à103bacilles/ml

→diagnos?cdelaplupartdescas(avecorienta?onsurl’espèceencause)

→délaimoyende14-21jourssiBAAR+/21-42jourssiBAAR-

Culture-surmilieusolide

M.tuberculosissurLoewenstein-Jensen-Medium

ü  MilieudeMiddlebrook(7H9ou7H10)+supplémentOADC(acideoléique,albumine,catalase,dextrose)+/-mélanged’an?bio?ques

ü  Croissancedétectéegrâceàdesautomatesd’incuba?onàlecturecon?nue²  Composéfluorescentsensibleàlaconcentra?ond’oxygène²  Larespira?ondesmycobactériesencroissanceconsomme

l’oxygènedumilieuetpermetl’ac?va?ondelafluorescence

→délaimoyende5-10jourssiBAAR+/10-28jourssiBAAR-

Culture-surmilieuliquide(MGIT©)

LatechniqueMGIT©

Conclusions

ü  Lecontextecliniqueetépidémiologiqueguidelesexamensàme\reenœuvre

ü  Aucunou?lmicrobiologiquen’est100%sensiblenispécifique

ü  Obliga?ondedemandesexplicitesduclinicienpourlarecherchedemicroorganismesatypiques

ü  Lediagnos?caulaboratoire=examenmicroscopique+culture

ü  Apportmajeurdestechniquesdebiologiemoléculaire