Physiologie bactérienne

Anne-Laure Michon- Laboratoire Bactériologie

Hôpital Arnaud de Villeneuve - Montpellier

Cours PCEM2

Objectifs

• les principaux éléments de la physiologie bactérienne :

les conditions de la croissance bactérienne nutritionnelles environnementales

la croissance bactérienne proprement dite division bactérienne dynamique de la croissance

• leurs implications :

dans la conduite d’un examen cytobactériologique

dans le diagnostic d’une infection bactérienne

Définition

Physiologie

Science des fonctions et des constantes du fonctionnement normal des organismes vivants,

unicellulaires comme pluricellulaires(Larousse Médical)

Science qui traite des fonctions organiques par lesquelles la vie se manifeste

(Petit Larousse)

Plan

Les principaux éléments de Implication lors de l’examenla physiologie bactérienne cytobactériologique

- Besoins nutritifs - Choix des milieux de culture

- Conditions environnementales - Choix de T°, atmosphère d’incubation

- Division bactérienne - Délais de croissance et de rendu des résultats

- Dynamique de la croissance - Dénombrement, identificationantibiogramme

Besoins nutritifs (1)

Bactéries : organismes vivants devant trouver dans l’environnement les substances nécessaires à leur énergie et à leurs synthèses cellulaires

1. Source d’énergie :

• lumineuse : bactérie phototrophe • composés minéraux ou organiques : bactérie chimiotrophe

- élément minéral : bactérie chimiolithotrophe- élément organique : bactérie chimioorganotrophe

2. Sources de carbone :

•bactérie autotrophe : CO2 exclusivement• bactérie hétérotrophe : CO2 ou substances hydrocarbonées

(alcool, acide acétique, acide lactique, sucres divers,…)

Besoins nutritifs (2)

3. Sources d’azote et besoins en soufre

4. Besoins inorganiques : phosphore

5. Autres éléments :

• Sodium, Potassium, Magnésium, Chlore

• Oligo-éléments : Manganèse, Nickel, Zinc, Sélénium, …

• Facteurs de croissance : - Acides aminés : Acide folique, Acide nicotinique, …- Divers : dérivés de l’hème

• Vitamines : B6 (pyridoxine), K et dérivées, ...

Quels sont les composés qui doivent être inclus dans un milieude culture pour permettre la croissance bactérienne ?

• Substrats nutritifs :Acides aminés, peptides, bases nucléiques, sucres, etc

• Système tampon

• Sels minéraux

• Vitamines

• autres facteurs de croissance pour certaines bactéries : Sang, protéines, hémoglobine, vitamines supplémentaires

Milieux de culture (1)

Milieux de culture (2)

- Composition

• synthétiques Composition définie• semi-synthétiques Ajout d’un extrait d’organismes (levures : facteurs

de croissance)

• complexes Réalisation empirique (extraits de viande, de levure, extraits enzymatiques, protéines = peptones)

- Rôle

• d’isolement Croissance de plusieurs espèces• d’enrichissement Croissance d’1 espèce en faible quantité favorisée• enrichis Croissance des bactéries exigeantes• sélectifs Croissance d’un type bactérien favorisée

+ inhibition de celle des autres

(à voir en T.P.)

Milieux de culture (3)

- Liquides bouillons de culture

En tubes

Ex : bouillons d’hémoculture

En flacons

Croissance bactérienne = trouble du bouillon

Incubation jusqu’à 15 jours à 37° C le plus souvent

Milieux de culture (4)

- Solides milieux gélosés en boîtes de pétri

Incubation 24 à 72 h à 37° C le plus souventMise en évidence de colonies bactériennes

(1 bactérie 1 colonie)

Combinaison de plusieurs types de milieux de 2 (ECBU) à 9 (Copro)

Plan

Les principaux éléments de Implication lors de l’examenla physiologie bactérienne cytobactériologique

- Besoins nutritifs - Choix des milieux de culture

- Conditions environnementales - Choix de T°, atmosphère d’incubation

- Division bactérienne - Délais de croissance et de rendu des résultats

- Dynamique de la croissance - Dénombrement, identificationantibiogramme

Conditions environnementales

• Le pH : bactéries neutrophiles (6- 8) Escherichia colialcalinophiles (> 8) Pseudomonasacidophiles (< 6) Lactobacillus

• La pression osmotique : bonne tolérance généralehalophiles : nécéssitent du NaClhalotolérants

• La pression mécanique / hydrostatique : bonne toléranceespèces barophiles (fonds marins)

• La température : bactéries mésophiles : 10-45°C optimum 30-37°C, psychrophiles : -15°C à 20°C (5-10°C)thermophiles (45-70°C) hyperthermophiles (>80°C)

Bactéries

1 - aérobies strictes(Pseudomonas)

2 - micro-aérophiles(Campylobacter)

3 - aéro-anaérobies facultatives(Escherichia coli)

4 - anaérobies strictes(Clostridium)

Conditions environnementales (2)

• L’oxygène moléculaire = mode respiratoire des bactéries

Croissance b

actérienne

Atmosphère normale

Etuve à CO2 (5%)

Anaérobioseou Microaérophilie

Jarres

Atmosphères particulières

Sachet

Plan

Les principaux éléments de Implication lors de l’examenla physiologie bactérienne cytobactériologique

- Besoins nutritifs - Choix des milieux de culture

- Conditions environnementales - Choix de T°, atmosphère d’incubation

- Division bactérienne - Délais de croissance et de rendu des résultats

- Dynamique de la croissance - Dénombrement, identificationantibiogramme

Division bactérienne

Croissance bactérienne =

Accroissement ordonné et coordonné de tous les composants de la bactérie

du nombre des bactéries

appauvrissement du milieu de culture en nutriments

enrichissement du milieu en sous-produits du métabolisme

Division bactérienne (2)

• Bactérie = organisme asexué

• Reproduction par division cellulaire :

- Allongement de la bactérie,- Duplication des constituants- Séparation

1 cellule mère

2 cellules filles identiques

= reproduction binaire = scissiparité Etc, … 1 colonie

Délais de croissance

Temps de génération de quelques espèces bactériennes

Bactérie In vitro (min) In vivo (h)

Escherichia coli 20-40 5

Staphylococcus aureus 40 3-5

Pseudomonas aeruginosa 40 4

Mycobacterium tuberculosis 120-240 24-48

• Temps de division et délais de croissance dépendent :- de la bactérie - des conditions du milieu extérieur (favorables/défavorables)

Conditionne le délai de l’analyse et donc du rendu des résultats

Plan

Les principaux éléments de Implication lors de l’examenla physiologie bactérienne cytobactériologique

- Besoins nutritifs - Choix des milieux de culture

- Conditions environnementales - Choix de T°, atmosphère d’incubation

- Division bactérienne - Délais de croissance et de rendu des résultats

- Dynamique de la croissance - Dénombrement, identificationantibiogramme

1. Latence2. Accélération

3. Exponentielle4. Ralentissement

5. Stationnaire 6. Déclin

Tempsd’incubation

Log dunombre bactéries

Dynamique de la croissance

Courbe de croissance = étude en milieu liquide : 6 phases

Dynamique de la croissance (2)

Courbe de croissance = étude en milieu liquide : 6 phases(milieu adapté non renouvelé)

- Phase de latence : Croissance 0 Accoutumance des bactéries à l’environnement

- Phase d’accélération : vitesse de croissance

- Croissance exponentielle :Taux de croissance maximal

- Phase de ralentissement : vitesse de croissance, épuisement dumilieu, accumulation des déchets

- Phase stationnaire : arrêt de la reproduction (facteur limitant)taux de croissance nul (division = autolyse)

- Phase de déclin : ressources épuisées, le nombre de bactéries

Applications

1/ Application au dénombrement des bactéries par unité de volume d’échantillon analysé

Dénombrement après culture (bactéries viables) :

ensemencement d’un volume défini d’échantillon sur milieu de culture gélosé UFC/ml (Unités Formant Colonie/ml)

Ex : 100 ml de LBA 70 colonies bactériennes 700 UFC/ml (seuil significatif : 104 UFC/ml)

autres : lames immergées (Uricult®) pour l’ECBU bactériurie

•Ex: ECBU Bactériurie- Ensemencement volume défini d’urine + dénombrement des colonies bactériennes

- Lame immergée :

Milieu bacilles à Gram négatif

Milieu tous germes

Bactéries ou UFC/ml 103 104 105 106 107

- Seuils significatifs (UFC) / ml• Cystite aiguë : ≥ 103 Escherichia coli, ≥ 105 autres bactéries • Pyélonéphrites et prostatites ≥ 104

•ITU nosocomiales ≥ 103

Applications (2)

2/ Application à l’identification bactérienne

Etude de la croissance en présence de divers substrats =étude du métabolisme bactérien

Saccharose

Arabinose

Inositol

ExempleEtude du métabolisme glucidiqueavec galerie miniaturisée

Escherichiacoli

Klebsiellapneumoniae

Applications (3)

3/ Application à la réalisation de l’antibiogramme

Etude de la croissance en présence de divers antibiotiques

Disqued’antibiotique

Inhibition de lacroissance

(souche sensible)

Croissance(souche résistante)

Applications (4)

4/Conduite d’un examen cytobactériologique (Ex : ECBU)

J0 Examen direct (GB, GR, bactéries, …) et mise en culture

J1 1 type de colonies isolées

Plusieurs types decolonies isolées

Plusieurs types de colonies non isolées

RéisolementNumérationIdentification(s)

Antibiogramme(s) éventuel(s)

Applications (5)

J2Identification et

antibiogramme éventuelRésultat

J3 Résultat

Conclusion

- Intérêt de l’étude de la croissance bactérienne : multiple

• Lors d’une maladie infectieuse : - isolement, dénombrement et identification de la ou des bactéries en cause

- détermination de la sensibilité aux antibiotiques

• Réalisation de contrôle de stérilité ou de densité microbienne dans certains locaux (air des blocs opératoires, surfaces, …)

• Contrôle de la qualité microbiologique Aliments, eaux, médicaments, produits cosmétiques, …

Importance de connaître la physiologie bactérienne +++

Importance des conditions de réalisation de la culture bactérienne (besoins nutritifs et conditions environnementales respectés)

2 sites Internet

http://www.phem.fr/bio puis « Les bactéries »

Campus de microbiologie médicale :http://www.microbes-edu.org

avechttp://www.microbes-edu.org/etudiant/etudiants.html

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