12-06-2009

Anne COLENO -COSTES

UMR7622 - Biologie du DéveloppementCNRS - UPMC

Bâtiment C - 7ème étage - case 249, quai Saint-Bernard75005 - Paris, France

tel: 00 33 1 44 27 32 59anne.coleno-costes@snv.jussieu.fr ou anlikia@yahoo.fr

Démonstration de PCR quantitative

1. Principe de la PCR quantitative

2. Exemples d’applications de la PCR quantitative

3. Calculs à effectuer pour l’analyse des résultats du stage

Principe de la PCR conventionnelle

Dénaturation du double brin d’ADN et hybridation des amorces

Elongation

Amorces, ADN, dNTPs, Taq Pol

72°C

55°C

95°C

72°C

x 35 cycles

Séparation électrophorétique

PCR conventionnelle versus PCR quantitative

Analyse en point final sur gel d’agarose

Phase exponentielle

Phase linéaire

Phase plateau

Analyse dynamique de la PCR quantitative

-haute précision pendant la phase exponentielle

-variabilité importante à la phase plateau

PCR quantitative SYBR ®Green

Mesure de fluorescence en fin d’élongation

PCR quantitative avec une sonde TaqMan®

Cette méthode repose sur deux principes :-l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol-la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer)

5’

5’

3’

3’

FP

RP

Reporter Quencher

FAM, VIC TAMRA, MGB

-Spécificité de l’amorce pour la PCR-Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan

5’

5’

3’

3’

FP

RP

R Q

-FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie),

pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte

Fluorescence

Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan®

PCR quantitative avec une sonde TaqMan®

Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan®

-au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’ exonucléase lyse la sonde

5’

5’

3’

3’

FP

RP

Q

5’

5’

3’

3’

FP

RP

Q

-lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence.

nm

Abs

orbt

ion Fluorescence

475 550

Reporter :FAM

nm550 600

Abs

orbt

ion Fluorescence

Quencher :TAMRA

-Le spectre d’emission du Reporteur recouvre le spectre d’absorption du Quencher

FRET

Mécanisme de quenching

Excitation

Émission

FRET

TaqMan® MGB probes

NFQ non fluorescent quencherNouvelle innovation

MGB minor groove binderstabilise les 5 à 6 dernières bases de la sonde (à son extrémité 3’)sonde plus courte et plus spécifique (pour un Tm donné)

NFQReporter

MGB

TaqMan ® versus SYBR ® Green

TaqMan ® SYBR ® GreenSpécificité -fixation des amorces

-hybridation de la sonde-conditions PCR

-fixation des amorces,--conditions PCR

Flexibilité -multiplexe,-détection de SNP-

---utilisation d’amorces dégénérées

Optimisation -standardisée -dépend du gène ciblé-vérifier la formation de dimère d’amorces

ROX™ comme référence passive

Le marqueur fluorescent ROX ™ permet de normaliser les variations de fluorescence non reliées à la PCR (fluorescence des plaques ou tubes, contamination du bloc PCR, légère variation du volume…)

ROX

Echantillon 2

FAM

ROX

Echantillon 1

FAM

Fluo

resc

ence

Fluo

resc

ence

Rn

Rn

Rn= Reporter / Passive référence

Détermination du Ct (cycle threshold) ou Cp (Crossing point)

Ct

La valeur de Ct est déterminée dans la phase exponentielle, à l’intersection de la ligne de base avec la courbe de fluorescence

Bruit de fond

Rn

Ligne de base

Ct

Efficacité de la PCR quantitative

Nom

bre

de c

opie

s (lo

g)

1

2

3

4

5

6

18 23 28 33 38Cycle seuil - Ct

Log N = -0,26Ct + 10,85R2= 0,998

Efficacité = 10(-pente) -1

Exemplepente = -0.26E = 10(0.26) –1

= 1.82 – 1= 0.82 soit 82 %

Si la pente est égale à 0.301 alors l’efficacité de la PCR quantitative est de 100 % : à chaque cycle le nombre d’ADN cible sera multiplié par deux.Si l’efficacité est de 82%, le nombre d’ADN cible sera multiplié par 1,64 !!!

PCR efficace à 100%

y = x (1 + E)n

cas spécifique E = 1 alorsy = x 2n

y=nombre de copie du gène cible

x=nombre de copie initiale

E=efficacité

n=nombre de cycle PCR

Quand E = 1 alors :

ΔCt = + 1 augmentation x2

ΔCt= + 3.32 augmentation x10

Quantification relative :

• pas besoin de courbe de standard

• calcul des résultats par comparaison des Ct

• nécessité de définir :- un gène servant de contrôle endogène,- un standard ou référence

• donne une image de la quantité de matrice apportée (ADN ou ADNc)• est présent en quantité constante dans tous les échantillons• normalise :

les biais d’extraction et de contaminations par des inhibiteurs (ADN)les variations d’efficacité de transcription inverse

le contrôle endogène :Quantification relative : Q-RT PCR

Le Standard :

• permet de comparer l’échantillon cible à un groupe de référence

• permet de rendre compte de la variation étudiée

• Peut être un groupe non traité, un t0 dans une cinétique, un input (en ChIP), un WT….

Quantification relative :

Contrôle endogène

Gène cible

ΔCt = 22 – 16 = 6

Ct=16 Ct=22 Cycle

ΔRn

Comparaison du gène cible avec le contrôle endogène

Ct=16 Ct=22 Cycle

ΔRn

Ct=21Ct=15

Contrôle endogène

Gène cible

ΔCt = 21 – 15 = 6

Si 2 x plus de matrice ?

Quantification relative :

Comparaison de Ct

Ct=16 Ct=26 Cycle

ΔRnt2

Ct=12 Ct=22 Cycle

ΔRnt4

Ct=15 Ct=31 Cycle

ΔRnt7

Ct=16 Ct=32 Cycle

ΔRnT0 = standard

Contrôle endogène Gène cible

Quantification relative :

Comparaison de Ct

Etape 1: normalisation par rapport au contrôle endogène

Ct gène cible – Ct contrôle endogène = ΔCt

Etape 2: normalisation par rapport au standard

ΔCt échantillon - ΔCt standard = ΔΔCt

Etape 3: détermination de la variation du nombre de copie du gène cible

X=2-ΔΔCt

Quantification relative :

Quantification relative des résultats :

64 64

1 1

standard

Aug

men

tatio

n pa

r x

t0

t2

t4

t7

Quantification absolue :

•besoin de courbe standard

• calcul des résultats en nombre de copies

• nécessité de définir :- le nombre de copies présentes dans l’extrait de référence- un gène cible servant de standard.

Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre d’ADN cibles initialement présents

Courbe de calibration : comparer les valeurs de Ct

0

50

100

150

200

250

0 10 20 30 40

Nombre de cycles

Fluo

resc

ence

ém

ise

(UA

)

101106 105 104 103 102

Nom

bre

de c

opie

s (lo

g)

1

2

3

4

5

6

18 23 28 33 38Cycle seuil - Ct

Log N = -0,26 Ct + 10,85R2= 0,998

Ct

Quantification absolue :

Créer une courbe standard avec de l’ADN génomique pour la Q- PCR

1.Identifier la taille du génome de l’organisme d’intéret.

2.Identifier la masse d’ADN dans le génome d’intéret

3.Diviser la masse du génome par le nombre de copies du gène d’interet par génome haploide.

4.Calculer la masse du gène d’intérêt pour avoir de 300 000 à 30 copies.

5.N copies du gène d’intéret× masse du génome haploide= masse de gDNA nécessaire

6.Calculer la concentration de gDNA nècessaire pour atteindre le nombre de copies du gène d’interet. Diviser la masse nécessaire (calculée en 4) par le volume à pipetter pour chaque réaction.

7.Préparer des dilutions successives du gDNA.

Quantification absolue :

Créer une courbe standard avec de l’ADN plasmidique pour la Q- PCR

1. Calculer la masse d’une seule copie du plasmide.

2. Calculer la masse du plasmide pour avoir de 300 000 à 30 copies

3. Calculer la concentration du plasmide nécessaire pour avoir le nombre de copiesnécessaires dans le volume voulu. Diviser la masse nécessaire (calculée en 2) par levolume à pipeter pour chaque réaction

4. Préparer des dilutions successives du plasmide.

Quantification absolue :

0

50

100

150

200

250

0 10 20 30 40

Nom

bre

de c

opie

s (lo

g)

1

2

3

4

5

6

18 23 28 33 38Cycle seuil - Ct

Log N = -0,26 Ct + 10,85R2= 0,998

Nombre de cycles

Fluo

resc

ence

ém

ise

(UA

)

101106 105 104 103 102Ct

Résultat : l’échantillon d’ADN (ex: 25 ng) contient 10000 copies du gène cible

Quantification absolue : interprétation

Quantification absolue :

Courbe standard avec plasmide ou avec gDNA????

Intéret Inconvénient

plasmide •pureté de la séquence : pas d’amplification aspécifique•facilité de mise en oeuvre si présent au laboratoire

•efficacité de la PCR probablement supérieurepar rapport au gène étudié(on sur-estime donc la quantité de gène amplifié)

gDNA •l’efficacité de PCR est identique•le même gDNA peut être utilisé pour l’étude de différents gènes ( seuls les calculs sont à refaire)

•Besoin d’un ADN de bonne qualité (nondégradé)•Variabilité des échantillons biologiques•Besoin de choisir des amorces capable d’amplifier du gDNA

Quantification absolue ou relative ?Que choisir ???

absolute relative

Calcul efficacité oui Oui

Courbe standard oui Non

Gene de réference non oui

méthode Standard curve Comparative Ct

intéret Quantification permet de rendre compte d’unnombre de copies

Permet la comparaison directe entre deux groupes, états, …Coût de revient inférieur à l’absolute

inconvénient Courbe standard à chaque plaque, donc augmentation du coûtProblème de conservation du standard

Le calcul d’éfficacité dePCR du calibrateur et de la cible est indispensable pour ne pas introduire de biais

•Etude de l’expression des gènes : Détermination de niveaux d’expression ARNmKnock-Down de gènes (SiRNA)Validation des expériences de puces à ADN

•Etude des gènes :PolymorphismeMutationsDiagnostic prénatal (anomalies chromosomiques)maladies génétiques Diagnostics en oncologie (charge tumorale)

•Etude de la répression des gènes: ChIPMeDIP

Applications :

SNP= Single Nucléotide Polymorphisms et discrimination allélique

Les Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) désignent despolymorphismes d'une seule paire de base du génome, entre individusd'une même espèce.

Ces variations sont très fréquentes (e.g. 1/1000 paire de bases dans legénome humain).

La discrimination allèlique permet la reconnaissance d’un allèle donnégrâce à une sonde fluorescente spécifique.

Cette technique permet l’établissement de génotypage rapide (lignéeanimaux transgéniques)

Homozygotes allele 1

Homozygotes allele 2

hétérozygotes

SNP= Single Nucléotide Polymorphisms et discrimination allélique

Chaque allèle aura une sonde spécifique :•allèle 1 non muté avec une sonde en FAM•allèle 2 muté avec une sonde en VIC.

La séquence de la sonde sera encadrée par un couple de primers identiques.

microARN

http://microrna.sanger.ac.uk/

•ARN simple-brin longs d'environ 21 à 24 nucléotides• plusieurs centaines de gènes de microARN dans lesgénomes de la plupart des organismes pluricellulaires.•Les miRNA sont des répresseurs post-transcriptionnels :en s'appariant à des ARN messagers, ils guident leurdégradation, ou la répression de leur traduction enprotéine.•Seuls les miRNA matures sont responsables derépression

Sondes microARN matures :

Synthèse de primers de RT spécifiques et Q-PCR pour microARN mature

ChIP

Mise en évidence "in vivo" des facteursde transcription sur leur site de liaisonau niveau des promoteurs desgènes, soit de l'état des histones auniveau des promoteurs.

Le CHIP consiste à purifier descomplexes ADN-protéines, liés par duformaldéhyde.

Cross-link des protéines à l’ADN en fixant les cellules au

formaldehyde

Purification des noyaux etsonication pour fragmenterl’ADN génomique en fragmentsde 200 à 1000 bp pour« mapper » les interactions ADNprotéines

Immunoprécipitationavec un anticorps primaire d’intéret

Collecte du complexe Anticorps- protéine- ADN

immunoprécipité à l’aide de billes couplées à la protéine G

Dépontage des complexes protéine-ADN par incubation à

65°C pour relarguer l’ADN

Analyse de l’ADN purifié par Q-PCR

La méthylation des cytosines peut être responsable de silencing épigénétique, c’est lamodification de l’ADN la plus répandue chez les eucaryotes.

Le MeDIP est une approche par immunoprécipitation de l’ADN méthylé. Le principe est quel’ADN est fragmenté par sonication et immunoprécipité avec un anticorps qui reconnaitspécifiquement la 5mC (5 methylcytidine).

Ce protocole est utilisé pour générer des profils de méthylation de l’ADN à l’échelle du génomechez les mammifères et les plantes, et pour identifier les gènes anormalement méthylés dans lescellules cancéreuses.

MeDIP : Methylated DNA ImmunoPrecipitation

MeDIP Diagénode

Interprétations des résultats du stageEtapes de traitement des données :

Faire la moyenne des Ct des duplicats / triplicats Faire le calcul pour chaque IP :

% input= AE^(Ctinput – CtChIP) x Fd x 100%

Exemple pour le binome 1 ChIP K4me3 sur cellules MLL-/-% input= 1,96^(31,595-30,085)x1/100 x 100 = 2,85%

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1 K4me3 2 K4me3 3 K4me3 4 K27me3 5 K27me3 6 K27me3 7 Mock lapin

8 Mock lapin

9 Mock lapin

binome1

binome2

i+ i- iF

i+ i- iF

i+ i- iF

Bons calculs à tous et merci de votre attention

!!!Calculs ChIP :

% input= AE^(Ctinput – CtChIP) x Fd(only for input) x 100%

Calculs MeDIP :

% (MeDNA-IP/ Total input)= 2^[(Ct(20%input) -3,32) -Ct(MeDNA-IP)]x 100%

Références bibliographiques

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• Dheda K, Huggett JF, Chang JS, Kim LU, Bustin SA, Johnson MA, Rook GA, Zumla A. The implications of using an inappropriate reference gene for real-time reverse

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• Bustin SA, Nolan T. Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. J Biomol Tech. 2004 Sep;15(3):155-66. Review.

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•Weber M, Hellmann I, Stadler MB, Ramos L, Paabo S, Rebhan M, Schubeler D: Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation

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•Reviews in Biology and Biotechnology Vol.2, No 2, December 2002 La PCR en temps réel: principes et applications Elyse Poitras et Alain Houde*

•Creating Standard Curves with Genomic DNA or Plasmid DNA Templates for Use in Quantitative PCR (Doc ABI)

•User Bulletin #5 ABI PRISM®7700 Sequence Detection System August 10, 1998 (updated 01/2001) SUBJECT: Multiplex PCR with TaqMan® VIC Probes