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Contrle microbiologique des aliments Manuel technique. Polytech Dpartement STIA.

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ACADEMIE DE MONTPELLIER UNIVERSITE MONTPELLIER II - SCIENCES ET TECHNIQUES DU LANGUEDOC -----

Dpartement

Sciences et Technologies des Industries Alimentaires

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRECONTROLE MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS

Professeur Jean-Louis CUQ

Contrle microbiologique des aliments Manuel technique. Polytech Dpartement STIA.

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I. GENERALITESCe document contient des informations de basesur lesquelles les Ingnieurs des Industries agroalimentaires que vous serez trs prochainement pourront sappuyer pour crer et/ou utiliser un laboratoire danalyses microbiologiques. Il devrait ainsi vous permettre de raliser les diffrentes analyses et les divers contrles indispensables la matrise de la qualit des produits alimentaires mais aussi de la qualit hyginique de lenvironnement de production et de distribution. A - INTERET DE LA BACTERIOLOGIE ALIMENTAIRE. Le contrle de la qualit microbiologique de nos aliments a t pendant longtemps limit aux contrles des produits finis, le plus souvent par rapport une norme. Ces analyses ont t souvent lapanage de laboratoires spcialiss car il est bien connu que lvaluation de la qualit hyginique de nos denres alimentaires ncessite beaucoup de matriel, un personnel qualifi et reste encore lourde, longue et coteuse. En consquence, cette valuation est encore difficilement applicable un nombre dchantillons reprsentatifs dun lot ou dune production. La matrise de la qualit microbiologique (hyginique obligatoire et marchande souhaite par le fabricant mais aussi le consommateur) passe par un ensemble de dmarches qui vont du contrle des matires premires brutes, en cours de transformation ou de laliment fini, aux pratiques de bonnes fabrications en passant par lidentification des principaux points critiques du systme de production / distribution, le plus souvent par une dmarche HACCP. Ces analyses prennent aujourdhui largement place dans la plupart des usines et des rseaux de distribution et permettent, par la ralisation de contrles judicieux, une bonne valuation de la qualit et une mise en vidence dventuelles contaminations, les actions correctives qui en dcoulent sans pour autant trop alourdir les charges. Dans ce contexte lanalyse microbiologique traditionnelle des produits finis reste encore indispensable car elle permet avec une certaine inertie dviter, dans le cas o des produits dangereux ou non conformes seraient fabriqus, leur commercialisation ou leur consommation. Ce type de contrle souvent pratiqu par des laboratoires officiels (DGCCRF: Direction Gnrale de la Concurrence, de la Consommation et de la Rpression des Fraudes , Laboratoires des Services Vtrinaires, etc.) nest pas prventif et ne permet pas de matriser la qualit microbiologique des produits fabriqus. Utilis seul, il se rvle sans grand intrt et souvent mme inutile si sa mise en uvre est longue et sans suite. Le contrle en cours de production doit permettre de dterminer les points critiques. Il faut donc choisir une mthode danalyse qui permette, aprs interprtation, de ragir sur la fabrication en amont par un vritable feed-back quand un dfaut dorigine microbienne est dtect. On comprend donc lintrt que portent les microbiologistes aux mthodes danalyse rapides ou ultrarapides quand on sait que 24 heures plus de quinze jours sont parfois indispensables pour obtenir des donnes quant la qualit du produit ou de ses drivs. Les mthodes danalyse mises en uvre doivent tre rapides, fiables, reproductibles et si possible simples (et peu coteuses) ; elles consistent en une recherche et/ou une numration des principaux germes microbiens rencontrs dans nos aliments afin den matriser leur prsence ou absence (dans le cas de germes dangereux responsables de maladies infectieuses) et leur nombre (dans le cas de

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germes peu dangereux, contaminants ou htes normaux des matires premires composant la denre). (ne jamais perdre de vue quil faut absolument garantir la scurit des consommateurs en permettant la dtection des microorganismes dangereux ou ventuellement de mtabolites toxiques ou de toxines microbiennes et assurer au produit une bonne qualit et une bonne conservation). Au plan sanitaire la liste des bactries dangereuses responsables de maladies aprs consommation daliments contamins a tendance saccrotre : aux Salmonella diverses, Shigella, Staphylococcus aureus entrotoxinognes et Clostridium perfringens sont venus sajouter Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli entropathognes ou encore des bactries des genres Streptococcus, Listeria, Campylobacter, Yersinia, Brucella etc. Le contrle microbiologique de routine dun produit alimentaire solide ou liquide consiste le plus souvent, en absence dinformation sur lventuelle implication de ce produit une maladie infectieuse, une toxi-infection ou une intoxination, en : - un contrle de strilit pour des produits soumis des traitements antimicrobiens de stabilisation (temprature, additifs, etc.) - une estimation du nombre des contaminants (flore arobie msophile totale, coliformes, anarobies sulfito-rducteurs) ou leur dtection - identification (Salmonella, Listeria etc). Ce contrle est actuellement long (plusieurs jours), ce qui implique souvent : - de stocker le produit en attendant la rponse (impossible pour les produits trs prissables) - de diffuser le produit sans connatre sa qualit bactriologique avec tous les risques que cela comporte. B . LES RISQUES AU LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE Il est clair que les risques lis la manipulation de microorganismes, dont lidentit et le pouvoir pathogne sont souvent inconnus dans les premires tapes de leur analyse doivent tre parfaitement matriss par des pratiques et un environnement sans dfaut. Il faut que le microbiologiste soit toujours conscient des risques lis la manipulation de bactries et un degr moindre de levures et moisissures, en particulier aprs leur amplification ncessaire 9 10 leur tude. Rappelons quune colonie est constitue denviron 10 10 cellules et quune turbidit 8 apprciable dun milieu de culture liquide correspond environ 10 cellules par ml. La matrise du risque microbiologique passe par la parfaite connaissance : - des germes manipuls ou recherchs - des voies de pntration de ces germes dans lorganisme - des meilleures mthodes de manipulation pour minimiser ce risque. Les microorganismes sont classs en 4 groupes en fonction des risques potentiels quils reprsentent. Le groupe 1 comprend des microorganismes peu dangereux pour le microbiologiste et son environnement. Le groupe 2 correspond des germes faisant courir des risques modrs aux manipulateurs et des risques limits la communaut. Le groupe 3 est constitu de microorganismes haut risque pour le manipulateur et risque modr pour la communaut. Le groupe 4 correspond de microorganismes trs dangereux pour le manipulateur et son environnement. Les voies de linfection sont essentiellement : - buccale (ingestion) : pipetage, port la bouche des doigts ou dobjets contamins comme des cigarettes, des stylos, des aliments etc. Ce type de contamination rsulte dun travail aseptique incorrect ou encore de projections, renversements ou actions diverses non contrls. - arienne (trache artre, poumons) par des arosols (particules liquides ou non en suspension dans lair et porteuses de germes). Ces arosols peuvent tre gnrs par des oprations classiques (homognisateur, centrifugeuse, etc.) et leur pouvoir de contamination est trs grand.

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- par contact cutan (Brucella, Staphylococcus ou encore Pseudomonas par exemple) ou au niveau de muqueuses ou dorganes comme les yeux. - par pntration sous-cutane accidentelle (par piqre ou au niveau dune plaie). C - LE LABORATOIRE Le laboratoire danalyse microbiologique doit tre mme de raliser des analyses de routine (contrle de qualit par rapport une norme, valuation de la qualit des matires premires), mais aussi de permettre lvaluation de la qualit des oprations de transformation ou de prparation, la recherche et matrise des ventuels points critiques (HACCP), lvaluation de lefficacit des traitements antimicrobiens de conservation, demballage ou de nettoyage etc. Les microorganismes susceptibles dtre rencontrs appartiennent pour la plupart aux groupes 1, 2 et ventuellement 3. Ceci impose donc des rgles fondamentales de conception et de fonctionnement du laboratoire danalyse microbiologique. Le laboratoire doit tre compos de trois parties principales : - le laboratoire proprement dit o sont ralises les analyses - la salle de prparation des milieux de culture - la laverie qui traite les produits et matriels utiliss pour lanalyse et qui fournit la verrerie et le matriel propre et strile. La laverie et la salle de prparation peuvent ne constituer quune seule pice.Echantillonnage prlvement Matriel usage unique Ensemencement Etuvage

Echantillons analyser

LABORATOIRE Salle de manipulations

Lecture

matriels contamins Stockage des milieux et matriels striles

Verrerie sale non contamine

Autoclavage (121 , 20 mn) C

Lavage

strilisation - autoclave - filtration

prparation des milieux

Cotonnage Dchet poubelle

Strilisation four Pasteur (180 10 60 mn) c,

Le laboratoire danalyse doit disposer : - dun espace suffisant avec une circulation limite. Deux ou trois parties sont souhaitables mais non ncessaires. - de murs, plafonds et sol dsinfecter. lisses mais non glissants, non absorbants, faciles nettoyer et

- dun clairage naturel ou artificiel de bonne qualit. Les fentres coulissantes avec montants aluminium quipes de volets roulants conviennent bien.

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- de plans de travail lisses et rsistants. - de lampes UV disposes au plafond et quipes dune minuterie au moins dans la salle de travail. Le plan prsent sur la figure 1 est une proposition type de conception du laboratoire. Il ne faut pas perdre de vue que le bon fonctionnement du laboratoire requiert, en particulier aux niveaux des manipulations, des personnels qualifis. Propret et rgles dhygine strictes doivent y rgner.documentation bibliographie bain-marie viers four Pasteur rangements produits divers viers tagres paillasses

bureaux frigo

lave-vaisselle

autoclave prparation de milieux tuves 25 -30 (37)-44 C hottes flux laminaires

souchier

figure 1 . Schma type dun laboratoire danalyse microbiologique

D. MATERIEL MICROBIOLOGIQUE

DEQUIPEMENT

DU

LABORATOIRE

DANALYSE

Lquipement dun laboratoire de microbiologie alimentaire diffre peu de celui dun laboratoire de bactriologie mdicale. Il faut disposer ainsi dune rserve de produits chimiques les plus courants et de milieux ou de composants de milieux de culture (deshydrats si possible) et de colorants. En microbiologie alimentaire, la frquence des tudes quantitatives et qualitatives et leur varit font quil est ncessaire de disposer dun nombre lev de milieux de culture et de matriels divers (tubes essai, erlenmeyers, botes de Ptri, pipettes, etc). Il est indispensable de disposer dun certain nombre dquipements et de matriels tels que : D . 1 . Systmes de strilisation / dsinfection et zones striles: 1) Lautoclave vertical ou horizontal pour la strilisation en milieu vapeur des milieux, des dchets est indispensable. La strilisation est gnralement ralise 115 ou 120 C pendant 10 30 minutes. 2) Le four Pasteur permet la strilisation sec du matriel en verre ou en mtal et doit pouvoir atteindre une temprature de 170 - 180C. 3) Les systme de micro ou ultra filtration membrane sont utiliss pour les milieux de culture liquides non autoclavables et pour lanalyse e liquides (eau par exemple).

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4) Les lampes UV germicides munies dune minuterie et installes dans la pice principale de manipulation ainsi que dans les hottes flux laminaires. Leur effet sur un germe donn est fonction de la puissance de la lampe, de la longueur donde du rayonnement UV, de la distance et du temps dirradiation. Elles sont efficaces sur les zones claires . Il est essentiel de se protger vis--vis dune exposition directe, la muqueuse oculaire tant particulirement sensible. 5) Les rcipients contenant par exemple de lhypochlorite de sodium pour recueillir les matriels souills tels que lames tats frais, les pipettes, les cnes usage unique etc. La rcupration des milieux contamins aprs lecture peut se faire dans des sacs en polypropylne qui ne seront limins quaprs autoclavage. 6) Les zones de travail sont situes dans la zone de protection de becs Bunsen avec dclenchement par bouton pied et/ou dans des hottes flux laminaires qui selon leur fonctionnement protgent avec efficacit soit le produit (figure 2), soit loprateur (figure 3), soit les deux (figure 4), ces hottes tant classes en trois catgories en fonction de leur fonctionnement. Elles sont utilises pour la distribution aseptique des milieux et le remplissage de botes de Ptri. Un flux dair strilis par filtration est dirig sur la zone de travail soit horizontalement, soit verticalement avec ou non un recyclage. Il ne sagit pas de zones de scurit et les hottes de classe I ne peuvent pas tre employes seules pour les manipulations des microorganismes ; dans ce cas, le travail strile est ralis dans la zone de protection dun bec de gaz, ce dernier prsentant nanmoins linconvnient de perturber le flux dair dans le systme. lampe UV lumire HOTTES DE CLASSE I Protection du produitturbine

filtre polyamide d' efficacit de rtention de 90 % pour des particules de d> 5 m filtre absolu d' efficacit de rtention de 99,999 % pour des particules de d > 0,3 mfigure 2 . Hottes flux laminaire horizontal de classe I avec protection du produit

HOTTES A FLUX LAMINAIRE horizontal de classe I Protrection du manipulateur pas du produit

figure 3 . Hottes flux laminaire horizontal de classe I avec protection du manipulateur

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HOTTE DE CLASSE II flux vertical Protection du produit et du manipulateur

figure 4 . Hotte flux laminaire vertical de classe II avec protection du manipulateur et du produit

Les hottes de classe III protgent avec une trs grande efficacit produit et manipulateur mais restent dune utilisation difficile. Il sagit en fait de botes gants tanches et striles (figure 5).

HOTTE DE CLASSE III

igure 5. Hotte flux laminaire de classe III

Dans ces hottes la vitesse linaire de lair est voisine de 0,25 1 m.sec-1. La dcontamination de ces hottes doit tre effectue quotidiennement (surface de travail et cts). Le formol est certainement le meilleur dsinfectant car il assure la strilisation la plus homogne; les phnols laissent des rsidus, et lhypochlorite est trs corrosif. Ltanchit de la hotte doit tre contrle ainsi que lintgralit du filtre strilisant HEPA. Si ce dernier filtre doit tre chang, il faut le faire aseptiquement et placer immdiatement le filtre dans un emballage en polypropylne tanche. Fabrication du formol Le formol peut tre gnr par bullition dune solution de formaldhyde 40 %. Sa concentration -3 dsinfectante optimale est de 50 mg.m qui sont par exemple obtenus par bullition de 25 ml de formol 40 % dans une hotte de 0,35 m3.Le formol peut aussi tre gnr partir du chauffage sec de paraformaldhyde (3 g par hotte) ou par addition de 6 g de permangante de potassium 25 ml de formol 40 % temprature ambiante. Il est galement possible de gnrer la quantit de formol ncessaire la strilisation de la hotte par mlange de 4 g de paraformaldhyde, 8 g de permanganate de potassium et 10 ml deau. La dure de ce type de traitement doit tre dune dizaine dheures et le systme de ventilation mis en marche au moins une demi-heure avant rutilisation.

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D . 2 . Matriels dincubation et de prparation des milieux Il faut disposer dtuves bactriologiques qui doivent pouvoir tre rgles avec prcision entre 25 et 55C. Trois tempratures dtuvage sont gnralement utilises en microbiologie alimentaire. Deux jarres anarobies et leur ncessaire de contrle de latmosphre (catalyseur, gnrateur dhydrogne et de gaz carbonique, indicateur au bleu de mthylne) sont indispensables ltude des germes anarobies stricts. Deux bains-marie sont ncessaires pour rgnrer les milieux de culture (100C) et les maintenir en surfusion (45 47 C). Une diminution de lmission de vapeur deau est obtenue par recouvrement de la surface par des petits morceaux de polystyrne. Un four microondes permet de rduire la dure des traitements thermiques des milieux (prparation chaud, rgnration). Deux balances (porte 1 2 kg au 1/10 de g et porte denviron 200 g au 1/10 de mg) sont indispensables la prparation des milieux et de lchantillon. Il faut toujours disposer de nombreux tubes essai en verre de 16 x 160 ou 18 x 180 mm (rutilisables aprs lavage et bouchs au coton card ou avec des bouchons thermostables en polypropylne) ou des tubes en polycarbonate striles et usage unique (tubes hmolyse) et de rcipients de volumes varis et strilisables (flacons, erlenmeyers, bchers etc). Des pipettes striles usage unique, et des systmes de pipetage automatiques cnes strilisables en propylne et usage unique sont Un agitateur magntique chauffant (barreaux tflons) et une seringue de Cornwall rpartiteur volumtrique sont ncessaires la prparation est la distribution des milieux. D . 3 . Prparation des chantillons et culture microbienne Les chantillons sont amens au laboratoire dans leur emballage dorigine sil sagit de produits finis ou dans des flacons ou rcipients striles sil sagit de produits en vrac ou de prlvements. Il faut parfois disposer de matriels permettant le prlvement daliments dans des emballages solides (poinons, ouvre-botes) ou encore de matriels indispensables au prlvement daliments solides ( cautrisateurs, pipettes harpons, etc). Le premier traitement auquel sont soumis la plupart des produits consiste, aprs prlvement dune partie aliquote, en une homognisation . Celle-ci est ralise au moyen de mortiers ou par des broyeurs couteaux (Virtis par exemple) ou des appareils de Potter ou encore par un Stomacher (figure 6). Cette opration doit permettre la mise en suspension homogne des microorganismes prsents sur ou dans le produit analys en vitant cependant toute contamination externe ou une inactivation des germes par des conditions trop drastiques (ultra turrax avec chauffement par exemple). Une centrifugeuse atteignant 3 4000 g permet, en peu de temps, de dcanter les microorganismes prsents dans les liquides. Des tubes bouchs sont indispensables pour viter la contamination arienne. Un vortex permet dhomogniser les suspensions bactriennes prsentes dans les tubes, en particulier au moment des dilutions ou des prlvements. Avec cet appareillage, il faut engendrer un nud de vibration entre pouce et index une hauteur du tube qui est en dessous du niveau du coton card. ou un

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mortier et pilon

Broyeur de POTTER

broyeur type VIRTIS

homognisateur type Stomacher

figure 6 . Schma des divers systmes de broyage / homognisation

Un trs grand nombre matriels usage unique (si possible) comme des botes de Ptri en polycarbonate de 90 mm de diamtre ou plus, de tubes essai et hmolyse, des pipettes gradues striles (1 et 10 ml) ou de pipettes automatiques (de 0,1 ou 1 ml) cnes en polypropylne strilisables, des pipettes Pasteur, des cannes de verre, des anses de platine etc. Un ensemenseur spiral et un compteur de colonies laser ou par analyse dimage ne simposent que si le nombre danalyses raliser quotidiennement est lev. Pour faciliter la numration des colonies dans les botes de Ptri il est possible dutiliser un systme du type stylo-compteur. Un systme complet de filtration doit faire partie intgrante de lquipement de base du laboratoire. D . 4 . Microscopie Bien que non prioritaire parmi les quipements, le microscope et son environnement de lames, lamelles, colorants et ractifs divers, constitue un outil important du laboratoire danalyse microbiologique. Pour un agrment dutilisation avec un minimum de fatigue et une meilleure image il est souhaitable dadopter les systmes binoculaires. De nombreux fabricants proposent un choix important de tels quipements; il faut veiller la qualit des optiques, mais aussi de la partie mcanique de lappareil. Les oculaires x10 sont les plus communs et il faut disposer dobjectifs x10, x 40 sec et x100 immersion. Lentretien des parties optiques du microscope doit tre ralis avec soin (xylne et papier joseph); il est aussi ncessaire de vrifier priodiquement le centrage de la lampe avant le condenseur. Pour lanalyse en DEFT, il faut disposer dun microscope adapt (pifluorescence). Lvolution des techniques immuno-microbiologiques avec dtection de marquage par anticorps fluorescents requiert galement des appareils adapts. Les microscopes quips de platines motoriss et dune camro vido permettant la saisie et le traitement des images (au moyen de logiciels de plus en plus perfectionns et accessibles); ils constitueront un outil performant dans la mesure ou lautomatisation et le traitement de limage seront simples et performants. Les ractifs colorants les plus utiliss sont ceux qui permettent la coloration de Gram (thanol, violet de gentiane, lugol, fuchsine) ou des colorations simples (bleu de mthylne phniqu). Ces ractifs sont disponibles prts lutilisation chez bon nombre de fournisseurs de produits. Veiller

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ne pas colorer la peau (doigts en particulier), certains de ces colorants ragissant avec les protines ou les acides nucliques. La prsence dune loupe binoculaire (x 100 par exemple) permet, entre autre, de bien caractriser les colonies. E . TECHNIQUES GENERALES Leau les matires premires et bon nombre de denres alimentaires ne sont pas, quelques exceptions prs comme le lait strilis, les conserves par exemple, des produits striles. La qualit marchande des produits dpend beaucoup du contrle de la flore prsente par des moyens physiques (temprature, pH, activit de leau par exemple) ou chimiques (additifs effets antimicrobiens) et par des rgles de bonne fabrication. Le microbiological guideline comporte en effet des rgles appliquer avant, pendant et en fin de prparation, pour la distribution et le stokage; ces recommandations sont fondes sur le respect de bonnes pratiques professionnelles (BPP). Les diverses tapes de ces BPP se situent au niveau des ateliers (construction, matriels et machines, outillages, facilit de nettoyage etc.), de la qualit microbiologique des matires premires et de leau , du personnel au niveau de son comportement et de son ducation hyginiques, de la pertinence et de lefficacit des traitements antimicrobiens appliqus aux produits ou aux systmes potentiellement dangereux et enfin de la mise en place dun ensemble de conditions de distribution les plus favorables au maintien de la qualit. Les spcifications microbiologiques sont des critres applicables pendant et aprs la prparation afin de sassurer que lhygine et les conditions de production sont satisfaisantes et en accord avec la rglementation. Les parties prenantes dun march y trouveront des garanties. Les normes sont des spcifications microbiologiques adoptes par la lgislation qui sadressent au produit fini et fixent les limites acceptables de prsence de microorganismes donns dans des produits bien dfinis. Il existe actuellement de nombreux organismes nationaux ou internationaux (OMS, FAO, ISO, ICMSF, CEE, AFNOR, CNERNA , DGCCRF, services vtrinaires, etc.) qui se proccupent de ltablissement de critres de qualit microbiologique de nos aliments. La qualit hyginique dpend surtout de la nature mais aussi souvent du nombre de la flore microbienne prsente dans le produit. Si cette flore est compose de microorganismes susceptibles dengendrer des maladies aprs consommation (maladies infectieuses, toxi-infections, intoxinations ) le produit est dangereux et ne doit en aucun cas tre commercialis. Il appartient alors au microbiologiste de dtecter le ou les points critiques affectant cette qualit hyginique pour laquelle la norme zro dfaut doit tre un objectif prioritaire de lensemble du systme de production. En bactriologie alimentaire il nest donc pas ncessaire de rechercher, de compter et didentifier systmatiquement toutes les bactries, levures et moisissures prsentes dans le produit. Il suffit souvent deffectuer : 1) une tude quantitative de la flore microbienne : - soit par dnombrement dune flore microbienne donne caractrise par un ensemble de proprits physiologiques communes comme par exemple numration de la flore arobie msophile revivifiable sur un milieu du type glose nutritive ordinaire (germes htrotrophes peu exigeants, msophiles si la temprature dincubation est voisine de 30C avec une dure dincubation gnralement infrieure 72 heures, neutrophiles si le pH est voisine de 7, arobie ou aro-anarobie si lincubation est ralise lair), la numration des levures et moisissures confondues (germes acidophiles, arobies pour la plupart, msophiles bas etc.), la numration des

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anarobies sulfito-rducteurs (germes htrotrophes, rduisant les sulfites en sulfure dhydrogne, msophiles, anarobies stricts). La prsence de bactries dorigine fcale ou tellurique tmoigne dans nos aliments dun manque dhygine et dun dfaut de rigueur technique et peut laisser craindre la prsence concomittante dans le produit de bactries entropathognes en nombre difficilement dtectable ou aprs un temps danalyse important. - soit par dnombrement dun groupe bactrien pouvant correspondre une contamination dtermine: coliformes thermotolrants et/ou streptocoques du groupe D pour la mise en vidence dune contamination dorigine., staphylocoques pour la mise en vidence dune contamination dorigine cutane, germes indolognes, germes putrides , etc... 2) une recherche oriente de certaines bactries pathognes telles que Salmonella, Staphylococcus, Shigella, Mycobacterium, Listeria, Brucella, Campylobacter, Yersinia , etc.... Cette recherche exige lutilisation de mthodes spcifiques hautement slectives. Le plus souvent, ces analyses ne diffrent dun produit alimentaire un autre que par certains dtails dexcution. Parmi les analyses communes tous (ou presque tous) les produits alimentaires on peut citer par exemple les numrations des coliformes ou de la flore totale. La bonne qualit microbiologique (hyginique et marchande) est donc fonction de trs nombreux facteurs ; le microbiologiste se doit nanmoins de dfinir le plus rapidement possible la notion quantitative et qualitative de flore normale de son produit ou de ses matires premires (microorganismes habituelset tolrables), et dune flore contaminante dont le seuil de tolrance sera dfini en fonction du risque que fait courir cette flore un type donn de consommateur. E . 1 . Prlvements Les modalits des prlvements ont fait lobjet dun arrt publi au J.O. du 19 janvier 1980. Trs schmatiquement, la taille de lchantillon dun produit de mme nature rparti en portions unitaires doit tre au moins de 5 units (lieu de fabrication ou de distribution), de 5 units pour les conserves. Le laboratoire doir disposer denviron 500 g de produits, soit 5 fois 100 g, ces 100 g pouvant tre fournis par une ou plusieurs pices. Si le prlvement de 5 chantillons savre trop lev par rapport la production il est procd un talement dans le temps des prlvements. Ces prlvements doivent avant tout respecter des rgles daseptie et de reprsentativit. La prise dessai destine la prparation de la suspension mre et de ses dilutions doit correspondre aux parties superficielles et profondes notamment pour les produits en tranche, hachs, diviss et les plats cuisins par exemple. Pour les produits liquides elle est effectue sur le produit homognis ou sur les parties superficielles et profondes. Dans le cas dexamens microbiologiques faisant suite une maladie de type TIA il faut rechercher les germes dangereux (pathognes, toxinognes) et leurs toxines aussi bien dans les prlvements de surface que dans la masse. Il faut tenir compte, pour un produit donn, des disparits possibles de fabrication et des disparits qui existent au niveau des rsultats fournis par le laboratoire (il est gnralement admis que la variabilit atteint une puissance de 10 ou mme plus ce niveau) . E - 1 - a . Echantillonnage Il sagit l dune tape fondamentale souvent dlicate. Les ouvrages consacrs lchantillonnage sont nombreux et des rgles prcises par produit ou milieu ont t dicts par lAFNOR et la DGCCRF; si les chantillons ne sont pas correctement prlevs et manipuls ou ne sont pas reprsentatifs dun lot ou dune production, les rsultats danalyse nauront aucune signification.

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Un chantillonnage reprsentatif est essentiel quand lanalyse a pour but de dtecter la prsence de germes pathognes ou de toxines qui peuvent tre distribus de faon htrognes dans laliment ou quand la commercialisation dun produit dpend de la qualit microbiologique en relation avec les normes imposes par la lgislation. 1) Mthode dchantillonnage prconise par lICMSF (Internation Commission on Microbiological Specifications for Foods) La Commission Internationale des Normes Microbiologiques relatives aux denres alimentaires a dfini des mthodes dchantillonnage pour lanalyse systmatique des produits alimentaires. Le principe de base est le suivant : un chantillon analys donne des rsultats non satisfaisants sil renferme des microorganismes dangereux ou sil contient des germes en nombre suprieur une limite au-del de laquelle il devient potentiellement dangereux. Dans cette mthode le symbole m reprsente la limite permettant de rpartir les chantillons en 2 groupes: les acceptables (valeur m) et les inacceptables (valeur m). Pour certains microorganismes dangereux m peut tre gal 0. Quand un microorganisme donn est tolr dans un aliment 3 catgories dchantillons sont dfinies : - catgorie 1 (acceptables sans rserve) - catgorie 2 (acceptables mais avec une limite) - catgorie 3 (inacceptables). m spare la 1re et la 2me catgories et M la 2me et la 3me (figure 7).m1

M3

rpartition des chantillons

4

2

acceptables(satisfaisants)

acceptables(selon le nombre)

inacceptables(non satisfaisants)

figure 7. Distribution des chantillons daprs lICMSF

Il existe deux types de plan dchantillonnage qui sont applicables des systmes aliments - germes - consommateurs bien identifis. - Plan dchantillonnage 2 classes Ce plan donne des rsultats permettant de dterminer 2 classes de contaminations. Ce type de plan naccepte aucune tolrance et correspond le plus souvent aux conclusions : absence dans (le rsultat est bon et le produit jug satisfaisant) ou encore prsence dans (le rsultat est mauvais et le produit est dclar impropre la consommation). Avec un plan dchantillonnage 2 classes (catgories 1, 3), n reprsente le nombre dchantillons examins. Il existe deux possibilits pour ce type de plan : - utiliser la notion de prsence ou absence

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- dterminer la tolrance ou non des numrations suprieures la valeur critique m Le symbole c reprsente le nombre dchantillons tolrs au-del de la valeur seuil, nombre qui permet de juger le lot comme satisfaisant. Exemple : Pour les viandes de volailles contamines en surface par Salmonella m=0 n=5 c=1 Pour la plupart des autres produits on a avec cette bactrie et dautres microorganismes trs dangereux (Listeria, Brucella , etc ) m = 0, n = 5 et c = 0. Pour les viandes de boucherie conditionnes sous vide ou non, rfrigres ou congeles on a pour la Flore Arobie Msophile m = 5.104 n=5 c=0 La rigueur du plan dpend des valeurs de n et de c. Plus grand est n pour une valeur donne de c, meilleure sera la qualit des lots accepts. A linverse, si pour une valeur donne de n, c augmente, la rigueur du plan diminue. - Plan dchantillonnage 3 classes Ce plan est bas sur la reconnaissance de 3 catgories dchantillons en fonction de leur niveau et nature de contamination : celle infrieure ou gale m, celle comprise entre m et le seuil M, celle suprieure M. La valeur S constitue le seuil de toxicit. Avec un plan dchantillonnage 3 classes (catgories 1, 2, 3), les symboles n et c ont la mme signification mais il existe pour c un facteur de prcision supplmentaire qui est le nombre dchantillons tolrs dont les charges microbiennes sont comprises entre m et M. La prsence dchantillons entre m et M nest pas souhaitable mais tolre. Pour les valeurs suprieures M les lots ne peuvent pas tre accepts pour la commercialisation en ltat. Ce plan 3 classes permet de dterminer par des calculs appropris la probabilit selon laquelle un lot sera accept ou refus en fonction du nombre dchantillons dfectueux quil contient. Sil ny a pas dchantillon avec une valeur suprieure M on est ramen au plan 2 classes. Le plan est choisi en fonction de lestimation du risque pour la sant et du mode dutilisation de laliment. Les germes sont classs en fonction du risque quils font courir au consommateur en : - germes entranant un risque svre (Clostridium botulinum, Salmonella typhi, S. paratyphi, Shigella dysenteriae, Vibrio comma , Brucella melitensis, Listeria monocytogenes , Clostridium perfringens type C, virus de lhpatite A). - germes entranant un risque moyen avec possibilit de large diffusion (Staphylocoques entrotoxinognes,Salmonella typhimurium et les autres srotypes, autres Shigella, Vibrio parahaemolyticus , Escherichia coli entropathognes, Streptocoques b hmolytiques). - germes entranant un risque moyen sans grande diffusion (Bacillus cereus, Brucella abortus, Clostridium perfringens,Salmonella arizonae, Francisella tularensis,Yersinia enterocolitica, Pseudomonas aeruginosa , Campylobacter jejuni , etc...). Choix du plan : le plan 3 classes est le plus souvent adopt; la valeur de m est dtermine par les rsultats de lanalyse de nombreux chantillons sur des lots jugs satisfaisants. La valeur de M est plus difficile fixer et est fonction du produit, de la bactrie recherche et de la mthode employe.

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Les valeurs de n et c sont choisies en fonction du niveau souhait dacceptabilit ou de rejet des lots. Il est vident que plus n sera grand et plus c sera petit et meilleur sera le contrle ralis (tableau I).conditions prvisibles de manipulation et de consommation aprs chantillonnage , dans les conditions normales d' emploi

utilit ou risque

rduction du risque

pas d' influence sur le risquecas n2 3 classes n = 5 c = 2 cas n5 3 classes n = 5 c = 2 cas n8 3 classes n = 5 c = 1 cas n11 2 classes n = 10 c = 0

augmentation du risquecas n3 3 classes n = 5 c = 1 cas n 6 3 classes n = 5 c = 1 cas n9 3 classes n = 10 c = 1 cas n 12 2 classes n = 20 c = 0

pas de risque direct pour la cas n1 sant. Utilit : vie commerciale 3 classes n = 5 c = 3

risque pour la sant

faible , indirect moyen , direct diffusion limite moyen , direct large diffusion possible svre , direct

cas n4 3 classes n = 5 c = 3 cas n7 3 classes n = 5 c = 2 cas n 10 2 classes n = 5 c = 0 cas n13 2 classes n = 15 c = 0

cas n 14 cas n 15 2 classes n = 30 c = 0 2 classes n = 60 c = 0

tableau I. Choix des valeurs de n et c et du type de plan en fonction des risques sur la sant et les modalits dutilisation du produit

Exemple dapplication : contrle de labsence de Salmonella dans des laits en poudre (cf aussi p. 14). Les caractristiques de risque produit sont classes en : a) produits contenant des ingrdients suspects b) pas dapplication au produit de traitements antimicrobiens efficaces sur le germe considr c) possibilit de croissance en cas derreur (composition du produit, pH, temprature, aeau etc.) A partir de ces caractristiques 5 catgories daliments sont dterminables: Catgorie I : aliments destins aux enfants sujets malades ou dficients, vieillards Catgorie II : aliments comportant les 3 catgories de risque Catgorie III : aliments comportant 2 catgories de risque Catgorie IV : aliments comportant 1 catgorie de risque Catgorie V : aliment ne comportant aucune caractristique de risque Il est alors possible de dfinir un plan dacceptation bas sur lanalyse dchantillons unitaires de 25 grammes et sur les cas n 13, 14 et 15 (tableau I). Ce plan drastique est mis en uvre pour le contrle de ce type de produit destin lexportation aux USA (tableau II).catgorie du produit nombre d' units testes pas plus de 0 positif 1 positif 60 ( 1500 g) 30 ( 750 g ) 15 (375 g) 95 ( 2375 g) 48 ( 1200 g) 24 (600 g) signification : probabilit 95 %qu' n' ait pas plus de 1 il y Salmonella dans 500 g 250 g 125 g

I II III , IV , V

tableau II . Plan dchantillonnage pour Salmonella dans du lait en poudre

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RESUME DUTILISATION DUN PLAN A TROIS CLASSESVALEURS NUMERIQUES DES CRITERES D' PLAN A TROIS CLASSES UN m : fix par dcret ( surtout fonction du germe , du consommateur type et de l' aliment) tous les rsultats gaux ou infrieurs m sont considrs comme satisfaisants M : seuil limite au-del duquel les rsultats ne sont pas considrs satisfaisants sans que le produit soit dangereux . Les valeurs de M sont fixes : M = 10 m quand les dnombrements sont raliss en milieux solides M = 30 m pour des numrations en milieu liquide n : nombre d' units composant l' chantillon c : nombre d' units de l' chantillon donnant des valeurs entre m et M QUALITE DU LOT satisfaisante ou acceptable : aucun rsultat ne dpasse M satisfaisante : les valeurs dtermines sont infrieures : 3 m lors de numrations en milieu solide 10 m lors d' emploi de milieu liquide acceptable : les valeurs dtermines cont comprises entre : 3 m et 10 m en milieu solide 10 m et 30 m en milieu liquide avec c / n 2,5 (avec le plan n = 5 et c = 2) non satisfaisant : des valeurs suprieures M sont observes ou avec c / n > 2,5

Exemples de plan dchantillonnage 3 classesALIMENT cacao chocolat oeufs lait en poudre crme glace BACTERIE n 10 10 10 5 5 5 10 5 5 c 0 0 0 1 3 1 2 2 2 m 0 0 0 5.104 5.104 10 2 5.102 102 M 0 0 0 7,5.104 105 50 10 1,5.103 103

Salmonella Salmonella Salmonella flore arobie msophile flore arobie msophile coliformes eau minrale coliformes fromage (past.) coliformes Staphylococcus

2) Cas particulier des conserves

Les conserves doivent satisfaire des preuves permettant de vrifier leur stabilit / strilit. Ces preuves consistent en deux tuvages de 5 chantillons 37C pendant 7 jours (ou 30C pendant 10 jours) et 55C pendant 7 jours. A lissu de ces preuves on observe lventuel bombage ou fuitage (il faut aussi que le pH entre les units tuves et les units tmoins ne dpasse pas 0,5).

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Par microscopie (aprs talement dun volume donn voisin de 10 l de produit puis fixation et coloration au bleu de mthylne par exemple) on compte sur 20 champs le nombre de germes respectivement observs partir de la bote incube (n) et de la bote tmoin (n). n / n doit tre infrieur 100.3) Mthode dchantillonnage pour rechercher un nombre peu lev de micro-organismes

On peut dterminer le nombre dchantillons analyser dans un lot en fonction du degr de sret recherch log ( 1 - p ) n= log ( 1 - d) p est la probabilit de dceler le micro-organisme (en gnral p = 0,95) d est le pourcentage de dfauts admis pour le lot entier (souvent infrieur 0,05). On peut galement raliser un chantillonnage satisfaisant au point de vue statistique avec n = N dans laquelle n est le nombre dchantillon analyser et N le nombre total de divisions du produit analyser. Cependant cette mthode conduit souvent un nombre trop lev danalyses, en particulier quand n est suprieur 10.4) Choix des chantillons- au hasard (tables de nombres) - on calcule N/n = a et on prlve la aime et ainsi de suite - on calcule n = b et on prlve le bime, puis le (b - 1)ime et ainsi de suite.

E - 1 - b. frquence des prlvementsLchantillonnage doit tre rparti dans le temps, et ce, en fonction du niveau de production et des risques de contamination.

E - 1 - c. Conditions du prlvementLes conditions essentielles respecter pour le prlvement sont dabord le respect des rgles dasepsie (travail correct du microbiologiste) et la non modification des flores prsentes dans le produit. Dans la mesure du possible, les chantillons du produit analyser doivent tre amens au laboratoire dans leur conditionnement dorigine, ce qui vite certaines contaminations. Si le produit se prsente sous forme de grands volumes (rservoirs lait etc...) sassurer de la bonne homognit de la rpartition des micro-organismes ; une partie reprsentative du produit sera prleve strilement. Il est parfois ncessaire de raliser des prlvements divers niveaux de laliment (surface, profondeur dun aliment solide) ou aprs broyage et homognisation. Les manipulations effectues au cours du prlvement ne doivent en aucun cas tre lorigine dune contamination : ncessit dutiliser des instruments striles et de travailler strilement. Certains instruments doivent tre striliss sur les lieux du prlvement. Le trempage dans lalcool et le flambage sont parfois insuffisants car la temprature atteinte nest pas assez leve. Il est ncessaire dutiliser des flacons propres, secs, tanches, col large striliss au four Pasteur (160C - 10 mn) ou par autoclavage 121C pendant 30 min ou encore usage unique et striles ; leur taille doit tre adapte au volume de lchantillon. Les rcipients peuvent tre en verre, en mtal ou

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en matire plastique (polythylne, polycarbonate, polypropylne); dans ce dernier cas il sagit de rcipients usage unique dont la strilisation est obtenue froid (radiations ou ). Dans tous les cas les rcipients de prlvement doivent possder un systme de fermeture hermtique. Le prlvement dun produit non emball doit tre ralis dans la zone de strilit dun bec bunsen ou dun systme quivalent.

1) Prlvement en surface- Ecouvillonnage

Un couvillon de coton hydrophile est immerg dans une solution strile de Ringer au 1/4 ou dans un bouillon tryptone-sel additionn de Tween (0,5/). Le prlvement est effectu par frottement sur la surface du produit ; lcouvillon est alors immerg dans 10 ml de Ringer au 1/4 ou 10 ml de bouillon tryptone-sel. Lanalyse est ralise partir de la suspension ainsi obtenue. - Rinage: cette mthode est utilise dans le cas de rcipients ou de tuyauteries; un volume connu de solution strile est introduit dans le matriel analyser. Aprs agitation, le liquide est rcupr et soumis lanalyse. - Mthode des empreintes : un ruban adhsif pralablement strilis par les UV est appliqu sur la surface tudier. Aprs quelques secondes de contact il est retir et appliqu sur la surface dun milieu glos appropri. Aprs quelques heures de contact la temprature dincubation dsire il est retir et la bote est incube jusqu apparition des colonies. - Mthode du cylindre : un cylindre creux de section connue est appliqu sur la surface analyser; on y introduit alors quelques ml de diluant strile et aprs quelques secondes de contact, le diluant est retir et analys.

2) Prlvement de produits liquidesLa technique varie avec le produit, le volume et la forme du contenant. Il faut nanmoins toujours sassurer de la parfaite homognisation du liquide (agitateurs) avant de prlever la pipette (ou avec un flacon lest strile ou autre) le volume ncessaire lanalyse.

3) Prlvement de produits solidesSelon le produit, le prlvement sera effectu au scalpel, la sonde (fromages et produits mous) ou la pipette harpon. La surface est souvent limine avant de procder au prlvement. Si le produit est htrogne (plats cuisins, conserves etc.) il faut sassurer de la bonne reprsentativit du prlvement.

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E . 2. Traitement de lchantillon E - 2 - a. Transfert de lchantillon au laboratoireQuand le prlvement aseptique a t ralis il faut identifier immdiatement le produit avec une tiquette ou une rfrence. Il est souhaitable de ne pas utiliser de crayons feutres sur des films plastiques (PVC) car lencre peut pntrer et perturber lanalyse. Noter la temprature initiale, lheure du prlvement, la date et la temprature de transport. Amener alors les chantillons le plus rapidement possible au laboratoire en maintenant les conditions initiales dans lesquelles se trouvait le produit. Lanalyse devrait tre ralise dans lheure qui suit le prlvement. Ds rception au laboratoire lchantillon accompagn de sa fiche signaltique est enregistr (nature, date, heure, provenance du prlvement, nom du prleveur, analyses demandes, autres indications utiles). Si lchantillon doit tre transport il faut rduire au maximum le dlai avant lanalyse. Il est souvent ncessaire de rfrigrer (mais non congeler) le produit au cours de son transport; certains germes fragiles peuvent disparatre au cours de cette rfrigration. Si un produit est dshydrat ou en conserve il ne doit pas tre rfrigr. Pour un produit congel sassurer quil ny ait pas de dconglation pendant le transport (ce produit peur tre gard pendant 1 mois avant dtre analys). Les dispositions relatives lanalyse des produits congels sont indiques dans le JO du 19 janvier 1980. La conglation dun produit provoque une diminution plus ou moins importante du nombre de germes quil contient. Il faut veiller ce que la temprature du produit prlev soit au moins gale -18C, transporter le produit cette temprature et dcongeler lair ambiant temprature voisine de 20C pendant un temps infrieur 3 heures, temps suffisant pour atteindre une texture qui permette le prlvement.

E - 2 - b. Prparation de lchantillonQuelle que soit la nature initiale du produit, lanalyse microbiologique seffectue toujours partir dune suspension. Aprs ouverture aseptique, lchantillon sera homognis (liquide) ou broy dans un volume connu de diluant strile (solide) ce qui constitue en fait la premire dilution. Pour les produits liquides (ou semi-liquides) une agitation manuelle vigoureuse en prsence de billes de verre permet dobtenir une homognit satisfaisante. Pour les produits solides diverses techniques de broyage sont utilisables : 1) broyage manuel au Potter ou en en prsence de sable strile ou de billes de verre (mortier) 2) broyage mcanique - avec un broyeur lectrique couteaux de type VIRTIS . Au cours du broyage les germes doivent tre disperss mais non dtruits; la temprature ne doit pas trop slever (le rcipient peut tre plac dans de la glace). Le broyage seffectue en gnral avec 10 volumes (ou 9) de diluant pour 1 volume de produit (par exemple 10 g de produit et 100 ml (ou 90) de diluant strile). Le diluant peut tre de leau distille, de leau physiologique, du Ringer au 1/4 ou une solution tryptone-sel , etc. . - avec un broyeur du type STOMACHER. Cet appareil permet de disperser dans des conditions relativement douces laliment dans le diluant. De plus il nest pas ncessaire, comme dans le cas de lutilisation dun broyeur de type Virtis, de striliser les rcipients entre deux utilisations. En effet, le Stomacher (digesteur) utilise des sacs plastiques striles usage unique. La prise dessai est le plus souvent de 10 g (ou 25) daliment et de 90 ml (ou 250) de diluant.

E - 3. Les diluantsAu cours de la prparation des chantillons (et des dilutions) les microorganismes peuvent tre inhibs ou mme altrs par le changement du milieu li laddition de diluant (changement de pH mais surtout de force ionique). Leffet bactricide de certains diluants est connu: ainsi

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Staphylococcus aureus est tu en quelques heures dans de leau distille de mme que la plupart des entrobactries (E.coli); il en est de mme pour Streptococcus pyogenes dans du srum physiologique ou dans du Ringer au 1/4 et pour Escherichia coli dans de leau sale 8,5. Actuellement il parat souhaitable, sauf indication affrente un type donn daliment, de raliser les prparations et les dilutions des chantillons analyser dans une solution de tryptone sel. En absence dinformation le choix se fera en fonction de la composition du produit analyser: si le produit est riche en protine et en minraux, Ringer ou eau physiologique suffisent et mme une solution de phosphate 2 % et pH 7,4 dans le cas des fromages frais, crmes fraches et casinates .tryptone sel Ringer (solution mre) Eau physiologique NaCl 9g eau D 1000 ml Eau peptone tamponne bacto peptone 20 g NaCl 5g Na2 HPO4 9g K H2 PO 4 eau D pH = 7,2 1,5 g 1000 ml

NaCl 9g tryptone 1 g KCl 0,42 g NaCl 8,5 g 0,48 g eau D 1000 ml CaCl2 pH = 7 NaHCO3 0,2 g eauD 1000 ml

Tous ces diluants sont striliss 121C pendant 20 minutes. Il faut noter que les milieu tryptone-sel et eau peptone tamponne permettent, dans des conditions particulires (temprature, temps), de raliser une revivification. Leau peptone tamponne est utilise avec certains produits acides au fort pouvoir tampon comme les yaourts.

E - 4. La revivificationLes micro-organismes sont souvent endommags mais non tus au cours des traitements technologiques (dshydratation, chaleur, froid etc.) appliqus aux produits alimentaires ou par suite de leur vieillissement. Ces altrations se refltent dans certaines de leurs proprits physiologiques en particulier au niveau de leur phase de latence qui est augmente ou de leurs besoins nutritionnels ou encore quant leur sensibilit aux conditions de milieu dfavorables (pH, sels biliaires, colorants, sels etc.). En gnral ces altrations sont rversibles et aprs leur disparition les bactries rcuprent leurs proprits initiales, en particulier au niveau de leur croissance ou de leur pouvoir pathogne. La ncessit de faciliter le rtablissement des cellules ayant subi des altrations sub-ltales, cest-dire leur ranimation ou encore leur revivification, simpose avant de les soumettre des milieux slectifs souvent peu favorables la croissance du fait de la prsence dinhibiteurs. En effet, la prsence de cellules endommages peut entraner des variations dans les numrations ou porter croire quil ny a pas ou peu de germes et donc pas ou aucun risque pour le consommateur. Ceci est particulirement important quand il sagit de dterminer si des micro-organismes pathognes ou indicateurs sont prsents ou non.

E - 4 - a. Revivification en milieu liquideLa revivification peut tre ralise ds la premire tape de lanalyse au cours de laquelle le produit est additionn de diluant. Il suffit alors de choisir un diluant de composition favorable et dincuber le tout la temprature optimale de croissance du germe rechercher pendant un temps qui variera

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en fonction du type danalyse ralis, temps qui est le plus souvent voisin du temps de latence du germe normal. Si la dure de revivification est suprieure au temps de latence, il se produira une multiplication des germes non altrs ce qui conduira, selon les techniques de numration utilises par la suite, une survaluation du nombre de germes. Aprs cette phase pralable de revivification la numration est ralisable soit en milieu liquide soit en milieu solide.

temps d' incubation temps de latence + temps de doublement

dilutions numration

homognat en milieu de revivificationDans les preuves du type prsence ou absence, la revivification est obtenue par un prenrichissement dans un milieu favorable (ex. recherche des Salmonella ). La dure dincubation peut tre relativement longue car la multiplication des germes rechercher est dans ce cas trs souhaitable.

temps d' incubation >> temps de latence + temps de doublement

recherche sur milieu slectif

homognat en milieu de revivificationDans le cas o la numration des germes doit tre ralise deux autres mthodes sont encore envisageables : - Quand la numration est effectue en milieu liquide, la revivification est ralisable dans des milieux non slectifs ensemencs partir des diffrentes dilutions. Cest partir de ces milieux que sont ensuite ensemencs les milieux slectifs (de tube tube).

dilutions en milieu de revivification homognat en milieu de revivification temps d' incubation >> temps de latence

milieu slectif (incubation)

Le dcret publi au JO du 19 janvier 1980 fixe les conditions de revivification : lexclusion des produits laitiers, si le produit a subi un traitement thermique ou sil a t congel ou encore sil renferme des sels pouvant exercer une action inhibitrice (NaCl, NaNO2...) aprs homognisation,

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laisser le flacon la temprature du laboratoire (202C) pendant trente quarante cinq minutes (optimum quarante minutes) .

E - 4 - b. Revivification sur milieu solide- Quand la numration est effectue sur milieu solide, la revivification peut tre obtenue par une pr-culture sur une glose non slective favorable avec un temps dincubation suprieur au temps de latence, mais ne permettant pas la formation de colonies macroscopiques visibles. Aprs revivification, la surface de la glose est recouverte de glose slective.talement en surface milieu de revivification temps d' incubation > temps de latence homognat dilutions incubation milieu slectif

- Quand la numration est ralise aprs filtration sur membrane, la membrane sur laquelle se trouvent les germes est dabord place la surface dun milieu de revivification pendant un temps permettant ventuellement plusieurs divisions cellulaires normales puis le filtre est plac la surface dun milieu slectif. A titre dexemple, les conditions optimales de revivification par cette mthode de germes stresss sont les suivantes : Traitement Germe Revivification temps (h) t (C) 5 4 4,5 4 2 4 35 35 35 35 25 25

chaleur conglation acide schage

coliformes coliformes entrocoques coliformes coliformes entrocoques

E - 5. Techniques de dilutionElles ncessitent la prsence de nombreux tubes essais contenant le plus souvent 9 ml de diluant strile et de nombreuses pipettes striles de 1 et 10 ml. Les pipettes peuvent tre remplaces par des systmes de pipetage automatique munis de cnes usage unique. Toutes les manipulations sont effectuer avec toutes les prcautions dasepsie exiges en microbiologie. Lintroduction ventuelle dun contaminant ou la contamination de loprateur doivent ne jamais se produire. Le rcipient contenant le liquide diluer est agit manuellement avec prcaution pour viter les projections pendant une dizaine de secondes. On prlve strilement 1 ml de ce liquide (aspirer et refouler une fois avant le prlvement) que lon introduit dans un tube contenant 9 ml de diluant strile. Le tube est agit par des mouvements de rotation ou au moyen dun Vortex. On obtient ainsi

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une dilution au 1/10. Avec une nouvelle pipette de 1 ml on prlve 1 ml de cette dilution que lon introduit dans un nouveau tube de diluant de 9 ml ; on obtient une dilution au 1/100 et ainsi de suite jusquau niveau de dilution recherch.

E - 6. Principales techniques de numrationEn microbiologie alimentaire lintrt de ltude la fois quantitative et qualitative de la flore prsente dans un aliment est considrable. Bien que de nombreuses techniques de numration soient utilisables, il nexiste pas lheure actuelle de technique parfaite. Certaines mthodes ne permettent pas de diffrentier les germes vivants des germes morts, dautres savrent incapables de compter individuellement les cellules microbiennes lorsque celles-ci sont associes (Staphylococcus, Streptococcus , myclium etc..) et permettent dvaluer des units formant colonies (UFC) ou des units formant trouble (UFT).

E - 6 - a. les mthodes gnrales directes1) Comptage directIl seffectue au microscope laide de microchambres gradues de volume connu (cellules de Thoma, de Malassez, de Nageotte, de Salimbni Cloup etc...) aprs dilution en eau physiologique pour les germes morts, en eau formole 10 % pour les germes vivants. Ce type de comptage peut tre automatis (compteurs de particules). Il est galement possible destimer au microscope le nombre de micro-organismes dun produit donn aprs talement et coloration dune quantit connue du produit (de lordre de quelques microlitres) sur une lame. Enfin, un comptage direct est ralisable aprs filtration du produit (ou de ses dilutions) sur membrane, coloration de la membrane et observation microscopique. Cette dernire technique permet lvaluation, aprs coloration par lacridine orange et observation en pifluorescence, des micro-organismes vivants et morts (DEFT). Ce colorant est un intercalant des acides nucliques avec lesquels il forme des complexes fluorescents verts (ADN) ou orange (ARN) currentpointN(CH3)2 N N(CH3)2 currentpoint

2) Dtermination du poids sec, ou dosage des protines microbiennes ou dosage des acides nucliques (aprs sonication par exemple et/ou extraction en milieu alcalin) 3) NphlomtrieLa turbidit dun milieu est, dans certaines conditions, proportionnelle au nombre de microorganismes prsents dans ce milieu. Ainsi labsorbance dune suspension microbienne une longueur donde suprieure ou gale 540 nm varie linairement jusqu des valeurs infrieures ou gales 0,8 avec le nombre de germes. Il est par ailleurs possible de comparer visuellement la turbidit du milieu avec une gamme talon dalbumine (mthode de Mestrezat : ainsi lopacit dune suspension de 5.109 staphylocoques par ml est identique celle dune suspension dalbumine 0,5 g par litre).

4) Systme lucifrine - lucifraseCette mthode permet le comptage des micro-organismes vivants par dosage de lATP intracellulaire, la teneur en ATP intracellulaire tant sensiblement constante pour un microorganisme donn ; cette teneur est gale 0 si le germe est mort. Aprs lyse de la cellule (SDS) lATP est dos par voie enzymatique selon le schma suivant :

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currentpointOH

N S

S N COOH + ATP

lucifrase Mg2+ , O 2OH

N S

S N O

lucifrine

oxylucifrine

+ PP + CO 2 + AMP + hv currentpoint

Le nombre de photons mis 562 nm mesur par un compteur scintillations est proportionnel la quantit dATP, elle-mme fonction du nombre de cellules vivantes.

E - 6 - b. Les mthodes gnrales indirectesconsomm. 1) Dosage dun mtabolite primaire synthtis, ou dosage de la quantit dun substrat

Ces mthodes ne sont applicables que dans des conditions bien dfinies (phase exponentielle de croissance, temprature, milieu etc...). 2) Rduction dun colorant Certains micro-organismes modifient le potentiel doxydo-rduction des milieux dans lesquels ils se trouvent ; la vitesse de cette modification est la fois fonction du nombre de micro-organismes, de leur activit mtabolique (rductrice le plus souvent) et dautres paramtres tels que la nature du milieu, le germe, la temprature etc... Parmi les indicateurs disponibles le bleu de mthylne et la rsazurine sont les plus utiliss. La modification de couleur intervient quand Eh = Eo - 0,05 V. currentpointCH3 CH3 N S N CH3 N

+CH3

CH3 CH3 N S N

CH3 N CH3

+ 2H Eo = + 0,011 V

+ H Cl currentpoint

bleu de mthylne (bleu)

leucodriv incolore

H

Avec la rsazurine la rduction est suivie par des variations de coloration du bleu au lilas puis au mauve, au rose et enfin lincolore. currentpointO N O

OH

Ocurrentpoint

3) Dilution et cultureCette technique permet en principe la numration des germes vivants. La culture est ralise soit en milieu liquide (1 germe ou un groupe de germes donne aprs inoculation et incubation 1 culture positive) soit en milieu solide (1 germe ou un groupe de germes donne naissance une colonie). Dans ce dernier cas lensemencement peut se faire dans la masse de la glose ou en surface.

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E - 7. Numration partir dun milieu solide : UFCCette mthodologie est le plus frquemment ralise dans des botes de Ptri. Elle repose sur le principe que toute bactrie vivante introduite dans la masse ou en surface dun milieu glos favorable donne en principe naissance aprs incubation une colonie macroscopique. Le nombre total de colonies correspond alors au nombre dUFC prsents dans linoculum. De nombreuses critiques cette mthode peuvent tre formules. Ainsi, les bactries arobies strictes se dveloppent mal dans la masse de la glose, tandis que les bactries anarobies strictes ne sy dvelopperont que dans des conditions dincubation appropries (jarre anarobie par exemple). Il peut aussi exister certains antagonismes bactriens (bactriocines etc...). Par ailleurs si la temprature de mlange du milieu glos mlange linoculum est suprieure 45 - 47C , il peut y avoir inactivation de microorganismes. Cette mthode de culture dans la masse conduit nanmoins des dispersions homognes dans la glose et donc une distribution homogne des colonies. Dans cette mthode des germes se trouveront dans la masse et dautres en surface, les colonies formes tant, compte tenu des contraintes striques imposes par le rseau glifi, alors diffrentes pour un mme micro-organisme. Cet inconvnient est limin par la technique de la double couche. La numration en surface nest ralisable que sur une surface de milieu parfaitement sche. Lopration dtalement au rteau reste matriser (adsorption de germes sur le rteau) et le volume dinoculum dpos ne peut en aucun cas excder 0,5 ml avec des botes de 9 cm de diamtre (des volumes suprieurs ne sont pas absorbs par le gel dagar et leau qui reste en surface rend impossible toute numration en raison de la formation dune nappe). Cette mthode donne de bons rsultats avec les germes arobies et aro-anarobies.

E - 7 - a. Technique de numration dans la masse de la gloseLes milieux gloss (rpartis en erlenmeyer ou en flacon de 15 ml) sont liqufis au bain-marie bouillant ou mieux au four micro-ondes, puis maintenus en surfusion dans un bain-marie 45 1C. 1 ml du liquide dans lequel on veut connatre le nombre de micro-organismes est introduit au centre de la bote de Ptri pose bien plat dans la zone de protection du bec Bunsen. Linoculum peut tre rparti en gouttes sur le fond de la bote. Afin de nutiliser quune seule pipette strile pour toutes ces oprations il est recommand de commencer lensemencement par la dilution la plus grande pour terminer avec le liquide non dilu. Noter avec soin sur chaque bote lorigine de lanalyse, le milieu utilis et la dilution correspondante (sur le ct de faon ne pas tre gn par la suite pour le comptage). On procde de la mme faon pour chaque dilution en ralisant, dans la mesure du possible, deux essais par dilution. Le milieu glos en surfusion dans lequel linoculum sera incorpor doit tre 45C1C. Si sa temprature est suprieure cette valeur il se produira une destruction partielle de la flore ; au contraire, si sa temprature est infrieure 45C le milieu se solidifiera irrgulirement et ne se mlangera pas de faon homogne avec linoculum. Pour raliser lintroduction du milieu glos : retirer le milieu du bain marie 45C, essuyer le rcipient, louvrir aseptiquement, flamber son ouverture et couler le milieu dans la bote de Ptri contenant linoculum aprs lavoir entrouverte dans la zone strile. Ne pas appuyer le rcipient sur la bote. Mlanger rapidement par agitations circulaire et alternative horizontales ; viter les mouvements brusques qui risquent de projeter le milieu inocul sur les bords ou mme lextrieur de la bote. Laisser refroidir les botes bien plat jusqu solidification complte (environ 30 minutes). Retourner les botes et les placer ltuve dans cette position la temprature requise.

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Pour viter la formation de colonies de grande taille en surface (par rapport celles qui se dvelopperont dans la masse de la glose) on peut couler la surface de la glose ensemence une fine couche de milieu de culture identique celui dj prsent dans la bote ou couler la surface une mince couche de glose non nutritive (technique de la double couche).

E - 7 - b. Technique de numration en surface de la glose100 500 microlitres (pipette gradue ou mieux pipette automatique) du milieu analyser sont dposs la surface de la glose et immdiatement rpartis de faon uniforme la surface du milieu au moyen dun ensemenceur strile du type pipette rteau. La pipette rateau est strilise entre deux talements par immersion dans de lthanol, lthanol adsorb sur le verre tant ensuite enflamm (cette opration ne dforme pas lensemenseur).

E - 8. Numration en milieu liquide : UFTCette mthode prsente certains avantages tels que la possibilit dtudier un caractre biochimique du germe difficilement mis en vidence sur milieu glos comme la production de gaz (cloche) ou encore deffectuer facilement la numration avec une phase de revivification. Cette mthode repose sur le fait quun inoculum contenant au minimum 1 germe (UFT) donnera, aprs introduction dans un milieu liquide donn, une culture positive. Dans cette technique, la disponibilit des nutriments pour le micro-organisme est excellente.

E - 8 - a. fractionnement de grands volumes liquidesPour viter laccumulation de produits de dgradation qui pourraient avoir une action inhibitrice, on ensemence 1 ml dinoculum dans 100 ml de milieu de culture. Ce milieu est ensuite rparti aseptiquement dans 10 tubes essais raison de 10 ml par tube, puis incub. En supposant une distribution homogne des micro-organismes, on peut conclure la prsence de 1 10 microorganismes dans linoculum initial de 1 ml. Si tous les tubes cultivent.........plus de 10 germes/ml Si 9 tubes cultivent.................. plus de 9 germes/ml .................................................................. Si 1 tube cultive....................... plus dun germe/ml.

E - 8 - b. Mthode de Mac Grady (technique du nombre le plus probable NPP)McGRADY, MH. (1918) Tables for rapid interpretation of fermentation test results. Public Health J., Toronto, 9, 201-210. Cette mthode permet de rvler de plus faibles quantits de germes que la plupart des mthodes de numration en milieu solide. Elle repose sur une analyse statistique et fournit par calcul des nombres les plus probables (NPP). Il existe de nombreuses variantes la mthode en fonction de la charge microbienne valuer. Cette mthode suppose que le micro-organisme est normalement distribu dans le milieu et donc quun mme volume dchantillon contient en moyenne le mme nombre de microorganismes (en ralit il en contient un peu plus ou un peu moins) ; le nombre le plus probable correspond la valeur moyenne. Si le nombre de micro-organismes est faible lcart par rapport la moyenne peut tre lev et inversement.Des prlvements de 10 ml contiennent en moyenne 10 germes avec des tubes plus de 10 et peu moins de 1. Des prlvements de 1 ml contiennent en moyenne 1 germe avec des tubes plus de 1 et des tubes ngatifs. Des prlvements de 0,1 ml conduisent 1 tube positif pour 10 tubes et de nombreux tubes sont ngatifs.

Exemple : un produit liquide contient 100 micro-organismes / 100 ml

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La distribution de ces populations est schmatise sur la figure 8.Frquence de la distribution moyenne 0,1 ml/ tube 1 ml /tube

10 ml /tube

0

1

5

10 nombre de microorganismes

figure 8 . Distribution de la population microbienne dans une numration en milieu liquide

Numration de charges microbiennes comprises entre 0 et environ 15 pour 100 ml Dans ce cas 50 ml de produit sont introduits dans un erlenmeyer avec 50 ml de milieu de culture adapt double concentration, et 5 fois 10 ml introduits dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu de culture galement double concentration. Aprs incubation les tubes positifs sont identifis et le NPP pour 100 ml de produit est dtermin en utilisant la table suivante : Erlenmeyers positifs 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 tubes de 10 ml positifs NPP / 100 ml 0 0 1 1 2 2 3 4 4 5 5 7 0 2 1 3 2 6 3 9 4 16 5 + de 18

Numration de charge microbiennes comprises entre 0 et 100 germes par ml Dans ce cas 1 ml de la suspension mre puis de ses dilutions est introduit dans des tubes contenant le milieu de culture choisi mais en ralisant chaque essai en double (ou en triple ou plus suivant le niveau de prcision souhait). Avec lessai comportant deux tubes ensemencs par dilution on note, aprs incubation, les rponses positives ou ngatives et on affecte : - le chiffre 2 deux tubes positifs ensemencs avec la mme dilution - le chiffre 1 si lun des deux tubes donne une rponse positive une dilution donne - le chiffre 0 si la culture est ngative pour les deux tubes.

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Exempleproduit pur -1 dilutions -2 10

10

10 -3

10 -4

rsultat aprs incubation affectation nombre par dilution nombre de trois chiffres

tube 1 tube 2 tube 1 tube 2 tube 1 tube 2 tube 1 tube 2 tube 1 tube 2

+1 2

+1

+1 2 221

+1

+1 1

0

0 1

+1

0 0

0

211

110

Les chiffres adjacents sont groups par 3; on obtient des nombres de 3 chiffres qui sont 221, 211, 110. Le nombre le plus petit et pour lequel, si possible, le chiffre des units est un 0 (110 ici) est choisi. Pour ce nombre, la table de Mac Grady donne le nombre le plus probable de bactries par ml ou de produit pur et ce videmment pour lessai deux tubes par dilution. Le chiffre des centaines (1 dans le cas de 110) correspond la dilution considrer pour donner le NPN par ml de produit. Ainsi dans lexemple choisi 110 correspond la dilution -2 ce qui donne, daprs la table de Mac Grady, 1,3 bactries (UFT) par ml. Ce NPP correspond donc la dilution 10-2, soit un NPP de 130 bactries (UFT) par ml de produit non dilu. Il existe des tables de Mac Grady pour les essais 3 ou 5 tubes avec des volumes dinoculum de 1 ou 10 ml et mme 50 ml. Table de Mac Grady (essai 2 tubes) nombre de 3 chiffres Nombre dUFT par ml (NPP/ml) 000 001 010 100 101 110 111 120 200 201 210 211 212 220 221 222 0 0,45 0,46 0,6 1,2 1,3 2 2,1 2,3 5 6,2 13 21 24 70 110 et plus

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E - 9. Numration par filtrationCette mthode consiste faire passer un certain volume dchantillon ou de ses dilutions au travers dune membrane filtrante (par exemple une membrane Millipore ou Sartorius ou ...de 47 mm de diamtre et dont la porosit moyenne est de 0,45 mm 0,22 m) sur laquelle sont retenus les microorganismes recherchs. Aprs filtration, on rince lentonnoir suprieur avec de leau distille strile ou avec une solution tamponne strile afin de rcuprer la totalit des germes et dliminer du filtre lui-mme dventuels agents microbicides. Le filtre est alors pos sur la surface dun milieu de numration imbibant un filtre adquat ou sur un milieu glos spcifique du germe rechercher, face portant les micro-organismes vers le haut. Aprs incubation, comme dans le cas de la numration en milieu glos, on compte les colonies formes la surface du filtre.

rservoir suprieur pince

milieu glos

liquide analyser membrane disque poreux ( fritt) face suprieure de la membrane ayany retenu les bactries

vide (trompe eau)

numration aprs incubation

Cette mthode prsente certains avantages par rapport aux mthodes dj crites. Ainsi, le temps dincubation est gnralement plus court (18 heures au lieu de 24 heures), le volume dchantillon analysable plus grand (jusqu plusieurs litres, ce qui permet de raliser des numrations de germes dans des liquides en contenant trs peu tels que certaines eaux) ; il ny a aucune interfrence entre micro-organismes (spars la surface du filtre et nourris par diffusion du milieu de culture au travers des pores) et les agents microbicides associs au produit sont limins (chlore, antibiotiques, conservateurs etc.). Les diffrences existant entre les rsultats des numrations spcifiques dun micro-organisme donn ont le plus souvent comme origine la nature du milieu de culture choisi ainsi que la mthode utilise, la temprature et la dure de lincubation sans omettre les variations lies au manipulateur.

E - 10. Interprtation des numrations E - 10 - a. Calcul de la charge microbienne du produitIl faut, partir du nombre dunits formant colonies ou du NPP dtermin pour une dilution donne, remonter au produit analys.

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Dans le cas dun produit liquide, cela ne prsente aucune difficult puisquil suffit de multiplier le nombre ou le NPP trouv une dilution donne par linverse de celle-ci. Si par exemple 256 colonies ont t comptes dans la bote ensemence partir de 0,1 ml de dilution 10-3 du produit, le nombre dUFC par ml de produit est gal : 256 x 1 / 0,1 x 1 / 10-3 soit de 256.104 UFC / ml. Dans le cas dun produit solide, le broyage ou la mise en suspension initiale est considre comme une dilution dont il faut tenir compte. Si par exemple 10 g de produit ont t mis en suspension dans 90 ml de bouillon tryptone-sel, on considre que 1 ml de cette suspension correspond 0,1 g de produit. Il sagit l dune approximation car en toute rigueur, il faudrait procder la mise en suspension en prenant un poids donn de produit et en compltant un volume prcis par du diluant . Il est possible parfois de prendre en considration la teneur en eau du produit. Lapprciation quantitative dune flore microbienne donne prsente dans un aliment ou dans leau est souvent imprcise. Cette imprcision, outre les alas biologiques, tient surtout linvitable htrognit du produit et des dilutions, htrognit donnant lieu des prlvements dont la richesse en micro-organismes est variable. En effet les germes sont distribus de faon alatoire et non uniforme, mme aprs homognisation parfaite. Leur rpartition seffectue suivant la loi de POISSON1,ce qui permet destimer la grandeur et la probabilit des variations. En milieu liquide, la mesure seffectuant par lapprciation prsence ou absence, limprcision est plus grande. 1) La loi de Poisson est la loi suivie par une variable alatoire x qui peut prendre toutes les valeurs entires positives (1,2,3...k) avec une probabilit P gale : k a -a P= .e k! La loi est discontinue, la moyenne est a, la variance est aussi a

La densit microbienne dun produit, exprime par le nombre de germes par ml ou par g, est dfinie comme la moyenne du nombre de germes de toutes les fractions de 1 ml ou 1 g du produit: il sagit du nombre total de germes prsents dans le volume ou le poids total, divis par ce volume ou ce poids. La prcision des dnombrements est mesure par un paramtre de dispersion : le coefficient de variation V. V est le rapport,exprim en %, de lcart type la moyenne des rsultats obtenus par rptition de lanalyse du mme produit. Lcart type est la racine carre de la moyenne des carrs des carts par rapport la moyenne de la population.= (x i - x) n2

Lestimation du nombre de germes peut tre limite par un intervalle de confiance (par exemple dans lequel on a 95 chances sur 100 de trouver la vraie valeur).

V = x 100 x

E - 10 - b . numration en milieu solideLa valeur de la densit microbienne de laliment est obtenue en multipliant le nombre de colonies observes (par comptage manuel ou automatique) par un facteur tenant compte du volume ensemenc et de la dilution. Exemples : - pour du lait (liquide) 150 colonies sont comptes dans une bote de Ptri ensemence avec 1 ml dune dilution 10-3. La densit microbienne sera de 150.103 UFC par ml de lait. - pour un aliment solide il faut en toute rigueur tenir comte de leau quil contient ou raliser la premire dispersion partir de x g de produit et rajouter le diluant en quantit suffisante pour y ml.

Le coefficient de variation V et les limites de confiance exprimes en % de lestimation sont indpendants du facteur de dilution.

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Le dnombrement obissant la loi de Poisson se caractrise par un cart type gal la racine carre de la moyenne ( = x ). Ainsi, si la densit microbienne du produit, la dilution et le volume ensemence sont tels que lon obtienne une moyenne x de colonies dans le milieu glos, on aura :V= 100 x

Les limites de confiance 95 % sont :

IC 95 % =Le rsultat sexprime alors de la faon suivante :

1,96 N n

N 1,96 N n navec N nombre total de colonies comptes une dilution donne et n = nombre de botes comptes cette dilution. Si n = , on a un intervalle de confiance 95 % qui est gal :N 1,96 N s oit N 2 N

Remarque : le calcul de lintervalle de confiance ne peut tre ralis qu partir des colonies rellement comptes. La prise en compte du facteur de dilution nest ralise quaprs.

Les coefficients de variation et les intervalles de confiance pour un nombre donn de colonies comptes sont indiqus ci-aprs. nombre de colonies 10 20 30 50 100 200 300 400 500 coefficient de variation 31 22 18 14 10 7 5,7 5 4,4 Intervalle de confiance 95 % 4 11 19 36 80 172 265 360 455 16 29 41 64 120 228 335 440 545

Lvaluation visuelle du nombre de colonies dans une bote de Ptri de 9 cm de diamtre se limite aux environs de 300 units. Lutilisation dun analyseur dimage ou dun compteur laser permet destimer jusqu 1000 colonies par bote et donc damliorer la prcision. Pour obtenir, par la mthode dapprciation visuelle, un nombre lev de colonies et donc une bonne prcision dans sa mesure, il est possible densemencer plusieurs milieux gloss partir dune dilution considre; N se rapporte alors aux germes prsents dans lensemble des gloses et peut atteindre des valeurs leves gage dune bonne prcision. Il apparat ici clairement que le coefficient de variation et lintervalle de confiance dpendent du nombre de colonies prsentes dans la glose et quil convient donc deffectuer les numrations partir de botes dans lesquelles le nombre de bactries est compris entre 30 et 300 (pour une bote et plus pour n botes). Au-dessous de 30, V est trop grand; au-dessus de 300 par bote, le comptage devient trs difficile).

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Il faut encore signaler que cette tude au cours de laquelle on estime que les micro-organismes sont distribus selon la loi de Poisson na de signification que dans des conditions idales (distribution au hasard dans le produit, prises parfaitement aliquotes, toute bactrie produit une colonie, comptage ralis sans erreur etc...).E - 10 - c. Numration en milieu liquide

Lestimation de la variabilit des rsultats obtenus par ces mthodes est plus dlicate car les formules utilises dans ce cas sont trs complexes et font appel des lois statistiques qui sappliquent ds la dtermination du NPP . La principale difficult de cette technique de numration rside dans le fait que les tables des nombres les plus probables (NPP) sont le fruit de calculs mathmatiques et statistiques et quelles ne reprsentent quune probabilit de rsultat. Il faudrait donc que le NPP soit toujours associ aux limites de confiance (par exemple 95 %).

1) Numration avec une seule dilution dans n tubesIl sagit ici dun systme peu courant en microbiologie alimentaire . Lestimation du nombre probable moyen par portion de liquide inocul est gale : n N = NPP = Ln n-p avec p = nombre de tubes positifs. Le coefficient de variation V dpend de N et de n. Pur une valeur donne de n il atteint son minimum (gal 124 n) pour un N attendu de 1,6 (ou 80 % de tubes positifs). Lintervalle de confiance est tir de tables. N 3 5 10 20 0,15 155 120 85 60 0,5 1 1,6

n

72 51 36

41 29

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Valeurs du coefficient de variation en fonction de N et n. Lintervalle de confiance peut tre calcul ou trouv dans des tables. Ainsi, pour un intervalle de confiance 95 % on a par exemple: n 3 5 p 2 4 NPP 1,1 1,61 Intervalle de confiance 95 % 0,1 0,3 4,8 5,3

Dans cette technique la numration est obtenue systmatiquement avec des excs de lordre de 20, 13, 7 et 5 % respectivement avec les essais 3, 5, 10 et 20 tubes. Cette erreur reprsente lexcs de la moyenne de tous les NPP possibles par rapport la valeur vraie.

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2) Numration avec plusieurs dilutions dcimales de n tubesLensemencement dune dilution unique risque de dboucher sur une srie entirement positive (NPP = ) ou entirement ngative (NPP = 0) ou tout au moins sur un V lev. En labsence dinformation sur la densit microbienne estimer on effectue plusieurs dilutions. Cest cette approche qui est frquemment utilise en microbiologie alimentaire. Lestimation du NPP ncessite lemploi de tables. V est ici plus stable pour un n donn (entre certaines limites de densit microbienne). Pour quatre dilutions dcimales de n tubes chacunes, si la premire reoit par exemple 1 ml par tube et la dernire 1.10-3 ml par tube, la densit microbienne la premire dilution devra tre comprise entre 1 et 103 germes par ml. Dans ce cas on a : V = 100 e1,61 n

-1 2,5

et les limites de confiance 95 % sont gales :N PP. e 1 n

Les valeurs de V et les limites de confiance 95 % pour des essais 2 , 3 , 5 et 10 tubes sont indiques dans le tableau ci-aprs : intervalle de confiance 95% 0,17.NPP - 5,85.NPP 0,24.NPP - 4,23.NPP 0,33.NPP - 3,06.NPP 0,45.NPP - 2,20. NPP

n 2 3 5 10

V 110 84 62 42

Tableau des intervalles de confiance dans la numration en milieu liquide

E - 10 - d. Exemple dexploitation statistique de rsultats exprimentaux

Analyse dun plat cuisin : 25 g homogniss dans 225 ml de bouillon tryptone-sel (homognat appel produit). Des dilutions dcimales sont ralises dans le mme diluant. Les coliformes totaux sont compts en milieu solide (VRBL, 1 ml par bote, 2 botes par dilution) et en milieu liquide dans des milieux BLBVB (essai 2 tubes, 1 ml par tube).Les rsultats sont les suivants :produit -1 10 DCL 325 378 + + + 29 39 + dilution 10 5 2 + + + -2 10 1 1 -3 10 0 0 -4

BLBVB

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Le nombre significatif pour le BLBVB est de 210 , ce qui donne un NPP de 6,2 UFT de coliformes / ml pour la dilution 10-2. Lintervalle de confiance 95 % autour de ce NPP est : 6,2.0,17 UFT/ ml 6,2. 5,85 UFT / ml soit de 1,05 36,3 UFT / ml la dilution 10-2. Le rsultat est alors :NPP de coliformes gal 6,2.103 UFT / g avec un IC 95% compris entre 1,05.103 UFT /g 36,3 .103 UFT / g.

Le nombre total de colonies partir du produit est de 703 colonies. Le nombre dUFC de coliformes est de 703 / 2 soit de 351 UFC / ml de produit. Lintervalle de confiance 95 % est gal :2. 2 703 = 26,5

Ramen au plat cuisin on a alors : N = 3,5.103 UFC coliformes / g avec un IC 95% gal 0,265.103 UFC coliformes / g soit de 0,3.103 UFC coliformes / g. Le nombre total de colonies comptes partir de la dilution -1 est de 68. Le nombre dUFC est de 68 /2 soit de 34 UFC / ml de dilution -1. Lintervalle de confiance 95 % est gal :2. 2 68 = 8,2

Ramen au plat cuisin on a alors : N = 3,4.103 UFC coliformes / g avec un IC 95% gal 0,82.103 UFC coliformes / g . Si on prend en compte les rsultats obtenus avec les deux dilutions on a alors : N = (3,5 + 3,4).103 UFC coliformes par g / 2 soit N = 3,45.103 UFC coliformes par g avec un IC 95% qui est gal (0,265.103 + 0,82.103 ) / 2 = 0,54.103 UFC coliformes / g . Si on schmatise les rsultats trouvs et leur intervalles de confiance on obtient :1 10 NPP N ( produit) N (dilution) N (intgr) 3 6,2.10 3 36.10 3

Il nest pas tonnant de trouver autour du NPP un IC 95% trs grand car lessai nest qu 2 tubes.

E - 10 - e. Conclusions

La numration en milieu liquide est accompagne dune erreur systmatique et cette technique est moins prcise que la numration en milieu solide. Pour obtenir un mme coefficient de variation dans les deux cas (14 % en milieu solide, N = 50), il faudrait utiliser en milieu liquide des galeries de 82 tubes. Cette conclusion pourrait faire abandonner la technique en milieu liquide ; cependant cette dernire peut possder une spcificit sans quivalent en milieu solide, ou encore tre beaucoup plus sensible (1 2 germes par ml ou 10 ml). En milieu solide, il faut noter que ltalement en surface conduit des valeurs uniformment infrieures celles enregistres aprs inoculation dans la masse (du fait de ladhsion des bactries lensemenceur).

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E - 11. Le contrle de conformit par rapport une norme

Le concept de norme guillotine a longtemps prvalu et utilisait les rsultats fournis par la laboratoire abusivement : toute valeur qui dpassait un seuil fix, cest dire la norme ou le critre, tait considre comme une faute. Ce comportement rpressif reposait sur la certitude accorde au rsultat. Or, les causes de variabilit (ou derreurs) sont nombreuses et se situent au niveau : -de lchantillon : sans plan dchantillonnage les normes nont pas de signification. Il faut que lchantillon soit reprsentatif pour extrapoler lensemble du lot - du traitement de lchantillon ( modalits de dconglation , htrognit ) - des mthodes dhomognisation - des suspensions mres et des dilutions - des milieux de culture - de lincubation - de la lecture - de la nature de la flore ( comptition etc) - de la qualit de travail de loprateur - de lexistence de germes stresss Il faut donc analyser les rsultats en sappuyant sur une rglementation qui fixe n 5 et c 2 et qui tolre un cart entre m et M de 1 log. Le plan 3 classes est universellement adopt sauf pour Salmonella qui est recherche par un plan 2 classes de type prsence ou absence. Si on dsire dclarer un aliment conforme une norme ou non (ou encore laccepter ou le refuser) on adopte une dmarche dans laquelle un critre de conformit ou nombre dacceptation c est choisi. Le raisonnement le plus simple est de choisir la norme et de la comparer avec lestimation de la densit microbienne. Or il se peut que limprcision de la mthode fasse rejeter des aliments tout juste conformes et il devient ncessaire de fixer une marge de tolrance en dplaant vers la droite le nombre dacceptabilit. On dfinit alors : - une probabilit a (risque du producteur) pour quun aliment tout juste conforme soit refus (mesure suprieure au critre) - une probabilit (risque du consommateur) pour que soient accepts les aliments (mesure infrieure au critre) de degr de non conformit donn. Dans la pratique on adopte un nombre dacceptation tel que le producteur ne soit expos qu un risque raisonnable (5 % par exemple) en sefforant de choisir un mode opratoire qui rduise au maximum les risques pour le consommateur. La protection du consommateur qui est lie lefficacit du contrle peut svaluer (avec un nombre dacceptation c fix) par le rapport : avec R = 100 N1 / N2

N1 = N 0,05 : le nombre de germe donne lieu une probabilit de refus de 5% N2 = N 0,1 : le nombre de germes donne lieu une probabilit dacceptation de 10 %. Ainsi, pour un contrle ralis en milieu solide, on fixe dabord le nombre dacceptation c (ou nombre maximum tolr de colonies dans le milieu glos). R augmente avec c, mais on choisit une valeur de c gnralement comprise entre 50 et 100.

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Avec un c gal 50 on a N1 = 39,7 N2 = 59,9 et R = 66,3. Pour un aliment tout juste conforme (avec une norme T de 100 germes par ml ou g) il faut procder de telle sorte que la glose prsente N1 (39,7) germes en moyenne; cest en effet la condition pour que cet aliment nait que 5 chances sur 100 dtre refus. Il faut donc dposer sur la glose lquivalent de N1/T = 39,7 / 100 (ml ou g) du produit. La valeur N 2 . T 100 T = 151 germes / ml ou g = R N1 nous indique la densit microbienne dun aliment qui a encore 10 chances sur 100 dtre accept. La mme dmarche est applicable au contrle en milieu liquide.

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II. GERMES IMPORTANTS EN MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRETous les