AMINOACIDES, PEPTIDES ET PROTEINES. AMINOACIDES, PEPTIDES ET PROTEINES. INTRODUCTION GENERALE:INTRODUCTION GENERALE:

les aminoacides peuvent exister: les aminoacides peuvent exister: ** à l’état libre ( à l’état libre (monomèremonomère) ou ) ou ** à l’état combiné ( à l’état combiné (polymèrepolymère) : peptides ou ) : peptides ou

protéines. protéines. Les protéines sont donc des Les protéines sont donc des macromoléculesmacromolécules

formées par l’association de formées par l’association de plusieurs unités plusieurs unités monomériquesmonomériques. .

Les protéines constituent plus de 50% du poids Les protéines constituent plus de 50% du poids sec des cellules.sec des cellules.

Elles sont présentent dans toutes les cellules et Elles sont présentent dans toutes les cellules et dans tout les compartiments cellulaires. dans tout les compartiments cellulaires.

AMINOACIDES, PEPTIDES ET PROTEINES. AMINOACIDES, PEPTIDES ET PROTEINES. INTRODUCTION GENERALE:suiteINTRODUCTION GENERALE:suite

Elles interviennent dans :Elles interviennent dans :** le le maintien des structures biologiquemaintien des structures biologique

(scléroprotéines)(scléroprotéines)** le le transport membranairetransport membranaire (canaux (canaux

protéiques)protéiques)** le le métabolismemétabolisme (enzymes) (enzymes)** la la régulation biologiquerégulation biologique (hormones) (hormones)** l’expression de l’information génétiquel’expression de l’information génétique

(facteurs de transcription)(facteurs de transcription)** Les protides signifient constituant de Les protides signifient constituant de

première importance aussi bien sur le plan première importance aussi bien sur le plan structurale que fonctionnelle.structurale que fonctionnelle.

LES ACIDES AMINÉS LES ACIDES AMINÉS

DEFINITION ET STRUCTUREDEFINITION ET STRUCTURE

H3N C H

R

C

O O

R étant une chaîne latérale pouvant ou non porter des R étant une chaîne latérale pouvant ou non porter des groupements fonctionnels. les carbones de cette groupements fonctionnels. les carbones de cette chaîne peuvent êtrechaîne peuvent être en position : en position : , etc, etc.hj.hj

Example : -CH2- CH2-CH2-CH2-CH(NH2)-COOHExample : -CH2- CH2-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH

Se sont des molécules organiques Se sont des molécules organiques comportant: comportant:

1.1. un un groupement groupement carboxyliquecarboxylique (- (-COOHCOOH)) etet

2.2. une une fonction aminefonction amine primaire primaire ((R-NH2R-NH2)) en en position position par rapport au carboxyle de par rapport au carboxyle de telle sorte à ce qu’ils répondent tous à telle sorte à ce qu’ils répondent tous à l’exception de la proline qui comporte une l’exception de la proline qui comporte une fonction amine secondaire fonction amine secondaire ((R-NH-R’R-NH-R’)) à à la formule suivante : la formule suivante :

Structure générale des Structure générale des -acides aminés-acides aminés

Structure générale théorique:

n’existe pas en réalité

Forme zwitterion: présente aux valeurs de pH

physiologique

CLASSIFICATION DES ACIDES AMINES:CLASSIFICATION DES ACIDES AMINES: selon le radical R plusieurs classifications ont été proposées :selon le radical R plusieurs classifications ont été proposées :

Selon la nature chimique de RSelon la nature chimique de R 1.1. Aa à R aliphatiqueAa à R aliphatique: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, : Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met,

Ser Ser (F. alcool)(F. alcool), Thr , Thr (F. alcool)(F. alcool), Asn , Asn (F. amide)(F. amide), , Gln Gln (F. amide)(F. amide), Cys , Cys (F. thiol)(F. thiol), Asp , Asp (F. (F. carboxylique: carboxylique: COOH)COOH), Glu , Glu (F. carboxylique: (F. carboxylique: COOH)COOH), Lys , Lys (F. Amine I(F. Amine Iaireaire: : NH2)NH2)

2.2. Aa à R aromatiqueAa à R aromatique: Phe : Phe (Noyau phényle)(Noyau phényle), Trp , Trp (Noyau indole)(Noyau indole), Tyr , Tyr (F. phénol)(F. phénol), Arg , Arg (F.Guanidine:G)(F.Guanidine:G) et His et His (F. Imidazole:Imid)(F. Imidazole:Imid)

3.3. Aa à fonction amine secondaireAa à fonction amine secondaire: Pro : Pro (F. (F. Amine II Amine II aireaire))

CLASSIFICATION DES ACIDES AMINES suite:CLASSIFICATION DES ACIDES AMINES suite: selon le radical R plusieurs classifications ont été proposées suite :selon le radical R plusieurs classifications ont été proposées suite :

Selon la propriété physico-chimique du Selon la propriété physico-chimique du radical Rradical R

1.1. Aa à R non polaireAa à R non polaire : Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe,  : Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp et ProTrp et Pro

2.2. Aa à R polaire non chargéAa à R polaire non chargé : Gly, Ser, Thr, Asn,  : Gly, Ser, Thr, Asn, Gln, Cys et TyrGln, Cys et Tyr

3.3. Aa à R polaire chargéAa à R polaire chargé : Asp, Glu, Lys, Arg et His : Asp, Glu, Lys, Arg et His Selon l’importance biologique des AASelon l’importance biologique des AA

1.1. Aa indispensablesAa indispensables (ne sont pas synthétisés par (ne sont pas synthétisés par l’organisme) : Val, Leu, Ile, Thr, Met, Arg, Lys et l’organisme) : Val, Leu, Ile, Thr, Met, Arg, Lys et Trp.Trp.

2.2. Aa semi indispensableAa semi indispensable : Phe. Obtenu à partir de  : Phe. Obtenu à partir de TyrTyr

3.3. Aa non indispensablesAa non indispensables : tous les autres : tous les autres

AA apolaires

AA polaires non chargés

AA polaires chargés négativement

AA polaires chargés positivement

F. Amine II aire: P

F. thiole: C

F. alcool: S et T

F. amide: N et Q

F. phénol: Y

F. carboxylique: D (COOH) et E (COOH)

F. Amine Iaire NH2: K

F. Guanidine (G): R

F. Imidazole (Imid): C

PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES A.APROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES A.A

Propriétés optiquesPropriétés optiques: :

* La lumière couvre un domaine d’énergie variable * La lumière couvre un domaine d’énergie variable allant des rayons allant des rayons , X, UV, Visible et IR. On dit , X, UV, Visible et IR. On dit qu’une qu’une solution absorbe la lumièresolution absorbe la lumière lorsqu’elle est lorsqu’elle est capable d’arrêter un rayoncapable d’arrêter un rayon lumineux à une lumineux à une longueur d’onde bien précise. longueur d’onde bien précise.

PROPRIETES OPTIQUES DES A.APROPRIETES OPTIQUES DES A.A

La La moléculemolécule se comporte donc comme un se comporte donc comme un miroirmiroir qui qui permet de permet de diffuser le rayon lumineuxdiffuser le rayon lumineux qui est qui est réfléchi dans la solution. On dit que la réfléchi dans la solution. On dit que la solution solution absorbe la lumière à cette longueur d’ondeabsorbe la lumière à cette longueur d’onde. .

PROPRIETES OPTIQUES DES A.APROPRIETES OPTIQUES DES A.A

Spectre d’absorptionSpectre d’absorption

L'absorption de la L'absorption de la lumière suit la Loi de lumière suit la Loi de Beer-Lambert Beer-Lambert : :

AA = log(Io/I) = log(Io/I) = = .L.C .L.C : : coefficient coefficient

d'extinction molaired'extinction molaire en en l.cml.cm-1-1.mol.mol-1-1 du composé, du composé,

L: L: longueur du trajet en longueur du trajet en cmcm et et

C:  C:  concentrationconcentration en en mole/l mole/l

Convention de FisherConvention de Fisher

Stéréo-isomèresStéréo-isomères:: molécules présentant molécules présentant des des configurations configurations différentesdifférentes autour autour d'au moins un de d'au moins un de leurs leurs centres centres chirauxchiraux, mais qui , mais qui sont, par ailleurs, sont, par ailleurs, identiques.identiques.

H3N C

C OH

CH3

H

COO

H

H3N C

C H

CH3

HO

COO

H

NH3C

CHO

CH3

H

COO

H

NH3C

CH

CH3

OH

COO

H

Plan du miroirL-Thréonine D-Thréonine

L-allo-Thréonine D-allo-Thréonine

SolubilitéSolubilité

Les aa sont solubles dans l’eau, Les aa sont solubles dans l’eau, cependant:cependant:

S avec l’ du S avec l’ du nombre de carbonesnombre de carbones dans le radical Rdans le radical R

S avec la présence de S avec la présence de groupements groupements polairespolaires sur le radical R sur le radical R

S varie en fonction du S varie en fonction du pHpH et de la force et de la force ionique (ionique ())

Pouvoir rotatoirePouvoir rotatoire

Les aa de série D ou L sont Les aa de série D ou L sont doués de doués de pouvoir pouvoir rotatoirerotatoire. C’est à dire qu’ils . C’est à dire qu’ils peuvent dévier la lumière peuvent dévier la lumière polarisée à droite ou à polarisée à droite ou à gauche. Ils sont dît: gauche. Ils sont dît:

Detrogyre ( + )Detrogyre ( + ) s’ils dévient s’ils dévient le plan de polarisation sur la le plan de polarisation sur la droitedroite

Levrogyre  ( - )Levrogyre  ( - ) s’ils dévient s’ils dévient le plan de polarisation sur la le plan de polarisation sur la gauchegauche

Un mélange Un mélange racémique racémique (50%;50%) est optiquement (50%;50%) est optiquement inactif  inactif 

Le pouvoir rotatoire suit Le pouvoir rotatoire suit Loi de BiotLoi de Biot, qui donne , qui donne l'angle de rotation  sur le l'angle de rotation  sur le plan de polarisation de la plan de polarisation de la lumière : lumière :

= = oo .L.C .L.C  avec   avec : angle de rotation : angle de rotation

(°) (°) oo : pouvoir rotatoire : pouvoir rotatoire spécifique du composé spécifique du composé L : épaisseur (dm) L : épaisseur (dm) C : concentration (g/ml)C : concentration (g/ml)  

Ionisation des aa à R non ionisableIonisation des aa à R non ionisable

HA A- + H+

(acide) (base conjugué)

la constante d’ionisation étant Ka :

Ka = [A-] [H+] [AH]

faisons sortir le paramètre intéressant, [H+]:

[H+] = Ka [AH] [A-]

Les a.a. ne se dissocient pas complètement dans l’eau. Ce sont des acides faibles ou des bases faibles

Équation d’Henderson-Hasselbalch

Prenons le logarithme:

Log [H+] = log Ka + log [AH] [A-]

ouLog 1 = log 1 + log [A-] ; comme Log 1 = pH [H+] Ka [AH] [H+]

nous pouvons poser, par analogie avec pHlog 1 = pKa Ka

nous avons ainsi

pH = pKa + log [accepteur de proton] [donneur de proton]

pouvoir tamponpouvoir tampon lorsque [COOlorsque [COO--] = [COOH] on a: ] = [COOH] on a:

pH = pK(pH = pK(COOH) 2COOH) 2 lorsque [NHlorsque [NH33

++] = [NH] = [NH22] on a: ] on a:

pH = pKpH = pK((NHNH22) 9) 9 Le Le pKa est le pHpKa est le pH pour lequel l’aa est à moitié pour lequel l’aa est à moitié

dissocié.dissocié. A ce pH l’aa exerce un A ce pH l’aa exerce un pouvoir tampon pouvoir tampon

maximal. maximal. Le Le pouvoir tamponpouvoir tampon est défini comme le est défini comme le

nombre de moles d’ions nombre de moles d’ions HH++ ou de ou de OHOH-- qu’il faut qu’il faut pour pour faire varier le pHfaire varier le pH d’une d’une seule unitéseule unité (Pt(PtHH++]/]/pH d’où Pt=[HpH d’où Pt=[H++]/1). ]/1).

cation Ion intermédiaire anion ZWITTERION

Forme acide Forme neutre Forme base

Propriétés amphotères des aminoacidesPropriétés amphotères des aminoacides

Les a.a., sont donc des ampholytes

Dissociation d’un acide aminéDissociation d’un acide aminé

H3N C COO

H

R

H2N C COO

H

R

H3N C COOH

H

R

En solution acide En solution basiquePoint Isoélectrique

OH OH

H3O H3O

F. protonéeF. protonée F. neutre F. déprotonéeF. neutre F. déprotonée Le pH auquel l ’acide aminé possède une Le pH auquel l ’acide aminé possède une charge charge

nette neutrenette neutre (forme zwitterionique) est son (forme zwitterionique) est son point point isoélectriqueisoélectrique (pI): (pI):

Chaque acide aminé possède un pI qui lui est propreChaque acide aminé possède un pI qui lui est propre AaAa basiques: pI élevésbasiques: pI élevés (ex: pI Lys = 9.47) (ex: pI Lys = 9.47) Aa Aa acides: pI basacides: pI bas (ex: pI Asp = 2.98) (ex: pI Asp = 2.98)

ji KKI pp2/1p

Courbe de titration de la glycineCourbe de titration de la glycine

La zone de pH, où la courbe de titration est relativement plate est appelée ZONE TAMPONTampon = mélange d’acide faible et de base conjuguée capable de stabiliser le pH

HA

AlogppH

-

K

Dosage spectrophotométrique: Absorption à 280 nmDosage spectrophotométrique: Absorption à 280 nm

Les aa aromatiques (tryptophane, la tyrosine et la phénylalanine) absorbent fortement à 280 nm. Il est donc possible de doser les protéines en mesurant l'A280. Évidemment l'absorption à cette longueur d'onde dépend principalement du nombre de ces aa dans le mélange protéique. Une solution contenant 1 mg de protéines/mL a une A280 de l'ordre de 0.5 à 2.0.On peut donc déterminer assez précisément la concentration de ces protéines en appliquant la

relation de Beer-Lambert: AA = log(Io/I) = log(Io/I) = = .L.C.L.C Les avantages de cette méthode sont sa relativement bonne sensibilité (50-100 g), sa simplicité et sa rapidité d'exécution. Elle permet en outre de récupérer la solution protéique si besoin est, car elle ne nécessite pas que les protéines de la solution soient détruites par une réaction quelconque. Elle est particulièrement utile pour suivre le contenu en protéine de l'effluent d'une chromatographie.

Dosages (applications de la loi de Beer-Lambert):Dosages (applications de la loi de Beer-Lambert): Deux cas sont possibles : (1)-La substance à doser possède un pic d'absorption caractéristique dans le visible (substance colorée) ou dans l'UV (substance incolore); on fait alors un dosage direct.

(2)-La substance à doser ne possède pas de pic d'absorption caractéristique; il faut donc effectuer une réaction colorée; on fait alors un dosage indirect.

Dosages (applications de la loi de Beer-Dosages (applications de la loi de Beer-

Lambert):Lambert): 1-3-1-Méthode directe 1-3-1-Méthode directe elle consiste à elle consiste à mesurer Amesurer A et et

à à calculer ccalculer c..

elle nécessite deelle nécessite de connaître leconnaître le coefficient d’extinction coefficient d’extinction molaire molaire de la substance à de la substance à doser à la longueur d'onde doser à la longueur d'onde choisie, et de bien caler le choisie, et de bien caler le monochromateur, car monochromateur, car varie varie avec avec ..

1-3-2-Méthodes indirectes : elles ne nécessitent pas de 1-3-2-Méthodes indirectes : elles ne nécessitent pas de connaître connaître ( (Méthode avec une gamme d'étalonnage)Méthode avec une gamme d'étalonnage) : :

- elle consiste à : - elle consiste à : préparer unepréparer une gamme de dilutions gamme de dilutions d'une solution étalon d'une solution étalon

dite solution "mère" dite solution "mère" (solution à concentration connue),(solution à concentration connue), mesurer l'absorbance de chacune de ces solutions mesurer l'absorbance de chacune de ces solutions

étalons "filles"étalons "filles"(solutions à concentrations connues),(solutions à concentrations connues), tracer la tracer la courbe d'étalonnagecourbe d'étalonnage A = f(c). A = f(c). L'absorbance de la solution à doser L'absorbance de la solution à doser (dont la concentration (dont la concentration

est inconnue)est inconnue) est mesurée dans les mêmes conditions, est mesurée dans les mêmes conditions, puis reportée sur la courbe d'étalonnage; puis reportée sur la courbe d'étalonnage; on fait ainsi une on fait ainsi une détermination graphiquedétermination graphique de la concentration de la de la concentration de la solution à dosersolution à doser. .

(la gamme doit encadrer la valeur probable de la solution (la gamme doit encadrer la valeur probable de la solution à doser)à doser)

elle permet de elle permet de vérifier la linéaritévérifier la linéarité, et tient compte des , et tient compte des erreurs de manipulation (tracé d'une droite statistique).erreurs de manipulation (tracé d'une droite statistique).

Dosages (applications de la loi de Beer-Lambert):Dosages (applications de la loi de Beer-Lambert):

Dosages (applications de la loi de Beer-Lambert): Gamme étalonDosages (applications de la loi de Beer-Lambert): Gamme étalon

L’équation de la droite d’étalonage est DO= aC d’où a= DO/C

[globulines]t7=DO /a ;  [globulines]t7=0,400/0,3= 1,33 µg/µl;

isomérie optiqueisomérie optique A l’exception du glycocolle, A l’exception du glycocolle,

tous les aa présentent au tous les aa présentent au moins un moins un carbone carbone asymétriqueasymétrique (le carbone (le carbone porte porte 4 substituants 4 substituants différentsdifférents) les aa peuvent ) les aa peuvent donc exister sous la forme de 2 donc exister sous la forme de 2 isomères optiques ou isomères optiques ou énantiomèresénantiomères

ÉnantiomèreÉnantiomère: molécule qui est : molécule qui est l'image de celle considérée l'image de celle considérée dans un miroir, c'est-à-dire, dans un miroir, c'est-à-dire, différente au niveau de tous différente au niveau de tous ses centres chiraux.ses centres chiraux.

n n centres chirauxcentres chiraux 22nn stéréo-isomères stéréo-isomères 22nn-1-1 paires d ’énantiomères paires d ’énantiomères

H3N C

C OH

CH3

H

COO

H

H3N C

C H

CH3

HO

COO

H

NH3C

CHO

CH3

H

COO

H

NH3C

CH

CH3

OH

COO

H

Plan du miroirL-Thréonine D-Thréonine

L-allo-Thréonine D-allo-Thréonine

Dosage spectrophotométrique: Absorption à 280 nmDosage spectrophotométrique: Absorption à 280 nm

Elle a cependant un désavantage majeur, la présence Elle a cependant un désavantage majeur, la présence de contaminants ayant une absorption à 280 nm. de contaminants ayant une absorption à 280 nm. Parmi ces contaminants potentiels, on retrouve aussi Parmi ces contaminants potentiels, on retrouve aussi les acides nucléiques. Ils absorbent fortement dans les acides nucléiques. Ils absorbent fortement dans l'U.V., avec un maximum autour de 254 nml'U.V., avec un maximum autour de 254 nm

Cependant Cependant Warburg et Christian (1941)Warburg et Christian (1941) on développé on développé une méthode pour déterminer la concentration une méthode pour déterminer la concentration protéique d'un mélange contenant une proportion protéique d'un mélange contenant une proportion donnée d'acides nucléiques:donnée d'acides nucléiques:

[protéines] (mg/mL) = 1.55 A[protéines] (mg/mL) = 1.55 A280280 - 0.76 A - 0.76 A260260

Dosage colorimétrique: Dosage colorimétrique: Méthode du biuretMéthode du biuret

Cette méthode a été développée par Cette méthode a été développée par GornallGornall et al (1949) et al (1949) qui ont appliqué la réaction du biuret pour obtenir une qui ont appliqué la réaction du biuret pour obtenir une méthode quantitative de dosage des protéines. Cette méthode quantitative de dosage des protéines. Cette réaction du biuret est la formation d'un complexe pourpre réaction du biuret est la formation d'un complexe pourpre entre le biuret (NHentre le biuret (NH22-CO-NH-CO-NH-CO-NH-CO-NH22) et deux liens ) et deux liens peptidiques consécutifs en présence de cuivre en milieu peptidiques consécutifs en présence de cuivre en milieu alcalin. Le complexe de coordination résultant absorbe alcalin. Le complexe de coordination résultant absorbe fortement dans le bleu.fortement dans le bleu.

Même si cette méthode est peu sensible (1-20 mg) elle Même si cette méthode est peu sensible (1-20 mg) elle est relativement rapide. Sa principale qualité est d'avoir est relativement rapide. Sa principale qualité est d'avoir une absorption égale pour toutes les protéines. Encore une absorption égale pour toutes les protéines. Encore une fois, le défaut de cette méthode est sa sensibilité à une fois, le défaut de cette méthode est sa sensibilité à certains interférents comme les peptides, le saccharose, certains interférents comme les peptides, le saccharose, le tris, le glycérol, etc.le tris, le glycérol, etc.

Dosage colorimétrique: Dosage colorimétrique: Méthode de LowryMéthode de Lowry

Cette méthode a été développée par Cette méthode a été développée par Lowry et al (1951)Lowry et al (1951) qui ont combiné une réaction au qui ont combiné une réaction au biuret et une réaction au réactif de Folin-Ciocalteu. biuret et une réaction au réactif de Folin-Ciocalteu. Ce dernier, à base de phosphomolybdate et de Ce dernier, à base de phosphomolybdate et de phosphotungstate, réagit avec les tyrosines et les phosphotungstate, réagit avec les tyrosines et les tryptophanes, pour donner une coloration bleue qui tryptophanes, pour donner une coloration bleue qui s'ajoute à celle du biuret.s'ajoute à celle du biuret.

La grande sensibilité de la méthode de Lowry est sa La grande sensibilité de la méthode de Lowry est sa principale qualité. Elle peut atteindre 5-10 µg. principale qualité. Elle peut atteindre 5-10 µg.

. .

Dosage colorimétrique: Dosage colorimétrique: Méthode du bleu de CoomassieMéthode du bleu de Coomassie

Bradford et al (1976)Bradford et al (1976) ont développée une méthode ont développée une méthode basée sur l'adsorption du colorant bleu de Coomassie basée sur l'adsorption du colorant bleu de Coomassie G250. En milieu acide ce colorant s'adsorbe sur les G250. En milieu acide ce colorant s'adsorbe sur les protéines et cette complexation provoque un transfert de protéines et cette complexation provoque un transfert de son pic d'adsorption qui passe du rouge au bleu.son pic d'adsorption qui passe du rouge au bleu.

C'est une méthode très sensible (2-5 µg de protéines) et C'est une méthode très sensible (2-5 µg de protéines) et très rapide. Elle est aussi assez résistante à la plupart très rapide. Elle est aussi assez résistante à la plupart des interférents qui nuisent à la plupart des autres des interférents qui nuisent à la plupart des autres méthodes. Seuls les détergents, comme le Triton et le méthodes. Seuls les détergents, comme le Triton et le dodécylsulfate de Na (SDS), et des bases fortes dodécylsulfate de Na (SDS), et des bases fortes interfèrent avec cette méthode.interfèrent avec cette méthode.

Dosage colorimétrique: Dosage colorimétrique: Acide bicinchoniqueAcide bicinchonique

L'acide bicinchonique (BCA) réagit avec les complexes de L'acide bicinchonique (BCA) réagit avec les complexes de CuCu2+2+ et de protéines de façon très similaire à la réaction du et de protéines de façon très similaire à la réaction du biuret. En formant de tels complexes, il prend une couleur biuret. En formant de tels complexes, il prend une couleur pourpre typique. C'est une méthode sensible et rapide qui pourpre typique. C'est une méthode sensible et rapide qui résiste aux détergents comme le Triton ou le SDS.résiste aux détergents comme le Triton ou le SDS.

Méthode de KejdahlMéthode de Kejdahl

Cette méthode consiste à mesurer la quantité Cette méthode consiste à mesurer la quantité d'azote organique d'un échantillon. Il faut d'azote organique d'un échantillon. Il faut évidemment savoir, pour l'échantillon analysé, évidemment savoir, pour l'échantillon analysé, quelle est la relation entre la quantité d'azote quelle est la relation entre la quantité d'azote et celle de protéines. Elle requiert un et celle de protéines. Elle requiert un équipement coûteux et complexe. On ne équipement coûteux et complexe. On ne l'applique qu'à des échantillons difficiles à l'applique qu'à des échantillons difficiles à homogénéiser. comme du matériel végétal. homogénéiser. comme du matériel végétal.