Aldo ManuscritoFinal261113

8/18/2019 Aldo ManuscritoFinal261113

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UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DEPUEBLA

Programa Académico de Maestría en Ingeniería en Automatización deProcesos Industriales

MONITOREO Y CONTROL DE UN BIORREACTORESCALA LABORATORIO PARA PROCESOS DE

FERMENTACIÓN DE CULTIVOS CELULARES

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN INGENIERÍA

PRESENTA:

ING. ALDO HERNÁNDEZ DÍAZ

DIRECTOR

DRA. MARÍA LETICIA RAMÍREZ CASTILLO

Juan C. Bonilla, Puebla 13 de Diciembre del 2013


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El presente trabajo fue realizado en el

Laboratorio de Investigación y Posgrado y en

los Departamentos de Biotecnología y

Mecatrónica de la Universidad Politécnica de

Puebla, con el apoyo del Consejo de Cienciay Tecnología del Estado de Puebla

(CONCYTEP). El programa de Maestría en

Ingeniería pertenece al Programa Nacional de

Posgrados de Calidad (PNPC-CONACYT).


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La presente tesis titulada “Monitoreo y control de un biorreactor escalalaboratorio para procesos de fermentación de cultivos celulares” y realizadapor el Ing. Aldo Hernández Díaz, ha sido revisada y aprobada por el Jurado paraobtener el Título de:

MAESTRO EN INGENIERÍA EN AUTOMATIZACIÓN DE PROCESOSINDUSTRIALES

PNPC-CONACYT

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE PUEBLA

Jurado integrado por:

Firma

Director: Dra. María Leticia Ramírez Castillo ___________________________

Asesor: ___________________________

Asesor: ___________________________

Revisor: ___________________________

Juan C. Bonilla, Puebla, México. Agosto 2013


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ContenidoResumen ................................................................................................................. 8

Capítulo 1 Planteamiento del problema de investigación ...................................... 10

1.1 Introducción ................................................................................................. 10

1.2 Objetivos ...................................................................................................... 12

1.2.1 Objetivo general ..................................................................................... 12

1.2.2 Objetivos específicos ............................................................................. 12

1.3 Justificación ................................................................................................. 12

Capítulo 2 Estudio del estado del arte ................................................... 15

2.1 Antecedentes ............................................................................................... 15

2.1.1 Características de un biorreactor ........................................................... 18

2.1.2 Parámetros de operación de un biorreactor ........................................... 20

2.1.3 Equipos existentes. ................................................................................ 22

2.1.3.1 BIOSTAT® ORB ................................................................................. 24

2.1.3.2 Biorreactor LAMBDA MINIFOR® ........................................................ 25

2.1.3.2 Biorreactor BIO FLO 310® .................................................................. 26

2.2 Modos de operación de cultivo..................................................................... 27

2.3. Parámetros de operación ............................................................................ 32

2.3.1 pH (potencial de Hidrógeno) ................................................................. 34

2.3.2 Oxígeno Disuelto (OD) ........................................................................... 35

2.3.3 Temperatura .......................................................................................... 37

2.3.4 Agitación del medio de cultivo ............................................................... 40

2.3.5 Alimentación de sustrato. ....................................................................... 41

2.4 Simulación de los sistemas de cultivo .......................................................... 43

La simulación de los sistemas de cultivo se basó en los puntos siguientes: .. 43

2.4.1 Cultivo lote ............................................................................................. 44

2.4.2 Cultivo continuo ..................................................................................... 46

2.4.3 Cultivos alimentados o cultivos lote alimentado ..................................... 48


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2.4.3.2 Cultivo alimentado lineal ..................................................................... 50

Capítulo 3 Implementación del sistema ................................................................. 52

3.1 Biorreactor ................................................................................................... 52

3.2 Control para los cultivos ............................................................................... 54

3.2.1 Cultivo alimentado exponencial. ............................................................ 54

3.2.2 Alimentación lineal ................................................................................. 56

3.2.3 Cultivo continuo ..................................................................................... 57

3.3 Agitación de medio de cultivo....................................................................... 57

3.4 Medición de pH. ........................................................................................... 58

3.5 Medición del oxígeno disuelto ...................................................................... 59

3.6 Interfaz de usuario ....................................................................................... 60

Capítulo 4 Resultados y discusiones ..................................................................... 63

4.1 Medición de pH. ........................................................................................... 63

4.2 Medición del oxígeno disuelto ...................................................................... 66

4.5. Agitación del medio de cultivo. ................................................................ 70

4.5 Panorama general del equipo ...................................................................... 71

4.6Simulación de los cultivos ............................................................................. 72

4.6.1 Cultivo Lote ............................................................................................ 73

4.6.2 Cultivo Continuo..................................................................................... 74 4.6.3 Cultivo lote alimentado ........................................................................... 77

Capítulo 5. Conclusiones ...................................................................................... 84

5.1 Conclusiones................................................................................................ 91

Capítulo 6 Referencias bibliográficas .................................................................... 93


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Índice de figurasFigura 1.1. Diagrama a bloques del proceso de fermentación. ............................. 14 Figura 2.1 Configuración de un biorreactor agitado (Ramírez 2004). .................... 19

Figura 2.2 Perspectivas de reacción y proceso involucrados en el crecimientocelular y formación de producto. ........................................................................... 22 Figura 2.3 Representación de cultivo lote, esquema general en (a) y cinética decultivo en (b). ......................................................................................................... 29 Figura 2.4 Representación de cultivo continuo. 2.4a. Esquema del biorreactor.2.4b. Cinética de cultivo continuo. ......................................................................... 30 Figura 2.5. Representación de cultivo lote alimentado. 2.4a. Esquema debiorreactor. 2.4b. Cinética del cultivo lote alimentado. .......................................... 31 Figura 2.6. Electrodo de vidrio para medir pH. ...................................................... 35

Figura 2.7. Electrodo de Oxígeno disuelto. Instrumento. ...................................... 36

Figura 2.8. Electrodo de Oxígeno disuelto. Conexiones. ...................................... 37 Figura 2.9. Termopar convencional. ...................................................................... 39 Figura 2.10. Agitación del medio de cultivo. .......................................................... 41 Figura 2.12. Bomba peristáltica. ............................................................................ 42 Figura 3.1. Procesos e fermentación en biorreactor escala laboratorio. ............... 53 Figura 3.2. Biorreactor de 4 litros de la UP-Puebla. .............................................. 53 Figura 3.3. Estructura del controlador PID y la planta a controlar. ........................ 56 Figura 3.4. Esquema del sistema de control como entrada al biorreactor de unabomba peristáltica. ................................................................................................ 56

Figura 3.5. Diagrama a bloques del controlador PID del motor de corriente directa. .............................................................................................................................. 57 Figura 3.6. Diagrama a bloques del controlador PID del motor de corriente directa. .............................................................................................................................. 58 Figura 3.7 Experimento de mediciones de porcentaje de saturación de oxígeno. 60 Figura 3.8. Diagrama general de interfaz de usuario. ........................................... 61 Figura 3.9 Diagrama de interfaz en Labview y mbed(http://mbed.org/cookbook/Homepage.). ............................................................... 62 Figura 4.1 Relación Voltaje-pH .............................................................................. 64 Figura 4.2 electrodo de pH. ................................................................................... 65

Figura 4.3. Gráfica de pH, datos tomados en línea. .............................................. 65 Figura 4.4. Datos obtenido y exportados en hoja de cálculo. ................................ 66 Figura 4.5. Mediciones de porcentaje de saturación de oxígeno, ......................... 67 aireación 1vvm. ..................................................................................................... 67


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Figura 4.6. Control de velocidad dando un flujo constante como alimentación desustrato ................................................................................................................. 67 Figura 4.7. Implementación de tarjeta de potencia. ............................................... 68 Figura 4.8. Termopar convencional. ...................................................................... 69 Figura 4.9. Circuito de conexiones del MAX6675 al microcontrolador MBED. ...... 70

Figura 4.10. Velocidad de agitación en medio de cultivo. ..................................... 71 Figura 4.11. Implementación de tarjeta de potencia. ............................................. 71 Figura 4.12 Panorama general de una fermentación. ........................................... 72 Figura 4.13 Dinámica del cultivo lote. .................................................................... 74 Figura 4.14.Comportamiento de la velocidad específica de crecimiento, en funcióndel flujo para un tiempo dado. ............................................................................... 76 Figura 4.15. Simulación del cultivo continuo simple etapa. ................................... 77 Figura 4.16. El cultivo alimentado exponencialmente de KlebsiellapneumoniaesppneumoniaeK63, =0.05 h-1. ................................................................................. 79 Figura 4.17. Cultivo alimentado exponencialmente de Klebsiella pneumoniae sp. pneumoniae, =0.05 h-1. A) Evolución de la biomasa total y B) Concentración debiomasa. ................................................................................................................ 79 Figura 4.18. Cultivo alimentado creciente de Klebsiella pneumoniae sp.

pneumoniae. Evolución del A) Flujo, B) Volumen. ................................................ 80 Figura 4.19 Incremento del volumen a diferentes flujos constantes en biorreactor. .............................................................................................................................. 82 Figura 4.20. Evolución de la concentración de biomasa para cultivos lotealimentado lineal. .................................................................................................. 83 Figura 4.21. Evolución de la biomasa total para cultivos lote alimentado lineal. ... 83


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Índice de tablasTabla 2.1 Productos obtenidos por fermentación (Quintero 1997) ........................ 16 Tabla 2.2 Aplicaciones de las enzimas producidas por fermentación, extraído de

Quintero (1997) ..................................................................................................... 17 Tabla 2.3 Variables comúnmente medidas en fermentadores y dispositivosutilizados para su determinación (Ramírez 2004). ................................................ 33 Tabla 2.4. Características de termopares de acuerdo al tipo. ............................... 39 Tabla 2.5. Clasificación de procesos de agitación. ................................................ 40 Tabla 3.1 Relaciones estándar del reactor de 4 litros utilizado. ............................ 54 Tabla 3.2 Voltajes obtenidos con sustancias buffer y amplificadas. ...................... 58 Tabla 4.2.Caracterización de la bomba peristáltica. .............................................. 68 Tabla 4.3. Características de termopares de acuerdo al tipo. ............................... 69

Tabla 4.4. Parámetros de simulación. ................................................................... 73

Tabla 4.5. Condiciones de operación. ................................................................... 74 Tabla 4.6 Condiciones de operaciónutilizadas en la simulación del cultivo continuosimple etapa. ......................................................................................................... 75 Tabla 4.7 Parámetros cinéticos utilizados en la simulación del cultivo continuosimple etapa .......................................................................................................... 75 Tabla 4.7. Condiciones de operación. ................................................................... 78 Tabla 4.8. Parámetros de simulación. ................................................................... 78 Tabla 4.9 Parámetros cinéticos utilizados en la simulación de cultivo lotealimentado lineal. .................................................................................................. 81

Tabla 4.10 Condiciones de operaciónutilizadas en la simulación de cultivo lotealimentado lineal. .................................................................................................. 82


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Resumen

Los biorreactores son recipientes en los que se pueden realizar reaccionesbioquímicas, con microorganismos, enzimas, células vegetales o células animales.Su función es proveer un medio controlado para llevara cabo las reacciones en las

mejores condiciones y de esa forma lograr la transformación de sustratos ybiosíntesis de productos con altos rendimientos. En la mayoría de losbiorreactores comerciales, el control de los parámetros se lleva a cabomanualmente y la medición de estos datos no es almacenada, el costo se vaincrementando conforme se aumentan los dispositivos para controlar losparámetros y adquirir los datos en línea, almacenarlos y graficarlos. En estetrabajo se desarrolló un sistema de medición y control de los parámetros deoperación así como de adquisición de los datos en línea que permite almacenarlosy graficarlos. Los parámetros medidos fueron pH, temperatura y oxígeno disuelto;los parámetros controlados fueron pH y alimentación de sustrato, este últimomediante el flujo controlado por una bomba peristáltica que permite llevar a cabo

cultivos alimentados y continuos. Se estudiaron los transductores que se utilizanpara dichas tarea. Además se llevaron a cabo las simulaciones de los cultivos(cultivos lote, continuo, lote alimentado exponencial y lineal) realizando losbalances de masa de acuerdo al modo de operación y utilizando los modelos decrecimiento y producción establecidos por la bibliografía. El desarrollo de estesistema fue menos costoso que un biorreactor comercial y presentar mayorflexibilidad al poder realizar cultivos alimentados.

Abstrac

The bioreactors are containers in which biochemical reactions can be performed,using microorganisms, enzymes, plant cells or animal cells. Its function is toprovide a controlled environment to carry out the reactions in the best conditionand thus transform substrates and synthesize products with high yields. In mostcommercial bioreactors, the control of parameters is carried out manually and themeasurement of such data is not stored, the cost will increase with the increase ofdevices to control the parameters, for online data acquisition, their storage andgraphing. In this work a system for measuring and controlling the operatingparameters was developed as well as acquisition of online data, storage andgraphing. The measured parameterswere pH, temperature and dissolved oxygen;

the controlledparameterswere pH and substrate feeding, the latter by the flowcontrol of a peristaltic pump that allows to perform fed-batch and continuouscultures. The transducersfor these tasks were studied. Culture simulations werealso carried out (batch, continuous, fed batch lineal and exponential cultures) bymass balances according to the operating mode and using models of growth and


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production established in the bibliographic references. The development of thissystem was less expensive than a commercial bioreactor and provides greaterflexibility, for example the fed-batch culture can be performed.


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Capítulo 1 Planteamiento del

problema de investigación1.1 Introducción

Una de las metas importantes en cualquier industria de los procesos, es el

incremento de la producción asegurando que el producto fabricado sea de calidad,

lo anterior sin importar cuál sea el proceso que se esté manejando; una de las

maneras de conseguir esto es la implementación de técnicas de control para

mantener las condiciones adecuadas necesarias para llevar a cabo el proceso.

Familiarizado con el término de control de proceso está el término de

automatización que es usado para describir la operación automática, en años

recientes la automatización ha sido utilizada en la manufactura moderna de

productos, operando de manera automática las máquinas, es decir, con la mínima

interacción del humano (Bolton 2002).

Las técnicas de control también son utilizadas para los procesos biológicos, mejor

conocidos como bioprocesos. Las principales preocupaciones en la industria de

los bioprocesos es poder controlar el proceso manteniendo las condiciones de la

reacción biológica en todo el medio de cultivo. El control de un bioproceso está


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definido como proveer las condiciones adecuadas para que los microorganismos

puedan crecer, reproducirse y sintetizar el producto deseado en las cantidades

esperadas, esto incluye: i) una concentración correcta de nutrientes en el cultivo

(fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo, oligoelementos y oxígeno); ii) remover las

toxinas producidas por el propio metabolismo de las células (dado el caso del

CO2), iii) controlar las condiciones de operación (temperatura, pH, aireación y

agitación)(Alford2006, Wang y col. 2009). Lo anterior permitirá controlar al

microorganismo y en el mejor de los casos su metabolismo para producir lo

previsto.

El desarrollo del monitoreo y control de un biorreactores indispensable en el

estudio de las condiciones adecuadas para llevar a cabo el metabolismo yreproducción celular, proporcionando al cultivo celular un medio adecuado de

reproducción, detallando la dinámica de crecimiento celular y de los sustratos

importantes para que ésta tarea sea llevada a cabo, tal es el objeto de este

trabajo. En este la dinámica de crecimiento celular es representada por medio de

modelos matemáticos establecidos y estudiados ampliamente por diversas

bibliografías. También se muestran las diversas técnicas de control que pueden

implementarse a los bioprocesos y los instrumentos que se utilizan para llevar a

cabo el sensado de los parámetros más importantes, así como los mecanismos

que ejecutan el control de dichos parámetros para propiciar a las células para su

apto desarrollo. Se logró desarrollar un sistema de adquisición de datos para los

parámetros de operación de pH y temperatura, asimismo se implementó un

dispositivo que permitirá controlar los motores para el control de flujo y de

agitación.


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1.2 Objetivos

1.2.1 Objetivo general

Monitorear y controlar un biorreactor escala laboratorio para procesos de

fermentación de cultivos celulares.

1.2.2 Objetivos específicos

Identificar y caracterizar el biorreactor.

Establecer una estrategia para medir pH deseado en el rango de operación

Establecer una estrategia para medir temperatura a lo largo del proceso de

fermentación.

Implementar un sistema para controlar la velocidad de un motor decorriente continua para la agitación del biorreactor.

Manipular el flujo de entrada de sustrato para realizar cultivos lote

alimentados en modos exponencial, lineal e intermitente.

Desarrollar una interfaz en la que se puedan visualizar y almacenar los

parámetros de operación.

1.3 Justificación

El cultivo de microorganismos requiere de un ambiente controlado que sólo se

logra con un biorreactor, los existentes en el mercado, además de alto costo son

limitados en su funcionamiento. En su mayoría en estos biorreactores el control de

los parámetros se lleva a cabo imponiendo manualmente un valor y la medición de

estos datos no es almacenada en caso de que se varíe. El costo se va

incrementando conforme se aumentan los dispositivos para adquirir los datos en

línea, almacenarlos y graficarlos. Los biorreactores para llevar a cabo cultivos

alimentados aún no se existen en el mercado. Por lo anterior es necesario

desarrollar un biorreactor con mayor flexibilidad disminuyendo los costos; un

biorreactor que no solamente cuente con sistema de medición y control de


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temperatura y pH sino también de adquisición de datos en línea almacenarlos y

observar directamente las gráficas con el fin de poder actuar rápido. Además en

este Biorreactor también se podrán poder realizar cultivos alimentados al tener un

sistema automático de adición de nutrientes. Se propondrá un diseño para los

cultivos continuos en los que el flujo de entrada y salida deben ser similares sino

es que iguales.

Partiendo de la existencia de un biorreactor en el laboratorio de biotecnología, el

trabajo a realizar es posible de alcanzar ya que se cuenta con el biorreactor con la

funcionalidad de operar procesos de fermentación en diferentes modos de

operación, así también cuenta con puertos para la medición de los parámetros de

operación y entradas para realizar la tarea de mantener en un valor deseado dicho

parámetro, en este caso sólo para pH y temperatura, y en el caso de oxígeno

disuelto sólo llevar a cabo la medición. Ya que el biorreactor cuenta con entradas y

salidas es posible manejar el modo de operación lote, lote alimentado y cultivo

continuo.

Debido a que los equipos existentes en el mercado son de alto costo, es necesario

reducir los mismos mediante la implementación de sistemas capaces de realizar la

medición y mantener parámetros de operación en valores deseados según el

cultivo que se quiera realizar. La Figura 1.1 hace notar en el proceso de

fermentación, identificando las entradas y salidas de las variables en el

biorreactor.


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Figura 1.1. Diagrama a bloques del proceso de fermentación.


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Capítulo 2 Estudio del estado del

arte2.1 Antecedentes

La ingeniería bioquímica es una disciplina que estudia el procesamiento de

materiales de origen biológico para generar bienes y servicios, los materiales

biológicos que competen a ésta disciplina son primordialmente aquellos derivados

de microorganismos, células o sus partes. La contribución de la ingeniería

bioquímica es generar productos a los menores costos, mejor calidad y mayor

seguridad posibles tanto para el ser humano como para el medio ambiente, para

esto, el tema central de atención es el diseño y operación de bioprocesos

eficientes y reproducibles mediante la integración de las ciencias biológicas con

diversas ingenierías como la mecánica, eléctrica, económica e industrial, por

mencionar algunos (Aiba y col. 1973, Belter y col. 1988, Stanbury y Whitaker 1995,

Ramírez 2004).

En la Tabla 2.1 se observan los productos de interés industrial obtenidos por

fermentación en biorreactor y en la Tabla 2.2 se observan las aplicaciones de las

enzimas que son de los productos biotecnológicos más aceptados y


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comercializados. Muchos productos biotecnológicos ya han sido aceptados y

algunos están en su etapa de desarrollo, las aplicaciones van desde alimentos,

medicina, ambiental, vegetal, industrias textiles y del petróleo.

Tabla 2.1 Productos obtenidos por fermentación (Quintero 1997)

Compuesto Ejemplo

Ácidos orgánicos Acético,cítrico, fumárico, glucónico, itacónico, láctico

Aminoácidos Glutamato de sodio, L-lisina, DL-metionina, L-triptofano,L-valina

Alcoholes y solventes Etanol, acetona, glicerol, butanol, 2,3- butanodiol

Antibióticos Bacitracina, estreptomicina, neomicina, penicilina,

tetraciclina

Esteroides Cortisona, hidrocortisona, prednisolona, testosterona,triamcinolona

Proteína unicelular Alga, bacteria, levadura, hongo

Vitaminas Ácido ascórbico, cianocobalamina, -caroteno, rivoflavina

Otros Alcaloides, enzimas, insecticidas biológicos, metano,nucleótidos (saborizantes),promotores de crecimiento,

recuperación de minerales (Fe, Cu, Pb, Zn, etc.).Polisacáridos Goma xantana

La generación del mejor ente biológico para un bioproceso en particular es materia

de la biología celular, biología molecular, microbiología e ingeniería de proteínas,

entre otras disciplinas. No obstante, para que el desempeño del material biológico

(derivados de microorganismos, células o sus partes) sea el más adecuado es

necesario proporcionarle un entorno adecuado, lo cual es el tema principal de la

ingeniería bioquímica. Para lograr dar al ente biológico las condiciones adecuadas

para su desarrollo, es necesario del diseño de reactores y sus estrategias para

operarlos y controlarlos.


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Tabla 2.2 Aplicaciones de las enzimas producidas por fermentación, extraídode Quintero (1997)

Alimento Enzima Acción Posible utilidad

Cerveza

Glucosaoxidasa/catalasa

(hongo)Elimina el oxígeno

Impide el crecimientode microorganismos

aeróbicos quegeneran

ácidosvolátilesyempobrecen el sabor.

Diacetilreductasa(levadura)

Convierte elradical diacetilo enacetoïna (requiere

NADH)

Elimina el diacetiloque contribuye a la

aparición de saboresindeseables en la

cerveza.

Pan Lactasa (hongo) Rompe la lactosa

Provee de másazúcares

fermentables a lalevadura de pan apartir de la leche

utilizada en la mezcla.

Jugos defrutas

AmilasaHidroliza

almidones

Con pectinasaclarifica los jugos de

fruta

NaringinasaDestruye lanaringina

Elimina el saboramargo del jugocítrico y de las

cáscaras

Gelatina Lipasa (hongo) Rompe grasa

Aumenta elrendimiento de

gelatina de hueso dealta calidad pordesengrasado

Glucosa CelulasaHidroliza la

celulosa

Hidrólisis de pulpa depapel, periódico o

desperdicio agrícolapara producir glucosa

o azúcaresfermentables.


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El término biorreactor o fermentador se refiere al equipo donde se efectúa la

transformación biológica, particularmente el crecimiento celular, y aunque

generalmente los términos de biorreactor y fermentador se usan de forma

indistinta, en general, el segundo se aplica sólo para el caso de cultivos

microbianos. Los biorreactores son equipos donde se realiza el proceso de cultivo,

sea en estado sólido o líquido. El diseño de un biorreactor debe ser tal que

asegure homogeneidad en el sistema y condiciones óptimas para el crecimiento

microbiano y la obtención del producto deseado (Ramírez 2004).

2.1.1 Características de un biorreactor

Un biorreactor tiene como función principal contener al ente biológico en un

entorno adecuado, garantizando la seguridad tanto del medio ambiente, el de losoperadores y el del propio cultivo mismo, es por eso que los biorreactores están

diseñados para ser esterilizados y mantener la esterilidad durante su operación, se

construyen de acero inoxidable y vidrio que soporte las temperaturas y presión de

la autoclave. Los reactores de escala laboratorio son construidos generalmente en

vidrio (pero si los hay en acero inoxidable) y los de mayor escala, arriba de 15

litros, son en acero inoxidable.

Los biorreactores pueden ser agitados de forma mecánica o neumática, los más

comunes son los primeros. En la Figura 2.1 se observa la configuración de un

reactor agitado mecánicamente (Ramírez 2004, Asenjo 2007).


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Figura 2.1 Configuración de un biorreactor agitado (Ramírez 2004).

Los criterios más importantes para el diseño de un biorreactor pueden resumirse a

continuación.

El tanque debe diseñarse para que funcione asépticamente durante varios

días, para evitar la aparición de contaminantes en las operaciones de

bioprocesos de larga duración.

Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireación y agitación para

cubrir las necesidades metabólicas de los microorganismos. El consumo de energía debe ser el mínimo posible.

Debe contar con entradas para la adición de nutrientes y el control de pH.

El crecimiento microbiano es generalmente exotérmico, por lo que el

biorreactor debe facilitar la transferencia de calor, del medio hacia las

células y viceversa, a medida que se produce el crecimiento celular,

además de mantener estable la temperatura deseada.

Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de

cultivo.

Suministrar oxígeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo.


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El diseño debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una vez que

todo el sistema ha sido esterilizado y posteriormente inoculado con el

microorganismo deseado (Ruiz 2007).

2.1.2 Parámetros de operación de un biorreactor

El desarrollo de bioprocesos tiene como objetivo entender y mejorar dicho proceso

midiendo la mayor cantidad de parámetros o variables posibles. En la práctica,

durante la ejecución del proceso los parámetros críticos que se encuentran

disponibles para su medición y que son los adecuados para controlar el proceso y

con esto asegurar la mayor calidad y rendimiento, se encuentran limitados por la

escasez de un sensor adecuado para su posterior manipulación. Aunque existen

vigorosas investigaciones en el desarrollo de sensores, sólo una pequeña fracciónde éstos es adecuada para su uso durante la fermentación, ya que los

bioprocesos son sorprendentemente difíciles tanto de sensar y de controlar.

Los sensores que se pueden utilizar a lo largo de una fermentación y que se

encuentran dentro del cultivo celular no deben contaminar el bioproceso, por lo

tanto éstos deben ser previamente esterilizados. Debido a que la producción de

células debe efectuarse en condiciones adecuadas, es necesario otorgarle a éste

un medio propicio para su desarrollo y que además se pueden medir durante una

fermentación, en la práctica son:

pH (potencial de hidrógeno). Es uno de los parámetros más comúnmente

medidos, ya que las células durante la fermentación producen un cambio

en el pH como producto de su propio metabolismo. Por lo cual para generar

el mayor crecimiento celular depende altamente del pH.

Oxígeno disuelto. Ya que es un sustrato limitante para el crecimiento

celular debido a su baja solubilidad en agua.


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Temperatura. Debido a que el metabolismo del microorganismo es

exotérmico, es necesario regular la temperatura dentro de la fermentación

para una buena función celular (Harmsy col. 2002).

Biomasa. El mejor desempeño en una fermentación es logrando el mayor

crecimiento celular, o la mayor producción de un metabolito; a la mayor

cantidad de células producidas se le conoce como biomasa. La conversión

de sustrato a biomasa es claramente el resultado de un largo número de

reacciones químicas. (Nielseny col. 1994)

Agitación. Cabe destacar de igual manera que aunque no es un parámetro

que se pueda medir dentro de la fermentación, también es de gran

importancia controlar la velocidad de agitación en el medio de cultivo, ya

que al mantener la distribución homogénea de todo el cultivo celular,también rompe las burbujas de oxígeno lo cual logra que éste se encuentre

disponible para el consumo dentro del metabolismo celular.

Sustratos. De igual manera la adición de sustratos (dependiendo del tipo

de cultivo) es de gran importancia a lo largo de una fermentación, ya que

sin esta función dentro de un bioproceso no se llevaría a cabo el mejor

crecimiento celular, por lo cual es importante añadir de manera automática

nutrientes suficientes para el mejor desempeño metabólico de las células.La Figura 2.2 muestra la reacción y proceso envuelta en el crecimiento

celular y formación de producto.

Sin embargo, no sólo la medición y control adecuado de estos parámetros

puede garantizar el mejor desempeño de un bioproceso, también hay que

referirse al modo de operación, los cuales son, cultivos por lote, cultivo

alimentado y cultivo continuo, estos modos de operación de un biorreactor sedescriben a continuación.


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Figura 2.2 Perspectivas de reacción y proceso involucrados en elcrecimiento celular y formación de producto.

2.2.3 Control de bioprocesos

En la actualidad la industria biotecnológica necesita cumplir con estándares

nacionales e internacionales de seguridad industrial, legislación ambiental y

producción continua de alta calidad, por lo cual es de vital interés el desarrollo e

implementación de sistemas de optimización lo cual lleva a implementar sistemas

de optimización eficientes, principalmente con información en tiempo real de lasvariables críticas del proceso. Los procesos biotecnológicos implican la

incorporación de microorganismos creciendo mediante la catálisis de reacciones

bioquímicas. Los sistemas biológicos presentan comportamientos singulares tales

como oscilaciones en las concentraciones de uno o más metabolitos, multiplicidad

de estados estacionarios, histéresis y caos. Lo anterior es de especial interés para

los sistemas biológicos con aplicación industrial, por ejemplo: la producción de

enzimas, antibióticos, vacunas, colorantes, combustibles o la remoción de

diversos contaminantes recalcitrantes, entre ellos la gran familia de pesticidas,

herbicidas, metales pesados y derivados del petróleo, por mencionar algunos.


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La estructura de estos esquemas se basa en la integración de un modelo

matemático basado en balances de materia y energía que representen a nivel

macroscópico y microscópico el comportamiento de las variables implicadas en el

bioproceso, simulando y validando con la parte experimental el modelo propuesto

utilizando diversas herramientas computacionales. Una vez representada la

dinámica del bioproceso, se diseñan estructuras de estimación y lazos de control

mediante pruebas analíticas asegurando su convergencia con el sistema

experimental para una aplicación viable; estas estructuras se implementan en

algoritmos computacionales en una unidad virtual (virtual instrument-software

sensor) en una PC, en donde se alimentan las mediciones de los sensores en

línea salidas de control hacia el biorreactor y mediante un mecanismo de tipo

interface-operador se pueden modificar los objetivos de control, así como eldiagnóstico del sistema buscando una mejora continua para cada etapa del

bioproceso. La figura 2.3 muestra las características generales del control de un

bioproceso, en ella se muestra, el biorreactor como planta, la parte del sensado, la

interfaz y la parte de control.

Figura 2.3 Diagrama general del control de un biorreactor.


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24

2.1.3 Equipos existentes.

Existen equipos existentes en el mercado, cada uno con diferentes características

y funciones, además de capacidad y costo; algunos de estos equipos varían en

precio de los $700,000 hasta llegar a los $2,000,000 el cual depende de lasfunciones y la capacidad de los biorreactores. Algunos de ellos se mencionan a

continuación.

2.1.3.1 BIOSTAT® ORB

El ORB BIOSTAT® 200 es una nueva generación de biorreactores de un solo uso

con la tecnología contrastada de agitador y costos operativos excepcionalmente

bajos. El principio de agitación orbital garantiza una alta capacidad de

transferencia de oxígeno por aireación superficial y una mezcla eficiente con bajo

cizallamiento. Al eliminar la necesidad de dispositivos de mezcla interna y

aspersión, las bolsas constituyen una alternativa económica a la agitación con

biorreactores de un solo uso. El biorreactor de este tipo se muestra en la figura 2.4

y es ideal para:

Cultivos de células de mamíferos, insectos y plantas

Transición de frascos agitadores a un biorreactor de mayor tamaño

Suministro de proteínas

Sistemas piloto de producción a gran escala de hasta 200 litros

Cultivo de semillas para biorreactores a gran escala

Tiene sensores de pH, OD precalibrados y esterilizados.

Gran variedad de tubos y puertos que permiten gran flexibilidad para conectarse a

otros biorreactores.


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25

Figura 2.4 Biorreactor BIOSTAT® ORB.

2.1.3.2 Biorreactor LAMBDA MINIFOR®

Un fermentador más con características diferentes al BIOSTAT es el LAMBA

MINIFOR que varía en sus características así como en la funcionalidad y

capacidad, el biorreactor se muestra en la figura 2.5 y las características se

mencionan a continuación:

Volúmenes de cultivo desde 35ml hasta 6 litros en un solo equipo.

Radiador patentado IR (Infrarrojo) con reflector parabólico bañado en oro se

utiliza para calentar suavemente el medio de cultivo.

Nueva agitación “fish-tail” (cola de pez) para sueve mezclado en cultivos

celulares.

Ideal para cultivos continuos, procesos batch y fed-batch.

Esterilizable en autoclave común.


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26

Figura 2.5 Biorreactor LAMBDA MINIFOR®.

2.1.3.3 Biorreactor BIO FLO 310®

El biorreactor BIO FLO 310 que se muestra en la figura 2.6 tiene las siguientescaracterísticas:

El recipiente de vidrio se puede intercambiar en autoclave y existen de 2.5,5, 7.5 y 14 litros.

Medición de Ph, OD por medio de software.

Cuenta con sistema de transferencia de oxígeno al medio.

Cuenta con 2 puertos USB, y conexiones input-output.

Cuenta con sistemas de aireación.


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27

Figura 2.6 Biorreactor BIO FLO 310®.

Los precios de estos biorreactores oscilan entre los $600,000 pesos y $900,000

pesos dependiendo de las funciones que contenga, los mostrados anteriormente

contienen funciones superiores a los que contienen solamente la medición y

control de los biorreactores comunes. Los mostrados en la sección 2.2.3.1 a la

2.2.3.3 muestran características superiores, como lo es la supervisión de los datos

adquiridos en línea, lo cual hace que el valor del biorreactor pueda alcanzar más

de $1,200,000 pesos en el precio de ctálogo, aumentando su costo en la

transportación hasta México.

2.2 Modos de operación de cultivo

Una de las formas prácticas de controlar el desempeño de un bioproceso es

manipulando la forma o modo en que se opera el cultivo celular, así como también

éstos se deben apoyar en la elaboración de modelos matemáticos. Los modos de

operación más comunes son: cultivo lote, cultivo continuo y cultivo alimentado o

también llamado cultivo lote alimentado.


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28

2.2.1 Cultivo lote

Este es el modo de operación más sencillo, y por ende el más frecuentemente

empleado en la industria debido a su bajo costo ya que no requiere de dispositivos

adicionales para su funcionamiento; sin embargo es el menos productivo ya que

las concentraciones celulares y producto alcanzadas son bajas y el tiempo muerto

entre lotes puede ser significativo. En un cultivo lote se cargan inicialmente los

nutrimentos los cuales se agotarán a medida que el cultivo crece, es decir, la

concentración de sustratos decrece con el tiempo mientras que la formación de

productos aumenta.

Al final de la fermentación, el reactor es vaciado, limpiado y preparado para otro

cultivo por lotes con diferente fermentación, de aquí viene el problema de los

tiempos muertos entre fermentaciones. Un inconveniente más que se tiene con

este modo de operación es, que la química y la reacción de crecimiento no son

conocidas con precisión. En la Figura 2.6 se muestra un esquema general del

funcionamiento del cultivo por lote, en la Figura 2.6a se muestra el

comportamiento cinético típico de la biomasa y sustrato , así como el valordel volumen del cultivo . En la Figura 2.6b se muestra como el valor delvolumen a lo largo de la fermentación permanece constante, esto se debe a que

no existen entradas de sustrato o salidas producto, mientras que los valores de

biomasa crecen durante un tiempo y decrecen (representando la muerte de las

células) después de que se ha terminado el sustrato; de la misma forma se

muestran los valores de sustrato, que decrecen debido al consumo de las células

a lo largo de la fermentación.


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29

(a) (b)

Figura 2.6 Representación de cultivo lote, esquema general en (a) y cinéticade cultivo en (b).

Los modelos que rigen este modo de operación por medio de balances de materia

son los denotados por las ecuaciones 2.1 para consumo de sustrato y la ecuación

2.2 el cultivo celular, la ecuación 2.3 representa el consumo de sustrato en

relación al cultivo celular y la ecuación 2.4 representa la generación de producto.

= 2.1

= 2.2

=

/

/ 2.3

= 2.4

2.2.2 Cultivo continuo

Es uno de los modos de operación más poderosos ya que permite manipular las

condiciones de crecimiento y al mismo tiempo mantener un ambiente constante

durante todo el transcurso del cultivo. En este modo de cultivo se alimenta

constantemente una corriente con medio de cultivo fresco y se cosecha al mismo


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flujo de alimentación una corriente conteniendo células, medio agotado y

productos. La gran utilidad del cultivo continuo radica en que permite operar un

cultivo bajo régimen de estado estacionario, es decir aquella situación en que

todas las variables permanecen constantes con respecto al tiempo (Doran1995,

Ramírez 2004). La figura 2.7 representa de manera esquemática al cultivo

continuo y la cinética de crecimiento celular.

(a) (b)

Figura 2.7 Representación de cultivo continuo. 2.4a. Esquema delbiorreactor. 2.4b. Cinética de cultivo continuo.

2.2.3 Cultivos alimentados

En este modo de operación se suplementa uno o varios nutrimentos limitantes a lo

largo del cultivo en vez de agregarlos todos al inicio. Existen además muchas

formas de alimentar tales sustratos, como por ejemplo por pulsos, continuamente

de forma constante (cultivo alimentado lineal) o de forma creciente (cultivo

alimentado exponencial), con esto se evita, por un lado que se agoten los

sustratos esenciales y por otro lado se previenen efectos negativos que resultarían

si tales substratos fueran adicionados inicialmente a altas concentraciones. Entre

los efectos negativos del cultivo alimentado se encuentran, la inhibición al

crecimiento celular por la alta concentración de sustrato o el desvío del

metabolismo hacia vías improductivas y que generan subproductos tóxicos. La


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31

Figura 2.8 representa de manera esquemática el modo de operación y el

comportamiento cinético del cultivo alimentado respectivamente; en la Figura 2.4b

(a) (b)

Figura 2.8. Representación de cultivo lote alimentado. 2.4a. Esquema debiorreactor. 2.4b. Cinética del cultivo lote alimentado.

Se puede ver que, mientras exista una entrada de sustrato constante, la cantidad

de biomasa permanecerá constante y el volumen irá en aumento con forme dure

el tiempo de la fermentación.

La ecuación 2.5 describe el comportamiento del cultivo celular, la ecuación 2.6

representa el consumo de sustrato en relación al cultivo celular y la ecuación 2.7representa el cambio de volumen en el biorreactor a lo largo de la fermentación

por una entrada de flujo de sustrato(Doran1995).

= 2.5 =

2.6

= 2.7

Por lo tanto, para generar el mayor crecimiento celular en unafermentación, no

basta con controlar las variables involucradas en dicho crecimiento (PH,


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temperatura, etc.) sino que también depende del modo de operación del

biorreactor (cultivo lote, cultivo continuo o cultivo alimentado), descrito

anteriormente.

2.3. Parámetros de operación

Una vez identificados los parámetros a controlar, y los modos de operación de un

biorreactor para el crecimiento celular, el trabajo inmediato es proponer la manera

de cómo controlar dichas variables, la elección de sensores y actuadores capaces

de dar al microorganismo las condiciones adecuadas de crecimiento; también, es

necesario que los actuadores sean regidos por leyes de control para lograr la

estabilización de dichas variables con respecto a las demandas del

microorganismo. En la tabla 2.3 se muestran los parámetros que más

comúnmente se manejan en una fermentación.


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33

Tabla 2.3 Variables comúnmente medidas en fermentadores y dispositivosutilizados para su determinación (Ramírez 2004).

Parámetr o medid o en línea Disp os itiv o/Instr um ento

Físicos

TemperaturaPresiónNivel del líquido

PesoFlujo (volumétrico, másico)

VelocidadTamaño y velocidad de burbujas

Hidrodinámica

Potencia

Termopar

ManómetroManómetros, sensor de conductividado capacitanciaBalanza, celdas de cargaRotámetro, controladores de flujomásicoTacómetroSensor de conductividad o fibraóptica, ultrasonido.

AnemómetrosTorquímetro y tacómetro

Fisicoquímicos pH

Oxígeno disuelto

Dióxido disuelto

Capacitancia y conductancia

Potencial redoxComposición de gases a la salida

Electrodo de vidrio, electrodo de fibraóptica y agente fluorescenteElectrodo galvánico/polarográfico,electrodo de fibra óptica y agentefluorescenteElectrodo de fibra óptica y agentefluorescente, electrodo de pH ysolución de bicarbonatosMonitor de biomasa

Electrodo de referenciaEspectrometría infrarroja o de masa.Biológicos o bioquímicosNADH Y NADPH

Densidad celularSensores de fluorescenciaSensores de turbidez, absorbancia,amperométricos o ultrasónicos.

Parámetros medidos en sistemas de flujo inyectado Ácidos orgánicosCarbohidratos

Actividades enzimáticas

AminoácidosDensidad y ciclo celularContenido de ácidos nucleicos

Equipos conectados a través de sistemas de flujo inyectado

Cromatógrafo de gases, cromatógrafo de alta resolución (HPLC), cromatografíade proteínas (FLPC), Cromatografía de iones, espectrómetro de masas,espectrofotómetro, analizadores bioquímicos (basados en biosensores), citómetrode flujo, resonancia magnética nuclear.


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Un recurso más que se tiene para lograr el mayor crecimiento microbiano, es

basarse en los modelos de crecimiento celular establecidos, esto con el fin de

conocer la dinámica del crecimiento celular, y por medio de éstos modelos

consumir el mínimo de recursos (adición de álcali en el balance del pH, control de

la temperatura tomando en cuenta las reacciones bioquímicas que generan

temperatura adicional al bioproceso durante la fermentación, etc.) y así lograr un

sistema adecuado de crecimiento celular de lo que se desea producir (Morris

1975,Macarullay Goñi1994, Haberman1998, Inghamy col 2000, Najafpour 2007).

2.3.1 pH (potencial de Hidrógeno)

Es uno de los parámetros más comúnmente medidos, ya que las células durante

la fermentación producen ácidos como producto de su propio metabolismo. Por lo

cual para generar el mayor crecimiento celular depende altamente del pH. Para

medir el potencial de hidrógeno (pH) es necesario constar con un transductor

adecuado que pueda ser capaz de ofrecer una señal eléctrica como un nivel de

voltaje a partir de la señal física que queremos medir, como lo es el pH, y uno de

estos transductores es el electrodo de vidrio. Los electrodos de vidrio son

“instrumentos de lectura directa”, leyéndose el pH de la disolución donde se

introduce el electrodo de vidrio en una escala con unidades de pH, la cual segradúa con valores de pH de referencia, suministrados por disoluciones tampón

estándar. Po tanto, la determinación del pH de una disolución con este

instrumento no requiere cálculos, pero debe tenerse en cuenta que:

a) El instrumento mide actividades del ion +;b) Debido a las restricciones propias de la composición química de las

membranas de vidrio normales, los instrumentos de electrodo de vidrio

pueden usarse solamente en una margen de valores de pH de 1 a 10;


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c) La membrana de vidrio debe mantenerse limpia; cuando se use para

determinar el pH de extractos celulares, etc., se debe tener mucho cuidado

en no permitir la desecación de una película de proteína en su superficie.

Un medidor de pH, mide en realidad una diferencia de potencial entre el llamadoelectrodo de referencia y un electrodo de vidrio. El electrodo de vidrio consiste en

esencia en una membrana selectivamente permeable a los hidrogeniones

(Douglas y col. 2001, Creus 2006). En la figura 2.9 se muestra el electrodo de pH.

Figura 2.9. Electrodo de vidrio para medir pH.

2.3.2 Oxígeno Disuelto (OD)

Uno de los parámetros importantes a medir a lo largo de una fermentación es el

oxígeno disuelto, ya que es un sustrato importante para que se lleve a cabo el

metabolismo celular, y a partir de éste se calcule el coeficiente volumétrico global

de transferencia de masa , y éste a su vez depende de otros factores en eldiseño de operación como lo es la velocidad de agitación que modifica el régimen

de turbulencia y disminuye el tamaño de burbuja manteniendo así el oxígeno

disponible para la célula y su metabolismo; también es importante la temperatura

del medio de cultivo ya que dependiendo esta, hará que varíe la cantidad de

oxígeno disuelto, así como también lo es la presión del biorreactor a lo largo de la

fermentación. Es así como la medición de oxígeno disuelto es muy importante

para saber qué cantidad del oxígeno es transferido al medio de acuerdo con la


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aireación suministrada al biorreactor y las revoluciones que permiten la agitación

(Najafpour 2007,Mettler Toledo Operation manual transmitter M300).

Para medir la cantidad de oxígeno disuelto en el medio de se utiliza un electrodo

del tipo Clark polarográfico que mide la concentración de oxígeno en agua o

soluciones acuáticas, este a su vez contiene un cátodo de platino y un ánodo de

cloruro de plata separados por una membrana de plástico permeable llena de

gas(Mettler Toledo. Operation manual transmitter M300, Creus 2006).

La Figura 2.10 muestra de manera esquemática al electrodo de oxígeno disuelto, y

las conexiones con las que cuenta, mientras que la Figura 2.11 muestra la

configuración de las conexiones y la asignación de las mismas, así como laconfiguración interna del electrodo.

Figura 2.10. Electrodo de Oxígeno disuelto. Instrumento.


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Figura 2.11. Electrodo de Oxígeno disuelto. Conexiones.

2.3.3 Temperatura

La medición de temperatura es un parámetro del crecimiento celular muy

importante debido a la relación que tiene con la cantidad de oxígeno disuelto en el

biorreactor, así como permitir un funcionamiento adecuado en el mismo debido a

las reacciones bioquímicas que se suscitan. El cambio de temperatura dentro de

un biorreactor se produce debido al metabolismo celular, ya que mientras este se

lleva a cabo se linera energía y esto le da condiciones inadecuadas al

microorganismo para realizar su metabolismo, durante el análisis de crecimiento

celular y producción de producto generalmente no se considera modelar el

balance de energía, es decir el cambio de temperatura ya que si se mantiene la

temperatura constante, puede considerarse despreciable. Una razón más de

mantener la temperatura constante.


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En el campo de la instrumentación, las mediciones de temperatura son de lo más

común, sin embargo, si no se emplean las técnicas o los equipos adecuados,

estas mediciones pueden ser erróneas. El termopar es por mucho el sensor de

temperatura más usado en la industria por diferentes razones, podemos

mencionar entre otras el amplio intervalo de temperatura de uso, su robustez, la

relativa buena exactitud, rápida respuesta a cambios de temperatura, versatilidad

de uso y bajo costo. De acuerdo al uso o aplicación en la cual se desea utilizar el

termopar, es necesario recurrir a la información y especificaciones que el

fabricante ofrece, para seleccionar el más conveniente (Creus 2006).

Una de las características que debe tomarse en cuanta es el rango de temperaturaa la cual se trabajará a lo largo de la fermentación, además de que dependiendo el

materia de construcción del termopar está la funcionalidad; ya que el material con

el que esté construido está en función de la precisión de la medición de la

temperatura, ofreciendo más fidelidad al momento de la medición. La tabla 2.4

muestra el tipo de termopar y el tipo de calibre, características de construcción

específicas, y las temperaturas máximas que pueden manejar, dependiendo el tipo

de termopar seleccionado. Mientras que la figura 2.12 muestra la imagen de un

termopar convencional.


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Tabla 2.4.Características de termopares de acuerdo al tipo.

TERMOPARTIPO

CALIBRES AWG = (mm)

8 = 3.25 14 = 1.63 20 = 0.81 24 = 0.51 28 = 0.33

T *** 370° C 260° C 200° C 150° C

J 760° C 590° C 480° C 370° C 320° C

E 860° C 650° C 540° C 430° C 430° C

K 1260° C 1090° C 980° C 870° C 760° C

R *** *** *** 1480° C ***

S *** *** *** 1480 ° C ***

B *** *** *** 1700° C ***

N 1260° C 1090° C 980° C 870° C 760° C

La caracterización del termopar en cualquier experimento es fundamental, ya que

aunque el fabricante ofrezca ciertas especificaciones, siempre es mejor constatar

cada una de ellas, ya que al momento de fabricar puede que las características

lleguen a variar, además de que es una tarea importante para obtener un

polinomio de interpolación, el cual será utilizado posteriormente en la

programación, indispensable para la visualización de la medición realizada en elhyperterminal de Windows, conectado al microcontrolador (Rowe 1995,

Anatychuk1998).

Figura 2.12. Termopar convencional.


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2.3.4 Agitación del medio de cultivo

La mezcla de fluidos es un proceso importante en los procesos de fermentación,

por lo general el más crítico, dado que es un parámetro importante en las

fermentaciones aerobias, sin embargo también es utilizado en los procesos

anaerobios. Los procesos de agitación pueden ser clasificados en dos grupos, el

primero es aquel en el que se necesita algún tipo de uniformidad en el medio de

cultivo y el segundo es para aquellos en los que se necesite algún tipo de

transferencia de masa o reacción química como criterio de operación (Perry y col.

2001). La Tabla 2.5 muestra una clasificación de los procesos de agitación por

tipo(VogelyTorado1997).

Tabla 2.5. Clasificación de procesos de agitación.

Tratamiento físico Tipo de aplicación en medio Tratamiento químicoSuspensión Líquido-sólido DissolvingDispersión Líquido-gas AbsorciónEmulsión Líquido inmisible ExtracciónMezcla Líquido misible ReacciónBombeo Fluido en movimiento Transferencia térmica

En este contexto la agitación forma parte de los procesos de transferencia de

masa, debido a que el oxígeno que es un sustrato importante para el metabolismo

en las fermentaciones anaerobias, debe encontrarse disponible para el

microorganismo en todo momento. La agitación permite que el oxígeno se

disuelva en el medio de cultivo y así que el tamaño de burbuja sea los

suficientemente pequeño para el consumo del microorganismo y permitir que

exista el suficiente oxígeno a lo largo de la fermentación. La agitación puede

llevarse a cabo de distintas maneras, la más utilizada para medios líquidos es por

impulsores, los cuales son implementados con motores. La Figura 2.13 muestra

un esquema de la agitación mecánica de un medio de cultivo.


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41

Figura 2.13. Agitación del medio de cultivo.

2.3.5 Alimentación de sustrato.

La alimentación de sustrato en un biorreactor a lo largo de una fermentación es

importante cuando se trabaja en los modos de operación lote alimentado y

continuo, las formas más comunes de alimentar un biorreactor según su modo de

operación son de forma creciente, de forma constante y por pulsos, y se utilizan

según el operador lo necesita; es decir, si lo que se quiere es producir algún

metabolito como resultado del metabolismo celular o aumentar la producción decélulas, es necesario determinar el tipo de alimentación a utilizar Figura 2.14. La

forma más común de suministrar sustrato es por medio de bombas peristálticas,

dichas bombas simulan el movimiento peristáltico del sistema digestivo y

funcionan básicamente con un motor eléctrico, y un cabezal con 2 o 3 rodillos que

aprietan la manguera que suministra el sustrato generando así un vacío que

empuja el líquido hacía el sentido donde se quiere suministrar el líquido. La Figura

2.15 muestra de manera esquemática la parte interna de una bomba peristáltica

(Flinkingery Drew1999).


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Figura 2.14. Tipos de alimentación en bioproceso.

Figura 2.15. Bomba peristáltica.

2.3.5.1 Alimentación de sustrato de forma creciente.

El tipo de alimentación de forma creciente, como su nombre lo indica, es agregar

sustrato limitante de manera exponencial para el microorganismo dando a este

tipo de cultivo la propiedad de mantener la velocidad específica de crecimiento

constante, en el biorreactor. Este cultivo es conocido como cultivo alimentado

exponencial.


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43

2.3.5.2 Alimentación de sustrato de forma constante.

La alimentación de sustrato limitante que se agrega de forma constante es la más

comúnmente utilizada, y consiste en suministrar sustrato en una cantidad en / que no varía a lo largo del proceso de fermentación. Este cultivo es conocidocomo cultivo alimentado lineal.

2.4 Simulación de los sistemas de cultivo

La simulación de los sistemas de cultivo se basó en los puntos siguientes:

Ecuaciones de balance de masa para biomasa, sustrato y producto

Modelos de crecimiento, consumo de sustrato y producción

Condiciones de operación.

La Ecuación General de Balance de masa se observa en la ecuación 2.8 que es

válida para todos los sistemas de cultivo y dependiendo del tipo (lote, continuo,

alimentado) y de la variable (biomasa, sustrato y producto) varían los términos.

ó = – ó – 2.8

Esta ecuación se debe plantear para cada variable, es decir: biomasa, sustrato y

producto.

Una extensa revisión bibliográfica permitió desarrollar las ecuaciones para cada

tipo de cultivo y revisar los principios de modelado (Pirt 1975, Levenspiel 1985,

Atkinson 1986, Bailey 1986, Lee 1992, Geankoplis 1998, Jakymec y col. 2001,

Najafpour 2007) y obtener la solución de las ecuaciones diferenciales para realizar

la simulación (Cooker 2001, Zill 2002, Kreyszig 2003, Chung 2004, Yang y col.

2005).


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44

2.4.1 Cultivo lote

2.4.1.1 Balance de biomasa

Es un sistema cerrado como el cultivo lote, el balance para biomasa es:

ó = ó = 2.9

Utilizando el modelo de Monod para crecimiento

= 2.10

= 2.11

=

2.12

La ecuación diferencial se resuelve analíticamente para la obtener la evolución de

la biomasa en función del tiempo. También se puede utilizar el modelo logístico

para crecimiento quedando la ecuación la ecuación de la siguiente forma:

= (1 ) 2.13 Esta ecuación diferencial también se resuelve analíticamente para la obtener la

evolución de la biomasa en función del tiempo.

2.4.1.2 Balance de Sustrato

Es un sistema cerrado como el cultivo lote, el balance para sustrato es:

ó = = 2.14


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45

Utilizando la ecuación de Aborhey y Williamson que incluye el modelo de

crecimiento logístico y de producción de Luedekin-Piret, la ecuación diferencial

queda de la siguiente forma:

= 1 1 – 2.15 =

1

1 (

) 2.16

=

1

2.17

Utilizando el modelo logístico para crecimiento desarrollado en la parte de

biomasa se resuelve la ecuación diferencial de forma analítica.

2.4.1.3 Balance de Producto

Es un sistema cerrado como el cultivo lote, el balance para producto es:

ó = ó

= 2.18

Utilizando el modelo de producción parcialmente asociado crecimiento de

Luedeking-Piret.

=

2.19

Utilizando el modelo logístico para crecimiento desarrollado en la parte de

biomasa se resuelve la ecuación diferencial de forma analítica. También utilizó el

modelo logístico para producción, dado por la ecuación:

= (1 ) 2.20


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46


2.4.2.1 Balance de Biomasa

Es un sistema abierto como el cultivo continuo, el balance para biomasa es:

ó = ó = 2.21

En estado de equilibrio dinámico la acumulación es 0 =0 2.22

Por lo tanto:

=

A se le llama velocidad de dilución, manipulando su valor se puede controlar lavelocidad específica de crecimiento, , es decir el metabolismo del

microorganismo. se calcula con los parámetros de operación y , es el flujode entrada (dado por la bomba peristáltica) y es el volumen de operación delreactor. Dado que el volumen del reactor permanece constante, se puede

manipular para variar mediante la fórmula siguiente:

= 2.23 2.4.2.2 Balance de Sustrato

Es un sistema abierto como el cultivo continuo, el balance para sustrato es:

ó = = 2.24

= 2.25


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47

=

2.26

En estado de equilibrio dinámico la acumulación es 0:

=0 2.27 = 2.28

Para el cálculo de s, dada una , se utilizó el modelo de Monod, despejando s y

sustituyendo . Conocida la s se puede calcular x .

=

2.29

2.4.2.3 Balance de Producto

Es un sistema abierto como el cultivo continuo, el balance para producto es:

ó = ó

= 2.30

En estado de equilibrio dinámico la acumulación es 0:

=0 2.31)

= 2.32 Para el cálculo de se usó el Modelo de la triple constante de Luedeking-Piret

= 2.33


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2.4.3 Cultivos alimentados o cultivos lote alimentadoLos cultivos lote alimentado son sistemas semicerrados, es decir, pueden existir

tanto entrada como salidas del biorreactor existen 3 tipos de cultivos de a cuerdo a

su modo de alimentación

Cultivo alimentado exponencial. Caracterizado por el incremento del flujo

en forma exponencial, bajo ciertas condiciones es posible mantener la

velocidad específica decrecimiento constante, dado que el volumen se

incrementa también de manera exponencial. Presenta las ventajas del

cultivo lote por su bajo costo en implementarlo y del cultivo continuo por su

alta productividad.

Cultivo alimentado lineal. Se caracteriza por mantener un flujo de entrada

de sustrato constante, y el incremento de volumen en el biorreactor

aumenta de forma lineal.

Cultivo alimentado por pulsos. Se adiciona el sustrato de manera

discreta, y esta operación se realiza cuando por ejemplo se observa una

disminución en la medición del oxígeno disuelto.

2.4.3.1 Cultivo alimentado exponencial

2.4.3.1.1 Balance de BiomasaEs un sistema semicerrado como el cultivo lote alimentado exponencial, el balancepara biomasa es:

ó = ó En este cultivo tanto la biomasa como el volumen varían por lo que el crecimiento

se expresa en dos diferenciales, el balance volumétrico queda expresado como:

= ( ) () = 2.34 = 2.35


50/96

49

= ( ) 2.36

= 2.37

= ( ) 3.38 El balance global se formula para la biomasa total, = .

= 2.39 Resolviendo la diferencial:

= 2.40

= 2.41 2.4.3.1.2 Balance de Sustrato

Es un sistema semicerrado como el cultivo lote alimentado exponencial, el balancepara sustrato es:

ó =

En este cultivo tanto la biomasa como el volumen varían por lo que el crecimiento

se expresa en dos diferenciales.

= (

) (

) =

2.42

= ( ) (

) =

2.43

= 2.44

=

2.45

= 2.46


51/96

50

= =

2.47

2.4.3.1.3 Balance de Producto

Es un sistema semicerrado como el cultivo lote alimentado exponencial, el balance

para sustrato es:

ó = ó

En este cultivo tanto la biomasa como el volumen varían por lo que el crecimiento

se expresa en dos diferenciales.

= (

) (

) = 2.48

= 2.49 =

2.50

El balance global se formula para el producto total, P =pV .

= 2.51

2.4.3.2 Cultivo alimentado linealEn este tipo de cultivo el Flujo, F , es contante y el volumen varía de acuerdo a laecuación:

= 2.52 = 2.53

Se establecen los balances de manera similar al cultivo exponencial:

Balance de Biomasa: Acumulación = Generación

Balance de Sustrato: Acumulación = Entrada – Consumo

Balance de Producto: Acumulación = Generación

Las ecuaciones diferenciales para cada balance son:


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= (

) 2.54

=

2.55

= 2.56 Considerando los modelos de, consumo de sustrato y formación de producto:

= 2.57 =

2.58 = 2.59

La variación de x, s, p en función del tiempo, se obtienen resolviendo el sistema

de ecuaciones diferenciales mediante el método numérico de Runge-Kutta de

cuarto orden (Zill 2002).

=− 226 2.60 =− 226 2.61 =− 226 2.62

Las constantes K, L y M son evaluadas al tiempo = 1 ℎ. El valor de h esun intervalo de tiempo arbitrario.


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Capítulo 3 Implementación del

sistema3.1 Biorreactor

La figura 3.1 muestra el proceso de fermentación que actualmente se lleva a cabo

en los biorreactores con los que se cuenta en el Departamento de Biotecnología

de la UPP. En estos biorreactores todos los parámetros medidos, como el pH,

temperatura, alimentación de sustrato agitación de medio de cultivo son

registrados de manera manual y no existe ningún programa de adquisición de

datos. Cabe mencionar que en el Departamento de Biotecnología contamos con

varios biorreactores de diferentes capacidades que vas desde 0.5l a 900 l que

requieren un sistema de adquisición automatizado, como el que aquí se propone.


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Figura 3.1. Procesos e fermentación en biorreactor escala laboratorio.

La Figura 3.2 muestra al biorreactor de 4 litros en vidrio con medidas estándar con

sensores de oxígeno disuelto y pH, así como las bombas peristálticas para adiciónde sustrato y sustancias ácidas y álcali.

Figura 3.2. Biorreactor de 4 litros de la UP-Puebla.

La tabla 3.1 muestra las medidas estándar de un reactor de 4 litros (que se

encuentra en la Universidad Politécnica de Puebla), y la relación entre todas las

medidas que tiene, como lo es la altura el diámetro, la medida de las paletas, etc.Cuenta con 2 impulsores tipo Rushton de 6 paletas planas.


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Tabla 3.1Relaciones estándar del reactor de 4 litros utilizado.

Relación Nomenclatura Valor

Altura del líquido en el reactor/Altura del reactor HL/Ht ~0.7-0.8

Altura del reactor/Diámetro del reactor Ht/Dt 2Diámetro del impulsor/Diámetro del reactor Da/Dt 1/3

Diámetro del bafle/Diámetro del reactor Db/Dt 0.1

Altura de la paleta del impulsor/Diámetro delimpulsor

W/Da 0.2

Ancho de la paleta del impulsor/Diámetro delimpulsor

L/Da 0.25

Distancia media de la paleta del impulsor al

difusor/Diámetro del impulsor

E/W 1

3.2 Control para los cultivos

3.2.1 Cultivo alimentado exponencial.El problema consiste en suministrar una entrada de sustrato de forma creciente

por medio de una bomba peristáltica que funciona con un motor de corriente

directa, esto es, adicionar al biorreactor un flujo de entrada de sustrato de manera

creciente. Para resolver este problema es necesario generar una estrategia decontrol que realice la tarea de aumentar las revoluciones del motor de corriente

directa de la bomba peristáltica de forma exponencial. Además, hay que tener en

cuenta el diámetro y tipo de material de la manguera con el que se realizará la

alimentación (Astrom y Hagglund 2000).

Para análisis de simulación podemos representar las ecuaciones 2.5, 2.6 y 2.7 en

espacio de estados y utilizando el modelo de Monod de la ecuación 3.3(Nielsen y

col. 1994, Inghamy col. 2000, Harms y col. 2002) se obtienen las ecuaciones 3.56,3.57 y 3.258.


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= 3.1

̇ = 3.2

̇ = 1

3.3

̇ = = 3.4 donde, y son biomasa, sustrato y volumen respectivamente; y es el flujode entrada de sustrato. Dado que la entrada puede ser de flujo constante y deflujo en incremento creciente es necesario relacionarla con la velocidad específica

de crecimiento , la concentración celular inicial , el volumen de operación inicialen el biorreactor , el rendimiento de biomasa sobre sustrato y la concentraciónde sustrato de entrada , mostrado en la ecuación 3.59.

= exp 3.5 Esta deducción es posible si se considera que la fermentación se realiza

inicialmente en cultivo lote hasta alcanzar una concentración celular alta, y

posteriormente comenzar una fermentación en cultivo lote alimentado con entradacreciente, considerando una velocidad específica de crecimiento constante.

Una de las maneras de controlar el flujo de una bomba peristáltica es controlar la

velocidad del motor dado que el motor a utilizar es de corriente directa, la

estrategia de control que se utiliza convencionalmente es un PID (Morris 1975). El

diagrama de bloques que ilustra esta estrategia de control se encuentra en la

figura 3.3 Se observa la estructura general de un controlador PID aplicado a un

motor eléctrico.


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e u y

u

V

XYref

Figura 3.3. Estructura del controlador PID y la planta a controlar.

Mientras que la figura 3.4 muestra a la planta o biorreactor representada por

ecuaciones de estado a la cual se le agrega un flujo de sustrato de entrada de

manera creciente, dando como resultado a la salida del sistema un crecimiento de

biomasa y un aumento en el volumen del biorreactor.

Figura 3.4. Esquema del sistema de control como entrada al biorreactor deuna bomba peristáltica.

3.2.2 Alimentación linealDado que la alimentación de un cultivo alimentado linealmente requiere una

alimentación de sustrato constante, es necesario mantener la velocidad del motorque tiene la bomba a una velocidad constante, para lo cual se realizó una

simulación con un control de velocidad PID al motor por medio de simulink. El

diagrama se muestra en la figura 3.5.

La simulación consistió en la sintonización del controlador por método de Ziegler-

Nichols(Kuo2002), o método de respuesta en frecuencia.La dificultad de controlar

los cultivos alimentados radica en las múltiples variables que se deben considerar

que van desde la velocidad de la bomba peristáltica, el cabezal, el tipo de

manguera, el material de la manguera, el microorganismo utilizado (parámetros

PID Proceso

Medición

Referencia

Control de Flujo = =


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cinéticos), el volumen inicial y final de operación y la velocidad específica de

crecimiento deseada.

Figura 3.5. Diagrama a bloques del controlador PID del motor de corrientedirecta.


Un cultivo continuo descrito en la sección 2.2.3 describe que existe tanto entrada

de sustrato y salida de medio de cultivo, por lo cual debe considerarse en primer

lugar que la entrada de sustrato al biorreactor es constante, así como también lo

es la salida de medio de cultivo. Dado que la bomba que alimenta de sustrato al

biorreactor funciona con un motor de corriente directa, así como también la bomba

que sustrae medio de cultivo del mismo, es necesario controlar las revoluciones

del motor para controlar el flujo de entrada y salida del biorreactor. Lo másconveniente es utilizar una estrategia de control PID; la simulación del control de

las revoluciones del motor a una entrada constante de voltaje es la misma que

para el modo de operación cultivo lote alimentado linealmente descrito en la

sección 3.3.1.2.

3.3 Agitación de medio de cultivo

Como se mencionó en la sección 2.3.4 la agitación en el medio de cultivo favorece

los fenómenos de transferencia de masa y es así como es considerado de gran

importancia en una fermentación, la intención de aumentar las revoluciones en el

medio de cultivo es para aumentar el índice volumétrico de transferencia de masa,


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que es un parámetro importante para conocer la cantidad de oxígeno que se

transfiere al medio de cultivo y está disponible a manera de sustrato para el

metabolismo celular del microorganismo. La agitación del medio de cultivo se lleva

a cabo por un motor de corriente directa con reducción de velocidad que va de 0 a

1800 rpm ,el cual se controla de manera conveniente por medio de un controlador

PID. Y la simulación de se muestra en la figura 3.6.

Figura 3.6. Diagrama a bloques del controlador PID del motor de corrientedirecta.

3.4 Medición de pH.

Se cuenta con un electrodo de pH de vidrio, marca Conductronic, las lecturas de

voltaje con sustancias buffer de pH conocido son en el orden de milivolts, pero

amplificados posteriormente a la salida del electrodo por un amplificador TL081.La Tabla 3.2 muestra las mediciones con las sustancias buffer.

Tabla 3.2 Voltajes obtenidos con sustancias buffer y amplificadas.

pH Buffer Voltaje conamplificación (V)

4 4.327 0.3310 -3.55

Con los datos obtenidos se pretende conocer que voltajes serán medidos con

cualquier sustancia de pH desconocido, una buena aproximación a partir de la


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información obtenida mostrada en la tabla 3.2 es realizar una interpolación de

Lagrange, y de éste modo obtener un polinomio que represente la relación voltaje-

pH que es necesaria para ofrecer una medición durante el proceso de

fermentación para el usuario. El polinomio que se obtuvo a partir de las tres

sustancias base es el siguiente.

= 19110000 19432500 7 3.60

3.5 Medición del oxígeno disuelto

En los procesos aerobios, el oxígeno es un sustrato limitante, ya que sus

características fisicoquímicas limitan su solubilidad en líquidos, por lo que el

transporte de oxígeno del exterior al reactor es necesario para el crecimiento idealde microorganismos. El transporte de oxígeno está directamente relacionado con

las características físicas de cada biorreactor como: geometría, diseño, número de

agitadores, tipo de dispersor de aire, etc.

Se utilizó un electrodo de oxígeno disuelto marca Mettler Toledo de 30 cm de largo

y media pulgada de diámetro en acero inoxidable, Figura 3.7. Se realizó la técnica

dinámica para poder caracterizar el electrodo y el reactor, medición del coeficiente

de transferencia de oxígeno (). Para la determinación de la transferencia deoxígeno en biorreactores es necesario calcular el coeficiente volumétrico de

transferencia de oxígeno () como lo describe (García-Ochoa y Gómez 2009)mediante el método de eliminación de oxígeno burbujeando nitrógeno en agua

destilada, el medidor de oxígeno disuelto fue calibrado a 0% con una solución

saturada de nitrógeno y a 100% con otra solución saturada con oxígeno al

bombear aire. Todas las determinaciones fueron determinadas a una temperatura

de 20°C, con condiciones de operación fijadas como la velocidad de agitación(350 y 700 rpm), aireación (1.33 y 2.66 vvm). Suponiendo que el sistema está bien

agitado, el fue determinado midiendo el porcentaje de oxígeno disueltomedido por la sonda cada 15 segundos. La técnica de eliminación de oxígeno


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consiste en la desorción de este por burbujeando nitrógeno, entonces la

concentración de O2 está ahora en función del tiempo.

Figura 3.7 Experimento de mediciones de porcentaje de saturación deoxígeno.

3.6 Interfaz de usuario

La interfaz del usuario es la relación que debe existir entre la máquina y el humano

mediante una relación de entradas y salidas que deben existir de forma física, esto

logra dar comunicación entre las dos partes involucradas, la parte informática y la

parte humana, dando con ello el mejor desempeño en cuanto a comunicación setrata. La figura 3.8 muestra de manera general un diagrama de la interfaz con todo

el sistema, es decir, la parte física del sistema (fermentador, sensores,

actuadores, parámetros de operación, etc.) la parte informática (la programación

necesaria de los componentes físicos, como actuadores, sensores, visualización,

gráficos, etc.) y la parte de visualización (la parte visual para el humano, la manera

en la cual ingresa parámetros de operación, establece parámetros de referencia

como en el caso de la temperatura, además de poder monitorearlos de manera

visual mediante gráficas o tablas de datos).


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Figura 3.8. Diagrama general de interfaz de usuario.

La interfaz fue programada en un microcontrolador de 32 bits el cual es un MBED

NXP LPC11U24, el cual se programa en lenguaje C, especializado paramicrocontroladores, basándose en la arquitectura de este, la gran ventaja de este

dispositivo es la gran cantidad de librerías con las que se cuenta, las cuales

reducen la cantidad de código dentro de las instrucciones y comandos de

programación. El MBED NXP LPC11U24 contiene puertos especializados para un

mejor uso en cuanto a tratamiento de señales. dando la facilidad de conectar a

programas de visualización como lo es LabVIEW , que en este caso funciona

como visualizador de las variables manejadas en el proceso de fermentación,

además de contar con un ADC interno de 16 bits, lo cual reduce la programación

requerida para manejar señales analógicas.La instrumentación en Labview es

virtual y para lalectura de los datos semuestra elsiguiente diagrama, el cual se

puedeencontrar en la página del mbed.org, para que los usuarios que utilizan el

microcontroladorMBED NXP LPC11U24 puedan utilizarlos.


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Figura 3.9 Diagrama de interfaz en Labview ymbed(http://mbed.org/cookbook/Homepage.).

3.7 Puesta en marcha del sistema integrado

Se llevó a cabo una fermentación con Saccharomyces cerevisiae paraprobar el sistema integrado.

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