BIOCHIMIE, 1971, 53, 1187-1194.

Adaptation fonclionnelle des t-RNA la biosynth se protdique dans un syst me cellulaire hautement diff6rencid.

IV - E v o l u t i o n des t - R N A dans la g lande s6ricig~ne de Bombyx mori L. au cours du dernier t, ge larvaire.

G 6 r a r d CHAVANCY ([ J a c q u e s DAILLIE.

Section de Biologie Gkndrale el Appliqude, Laboratoire Associd au CNRS, Universit(" Cla~:de Bernard, L y o n - Villenrbanne.

J ean -P i e . r r e GAREL.

Centre de Neurochimie d~t CNRS, Strasbottrg (13-5-1971).

Summary. - - The quan t i t a t i ve changes in the t-RNA species extracted f rom the post- r ibosoma1 superna tan t of the pos ter ior par t and of the middle par t of the s i lkgland of Bombyx mort L dur ing the growth phase of the g land and the phase of f ibroin and sericin secretion of the 5th la rva l ins ta r have been studied. In the pos ter ior pa r t which produces fibroin, the level of t-RNA is increasing 10-fold f rom the 1st to the 8th day and rapid ly decreasing dur ing the two days before spinning. In the middle part , which produces sericin s imi lar changes ~a cont inuous 5-fold increase f rom the 1st to the 7th day) are shown.

The quan t i t a t ive changes in each of 17 t-RNA species were followed by in vitro hetero- logous acyla t ion under op t i m um condit ions. The t-RNA correspondin,g to the m a j o r amino acids of the silk proteins were p redominan t : t-RNAAIa, t-RNAGly, t-RNASer and t-RNATyr in the poster ior part, t-RNASer, t-RNAAla, t-RNAGly and t-RNAAsp in the middle part , account for 2/3 of the to ta l s upe r na t an t t-RNA pools at the 8th day and at the 7th day respectively.

Two groups of t-RNA can be dis t inguished. Those wh ich have a role in f ibroin produc- tion, have a n lax imum concen t ra t ion at 7-8 days, and those which are p r imar ly involved in the synthes is of other prote ins , which reach a maximuxn a round 4-5 days.

I N T R O D U C T I O N .

La S6cr6 t ion de la sole en q u a n t f f 6 m a s s i v e d u n s la g l a n d e s ,6r icig6ne du V e t ",i so ie Bombyw mort L, a,u d e r n i e r s t ade 1.arvaire, est pr ,6e6d6e d ' u n e pha.se de c r o i s s a n c e t i s s u l a i r e de la p a r t i e p o s t 6 r i e u r e (ap,pel6e s~cr~teur) qu i p r o d u i t la f i b r o i n e et de la p a t t i e m o y e n n e ( a p p e l 6 e r~ser- voir) qu i s6c r6 t e la s 6 r i c i n e i l l . Si l ' o n c o n n a i t assez b i e n l '6vo . lu t ion p o n d 6 r a l e , a u 5" fige l a r v a i r e , de ces p a r t i e s g l a n d u l a i r e s e,t l % v o l u t i o n des q~mn- t i t6s de DNA [2] et des RNA [1, 31, l ' i n f o r m a t i o n r e l a t i v e a u x t - R N A est e n c o r e f r a g m e n t a i r e . Nous avon, s m o n t e 6 [4, 51 que la p o p u l a t i o n des t -RNA n ' a u g m e n : t a i t p a s de f a c o n hoxnog6ne e n t r e la fin de la ~phase de c r o i s s a n c e t i s s t f l a i re (5" jou,r) et la p h a s e s u i v a n t e de s6cr,~tion o p t i m a l e de ]a f i b r o i n e et de 1,a s 6 r i c i n e . N o n s e t t l e m e n t les t -RNA co r r e s - po,nd,ant aux a m i n o a c i d e s majeu . rs de l a i i lbroine (g lyc ine , a l a n i n e , s 6 r i n e et t y r o s i n e ) et de 1,a s,6ri- c i n e ( s~r ine , g lyc ine , a s p a r t a t e , g l .u tamate et a la- n i n e ) son,t en exc+s au 8" j o u r p a r , r a p p o r t h Fen- s e m b l e des a u t r e s , m a t s la p r o , p o r t i o n de lelars

e s p b c e s i s o a c c e p t r i c e s se m o d i f i e aus s i [6]. I1 n ' e x i s t e p a s to,utefois d'.6t~ade syst61n, a t i q u e de l ' 6 v o ] u t i o n des t -RNA t~o.taux et ind iv iduer l s au c o u r s d u d e r n i e r ~ge l a r v a i r e . P o u r co ,mbler en p a r t i e ce t t e l a c u n e , n o u s a v o n s e n t r e p r i s te dosage et l ' i d e n t i f i c a t i o n de 17 t -RNA d u s u r n a g e a n t pos t - r i b o s o m i q u e de jotw en j o u r p e n d a n t c e t t e l~6riode, t a n t d u n s le s6cr6te~ar que d u n s le .r6ser'voir. Cette 6 rude v i se 6galea~lent "h 6 t a b l i r ~si l e s t -RNA n o n engag6s , a u m o m e n t con.s id6r6 , d u n s ,la p r o t 6 o - s y n - th6se c o n s t i t u e n t u n 6cban t i , l l on r e , p r6 sen t a t i f de la to t a l i t6 des t -RNA examin:6e p r6e6dem~ment [4, 5]. Nos r 6 s u l t a t s c o n f i r m e n t que ~a g l a n d e s 6 r i c i g 6 n e est le s i6ge d ' u n e s y n t h 6 s e a b o n d a n t e de t -RNA, n o t a m m e n t de ceux qui : c o r r e s p o n d e n t aux a m i n o - a c i d e s m a j e u r s des p ro t ,6 ines de l a soie.

M E T H O D E S .

Le,s c h e n i l l e s du V e r h soie B o m b y x mort L s o n t des h y b r i d e s des r a c e s eu~rop6ennes 200 et 300. EHes s, on t 61ev6es /~ la t e m p 6 r a t u r e de 21°C. EAles

1 188 Gd, rard Chavancg , J a c q u e s Dai l l ie el J. P. Garel .

sont diss~qu.6es par lots ~hmnog6nes au cours du 5 ¢ fige larwaire, apr~s anesthl6sie h l '6ther. Les par t ies post6rieure et moyenne des gla, ndes s~ricig~nes (40-60) sont pr61ev6es s~,par6ment et imm~,diate- ment co.ngel6es h - - 4 0 ° C , p,uis conserv6es - - 2 0 ° C j~u.squ'h leur ut i l i sa t ion 12 h 65 jou~rs apr~s.

Extract ion des RNA de transfert . - - Nous avon.s p,roc~d~6 h l 'extract ion, spit h par t i r des glandes enti~res pour d6finir les condi t ions optim,ales d'ac~¢lation, spit h par t i r du surnageant post.ribo- somiq.ue. Les glandes (s6cr6teur ou r~servoir) sprit d6couoi6es au moyen de ciseaux, puts broy6es au froid h grande vitesse pendan t 5 minu tes environ, en plusieurs fois, avec un homog6n6iseur Ultra-Tu- rax, en pr6sence d 'une s o~lution .de ph~6n.ol satur6 d 'eau (~6quilibr~e h 4°C) con tenan t 1,5 g d 'hydroxy- 8-quinol6ine par litre (1 volume) et d 'une solut ion de NaC1 h 1 ,p. ce~t (2 vo~lumes). Le t ra i tement h l 'Ultra-Tu,rax est ind ispensable pour at teindre un r endemen t satisfaisant, en raison des obstacles m6caniques flue .constituent le r6ti(~tflum endoplas- mique des cehules s,6crdtrices et l '~ccunmlat ion darts la lumi6re de la glande de la sole synth6ti- sde. Le volume total de soluti.on est envi ron de 100 ml pour 20 glandes. A~pr6s centr ifugation (10 minutes h 6.500 rpm avec une centr i fugeuse Jouan, Paris) la'pha,s,e aqueuse est prNevde. La phase ph~6- nol ique et l ' in terphase sont h nouveau agit6es avec un demi-vo.iume de solut ion NaC1 h 1 p. cent, puts centrifug6es. La nouvelle phase aqueuse est m4dan- g6e ,h 1,a pr,6C6dente. Le tout est por~6 h 3 p. cenl en NAG1, ,puts est extrait, h nouveau, une ou deu~ fois avec un demi-volume de sol'ution ph.6nolique. Les RNA sont p r,6ci,pit6s ,par deux volumes d'6tha- nol h 95 p. cent et abandonn6:s 2-3 heures h - -20°C. Aprbs, centrif.'u,gation, le calot est lav~ avee une so,lutiou d'6~hanol h 75 p. cent contenant 10 g/1 d'ac6tate de sodiu.m. Les t-RNA sont sbpar6s des r-RNA .par sol,ubilisation dans une soh~tion d',a~6- tate de so dit~m 3 M pH 6,0 ,scion KIRBY ~7], puts dialys6s contre .de l 'eau d6min6ralis6e pendan t 15 heures. La quantit6 de t-RNA est dos~e p,av mes,ure de l ' absorbance h 26.0 n.m (2.4 UA260 = 1,0 mg). Si n,8cessaire, ils sont conserv~6s fi - -20°C sous fo r ~ e lyophilis6e.

Les t-RNA du surnageant post-r ibosomique sont obtenus de la manibre suivante : ]es s6.er6teur's ou les r6servoirs, p~ar lot de 4'{)-60, sont bro?c~6s ~om- me pr6c6demment en pr6sence du t~mpon A (tris- HC1 0,05 M pH 7,4, KC1 0,025 M, MgC~ 0,01 M e t 10 p. cent de saccharose), puts centrifug6s peudan t 15 minutes h 17.000 rpm (rotor R 40 de Spinco- Beckman) pour 61iminer les pl,us gros d6bris cellu- laires. Le surnageant est centrifug6 h nouveau pen- dant 2 heures 'A 36.0'00 rpm. La solution surna-

geante esl amen6e h 3 p. cent en NaC1 et agit6e 15 nfinules avec un demi-volume .de ta solut ion ph6- nolique pr~c~dente. Les t-RNA sont pr,~cipit~s h l '6thanol, puts trait6s comme pr~c~,demment.

Prdparation des L-aminoacide t-RNA ligases (EC 6.1.1). - - Pour des ra isons .de pl,us grande commo- dit6, nous avons travai'lld avec des pr~pavations de foie de Rat. Deux rotes de Rat adulte sont homo- g6n6is6s dons 40 m~l de tampon A conten,an,t O,01 M de ~-merc.a,pto6thanol. L'ho~nog6nat est centrifug~ pendant 15 minutes h 20.0,00 g (tfltracentrifugeuse Sorvall). Le surnageant est d6barrass6 des r ibo- somes par une nouvelle centri.fugation de 90 mi- nutes h 4,5.000 ~pm (rotor R 50 de Spinco-Beck- man). Le surnageant est imm&dialement 61u,6 s~ur une colonne.de Sephadex G-25 (3,5 × 50 em) avec le tampon B (tris-HC1 0,05 M pH 7,4, KCA 0,02'5 M, MgCL 2 0,01 M, ~-merc~pto6th,anol 0,01 M).

La premiere f ract ion ex,clue du gel est recueil- lie, puts d~pos6e su,r une courte c(~lonue de DEAE- cellulose (Serva, SS). L'effluent de l,avage et la fraction .61u6e par le tampon B + NaG1 0,20 M sprit m61ang~s [8]. La quantit'~ de ,prot~ines e,st dos:6e par ,la m~tho,de du microbiure~. La concen t ra t ion moyenne f~uctue g6n'6ralement auto.ur de 12-15 mg/ m l e t le raooor t spectro,photom6trique 280/260 entre 1,2 et 1,4. La solution enzymatique brute est stock~e h - -20°C en pr6sence de 50 p. cent de gly- c6rol (concentra t ion finale). La sol~(tion est utili- sde dans un laps de temps maximt~m de 3 semaines.

Conditions d' acylat ion standard des t-RNA.

L'acylat ion est faite au bain-mar ie h 37°C pe nda n t 30 minutes. La solut ion incub6e est consti tu6e par :

20-10,0, ~xg de t-RNA ;

200-5,00 nC de (14C)-aminoacide du CEA (Saclay, France) employ6 sans di lut ion d'activil,6 sp~ci- fique, variable de 30 h 200 ~C/,t~M ;

20 ~moles de tampon tris-tlC,1 oH 7,4 ;

2 ~xmoles d 'ATP (Boehringer) ;

2, 3 ou 4 ~moles de MgC12 ;

600-800 ~g de prot6ines enzymatiques de foie ;

volume final : 2'00 ~1.

Apr6s incubat ion , des par t ies aliquotes (100 M) sont d,6,pos~6es sur des filtres num6rot,6.s .de 4 cm 2 (papier filtre Macherey-Nagel), plong6s dons un grand exc6s d 'acide tr icMorac6tique h 100 g/1 froid pendan t 10 minu tes environ, puts l av.6s s'uc- cessivement avec une solution d 'acide l r ichlorac6- t ique h 50 g/l, d '6thanol h 95 p. cent et d '6ther

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 11- 12.

E v o l u t i o n des I - R N A c h e z B o m b y x m o r t L. 1189

6 thy l ique . La radio,a.ctivit6 est m e s u r 6 e h l ' a ide d ' un spec t rcnnbt re h sc in t i l l a t i on l i q u i d e ( Inter- t e c h n i q u e SL 40) dans un. m i l i e u s c i n t i l l a n t (Omni- f luor -NEN C,hemicals - - h 4 g/~l de .tol.u~ne).

Rl~SULTATS.

1 °) Ddte rmina t i on des cond i t ions op t imales de l 'acglation. Nous nous s o m m e s e f fore6s de r e c h e r - c h e r et de m a l t r i s e r les c o n d i t i o n s d ' a c y l a t i o n : c o n c e n t r a t i o n o p t i m a l e en ATP, en Mg ++, du r6e de l ' i n c u b a t i o n , quan t i t6 d ' e n z y m e s , i n f luence du CTP.

c p m

4000

3000

2 000

1000

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T y r o /.z~.."" ""....~ k

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2 0 10 14 18

ATP ] u M / m l

FIG. 1. - - Influence de la concentration en ATP sur l'acylation. On acyle dans les conditions standard : 20 ktg de t-RNA de s6er6teur du 2 ~ ou du 8 ~ jour, 500 nC de 04C)-aminoacide, 4 :~moles de MgCI~, 400 lzg de prot6ines enzymatiques de foie de Rat, 20 p.moles de tampon tris-HC1 pH 7,4, volume final 200 ~tl. Durde d' ineubation : 30 minutes.

La f igure 1 r e p r 6 s e n t e la sens ib i l i t6 de q u e l q u e s t-RNA .de s6c r6 teur h 1,a concen , t r a t ion en ATP. On r e m a r q u e que aa c o n c e n t r a t i o n de 10 ~ m o l e s / m l est la meil . leure p o u r a c y l e r les t-R.NA princip~aux de s~6cr6teur, du 2 ~ c o m m e du 8 ° jour . La mo,larit~ en M g ÷÷,~tait fix6e ~ 2.10-~ M.

Les figure.s 2 a et b d6f in issent les c o n c e n t r a t i o n s op t ima le s en i o n s Mg ++, pou,r nne c o n c e n t r a t i o n fixe en ATP, d o n n 6 e p a r l ' e x p 6 r i e n c e pr:6c~6dente. On no te des opti,ma va r i ab l e s se lon les enzymes h6'p,atiques tes t6es au voisin,age d ' u n e c o n c e n t r a - t ion en MgG1,_, de 14-16 ~moles/~ml. P u i s q u e toutes les c o m b i n a i s o n s n'avaien~t p a s 6t6 es'say6es, dans la sui te du p r6 sen t t rava i l , les a c y l a t i o n s ont 6t6 r6alis6es s y s t ~ m a t i q u e m e n t (voir M.~thodes) dans t ro i s c o n d i t i o n s carac~6ris.6es ,par le r a p p o r t

Mg++/ATP (1,0, 1,5 et 2,0). Nous avons r e t e n u la mei l , leure des t ro i s va l eu r s o b t e n u e s po.u,r t r ace r les c o u r b e s des f igures 6 et 7.

C P m

4000 ~

3000

2000

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I I I I - -

8 12 16 20

M g C I 2 p M / m l

Fins. 2 a et b. - - Influence de la concentration en Mg ÷÷. Les conditions d'acylation sont celles d6erites (fig. 1) dans lesquelles on fait var ie r la concentration en MgC12 pour une concentration fixe de ATP (2 izmo]es pour 200 !~l de solution). Les t-RNA de s6crdteur pro- viennent de divers lots de 1 °r au 10 ~ jour du de rnier hge larvaire.

Les c o u r b e s de cin6ticfue ~fi,gure 3) m o n t r e n t que l ' , acyla t ion m a x i m a l e esi a t t e in te assez l en t emen t , apr~s 30 m i n u t e s en g6n6ral . C 'es t cet te du,r6e que nous a v o n s cho i s i e p o u r les a c y l a t i o n s de rou t ine (vo i r M,6thodes).

La quantit.6 d ' e n z y m e b ru t e ut i l is6e est large- m e n t satur,ante (figure 4,) p u i s q u e nou.s t r a v a i l l o n s avec if00-800 I~g de pvol.6ines et que 200-30,0 :~g de p r o t 6 i n e s h.6patiques sont s~uffisantes poaar acy- l e r 20 I~g de t-RNA.

Des essai,s en pr6sen, ce de C T P (BoChringer) 1 ~mo.l.e/2~O0 ~l de so lu t ion ~ i n c u b e r n ' on t pas p e r m i s d'~am,61iover les t aux d ' a c y l a t i o n . MATSUZAKI [9] a raplport6 la m~me obse rva t i on . On p e u t p e n - ser q u e l ' ex t rbmi t6 3 ' - t e r in ina le des t -RNA est in tac te .

Les dosages des I -RNA de l~a g lande s6r ic igbne ont ~6t6 r6alis'6s au m o y e n de p r 4 p a r a t i o n enzyma- t iques :brutes de foie de Rat. Les v a r i a t i o n s sai- s o n n i b r e s clans l ' a l i m e n t a t i o n et l ' a r r6 t h i v e r n a l

BIOCHIMIE, 1971, 53, n" 11- 12.

1 1 9 0 G t ; r a r d C h a v a n c y , J a c q u e s D a i l l i e e l J. P . G a r e l .

de l ' 6 l evage d e s Vers "h so ie se p r 6 t e n t rea l h u n e 6 t u d e c o n t i n u e du m 6 t a b o l i s m e des a c i d e s nucl :6 iques . S ' i l est p o s s i b l e de c o n s e r v e r f ac i l e -

c p m

~ . - - , Ala s / 1.500 9r'

1.000 / : / , ~ e ~ • -e GIVs

I , 500~- / ( . / = / . • • • - - • - - '~ Sers

0 ~ l I I _ I 10 20 30 40

minutes

Fro. 3. - - Inf luence de la dur6e d' incubation. Les con- d i t ions d'.acylation sont d6crites dans la tig. 1, avec Mg++/ATP = 2. I1 s 'agit t ou jours de t-RNA de s6crd- t eu r et d 'enzymes hdpatiques.

l n e n t des t -RNA sous f o r l n e l y o p h i l i s 6 e , on sa i t que . l e s ' , p r6para t ions e n z y m a t i q u e s - - m 6 m e c o n g e - 16es d a n s l ' azo te l i q u i d e - - ne son t gu6re u t i l i -

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Fro. 4. - - In f luence de la concentration en extrai t enzymat ique (foie de Rat) sur l 'acylation des t-RNA de s6cr6teur et de r6servoir. Les condi t ions d 'acyla t ion sont d6crites (fig. 1) avec un rappor t Mg++/ATP = 1,5. Les quant i tds de prot~ines dans la solut ion d 'enzymes h6pat iq~es (dos6es au mierobiure t ) indiqu6es en ~g, sont les seules var iables . Les t-RNA de s6cr~teur sont indiqu6s (S) et de r6servoir (R).

s a b l e s a p r 6 s q u e l q u e s mo i s . C 'es t p o u r ce t te r a i - son qu ' i l n o u s est appa : ru n 6 c e s ~ a i r e de n o u s t o u r - n e r v e r s d e s p r 6 , p a r a t i o n s h '6pa t iques . T o u t e f o i s u n e te l le m 6 t h o d e n ' e s t vaLl, a:ble que si ]es 6 c a r t s

c o n s t a t 6 s e n t r e a c y l a t i o n s h o I n o l o g u e s et h6 t6 ro - logues ne son t p a s s ign i f i ca t i f s . Nos r 6 s u l t a t s p r6- l i m i n a i r e s d ' a c y l a t i o n des t-t:~NA de s 6 c r 6 t e u r [4] 6 t a i en t fond:6s su r les m o y e n n e s des v a l e u r s op t i - m a l e s d ' a c y l a t i o n s h o n l o l o g u e s et h,6t6r 'ologues.

Nous r e p r o d u i s o n s c i - d e s s o u s les v a l e u r s ex t r (m]es o b t e n u e s a l o r s (eu p i c o m o l e s de t -RNA acy l6es p o u r 20 L~g de t -RNA tota l ) .

Aminoacyl-t RNA Enzyme homologue (6-80 jour) Enzyme h6patique

G l y 108-127 20-105 Ala 57-104 44-100 Ser 28- 49 22- 40 T y r 16- 32 19- 42

On vo i t que, si les r 6 s M t a t s son t c o m p a r a b l e s d a n s les d e u x con, dit i .ons, ]pour les t-RNAa~a, t -RNA so" et t-RNATy r, l ' a c y l a t i o n du t-RNAGly de s 6 c r 6 t e u r p a r u n e p r 6 p a i r a t i o n e n z y m a t i q u e b r u t e du foie de Ra t est t r 6 s v a r i a b l e . P o u r le c a l c u l de l ' 6 c a r t s t a n d a r d , n o u s n ' a v i o n s t e n u coml~te que des v a l e u r s s u p 6 r i e u r e s . E n effet, n o u s a v i o n s r e m a r q u 6 que, a v e c des p r 6 i p a r a t i o n s h i6pa t iques f r a i c h e s , les d o s a g e s p a r a c y l a t i o n 6 t a i e n t co,m:pa- r a b i e s h ceux f o u r n i s p a r les e n z y m e s h o m o l o g u e s , t a n d i s q u e l e s f a i b l e s v a l e u r s d ' a c y l a t i o n a p g a - r a i s s a i e n t avec l ' a c c r o i s s e m e n t de la d u r 6 e de s t o c k a g e de nos o r 6 p a r a t i o n s h ,6pa t iques ( h - - 2 0 ° C d a n s 50 p. c e n t de g lyc6 ro l ) . Apr6s 8-10 j o u r s de c o n s e r v a t i o n , o n n ' a t t e i n t p l u s q u ' u n e v a l e u r m o i - t i6 e n v i r o n . On n e s ' 6 t o n n e r a d o n c pa,s d ' a s s i s t e r f a c i l e m e n t h u n e i n v e r s i o n des quan, t i t6s des Gly- et Ala- t -RNA [51.

2 °) E v o l u t i o n des t -RNA du s u r n a g e a n t pos t - r i b o s o m i q u e en f o n c l i o n de l'dge. L'6vt~lu t ion q u a n t i t a t i v e des t -RNA e x t r a i t s du s u r n a g e a n t pos t - r i b o s o m i q u e , r a p p o r t 6 e h u n e g l a n d e et i n d i q u 6 e en UAeG 0 .m, est d o n n 6 e su r la f igure 5 a p o u r le s 6 c r 6 t e u r et 5 b p o u r le r 6 s e r v o i r . On c o n s t a t e u n e a u g m e n t a t i o n d ' u n f a c t e u r 10 ~ peu p rbs l i n 6 a i r e du F r aux 7-8 ~ j o n r s d a n s ]e p r e m i e r cas , d ' u n f a c t e u r 5, du 1 "~ aux 6-7 ° j o u r s d a n s le secon~d cas, s u i v i e p a r u n p a l i e r ou u n e 16g~re d imin ,u t ion .

Nous a v o n s 6 g a l e m e n t t r ac6 les c o u r b e s des t -RNA dos,6s p a r a c y l a t i o n , o b t e n u e p a r la s o m m a - t ion , j o u r a p r b s j o u r , des r6s:ultats i n d i q u 6 s s a t les f igures 6 et 7. Ces c o u r b e s d ' a c y l a t i o n to t a l e se p l a c e n t n e t t e m e n t e n - d e s s o u s des co.uvbes d ' a b s o r - b a n c e . Si l ' on a d m e t que les c o u r b e s d ' a b s o r b a n c e re p r ~ s e n t e n t u n i q u e m e n t de s t -RNA, on r e m a r q u e que le r e n d e m e n t de ] ' a c y l a t i o n 6v'o~ue p o u r les t -RNA d e s :6cr6teur de 30 h 4'0 p. c e n t e n t r e le 2 ~' et le 8 ° jour , et de 55 h 37,p. c e n t e n t r e le 2 ~ et le 7 ~ j o u r p o u r les t -RNA de r ,6servoir .

BIOCHIMIE, 1971, 53, n" 11-12 .

E v o h z t i o n d e s t - R N A c h e z B o m b y x m o r i L. 1191

Les f igures 5 a et 5 b c o m p o r t e n t a~ussi l ' 6vo lu- t i on p o n d 6 r a l e d u t i s su g l a n d u l a i r e ( in d i q u 6 en rag) se lon DAILLIE [1]. La c r o i s s a n c e de la gl:ande est t e r m i n 6 e h la fin dn 5 ~ jour . On p e u t a i n s i fac i - l e m e n t c a l c u l e r la q u a n t i t 6 de t -RNA e x t r a i t p a r g de t i s su f r a i s ( t a b l e a u I). Les v a l e u r s c a l c u l 6 e s 'h

p a r t i r de l ' a b s o r b a n c e f l u c t u e n t a u t o u r de 380 -+ 100 vg, ce l l es f o n d 6 e s su r les a c y l a t i o n s r6e l les a u t o u r de 150 +_ 30 ~g. MIURA et MATSUZAKI [10] on t t r o u v 6 40 m g de t -RNA to ta l p o u r 200 ve r s , soi t a p p r o x i m a t i v e m e n t 330 p~g d e t - R N A / g de t i s su f ra is . Ces v a l e u r s son t en a c c o r d avec c e l l e s t r ou - v6es p a r d i f f 6 r e n t s a u t e u r s p o u r l e s t -RNA t o t a u x de foie de Ra t [11 "h 13] ou de B,ceuf I14].

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FIGS. 5 a et 5 b. - - Evolution des t-RNA du surna- geant post-ribosomique dans le sdcr~teur (a) el le r~ser- voir (b) et du poids des enveloppes glandulaires corres- pondantes. La c o u r b e - - e - - o - - i n d i q u e l 'Svolut ion des t-RNA (pmoles) ex t ra i t du su rnagean t post-r iboso- mique de s(~cr6teur (a) o u du r6servoir (b) dos6s, apr~s extract ion ph~nol ique h froid par ]eur absorp t ion h %0 nm. La eourbe--O - O - - i nd i que l '~volut ion de ces m~mes: t-RNA dos6s pa r acylat ion in vitro au moyen d 'enzymes h6pat iques. Les pmoles cor respondent ~ ]a somme des 17 t-RNA ind iv idue l lement dosds et rappor- tds sur ]es figures 6 et 7 et le tableau 2. La courbe ~t--~t tirde des t r avaux de D'AILLIE [1] reprdsente la var ia t ion pond6rale du t issu s6cr6teur des enveloppes glandula i res de s6cr6teur et de r6servoir.

Au su je t du r e n d e m e n t l u o y e n de l ' a cy4a t ion , n o t o n s tou t d ' a b o r d qu ' i l es t du m 6 n l e o r d r e que cel.ui que nol~s o b s e r v i o n s p r 6 c 6 d e m m e n t [4] et b i e n s u p 6 r i e u r h ce lu i a t t e i n t p a r MATSZUAKI [9].

On ne p e u t e x c l u r e c e p e n d a n t q u e ce r e n d e m e n t ne so i t p a s a f fa ib l i p a r la ,p r6sence de t -RNA acyl6s iz, v ivo ou p a r t i e l l e m e n t d 6 g r a d 6 s et de ce f a i t n o n acy l~b le s . Cet te d e r n i ~ r e r 6 s e r v e es t d ' a u t a n t ph l s p l a u s i b l e que l ' e x t r a c t i o n de t -RNA est f a i t e en l ' : absence d ' i n h i b i t e u r d e s r i b o n u c ~ 6 a s e s endo- gbnes .

La c o n r p a r a i s o n des c o u r b e s o b t e n u e s d ' u n e p a r t p a r la m e s u r e de l ' a b s o r b a n , c e d e s t -RNA d u sur- n a g e a n l , d ' a u t r e p a r t en s o m m a n t les r~ su l t a t s des a c y l a t i o n s e f fec tu~es su r les 17 t -RNA (fig. 5 a et b) fa i r a p p a r a l t r e u n e a u t r e d i s c o r d a n c e q u ' i l faut r e l e v e r : l ' a c y l a t i o n m e t en 6 v i d e n c e u n e d6c ro i s - s a n c e de s t -RNA, en fin de v ie la . rva i re ; cel le-c i n ' a p p a r a i ~ p a s n e t t e m e n t en a b s o r b a n c e . L a du r6e du s t o c k a g e d e s glan,des u n e fo i s pr61ev6es, bie.n que v a r i a b l e se lon les lots, ne s e m b l e n t p a s pou- v o i r e ~ p l i q u e r ces r6sult .ats. N o u s n ' o b s e r v o n s pas de v a r i a t i o n s s e n s i b l e s d.ans le t r~c6 des c o u r b e s des f i gu re s 6 et 7, en p a r t i c u l i e r p o u r l ' e n s e m b l e des p o i n t s r e p r 6 s e n t a t i f s des 2, 3 et 9 ~ jo,urs (cong6- l a t i o n de 66 j ou r s ) , des 1, 4, 5, 6 et 10 ° j o u r s (stoc- kage de 45 j o u r s ) p a r r a p p o r t a u x lo ts des 7 e t 8 e j o u r s t r a i t 6 s s e u l e m e n t a p r b s 12 j o u r s .de c .onserva- t i o n ~ - - 2 0 ° C .

Mais n o u s a v o n s r e m a r q u 6 [15] que, d~s le 5 ° jou r , u n e p a r t i e des RNA r i b o s o m i q u e s ( r i b o s o m e s l i b r e s ) s u b i s s e n t u n e i n t e n s e d6 ,grad~t ion , c o r r e s - p o n d . a n t h u n e d e m i - v i e d e 5 j o u r s envi ' ron . Des f r a g m e n t s d e ces r -RNA (6-14 S) a n a l y s 6 s p a r u l t r a c e n t r i f u g a t i o n a n a l y t i q u e se r e t r o u v e n t d a n s les t -RNA d u s u r n a g e a n t , en p r o p o r t i o n no t ab l e , au c o u r s d e s t r o i s d e r n i e r s jours .

E n d6 f in i t i ve , en d e h o r s de la q u e s t i o n du ren - d e m e n t d ' a c y l a t i o n , d~lica.t h conn,ai~re a priori , l ' 6 c a r t f ina l e n t r e les d e u x c o u r b e s p r o v i e n t t r~s v r a i s e m b l a b l e m e n t d ' u n e c o n t a m i n a t i o n 1~ronon- c6e p a r du r -RNA. A c e n i v e a u , il est d o n e p lu s l og ique de se f o n d e r su r la c o u r b e de som,mat ion des a c y l a t i o n s . D a n s ce cas, l a d 6 c r o i s s a n c e ra, p i d e o b s e r v 6 e r 6 s u l t e r a i t de l ' e f fe t c o n j u g u 6 de l ' a r r 6 t de la s y n t h b s e des t -RNA et de l e u r d 6 g r a d a t i o n n a t u r e l l e . La d e m i - v i e m o y e n n e q u ' o n p e u t fa,cile- m e n t e s t i m e r h 2-3 jo.urs est c o m p a t i b l e avec la d e m i - v i e b i o l o g i q u e des t -RNA de fo ie [16].

Les figu,res 6 a-d et 7 a*d r e p r 6 s e n t e n t l ' 6 v o l u t i o n en p i c o m o l e s / g l a n d e de 16 t -RNA de s 6 c r 6 t e u r et de r 6 s e r v o i r , dos6s p a r a c y l a t i o n h6 t&ro logue in vitro. T o u t e s ces c o u r b e s t r a d u i s e n t un a c c r o i s s e - m e n t i n i t i a l de la q u a n t i t 6 de c h a q u e t-RNA, pu i s une d 6 c r o i s s a n c e i m p o r t a n t e h p a r t i r d ' u n m o m e n t qu i v a r i e a v e c les d i v e r s t -RNA et la p o r t i o n de g l a n d e c o n s i d 6 r 6 e . Les v a l e u r s a b s o l u e s au m a x i - m u m d ' a c t i v i t 6 son t r a p p o r t 6 e s d a n s le t a b l e a u III.

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 11- 12.

1192 G~rard Chavancy, Jacques Daillie et J. P. GareI.

Les t-RNA correspondant aux q.uatre aminoac ides pr6pond,6rants de la f ibroine (glycine, alanine, s6rine et tyrosine) sont nettement les plus abon- dants et repr6sentent les 2 /3 de la populat ion brute

a o Asp lS0 • GIu

Lys

1oo

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I0 j o u r s du V i~m~ 4 6 8 10 ~ g e l a r v a i r e

150

100

50

Fins 6 a-d. - - E v o l u t i o n i n d i v i d u e l l e des t -RNA acg- lds p a r sdcrdleur. Les conditions d'acylation sont d6crites d,ans, M6thodes. Les quantit6s(pmoles) pour chaque t-RNA ont 6t6 rapport6es h une 9 lande (s6cr~- teur).

des t-RNA acylables du s6cr6teur. On assiste ~ une situation analogue dans le r6servoir off les t-RNA correspondant aux c inq aminoac ides majeurs de

150 a

A S p •

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15o

10o

5e

2 4 6 8 IO

Fl6s. 7 a-d. - - E v o l u t i o n i n d i v i d u e l l e des t -RNA acg- l~s p a r r~servoir . Les conditions standard d'acylation sont d6crites dans M~thodes. Les quantit~s (pmoles) de chaque t-RNA ont 6t6 rapport6es h une 9lande (r6ser- voir).

la s6ricine (s6rine, g lycine, aspartate, gl,ut~mate et alanine) constituent au 7 ° jo,ur les ~ /3 des t-RNA totaux du surnageant. L'ordre qu,antitatif dans

lequel ils apparaissent n'est pas exactement celui des aminoac ides constitutifs des prot6ines soyeuses. Le t-RNA nla sem, ble le plus abondant dans le sbcr6teur, le t-RNAGh, est faible dans le r6servoir. Le t-RNAL,~, est assez aboudant dans les deux compart iments , tandis que les t-RNAP,'o et ceux fixant les aminoac ides basiques sont faibles ( lysine) et m 6 m e h l'6tat de traces (h is t id ine et arginine).

On peut encore constater l '6volution diff6ren- tielle des t-RNA en deux sous-groupes, constitu6s, l'un part les t-RNA majeurs dont la concentrat ion maximale se situe aux 7 - 8° j,ours (p6riode de s6- cr6tion intense) et l'autre par les t-RNA qui attei- gnent u,n pal ier a u - - 4 - 5 ° jours (fin de la phase de croissance t issulaire).

DISCUSSION.

Notre travail porte sur les t-RNA d'un surna- geant post-riboso.mique qui exclut la fraction des t-RNA acyl,6s et fix6s sur les po lysomes li6s aux membranes et s,p6,cialis6s dans la product ion de la f ibroine [17] et de la s6ricine. WEIL [18] a d'ailleurs m.ontr6 que la distr ibut ion subcell,ulaire des t-RNA chez la lewure et ]e col ibaci l le peut varier d'un t-RNA h l'autre, si l'on consid6re l e vapp,ort t-RNA du surnageant/ t -RNA li6s aux riboso,mes. Malgr6 cela, les valeurs rapport6es dans le tableau II pour les t-RNA de s6cr6teur aux 4, 6 et 8 e jours et pour les t-RNA de r6servoir au 7 ° jour montrent nette- ment l'exc6s des t-RNA correspondant aux amino- acides majeurs de la f ibroine et de la s~ricine.

En outre, les t-RNA acylables i n v i t r o peuvent part ic iper h deux types de synth6ses : d'une part l'ensem~ble des synth6ses des a~tres prot6ines ou synt~h6ses asp6cif iques, d'autre part les s ynth6ses sp~cifiques auxquel les prennent part les t-RNA d6codant les m-RNA de l~a fibroine et de la s6ri- cine. C'est pourquo i nous avons 1,6gitimement d6- duit la part des t-RNA oart ic ipant aux synth6ses asp6cifiques, sous le nom de <<bruit de fond >>. Nous l'avons ind iqu6 dans le tableau II. I1 est 6va- lu6 clans c:haque cas en se fondant sur les valeurs moyennes obtenues pour les t-RNA corresoondant aux aminoac ides mineurs (1-5 p. cent) des 9ro- t6ines soyeuses. Aprbs d6,duction de ce bruit de fond, on constate la ten.dance des t-RNA majeurs

croitre et au contraire celle des autres h d6- croitre. Les taux ainsi obtenus de t-RNA dispo- nibles pour la synthbse de la f ibroine et de la s6ri.cine se rapprochen.t de la distr ibution des aminoac ides majeurs de ces ,prot6ines. Les pour- centages indiqu6s par MATSUZAKI [9] (voir ta-

BIOCHIMIE, 1971, 53, n" 11- 12.

E v o l u t i o n des l -RNA chez B o m b y x m o r i L . 1193

b l e a u I t) o b t e n u s p a r a c y l a t i o n h o m o l o g u e et les n 6 t r e s (a, c y l a t i o n h 6 t 6 r o l o g u e ) aux 6-8 e j o u r s du d e r n i e r ~ge l a r v a i r e d i f f 6 r e n t s u r t o u t p a r u n e i n v e r s i o n des t-RNAOly et t -RNA Ala d a n s le s6cr6- t eu r .

fix6s s u r les r i b o s o m e s . De p lus , c e r t a i n s de s t -RNA qui i n t e r v i e n n e n t p e u d a n s la s y n t h ~ s e de ces p r o - t 6 i n e s c o m m e n c e n t h d i s p a r a i t r e p l u s t6 t que les a u t r e s b i e n que l ' a u g m e n t a t i o n d e s t -RNA t o t a u x d u s u r n a g e a n t p o s t - r i b o s o m i q u e s u i v e assez exac-

TABLEAU I.

Quanti~ de t-RNA (,~g) par gramme de tissu [rais.

S~er~teur :

t -RNA UA260 mn . . . . . . . . . t -RNA aeylfis . . . . . . . . . . . .

R~servoir :

480 160

t -RNA UA26omn . . . . . . . . . . 330 t -RNA acyl6a . . . . . . . . . . . . 180

450 140

310 155

400 300 135

28O 120 ] 115 L

8 jours

430 165

On ne s a u r a i t s ' 6 t o n n e r de r e t r o u v e r d a n s le s u r n a g e a n t p o s t - r i b o s o m i q u e u n e d i s t r i b u t i o n des t -RNA f a v o r a b l e h l ' a d a p t a t i o n aux s y n t h 6 s e s des p r o t 6 i n e s de la soie , d a n s la mes.ure off i l es t c o n e e - v a b l e d ' i m a g i n e r l ' e x i s t e n c e d ' u n 6 q u i l i b r e s ta- t i o n n a i r e e n t r e les t -RNA fix6s et l es ~t-RNA n o n

t e m e n t l ' 6 v o l u t i o n pond .6 ra le des z o n e s c o r r e s p o n - d a n t e s de la g l a n d e ( t a b l e a u I). A p a r t i r du 5 ° jour , la p o p u l a t i o n des t -RNA s ' e n r i c h i t en e sp6ces n 6 c e s s a i r e s h la s y n t h 6 s e des p r o t 6 i n e s de la soie. Ces t -RNA c o n t i n u e n t d o n c d ' e t r e p r o d u i t s ac t ive - m e n t au d 6 b u t de la phas,e de s 6 c r 6 t i o n , c o m m e le

TABLEAU II.

Evolution des t-RNA (picomoles/glande).

S6cr6tenr 4' jour/S6cr6teur 6' jour - - / " - -

t-RNA du [ t-RNA total surnageant r6f. (9}

t-RNA . (x} p cent p. cent _ _ . p,comoles ~ ... . .

Ala . . . . . . I 120 17,5 / 36,5 Arg . . . . . . ', 12 Asp . . . . . . Glu . . . . Gly.. .~ H i s . . • I I le. . . Leu. . . Lys . . . . Met . . . . Phe . . . . Pro . . . . S e r . . . . T h r . . . T rp . . . : . . ! Tyr . . . . . . I Val . . . . . . '~

60 6,4 45 3,7

140 21,1 10 65 7O 4O 25 16

2 90 10,9 65

100 13,7 3I

4 ,6 1,9

43,6

0,4 0 ,4 0 ,4 0 ,4

7 ,7

4 ,2

S6cr6teur 8' jour

t-RNAr6f, total ! t-RNA du surnageant

(4)p. cent p. cent p.( picomoles picomoles XcXJn t

3 8 5 _ 1 5 o 22,6[ 530 ]24 34 14

6 4 ___ lO 52 + 21

720 ~__ 50

30 + 15

238 + 52 75 "~ 12

165 -{- 70

3 ,8 3 ,0

42,4

14,0

9,7

130 100 470

12 75 95 42 46 22

5 180

70

220 55

5,9 4 ,5

21,1

8,1

9,9

5 ,7 3 ,5

29,8

9 ,3

12,0

R6servoir 7' jour

t- RNA du surnage.,nt

picomoles p. cent (xxx) p. cent

1306 4 ,6 14,1 80 8 ,2 7,0 45 2,1

120 12,3 12,7 4

32 100

34 18

24o 58 25 30 50

24,6 29,6

(*) Apr6s d6duct ion d 'un b ru i t de fond de 25 picomoles. (**) Apr6s d~duction d 'un b ru i t de fond de 50 picomoles. (***) Apr6s d~duction d 'un b ru i t de fond de 25 picomoles.

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 11- 12.

1 1 9 4 G d r a r d C h a v a n c y , J a c q u e s D a i l l i e e t d. P . G a r e l .

c o n f i r m e n t d ' a i l l e u r s l e s f i g u r e s 6 et 7, et n e s n b i s -

s e n t p a s s e u l e m e n t u n r e n o u v e l l e m e n t i n t e n s e d e

l e u r - C C A t e r m i n a l c o m n ~ e le p e n s a i e n t KULLYEV

e t co l l . [19].

Malgr:6 tout, il f a u t c o n v e n i r q u e l e s t - R N A d u

s u r n a g e a n , t b i e n q u ' e n r i c h i s e n t - R N A m a j e u r s c o r -

r e s p o n d a n t a u x a m i n o a c i d e s , p r 6 p o n d 6 r a n t s d e s

p r o t 6 i n e s de la s o i e n e r e p r 6 s e n t e n t p a s u n 6 c h a n -

t i l l o n a b s o l m n e n t r e p r 6 s e u t a t i f d e l a p o p u l a t i o n

t o t a l e d e s t - R N A . S e u l e c e l l e - c i , e n f a i s a n t i n t e r -

v e n i r l a f r a c t i o n n o n n 6 g l i g e a b l e d e s t - R N A l i 6 s

a u x p o l y s o m e s r e s p o u s a b l e s de la p r o d u c t i o n d e

la f i b r o i n e et de la s 6 r i c i n e , p e r m e t de m e t t r e

e n 6 v i d e n c e u n e a d a p t a t i o n q u a n t i t a t i v e d e s

t - R N A [4] .

U n t r a v a i l p l u s a p p r o f o n d i , e n s y s t ~ m e h o m o -

l o g u e , e s t e n c o u r s p o u r t e n t e r de d 6 t e r m i n e r l a

p a r t e t la n a t u r e e x a c t e d e s t - R N A et d e s e s p 6 c e s

i s o a c c e p t r i c e s d i r e c t e m e n t i m p l i q u 6 s d a n s le d6-

c o d a g e d e s m - R N A d e la f i b r o i n e e t de la s ,+ r ic ine .

Bemerc iements .

N o u s r e m e r c i o n s t o u t s p 6 c i a l e m e n t M a d a m e G. DECAUSSIN (dlevage des c h e n i l l e s et p r616vement des g l andes ) et M o n s i e u r D. FHAAOL (ex t r ac t ion et d o s a g e de s t -RNA) qu i on t p r i s u n e pa r t ac t ive h c e t r a v a i l . Nos r e m e r c i e m e n t s v o n t d g a l e m e n t h M a d a m e POUYET du Cen t re de Reche rche s u r les Maeromoldcu le s (S t ras - bourg ) p o u r sos a n a l y s e s p a r u l t r a e e n t r i f u g a t i o n a n a - l y t i que . La t in , les c r i t i q u e s et conse i l s f o r m u l d s p a r MM. les p r o f e s s e u r s CHAPEVILLE, EBEL et MON1ER n o u s on t b e a u c o u p aidd d a n s l ' e x 6 c u t i o n et la p r d s e n t a t i o n de ce t r ava i l . Nous l eu r s en s o m m e s s i n e 6 r e m e n t r e con - n a i s s a n t s .

R~SUM~.

On a dtudi~ l ' 6 v o l u t i o n p o n d d r a l e des t -RNA e x t r a i t s du s u r n a g e a n t p o s t - i ' i b o s o m i q u e des pa r t i e s pos t6 - r i eu r e (sdcrdteur) ct m o y e n n e ( rdservoir ) de la g r a n d e s6r ic ig6ne du Ver h soie B o m b y x mori L, au c o u r s des p h a s e s de c r o i s s a n c e de la g l ande et de s6crd- t i on de la fibro~ne et de la s6r ic ine au d e r n i e r fige l a r v a i r e . D a n s le s~cr6 teur qu i p r o d u i t la f ibroine, los t -RNA a u g m e n t e n t du 1 ~r au 8 ~ j o u r d ' u n f a c t e u r 10 p o u r d6cro i t re r a p i d e m e n t d a u s les deux d e r n i e r s j o u r s a v a n t le f i l t rage du e o c o n ; d a n s le r6 se rvo i r qu i sdcr6te la s6r ic ine , on e o n s t a t e u n e dvo l u t i on paral l61e (accro is - s e m e n t c o n t i n u du 1 ~r au 7" j o u r d ' u n f a c t e u r 5).

L ' 6 v o l u t i o n i n d i v i d u e l l e de 17 esp~ces de t -RNA a 616 r6a l i s6e pa r a c y l a t i o n h d t 6 r o l o g u e in vitro, apr6s d~6ter - m i n a t i o n des c o n d i t i o n s o p t i m a l e s . On me t en 6v idence la p r 6 p o n d d r a n c e des t -RNA c o r r e s p o n d a n t a u x a m i n o - ac ides m a j e u r s des p r o t 6 i n e s s o y e u s e s . Les t-RNAAla, t-RNAGly, t-RNASer et t-RNATy~" du s6cr6 teur a i n s i q u e les t-RNASer, t-RNAAIa, t -RNAolu, t-RNA(~ly et t -RNAAsp du rd se rvo i r r e p r d s e n t c n t les 2/3 de la p o p u l a t i o n des t -RNA a u x 8 ~ et 7" j o u r s r e s p e e t i v e i n e n t .

On obse rve u n e 6 v o l u t i o n d i f fdren te pou r d e u x g r o u p e s de t -RNA : ccux qu i p a r t i c i p e n t h la p r o d u c - t i on de la fibroi 'ne et de la sd r ie ine avec u n e concen - t r a t i o n m a x i m a l e a u x 7-8" j o u r s et ceux qu i p a r t i c i p e n t

a u x a u t r e s s y n t h b s c s i i ro td iques avec u n m a x i m u m a u x 4-5 ° j o u r s .

ZUSAMMENFASSUNG.

Die t -RNS Ar ten des h i n t e r e n , s e z e r n i e r e n d e n Tei l s des Sp inad r f i s e (Secre leur) der S e i d e n r a u p e (Bombyx mori L) u n d des i n i t t l e r en Toi ls (Rese rvo i r ) s ind wi ih rend der W a c h s t u m s p e r i o d e uiid w i i h r e n d tier Sek re t i on yon F i b r o i n u n d Ser ic in im l e t z t en L a r v e n - s t a d i u m a u s d e m p o s t r i b o s o m a l e n U b e r s t a n d ex t r a - h i e r t u n d ihre q u a n t i t a t i v e E n t w i c k l u n g ve r fo lg t w(ir- den . h n s e z e r n i e r e n d e n , F i b r o i n p r o d u z i e r e n d e n Dr i i sen te i l n i m m t die t -RNS v o m ers ten b i s a c h t e n Tag u m e inen F a k t o r 10 zu, u m in den l e t z t en be iden T a g e n vor d e m S p i n n e n des Kokons r a s c h w iede r a b z u n e h m e n ; im R e s e r v o i r - A n t e i l , der Ser ic in p r o d u - z ie r t u n d den S e i d e n f a d e n s tape l t , l i iuf t d ie E n t w i - c k l u n g para l l e l : v o m e r s t e n h i s s i eb t en Tag u m e i n e n F a k t o r 5.

Die i n d i v i d u e l l e E n t w i c k l u n g der 17 t -RNS Ar ten is t m i t t e l s h e t e r o l o g e r A c y l i e r u n g in vitro u n t e r s u c h t worden , n a c h d e i n die o p t i m a l e n B e d i n g u n g e n daf i i r a u s f i n d i g g e m a c h t w o r d e n w a r e n . W i t h a b e n g e f u n d e n , d a s s die t -RNS A r t e n v o r h e r s c b e n , die den h / iu f igs ten A m i n o s i i u r e n de r S e i d e n p r o t e i n e e n t s p r e c h e n : die t-RNSAla, t-RNSGIy, t-RNSSer u n d t-RNSTyr im Secre- t e u r u n d die t-RNSSer, t-RNSAla, t-RNSGly, t-RNSG]u, t-RNSAsp im R e s e r v o i r m a c h e n am 8. bzw. a m 7. Tag 2 /3 des ganzcn t -RNS aus .

L ine u n t e r s c h i e d l i c h e E n t w i c k l u n g zwe ie r t -RNS G r u p p e n w u r d e f e s t g e s t e l l t : a u f der e i n e n Sei te die t -RNS Ar tcn , die a n de r H e r s t e l l u n g yon F i b r o i n u n d Ser ic in l n i t w i r k e n , m i t e i n e r m a x i m a l e n K o n z e n t r a t i o n a m 7. u n d 8. Tag , a u f der a n d e r e n Seite die t -RNS Ar ten , die an de r S y n t h e s e der f i b r i g e n P r o t e i n e be t e i l i g t s ind , m i t e i n e m M a x i m u m a m 4. b i s 5 Tag.

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