8/3/2019 Adam (1991)

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M I C R O B I O L O G I C A L R E V I E W S , D e c . 1 9 9 1 , p . 7 0 6 - 7 3 2 V o l . 5 5 , N o . 40 1 4 6 - 0 7 4 9 / 9 1 / 0 4 0 7 0 6 - 2 7 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 9 1 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

T h e B i o l o g y o f G i a r d i a s p p .RODNEY D . ADAM

S e c t i o n o f I n f e c t i o u s D i s e a s e s , D e p a r t m e n t o f I n t e r n a l M e d i c i n e , * a n d D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y / l I m m u n o l o g y ,U n i v e r s i t y o f A ri z o na , T u cs o n , A r i z o n a 8 5 7 2 4OVERVIEW .............................................. 7 0 6TROPHOZOITE STRUCTURE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 0 7F l a g e l l a .............................................. 7 0 7V e n t r a l D i s k a n d A t t a c h m e n t .............................................. 7 0 7M e d i a n B o d y .............................................. 7 0 8G o l g i A p p a r a t u s .............................................. 7 0 9V a c u o l e s .............................................. 7 0 9N u c l e i .............................................. 7 0 9E n d o s y m b i o n t s .............................................. 7 0 9CYST STRUCTURE .............................................. 7 0 9EXCYSTATION AND ENCYSTATION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 1BIOCHEMISTRY .............................................. 7 1 1A x e n i c C u l t u r e .............................................. 7 1 1C a r b o h y d r a t e a n d P r o t e i n M e t a b o l i s m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 1L i p i d M e t a b o l i s m .............................................. 7 1 2N u c l e i c A c i d S a l v a g e .............................................. 7 1 3GENETICS.............................................. 7 1 3DNA a n d Chromosome C o n t e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 3rRNA .............................................. 7 1 5T r a n s l a t i o n .............................................. 7 1 5T r a n s c r i p t i o n .............................................. 7 1 5H e a t S h o c k R e s p o n s e .............................................. 7 1 6SPECIES DETERMINATION AND STRAIN VARIATION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 6L i g h t - M i c r o s c o p i c C a t e g o r i e s o f G i a r d i a S p e c i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 6E l e c t r o n - M i c r o s c o p i c C a t e g o r i e s o f t h e G . l a m b l i a G r o u p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 6N o n m o r p h o l o g i c a l D i f f e r e n c e s among t h e G i a r d i a S p e c i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 6N o n m o r p h o l o g i c a l D i f f e r e n c e s among G . l a m b l i a I s o l a t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 6EPIDEMIOLOGY .............................................. 7 1 7CLINICAL ILLNESS AND PATHOGENESIS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 7IMMUNE RESPONSE ................................. 7 1 9Humoral I m m u n i t y ................................. 7 2 0T L y m p h o c y t e s ................................. 7 2 0M a c r o p h a g e s ................................. 7 2 1O t h e r Immune M e c h a n i s m s ................................. 7 2 1S u r f a c e A n t i g e n s a n d A n t i g e n i c V a r i a t i o n ................................. 7 2 1Nonimmune P r o t e c t i o n ................................. 7 2 3S u m m a r y o f I m m u n i t y ................................. 7 2 3DIAGNOSIS ................................. 7 2 3TREATMENT.................. 7 2 3CONCLUSIONS.................. 7 2 4ACKNOWLEDGMENTS.................. 7 2 5REFERENCES.................. 7 2 5

OVERVIEW p a w s , w h e r e w i t h t h e y made s u c h a s t i r i n t h e c l e a r m e d i u m ,a n d among t h e g l o b u l e s , t h a t y o u m i g h t e ' e n f a n c y y o u s a w aG i a r d i a i s a b i n u c l e a t e f l a g e l l a t e d p r o t o z o a n p a r a s i t e t h a t p i s s a b e d r u n n i n g u p a g a i n s t a w a l l ; a n d a l b e i t t h e y m a d e ac a u s e s i n t e s t i n a l i n f e c t i o n i n m a m m a l s , b i r d s , r e p t i l e s , a n d q u i c k m o t i o n w i t h t h e i r p a w s , y e t f o r a l l t h a t t h e y m a d e b u ta m p h i b i a n s . I t w a s o n e o f t h e f i r s t p r o t o z o a n s t o b e d e - s m a l l p r o g r e s s . "s c r i b e d when v a n Leeuwenhoek d i s c o v e r e d t h e t r o p h o z o i t e s L a m b l d e s c r i b e d t h e g e n u s G i a r d i a i n g r e a t e r d e t a i l i ni n 1 6 8 1 i n h i s o w n d i a r r h e a l s t o o l ( 7 7 ) : 1 8 5 9 ( 1 9 5) ; a s a r e s u l t , t h e h u m a n s p e c i e s w a s n a m e d a f t e r"My e x c r e m e n t b e i n g s o t h i n , I w a s . . . p e rs u a d e d t o e x a m - h i m . D e s p i t e i t s e a r l y d i s c o v e r y , G i a r d i a o n l y r e c e n t l yi n e i t . . . w h e r e i n I h a v e s o m e t i m e s a l s o s e e n a n i m a l c u l e s b e c a m e u n i v e r s a l l y a c c e p t e d a s a h u m a n p a t h o g e n b e c a u s ea - m o v i n g v e r y p r e t t i l y ; some o f ' e m a b i t b i g g e r , o t h e r s a b i t G i a r d i a i n f e c t i o n s a r e n o n i n v a s i v e a n d f r e q u e n t l y a s y m p t o -l e s s , t h a n a b l o o d - g l o b u l e , b u t a l l o f t h e o ne a n d t h e s a m e m a t i c . Hoeerthe no fs e v e a n d r e q u e n t sm a k e ; t h e i r b o d i e s w e r e s o m e w h a t l o n g e r t h a n b r o a d a n d m a t i c . H o w e v e r , t h e f i n d i n g o f s e v er e g i a r d i a s i s i n p a t i e n t st h e i r b e l l y , w h i c h was f l a t l i k e , f u r n i s h e d w i t h s u n d r y l i t t l e w i t h h y p o g a m m a g l o b u l i n e m i a , t h e o c c u r r e n c e o f w a t e r -7 0 6

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BIOLOGY OF GIARDIA S P P . 7 0 7b o r n e o u t b r e a k s o f d i a r r h e a , a n d t h e f u l f i l l m e n t o f K o c h ' sp o s t u l a t e s i n e x p e r i m e n t a l human i n f e c t i o n s ( 2 4 0 ) h a v ec o n f i r m e d i t s a s s o c i a t i o n w i t h human d i s e a s e . I t i s t h e m o s tcommon p r o t o z o a n i s o l a t e d f r o m human s t o o l s p e c i m e n s( 1 1 6 ) a n d i s a common c a u s e o f d i a r r h ea i n h u m a n s a s w e l l a si n d o g s a n d c a t s ( 1 8 8 ) .G i a r d i a h a s b e e n p l a c e d i n t h e p h y l u m S a r c o m a s t i g o p h o r aa n d c l a s s Z o o m a s t i g o p h o r e a , a l o n g w i t h t h e o t h e r f l a g e l l a t e dhuman p a r a s i t e s , T r y p a n o s o m a , L e i s h m a n i a , T r i c h o m o n a s ,a n d D i e m t a m o e b a , a n d h a s b e e n c l a s s i f i e d i n t h e O r d e rD i p l o m o n a d i d a ( 2 0 1 ) . H o w e v e r , t h e s e q u e n c e o f i t s s m a l l -s u b u n i t rRNA i s m a r k e d l y d i f f e r e n t f r o m t h o s e o f a l l o t h e rp r o t o z o a n s , a n d o n t h e b a s i s o f t h e s m a l l - s u b u n i t rRNAs e q u e n c e , i t h a s b e e n p r o p o s e d a s t h e m o s t p r i m i t i v e e u -k a r y o t e ( 2 9 6 ) . M o r p h o l o g i c a l c r i t e r i a h av e b e e n u s e d t od i v i d e t h e g e n u s G i a r d i a i n t o t h re e s p e c i e s ( 1 1 4 ) . G i a r d i aa g i l i s i n f e c t s a m p h i b i a n s ; G . m u r i s i n f e c t s r o d e n t s , b i r d s ,a n d r e p t i l e s ; a n d G . l a m b l i a i n f e c t s a v a r i e t y o f m a m m a l s ,i n c l u d i n g h u m a n s , a s w e l l a s b i r d s a n d r e p t i l e s . G . l a m b l i a( a l s o c a l l e d G . i n t e s t i n a l i s a n d G . d u o d e n a l i s ) h a s m o r er e c e n t l y b e e n d i v i d e d i n t o s e v e r a l s p e c i e s o n t h e b a s i s o fm o r e s u b t l e d i f f e r e n c e s s e e n b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( s e eb e l o w ) . T h i s r e v i e w f o c u s e s p r i m a r i l y o n G . l a m b l i a , n o to n l y b e c a u s e i t i s t h e s p e ci e s a s s o c i a t e d w i t h human d i s e a s e ,b u t a l s o b e c a u s e i t i s t h e o n l y s p e c i e s t h a t h a s b e e n a x -e n i z e d , s o i t h a s b e e n u s e d f o r a l l t h e i n v i t r o s t u d i e s . M i c ei n f e c t e d w i t h G . m u r i s p r o v i d e a u s e f u l m o d e l f o r s t u d y i n gt h e immune r e s p o n s e t o G i a r d i a i n f e c t i o n , a n d t h i s m o d e lw i l l b e d i s c u s s e d i n t h e s e ct i o n o n t h e immune r e s p o n s e t og i a r d i a s i s .G i a r d i a h a s a s i m p l e l i f e c y c l e c o n s i s t i n g o f a n i n f e c t i v ec y s t a n d a v e g e t at i ve t r o ph o z o i t e . T h e c y s t i s r e l a t i v e l yr e s i s t a n t t o e n v i r o n m e n t a l d e s i c c a t i o n a s w e l l a s t o g a s t r i ca c i d o f t h e h o s t s t o m a c h . A f t e r a c y s t i s i n g e s t e d , i t e x c y s t si n t h e s m a l l i n t e s t i n e t o f o r m t w o t r o p h o z o i t e s . T h e t r o p h o -z o i t e d i v i d e s b y b i n a r y f i s s i o n i n t h e s m a l l i n t e s t i n e a n d i sr e s p o n s i b l e f o r t h e s y m p t o m s o f g i a r d i a s i s . Some o f t h et r o p h o z o i t e s a r e i n d u c e d t o e n c y s t , a n d t h e c y c l e i s c o m -p l e t e d when t h e c y s t s a r e p a s s e d i n t h e f e c e s a n d i n g e s t e d b ya n o t h e r h o s t .

TROPHOZOITE STRUCTURET h e G . l a m b l i a t r o p h o z o i t e i s a p p r o x i m a t e l y 1 0 t o 1 2 , u ml o n g a n d 5 t o 7 , i m w i d e . T h e c y t o s k e l e t o n c o n s i s t s o f a f u n i s( b o d y ) ; a m e d i a n b o d y ; a c o n c a v e s u r f a c e o n t h e a n t e r i o rt w o - t h i r d s o f t h e v e n t r a l s u r f a c e , v a r i o u s l y r e f e r r e d a s as u c k i n g d i s k , s t r i a t e d d i s k , o r v e n t r a l d i s k ; a n d f o u r p a i r s o ff l a g e l l a ( F i g . 1 ) . A G o l g i a p p a r a t u s h a s b e e n r e p o r t e d i ne n cy s t i n g t r o p h o z o i t es ( d i s c u s s e d i n t h e e n c y s t a t i o n - e x c y s -t a t i o n s e c t i o n ) ( 2 6 7 ) . O t h e r d i s t i n c t o r g a n e l l e s , i n c l u d i n g t w on u c l e i t h a t a p p e a r i d e n t i c a l a n d l y s o s o m a l v a c u o l e s , a r ep r e s e n t . G l y c o g e n a n d r i b o s o m a l g r a n u l e s a r e p r e s e n t i n t h ec y t o p l a s m . I n c o n c e r t w i t h i t s c l a s s i f i c a t i o n a s a p r i m i t i v ee u k a r y o t e , many o f t h e u s u a l e u k a r y o t i c o r g a n e l l e s , i n c l u d -i n g m i t o c h o n d r i a , p e r o x i s o m e s , s m o o t h e n d o p l a s m i c r e t i c u -l u m , a n d n u c l e o l i , h a v e n o t b e e n i d e n t i f i e d .

F l a g e l l aT h e f o u r p a i r s o f f l a g e l l a ( a n t e r i o r , c a u d a l , p o s t e r i o r , a n dv e n t r a l ) e m e r g e f r o m b a s a l b o d i e s n e ar t h e m i d l i n e a n da n t e r o v e n t r a l t o t h e n u c l e i . N i n e p a i r s o f m i c r o t u b u l e s a r es y m m e t r i ca l l y p l a c e d a r o u n d t h e o u t e r p a r t o f e a c h f l a -g e l l u m , w i t h t w o m i c r o t u b u l e s i n t h e m i d d l e . A l t h o u g hf l a g e l l a r m o t i o n i s a s s o c i a t e d w i t h m o t i l i t y , t h e f u n c t i o n o f

t h e f l a g e l l a h a s n o t b e e n r i g o r o u s l y i n v e s t i g a t e d . I f a s e l e c -t i v e i n h i b i t o r o f f l a g e l l a r f u n c t i o n c o u l d b e i d e n t i f i e d , t h e r o l eo f t h e f l a g e l l a c o u l d b e more r i g o r o u s l y i n v e s t i g a t e d . T h es u g g e s t i o n t h a t t h e f l a g e l l a a r e i n v o l v e d i n a d h e r e n c e ( 1 6 0 ) i sd i s c u s s e d b e l o w.V e n t r a l D i s k a n d A t t a c h m e n t

T h e s i t e f o r a t t a c h m e n t t o t h e i n t e s t i n a l m u c o s a o f t h e h o s ti s p r o v i d e d b y t h e v e n t r a l d i s k , w h i c h p r o b a b l y a c t s a s as u c t i o n c u p i n a t t a c h m e n t t o t h e i n t e s t i n e . A l t e r n a t i v e m e c h -a n i s m s i n c l u d e a m o d e l i n w h i c h f l a g e l l a r m o t i o n p r o v i d e st h e n e c e s s a r y h y d r o d y n a m i c f o r c e t o a l l o w a t t a c h m e n t ( 1 6 0 )a n d o n e i n w h i c h r e c e p t o r - m e d i a t e d i n t e r a c t i o n s a r e u s e d( 1 0 3 ) . D i s c u s s i o n o f t h e f o l l o w i n g s t u d i e s on t h e s t r u c t u r e ,c h e m i s t r y , a n d p h y s i o l o g y o f t h e d i s k w i l l t a k e i n t o a c c o u n tt h e s e p o t e n t i a l m e c h a n i s m s .T h e v e n t r a l d i s k i s a concave s t r u c t u r e t a k i n g u p most o ft h e a n t e r i o r t w o - t h i r d s o f t h e v e n t r a l s u r f a c e o f t h e t r o p h o -z o i t e . I t i s s u r r o u n d e d b y a r i m w h i c h c o n t a c t s a n d a c t u a l l yd i s r u p t s t h e a r c h i t e c t u r e o f t h e i n t e s t i n a l m i c r o v i l l i ( 1 5 9 ) ;s u r r o u n d i n g t h e r i m i s a v e n t r o l a t e r a l f l a n g e ( F i g . 1 ) . T h ed i s k a p p e a r s t o b e f a i r l y r i g i d a n d i s made o f m i c r o t u b u l e s ,c r o s s b r i d g e s a t t a c h e d t o t h e m i c r o t u b u l e s , a n d u n i q u es t r u c t u r e s c a l l e d m i c r o r i b b o n s t h a t a r e p e r p e n d i c u l a r t o b o t ht h e m i c r o t u b u l e s a n d t h e c r o s s b r i d g e s ( F i g . 1 ) . T h e m i c r o -t u b u l e s c o n t a i n t u b u l i n , a n d t h e m i c r o r i b b o n s c o n t a i n g i a r -d i n s ( 2 5 6 ) . T h e g i a r d i n s a r e a s e t o f G i a r d i a - s p e c i f i c p r o t e i n sf o u n d o n l y i n t h e v e n t r a l d i s k a n d r a n g e i n s i z e f r o ma p p r o x i m a t e l y 2 9 t o 3 8 kDa ( 6 7 , 6 8 , 1 6 1 , 1 6 2 , 2 5 6 ) . U p t o 2 3d i s t i n c t g i a r d i n s h a v e b e e n i d e n t i f i e d b y u s i n g t w o - d i m e n -s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s , b u t s o m e o f t h e s e f o r m s a r e t h e samei n t h e i r N - t e r m i n a l s e q u e n c e s a n d a n t i g e n i c a l l y , w h i c h s u g -g e s t s t h a t some o f t h e g i a r d i n s may b e d e r i v e d b y d i f f e r e n tp o s t t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s o f t h e s a m e p r o t e i n ( 2 5 6 ) . A tl e a s t two d i s t i n c t c a t e g o r i e s o f g i a r d i n s h a v e b e e n c l o n e d a n ds e q u e n c e d : a - a n d P - g i a r d i n s . a 1 - G i a r d i n i s 3 3 . 8 kDa a n d i sp r e d i c t e d t o b e p r e d o m i n a n t l y a l p h a - h e l i c a l i n i t s s e c o n d a r ys t r u c t u r e ( 2 5 6 ) . a 2 - G i a r d i n h a s b e e n c l o n e d a n d i s s i m i l a r t oa 1 - g i a r d i n i n i t s DNA a n d a m i n o a c i d s e q u e n c e s ( 8 1 a n d7 7 % , r e s p e c t i v e l y ) ( 1 5 ) . , B - G i a r d i n ( 2 9 . 4 k D a ) i s a l s o p r e -d i c t e d t o b e a l p h a - h e l i c a l i n s t r u c t u r e a n d h a s a h e p t a dr e p e a t c o n s i s t e n t w i t h a c o i l e d - c o i l s t r u c t u r e , a s i s f o u n d i nm y o s i n a n d t r o p o m y o s i n ( 1 6 2 ) . 1 - G i a r d i n s h o w s n o DNA ora m i n o a c i d s i m i l a r i t y t o o a - g i a r d i n . T h e two p u b l i s h e d s e -q u e n c e s ( 6 , 2 2 ) d i f f e r o n l y a t G + C - r i c h r e g i o n s a n d i n t h ep u t a t i v e i n i t i a t i o n s i t e . T h e p r e d i c t e d a m i n o a c i d s e q u e n c e sf o r a n i n t e r n a l p o r t i o n a r e v e r y d i f f e r e n t , b u t i t i s p o s s i b l et h a t t h e s e d i f f e r e n c e s a r e d u e t o s e q u e n c i n g errors r a t h e rt h a n b e i n g t r u e d i f f e r e n c e s . O f i n t e r e s t , t h e g e n o m i c c l o n e( 6 ) c o n t a i n s an ATG 4 b a s e s 5 ' t o t h e b e g i n n i n g o f t h e cDNAs e q u e n c e r e p o r t e d ( 2 2 ) . I t i s 3 3 b a s e s 5 ' t o t h e o t h e r ATGa n d i s i n t h e s a m e r e a d i n g f r a m e ; i t i s more l i k e l y t o b e t h et r u e s i t e o f i n i t i a t i o n , b u t t h i s h a s n o t b e e n c o n f i r m e d b yp r i m e r e x t e n s i o n o r S 1 n u c l e a s e p r o t e c t i o n e x p e r i m e n t s .I n c o n t r a s t t o t h e r i g i d s t r u c t u r e o f t h e d i s k i t s e l f , t h e r i ma r o u n d t h e d i s k d e m o n s t r a t e s f l e x i b i l i t y i n i t s a t t a c h m e n t t oi n t e s t i n a l m ucos a ( 9 5 ) a n d a p p e a r s t o d i s r u p t t h e i n t e s t i n a lm u c o s a l s u r f a c e d u r i n g a t t a c h m e n t ( 9 5 , 2 5 0 , 2 6 0 ) . I m m u n o -e l e c t r o n - m i c r o s c o p i c s t u d i e s h a v e l o c a l i z e d t h e c o n t r a c t i l ep r o t e i n s , a c t i n , a - a c t i n i n , m y o s i n , a n d t r o p o m y o s i n t o t h er i m ( 1 1 2 ) . T h e r e f o r e , t h e r i m o f t h e v e n t r a l d i s k a p p e a r s t oh a v e c o n t r a c t i l e p r o p e r t i e s a n d t o b e c l o s e l y i n v o l v e d i n t h ea t t a c h m e n t p r o c e s s . T h e a t t a c h m e n t d e p e n d s o n a c t i v em e t a b o l i s m a n d i s i n h i b i t e d b y o x y g e n , r e d u c e d t e m p e r a -t u r e , r e d u c e d c y s t e i n e c o n c e n t r a t i o n ( 1 2 3 , 1 2 7 ) , a n d p h a r -

V O L . 5 5 , 1 9 9 1

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7 0 8 ADAM

2 -

F I G . 1 . C r o s s - s e c t i o n a l t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a G . l a m b l i a t r o p h o z o i t e . L C , l a t e r a l c r e s t ; V L F , v e n t r o l a t e r a l f l a n g e ; V D ,v e n t r a l d i s k ; N , n u c l e u s ; F , f l a g e l l a ; V , v a c u o l e . I n t h e l o w e r p a n e l , a h i g h e r m a g n i f i c a t i o n s h o w s t h e m i c r o t u b u l e s ( m t ) a n d m i c r o r i b b o n s( m r ) . A d a p t e d w i t h p e r m i s s i o n ( 2 5 6 ) .

m a c o l o g i c a g e n t s w i t h a c t i v i t y a g a i n s t G i a r d i a s p p . , i n c l u d i n gm e t r o n i d a z o l e , f u r a z o l i d o n e ( 7 0 ) , a n d t h e b e n z i m i d a z o l e ss u c h a s m e b e n d a z o l e ( 8 4 ) . B e n z i m i d a z o l e s a r e b e l i e v e d t o a c tb y t a r g e t i n g P - t u b u l i n ( 8 4 ) , w h i c h i s p r e s e n t i n m i c r o t u b u l e sa n d f l a g e l l a . T h e y i n h i b i t a d h e r e n c e b y G i a r d i a s p p . w i t h n oa p p a r e n t e f f e c t o n f l a g e l l a r f u n c t i o n , s u g g e s t i n g t h e p o s s i b i l i t yt h a t t h e f l a g e l l a r t u b u l i n l a c k s a b i n d i n g s i t e f o r b e n z a m i d a -z o l e s ( 8 4 ) . D i s k a n d f l a g e l l a r t u b u l i n s a r e a n t i g e n i c a l l y d i f -f e r e n t ( 6 9 , 3 0 7 ) , p r o v i d i n g f u r t h e r e v i d e n c e t h a t t h e d i s k a n df l a g e l l a c o n t a i n d i s t i n c t t u b u l i n s . T h e l o s s o f a d h e r e n c e d e -s p i t e i n t a c t f l a g e l l a r f u n c t i o n i n d i c a t e s t h a t f l a g e l l a r f u n c t i o na l o n e i s n o t s u f f i c i e n t f o r a t t a c h m e n t .T h e s u r f a c e o f G i a r d i a t r o p h o z o i t e s c o n t a i n s a l e c t i n( c a r b o h y d r a t e - b i n d i n g m o i e t y ) t h a t b i n d s t o m a n n o s e - g l u -c o s e , a n d l e c t i n - m e d i a t e d r e c e p t o r b i n d i n g h a s b e e n p r o -p o s e d a s a n a l t e r n a t i v e m e t h o d o f i n t e s t i n a l a t t a c h m e n t( 2 0 0 ) . T r o p h o z o i t e s h a v e b e e n s h o w n t o b i n d t o m a m m a l i a ne r y t h r o c y t e s b y t h i s l e c t i n b i n d i n g ; h o w e v e r , a l l s i d e s o f t h et r o p h o z o i t e b i n d e r y t h r o c y t e s e q u a l l y w e l l ( 1 0 3 ) . T h i s l a c k o fb i n d i n g s p e c i f i c i t y f o r t h e v e n t r a l s u r f a c e s u g g e s t s t h a t i fl e c t i n - m e d i a t e d b i n d i n g i s p a r t o f t h e a t t a c h m e n t p r o c e s s , i ti s a s e c o n d a r y r a t h e r t h a n a p r i m a r y m e c h a n i s m o f a t t a c h -m e n t . I n a d d i t i o n , a d h e r e n c e t o g l a s s c a n n o t b e b as e d o n

r e c e p t o r - m e d i a t e d b i n d i n g . T h u s , i t a p p e a r s m o s t l i k e l y t h a tG i a r d i a t r o p h o z o i t e s a t t a c h t o t h e i n t e s t i n a l w a l l m e c h a n i -c a l l y b y m e a n s o f s u c t i o n g e n e r a t e d b y t h e v e n t r a l d i s k . T h ea b i l i t y o f G . p s i t t a c i ( s e e b e l o w ) t o a d h e r e d e s p i t e t h e p a r t i a la b s e n c e o f t h e v e n t r o l a t e r a l f l a n g e i s i n c o n s i s t e n t w i t h t h eh y d r o d y n a m i c m o d e l ( 9 1 ) . I n a d d i t i o n , t h e r a p i d r e v e r s a l o fa d h e r e n c e b y t h e b e n z i m i d a z o l e s d e s p i t e a p p a r e n t l y n o r m a lf l a g e l l a r f u n c t i o n ( 8 4 ) , a s w e l l a s a d h e r e n c e d e s p i t e t h ea b s e n c e o f f l a g e l l a r movement ( 1 1 2 ) , i n d i c a t e s t h a t f l a g e l l aa r e n o t i m p o r t a n t i n a d h e r e n c e .M e d i a n B o d y

T h e m e d i a n b o d y i s a s t r u c t u r e i n t h e m i d l i n e a n d d o r s a l t ot h e c a u d a l f l a g e l l a . I t i s u n i q u e t o G i a r d i a s p p . , a n d i t sm o r p h o l o g y h a s b e e n u s e d t o d i s t i n g u i s h d i f f e r e n t G i a r d i as p p . ( 1 1 4 ) . G . l am b l ia t r o p h o z o i t e s u s u a l l y c o n t a i n t w om e d i a n b o d i e s w h i c h a r e s h a p e d l i k e c l a w h a m m e r s . T h ef u n c t i o n o f t h e m e d i a n b o d y i s u n k n o w n , b u t t h e f i n d i n g t h a ta n t i g i a r d i n ( 6 9 ) a n d a n t i t u b u l i n ( 1 1 2 ) a n t i b o d i e s l o c a l i z e t ot h e m e d i a n b o d y s u g g e s t t h a t i t may b e f u n c t i o n a l l y r e l a t e dt o t h e v e n t r a l d i s k .

M I CR O BI O L. R E V.

8/3/2019 Adam (1991)

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BIOLOGY OF GIARDIA S P P . 7 0 9G o l g i A p p a r a t u s

A s t r u c t u r e f u l f i l l i n g a t l a s t s o m e o f t h e c r i t e r i a o f a G o l g ia p p a r a t u s w a s i n i t i a l l y r e p o r t e d d u r i ng t h e a n a l y s i s o f i nv i t r o e n c y s t a t i o n ( 2 6 7 ) . I m m u n o e l e c t r o n - m i c r o s c o p i c s t u d -i e s r e v e a l e d t h a t e n c y s t a t i o n - s p e c i f i c a n t i g e n s w e r e l o c a l i z e di n t h e G o l g i a p p a r a t u s . T h e s e a n t i g e n s a r e t r a n s p o r t e d t o t h ef o r m i n g c y s t w a l l b y e n c y s t a t i o n - s p e c i f i c v e s i c l e s ( s e e b e -l o w ) . I n c o n t r a s t , t h e c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s e d p r o t e i n s , a c i dp h o s p h a t a s e a n d t h e c y s t e i n e - r i c h p r o t e i n TSA 4 1 7 ( 1 2 6 ) , a r et r a n s p o r t e d t o t h e i r l y s o s o m a l a n d s u r f a c e l o c a t i o n s , r e s p e c -t i v e l y , b y d i f f e r e n t r o u t e s . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e G o l g ia p p a r a t u s c a n s o r t p r o t e i n s f o r t r a n s p o r t t o d i f f e r e n t l o c a -t i o n s . G o l g i a p p a r a t u s e s h a v e n o t y e t b e e n r e p o r t e d i nn o n e n c y s t i n g t r o p h o z o i t e s , b u t t h e e v i d e n c e f o r p r o t e i ns o r t i n g m a k e s i t l i k e l y t h a t a l l t r o p h o z o i t e s c o n t a i n t h e m .

V a c u o l e sC y s t s a n d t r o p h o z o i t e s c o n t a i n o v o i d v a c u o l e s 0 . 1 t o 0 . 4p u m i n d i a m e t e r t h a t a r e a d j a c e n t t o t h e p l a s m a l e m m a ( F i g .1 ) . I n t r o p h o z o i t e s t h e y a r e f o u n d a l o n g t h e d o r s a l a n dv e n t r a l s u r f a c e s , b u t n o t i n t h e r e g i o n o f t h e v e n t r a l d i s k .T h e s e v a c u o l e s c o n t a i n a v a r i e t y o f h y d r o l a s e a c t i v i t i e s ,i n c l u d i n g a c i d p h o s p h a t a s e ( 1 0 9 , 2 0 5 ) , D N a s e , R N a s e , c y s -t e i n e ( t h i o l d e p e n d e n t ) , a n d t h i o l - i n d e p e n d e n t p r o t e i n a s ea c t i v i t i e s ( 2 0 5 ) . T h e l o c a l i z a t i o n o f t h e h y d r o l a s e e n z y m e s t ot h e v a c u o l e s i n d i c a t e s t h a t t h e y a r e l y s o s o m a l . T h e l y s o -s o m e s h a v e a l s o b e e n s h o w n t o t a k e u p f e r r i t i n ( 4 1 ) , b u t t h es i g n i f i c a n c e o f t h i s i s u n k n o w n . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n h a ss h o w n t h a t G . l a m b l i a h a s t w o m a j o r c y s t e i n e p r o t e a s e s , o f4 0 a n d 1 0 5 kDa ( 1 4 5 ) . T h e 4 0 - k D a c y s t e i n e p r o t e a s e c l e a v e sh e m o g l o b i n a n d i m m u n o g l o b u l i n Al ( I g A l ) ( 2 5 4 ) a n d h a sb e e n p r o p o s e d a s a v i r u l e n c e d e t e r m i n a n t . W h e t h e r t h ep r o t e a s e s a r e i n v o l v e d i n p a t h o g e n e s i s , l i f e c y c l e s w i t c h , o ra n o t h e r f u n c t i o n i s u n k n o w n .

N u c l e iT h e t w o n u c l e i o f G i a r d i a t r o p h o z o i t e s a r e s y m m e t r i c a l l yp l a c e d o n e i t h e r s i d e o f t h e m i d l i n e . T h e n u c l e a r m e m b r a n ei s p a r t i a l l y c o v e r e d w i t h r i b o s o m e s , a n d n o n u c l e o l i h a v eb e e n s e e n . S t u d i e s o f n u c l ea r r e p l i c a t i o n b y u s i n g [ 3 H ] t h y -m i d i n e ( 3 2 8 ) a n d 4 ' , 6 - d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e ( D A P I ) f l u -o r e s c e n t s t a i n i n g ( 1 7 7 ) h a v e s u g g e s t e d t h a t b o t h n u c l e ir e p l i c a t e a t t h e s a m e o r n e a r l y t h e s a m e t i m e . When DNAw a s s t a i n e d w i t h D A P I , a p p r o x i m a t e l y 1 o f 1 0 0 c e l l s h a dc o n d e n s e d s t r u c t u r e s , a n d when t h e s e s t r u c t u r e s w e r ep r e s e n t , t h e y w e r e s e e n i n b o t h n u c l e i . T r o p h o z o i t e s h a v eb e e n m e t a b o l i c a l l y l a b e l e d w i t h [ 3 H ] u r i d i n e ( 1 7 7 ) , a n d t h el a b e l w a s i n c o r p o r a t e d e q u a l l y i n b o t h n u c l e i , i n d i c a t i n g t h a tb o t h n u c l e i a r e t r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v e . C e r t a i n o t h e r p r o t o -z o a n s , i n c l u d i n g t h e c i l i a t e s a n d D i e n t a m o e b a f r a g i l i s , a l s o

c o n t a i n t w o n u c l e i . H o w e v e r , i n t h e c i l i a t e s , a t r a n s c r i p t i o n -a l l y a c t i v e m a c r o n u c l e u s c o n s i s t i n g o f m u l t i p l e c o p i e s o ft r a n s c r i b e d g e n e s i s f o r m e d f r o m t h e m i c r o n u c l e u s , w h i c hc o n t a i n s t h e e n t i r e g e n o m e i n a s i n g l e c o p y ( 3 3 0 ) . D . f r a g i l i st r o p h o z o i t e s u s u a l l y h a v e t w o e q u a l - a p p e a r i n g n u c l e i , a l -t h o u g h some t r o p h o z o i t e s a r e m o n o n u c l e a r a n d a f e w o r g a n -i s m s c o n t a i n m o r e t h a n t w o n u c l e i . C y t o k i n e s i s o f b i n u c l e a t et r o p h o z o i t e s r e s u l t s i n t w o m o n o n u c l e a r o r g a n i s m s , f o l -l o w e d b y n u c l e a r d i v i s i o n a n d t h e r e a p p e a r a n c e o f b i n u c l e -a t e o r g a n i s m s ( 3 2 5 ) . T h u s , G i a r d i a s p p . a r e u n i q u e i n p o s -s e s s i n g t w o n u c l e i t h a t a r e e q u i v a l e n t b y a l l c r i t e r i a t h a t h a v eb e e n a p p l i e d . T h i s r a i s e s t h e i n t e r e s t i n g q u e s t i o n o f w h yG i a r d i a s p p . h a v e two n u c l e i a n d t h e s e l e c t i v e a d v a n t a g e

t h a t m a i n t a i n s two n u c l e i . I f e a c h n u c l e u s i n d e e d h a s t h esame c o m p l e m e n t o f c h r o m o s o m e s , i s t h e r e a n y e x c h a n g e o fDNA b e t w e e n t h e t w o n u c l e i ?E n d o s y m b i o n t s

U l t r a s t r u c t u r a l s t u d i e s h a v e i d e n t i f i e d a v a r i e t y o f e n d o -s y m b i o n t s i n G i a r d i a t r o p h o z o i t e s ( 1 0 8 , 2 4 5 ) . An e n d o s y m -b i o n t m o r p h o l o g i c a l l y c o n s i s t e n t w i t h a g r a m - n e g a t i v e b a c -t e r i u m was i d e n t i f i e d i n a G . m u r i s i s o l a t e t h a t was e s p e c i a l l yi n f e c t i v e f o r m i c e , b u t w a s n o t f o u n d i n s e v e r a l G . l a m b l i ai s o l a t e s ( 2 4 5 ) . I n a s u b s e q u e n t s t u d y , b ac t e ri a a n d m y c o p l a s -m a l i k e s t r u c t u r e s w e r e s e e n i n G i a r d i a c y s t s a n d t r o p h o z o -i t e s f r o m a v a r i e t y o f mammals a n d b i r d s a n d v i r u s l i k ep a r t i c l e s w e r e s e e n i n G . m u r i s t r o p h o z o i t e s ( 1 0 8 ) . One o ft h e more i n t e r e s t i n g f i n d i n g s i s t h e p r e s e n c e o f a 3 3 - n md o u b l e - s t r a n d e d RNA v i r u s ( G . l a m b l i a v i r u s [ G L V ] ) i nc e r t a i n human i s o l a t e s o f G . l a m b l i a ( 3 1 6 ) . I t c o n s i s t s o f a7 - k b d o u b l e - s t r a n d e d RNA g e n o m e s u r r o u n d e d b y a 3 3 - n mi c o s a h e d r a l c a p s u l e ( 2 2 3 ) a n d m o s t p r o b a b l y r e p l i c a t e s b ym e a n s o f a v i r u s - e n c o d e d RNA p o l y m e r a s e ( 3 2 7 ) . GLV c a nt r a n s f e c t u n i n f e c t e d i s o l a t e s ( 7 5 , 2 2 2 ) a n d i s a s s o c i a t e d w i t hd e c r e a s e d a d h e r e n c e a n d g r o w t h r a t e ( 2 2 3 ) . T h e p r e s e n c e o fa n RNA v i r u s i n T r i c h o m o n a s v a g i n a l i s h a s b e e n c o r r e l a t e dw i t h t h e a b i l i t y t o u n d e r g o p h e n o t y p i c v a r i a t i o n ( 3 1 5 ) , b u tGLV h a s n o t b e e n a s s o c i a t e d w i t h t h e a b i l i t y o f G . l a m b l i at o u n d e r g o a n t i g e n i c v a r i a t i o n ( 2 ) . A s i n g l e - s t r a n d e d c o p y o fGLV RNA h a s b e e n i s o l a t e d ( 1 1 9 ) a n d h a s b e e n i n t r o d u c e di n t o p r e v i o u s l y u n i n f e c t e d G . l a m b l i a t r o p h o z o i t e s b y e l e c -t r o p o r a t i o n ; t h i s h a s r e s u l t e d i n t h e p r o d u c t i o n o f c o m p l e t ev i r a l p a r t i c l e s ( 1 1 8 ) .

CYST STRUCTURET h e c y s t i s t h e i n f e c t i v e f o r m o f G i a r d i a s p p . a n d i sr e l a t i v e l y r e s i s t a n t t o t h e e x t e r n a l e n v i r o n m e n t a s w e l l a s t og a s t r i c a c i d i n t h e s t o m a c h o f t h e i n f e c t e d h o s t . T h e c y s t i sa p p r o x i m a t e l y S b y 8 p u m a n d i s s u r r o u n d e d b y a w a l l t h a t i s

0 . 3 , u m t h i c k ( 2 8 6 ) . T h e o u t e r p o r t i o n o f t h e w a l l c o n s i s t s o fa s t r u c t u r e c o m p o s e d o f 7 t o 2 0 f i l a m e n t s ( 9 2 ) ( F i g . 2 ) ,w h e r e a s t h e i n n e r ( m e m b r a n o u s ) p o r t i o n c o nt a in s a n o u t e ra n d i n n e r c y s t w a l l m e m b r a n e s e p a r a t e d b y a t h i n l a y e r o fc y t o p l a s m .G a l a c t o s a m i n e was d e t e c t e d a s t h e m a j o r s u g a r o f t h eo u t e r c y s t w a l l o f i n v i v o - d e r i v e d c y s t s b y g a s c h r o m a t o g r a -p h y , m a s s s p e c t r o m e t r y , a n d e n z y m a t i c a s s a y s ( p u r i f i e dc h i t i n a s e ) ( 1 7 1 ) . B i n d i n g t o a l e c t i n f r o m P h a s e o l u s l i m e n s i sw i t h a n a f f i n i t y f o r N - a c e t y l g a l a c t o s a m i n e ( G a l N A c ) s u g -g e s t e d t h a t t h e g a l a c t o s a m i n e was p r e s e n t i n t h e f o r m o fG a l N A c . G l u c o s e i s t h e m a j o r s u g a r i n t h e r e m a i n d e r o f t h ec y s t . A m y l o g l y c o s i d a s e t r e a t m e n t o f t h e o u t e r c y s t w a l ld e c r e a s e s t h e c o n c e n t r a t i o n o f g l u c o s e 3 0 - f o l d a n d a b o l i s h e sp e r i o d i c a c i d - S c h i f f s t a i n i n g , s u g g e s t i n g t h a t t h e g l u c o s e i sp r e s e n t a s g l y c o g e n .T h e p r e s e n c e o f c h i t i n i n t h e c y s t w a l l h a s b e e n s u g g e s t e do n t h e b a s i s o f b i n d i n g o f t h e o u t e r c y s t w a l l t o w h e a t g e r ma g g l u t i n i n ( W G A ) ; t h i s b i n d i n g was a b o l i s h e d b y c h i t i n a s e( 3 2 1 ) . WGA b i n d s t o N - a c e t y l g l u c o s a m i n e ( G l c N A c ) , t h es u g a r t h a t c o m p o s e s c h i t i n . The e x i s t e n c e o f c h i t i n s y n -t h e t a s e a c t i v i t y i n e n c y s t i n g t r o p h o z o i t e s ( 1 2 9 ) h a s a l s o b e e np r o p o s e d . H o w e v e r , t h e s e f i n d i n g s h a v e b e e n c r i t i c i z e db e c a u s e o f t h e p o t e n t i a l l a c k o f s p e c i f i c i t y o f t h e c h e m i c a l s( 1 7 1 ) . I n l a t e r s t u d i e s , GlcNAc was d e t e c t e d b y mass s p e c -t r o m e t r y o f t r o p h o z o i t e s a n d i n v i t r o - d e r i v e d c y s t s ( 2 4 7 ) , b u tt h e p u r i f i c a t i o n p r o c e s s p r o b a b l y r e m o v e d t h e i n s o l u b l eo u t e r c y s t w a l l . T h e l a c k o f s t a i n i n g o f t h e c y s t w a l l b y

VOL. 5 5 , 1 9 9 1

8/3/2019 Adam (1991)

5/27

7 1 0 ADAM

a iI t ,

.:

.. j.. s.4,

S i l , I4

F I G . 2 . H i g h - r e s o l u t i o n f i e l d e m i s s i o n s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a G . m u r i s c y s t , d e m o n s t r a t i n g t h e f i l a m e n t o u s s t r u c t u r e o f t h e c y s tw a l l . C o u r t e s y o f S t a n l e y E r l a n d s e n .

M I C R O B I O L . R E V .

. . ,. : :

.* - 2 , ' .K I. - i . r ' ."

.,T :. . . : f:1 k. . j gt :-:. V , :

8/3/2019 Adam (1991)

6/27

BIOLOGY OF GIARDIA S P P . 7 1 1Z a n d e r ' s i o d i n e - z i n c c h l o r i d e , K u h n e l t ' s s u l f u r i c a c i d - i o -d i n e , a n d p i c r o - n i g r o x i n e ( 1 6 8 ) a n d t h e a b s e n c e o f F e u l g e ns t a i n i n g a f t e r h y d r o l y s i s ( 1 1 4 ) a l s o a r g u e a g a i n s t t h e p r e s -e n c e o f c h i t i n a s a m a j o r c o m p o n e n t o f t h e c ys t w a l l .T h e d i s c o v e r y o f G a l N A c i n c y s t s b u t n o t i n t r o p h o z o i t e s( 1 7 1 , 2 4 7 ) may b e e x p l a i n e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t e n c y s t -i n g G i a r d i a t r o p h o z o i t es s y n t h e s i z e GalNAc f r o m g l u c o s et h r o u g h a n i n d u c i b l e p a t h w a y ( 1 6 8 ) . T h e a c t i v i t y o f o n ee n z y m e o f t h i s p a t h w a y , UDP-GlcNAc 4 ' - e p i m e r a s e , b e -c o m e s d e t e c t a b l e a f t e r 8 h i n e n c y s t a t i o n medium a n d p e a k sa t 4 8 h . T h u s , s y n t h e s i s o f t h e o u t e r c y s t w a l l s u g a r ,G a l N A c , d u r i n g e n c y s t a t i o n may b e a k e y b i o c h e m i c a lp r o c e s s o f e n c y s t a t i o n .T h e p r e s e n c e o f p r o t e i n i n t h e c y s t w a l l w a s d e m o n s t r a t e db y t h e h y b r i d i z at i o n o f c y s t w a l l - s p e c i f i c a n t i b o d i e s t o s p e -c i f i c b a n d s o n W e s t e r n i mm u n o b l o t s ( 2 6 6 ) . I m m u n o g o l de l e c t r o n m i c r o s c o p y h a s b e e n u s e d t o l o c a l i z e s e v e r a l p r o -t e i n s ( 2 9 , 7 5 , 8 8 , a n d 1 0 2 k D a ) t o t h e f i l a m e n t o u s s t r u c t u r e so f t h e o u t e r p o r t i o n o f t h e c y s t w a l l ( 9 3 ) .I n s i d e t h e G . l a m b l i a c y s t w a l l , f l a g e l l a r a x o n e m e s , v a c u -o l e s , r i b o s o m e s , a n d f r a g m e n t s o f t h e v e n t r a l d i s k a r e f o u n d( 9 2 , 9 6 , 2 8 6 ) . M o s t c y s t s c o nt a i n f o u r n u c l e i , w h e r e a s t h o s et h a t h a v e n o t y e t u n d e r g o n e n u c l e a r d i v i s i o n c o n t a i n t w o .

EXCYSTATION AND ENCYSTATIONE x c y s t a t i o n o f G . l a m b l i a i n v i t r o c a n b e i nd u c e d b yi m i t a t i n g t h e a c i d i c e n v i r o n m e n t o f t h e s t o m a c h . S t u d i e sh a v e d e t e r m i n e d t h e o p t i m u m pH t o b e 1 . 3 t o 2 . 7 ( 3 9 ) o r 4 . 0( 4 5 ) . H o w e v e r , e x c y s ta t i o n o f G . l a m b l i a ( 4 5 ) a n d G . m u r i s( 1 1 1 ) c a n a l s o o c c u r a t a n e u t r a l p H , p r o v i d i n g a n e x p l an a-t i o n o f how g i a r d i a s i s o c c u r s i n p a t i e n t s w i t h a c h l o r h y d r i a .E x c y s t a t i o n o f G . m u r i s c a n b e i n d u c e d b y 0 . 3 M s o d i u mb i c a r b o n a t e a t pH 7 . 5 ( 1 1 1 ) , s u g g e s t i n g t h a t p a n c r e a t i cs e c r e t i o n s p l a y a r o l e i n e x c y s t a t i o n .T h e s e q u e n c e o f e v e n t s t h a t o c c u r d u r i n g t h e p r o c e s s o fe x c y s t a t i o n h a s b e e n d e t e r m i n e d b y o b s e r v i n g t h e i n v i t r op r o c e s s f o r G . m u r i s ( 6 2 , 6 3 ) a n d G . l a m b l i a ( 4 9 ) . W i t h i n 5 t o

1 0 m i n a f t e r b e i n g p l ac e d i n c o n d i t i o n s c o n d u c i v e t o e x c y s -t a t i o n , f l a g e l l a r m o t i o n b e g i n s a n d t h e p o s t e r i o r e n d o f t h et r o p h o z o i t e e x i t s t h r o u g h a b r e a k i n t h e c y s t w a l l . C y t o k i -n e s i s b e g i n s w i t h i n 3 0 m i n , r e s u l t i n g i n t w o b i n u c l e a t et r o p h o z o i t e s . D u r i n g e x c y s t a t i o n , t h e v a c u o l e s r e l e a s e t h e i rc o n t e n t s , l e a d i n g t o t h e s p e c u l a t i o n t h a t e n z y m e s f r o m t h ev a c u o l e s p l a y a r o l e ( 6 3 ) . S m a l l , d e n s e v e s i c l e s a r e s e e n o nt h e s u rf a c e o f t h e t r o p h o z o i t e s a s t h e y e m e r g e f r o m t h e c y s tw a l l .More r e c e n t l y , e nc y s t a ti o n h a s a l s o b e en p e r f o r m e d i nv i t r o ( 1 2 9 , 2 8 4 , 2 9 8 ) , a l l o w i n g f u l l c o m p l e t i o n o f t h e G .l a m b l i a l i f e c y c l e i n v i t r o . B e c a u s e m a x i m a l e n c y s t a t i o n o fG . l a m b l i a w a s o b s e r v e d i n t h e m i d t o l o w e r j e j u n u m o fi n f e c t e d s u c k l i n g m i c e , t h e s e c o n d i t i o n s w e r e i m i t a t e d i nv i t r o ( 1 2 9 ) . O p t i m a l e n c y s t a t i o n w a s o b s e r v e d i n t h e p r e s -e n c e o f t h e p r i m a r y b i l e s a l t s , g l y c o c h o l a t e w i t h m y r i s t i ca c i d , a t a pH o f 7 . 8 ( 1 2 8 ) . I n o t h e r s t u d i e s , p o r c i n e b i l e a n dl a c t a t e w e r e e f f e c t i v e i n i n d u c i n g e n c y s t a t i o n ( 1 2 2 ) . W i t h i nt h e f i r s t 5 h o f e n c y s t a t i o n , e n c y s t a t i o n - s p e c i f i c a n t i g e n s c a nb e f o u n d i n a G o l g i a p p a r a t u s a n d a p p e a r t o b e p a c k a g e d i n t oe n c y s t a t i o n - s p e c i f i c v e s i c l e s , w h i c h a p p e a r i n 6 t o 1 8 h ( 1 0 5 )a n d a r e t r a n s p o r t e d t o t h e f o r m i n g c y s t w a l l ( 2 6 7 ) . I n i t i a l l y ,a g r o u p o f l o w - m o l e c u l a r - m a s s a n t i g e n s ( 2 1 t o 3 9 k D a )a p p e a r . A t 2 4 h , f o u r h i g h e r - m o l e c u l a r - m a s s a n t i g e n s ( 6 6 t o1 0 3 k D a ) a p p e a r , a l l o f w h i c h r e a c t w i t h WGA. I t i s l i k e l yt h a t s o m e o f t h e s e a n t i g e n s a r e t h e s a m e a s t h o s e t h a t h a v eb e e n l o c a l i z e d t o t h e f i l a m e n t s o f t h e c y s t w a l l ( 9 3 ) . B ya p p r o x i m a t e l y 4 4 t o 7 0 h , f o r m a t i o n o f t h e c y s t w a l l i s

c o m p l e t e d ( 2 6 7 ) a n d b o t h n u c l e i d i v i d e s i m u l t a n e o u s l y ,y i e l d i n g a c y s t w i t h f o u r n u c l e i , w h e r e a s c y t o k i n e s i s o c c u r ss h o r t l y a f t e r e x c y s t a t i o n , r e s u l t i n g i n t h e d e v e l o p m e n t o ft w o t r o p h o z o i t e s f r o m o n e c y s t . A t l e a s t some o f t h e i nv i t r o - d e r i v e d c y s t s c a n b e i n d u c e d t o e x c y s t i n t o t r o p h o z o -i t e s . T r i g g e r i n g o f e x c y s t a t i o n i s m a x i m a l a t pH 4 . 0 , a n de m e r g e n c e i s s t i m u l a t e d b y c h y m o t r y p s i n , t r y p s i n a n d p a n -c r e a t i c f l u i d ( 4 5 ) .

BIOCHEMISTRYA x e n i c C u l t u r e

T h e d e v e l o p m e n t o f a n a x e n i c ( f r e e o f e x o g e n o u s c e l l s )m e d i u m f o r t h e g r o w t h o f G . l a m b l i a t r o p h o z o i t e s i n 1 9 7 6( 2 2 0 ) h a s p e r m i t t e d s t u d i e s o f t h e b i o c h e m i s t r y a n d n u t r i -t i o n a l r e q u i r e m e n t s o f G . l a m b l i a . T h e f i r s t G i a r d i a i s o l a t ea x e n i z e d was f r o m a p a t i e n t i n P o r t l a n d , O r e g . , a n d i s c a l l e dP o r t l a n d - 1 ( P - 1 ) . M o s t i n v i t r o s t u d i e s o f G . l a m b l i a h a v eu s e d t h e P - 1 o r t h e WB i s o l a t e , w h i c h was a x e n i z e d f r o m ap a t i e n t w i t h p r o l o n g e d s y m p t o m a t i c g i a r d i a s i s wh o p r o b a b l ya c q u i r e d t h e i n f e c t i o n i n A f g h a n i s t a n ( 2 9 1 ) . A l t h o u g h at o t a l l y d e f i n e d m e d i u m h a s n o t b e e n d e v e l o p e d , c e r t a i no b s e r v a t i o n s c a n b e made a b o u t t h e n u t r i t i o n a l r e q u i r e m e n t so f G i a r d i a s p p . T h e most c o m m o n l y u s e d m e d i u m , m o d i f i e dT Y I - S - 3 3 ( 1 8 3 ) , i n c l u d e s b o v i n e s e r u m , b i l e s a l t s , c a s e i nd i g e s t , y e a s t e x t r a c t , c y s t e i n e , d e x t r o s e , f e r r i c ammoniumc i t r a t e , a n d a s c o r b i c a c i d . E s p e c i a l l y n o t a b l e a r e t h e a b s o -l u t e r e q u i r e m e n t s f o r c y s t e i n e a n d a l o w 0 2 c o n c e n t r a t i o n ,d i s c u s s e d i n g r e a t e r d e t a i l b e l o w .

C a r b o h y d r a t e a n d P r o t e i n M e t a b o l i s mA l t h o u g h e u k a r y o t e s a r e c h a r a c t e r i z e d b y a p r e d o m i -n a n t l y a e r o b i c m e t a b o l i s m , s e v e r a l p r o t o z o a n s , i n c l u d i n gG i a r d i a , E n t a m o e b a , a n d T r i c h o m o n a s s p p . , a r e n o t a b l ee x c e p t i o n s ( 2 2 9 ) . I n k e e p i n g w i t h t h e i r l a c k o f m i t o c h o n d r i aa n d m i t o c h o n d r i a l e n z y m e s , t h e s e o r g a n i s m s p r o d u c e e n -

e r g y b y f e r m e n t a t i o n , w i t h a l a c k o f c o m p l e t e o x i d a t i o n o fc a r b o h y d r a t e s t o C O 2 a n d H 2 0 . A l l t h e e n z y m e s o f c ar b o -h y d r a t e m e t a b o l i s m i n G i a r d i a s p p . a r e p r e s e n t i n t h ec y t o p l a s m , w h e r e a s some o f t h e e n z y m e s i n T r i c h o m o n a ss p p . a r e p r e s e n t i n o r g a n e l l e s c a l l e d h y d r o g e n o s o m e s ( 2 0 5 ) .S i m p l e s u g a r s , p r i m a r i l y g l u c o s e , a p p e a r t o p r o v i d e t h em a j o r s o u r c e o f e n e r g y t h a t i s d e r i v e d f r o m c a r b o h y d r a t e s( 2 0 6 ) . I n o n e s t u d y , G i a r d i a t r o p h o z o i t e s w e r e a b l e t op r o l i f e r a t e i n m e d i u m w i t h a l o w ( < 1 0 mM) g l u c o s e concen-t r a t i o n a t a r a t e 5 0 % t h a t o f c o n t r o l s , l e a d i n g t o t h e s u g g e s -t i o n t h a t G . l a m b l i a t r o p h o z o i t e s o b t a i n a p o r t i o n o f t h e i re n e r g y f r o m s o u r c e s o t h e r t h a n g l u c o s e ( 2 8 3 ) . H o w e v e r , t h eu s e o f e n d o g e n o u s g l u c o s e o r o t h e r e n e r g y s t o r e s w a s n o tr u l e d o u t .A n a l y s e s o f t h e c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m o f G . l a m b l i ah a v e d e m o n s t r a t e d t h e a b s e n c e o f a K r e b s c y c l e , c y -t o c h r o m e - m e d i a t e d e l e c t r o n t r a n s p o r t , a n d o x i d a t i v e p h o s -p h o r y l a t i o n ( 2 0 6 , 3 2 4 ) . C y t o c h r o m e s h a v e n o t b e e n d e t e c t e di n G i a r d i a s p p . ( 1 7 2 ) .G l u c o s e a n d p e r h a p s o t h e r s i m p l e s u g a r s a r e c o n v e r t e d t op y r u v a t e b y t h e E m b d e n - M e y e r h o f - P a r n a s a n d h e x o s em o n o p h o s p h a t e s h u n t p a t h w a y s ( 1 7 2 , 2 0 6 , 3 2 4 ) ( F i g . 3 ) . I nm o s t a e r o b i c a n d a n a e r o b i c o r g a n i s m s , t h e m a j o r r e g u l a -t o r y s t e p i n g l y c o l y s i s i s t h e c o n v e r s i o n o f f r u c t o s e 6 - p h o s -p h a t e t o f r u c t o s e 1 , 6 - p h o s p h a t e b y A T P - d e p e n d e n t p h o s -p h o f r u c t o k i n a s e . H o w e v e r , l i k e t h e a n a e r o b i c p r o t o z o a n sE n t a m o e b a h i s t o l y t i c a a n d T r i c h o m o n a s s p . , G . l a m b l i ac o n t a i n s P P i - d e p e n d e n t p h o s p h o f r u c t o k i n a s e i n s t e a d o f ATP-

VOL. 5 5 , 1 9 9 1

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NADH NADO x a l a c e t a t e \ J M a l a t eGTP NADP

GDP) C 0 2 C 0 2 NADPH0 C 2 CoA

C a r b o h y d r a t e --z P h o s p h o e n o l p y r u v a t e - P y r u v a t e A c e t y l Co A A c e t a t e2NAD 2NADH ADP A T P . X X H 2 ADP A T P

, NADPH NADP,NADPH NADP

A c e t a l d e h y d e E t h a n o l( o G l y c o l y t i c e n z y m e s ; ( P h o s p h o e n o l p y r u v a t e c a r b o x y k i n a s e ( G D P ) ; O p y r u v a t e k i n a s e ( A D P ) ; m a l a t e d e h y d r o g e n a s e ( N A D ) ;0 m a l a t e d e h y d r o g e n a s e ( d e c a r b o x y l a t i n g ) ( N A D P ) ; 0 p y r u v a t e : f e r r e d o x i n o x i d o r e d u c t a s e ( 0 a c e t y l - C o A s y n t h e t a s e ( A D P ) ;0 a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ( N A D P ) ; ( ) NADPH o x i d o r e d u c t a s e .

F I G . 3 . C a r b o h y d r a t e p a t h w a y . N o t e t h a t t h e o l d name f o r n o . 6 i s p y r u v a t e s y n t h a s e . S e e r e f e r e n c e 2 5 2 f o r i n c l u s i o n o f t h e a l a n i n es y n t h e s i s p a t h w a y . R e p r i n t e d w i t h p e r m i s s i o n ( 2 0 6 ) .

d e p e n d e n t p h o s p h o f r u c t o k i n a s e ( 2 1 9 ) . No e v i d e n c e f o rr e g u l a t i o n o f t h i s enzyme h a s b e e n r e p o r t e d .T h e e n d p r o d u c t s o f c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m vary con-s i d e r a b l y w i t h t h e 02 c o n c e n t r a t i o n ( 2 5 2 , 2 5 3 ) . I n a n anaer-o b i c e n v i r o n m e n t , a l a n i n e i s t h e m a j o r p r o d u c t ( 8 9 , 2 5 2 ,2 5 3 ) . I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t a l a n i n e i s p r o d u c e d f r o mp y r u v a t e a n d k e t o g l u t a r a t e i n a p a t h w a y u s i n g g l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s e a n d a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e a n d t h e o x i d a -t i o n o f NAD(P)H ( 2 5 2 ) . W i t h t h e a d d i t i o n o f l o w c o n c e n t r a -t i o n s o f 02 ( < 0 . 2 5 F . M ) , e t h a n o l p r o d u c t i o n i s s t i m u l a t e d a n da l a n i n e p r o d u c t i o n i s d e c r e a s e d ( 2 5 2 ) . A t s o m e w h a t h i g h e r02 c o n c e n t r a t i o n s ( > 4 6 , u M ) , a c e t a t e a n d CO2 p r o d u c t i o n i sp r e d o m i n a n t a n d a l a n i n e p r o d u c t i o n d i s a p p e a r s ( 8 9 ) . T h eo x y g e n - s e n s i t i v e enzyme p y r u v a t e : f e r r e d o x i n o x i d o r e d u c -t a s e ( f o r m e r l y c a l l e d p y r u v a t e s y n t h a s e ) c a t a l y z e s t h e pro-d u c t i o n o f a c e t y l c o e nz y m e A f r o m p y r u v a t e , b u t w h e t h e rt h i s e x p l a i n s t h e i n h i b i t i o n o f a c e t a t e p r o d u c t i o n b y h i g h 02c o n c e n t r a t i o n s h a s n o t b e e n r e p o r t e d .I n a d d i t i o n t o a l a n i n e p r o d u c t i o n , t h e r e i s e v i d e n c e f o re n d o g e n o u s p r o d u c t i o n o f v a l i n e ( 2 5 2 ) . T h e p r o p o s a l t h a tp r o l i n e i s s y n t h e s i z e d ( 8 9 ) h a s n o t b e e n c o n f i r m e d ( 2 5 2 ) .T h e r e f o r e , most a m i n o a c i d s are o b t a i n e d b y s c a v e n g i n gf r o m t h e h o s t .D u r i n g axe nic g r o w t h , G . l a m b l i a t r o p h o z o i t e s s u r viveb e s t u n d e r c o n d i t i o n s o f low 02 t e n s i o n . S u r v i v a l i n h i g h 02( a m b i e n t c o n c e n t r a t i o n ) i s r e d u c e d , b u t c y s t e i n e p r o v i d e sp a r t i a l p r o t e c t i o n a g a i n s t t h e O 2 - m e d i a t e d k i l l i n g . T h i s pro -t e c t i o n i s a s p e c i f i c e f f e c t o f c y s t e i n e a n d i s n o t s e e n w i t hc y s t i n e or o t h e r r e d u c i n g a g e n t s ( 1 2 3 , 1 2 4 , 1 2 7 ) . T h e pres-e n c e o f f r e e t h i o l g r o u p s on t h e s u r f a c e o f G i a r d i a t r o p h o -z o i t e s h a s b e e n d e m o n s t r a t e d b y s h o w i n g t h a t t r o p h o z o i t e swere k i l l e d b y t h r e e d i f f e r e n t t h i o l - b l o c k i n g agents t h a t d on o t p e n e t r a t e i n t a c t c e l l s ( 1 3 0 ) . Th e k i l l i n g was p r e v e n t e d b yc y s t e i n e a n d b y p r o t e i n s c o n t a i n i n g c y s t e i n e . When t r o p h o -z o i t e s ar e m e t a b o l i c a l l y l a b e l e d w i t h r a d i o a c t i v e c y s t e i n e ,most o f t h e l a b e l i s i n c o r p o r a t e d i n t o a m a j o r s u r f a c e p r o t e i nt h a t i s p r e s e n t on t h e s u r f a c e o f t h e o r g an i s m a n d s e c r e t e d i nl a r g e q u a n t i t i e s i n t o t h e medium ( 2 , 8 ) . T h e r e f o r e , i t i sp o s s i b l e t h a t t h i s p r o t e i n p r o v i d e s some p r o t e c t i o n a g a i n s t0 2 .

E n e r g y m e t a b o l i s m h a s b e e n o b s e r v e d i n G . m u r i s c y s t s a ta l e v e l a p p r o x i m a t e l y 1 0 t o 2 0 % t h a t i n t r o p h o z o i t e s ( 2 5 1 ) .E t h a n o l s t i m u l a t e d t h e r e s p i r a t i o n o f b o t h t r o p h o z o i t e s a n dc y s t s , w h e r e a s g l u c o s e s t i m u l a t e d o n l y t r o p h o z o i t e s . T h er a t e o f r e s p i r a t i o n d e c l i n e d w i t h d e c r e a s i n g t e m p e r a t u r e ,s u g g e s t i n g a p o s s i b l e e x p l a n a t i o n f o r t h e l o n g e r s u r v i v a l o fG i a r d i a c y s t s a t l o w e r t e m p e r a t u r e s ( 3 8 ) . A l t h o u g h mostr e s p i r a t o r y i n h i b i t o r s h a d s i m i l a r e f f e c t s o n c y s t s a n d t r o -p h o z o i t e s , m e t r o n i d a z o l e h a d n o e f f e c t o n c y s t s when i t wasu s e d a t c o n c e n t r a t i o n s t h a t c o m p l e t e l y i n h i b i t e d t r o p h o z o i t er e s p i r a t i o n . S o d i u m n i t r i t e i s t h o u g h t t o a c t b y a m e c h a n i s ms i m i l a r t o t h a t o f m e t r o n i d a z o l e , a n d i t i n h i b i t e d r e s p i r a t i o ni n b o t h f o r m s ( 2 5 1 ) . T h e r e f o r e i t i s p r o p o s e d t h a t m e t r o n i d a -z o l e was n o t a c t i v e a g a i n s t t h e c y s t b e c a u s e i t d i d n o tp e n e t r a t e t h e c y s t w a l l . M e n a d i o n e , a r e d o x - c y c l i n g n a p h -t h o q u i n o n e , f i r s t s t i m u l a t e d a n d t h e n i n h i b i t e d r e s p i r a t i o n i nb o t h c y s t s a n d t r o p h o z o i t e s a n d d e s t r o y e d t h e i r v i a b i l i t y ,p r e s u m a b l y t h r o u g h t h e g e n e r a t i o n O f 0 2 r a d i c a l s .

L i p i d M e t a b o l i s mS t u d i e s o f t h e l i p i d m e t a b o l i s m o f G . l a m b l i a t r o p h o z o i t e sh a v e r e v e a l e d l i t t l e o r n o d e n o v o s y n t h e s i s o f c e l l u l a rp h o s p h o l i p i d s o r s t e r o l s ( 1 7 2 ) . R a t h e r , f a t t y a c i d s a n d c h o -l e s t e r o l a r e i n c o r p o r a t e d f r o m t h e g r o w t h m e d i u m i n t o t h el i p i d f r a c t i o n o f t h e t r o p h o z o i t e . A l t h o u g h i t i s n o t knownhow much o f t h e l i p i d s y n t h e s i s i s f r o m f r e e f a t t y a c i d s a n dh ow mu ch i s f r o m e s t e r i f i e d f a t t y a c i d s , t r o p h o z o i t e s h a v eb e e n s h o w n t o i n c o r p o r a t e a r a c h i d o n i c a c i d i n t o p h o s p h a t i -d y l i n o s i t o l ( 4 0 ) .T h e i m p o r t a n c e o f b i l e i n t h e g r o w t h o f G i a r d i a s p p . w a sf i r s t s u g g e s t e d b y t h e p r o p e ns i t y o f t h e o r g a n i s m s t o c o l o n i z et h e d u o d e n u m a n d j e j u n u m . T h e e n h a n c e d g r o w t h o f t r o p h o -z o i t e s i n t h e p r e s e n c e o f b i l i a r y l i p i d s a n d t h e a b i l i t y o fb i l i a r y l i p i d s t o s u p p o r t t h e i r g r o w t h i n t h e a b s e n c e o f s e r u ms u g g e s t t h a t b i l e may b e i m p o r t a n t i n v i v o a s a s o u r c e o fl i p i d s ( 1 0 1 , 1 0 4 , 1 2 5 ) . S p e c i f i c a l l y , i n v i t r o g r o w t h o f t r o p h o -z o i t e s i s s u p p o r t e d b y c h o l e s t e r o l , t h e b i l i a r y p h o s p h o l i p i dp h o s p h a t i d y l c h o l i n e , a n d t h e b i l e s a l t s g l y c o c h o l a t e a n dg l y c o d e o x y c h o l a t e ( 1 2 5 ) . I n c o n t r a s t , f r e e f a t t y a c i d s a t

M I C R O B I O L . R E V .7 1 2 ADAM

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BIOLOGY OF GIARDIA S P P . 7 1 3

P y r i m i d i n eP a t h w a y s

U r a c i l 0 o UMP - U D P - - UTPU r i d i n et oC y t i d i n e

C y t o s i n e i ;CMP - CDP - CTPT h y m i d i n e 0 TMP -*TDP- TTP

P u r i n eP a t h w a y s

A d e n o s i n e ( i A d e n i n e i -AMP - * ADP * - A T PG u a n o s i n e - o G u a n i n e -a GMP > o GDP *- GTP

( o u r a c i l p h o s p h o r i b o s y l t r a n s f e r a s e ; ( 0 u r i d i n e h y d r o l a s e ; ( D u r i d i n e p h o s p h o t r a n s f e r a s e ; 0 c y t i d i n ed e a m i n a s e ; 0 c y t i d i n e h y d r o l a s e ; ( c y t o s i n e p h o s p h o r i b o s y l t r a n s f e r a s e ; ( 0 t h y m i d i n e p h o s p h o t r a n s f e r a s e ;( O a d e n o s i n e h y d r o l a s e ; 0 a d e n i ne p h o s p h or i b o s y l tr a ns f e r as e ; ( i g u a n o s i n e h y d r o l a s e ; ( g u a n i n ep h o s p h o r i b o s y l t r a n s f e r a s e .

F I G . 4 . N u c l e o t i d e s y n t h e s i s p a t h w a y . N o t e t h a t o t h e r i n v e s t i g a t o r s ( 1 9 6 ) h a v e r e p o r t e d a u r i d i n e - t h y m i d i n e p h o s p h o r y l a s e c a t a l y z i n g t h ec o n v e r s i o n o f u r i d i n e t o u r a c i l ( e n z y m e n o . 2 ) a n d t h y m i d i n e t o t h y m i n e , b u t t h e r e s u l t s h a v e n o t b e e n c o n f i r m e d . A d a p t e d w i t h p e r m i s s i o n( 1 3 , 3 1 8 ) .

c o n c e n t r a t i o n s b e l o w 1 2 p , M a r e t o x i c t o t r o p h o z o i t e s .N o r m a l human m i l k i s t o x i c t o t r o p h o z o i t e s i n v i t r o , p r o b a -b l y t h r o u g h f r e e f a t t y a c i d s r e l e a s e d b y a b i l e s a l t - s t i m u l a t e dl i p a s e p r e s e n t i n t h e m i l k ( 2 6 8 ) .N u c l e i c A c i d S a l v a g e

M o s t e u k a r y o t e s a r e c a p a b l e o f d e n o v o p u r i n e a n dp y r i m i d i n e s y n t h e s i s , b u t n o t a b l e e x c e p t i o n s a r e f o u n da m o n g t h e p r o t o z o a n s ( 3 1 7 ) . A l t h o u g h m o s t o f t h e p r o t o z o a np a r a s i t e s l a c k p u r i n e s y n t h e s i s , G . l a m b l i a ( 1 3 ) ( F i g . 4 ) ,T r i c h o m o n a s v a g i n a l i s ( 3 1 9 ) , a n d T r i t r i c h o m o n a s f o e t u s( 3 2 0 ) a l s o l a c k d e n o v o s y n t h e s i s o f p y r i m i d i n e s ; i n s t e a d ,t h e y d e p e n d o n s a l v a g e o f e x o g e n o u s l y s y n t h e s i z e d n u c l e i ca c i d s . S t u d i e s o f t h e p u r i n e m e t a b o l i s m o f G . l a m b l i a b yu s i n g r a d i o l a b e l e d p r e c u r s o r s r e v e a l e d t h e i n c o r p o r a t i o n o fa d e n i n e , a d e n o s i n e , g u a n i n e , a n d g u a n o s i n e i n t o n u c l e o -t i d e s , b u t n o t f o r m a t e , g l y c i n e , h y p o x a n t h i n e , i n o s i n e , o rx a n t h i n e ( 3 5 , 2 2 1 , 3 1 8 ) . A s s a y s f o r e n z y m e a c t i v i t y r e v e a l e do n l y a d e n o s i n e a n d g u a n o s i n e h y d r o l a s e a n d a d e n i n e a n dg u a n i n e p h o s p h o r i b o s y l t r a n s f e r a s e . T h e l a t t e r h a s b e e n p u -r i f i e d ( 1 4 ) . G i a r d i a s p p . l a c k r i b o n u c l e o t i d e r e d u c t a s e a n df a i l t o i n c o r p o r a t e p u r i n e b a s e s a n d n u c l e o s i d e s , i n s t e a dd e p e n d i n g o n t h e s a l v a g e o f e x o g e n o u s p u r i n e d e o x y n u c l e -o s i d e s ( 2 4 ) .S t u d i e s o f p y r i m i d i n e m e t a b o l i s m h a v e r e v e a l e d d e p e n -d e n c e o n s a l v a g e o f e x o g e n o u s t h y m i d i n e , c y t i d i n e , a n du r i d i n e ( 1 3 , 2 0 4 ) ( F i g . 4 ) . T h e p y r i m i d i n e s a r e t a k e n u p b ya c t i v e - t r a n s p o r t m e c h a n i s m s , a n d c o m p e t i t i o n e x p e r i m e n t ss u g g e s t t h a t o n e s i t e i s u s e d f o r u r i d i n e a n d c y t o s i n e a n da n o t h e r i s u s e d f o r t h y m i d i n e ( 1 7 0 ) . O t h e r i n v e s t i g a t o r s h a v es u g g e s t e d t h a t c o n v e r s i o n o f t h e p y r i m i d i n e n u c l e o s i d e s ,t h y m i d i n e , u r i d i n e , a n d d e o x y u r i d i n e , t o t h e i r r e s p e c t i v eb a s e s may b e c a t a l y z e d b y a s i n g l e e n z y m e , u r i d i n e / t h y m i -

d i n e p h o s p h o r y l a s e ( 1 9 6 ) . T h e s e i n v e s t i g a t o r s d i d n o t f i n de v i d e n c e f o r t h e e n z y m e u r i d i n e h y d r o l a s e ( F i g . 4 , e n z y m en o . 2 ) d e s c r i b e d b y o t h e r i n v e s t i g a t o r s ( 1 3 ) .GENETICS

A n a l y s i s o f G i a r d i a b y c l a s s i c g e n e t i c a n a l y s i s w o u l d b ev e r y h e l p f u l i n u n d e r s t a n d i n g i t s b i o l o g y . H o w e v e r , t h e l a c ko f a d e f i n e d g r o w t h medium w i t h n u t r i t i o n a l a u x o t r o p h s o rd r u g - r e s i s t a n t m u t a n t s h a s made t h e c l a s s i c a p p r o a c h i m p o s -s i b l e . S t a b l e t r a n s f o r m a t i o n w i t h f o r e i g n DNA h a s a l s o b e e nd i f f i c u l t t o a c h i e v e i n p r o t o z o a n s , b u t t r a n s i e n t ( 2 8 , 6 0 , 1 9 4 )o r s t a b l e ( 1 8 2 , 1 9 3 ) e x p r e s s i o n o f e x t r a c h r o m o s o m a l DNAi n t r o d u c e d b y e l e c t r o p o r a t i o n a n d s t a b l e e x p r e s s i o n w i t h t h eu s e o f g e n e s i n t e g r a t e d i n t o t h e g e n o m e b y h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ( 1 9 7 ) h a v e r e c e n t l y b e e n r e p o r t e d f o r o t h e rp r o t o z o a n s a n d may a l s o b e s u c c e s s f u l i n G i a r d i a s p p . T h u sf a r , o u r u n d e r s t a n d i n g o f G i a r d i a g e n e t i c s h a s b e e n o b t a i n e db y a n a l y s i s o f t h e f e w G i a r d i a g e n e s t h a t h a v e b e e n c l o n e d .DN A a n d C h r o m o s o m e C o n t e n t

T h e G+C c o n t e n t o f t h e G . l a m b l i a g e n o m e h a s b e e nc a l c u l a t e d t o b e 42% ( 2 4 2 ) o r 48% ( 4 2 ) , w h e r e a s t h e G+Cc o n t e n t o f t h e rDNA g e n e i s 75% ( 1 4 6 ) a n d t h o s e o f t h ep r o t e i n - c o d i n g g e n e s s e q u e n c e d s o f a r r a n g e f r o m 49% t og r e a t e r t h a n 60% ( T a b l e 1 ) . A s a t e l l i t e b a n d c o n t a i n i n grDNA c a n b e s e e n o n c e s i u m c h l o r i d e - e t h i d i u m b r o m i d eu l t r a c e n t r i f u g e d DNA p r e p a r a t i o n s ( 1 ) b e c a u s e o f t h e h i g hG+C c o n t e n t . T h e r e f o r e t h e n o n c o d i n g r e g i o n s m u s t b er e l a t i v e l y A+T r i c h i f t h e v a l u e s o b t a i n e d b y u s i n g t h em e l t i n g t e m p e r a t u r e a r e c o r r e c t .E s t i m a t e s o f t h e g e n o m e c o m p l e x i t y o f G . l a m b l i a u s i n gC o t a n a l y s i s h a v e r a n g e d f r o m 3 . 0 x 1 0 7 ( 2 4 2 ) t o 8 x 1 0 7 ( 4 2 ) .

V O L . 5 5 , 1 9 9 1

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TABLE 1 . P r o t e i n - c o d i n g g e n e s o f G . l a m b l i aS e q u e n c e a t p r o b a b l e L e n g t h o f 5 ' G+C c o n t e n t o fP r o t e i n a ( r e f e r e n c e ) s i t e o f t r a n s l a t i o n u n t r a n s l a t e d 3 ' U n t r a n s l a t e d s e q u e n c e d p r o t e i n - c o d i n gi n i t i a t i o n b s e q u e n c e ' p o r t i o n ( % )

S t r u c t u r a l p r o t e i n sc x - T u b u l i n ( g , c ) ( 1 8 7 ) ATAAAAATGCGT 6P - T u b u l i n ( g , c ) ( 1 8 6 , TTAAAAATGCGT 6 TAGCCTTGAGCGAGTAAATTCCCG 6 71 8 7 )c s 1 - G i a r d i n ( g ) ( 1 5 , 2 5 6 ) TTAAAAATGCCG 3 TAGGGGTTTAGIGAACGTCTTTAG 6 0c t 2 - G i a r d i n ( 1 5 ) TAGAAAATGCCG 3 TAGGCGCCTTTACTGCGGGGTTTCCTTTCGCTAGTGA 5 7ATTGCCTAGCGGGT1 - G i a r d i n ( g , c ) CCGTCTATGTTC TAACGCCTCGAGTAAA 5 9( 6 , 2 2 , 1 6 2 )- y - G i a r d i n ( 2 4 6 ) AAGAAAATGAAG TAAGGGGCTGGGCTGGTGAGTAAATTTCCCTATAGC 5 3S u r f a c e p r o t e i n sCRP 1 7 0 ( g , c ) ( 2 , 5 ) GCCTCAATGTTG 1 TGACTTAGGTAGTGAATGCTGTAC(A),, 6 5 , 5 6 eTSA 4 1 7 ( g ) ( 1 2 6 ) GGCCTAATGTTC TAGATGTACTTAGATAGTAAACCGTCATCGATG 5 3CRP 7 2 ( c ) ( 5 ) TGACTTAGGTAGTGAATGCTATAC(A), 5 5VSP 1 2 6 7 ( c , g ) ( 2 2 8 ) ACTTCAATGTTG 1 TAGACTTAGGTAGTAAACGCGTCACTGT(A)n 4 9H e a t s h o c k p r o t e i n ( g ) ( 7 ) AGTAGGATGCCT 5 0G l u t a m a t e d e h y d r o g e n a s e TTTAAAATGCCT 3 - 6 TGAGGGCTGA,AGTGAATATTTACCTTTTCC 6 1( g , c ) ( 3 3 1 )" g , g e n o m i c ; c , cDNA.b I n e a c h c a s e , t h e f i r s t ATG w a s u s e d a s t h e s i t e o f t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n a n d w as i n t h e o p e n r e a d i n g f r a m e . F o r Q , - g i a r d i n , c o n f i r m a t i o n o f t h e b e g i n n i n g o ft r a n s l a t i o n w a s o b t a i n e d b y N - t e r m i n a l s e q u e n c i n g o f t h e p r o t e i n ( 1 5 , 2 5 6 ) . F o r t h e t u b u l i n p r o t e i n g e n e s , c o m p a r i s o n w i t h t u b u l i n g e n e s f r o m o t h e r o r g a n i s m sw a s c o n s i s t e n t w i t h t h e p u t a t i v e t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n s i t e .' L e n g t h i n n u c l e o t i d e s . D e t e r m i n e d b y p r i m e r e x t e n s i o n a n d / o r S 1 n u c l e a s e p r o t e c t i o n .d T h e s t o p c o d o n a n d p o s s i b l e p o l y a d e n y l a t i o n s i g n a l ( A G T P u A A P y ) a r e u n d e r l i n e d ." T h e G+C c o n t e n t s o f t h e r e p e a t a n d 3 ' r e g i o n s o f t h e CRP 1 7 0 g e n e a r e s e p a r a t e d .

T h e n u m b e r o f c h r o m o s o m e s p e r n u c l e u s h a s b e e n e s t i m a t e dt o b e f o u r b y l i g h t m i c r o s c o p y ( 1 1 4 ) a n d b y l i g h t - m i c r o s c o p i co b s e r v a t i o n o f f l u o r e s c e n t D A P I - s t a i n e d n u c l e i ( 1 7 7 ) .I n c o n t r a s t , p u l s e d - f i e l d s e p a r a t i o n s o f i n t a c t c h r o m o -s o m e s d e m o n s t r a t e d t h e p r e s e n c e o f a t l e a s t f i v e d i s t i n c t s e t so f c h r o m o s o m e s i n a d d i t i o n t o t h e f r e q u e n t o c c u r r e n c e o fm o r e f a i n t l y s t a i n i n g m i n o r b a n d s t h a t s h o w e d m a r k e d DNAs i m i l a r i t y t o a m a j o r b a n d o f a s l i g h t l y d i f f e r e n t s i z e ( 3 ) ( F i g .5 ) . T h e c h r o m o s o m e s i z e s v a r i e d b e t w e e n a p p r o x i m a t e l y 1x 1 0 6 a n d 4 x 1 0 6 b p , y i e l d i n g a t o t a l o f 1 . 2 x 1 0 7 b p f o r t h ef i v e c h r o m o s o m e s . S i m i l a r l y , o t h e r i n v e s t i g a t o r s h a v e e s t i -m a t e d t h e h a p l o i d g e n o m e s i z e t o b e a p p r o x i m a t e l y 1 . 1 x 1 0 7b p b y d e n s i t o m e t r i c s c a n n i n g o f r e s t r i c t i o n d i g e s t s o f G .l a m b l i a DNA w i t h a n i n f r e q u e n t l y d i g e s t i n g e n z y m e ( 9 9 ) .D e n s i t o m e t r i c s c a n n i n g s u g g e s t e d t h a t e a c h t r o p h o z o i t ec o n t a i n s a p p r o x i m a t e l y 3 0 t o 5 0 c h r o m o s o m a l DNA m o l e -c u l e s ( 3 ) . T h i s r e p r e s e n t s a p p r o x i m a t e l y o n e c o p y o f t h em i n o r b a n d s a n d t h r e e t o f i v e c o p i e s o f t h e m a j o r b a n d s p e rn u c l e u s . O n e p o s s i b l e e x p l a n a t i o n o f t h e d a t a i s t h a t G i a r d i at r o p h o z o i t e s a r e p o l y p l o i d , c o n t a i n i n g s e v e r a l c o p i e s o f e a c hc h r o m o s o m e p e r n u c l e u s . T h e m i n o r b a n d s m i g h t r e p r e s e n ts i z e v a r i a n t s o f " h o m o l o g o u s " c h r o m o s o m e s . A l t e r n a t i v e l y ,e a c h o f t h e m o r e i n t e n s e l y s t a i n i n g b a n d s may r e p r e s e n tm o r e t h a n o n e d i s t i n c t c h r o m o s o m e .T h e l i g h t - m i c r o s c o p i c f i n d i n g s a r e m o s t c o n s i s t e n t w i t ht h e p r e s e n c e o f h a p lo i d n u c l e i . H o w e v e r , f o u r ( i f e a c hn u c l e u s h a s t h e s a m e c h r o m o s o m e s ) o r e i g h t ( i f e a c h n u c l e u sh a s d i f f e r e n t c h r o m o s o m e s ) c h r o m o s o m e s o f 1 t o 4 Mb d on o t e x p l a i n t h e C o t a n a l y s i s v a l u e s o f 3 x 1 0 7 a n d 8 x 1 0 7 o rt h e a p p a r e n t p r e s e n c e o f 3 0 t o 5 0 c h r o m o s o m a l DNA m o l e -c u l e s p e r t r o p h o z o i t e . F u r t h e r s t u d i e s i n v o l v i n g d i f f e r e n ta p p r o a c h e s a r e n e c e s s a r y t o r e s o l v e t h e s e c o n f l i c t i n g d a t ar e g a r d i n g t h e G i a r d i a g e n o m e s i z e a n d p l o i d y .I f G i a r d i a i s p o l y p l o i d , ho w a r e m u l t i p l e c o p i e s o f ac h r o m o s o m e m a i n t a i n e d i n t h e a b s e n c e o f a s e xu a l c y c l e ? Tod a t e , a s e x u a l c y c l e o f r e p r o d u c t i o n h a s n o t b e e n d e s c r i b e d

f o r G i a r d i a s p p . I n a d d i t i o n , t h e r e m a r k a b l e g e n e t i c d i v e r s i t ya m o n g G i a r d i a i s o l a t e s c a n p e r h a p s b e e x p l a i n e d b e t t e r o nt h e b a s i s o f c l o n a l d i v e r g e n c e ( 3 0 4 ) t h a n t h r o u g h s e x u a lr e p r o d u c t i o n .

F I G . 5 . P u l s e d - f i e l d g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f e i g h t i s o l a t e s . C h r o -m o s o m a l s e p a r a t i o n s o f e i g h t d i f f e r e n t G i a r d i a i s o l a t e s i s s h o w n . A l la r e h u m a n e x c e p t BE 1 ( b e a v e r ) a n d GP ( g u i n e a p i g ) . T h e JH i s o l a t eh a s f i v e d i s t i n c t c h r o mo s o m e s , a nd t o t a l DNA a n d c h r o m o s o m e -s p e c i f i c p r o b e s f r o m t h e s m a l l e s t t w o JH c h r o m o s o m e s h y b r i d i z e t ot h e s m a l l e s t b a n d f r o m t h e o t h e r i s o l a t e s , s u g g e s t i n g t h a t i t r e p r e -s e n t s t w o c o m i g r a t i n g c h r o m o s o m e s ( 3 ) . N o t e t h e m o r e f a i n t l ys t a i n i n g m i n o r b a n d s o n some i s o l a t e s ( e . g . , I S R ) . T h e y a r e p r e s e n ti n d o u b l y c l o n e d i s o l a t e s a n d s h o w m a r k e d DNA s i m i l a r i t y t o o n e o ft h e m o r e i n t e n s e l y s t a i n i n g b a n d s , b u t t h e e x a c t r e l a t i o n s h i p b e -t w e e n t h e m i s n o t k n o w n . A l s o n o t e t h e d i s t i n c t p a t t e r n o f t h e CMa n d BE 1 i s o l a t e s . I n c o n t r a s t , BE 2 m i g r a t e s i n a p a t t e r n s i m i l a r t ot h a t o f WB ( 1 ) . I t i s o f i n t e r e s t t h a t t h e d i f f e r e n c e s a r e d i s t i n c t f r o mt h e m a m m a l i a n s p e c i e s o f o r i g i n .

M I C R O B I O L . R E V .7 1 4 ADAM

A . . * % A .. , C T o q e 0 1 0 C . : 0M.. . . . W -W-..

8/3/2019 Adam (1991)

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BIOLOGY OF G I A R D I A S P P . 7 1 5rRNA

T h e rRNAs o f G . l a m b l i a a r e u n i q u e i n t h a t t h e y a r es m a l l e r t h a n t h o s e o f o t h e r e u k a r y o t e s a n d i n f a c t a r e s m a l l e rt h a n t h o s e o f t h e e u b a c t e r i a ( 4 2 , 8 3 ) . T h e rDNA g e n e i s o n l y5 , 5 6 6 b p ( 1 4 6 ) a n d i s t a n d e m l y r e p e a t e d i n t h e g e n o m e . T h et a n d e m r e p e a t e n c o d e s t h e l a r g e s u b u n i t ( 2 8 S ) , s m a l l s u b u n i t( 1 6 S ) , a n d 5 . 8S f o r m s , e a c h o f w h i c h i s s m a l l e r t h a n i t sc o u n t e r p a r t s i n o t h e r e u k a r y o t i c o r g a n i s m s . I n c o n t r a s t , t h erDNA g e n e s o f G . m u r i s a n d G . a r d e a e a r e 7 . 6 k b b e c a u s e o fa l a r g e r i n t e r g e n i c s p a c e r r e g i o n ( 3 1 1 ) ( s e e t h e s e c ti o n o ns p e c i e s d e t e r m i n a t i o n a n d s t r a i n v a r i a t i o n ) .S e q u e n c e a n a l y s i s o f t h e g e n e e n c o d i n g t h e s m a l l - s u b u n i tRNA h a s b e e n u s e d t o c l a s s i f y G . l am b l i a a s t h e m o s tp r i m i t i v e e u k a r y o t e ( 2 9 6 ) . I n f a c t , t h e s e q u e n c e o f t h e G .l a m b l i a s m a l l - s u b u n i t rRNA s h o w s g r e a t e r s i m i l a r i t y t o t h ea r c h a e b a c t e r i a s e q u e n c e t h a n d o t h e s e q u e n c e s f r o m o t h e re u k a r y o t e s . T h e s m a l l s i z e h a s a l s o a l l o w e d f u r t h e r a n a l y s i so f t h e e s s e n t i a l r e g i o n s a n d p u t a t i v e p r o c e s s i n g r e g i o n s ( 8 5 ) .S t u d i e s o f t h r e e G . l a m b l i a t e l o m e r i c c l o n e s r e v e a l e d a na b r u p t t r a n s i t i o n f r o m rDNA t o t e l o m e r i c r e p e a t s , TAGGG,t w o f r o m t h e s a m e p l a c e a t t h e b e g i nn i ng o f t h e l a r g e- s u b u ni trRNA a n d o n e a t t h e b e g i n n i n g o f t h e i n t e r g e n i c s p a c e r . Thes e q u e n c e CCCCGGA w a s p r e s e n t a t e a c h o f t h e b r e a k p o i n t s( 4 ) . C o p i e s o f rDNA g e n e s w e r e p r e s e n t o n m u l t i p l e c h r o -m o s o m e s , w i t h s u b s t a n t i a l v a r i a t i o n among o t h e r w i s ec l o s e l y r e l a t e d i s o l a t e s . I n t e r e s t i n g l y , c o p i e s o f t h e rDNAr e p e a t s a r e p r e s e n t o n t h e m i n o r b a n d s o f t h e I S R i s o l a t e a n dm ay a c c o u n t f o r some o f t h e s i z e d i f f e r e n c e o f t h e m i n o rb a n d s . O t h e r i n v e s t i g a t o r s a l s o d e m o n s t r a t e d a t e l o m e r i cl o c a t i o n f o r rDNA r e p e a t s a n d s h o w e d f r e q u e n t r e a r r a n g e -m e n t s o f t h e rDNA r e p e a t s w i t h i n c l o n e d l i n e s o f WBt r o p h o z o i t e s ( 1 9 5 a ) .

T r a n s l a t i o nL i t t l e i s k n o w n a b o u t t r a n s l a t i o n i n G i a r d i a s p p . , b u t t h e r e

i s some e v i d e n c e t o s u g g e s t t h a t t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n may b ed i f f e r e n t f r o m t h a t i n t h e h i g h e r e u k a r y o t e s . O f t h e s e -q u e n c e s t h a t h a v e b e e n r e p o r t e d f r o m cDNA c l o n e s a n dc o n f i r m e d b y RNA s e q u e n c i n g o f t h e 5 ' e n d a n d / o r S 1m a p p i n g , a v e r y s h o r t 5 ' u n t r a n s l a t e d r e g i o n h a s b e e nd i s c o v e r e d ( 1 t o 6 b a s e s [ T a b l e 1 ] ) . I n c o n t r a s t , o n l y 4 o f 6 9 9v e r t e b r a t e mRNAs h a d l e a d e r s e q u e n c e s l e s s t h a n 1 0 n u c l e -o t i d e s i n l e n g t h ( 1 9 0 ) . I n v e r t e b r a t e s , mRNAs w i t h s h o r tl e a d e r s e q u e n c e s a r e g e n e r a l l y t r a n s l a t e d i n e f f i c i e n t l y .T h e m e c h a n i s m p r o p o s e d f o r e u k a r y o t i c t r a n s l a t i o n i n i t i -a t i o n i s t h e s c a n n i n g m o d e l ( 1 9 1 ) . T h e 5 ' n u c l e o t i d e o fmRNA c o n t a i n s a m e t h y l a t e d c a p s t r u c t u r e w h i c h s t a b i l i z e st h e mRNA a n d i s i n v o l v e d i n f o r m a t i o n o f t h e s e c o n d a r y a n di n s p l i c i n g . I n t h e s c a n n i n g m o d e l , t h e s m a l l - s u b u n i t RNAb i n d s t h e c a p s t r u c t u r e a n d moves a l o n g ( s c a n s ) t h e mRNAu n t i l i t r e a c h e s t h e f i r s t AUG, w h e r e t r a n s l a t i o n i s i n i t i a t e d .( A l t h o u g h t h e f i r s t AUG i s u s e d f o r t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n i nm o s t mRNAs, a l a t e r AUG i s o c c a s i o n a l l y u s e d . ) T h e s h o r tl e a d e r s e q u e n c e s f o u n d i n G . l a m b l i a mRNAs s u g g e s t t h a t i nG . l a m b l i a , b i n d i n g o f t h e r i b o s o m e t o t h e mRNA a n di n i t i a t i o n o f t r a n s l a t i o n may b e more c l o s e l y l i n k e d t h a n i nv e r t e b r a t e s . R e l a t i v e l y s h o r t l e a d e r s e q u e n c e s a r e a l s o f o u n di n t h e a c t i n ( 1 1 b a s e s [ 8 6 ] ) a n d f e r r e d o x i n ( 9 b a s e s [ 1 6 4 ] )g e n e s o f E n t a m o e b a h i s t o l y t i c a a n d t h e f e r r e d o x i n g e n e ( 1 6b a s e s [ 1 7 3 ] ) o f T r i c h o m o n a s v a g i n a l i s . T h e k i n e t o p l a s t i cp r o t o z o a n s , i n c l u d i n g T r y p a n o s o m a s p . a n d L e i s h m a n i a s p . ,c o n t a i n t r a n s - s p l i c e d l e a d e r RNA s e q u e n c e s w h i c h a r e 3 9n u c l e o t i d e s l o n g i n t h e m a t u r e mRNA ( 7 8 , 3 1 4 ) , b u t no

e v i d e n c e h a s b e e n f o u n d f o r a s i m i l a r phenomenon i nG i a r d i a s p p .T h e e u k a r y o t i c r i b o s o m e r e c o g n i t i o n s e q u e n c e s i n c l u d et h e i n i t i a t i o n c o d o n , a n d c o n s e n s u s s e q u e n c e s a r e GCCA/GCCAUGG i n v e r t e b r a t e s ( 1 9 0 ) , C/AAAA/CAUG i n D r o -s o p h i l a m e l a n o g a s t e r ( 5 6 ) , a n d A/YAA/UAAUGUAU i nS a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ( 5 8 ) . T h e r e i s l i t t l e s i m i l a r i t y o ft h e r e g i o n s u r r o u n d i n g t h e i n i t i a t i o n among t h e G . l a m b l i as e q u e n c e s o r w i t h t h e v e r t e b r a t e c o n s e n s u s s e q u e n c e . How-e v e r , t h e a - a n d , - t u b u l i n s e q u e n c e s m a t c h t h e D r o s o p h i l aa n d S . c e r e v i s i a e r e c o g n i t i o n c o n s e n s u s s e q u e n c e s , a n d A i sp r e s e n t i n 7 o f 1 1 g e n e s a t t h e -3 p o s i t i o n a n d i n 9 o f 1 1 a tt h e -1 p o s i t i o n . I t m u s t b e e m p h a s i z e d t h a t f o r t h e G i a r d i as e q u e n c e s r e p o r t e d , t h e c o r r e ct i n i t i a t i o n c o d o n h a s n o tb e e n e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d b y N - t e r m i n a l a m i n o a c i ds e q u e n c i n g , w i t h t h e e x c e p t i o n o f x 1 - g i a r d i n ( 1 5 , 2 5 6 ) ;k n o w l e d g e o f t h i s i s e s s e n t i a l f o r m o r e r i g o r o u s a n a l y s i s o fr i b o s o m e r e c o g n i t i o n s e q u e n c e s i n G i a r d i a s p p . D e s p i t e t h ed i f f e r e n c e s b e t w e e n mRNA f r o m G i a r d i a s p p . a n d v e r t e -b r a t e s , i n v i t r o t r a n s l a t i o n o f G i a r d i a mRNA h a s b e e np e r f o r m e d i n a r a b b i t r e t i c u l o c y t e l y s a t e s y s t e m ( 1 1 , 2 5 6 ) ,i n d i c a t i n g t h a t G . l a m b l i a mRNA c a n b e t r a n s l a t e d i n av e r t e b r a t e s y s t e m . I n a d d i t i o n , a c o m p a r i s o n o f t h e p e p t i -d y l t r a n s f e r a s e l o o p s e q u e n c e f r o m d o m a i n V o f t h e G .l a m b l i a LS rRNA r e v e a l s g r e a t e r s i m i l a r i t y t o e u k a r y o t e st h a n t o a r c h a e b a c t e r i a o r e u b a c t e r i a ( 8 2 ) .T h e p r o k a r y o t i c r i b o s o m e r e c o g n i t i o n ( S h i n e - D a l g a r n o )s e q u e n c e ( c o n s e n s u s UAAGGAGG) i s l o c a t e d 5 t o 1 0 n u -c l e o t i d e s b e f o r e t h e i n i t i a t i o n c o d o n . A S h i n e - D a l g a r n os e q u e n c e h a s b e e n p r o p o s e d i n some o f t h e G i a r d i a s e -q u e n c e s a n a l y z e d , b u t t h e r e h a s b e e n n o c o n s i s t e n t r e l a t i o n -s h i p b e t w e e n t h e l o c a t i o n o f t h e p u t a t i v e S h i n e - D a l g a r n os e q u e n c e a n d t h e i n i t i a t i o n c o d o n . I n a d d i t i o n , t h e s h o r t 5 'l e a d e r s e q u e n c e s w o u l d n o t a l l o w r i b o s o m e s t o r e c o g n i z e a nu p s t r e a m s e q u e n c e . T h u s , a l t h o u g h t h e t r a n s l a t i o n a p p a r a -t u s o f G . l a m b l i a i s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h a t o f o t h e re u k a r y o t e s , i t a p p e a r s t o b e more s i m i l a r t o t h a t o f o t h ere u k a r y o t e s t h a n o f p r o k a r y o t e s .

S t u d i e s o f t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n i n G i a r d i a s p p . p r o m i s e t ob e i n t e r e s t i n g a n d may s h e d l i g h t o n t h e r e l a t i o n s h i p s b e -t w e e n G i a r d i a s p p . , t h e p r o k a r y o t e s , a n d t h e h i g h e r e u k a r y -o t e s . T h e s h o r t 5 ' l e a d e r s e q u e n c e s a n d t h e u n i q u e rRNAm a y e v e n a l l o w i n s i g h t i n t o t h e t r u l y e s s e n t i a l f e a t u r e s o fe u k a r y o t i c t r a n s l a t i o n .T r a n s c r i p t i o n

T r a n s c r i p t i o n m a y b e more s i m i l a r t o t h a t i n o t h e r e u k a r y -o t e s . A p o s s i b l e TATAA b o x h a s b e e n i d e n t i f i e d i n t h eg e n o m i c c l o n e s t h a t h a v e b e e n s e q u e n c e d ( 7 , 1 2 6 , 1 8 7 ) 9 t o1 3 4 b a s e s u p s t r e a m f r o m t h e i n i t i a t i o n c o d o n . W h e t h e r a n yo f t h e s e p o t e n t i a l TATAA s e q u e n c e s r e p r es e nt s i t e s r e c o g -n i z e d b y RNA p o l y m e r a s e i s u n k n o w n . A p o l y ( A ) t a i lf o l l o w s a s h o r t 3 ' u n t r a n s l a t e d r e g i o n ( T a b l e 1 ) . A 6 - t o1 9 - n u c l e o t i d e i n t e r v a l s e p a r a t e s t h e s e q u e n c e AGTPuAAPyf r o m t h e s t o p c o d o n , w h i c h i s t h e n s e p a r a t e d b y 7 t o 1 0 b a s e sf r o m t h e b e g i n n i n g o f t h e p o l y ( A ) t a i l . Th e s e q u e n c e AGTPuAA h a s b e e n p r o p o s e d a s a p o l y a d e n y l a t i o n s i g n a l f o rG i a r d i a s p p . ( 2 5 6 ) , a n d , i n a d d i t i o n , a p y r i m i d i n e i s p r e s e n ta t t h e n e x t b a s e i n e a c h o f t h e r e p o r t e d s e q u e n c e s . I nc o m p a r i s o n , t h e p o l y a d e n y l a t i o n consensus s e q u e n c e i nv e r t e b r a t e s a n d p l a n t s (AATAAA) i s f o u n d 1 0 t o 3 0 n u c l e o -t i d e s f r o m t h e p o l y ( A ) t a i l ( 2 6 4 ) .I n t r o n s h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n o n l y a m i n o r i t y o f p r o t e i n -c o d i n g g e n e s o f o t h e r p r o t o z o a n s , a n d , s o f a r , n o i n t r o n sh a v e b e e n r e p o r t e d i n G i a r d i a s p p .

VOL. S S , 1 9 9 1

8/3/2019 Adam (1991)

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7 1 6 ADAMH e a t S h o c k R e s p o n s e

A n a l y s i s o f t h e h e a t s h o c k response i n G i a r d i a s p p .r e v e a l e d r e p r e s s i o n o f n o r m a l p r o t e i n s y n t h e s i s a n d i n -c r e a s e d s y n t h e s i s o f f o u r p r o t e i n s ( 1 0 0 , 8 3 , 7 0 , a n d 3 0 k D a )( 2 0 3 ) . I n a d d i t i o n , t h e s eq u e nc e o f a g e n e w h o s e t r a n s c r i p tl e v e l i n c r e a s e s d u r i n g h e a t s h o c k b u t i s u n r e l a t e d t o t h eHSP70 g e n e s o f o t h e r o r g a n i s m s h a s b e e n r e p o r t e d ( 7 ) . T h i sg e n e d o e s n o t h y b r i d i z e t o DNA f r o m c e r t a i n i s o l a t e s ( e . g . ,t h e GS i s o l a t e [ 2 3 2 ] ) , p r o v i d i n g f u r t h e r e v i d e n c e t h a t t h i sg e n e d o e s n o t e n c o d e a t y p i c a l h e a t s h o c k p r o t e i n .SPECIES DETERMINATION AND STRAIN VARIATION

D e t e r m i n a t i o n o f G i ar d i a s p e c i e s h a s c l a s s i c a l l y b e e nmade b y t w o p r e d o m i n a n t m e t h o d s : ( i ) h o s t o f o r i g i n , a n d ( i i )m o r p h o l o g y b y l i g h t m i c r o s c o p y o f t h e t r o p h o z o i t e , p r i m a r -i l y b y t h e a p p e a r a n c e o f t h e m e d i a n b o d y . S i nc e G i ar d i a s p p .c o l o n i z e many m a m m a l i a n a n d n o n m a m m a l i a n h o s t s , t h ec l a s s i f i c a t i o n s c h e m e d e p e n d i n g on t h e h o s t o f o r i g i n r e -s u l t e d i n numerous G i a r d i a s p e c i e s , e a c h named f o r t h e h o s to f o r i g i n ( 1 4 7 ) . I n c o n t r a s t , t h r e e d i s t i n c t m o r p h o l o g i c t y p e so f t r o p h o z o i t e s were i d e n t i f i e d , G . l a m b l i a o r G . d u o d e n a l i s( m a m m a l s a n d b i r d s ) , G . m u r i s ( m o u s e ) , a n d G . a g i l i s( t a d p o l e ) ( 1 1 4 ) . S p e c i e s d e t e r m i n a t i o n b y h o s t o f o r i g i n i sp r o b a b l y i n v a l i d b e c a u s e G i a r d i a spp. f r o m d i f f e r e n t h o s t s( e . g . , c a t , g u i n e a p i g , b e a v e r ) f r e q u e n t l y appear i d e n t i c a l a n dar e v e r y s i m i l a r b y DNA a n a l y s i s , w h e r e a s d i f f e r e n t i s o l a t e sf r o m t h e same h o s t s p e ci e s ca n b e m a r k e d l y d i f f e r e n t ( 2 4 2 ) .T r a n s m i s s i o n f r o m one h o s t t o a n o t h e r h a s b e e n s u c c e s s f u li n a n u m b e r o f e x p e r i m e n t s ( 9 7 , 1 8 8 ) , a l t h o u g h r e s u l t s h a v es o m e t i m e s b e e n c o n t r a d i c t o r y . I n c o n t r a s t t o t h e d i f f i c u l t i e so f s p e c i e s d e t e r m i n a t i o n b y h o s t o f o r i g i n , e l e c t r o n m i c r o s -c op y o f t h e c y s t a n d t r o p h o z o i t e h a s i m p r o v e d t h e a b i l i t y t od e t e c t m o r p h o l o g i c d i f f e r e n c e s b e t w e e n o r g a n i s m s t h a t ap-pe ar t h e same b y l i g h t m i c r o s c o p y .T h e l a c k o f a g o l d s t a n d a r d f o r s p e c i e s d e t e r m i n a t i o n i np r o t o z o a n s ( 3 0 4 ) a d d s t o t h e d i f f i c u l t y o f a s s i g n i n g a p p r o p r i -a t e s p e c i e s t o v a r i o u s G i a r d i a i s o l a t e s . T h e q u e s t i o n o fw h e t h e r g i a r d i a s i s i s a z o o n o t i c i n f e c t i o n h a s b e e n c o n t r o -v e r s i a l ( 3 4 , 1 0 6 ) , a n d i t s r e s o l u t i o n d e p e n d s on c l a r i f y i n g t h ei s s u e o f s p e c i e s d e t e r m i n a t i o n . T h e r e f o r e , t h e d i f f e r e n c e samong t h e G i ar d i a s p e c i e s a n d i s o l a t e s w i l l b e s u m m a r i z e db e l o w t o h e l p c l a r i f y t h e c u r r e n t s t a t e o f k n o w l e d g e .

L i g h t - M i c r o s c o p i c C a t e g o r i e s o f G i a r d i a S p e c i e sG . a g i l i s i s a p a r a s i t e o f a m p h i b i a n s a n d h a s n o t b e e ni s o l a t e d f r o m m a m m a l s . Th e t r o p h o z o i t e s a r e l o n g ( 1 3 t o 3 6, u m ) a n d narrow ( 4 , u m ) ( 1 1 0 ) , f l e x a t t h e m i d b o d y , a n d h a v el o n g c l u b - s h a p e d m e d i a n b o d i e s . I n v i t r o g r o w t h h a s notb e e n r e p o r t e d f o r G . a g i l i s .G . m u r i s t r o p h o z o i t e s a r e a p p r o x i m a t e l y 1 0 t o 1 2 , u m b y 5t o 7 , u m , h a v e a s m a l l , r o u n d e d m e d i a n body ( 1 1 7 ) , a n d a r ef o u n d i n r o d e n t s , r e p t i l e s , a n d b i r d s . L i k e G . a g i l i s , G . m u r i sh a s n o t b e e n grown i n v i t r o a n d h a s not b e e n shown t o causehuman i n f e c t i o n . M i c e i n f e c t e d w i t h G . m u r i s have p r o v i d e d

a g o o d a n i m a l m o d e l f o r s t u d y i n g t h e i m m u n e response tog i a r d i a s i s ( s e e b e l o w ) .T r o p h o z o i t e s o f t h e G . l a m b l i a group a r e a p p r o x i m a t e l y1 0 t o 1 2 , u m b y 5 t o 7 , L m a n d h a v e one o r t w o m e d i a n b o d i e st h a t r e s e m b l e c l aw h a m m e r s . O r g a n i s m s o f t h i s f o r m haveb e e n i s o l a t e d f r o m h u m a n s , d o g s , c a t s , g u i n e a p i g s , b e a v e r s ,g e r b i l s , b i r d s a n d r e p t i l e s , s h e e p , a n d c a t t l e , a n d a t l e a s tsome o f t h e a n i m a l s ar e b e l i e v e d t o a c t a s a r e s e r v o i r f o rhuman i n f e c t i o n ( 5 0 , 1 0 6 ) . T r o p h o z o i t e s f r o m t h i s group

h a v e b e e n a x e n i z e d a n d h a v e t h e r e f o r e b e e n s t u d i e d i ng r e a t e r d e t a i l t h a n G . a g i l i s a n d G . m u r i s .E l e c t r o n - M i c r o s c o p i c C a t e g o r i e s o f t h e G . l a m b l i a G r o u pE l e c t r o n - m i c r o s c o p i c s t u d i e s o f G i a r d i a c y s t s i s o l a t e d

f r o m v o l e s d e m o n s t r a t e d t h e p r e s e n c e o f t h e o r g a n e l l e s o ft w o t r o p h o z o i t e s w i t h i n o n e c y s t , s u g g e s t i n g t h a t c y t o k i n e s i so c c u r s w i t h i n t h e c y s t r a t h e r t h a n a f t e r e x c y s t a t i o n a s i no t h e r o r g a n i s m s f r o m t h e G . l a m b l i a g r o u p ( 1 0 7 ) . T h e r e f o r e ,t h e s e o r g a n i s m s h a v e b e e n a s s i g n e d t o a d i s t i n c t s p e c i e s , G .m i c r o t i , o n t h e b a s i s o f f u n c t i o n a l a n d m o r p h o l o g i c c r i t e r i a .T h e m u s k r a t b e l o n g s t o t h e same f a m i l y a s t h e v o l e ( C r i c e -t i d a e ) a n d h a s a G i a r d i a s p . o f s i m i l a r m o r p h o l o g y ; t h u s , t h em u s k r a t G i a r d i a s p . may a l s o b e l o n g t o t h e s p e c i e s G .m i c r o t i .S i m i l a r l y , a G i a r d i a s p . i s o l a t e d f r o m a p a r a k e e t w asc l a s s i f i e d i n t h e G . l a m b l i a g r o u p o n t h e b a s i s o f t h ec h a r a c t e r i s t i c c l a w h a m m e r - s h a p e d m e d i a n b o d y . I n v e s t i g a -t i o n o f t h e t r o p h o z o i t e s b y s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p yd e m o n s t r a t e d a n i n c o m p l e t e v e n t r o l a t e r a l f l a n g e a n d l a c k o fa m a r g i n a l g r o o v e ; a c c o r d i n g l y , t h e s e i s o l a t e s h a v e b e e na s s i g n e d t o a s e p a r a t e s p e c i e s , G . p s i t t a c i ( 9 1 ) . A G i a r d i a s p .i s o l a t e d f r o m t h e g r e a t b l u e h e r o n i s a l s o m o r p h o l o g i c a l l yd i s t i n c t f r o m o t h e r s p e c i e s a n d h a s b e e n c a l l e d G . a r d e a e( 9 4 ) . T h e m e d i a n b o d y i s s i m i l a r t o t h o s e o f G . m u r i s a n d G .l a m b l i a , b u t t h e v e n t r a l d i s k a n d s i n g l e c a u d a l f l a g e l l u m a r em o r e s i m i l a r t o t h o s e o f G . m u r i s .N o n m o r p h o l o g i c a l D i f f e r e n c e s a m o n g t h e G i a r d i a S p e c i e sN o n m o r p h o l o g i c a l d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e m o r p h o l o g i c a lG i a r d i a