Le Borgne Justine, Tual Ophélie14/01/11Hématologie, Hématopoïèse, Fest ThierryLe poly sera disponible sur le réseau pédagogique, et sur l'ordi de la corpoL’examen se présente sous la forme de 2 questions rédactionnelles et 10 QCM

Hématopoïèse

I - Définitions

L'hématopoïèse représente l'ensemble des mécanismes qui assurent le remplacement continu et régulé des différentes cellules sanguines de l'organisme.Ce système est complexe et hautement spécialisé, il peut être le siège de désordre physiopathologique (exemple : Leucémie).

Les sites de production sont :-La moelle osseuse : il s'agit de la moelle rouge (tissu hématopoïétique) à bien différencier de la

moelle jaune (tissu graisseux). La moelle rouge est présente dans tous les tissus osseux dans l'enfance, puis se limite aux os longs (fémur et tête fémorale) et aux os plats (crête iliaque, sternum) lors du passage à l'âge adulte.

-Chez l'embryon : dès le 15 ème jour, des cellules apparaissent au niveau du sac vitellin, elles migrent au niveau ventral de l'aorte primitive où une partie d'entre elles donnent le tissu vasculaire endothélial, et l'autre partie donne les hémangioblastes qui sont à l'origine du tissu hématopoïétique. Ces cellules vont aller au niveau hépatique, splénique et in fine au niveau médullaire.

-Extra-médullaire : Foie, rate, ganglions et autres organes lymphatiques. C'est en générale dans le cadre d’une pathologie, ou d'une destruction du tissu médullaire entrainant la migration des cellules souches hématopoïétiques ailleurs.

II - les éléments figurés du sang

A - Leur origine : la moelle osseuse

Sur une coupe transversale de la moelle osseuse, on peut voir il s'agit d'un tissu très vascularisé, avec en périphérie la partie minérale de l'os, et entre les deux le tissu hématopoïétique représenté par des cellules de taille différente (stade se différentiation différent).

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Sur le schéma on observe :-cellules souches connectées

avec des cellules stromales.-cellules progénitrices-cellules précurseurs-cellules maturées près des

vaisseaux-grande cellule vide à la

fixation : cellule adypocitaire-cellules stromales, qui sont

très réticulées, rôle de support-macrophages, qui possèdent

déjà une fonction : prise en charge des débris cellulaire.

- le tissu vasculaire avec les cellules endothéliales.

B - Organisation morphologique de la moelle osseuse

La partie vasculaire est importante, lors d'un prélèvement de moelle osseuse il peut y avoir contamination sanguine : cela donne une dilution de la moelle osseuse par le sang.Les échanges se font au niveau de l'os minéral entre le système artériel et veineux. Les veines donnent au niveau de la moelle osseuse des lassis veineux : c'est un réseau capillaire qui grillage la moelle. Près des capillaires on trouve des cellules réticulaires (cellules de soutient) qui entourent les vaisseaux, et des cellules hématopoïétiques à différent stade de maturation.

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C - Les cellules matures : 8 lignées différentes

Elles ont toutes une activité fonctionnelle particulière :-GR : chargés d’hémoglobine, rôle du transport de l'oxygène (principal élément sanguin)-GB : renferme des cellules d'origine myéloïde (PNN, PNE, PNB, monocytes) et lymphoïde

(Lymphocyte T et B). Possèdent un rôle de défense de l'hôte face à une agression extérieure : les éléments myéloïdes sont chargés de la phagocytose, immunité innée et les éléments lymphoïdes de l'immunité adaptative.

-Plaquettes sanguines : rôle dans l'hémostase primaire.

Elles possèdent une capacité de division nulle et une durée de vie variable :-GR : 120jours-PN : 24h (variable)-Monocyte : quelques jours à quelques mois-Lymphocyte : quelques mois à plusieurs années (lymphocyte mémoire)-Plaquettes : 8jours

Malgré cela, leur nombre doit rester constant, d'où une production importante.

Si on considère les GR : il y en a environ 4,5-4million/µL (1012 /L), leur taux de renouvellement est de 1010GR/h soit 2million GR/s. Ce taux peut varier physiologiquement (expl : à la montagne le taux GR augmente)Pour les éléments myéloïdes le taux de renouvellement est de 4.108/hCe renouvellement nécessite une organisation bien réglée. C'est le tissu se renouvelant le plus avec le tissu digestif et le tissu endothéliale.

III - Organisation hématopoïétiques

A - 4 compartiments cellulaires

L'hématopoïèse distingue 4 compartiments :-Les cellules couches : elles sont multipotentes.-Les progéniteurs : elles sont déjà engagées dans une certaine différentiation, elles ne sont pas

différentiables au microscope.-Les précurseurs : sont déjà bien engagées, ces cellules sont reconnaissables en cytologie.-Les cellules matures : cellules retrouvées dans le sang

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B - Cytométrie de flux : un outil indispensable

3 techniques sont utilisées en hématologie :-la culture cellulaire-la microscopie-la cytométrie

La cytométrie permet de caractériser la taille, la structure et l' immunophénotype des cellules en suspension.Principe : on fait passer un flux de cellule en suspension (l'une derrière l'autre dans une gaine de fluide) qui vont être bombardées par un laser. Cela donne une émission résultante du faisceau incident qui est recueillis par un photomultiplicateur qui les transforme en signal électronique.

La diffraction à 180° donne la taille de la cellule, celle à 90° donne la structure interne de la cellule (plus elle est granuleuse, plus la cellule a une diffraction à 90°).

Ce système est sensibilisé par l'utilisation d'un système d'anticorps marqués par des fluorochromes qui sont excités par le laser, donnant une certaine longueur d'onde d'émission. Entre les cellules et les photomultiplicateurs il y a des filtres sélectionnant les longueurs d'onde.

On peut aller jusqu'à 12 paramètres par cellules (8-10 Ac, granularité, taille) permettant d'avoir des informations multiples sur les cellules.

90°

180°

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III - La cellule souche hématopoïétique (CSH)

Il correspond au compartiment le plus immature.La CSH est caractérisée par deux éléments : elle peut s’auto-renouveler (pour maintenir le pool de cellule souche) et peut se différencier pour donner naissance aux cellules matures.La CSH doit avoir un endroit lui permettant de se maintenir, de se protéger contre les agressions de mettre en place tout le système de régulation, l’auto renouvellement…On retrouve ces caractéristiques dans la moelle osseuse, au niveau d’un endroit particulier appelé « niche hématopoïétique » dans laquelle se trouve un microenvironnement spécifique dédié à cette cellule. Cette niche peut être en partie créée par la CSH.

Caractéristique de la CSH :-localisée dans la moelle osseuse, mais passant  régulièrement dans le sang de façon temporaire

(après un stress, un traitement contre le cancer…).-représente un faible pourcentage des cellules présentent dans la moelle osseuse (0.01 à 0.05%).-non indentifiable morphologiquement (de type petit lymphocyte).-cycle cellulaire : en quiescence (G0) ou cycles cellulaires très longs (30-60jours) permettant le

renouvellement du pool cellulaire.-Elles possèdent des marqueurs immunologiques (accessible par cytométrie) :

Positives pour : CD34, la rhodamine efflux (assure une protection en évacuant grâce à des pompes des produits toxiques (drogues chimiothérapique) ou non (la rhodamine) entrés dans la cellule).Négatives pour l’ensemble des marqueurs membranaires caractérisant les cellules matures : CD33 (chez les éléments myéloïdes), CD38 (chez les progéniteurs), HLA DR (ne peut donc pas présenter l’Ag).

-Elles peuvent être congelées et conservées dans l’azote liquide : permet la conservation et l’utilisation ultérieure (greffe de CSH).

Sur le plan fonctionnel la CSH est définie :-in vivo   : par sa capacité à régénérer totalement l’hématopoïèse.

Exp : une greffe chez des souris déficientes permet de recréer l’hématopoïèse avec moins de 5 CSH.-in vitro   : par un système de culture à long terme (3 à 5 semaines), reproduction in vitro de

colonies cellulaires (précurseurs) et obtention de différenciation cellulaire.

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IV - Cascade de différentiation et régulation

A - variation d'expression des protéines membranaires : exemple de la différentiation B

La CSH se différencie en progéniteur lymphoïde commun qui se transforme en précurseur : la cellule B primitive, se différenciant elle même en Pro-B puis en Pré-B et en Lymphocyte B.

La présence de marqueur membranaire évolue avec la différentiation, c’est un paramètre utilisé en cytométrie :

-CD34 est portée par la CSH, plus on s’éloigne de ce compartiment plus l’expression de cette protéine diminue jusqu’à disparaitre.-CD38 apparait chez le progéniteur puis diminue jusqu’à disparaitre, mais peut réapparaitre lors de l’activation des LB.

-CD19 apparaît au stade pro-B et reste présent tout au long de la vie sur le LB.

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B - Modification morphologique, reconnaissance cytologique

1 – Erythropoïèse

La différentiation s’accompagne d’une diminution de taille et d’une variation du niveau de coloration traduisant la modification de la richesse en ARN (diminue) et protéine (augmente).Au départ, la cellule type érytroblastique possède un grand noyau et un cytoplasme très coloré. Le noyau va se rétracter et la coloration cytoplasmique diminuer.Au niveau pré-réticulocytaire il n’y a plus de noyau.

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2 - La granulopoϊèse

A partir du myéloblaste (cellule à gros noyau) va naitre la synthèse des polynucléaires. Le myéloblaste a un noyau rubané polynucléaire et un cytoplasme abondant et pas coloré. Ensuite, les cellules vont subir une différenciation tinctoriale, acquérir des protéines spécifiques et obtenir la capacité de phagocytose.

3 - La mégacaryopoϊèse

Elle va donner naissance aux plaquettes qui sont des cellules dédiées à l’hémostase. Cette lignée commence avec le mégacaryocyte. C’est une cellule avec un noyau caractérisé par une grande quantité d’ADN car elle est en asynchronisme de fonction (beaucoup plus d’ADN que de cytoplasme). Ces cellules peuvent avoir jusqu’à 32n ADN alors qu’une cellule normale contient 2n ADN, c’est une cellule polyploïde. Ces cellules ne font pas de cytokinèse, elles restent fusionnées, en 1 seule cellule.Ensuite, des excroissances membranaires apparaissent, elles prélèveront une partie du cytoplasme pour former les plaquettes sanguines, très riches en calcium, protéines, héparine.

4 - Autres cellules présentes

- Les plasmocytes qui sont produites par les lymphocytes B. Ces plasmocytes reviennent dans la moelle osseuse car naissance dans les organes lymphoïdes secondaires.

- Les macrophages, ostéoblastes.

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C - Une cascade de différenciation

Schéma arborescence de différenciation à partir d’une cellule qui s’auto-renouvelle

- Les progéniteurs

CMP : progéniteur commun myéloideGMP : progeniteur granulocyte monocyteMEP : progéniteur megacaryocyte erythropoiétiqueCLP : progéniteur commun lymphoides

- Les précurseurs

Myeloϊdes : - EO-CFC : précurseur éosinophile (spécifique des allergies) - GM-CFC : précurseur neutrophile, monocyte, macrophage - Mast-CFC :précurseur mastocytaire qui donnera les polynucléaires

Basophiles (responsable des allergies) - MEG-CFC : précurseur du mégacaryocyte - BPU-E : précurseur érythrocytaire

Lymphoïdes : - pre-T-cell - pre-B-cell

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1 - La division asymétrique : auto-renouvellement et différenciation

La cellule souche hématopoïétique(CSH) a une capacité d’auto-renouvellement et de différenciation.

a - La division symétrique

Avec une division symétrique cellulaire standard, on obtient la naissance de deux cellules filles identiques à la cellule mère. L’auto-renouvellement est assuré mais pas la différenciation.

b - La division asymétrique

Cette division va entrainer un déséquilibre dans la cytokinèse, une des deux cellules filles obtiendra plus d’information cellulaire que l’autreelle sera différenciée et l’autre sera identique à la cellule mère.Cette division asymétrique permet : −de maintenir le pool de cellule souche

− la différenciation en cellule mature

L’information sera donnée par l’environnement dans lequel évolue la cellule :- Une cellule fille dans un environnement identique à celui de la cellule mère alimentera le pool

de renouvèlement.- Une cellule fille, dans un autre environnement tridimensionnelle que la cellule mère, sera

favorable à la différenciation.

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- La richesse variable de la division cellulaire résulte du micro-environnement. La CSH subira des divisions asymétriques ou symétriques en fonction des besoins de l’organisme.

Au début, il y a une niche de stockage en quiescence : la CSH est en contact étroit avec les cellules stromales, il y a des divisions symétriques. En dehors de cette niche, il y a des cellules stromales différentes qui entraineront une différenciation vers une lignée particulière. Selon le type de mécanisme, on aura une différenciation spécifique.

c - Les compartiments cellulaires

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α - Les CSH

L’hématopoïèse est un système pyramidal avec une CSH à son sommet. Les CSH sont peu connus, rares avec une morphologie non discernable, mais on sait qu’elles ont un engagement. Cet engagement les regroupera en compartiments où les cellules auront un morphotype et un environnement spécifique. Les CSH ne seront donc pas totalement identiques entre deux compartiments.Au sommet de cette pyramide, l’auto-renouvellement est au maximum, puis il diminuera au profit de la différenciation au niveau du compartiment des progéniteurs pour devenir nul dans le compartiment des précurseurs. L’hématopoïèse est un système adapatatif qui s’orientera suivant les besoins.

Exemple :-Si on a une angine, une infection, l’organisme sera très sollicité pour produire des macrophages, des PNN et moins de GR, lymphocytes... donc orientation de l’hématopoïèse vers la granulopoϊèse.

-Si on a une hémorragie avec une perte de 1l de sang, l’organisme va produire une grande quantité de GR au détriment des autres lignages.

NB : Avant la production importante de cellules hématopoïétiques, les CSH vont d’abord augmenter leur pool de renouvellement puis elles augmenteront leurs différenciations.

β - Les progéniteurs engagés

Ils ne sont pas caractérisés en microscopie et peu en cytométrie de flux, mais ils sont mis en évidence sur une culture cellulaire. Production de colonies cellulaires que l’on pourra orienter : BFU-E, CFU-E, CFU-GM, CFU-GEMM

γ - Les cellules matures

Elles vont acquérir le pouvoir de : - diapédèse - chimiotactismeElles seront donc adressées dans les différents tissus de l’organisme.

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1 - Les facteurs de croissances

L’hématopoïèse est médiée par de nombreux facteurs de croissances (cytokines) :

- EPO = érythropoïétine produite par le rein, elle intervient sur BFU-E, CFU-E et la différenciation terminale des GR.

- GM-CSF qui est produit par les LT, les cellules endothéliales et les fibroblastes. Il va agir sur la différenciation des PNN

- IL3 (interleukine 3) est produite par les LT et elle agit précocement au niveau des progéniteurs et tardivement au niveau lymphocytaire.

- Sten Cell Factor= facteur souche qui stimule l’auto-renouvellement des CSF

Aujourd’hui, ces cytokines sont synthétisées in vitro et recombinées à des protéines recombinantes. Ensuite, elles seront injectées aux gens traités par chimiothérapie (immunodéprimé).

2 - Nécessité d’un contact cellulaire opérationnelle : dialogue bidirectionnel avec le micro-environnement

Exemple de la lymphopoïèse B :Elle se fait à proximité des cellules stromales qui produisent des facteurs soit :

- Positifs = favorisent la lymphopoïèse : IL-7, SDF-1, FLT3-L- Négatifs = bloquent la lymphopoïèse : TNF-α, TGF-β, γ-IFN, ces facteurs sont libérés dans les

situation de stress

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3 - Régulation interne par des facteurs de transcriptions

Les signaux intra-cellulaires sont très importants, l'engagement dans un lignage et la différenciation qui en résulte s'effectuent par une succession d'activation et de mise en silence des gènes suite à des facteurs de transcriptions(FT). Les facteurs de transcriptions (= protéines) vont se lier à l’ADN →ouverture du cadre de lecture → augmentation de la transcription des gènes →production de protéines→ régulation de l’hématopoïèse

Ex du facteur PU-1 :C’est un facteur basique qui apparait au niveau de la cellule hémangioblastique. Ce facteur est indispensable pour l’engagement vers les lignées myéloïde et lymphoïde.En effet, si on inhibe le gène qui produit PU-1 chez la souris, elle ne sera pas viable.

4 - Le FT PAX-5 engage vers le lignage lymphocytaire B

La lymphopoïèse B est le passage d’un progéniteur lymphocytaire commun à un précurseur puis engagement vers le LB par le gène PAX-5 qui donnera un FT. Ce FT aura une activité inhibitrice et excitatrice :

- Ferme la lecture des gènes MPO, MCSF-B qui interviennent dans la différenciation myéloïde- Ouverture du cadre de lecture BLNK, CD19 qui interviennent dans la différenciation des LB

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Pour un progéniteur LB déjà engagé si on a :- PAX-5 négatif on pourra avoir une cellule myéloïde- PAX-5 positif on aura un LB

→une reprogrammation cellulaire est donc possible

Ex : on prend un LB immature avec PAX-5 + puis invalidation de PAX-5→ obtention d’une cellule myéloïde.Une voie est ouverte vers la médecine de la régénération cellulaire.

NB : les FT agissent dans une certaine hiérarchie, organisation temporelle

5 - Les FT C/EBPα et GATA-2 (pas à connaitre)

De la cellule pas encore engagée, plusieurs scénarios sont possibles :- C/EBP α + avec une modulation de l’expression de GATA-2: différenciation en éosinophile,

neutrophile et monocyte- GATA-2 + avec une modulation de l’expression de C/EBP α : différenciation en basophile,

mastocyte

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6 - La biopsie ostéo-médullaire

Évaluer la qualité de l'échantillon : 1. Présence de grains de moelle2. Cellularité : 25-75% de cellules et 75-25% de graisse3. Présence de mégacaryocytes (grande cellule, 16n ou 32n) 4. Stockage du fer : hémosidérine

Évaluer le ratio Myéloïde vs Érythroïde : 2 vs 11. Augmentation : hyperplasie M ou hypoplasie E2. Diminution : inversement

À interpréter à la lumière des résultats (NFS)

V) Niche hématopoïétique

Elle doit comprendre :- La partie minérale de l’os- Le secteur vasculaire- Entre ces deux zones, il y a les CSH, les cellules stromales, les adipocytes- Et entourant ces cellules, il y a une matrice extra-cellulaire : - collagénique-réticulaire

- Facteurs de croissances

Localisation :- Le long de l’os minéral dans l’endosteum qui est en regard de l’alignement des cellules

ostéoblastiques. Niche ostéoblastique = ostoblastes spécifiques+ CSH +cellules stromales- Au niveau des cellules endothéliales : cellules endothéliales+ CSH+ cellules stromales= niche

endothéliale qui est très rapidement mobilisable

La niche hématopoïétique présente :- des éléments paracrines = signaux qui vont agir sur les CSH- des signaux humoraux = érythropoïétine, stéroïdes - des éléments physiques (pression partielle en O2)- des éléments métaboliques (taux de glucose)

L’os est le meilleur endroit pour donner naissance à des niches car c’est grâce à l’os que l’on a :- une quiescence des cellules en cas d’hypoxie- une augmentation des divisions cellulaires par augmentation de la pression partielle en O2

L’os est le meilleur endroit pour protéger la cellule notamment des rayons UV.Les CSH peuvent migrer.

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Ex de la splénomégalie myéloïde :Fibrose stromale au niveau de la moelle osseuse→ arrêt de l’hématopoïèse→ CSH vont migrer dans la rate→ splénomégalie.Ainsi, quand on injecte de la moelle osseuse dans le pli du coude de patient chimiothérapé, les CSH vont migrer au niveau de la moelle osseuse pour la recoloniser. Il faut moins de 10000 CSH pour redonner naissance à l’hématopoïèse chez un chimiothérapé.

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