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A Sorting Platform Determinesthe Order of Protein Secretionin Bacterial Type III Systems

María Lara-Tejero, Junya Kato, Samuel Wagner, Xiaoyun Liu, Jorge E. Galán*

DOI: 10.1126/science.1201476, 1188 (2011);331 Science

Présenté par Audrey Moine

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Introduction

Le système de sécrétion de type 3

Injection des effecteurs en une étapeMachinerie de sécrétion (20aine de protéines,

homologie flagelle)

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Introduction

•Gram –

3 espèces, dont la principale est Salmonella enterica, elle-même

divisée en 6 sous-espèces puis en serovar

Ingestion orale

• Deux types de pathologies «Salmonellose»

- Gastroentérites

- Syndrome typhoïque

Intracellulaire facultatif, ne sort pas de la vacuole

•Salmonella

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Introduction

http://www.epernicus.com/srd

•Le système de sécrétion de type 3 chez S. enterica serovar Thyphimurium

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Introduction

Découverte d’une protéine cytoplasmique SpaO conservée et possédant une forte similarité de séquence avec des composants du flagelle (C-ring)

•Homologie entre le flagelle et le SST3

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Etude de la fonction des composants cytoplasmiques essentiels au SST3 chez S. Typhimurium

Localisation de SpaO?

Caractérisation des intéractions de SpaO avec d’autres protéines

Rôle de SpaO dans la hiérarchie de sécrétion translocases / effecteurs?

Le rôle des chaperonnes?

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I Localisation de SpaO

Fig1.A: fractionnement subcellulaire de SpaO

Environ 20% des protéines se trouve dans la fraction insoluble

• Quelle est la localisation subcellulaire de SpaO?

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I Localisation de SpaO

InvG, PrgH et PrgK sont des protéines du sécréton

• SpaO serait-elle en intéraction avec les protéines du sécréton?

Fig1.B: la fraction insoluble est soumise à un gradient de sucrose, et les différentes fractions sont déposées sur gel SDS-PAGE puis révélées par Immunoblot.

Beaucoup de SpaO se trouve dans la même fraction du gradient que les protéines du sécréton

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I Localisation de SpaOCractérisation du complexe SpaO

Fig I.E: Immunoblot des fractions subcellulaires insolubles sur gel natif

Les protéines du sécréton seraient en interaction avec la protéine SpaO

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I Localisation de SpaO• Cette localisation de SpaO est-elle dépendante du sécréton?

Fig I.C: Les fractions insolubles de deux souches différentes sont soumises à un gradient de sucrose puis les différentes fractions sont déposées sur gel SDS-PAGE

La localisation subcellulaire de SpaO n’est pas dépendante de la présence du sécréton

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I Localisation de SpaOCette localisation de SpaO est-elle dépendante de la

membrane?

Fig I.D: Les fractions insolubles, après différents traitements, sont déposées sur gel SDS-PAGE et SpaO est révélée par immunoblot

SpaO forme donc un complexe à haut poids moléculaire même en absence de tous les composants membranaires du SST3 et de la membrane même

Interaction avec d’autres protéines cytoplasmiques??

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II Caractérisation du complexe SpaO

Quels sont les composants du complexe SpaO?

Fig I.B: Gel natif 2D des fractions du gradient de sucrose et identification des protéines par LC-MS/MS

Il y a de nombreuses protéines du sécréton mais aussi des translocases et des protéines cytoplasmiques.

Etude des protéines cytoplasmiques

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II Caractérisation du complexe SpaO

• Est-ce qu’ OrgA et OrgB font partie du complexe SpaO?

Fig 2.C: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

Les protéines SpaO, OrgA et OrgB forment une partie d’un complexe pouvant inclure les protéines du sécréton

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III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO

SipB fait-elle partie du complexe SpaO?

Fig 3.B: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

SipB est présente dans le complexe SpaO OrgA OrgB.

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SpaO OrgA et OrgB forment un complexe protéique pouvant s’associer à des protéines membranaires du SST3.

Ce complexe peut aussi être composer de nombreuses translocases.

Ce complexe pourrait servir de plateforme de sortie pour une sécrétion ordonnée des protéines

Alors l’absence des translocases devrait engendrer la présence des effecteurs dans le complexe?

III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO

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Les effecteurs sont-ils dans le complexe en absence des translocases?

III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO

Fig 3.C: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

L’absence de la translocase permet aux effecteurs SipA et SptP de se lier au complexe

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Les effecteurs sont-ils dans le complexe en absence de translocases?

III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO

Fig 3.D: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

L’absence des translocases permet à l’effecteur SopE de se lier au complexe.

Ce complexe est donc bien une plateforme de sortie pour une sécrétion ordonnée des protéines substrats

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IV Le rôle des chaperonnesEst-ce que les chaperonnes jouent un rôle dans le

recrutement des protéines pour le complexe SpaO OrgA OrgB?

Fig 4.A: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

Sans la chaperonne InvE les translocases ne peuvent plus se lier à la plateforme

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Fig 4.A.C: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

IV Le rôle des chaperonnesEst-ce que les chaperonnes jouent un rôle dans le

recrutement des protéines pour le complexe SpaO OrgA OrgB?

Les chaperonnes sont requises pour la fixation des protéines sécrétées à la plateforme.

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Conclusion

Formation d’une plateforme SpaO-OrgA-OrgB dans le cytoplasme pouvant être en interaction avec les protéines du sécréton

D’abord liaison des translocases

Ensuite liaison des effecteurs en absence des translocases

Les chaperonnes sont requises pour l’adressage des protéines sécrétées à la plateforme.

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Conclusion

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Discussion

L’intéraction de PrgI avec la plateforme n’a pas été démontrée

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Discussion

Aucune piste sur la manière dont le complexe substrat-chaperonne informerait sur la hiérarchie de sécrétion

question d’affinité??

• Généralisation de la nécessité des chaperonnes pour l’adressage des protéines substrats à la plateforme

Comment se fait la reconnaissance pour les effecteurs sans chaperonne?

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Perspectives

De nombreux points du modèle sont encore à éclaircir

Contribution de la plateforme à l’assemblage du sécréton?

Applicable à la plupart des SST3

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Merci de votre attention

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II Carctérisation du complexe SpaO

Quelle est la localisation subcellulaire d’OrgA et OrgB?

OrgA et OrgB se trouvent également dans les même fractions de gradient de gradient de sucrose que SpaO

Fig 2.D: Immunoblot contre OrgA et OrgB sur gel SDS-PAGE des différentes fractions des gradients de sucrose.

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SpaO, OrgA et OrgB sont-elles interdépendantes?

Fig S.3: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

Les protéines SpaO, OrgA et OrgB formeraient une partie d’un complexe pouvant inclure les protéines du sécréton

II Carctérisation du complexe SpaO

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Les effecteurs sont-ils dans le complexe en absence de translocases?

III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO

Fig 3.E: Gel SDS-PAGE des fractionnements subcellulaires

En absence des translocases les effecteurs SptP et SipA sont beaucoup plus présents dans la fraction insoluble

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III Etude des translocases et effecteurs dans le complexe SpaO

Fig 3.F: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

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Est-ce que les chaperonnes jouent un rôle dans le recrutement des protéines pour le complexe SpaO OrgA OrgB?

Fig 4.A: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

SicP est un cas particulier car elle reste fixée à la plateforme même après la fixation de l’effecteur.

IV Le rôle des chaperonnes

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La reconnaissance du complexe se fait-elle par la chaperonne ou l’effecteur?

IV Le rôle des chaperonnes

Fig 4.C: Analyse sur gel BN-PAGE de la fraction insoluble après application d’un gradient de sucrose chez différentes souches.

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Action de InvJ

Model of needle length control. Assembly of the inner rod but not the needle requires InvJ. Completion of the inner rod leads to conformational changes on the cytoplasmic side of the injectisome, which results in substrate switching and the interruption of secretion of the inner rod and needle proteins, hence determining the length of the needle substructure. In the absence of InvJ, the socket of the base is not formed and the inner rod fails to assemble. Consequently, the secretion machinery remains locked in a secretion mode competent for the secretion of the needle protein, resulting in non-functional injectisomes with abnormally long needles. Filled circles, needle protein PrgI; open circles, inner rod protein PrgJ.

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