A ma mère - Les thèses en ligne de l'Université de Poitiers

THÈSE

Pour l'obtention du grade deDOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS

UFR des sciences fondamentales et appliquéesLaboratoire Signalisation et transports ioniques membranaires - STIM (Poitiers)

(Diplôme National - Arrêté du 25 mai 2016)

École doctorale : Biologie-santé - Bio-santé (Limoges)Secteur de recherche : Biomolécules, pharmacologie, thérapeutique

Présentée par :Élodie Péraudeau

Évaluation et optimisation de l'efficacité de conjuguésanticancéreux ciblant les récepteurs de l'acide folique

Directeur(s) de Thèse :Laurent Cronier, Jonathan Clarhaut

Soutenue le 07 décembre 2016 devant le jury

Jury :

Président Sebastien Papot Professeur, Université de Poitiers

Rapporteur Frederic Blanchard Directeur de recherche, INSERM, Université de Nantes

Rapporteur Fabrice Soncin Directeur de recherche, INSERM, Université de Lille

Membre Laurent Cronier Maître de conférences, Université de Poitiers

Membre Jonathan Clarhaut Ingénieur de recherche, CHU, Université de Poitiers

Membre Francois Guilhot-Gaudeffroy Professeur et praticien hospitalier, Université de Poitiers

Membre Frédéric Schmidt Directeur de recherche CNRS, Institut Curie, Paris

Membre Nicolas Guilbaud Directeur de recherche, P. Fabre pharmaceutics, Toulouse

Pour citer cette thèse :Élodie Péraudeau. Évaluation et optimisation de l'efficacité de conjugués anticancéreux ciblant les récepteurs del'acide folique [En ligne]. Thèse Biomolécules, pharmacologie, thérapeutique. Poitiers : Université de Poitiers, 2016.Disponible sur Internet <http://theses.univ-poitiers.fr>

THESE DE DOCTORAT Pour l’obtention du grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées

Diplôme national – Arrêté du 25 Avril 2012

Ecole doctorale Biosanté n°524 Discipline Biologie, Médecine, santé

Secteur Biomolécules, pharmacologie, thérapeutique

Présentée par

Elodie PERAUDEAU

Evaluation et optimisation de l’efficacité de conjugués anticancéreux ciblant les récepteurs de l’acide folique

Sous la direction des Dr Laurent Cronier et Jonathan Clarhaut et du Pr François Guilhot

Soutenue publiquement le 07 Décembre 2016 devant la commission d’examen

JURY

Dr Frédéric BLANCHARD Directeur de Recherche INSERM, Université de Nantes

Rapporteur

Dr Fabrice SONCIN Directeur de Recherche INSERM, Université de Lille

Rapporteur

Dr Nicolas GUILBAUD Directeur de l’innovation externe en oncologie, Pierre Fabre Pharmaceutics, Toulouse

Examinateur

Dr Frédéric SCHMIDT Directeur de Recherche CNRS Institut Curie, Paris

Examinateur

Pr Sébastien PAPOT Professeur Universitaire Université de Poitiers

Examinateur

Pr François GUILHOT Professeur Universitaire-Praticien Hospitalier CHU et Université de Poitiers

Examinateur

Dr Laurent CRONIER Maitre de Conférences Universitaire Université de Poitiers

Examinateur

Dr Jonathan CLARHAUT Ingénieur de Recherche CHU et Université de Poitiers

Examinateur

A ma mère

REMERCIEMENTS

C’est en toute logique que mes premiers remerciements s’adressent à mes

directeurs de thèse et tout particulièrement au Dr Jonathan Clarhaut, pour la confiance

qu’il m’a accordée en me recrutant d’abord en master puis en re-signant pour trois

années supplémentaires ! Et dire que tout est parti d’un coup du sort… Bien sûr, je te

remercie pour la formation scientifique et technique que tu m’as apportée. Mais aussi

pour des qualités plus subtiles à insuffler à un étudiant comme l’autonomie et la

confiance en ses capacités. Merci d’avoir imaginé tous les projets qui nous attendent,

qui nous poussent vers de nouvelles techniques et qui font que j’ai hâte de retourner à

la paillasse (et en réunion dès le lendemain de la soutenance…)!

Je tiens à exprimer toute ma gratitude au Dr Laurent Cronier qui n’a pas hésité à

prendre la direction de cette thèse et qui a souvent représenté la voix de la raison dans

nos discussions et réunions. Merci pour votre présence et votre implication ainsi que

pour la patience dont vous avez fait preuve concernant l’apprentissage de la

manipulation sur animaux qui fut long et pas évident…

Ma reconnaissance s’adresse aussi au Pr François Guilhot qui, malgré son emploi

du temps chargé, a apporté son regard de clinicien expérimenté sur mes résultats au

cours de nos réunions.

Je souhaiterais remercier les membres extérieurs de mon jury de thèse, le Dr

Frédéric Blanchard, le Dr Fabrice Soncin, le Dr Nicolas Guilbaud et le Dr Frédéric

Schmidt, qui ont accepté d’accorder de leur temps pour faire le déplacement et

évaluer mon travail de thèse.

Toute ma gratitude s’adresse à l’ensemble du personnel du laboratoire de

Signalisation et Transports Ioniques Membranaires, en particulier aux membres de

l’équipe Implications Physiologiques et Physiopathologiques des Connexines qui m’ont

accueillie et avec qui j’ai pu collaborer. Je n’oublie pas non plus les donateurs et les

associations qui ont soutenu et permis la réalisation de cette thèse : Sport et Collection,

La Ligure Contre le Cancer, le Centre Hospitalier Universitaire de Poitiers et France

ADOT86. Merci aux « jeunes » de l’étage, Camille « Camoïkis », Jonathan « N°Bis », et

Amandine pour les fous-rires, les nombreux débriefings de films et plus généralement

pour votre soutien et votre bonne humeur de (presque) tous les jours.

Merci également aux chimistes de L’institut de Chimie des Milieux et des

Matériaux de Poitiers avec qui j’ai eu la chance de collaborer toute ces années et en

particulier au Pr Sébastien Papot, même si je le l’entends déjà me chambrer en relisant

ce passage avec une voix beaucoup trop aiguë pour lui… Merci pour ta présence, ton

optimisme et ta créativité. J’ai tout de même le regret d’émettre quelques réserves sur

tes talents de graphiste…

Enfin, et de manière plus personnelle ma profonde gratitude s’adresse à mes

parents, qui m’ont toujours soutenue et cru en moi et qui ont sacrifié beaucoup pour

m’emmener jusque-là. Merci à toi, Quentin, pour ta patience, ton soutien et ta

compréhension indéfectibles. Merci à tous mes amis et notamment à Elodie avec qui

j’ai vécu cette aventure en parallèle, mais aussi à Jacques, Valentine et Clément avec

qui j’ai fait mes premiers pas à Poitiers il y a presque 10 ans maintenant !

AVANT-PROPOS

L’ère de la chimiothérapie pour le traitement du cancer a débuté dans les années 1940. En

dépit des nombreux progrès réalisé depuis, l’efficacité de cette stratégie de soin est toujours

limitée par les nombreux et sévères effets secondaires qu’elle entraine. Mon travail de thèse entre

dans le cadre du développement de nouveaux médicaments conçus pour cibler et détruire

sélectivement les tumeurs. L’introduction présentée dans ce document abordera succinctement

les différentes stratégies de ciblage thérapeutique des cancers avant de se focaliser sur les

récepteurs à l’acide folique dont le ciblage a constitué la majeure partie de mon travail. J’ai

abordé cette thématique selon deux approches :

une approche chimique au cours de laquelle de nouvelles molécules plus

performantes ciblant les récepteurs à l’acide folique ont été développées et testées

en collaboration avec les chimistes du groupe ;

une approche biologique qui a consisté à modifier les cellules tumorales pour

augmenter la quantité de récepteurs à l’acide folique afin de faciliter leur

reconnaissance et leur élimination par nos agents anticancéreux.

Ces travaux ont donné lieu à la publication de trois articles alors qu’un quatrième est en

cours de rédaction. De plus, au cours de ces trois années, j’ai eu l’opportunité de participer à des

études exploitant d’autres stratégies de ciblage thérapeutique donnant lieu à trois autres

publications et qui seront présentées de manière concise à la fin de ce document.

SOMMAIRE

SOMMAIRE

1ere Partie : Etat de l'art .................................................... 1

1er Chapitre – Généralités sur le cancer ...................................................... 1

I. Le cancer en quelques chiffres ............................................................................................... 1

II. Cancer : définition .................................................................................................................. 2

2e Chapitre – De la chimiothérapie à la nanomédecine ............................. 5

I. Des chimiothérapies classiques au ciblage des tumeurs ......................................................... 6

A. Les chimiothérapies classiques .......................................................................................... 6

B. Notion de ciblage tumoral .................................................................................................. 7

II. Les thérapies ciblées ............................................................................................................... 8

III.Les chimiothérapies vectorisées ........................................................................................... 10

A. Définition ......................................................................................................................... 10

B. Comment cibler les tumeurs? ........................................................................................... 10

1. Ciblage passif des tumeurs solides, exemple de l’« effet EPR » ....................... 11

2. Ciblage actif des tumeurs .................................................................................. 12

C. Différents types de vecteurs ............................................................................................. 13

1. Les nanotransporteurs ....................................................................................... 13

2. Les conjugués d’agents anticancéreux .............................................................. 14

3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs ....................................... 16

I. Les folates ............................................................................................................................. 16

II. Le transport des folates ......................................................................................................... 17

A. Le transporteur de folates réduits (RFC) .......................................................................... 17

1. Structure du gène et de la protéine RFC ........................................................... 17

2. Transport des folates par le RFC ....................................................................... 18

3. Expression et physiopathologies liées aux RFC ............................................... 18

B. Le transporteur de folates couplés aux protons (PCFT) ................................................... 19

1. Structure du gène et de la protéine PCFT ......................................................... 19

2. Transport des folates par le PCFT .................................................................... 20

3. Expression et physiopathologie liée au PCFT ................................................... 20

C. Les récepteurs à l’acide folique (FR) ............................................................................... 21

1. Généralités sur les FR ....................................................................................... 21

2. Différentes isoformes de FR ............................................................................. 22

3. Transport des folates et recyclage de FRα et FRβ ............................................. 25

4. Physiopathologies liées au récepteur FRα ......................................................... 25

5. Physiopathologies liées au récepteur FRβ ......................................................... 28

4e Chapitre – Vectorisation et ciblage par l’acide folique ....................... 31

I. Les vecteurs de l’acide folique pour l’imagerie médicale .................................................... 31

A. Généralités ........................................................................................................................ 31

B. Exemple de l’Etarfolatide ................................................................................................. 32

II. Des vecteurs de l’acide folique à visée thérapeutique .......................................................... 33

A. Généralités ........................................................................................................................ 33

B. Exemple du Vintafolide ................................................................................................... 34

2e Partie : Objectifs de la thèse ....................................... 36

5e Chapitre – Contexte scientifique & travaux antérieurs ...................... 36

I. Synthèse et validation d’un vecteur dérivé de la doxorubicine ............................................ 37

II. Synthèse du vecteur dérivé de la MMAE ............................................................................. 38

III.Transfert du concept sur cellules de patients ........................................................................ 40

→ Clarhaut J. et al., 2013, Leukemia Research........................................43

6e Chapitre – Objectifs de la thèse ............................................................. 42

3e Partie : Matériels & Méthodes ................................... 44

I. Culture cellulaire .................................................................................................................. 44

A. Modèles cellulaires ........................................................................................................... 44

B. Décongélation, entretien, congélation .............................................................................. 44

1. Décongélation des cellules ................................................................................ 44

2. Entretien des cellules ......................................................................................... 44

3. Congélation des cellules .................................................................................... 45

II. Etude de cytotoxicité ............................................................................................................ 46

A. Mesure de la viabilité cellulaire ....................................................................................... 46

1. Principe .............................................................................................................. 46

2. Protocole ............................................................................................................ 46

B. Mesure de la prolifération cellulaire ................................................................................ 47

1. Principe .............................................................................................................. 47

2. Protocole ............................................................................................................ 47

C. Mesure de l’apoptose ....................................................................................................... 48

1. Principe .............................................................................................................. 48

2. Protocole ............................................................................................................ 48

D. Test de morphogenèse sur Matrigel® .............................................................................. 49

III.Mesure de l’expression d’un gène par réaction en chaine par polymérase .......................... 50

A. Extraction des ARN totaux .............................................................................................. 50

1. A l’aide du kit Promega .................................................................................... 50

2. A l’aide du kit Macherey-Nagel ........................................................................ 51

3. Extraction d’ARN sur de petites quantités de cellules ...................................... 51

B. Qualité et dosage des ARN totaux ................................................................................... 52

C. Transcription inverse des ARN ........................................................................................ 52

1. A l’aide du kit Invitrogen .................................................................................. 52

2. A l’aide du kit Quanta ....................................................................................... 52

D. PCR quantitative en temps réel ........................................................................................ 53

1. Principe .............................................................................................................. 53

2. Protocole ............................................................................................................ 53

3. Analyse des résultats ......................................................................................... 54

IV.Etude de l’expression et de la localisation d’une protéine ................................................... 54

A. Etude de l’expression par Western blot ............................................................................ 54

B. Etude de la localisation par immunofluorescence ............................................................ 55

V. Etude de la résistance à l’anoïkis .......................................................................................... 56

A. Croissance sans ancrage et mesure de l’apoptose ............................................................ 56

B. Croissance en soft-agar .................................................................................................... 57

VI.Quantification de la MMAE par HPLC/HRMS ................................................................... 58

VII. Etudes in vivo ................................................................................................................... 58

A. Etude de l’efficacité antitumorale du vecteur MGAF ...................................................... 58

B. Analyse histopathologique des organes ........................................................................... 59

4e Partie : Résultats ......................................................... 60

7e Chapitre – Optimisation chimique ........................................................ 60

I. Synthèse et évaluation du vecteur diDGAF .......................................................................... 60

A. Introduction et principe de l’étude ................................................................................... 60

B. Résultats biologiques principaux ..................................................................................... 61

→ Grinda M. et al., 2013, Organic & Biomolecular Chemistry................64

II. Synthèse et évaluation du vecteur diMGAF ......................................................................... 63

A. Introduction et principe de l’étude ................................................................................... 63

B. Résultats biologiques principaux ..................................................................................... 64

→ Alsarraf J. et al., 2015, Chemical Communication...............................64

8e Chapitre – Optimisation biologique ...................................................... 65

I. Comment modifier l’expression du gène FOLR1 ? .............................................................. 65

II. Evaluation in vitro du mélange DV ...................................................................................... 67

A. Caractérisation des lignées KB et A549 ........................................................................... 67

B. Effet du mélange DV sur les cellules KB et A549 ........................................................... 68

1. Toxicité du mélange adjuvant ........................................................................... 68

2. Effet sur l’expression des récepteurs FR ........................................................... 68

C. Effet du mélange DV sur d’autres lignées tumorales ....................................................... 69

1. Caractérisation des lignées cellulaires ............................................................... 69

2. Toxicité et stimulation de FOLR1 induite par le mélange DV ......................... 70

D. Spécificité de la stimulation de FOLR1 ........................................................................... 71

E. Réversibilité de l’effet du traitement adjuvant ................................................................. 71

F. Effet du traitement adjuvant sur les cellules saines .......................................................... 72

III.Modulation in vivo de l’activité d’un vecteur anticancéreux ................................................ 73

A. Le mélange DV augmente-t-il in vivo l’expression tumorale des FR ? ........................... 73

1. Expression de FOLR1 et FOLR2 dans les tumeurs ........................................... 73

2. Expression de FOLR1 et FOLR2 dans les cellules saines ................................ 74

B. Modulation de l’activité antitumorale d’un vecteur ......................................................... 75

1. Effet sur la croissance tumorale ........................................................................ 75

2. Mesure de la quantité d’agent anticancéreux libéré .................................... 76

C. Toxicité du cotraitement – effets indésirables ............................................................. 77

1. Comportement et poids des souris ................................................................. 77

2. Etude histopathologique des organes sains ................................................... 77

IV. Mécanismes impliqués dans la modulation de l’activité du vecteur MGAF ................ 79

A. Internalisation du vecteur MGAF ................................................................................ 79

B. Effet du cotraitement sur la viabilité des cellules KB ................................................. 79

C. Toxicité du cotraitement sur les cellules cultivées en condition sans ancrage .......... 80

1. Effet sur la croissance des cellules dans une matrice semi-solide ............... 80

2. Effet sur l’apoptose dans les cellules KB cultivées en suspension............... 81

3. Effet sur les cellules HeLa, A2780 et A549 .................................................... 82

5e Partie : Discussion & Perspectives ............................. 84

I. Optimisation chimique des vecteurs dérivés de l’acide folique ...................................... 84

II. Optimisation biologique du ciblage des récepteurs à l’acide folique ............................. 86

A. Stimulation du gène FOLR1 .......................................................................................... 86

B. effets du mélange DV in vivo ......................................................................................... 89

C. Stimulation de l’activité d’un vecteur anticancéreux.................................................. 92

6e Partie : Conclusion ...................................................... 95

7e Partie : Travaux collaboratifs .................................... 98

9e Chapitre – Développement d’un vecteur ciblant le microenvironnement tumoral .............................................................................. 98

→ Renoux B.. et al., 2016, Angewandte Chemie

(soumis)......................102

10e Chapitre – Autres stratégies de ciblage thérapeutique ................... 103

→ Rubio S. et al., 2016, Peptide Science.................................................104

→ Barat R. et al., 2013, Chemical Science..............................................104

8e Partie : Bibliographie ............................................... 105

INDEX DES FIGURES &

TABLEAUX

INDEX DES FIGURES

Figure Sujet Page

1 Incidence et mortalité associées au cancer 2

2 Incidence et mortalité par cancer 2-3

3 Représentation de la carcinogenèse 2-3

4 Critères d’agressivité des cellules tumorales 3

5 Principe des chimiothérapies conventionnelles et des « Magic bullets » 7

6 Mécanismes des thérapies ciblées, des chimiothérapies classique et vectorisée 8

7 Structure de vaisseaux sanguins normaux et tumoraux 11

8 Principe des ciblages passif et acif 12

9 Représentation des différentes stratégies de vectorisation 13

10 Transport des folates 17

11 Conjugué d’acide folique et de fluorescéine isothiocyanate 31

12 Structure et activité de l’Etarfolatide (99mTc-EC20) 32

13 Structure et mécanisme d’action du Vintafolide (EC145) 34

14 Représentation et mode d’action des vecteurs dérivés de l’acide folique 37

15 Structure et hydrolyse du vecteur DGAF 37-38

16 Internalisation du vecteur DGAF dans les cellules HeLa et A549 37-38

17 Cytotoxicité du vecteur DGAF sur les cellules HeLa et A549 37-38

18 Structure du vecteur MGAF 38-39

19 Toxicité du vecteur MGAF en chambre de Boyden 38-39

20 Efficacité antitumorale du vecteur MGAF in vivo 39

21 Expression de FOLR2 et toxicité du DGAF sur des cellules leucémiques 40

22 Expression de FOLR2 et internalisation du DGAF dans des cellules de patient 41

23 Représentation des deux approches abordées au cours de ma thèse 42

24 Exemple de courbe obtenue en RT-qPCR 54

25 Structure et hydrolyse du vecteur diDGAF 61

26 Etude en microscopie confocale de l’internalisation du vecteur diDGAF 62

27 Toxicité du vecteur diDGAF sur les cellules A2780 et A549 62-63

28 Etude par cytométrie en flus de l’internalisation du diDGAF 62-63

29 Structure du vecteur diMGAF 63

30 Caractérisation de l’expression des FR dans les cellules KB et A549 67

31 Toxicité du mélange DV sur les cellules KB et A549 68

32 Effet du mélange DV sur l’expression des FR dans les cellules KB et A549 69

33 Expression de FOLR1 et FOLR2 des cellules KB, HeLa, A2780 et A549 70

34 Effet du mélange DV sur l’expression des FR dans les cellules HeLa et A2780 71

35 Effet du mélange DV sur l’expression des gènes RFC et PCFT 71-72

36 Réversibilité de l’effet du DV sur l’expression de FOLR1 71-72

37 Effet du mélange DV sur les cellules saines HUVEC 72

38 Effet in vivo du mélange DV sur l’expression des FR tumoraux 73

39 Effet in vivo du mélange DV sur FOLR1 dans les cellules saines 74

40 Effet du mélange DV sur l’activité du vecteur MGAF in vivo 75

41 Effet du mélange DV sur le poids des souris et étude histopathologique 77

42 Quantité de MMAE dans les cellules KB et A549 et cytotoxité 79

43 Croissance des cellules KB en matrice semi-solide d’agarose 80

44 Croissance des cellules KB sur poly-HEMA 81

45 Croissance des cellules HeLa, A2780 et A549 en matrice semi-solide 82

46 Modes d’action hypothétique du mélange DV sur la régulation des FR 86

47 Alternative au VPA et vecteur hétérodimérique dexaméthasone/MS-275 91

48 Mécanismes de déclenchement de l’anoïkis 92

49 Structure du vecteur MMAE-Alb 99

50 Efficacité du vecteur MMAE-Alb in vivo sur des xénogreffes tumorales KB 100

51 Efficacité du vecteur MMAE-Alb in vivo sur des tumeurs orthotopiques du

sein et du pancréas

101

52 Efficacité du vecteur MMAE-Alb in vivo sur la régression des tumeurs

orthotopiques du pancréas de volume important

102

INDEX DES TABLEAUX

Tableau Sujet Page

1 Distribution tissulaire des récepteurs à l’acide folique 22

2 Niveau d’expression des récepteurs à l’acide folique dans les cancers 27

3 Toxicité du MGAF en fonction du niveau de FOLR1 38-39

4 Caractéristiques des lignées cellulaires utilisées 45

5 Marquage des cellules par le Apoptotic/Necrotic/Healthy Cell Detection Kit 48

6 Séquences des couples d’amorces utilisés en RT-qPCR 53

7 Anticorps primaires et secondaires utilisés en Western blot 55

8 Anticorps primaires et secondaires utilisés en Immunofluorescence 56

9 Toxicité du vecteur diMGAF sur les cellules HeLa, SKOV-3 et A2780 64

10 Quantification de la MMAE présente dans les cellules A2780 64

11 Facteurs de transcription potentiellement impliqués dans la régulation de FOLR1 87

12 Toxicité du MMAE-Alb sur les cellules KB, MDA-MB-231 et MIA-PaCA2 99

ABREVIATIONS

ABREVIATIONS

5’UTR : 5’ Untranslated Region, région non transcrite en 5’ A ABC : ATP-Binding Cassette ADN : acide désoxyribonucléique ARN : acide riboNucléique ATP : adénosine triphosphate B Bim : Bcl-2 interacting mediator of cell death BrdU : 5-bromo-2’-déoxyuridine BSA : Bovin Serum Albumin C CIPA : Centre d’Imagerie du Petit Animal Ct : Cycle treshold, cycle seuil D Dexa : dexamethasone DGAF : Doxorubicine-Galactoside-Acide Folique diDGAF : diDoxorubicine-Galactoside-Acide Folique diMGAF : diMMAE-Galactoside-Acide Folique dNTP : désoxyribonucléotides DO : densité optique DV : mélange adjuvant composé de dexaméthasone et de VPA E EBM-2 : Endothelial cell Basal Medium-2 EGM-2 : Endothelial cell Growth Medium-2 EMEM : Eagle’s Minimum Essential Medium EPR : Enhanced Permeability and Retention ER : Estrogen Receptor EthD-III : Ethidium Homodinère III F FAK : Focal Adhesion Kinase FDA : Food and Drug Administration FITC : Isothiocyanate de fluorescéine

FR : Folate Receptor, récepteur à l’acide folique G GPI : Glycosyl PhosphatidylInositol GRE : Glucocorticoid receptor Response Element H HDAC : Histone Déacétylase HER2 : Human Epidermal Growth Factor-2 HPLC : chromatographie en phase liquide à haute performance HRMS : spectrométrie de masse à haute résolution HRP : Péroxydase de Raifort HUVEC : Human Umbilical Vein Endothelial Cells I IRM : Imagerie à Résonance Magnétique K kDa : kilo Dalton L LAM : Leucémie Aigue Myéloblastique LMC : Leucémie Myéloïde Chronique -luc : luciférase M MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinases MDR : Multi-Drug Resistance Proteins MGAF : MMAE-Galactoside-Acide Folique MHAF : Malabsorption Héréditaire de l’acide folique MMAE : MonoMéthyl Auristatine E N NEAA : Non-Essential Amino Acids NRF-1 : Nuclear Respiratory Factor 1

P PBS : Phosphate Buffered Saline PCFT : Proton Coupled Folate Transporter, transporteur de folates couplé aux protons PCR : Polymerase Chain Reaction, réaction en chaine par polymérisation PEG : Poly-Ethylène Glycol PI3K : PhosphoInositol-3-Kinase

Poly-HEMA : poly(2-hydroxyethyl methacrylate) PS : Pénicilline/Streptomycine R RFC : Reduced Folate Carrier, transporteur de folates réduits rpm : rotations par minute RPMI : Roswell Park Memorial Institute RT-qPCR : PCR quantitative en temps réel S SAHA : acide subéroylanilide hydroxamique siRNA : short interfering RNA SVF : Sérum de Veau Fœtal

T TEMP : Tomographie par Emission MonoPhotonique TEP : Tomographie par Emission de Positons THF : Tetrahydrofolate TSA : Trichostatine A V VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor VEGFR : Vascular Endothelium Growth Factor Receptor VPA : acide valproïque

1ERE PARTIE

ETAT DE L’ART

1ere Partie – Etat de l’art 1er Chapitre – Généralités sur le cancer

1

1ER CHAPITRE

Généralités sur le cancer

I. LE CANCER EN QUELQUES CHIFFRES

Selon le rapport « Les Cancers en France » publié en 2014 par l’Institut National du

Cancer, le nombre de nouveaux cas de cancers (toutes origines confondues) diagnostiqués en

France a augmenté d’environ 109 % chez l’homme comme chez la femme entre 1980 et 2012

(Figure 1). Ainsi, un homme sur deux et une femme sur trois de moins de 85 ans se voient

diagnostiquer un cancer. Ces chiffres sont liés à l’accroissement et au vieillissement de la

population française mais également à l’amélioration des techniques de dépistage de cette

maladie. Le cancer le plus fréquent chez l’homme est de loin le cancer de la prostate (56 800 cas

par an), suivi du cancer du poumon (28 200 cas par an) et du cancer colorectal (23 200 cas par

an ; Binder-Foucard et al., 2014). Avec 48 800 nouveaux cas diagnostiqués en 2012, le cancer du

sein est le plus fréquent chez la femme, suivis par les cancers colorectaux (18 900 cas) et

pulmonaires (11 300 cas ; Figure 2A). Selon cette étude, sur la période comprise entre 1980 et

2012, certains cancers moins fréquents ont vu leur incidence augmenter fortement. C’est le cas

des mélanomes de la peau (+ 590,7 %), des cancers de la thyroïde (+ 577,6 %), du foie (+ 350,9

%), du pancréas (+ 247,7 %) et du rein (+ 206,9 %).

Sur la même période, l’amélioration des traitements mais également les diagnostics à des

stades précoces de la maladie se sont traduits par une diminution du risque de décès à cause du

cancer. Malgré cela, l’accroissement et le vieillissement de la population aboutissent tout de

même à une augmentation de plus de 10 % chez l’homme et d’environ 17 % chez la femme du

nombre de décès liés à cette maladie (Figure 1). Chez l’homme, le cancer du poumon reste le

plus meurtrier avec plus de 21 000 décès estimés, loin devant les cancers colorectaux (9 300

décès) et prostatiques (8 900 décès). Chez la femme, les trois cancers entrainant le plus de

Figure 1. Incidence (A) et mortalité (B) des cancers de toutes origines confondues en France

métropolitaine sur la période 1980 - 2012. D’après Binder-Foucard F., 2014 et Les Cancers en

France, Les Données, INCa, 2014.


2

mortalité sont les cancers du sein (11 900 décès), du poumon (8 600 décès) et les cancers

colorectaux (8 400 décès ; Figure 2B).

Globalement, l’analyse de l’évolution de l’incidence et de la mortalité liée au cancer sur

la période 1980 – 2012 montre que pour de nombreux cancers (estomac, col de l’utérus, sein,

prostate…) l’incidence et/ou la mortalité ont diminué. En revanche, d’autres cancers présentent

des évolutions plus préoccupantes avec une augmentation à la fois de l’incidence et de la

mortalité. C’est notamment le cas du cancer du poumon chez la femme, du mélanome cutané et

du cancer du système nerveux central (Binder-Foucard et al., 2014).

II. CANCER : DEFINITION

Le terme « cancer » regroupe un ensemble de maladies caractérisées par la prolifération

et la propagation incontrôlées de cellules anormales. On distingue deux grandes catégories de

cancers : les cancers dits « solides » qui regroupent les carcinomes d’origine épithéliale et les

sarcomes qui apparaissent dans le tissu conjonctif, ainsi que les cancers hématopoïétiques qui

affectent des cellules sanguines situées dans la moelle osseuse dans le cadre des leucémies, ou

bien dans les organes lymphoïdes (ex : les ganglions lymphatiques) pour les lymphomes.

La carcinogenèse est un processus multifactoriel et complexe qui se développe autour de

trois étapes principales : l’initiation, la promotion et la progression. De manière simplifiée, au

cours de l’initiation, une cellule normale acquiert des anomalies génétiques irréversibles

conduisant à sa transformation (Figure 3A). Ces mutations peuvent se produire de manière

spontanée, par exemple suite à une erreur lors de la réplication de la cellule, mais dans la plupart

des cas, il s’agit d’une conséquence d’une exposition à des agents carcinogènes (polluants,

produits chimiques, rayons ultraviolets, virus, etc.) et/ou à l’influence de facteurs intrinsèques

(dérèglement hormonal ou immunitaire, mutation héréditaire, etc.). Lorsque ces altérations se

produisent au niveau de proto-oncogènes ou de gènes suppresseurs de tumeurs, cela peut

conduire à la dérégulation de processus essentiels à l’homéostasie cellulaire tels que la

croissance, la prolifération et la survie cellulaires. Ces mutations peuvent également altérer la

fonction de gènes impliqués dans la surveillance et la réparation du génome. On parle alors de

cellule initiée (pour revue : Oliveira et al., 2007).

Figure 2. Incidence (A) et mortalité (B) estimées par cancer chez les hommes et chez les

femmes en France métropolitaine en 2012. Les données concernant la mortalité pour le cancer du

foie et du pancréas ne sont pas disponibles compte tenu de leur faible qualité. D’après Binder-

Foucard F., 2014.

Figure 3. Représentation de la carcinogenèse. (A) Suite à une mutation spontanée ou à

l’exposition à des facteurs carcinogènes, une cellule normale acquière des altérations génétiques

irréversibles. C’est l’étape d’initiation. (B) Pendant l’étape de promotion, et en présence de

facteurs promoteurs, la cellule initiée prolifère pour former une lésion précancéreuse. (C) La

phase de progression correspond à la transformation de la lésion pré-maligne en cancer invasif.

Les cellules tumorales sont soumises à une forte instabilité génétique et acquièrent des

caractéristiques d’agressivité comme la capacité à envahir les tissus adjacents. (D) La mise en

place d’une angiogenèse soutient la croissance tumorale et favorise la dissémination des cellules

cancéreuses et la formation de métastases.

Figure 4. Au cours des différentes étapes de la carcinogenèse, une cellule cancéreuse acquiert

différents critères d’agressivité. Elle développe une auto-suffisance en facteurs de croissance,

une insensibilité aux facteurs anti-prolifératifs et apoptotiques et échappe à la sénescence

cellulaire ce qui lui confère un potentiel réplicatif illimité. Elle peut induire une angiogenèse

tumorale et développer des capacités d’invasion et un potentiel métastatique.


3

La promotion (Figure 3B) correspond à l’amplification clonale, autrement dit à la

prolifération, de la cellule initiée en réponse à des facteurs dits promoteurs tels que peuvent l’être

certaines hormones (Mehta, 1995). Contrairement à l’étape d’initiation, la promotion peut être

réversible. Après disparition de l’agent promoteur, il peut y avoir régression tumorale,

probablement par un processus d’apoptose (Oliveira et al., 2007).

Au cours de ces deux étapes, les cellules transformées subissent des mutations

additionnelles ainsi que des réarrangements génétiques qui leur permettent d’acquérir différentes

caractéristiques (Figure 4). Elles deviennent notamment indépendantes vis-à-vis des signaux

extérieurs de croissance : les cellules mutées sécrètent leurs propres facteurs de croissance et

stimulent leur prolifération de manière autocrine (Pedraza-Fariña, 2006). Elles développent

également une résistance aux facteurs inhibant la prolifération et déclenchant l’apoptose, ainsi

qu’un échappement à la senescence cellulaire (Hanahan and Weinberg, 2011).

L’étape de progression (Figure 3C) correspond à la transition entre une lésion pré-

maligne, telle qu’elle peut l’être au cours des étapes d’initiation et de promotion, et le

développement d’un cancer invasif. Au cours de cette phase, les cellules mutées acquièrent une

capacité invasive et un potentiel métastatique (Figure 4). Elles sont alors caractérisées par une

forte instabilité génétique, une croissance rapide et présentent des changements morphologiques,

biochimiques et métaboliques (Oliveira et al., 2007). L’angiogenèse, ou la formation de

vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants, est également un processus important dans

cette étape. En effet, en absence d’angiogenèse, la croissance tumorale est limitée à 1 ou 2 mm3

(Folkman, 1995). Au-delà, les cellules se trouvant au centre souffrent d’hypoxie et de carence en

nutriments. Pour y remédier, les cellules sécrètent des facteurs dits pro-angiogéniques dont le

Vascular Endothélium Growth Factor ou VEGF est un des plus emblématiques. En se liant à son

récepteur (le VEGFR ou Vascular Endothélium Growth Factor Receptor) situé à la membrane

des cellules endothéliales, le VEGF stimule la prolifération et la migration de ces dernières, qui

vont alors irriguer la tumeur (Figure 3D). Associée au potentiel invasif des cellules tumorales,

l’angiogenèse est ainsi un processus clé de la dissémination des cellules malignes et favorise la

formation de métastases dans les tissus situés à distance de la tumeur primaire (Hanahan and

Folkman, 1996 ; Hanahan and Weinberg, 2000). La lymphangiogenèse qui correspond à la

formation de capillaires lymphatiques au niveau de la tumeur participe également à ce

phénomène et est impliquée dans la colonisation des ganglions lymphatiques par les cellules

cancéreuses (Christiansen and Detmar, 2011).


4

En conclusion, avec plus de 384 000 nouveaux cas diagnostiqués en 2015 et plus de

149 000 décès liés à cette pathologie, le cancer demeure aujourd’hui encore un problème majeur

de santé publique. Cette maladie est également un enjeu socio-économique puisque les dépenses

liées à la prise en charge des cancers en 2014 ont représenté plus de 5 milliards d’euros. En

France, depuis 2003, la lutte contre le cancer s’est structurée autour de plans nationaux appelés

« Plan Cancer » qui définissent des objectifs pour guider la prévention, le dépistage, les soins, la

recherche et l'accompagnement des patients. Ainsi, l’objectif 5 du troisième plan cancer s’étalant

de 2014 à 2019 souligne l’importance de l’innovation thérapeutique et du développement de la

médecine personnalisée notamment avec l’utilisation de nouveaux biomarqueurs pour le choix

des traitements. Il oriente ainsi la recherche vers l’optimisation des traitements et l’amélioration

de la qualité de vie des patients.

1ere Partie – Etat de l’art 2e Chapitre – De la chimiothérapie à la nanomédecine

5

2E CHAPITRE

De la chimiothérapie à la nanomédecine

Les protocoles de traitement mis en place pour lutter contre les cancers sont choisis en

fonction de différents facteurs prenant en compte l’âge et l’état général de la personne, le type et

le degré d’extension du cancer dont elle est atteinte ainsi que la présence d’éventuelles autres

maladies. La chirurgie, utilisée depuis de nombreux siècles pour l’ablation des tumeurs solides

fut longtemps la seule ligne d’attaque contre cette maladie. Aujourd’hui, elle est souvent utilisée

avec la radiothérapie pour lutter contre les tumeurs solides. Cependant, ces deux stratégies de

soin s’avèrent inefficaces lorsque le cancer est caractérisé par un fort potentiel métastatique,

qu’il est disséminé au sein de l’organisme ou que le patient présente un haut risque de rechute.

En agissant de manière systémique, les chimiothérapies cytotoxiques permettent de pallier à ce

manque car elles peuvent agir sur les cellules malignes disséminées dans l’ensemble du corps.

Bien qu’essentiels encore aujourd’hui dans les protocoles de traitement, le manque de

sélectivité des médicaments utilisés en chimiothérapie est souvent responsable de sévères effets

secondaires. Un des objectifs présents de la recherche en oncologie médicale est donc de

développer des molécules ou des stratégies innovantes capables de rendre l’action de l’agent

anticancéreux spécifique des cellules pathologiques à éliminer et, par conséquent, de limiter les

effets secondaires vis-à-vis du reste de l’organisme.


6

I. DES CHIMIOTHERAPIES CLASSIQUES AU CIBLAGE DES

TUMEURS

A. LES CHIMIOTHERAPIES CLASSIQUES

L’aire de la chimiothérapie cytotoxique pour le traitement du cancer a débuté dans les

années 1940, lorsque Goodman et Gilman découvrent que les moutardes azotées, des dérivés du

gaz moutarde, sont capables d’entrainer une régression tumorale chez des patients atteints de

lymphome non-Hodgkinien (Gilman, 1963). Depuis, plusieurs dizaines de molécules

cytotoxiques ont été identifiées et sont utilisées pour le traitement des cancers. Il en existe

plusieurs catégories, classées par la société Vidal selon leur mode d’action. Les agents alkylants

forment des liaisons covalentes avec l’ADN pour en inhiber la réplication. On retrouve dans

cette catégorie les moutardes azotées citées ci-dessus, ainsi que la cisplatine qui est fréquemment

utilisée contre le cancer ovarien (Dasari and Tchounwou, 2014). Les anti-métabolites

comprennent des antifolates tels que le methotrexate et le pemetrexed ainsi que des antipuriques

et des antipyrimidiques (fluorouracil). Ces molécules qui inhibent la synthèse des acides

nucléiques et bloquent ainsi la réplication sont utilisées pour lutter notamment contre les cancers

mammaires, ovariens et colo-rectaux mais également pour le traitement des ostéosarcomes et des

choriocarcinomes (tumeurs du trophoblaste ; Gonen and Assaraf, 2012). Les taxanes et les vinca-

alcaloïdes tels que la vinblastine appartiennent au groupe des poisons du fuseau mitotique. Ils

perturbent la polymérisation des microtubules et empêchent ainsi la division cellulaire. A titre

d’exemple, la vinblastine est utilisée dans une variété de cancers incluant les cancers de l’ovaire,

de la vessie, du rein (Yue et al., 2010). Enfin, on trouve les inhibiteurs de topoisomérases, des

enzymes impliquées dans la réplication de l’ADN. Cette catégorie regroupe les anthracyclines

telles que la doxorubicine, une molécule fréquemment utilisée pour le traitement des leucémies

et des lymphomes (Rivankar, 2014).

Malgré leur diversité, l’efficacité des chimiothérapies conventionnelles est limitée par les

nombreuses contraintes qu’elles entrainent. En effet, les agents utilisés en chimiothérapie

traditionnelle exploitent les propriétés cytotoxiques d’agents non spécifiques, qui circulent dans

l’ensemble de l’organisme et qui affectent les cellules à division rapide, qu’elles soient

cancéreuses ou non (Figures 3). Ce manque de sélectivité vis-à-vis des cellules malignes induit

une toxicité importante envers certaines cellules saines telles que les cellules du système

Figure 5. Les chimiothérapies classiques affectent sans discrimination les cellules cancéreuses et

les cellules saines (à gauche). Cela se traduit par la manifestation de nombreux effets secondaires

chez les patients. Paul Ehrlish proposa la création de « magic bullets », des médicaments qui

seraient conçus pour reconnaitre une structure moléculaire pathologique et ainsi épargner les

tissus sains (à droite, Strebhardt et Ullrich, 2008).


7

immunitaire, les cellules épithéliales gastro-intestinales, les follicules pileux, etc. De nombreux

effets secondaires dont la gravité peut varier sont alors observés suite à une chimiothérapie. Par

exemple, elles peuvent entrainer une aplasie médullaire (diminution de la proportion d’un ou

plusieurs types de cellules sanguines), une inflammation des muqueuses notamment de

l’œsophage et du colon pouvant aboutir à la formation d’ulcères, des diarrhées, constipations,

nausées et vomissements. Dans les cas les plus graves, les chimiothérapies peuvent être

responsables de lésions au niveau des organes, comme la doxorubicine pour laquelle une forte

toxicité au niveau du cœur a été rapportée (Rivankar, 2014).

A cause de ces lourds effets secondaires, la quantité d’agent anticancéreux administrée

au patient est souvent limitée voir insuffisante pour éradiquer le cancer et l’arrêt prématuré du

traitement est parfois recommandé. Par ailleurs, les cellules cancéreuses en présence de ces

agents de chimiothérapie traditionnelle développent régulièrement des mécanismes de

résistances dits multidrogues. Ces résistances peuvent résulter de plusieurs mécanismes tels que

des modifications lipidiques qui entrainent une internalisation moins efficace de l’agent

anticancéreux ou à la surexpression d’une famille de transporteurs ABC ou ATP-Binding

Cassette (Núñez et al., 2016). Ces protéines, appelées MDR pour Multidrug Resistance Proteins,

utilisent l’énergie de l’hydrolyse de l’ATP (adénosine triphosphate) pour prendre en charge

l’agent chimiothérapeutique et l’expulser hors de la cellule cancéreuse (Zhang et al., 2015). Elles

sont notamment responsables d’une diminution de la sensibilité des cellules cancéreuses

pulmonaires à la vincristine, la cisplatine et à la doxorubicine (Young et al., 2001).

B. NOTION DE CIBLAGE TUMORAL

Considéré comme le père de la chimiothérapie, le célèbre immunologiste Paul Ehrlich

avait déjà conscience au début du XXe siècle de la « puissance aveugle » de ces molécules de

chimiothérapie et émit l’idée de la création de « magic bullets », des médicaments attaquant

efficacement une structure biologique pathogène tout en demeurant inoffensifs pour le reste de

l’organisme (Strebhardt et Ullrich, 2008 ; Figure 5). Dans le cadre du traitement du cancer, cela

signifie développer des agents thérapeutiques, utilisés seuls ou en combinaison avec des

chimiothérapies traditionnelles et dont l’activité est spécifique des cellules cancéreuses. Cet

objectif peut être atteint par deux approches différentes : les thérapies ciblées et les

chimiothérapies vectorisées dont les principes sont décrits ci-dessous.

Figure 6. (A) Les thérapies ciblées sont conçues pour altérer des acteurs majeurs de voies de

signalisation cruciales au développement du cancer. (B) Les agents anticancéreux utilisés en

chimiothérapie classique peuvent souvent pénétrer par diffusion passive dans les cellules

cancéreuses mais également dans les cellules saines, causant de nombreux effets secondaires. (C)

Enfin, la plupart des vecteurs anticancéreux ciblent des marqueurs moléculaires surexprimés ou

exprimés spécifiquement à la surface des cellules malignes. Le vecteur est ensuite internalisé

dans la cellule par endocytose et l’agent cytotoxique libéré pour tuer la cellule de l’intérieur.


8

II. LES THERAPIES CIBLEES

La première approche pour le ciblage des cellules tumorales est une approche directe : les

molécules altèrent directement des voies de signalisation essentielles à la survie ou à la

progression tumorale (Figure 6A). La protéine ciblée par le médicament doit être drastiquement

surexprimée dans les cellules cancéreuses ou présenter une activité fortement augmentée

comparée aux cellules saines. Il peut également s’agir d’une forme mutée de la protéine ou d’une

protéine chimérique résultant de la fusion de deux gènes. Dans cette catégorie de médicaments,

on trouve généralement des anticorps monoclonaux dont un des plus emblématiques est le

Bevacizumab (Avastin®, Genentech). Le Bevacizumab, un anticorps humanisé dirigé contre le

VEGF-A (vascular endothelial growth factor A), est utilisé en complément de chimiothérapies

classiques pour bloquer l’angiogenèse tumorale (Kim et al., 1993). Il est utilisé pour le

traitement de plusieurs cancers tels que les cancers colorectaux, pulmonaires et mammaires mais

également pour la prise en charge de certaines formes de dégénérescence maculaire liée à l’âge

(Falk et al., 2015).

En plus des anticorps monoclonaux, on trouve également dans cette catégorie de thérapie

à ciblage direct de petites molécules inhibitrices comme l’Alpelisib (BYL917, Novartis) ou

l’Imatinib mesylate (Glivec®, Novartis). Le BYL917 est un inhibiteur spécifique de la

phosphoinositol-3-kinase (PI3K), une protéine à la base de nombreuses voies de signalisation

(apoptose, prolifération, différenciation, migration cellulaire, etc.) est fréquemment dérégulée

dans de nombreux cancers (Katso et al., 2001 ; Engelman, 2009). Le BYL917 est actuellement

testé dans différents essais cliniques de phase 1 pour le traitement de patients souffrant de

différents cancers solides (cancers mammaires, colorectaux, ovariens, etc. ; De Buck et al.,

2014). De plus, compte tenu des données précliniques et cliniques obtenues pour le BYL917,

Gobin et al., ont proposé en 2015 d’utiliser le BYL917 pour le traitement de l’ostéosarcome. Au

cours de cette étude préclinique, le BYL917 a montré qu’il était capable d’entrainer une

diminution de la croissance tumorale d’une part en inhibant la croissance des cellules tumorales,

mais également en influant sur le microenvironnement de la tumeur notamment pour inhiber

l’angiogenèse (Gobin et al., 2015).

Un autre exemple de thérapie ciblée est l’Imatinib mesylate. Ce médicament cible

différentes protéines ou récepteurs à activité tyrosine-kinase et notamment une protéine

particulière présente uniquement dans les cellules malignes de patients souffrant de leucémies


9

myéloïdes chroniques (LMC) : la protéine de fusion BCR-ABL (Rea et al., 2012). Cette protéine

est le produit du gène de Philadelphie, un gène de fusion issu d’une altération chromosomique au

niveau des gènes BCR et ABL. La protéine BCR-ABL est constitutivement activée et stimule la

prolifération des cellules leucémiques (Røsland et Engelsen, 2015). L’Imatinib mesylate est

apparu comme une révolution dans le traitement des LMC entrainant des résultats supérieurs au

traitement utilisé jusqu’alors (une combinaison d’interféron α et de cytarabine ; O’Brien et al.,

2003) et une survie globale à 5 ans de 89 % des patients (Druker et al., 2006). Par ailleurs,

l’Imatinib mesylate est également utilisé pour le traitement des tumeurs stromales gastro-

intestinales et des dermatofibrosarcomes protuberans dans lesquels il inhibe d’autres protéines

tyrosine-kinases telles que le récepteur Kit (Waller, 2014 ; Rutkowski and Debiec-Rychter,

2015).

La seconde approche permettant le ciblage des tumeurs est une approche indirecte qui

repose sur la reconnaissance et l’utilisation de caractéristiques spécifiques des cellules tumorales

ou de leur microenvironnement pour réaliser l’adressage d’agents chimiothérapeutiques

uniquement à ces cellules (Figure 6C). Pour cela, on utilise des vecteurs ou des conjugués, c’est-

à-dire des molécules permettant le transport et la protection du principe actif jusqu’au site

pathologique à traiter. On parle alors de chimiothérapie vectorisée, une stratégie qui fait l’objet

de mes travaux de thèse et qui est décrite plus particulièrement dans le chapitre suivant.


10

III. LES CHIMIOTHERAPIES VECTORISEES

A. DEFINITION

La vectorisation consiste à associer un principe actif à une structure ou un édifice

moléculaire permettant son transport jusqu’au site d’action où il est libéré de manière contrôlée

(Pérez-Herrero and Fernández-Medarde, 2015). La vectorisation d’agents anticancéreux présente

de nombreux avantages puisqu’en plus de protéger les tissus sains des agents transportés, les

molécules vectorisées permettent d’éviter ou de ralentir la dégradation ou l’élimination du

principe actif par l’organisme. Certains composés permettent également de s’affranchir des

problèmes de solubilité et de stabilité du principe actif et d’en maitriser les propriétés de

pharmacodynamique et de pharmacocinétique (Duncan et Gaspar, 2011). De nombreuses

stratégies de vectorisation ont donc été imaginées pour transporter des médicaments ou des

agents permettant le diagnostic des tumeurs (agents de contraste pour l’imagerie médicale par

exemple). L’objectif de ce chapitre n’est pas d’en dresser une liste exhaustive mais, après une

présentation générale de l’adressage de ces molécules vectorisées aux cellules cancéreuses suite

à la reconnaissance de marqueurs tumoraux, de décrire les deux grandes familles de vecteurs :

les transporteurs et les conjugués.

B. COMMENT CIBLER LES TUMEURS?

A cause de l’instabilité génétique qui caractérise les cellules tumorales, chaque cancer

peut être considéré comme unique dans son répertoire de mutations et d’anomalies génétiques.

Cependant, les études dites « OMICS » (génomique, protéomique, métabolomique…) menées à

grande échelle font ressortir un certain nombre de particularités phénotypiques communes à

certaines cellules cancéreuses et permettant leur distinction des cellules saines (Alexandrov et

al., 2013). Ces signatures tumorales, ou marqueurs, sont exprimées par la cellule cancéreuse elle-

même, mais peuvent également être des spécificités du microenvironnement tumoral.

Pour reconnaitre les tumeurs, les molécules vectorisées exploitent deux types de ciblage.

Le ciblage passif tire profit des différences physiques entre les cellules saines et les cellules

cancéreuses ou leur microenvironnement. Il est principalement utilisé pour le ciblage des

Figure 7. Structure de vaisseaux sanguins normaux (à gauche) et tumoraux (à droite) en

microscopie électronique. (A) Les tissus sains murins ont une vascularisation simple et organisée

en artérioles, capillaires et veinules. Au contraire, la vascularisation tumorale ne suit pas cette

hiérarchie et présente une structure désorganisée et hautement ramifiée (d’après McDonald and

Baluk, 2005). (B) Les cellules endothéliales formant la paroi luminale des vaisseaux sanguins

sains sont lisses et présentent une structure resserrée, ce qui n’est pas le cas des cellules

endothéliales des vaisseaux tumoraux qui forment des pores dans lesquelles les macromolécules

peuvent s’accumuler et diffuser vers la tumeur (d’après Baluk et al., 2005).


11

tumeurs solides. Le ciblage actif des tumeurs repose sur la reconnaissance de marqueurs

moléculaires présents ou surexprimés de manière spécifique sur les cellules cancéreuses, tels que

peuvent l’être certains récepteurs membranaires.

1. Ciblage passif des tumeurs solides, exemple de l’« effet EPR »

Le ciblage passif des tumeurs solides exploite les différences physiques entre les tissus

tumoraux et les tissus sains pour déposer ou activer plus efficacement la molécule vectorisée là

où elle doit agir. Une des caractéristiques les plus exploitées pour ce type de ciblage est la

vascularisation anormale des tumeurs. En effet, comme les tissus normaux, les cellules tumorales

nécessitent un apport suffisant en nutriments et en oxygène pour survivre et se développer. Pour

cela, elles stimulent la formation de vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants par un

processus appelé angiogenèse. Chez l’adulte, les cellules endothéliales sont quiescentes en

conditions physiologiques et l’angiogenèse, est quasiment inexistante due à la balance entre la

production de facteurs pro- et anti-angiogéniques. Les cellules cancéreuses, en sécrétant des

facteurs pro-angiogéniques, activent les cellules endothéliales avoisinantes qui prolifèrent alors

pour former des vaisseaux et irriguer la tumeur (Folkman, 1995). La production non contrôlée de

ces facteurs pro-angiogéniques aboutit à la formation rapide d’un réseau vasculaire dont

l’architecture est fragile et aberrante. En effet, outre l’absence de hiérarchisation des vaisseaux

sanguins tumoraux, ceux-ci présentent une porosité plus importante que les vaisseaux normaux

et sont donc plus perméables aux macromolécules (Figure 7 ; Baluk et al., 2005 ; McDonald et

Baluk, 2005 ; Smith et al., 2012). De plus, l’absence ou le faible drainage lymphatique au sein

des tumeurs y entraine une rétention des macromolécules. Ce phénomène, appelé effet « EPR »

pour « Enhanced Permeabily and Retention », confère un avantage à certains vecteurs comme les

liposomes et les nanoparticules qui circulent à travers les pores des vaisseaux sanguins tumoraux

et s’accumulent dans les tissus malades (Figure 8 ; Zwicke et al., 2012). Ce ciblage passif est

donc conditionné préférentiellement par la taille du vecteur, sans véritable reconnaissance d’une

cible moléculaire.

Figure 8. (A) La structure des vaisseaux sanguins normaux empêche l’extravasation des

nanotransporteurs. (B) Le ciblage passif des tumeurs tire profit de la fenestration importante des

vaisseaux tumoraux. Les nanotransporteurs peuvent alors s’accumuler dans les pores des

vaisseaux et rejoindre le microenvironnement de la tumeur. (C) Le ciblage actif des tumeurs est

basé sur la reconnaissance de marqueurs moléculaires spécifiques aux cellules tumorales.


12

2. Ciblage actif des tumeurs

L’effet « EPR » facilite la localisation efficace de certains vecteurs anticancéreux mais ne

promeut pas l’internalisation spécifique du principe actif qu’ils transportent dans la tumeur. Cette

seconde étape peut être assurée en intégrant à la structure du vecteur un ou plusieurs éléments de

ciblage des cellules tumorales tels que des petites molécules (par exemple de l’acide folique ou

des carbohydrates), des peptides, des protéines ou des anticorps. Souvent, ces éléments de

ciblage reconnaissent des récepteurs membranaires surexprimés ou exprimés spécifiquement à la

surface des cellules cancéreuses et déclenchent l’internalisation du composé au sein de la cellule

tumorale par un processus d’endocytose (Figure 6 ; Bazak et al., 2015). En plus de permettre la

libération du principe actif directement dans les cellules à éliminer, l’internalisation sélective par

endocytose du médicament (comparée à la diffusion passive d’une molécule de chimiothérapie à

travers la membrane plasmique) semblerait supprimer le phénomène de résistance multidrogue

observé dans certains cancers (Huwyler et al., 2002).

Compte tenu de ces avantages, de nombreux ligands de ciblage sont proposés pour cibler

activement les cellules cancéreuses, notamment des anticorps ou des fragments d’anticorps qui

sont une des approches les plus avancées, des aptamères, des peptides ou des protéines entières

comme la transferrine (une glycoprotéine sérique), différents ligands, etc. A titre d’exemple, la

sous-unité B non toxique de la toxine Shiga, produite par une bactérie intestinale pathogène, a

été conjuguée à différents agents anticancéreux. Le composé est internalisé via l’interaction de la

sous-unité B de la toxine et son récepteur Gb3 surexprimé notamment dans les cancers

colorectaux. In vitro, ces composés montrent des résultats prometteurs sur des cellules de cancer

du côlon (HT29) avec des concentrations inhibitrices médianes (IC50) de l’ordre du nanomolaire

et sont en attente d’évaluation in vivo (El Alaoui et al., 2007 ; Kostova et al., 2015).

Figure 9. Représentation schématique de différentes stratégies de vectorisation anticancéreuse. Il

existe deux grandes familles de vecteurs : les conjugués en rouge et les transporteurs en bleu,

dont la liste n’est pas exhaustive et qui sont classés selon la nature de leurs composants (d’après

Wicki et al., 2015).


13

C. DIFFERENTS TYPES DE VECTEURS

Il existe toute une variété de vecteurs même si beaucoup sont encore à des stades

précoces de développement. Ils diffèrent par leur taille, leur structure, la nature de leurs

composants, etc., ce qui rend leur classification assez difficile. Cependant, il est possible d’en

faire ressortir deux grandes catégories : les nanotransporteurs qui « encapsulent » le principe

actif, et les conjugués qui sont des structures liant de manière covalente un élément de ciblage

des cellules tumorales et le principe actif (Figure 9).

1. Les nanotransporteurs

Les nanotransporteurs représentent la plus grande catégorie de vecteurs. Ce sont des

assemblages moléculaires de taille nanométrique dans lesquels plusieurs molécules de principe

actif (petites molécules de faible poids moléculaire ou macromolécules telles que des gènes ou

des protéines) sont piégées pour permettre leur transport jusqu’au site d’action. Ils ont

généralement un diamètre compris entre 10 et 200 nm, leur conférant une taille suffisante pour

éviter leur élimination par le rein (Venturoli et Rippe, 2005) et une taille optimale à leur

extravasation entre les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins tumoraux (Dreher et al.,

2006). La libération des molécules de principe actif est réalisée dans le microenvironnement de

la tumeur (ciblage passif) ou directement dans la cellule à éliminer (ciblage actif) suite à la

décomposition du vecteur. Les propriétés de cette décomposition peuvent être modulées en

modifiant les composants du transporteur.

Il existe une très grande variété de ce type de vecteurs répartis selon Wicki et al. en

quatre classes en fonction de la nature des composants utilisés (Wicki et al., 2015 ; Pérez-

Herrero et Fernández-Medarde, 2015 ; Figure 9). Ainsi, il existe des nanoparticules virales

conçues pour se répliquer préférentiellement dans les cellules cancéreuses et qui entrainent leur

destruction en détournant les voies de signalisation de la cellule hôte et/ou en recrutant le

système immunitaire. On peut également citer les nanoparticules inorganiques qui peuvent être

utilisées comme sensibilisateurs à la radiothérapie ou pour l’ablation thermique des tumeurs

(NanoTherm® développé par MagForce AG pour l’ablation des glioblastomes, Rivera Gil et al.,

2010). On retrouve également les nanoparticules polymériques qui sont composées d’un

enchevêtrement de biopolymères piégeant les molécules de principe actif à transporter.


14

Enfin, il est possible de trouver dans cette catégorie des liposomes, des structures

composées d’une bicouche phospholipidique formant un compartiment dans lequel se trouve le

principe actif (qui peut également être piégé dans la bicouche phospholipidique selon sa nature).

D’ailleurs, un des premiers nanotransporteurs lipidiques mis sur le marché est le Doxil®, ou

Caelyx® en Europe. Il s’agit d’un liposome contenant de la doxorubicine et recouvert de

polyéthylène glycol pour augmenter la durée de circulation systémique du composé. Il est

aujourd’hui utilisé pour le traitement du cancer du sein métastatique, des cancers ovariens

avancés, des sarcomes de Kaposi et des myélomes multiples (Barenholz, 2012).

2. Les conjugués d’agents anticancéreux

Une autre approche permet de délivrer des molécules cytotoxiques ou des agents

d’imagerie médicale en les liant de manière covalente à un anticorps ou à un ligand

reconnaissant une cible moléculaire présente à la surface des cellules cancéreuses. On parle alors

de conjugué ou de prodrogue. La liaison entre le principe actif et l’élément de ciblage doit être

stable au sein de la circulation sanguine pour permettre le maintien de l’inactivité du

médicament. En revanche, cette liaison covalente doit pouvoir être dégradée en intra- ou en

extracellulaire au niveau des cellules cancéreuses et libérer le médicament pour qu’il puisse

exercer son activité.

A titre d’exemple, le F14512 est un conjugué composé d’un ligand de ciblage, la

spermine et d’un agent anticancéreux dérivé de la podophyllotoxine (un inhibiteur de la

topoisomérase II). Le ligand de ciblage permet l’internalisation du composé au sein de certaines

cellules cancéreuses qui surexpriment le système de transport de polyamines. Le F14512 exerce

de fortes propriétés antitumorales in vitro sur différentes lignées cancéreuses (leucémie, cancers

du sein et du poumon, mélanomes et sarcomes) et in vivo, sur des modèles de leucémies, de

cancers du sein et du côlon (Barret et al., 2008 ; Kruczynski et al., 2009). Le F14512 a

également montré une forte efficacité au cours de différents essais cliniques de phase 1 menés

sur un modèle canin de lymphome ou chez l’homme pour le traitement de leucémies myéloïdes

aigues (LAM ; Tierny et al., 2015). Il est actuellement en cours d’évaluation chez l’homme, dans

une phase 2 pour le traitement des LAM.


15

Aujourd’hui, beaucoup de molécules de ce type sont testées en essais cliniques. Parmi

celles approuvées par la Food et Drug Administration, on trouve le brentuximab vendotin

(Adcetris®, Takeda Pharma) et le trastuzumab emtansine (Kadcyla®, Roche). Le brentuximab

vendotin consiste en un anticorps chimérique dirigé contre l’antigène CD30 et relié à un puissant

agent anticancéreux, la monométhyl Auristatine E (MMAE). Il est approuvé depuis 2011 pour le

traitement des lymphomes Hodgkiniens et des lymphomes anaplasiques à grandes cellules (Foyil

et Bartlett, 2011). Le trastuzumab emtansine, lui, cible le récepteur HER2 (Human Epidermal

growth factor Receptor-2) et est associé à un agent cytotoxique dérivé de la maitansine. Il est

autorisé depuis 2013 pour le traitement des cancers du sein métastatique exprimant le récepteur

HER2 (Verma et al., 2012).

Ainsi, il existe plusieurs stratégies de ciblage des cellules tumorales ou de leur

microenvironnement. A travers mes travaux de thèse, j’ai eu l’occasion de travailler sur plusieurs

types de ciblage mais c’est celui concernant les récepteurs à l’acide folique qui a représenté la

plus grande partie de mon travail. De ce fait, le prochain chapitre est consacré à la présentation

de ce récepteur particulier.

1ere Partie – Etat de l’art 3e Chapitre – Les folates et leurs transporteurs

16

3E CHAPITRE

Les folates et leurs transporteurs

I. LES FOLATES

Le terme générique « folate » regroupe tous les composés, naturels et synthétiques

(comme l’acide folique), appartenant à la famille des vitamines B9. Ils interviennent comme

cofacteurs enzymatiques dans les réactions de transfert de carbone unique et sont de fait

impliqués dans de nombreuses fonctions essentielles du métabolisme cellulaire telles que la

biosynthèse des purines et des pyrimidines, la méthylation de l’ADN, la synthèse d’acides

aminés et de quelques vitamines (Iyer et Tomar, 2009).

Avec un apport quotidien recommandé de 400 µg pour un adulte, la vitamine B9 fait

obligatoirement l’objet d’apports exogènes, les cellules de mammifères ne possédant pas les

enzymes nécessaires à sa biosynthèse. Ainsi, les carences en folates sont courantes. Elles sont à

l’origine de nombreux symptômes et favorisent de nombreuses pathologies. A titre d’exemple,

une carence en vitamine B9 au cours du développement embryonnaire entraine des défauts de

formation du tube neural (Daly et al., 1995). Chez l’adulte, les déficiences en folate sont

associées à des anémies et différents problèmes neurologiques tels que des dépressions et des

accidents vasculaires cérébraux. Elles peuvent également favoriser l’apparition de maladies

cardio-vasculaires (Morrison et al., 1996) et de la maladie d’Alzheimer (Hinterberger et Fischer,

2013). Dans le cadre du cancer, les folates jouent un rôle ambivalent. En effet, alors qu’une

carence en folate peut augmenter le risque de cancers notamment mammaires et colorectaux

(Choi et Mason, 2002), ils sont également décrits comme un soutien majeur de la prolifération

des cellules malignes (Gonen and Assaraf, 2012). A ce titre, de nombreuses molécules ont été

utilisées en chimiothérapie comme antifolates. C’est par exemple le cas du méthotrexate et du

pemetrexed qui inhibent des enzymes clés du métabolisme des folates (la dihydrofolate reductase

et la thymidylate synthase, respectivement ; Gonen and Assaraf, 2012).

Figure 10. Transport des folates dans les cellules saines ou cancéreuses via le transporteur de

folates réduits (Reduced Folate Carrier), le transporteur de folates couplé aux protons (Proton

Coupled Receptor) ou le récepteur de l’acide folique (Folate Receptor).


17

II. LE TRANSPORT DES FOLATES

En raison des motifs glutamates qu’ils contiennent, les folates sont des molécules

hydrophiles anioniques qui ne peuvent diffuser passivement à travers la membrane plasmique

des cellules. L’internalisation des folates au sein des cellules dépend alors de trois systèmes de

transport : le transporteur de folates réduits (RFC pour Reduced Folate Carrier), le transporteur

de folates couplé aux protons (PCFT pour Proton Coupled Folate Transporter) et les récepteurs

de l’acide folique (FR pour Folate Receptor ; Figure 10). La régulation de la concentration

cellulaire des folates est un processus complexe dont les transporteurs RFC et PCFT sont les

acteurs principaux puisque, contrairement aux récepteurs FR, ils permettent des échanges

réversibles de folates à travers la membrane des cellules (Stover, 2004).

A. LE TRANSPORTEUR DE FOLATES REDUITS (RFC)

Le transporteur RFC est le premier transporteur de folates à avoir été identifié dans le

milieu des années 1960 (Matherly et al., 2007). C’est un membre de la « major facilitator

superfamily », une classe de transporteurs impliqués dans la diffusion facilitée à travers les

membranes cellulaires de molécules telles que des acides aminés, des neurotransmetteurs, des

sucres, des vitamines, des nucléosides et des phosphates organiques. Le RFC permet l’échange

des folates dans les tissus à partir de la circulation systémique. De ce fait, on le retrouve de

manière ubiquitaire dans les tissus sains et cancéreux, faisant de ce transporteur l’acteur

majoritaire du transport des folates chez les mammifères.

1. Structure du gène et de la protéine RFC

Le gène RFC, qui est hautement conservé d’une espèce à l’autre est situé chez l’homme

sur le chromosome 21q22.3 (Whetstine et al., 2002). Bien que la structure protéique de ce

transporteur ne soit pas encore clairement décrite, une structure tridimensionnelle prédictive a pu

être proposée à partir de l’analyse par cristallographie de protéines analogues au RFC. Il s’agit

d’un transporteur à 12 domaines transmembranaires, dont la courte extrémité aminée (N-

terminal) et la longue extrémité carboxyle (C-terminal) sont situées dans le compartiment


18

intracellulaire. Il est constitué de 591 acides aminés et possède un poids moléculaire d’environ

85 kDa. Il présente un site hautement conservé de N-glycosylation (asparagine 58) sur la

première boucle extracellulaire ainsi qu’une large boucle intracellulaire entre les domaines

transmembranaires 6 et 7 qui semble indispensable à la fonction optimale du transporteur (Liu et

al., 2003 ; Matherly et al., 2007).

2. Transport des folates par le RFC

Le RFC est un transporteur antiport qui couple l’influx de folates à un efflux de substrats

anioniques cellulaires (Figure 10). Il s’agit d’un transporteur actif secondaire qui utilise le

gradient de concentration transmembranaire de phosphates anioniques pour transporter les

folates contre leur gradient de concentration. Il n’est pas directement dépendant de l’hydrolyse

de l’adénosine triphosphate. Le transport des folates est maximal à pH neutre, et décroit

rapidement au fur et à mesure que le pH diminue. Il est saturable à de faibles concentrations et

fortement sensible à la compétition par des analogues. Comme son nom le laisse supposer, il

possède une haute affinité pour les folates réduits (Km = 1 à 3 µM) mais n’en présente que peu

pour les folates oxydés tels que l’acide folique (Km = 200 à 400 µM) (Sirotnak, 1985).

Le transporteur RFC est principalement présent sous forme monomérique mais peut aussi

être retrouvé comme beaucoup de transporteurs de la « major facilitator family » sous forme

d’homo-oligomères. Ceux-ci interviendraient notamment dans le transport des folates du

réticulum endoplasmique vers la membrane cellulaire, laissant supposer une régulation complexe

de la fonction de ce transporteur (Hou et al., 2010).

3. Expression et physiopathologies liées aux RFC

Le transporteur RFC est exprimé de manière ubiquitaire dans les tissus sains. Ainsi, de

forts niveaux d’expression du transcrit RFC ont été décrits par Whetstine et al. en 2002 dans le

foie et le placenta, et des niveaux intermédiaires dans des tissus tels que le rein, les leucocytes, le

poumon, la moelle osseuse, l’intestin et dans certaines parties du système nerveux central et du

cerveau. Des niveaux d’expression plus modestes ont également été décrits dans le cœur et les

muscles squelettiques.


19

Témoignant de l’importance physiologique de ce transporteur, l’inactivation des deux

allèles du gène RFC chez la souris est létale. Par ailleurs, de faibles niveaux d’expression du

RFC se traduisent par de nombreux symptômes associés à des carences en folates, tels que des

maladies cardiovasculaires, des défauts de formation du tube neural au cours du développement

et des troubles neurologiques (Matherly et al., 2007). Dans le cadre du cancer, les folates jouent

un rôle complexe et ambivalent. En effet, alors qu’une déficience en folate peut favoriser

l’apparition de certains cancers (Iyer and Tomar, 2009), au sein des tumeurs, ils soutiennent la

croissance et la prolifération des cellules malignes (Vergote et al., 2015). Bien que les variations

d’expression du RFC dans les cancers soient peu étudiées, de nombreuses molécules inhibant le

métabolisme des folates telles que le méthotrexate ont été conçues pour être internalisées dans

les cellules pathologiques via ce transporteur. Cependant, des mécanismes de résistance sont

souvent observés suite à la mise en place de ce type de traitements, notamment à cause d’une

perte de la fonction du RFC (perte allélique, mutation, etc. ; Gonen and Assaraf, 2012).

B. LE TRANSPORTEUR DE FOLATES COUPLES AUX PROTONS (PCFT)

D’abord connu comme un transporteur d’hèmes, le PCFT a été décrit en 2006 par Qiu et

al. comme le transporteur majoritaire concernant l’absorption intestinale des folates provenant de

l’alimentation. C’est un transporteur de type symport qui permet l’entrée de folates et de protons

au sein des cellules intestinales par diffusion facilitée (Figure 10). Il est principalement exprimé

dans la partie proximale de l’intestin grêle où le pH acide permet l’activité optimale de ce

transporteur.

1. Structure du gène et de la protéine PCFT

Le gène humain codant le transporteur PCFT est constitué de cinq exons et de quatre

introns et se situe sur le chromosome 17q11.2. Il code une protéine constituée de 439 acides

aminés possédant un poids moléculaire de 49,8 kDa. Sa composition prédit une structure à 12

domaines transmembranaires dont les terminaisons carboxyle et aminée sont

intracytoplasmiques. La première boucle extracellulaire de ce transporteur contient deux


20

domaines de glycosylation (asparagines 58 et 68) qui semblent importants pour l’efficacité du

transport des folates (Unal et al., 2008).

2. Transport des folates par le PCFT

La principale caractéristique de ce transporteur réside dans le pH acide permettant son

activité optimale. Ainsi, le transport de folate est maximal lorsque le pH est compris entre 5 et

5,5 et diminue rapidement à mesure que le pH augmente pour être quasiment inexistant à un pH

de 7. En tant que symport, le PCFT permet un transport électrogénique des folates : deux protons

sont cotransportés pour chaque molécule de folale internalisée (anion bivalent ; Figure 10).

L’internalisation des folates par le PCFT s’accompagne alors d’une acidification du milieu

intracellulaire (Qiu et al., 2006). Enfin, et contrairement au RFC, le PCFT possède des affinités

équivalentes (Km 0,5 – 1 µM) pour les folates réduits et les folates oxydés tels que l’acide

folique (Zhao et Goldman, 2007).

3. Expression et physiopathologie liée au PCFT

a) Expression du PCFT

Le PCFT possède un profil d’expression plus limité que le transporteur RFC. Acteur

majeur de l’absorption intestinale des folates provenant de l’alimentation, le PCFT est fortement

exprimé à la face apicale des cellules à bordure en brosse du duodenum et du jejunum (intestin

grêle). Son expression diminue drastiquement dans les autres segments de l’intestin et du colon

(Urquhart et al., 2010). Par ailleurs, le PCFT serait également exprimé dans les cellules

épithéliales du plexus choroïde où il agirait en tandem avec les récepteurs à l’acide folique pour

maintenir un taux physiologique de folates dans le liquide céphalorachidien, et ce, malgré la

présence de la barrière hémato-encéphalique (Wollack et al., 2008).

Enfin, alors que l’ARN messager (ARNm) du transporteur PCFT est faiblement exprimé,

voir indétectable dans la plupart des tissus, il est détecté dans les reins et le foie mais le rôle qu’il

pourrait y jouer reste encore à élucider.


21

b) Malabsorption héréditaire des folates

C’est l’identification d’une mutation homozygote dans le gène PCFT chez des patients

atteints de malabsorption héréditaire de l’acide folique qui a permis d’établir le rôle

physiologique du PCFT. Cette maladie rare est causée par la perte de fonction du transporteur et,

de fait, par une forte carence en folates (Qiu et al., 2006). Les personnes atteintes par cette

pathologie présentent des défauts de développement au cours des premiers mois de leur vie et

des retards cognitifs. Elles souffrent également d’anémie et d’hypo-immunoglobulinémie

associée à des complications infectieuses (pneumonie ; Desmoulin et al., 2012). Ces symptômes

lourds traduisent l’importance du PCFT dans le transport des folates à travers l’épithélium

gastro-intestinal et indiquent que le RFC n’y contribue pas de manière significative.

C. LES RECEPTEURS A L’ACIDE FOLIQUE (FR)

Bien que les transporteurs PCFT et RFC représentent les principaux acteurs de

l’internalisation et du transport des folates au sein des cellules, une troisième voie d’entrée existe

(Figure 10). Les récepteurs à l’acide folique (FR), aussi appelés FBP ou Folbp pour « Folate

Binding Protein » lient l’acide folique et les folates réduits avec une affinité plus importante que

le RFC et le PCFT (Km < 1 nM). De plus, contrairement aux RFC et au PCFT, les récepteurs FR

sont également capables de lier des dérivés chimiques de l’acide folique comme les vecteurs

anticancéreux et de permettre leur internalisation au sein de la cellule (voir page 12).

1. Généralités sur les FR

Chez l’homme, quatre gènes notés FOLR1 à 4 ont été identifiés et localisés sur le

chromosome 11q13.3 à q13.5. Ces gènes codent respectivement quatre isoformes des récepteurs

de l’acide folique appelés FRα, FRβ et FRγ. La protéine FRδ codée par le gène FOLR4 est une

protéine particulière qui n’a été identifiée que récemment et pour laquelle très peu de données

sont aujourd’hui disponibles.

Les récepteurs FR forment une famille de glycoprotéines de 220 à 243 acides aminés

dont les poids moléculaires sont compris entre 38 et 45 kDa. Ils partagent entre 68 et 79 %

Isoforme de la protéine Distribution tissulaire physiologique Surexpression dans les tissus tumoraux

FRα Quelques cellules épithéliales : Trompes de Fallope Tubules proximaux du rein Pneumocytes de type I et II Plexus choroïde Glandes salivaires sous-maxillaires Glandes bronchiques Epithélium pigmentaire rétinien Cellules trophoblastiques placentaires

Carcinomes : Gynécologiques Rein Poumon Cerveau Sein Colon

FRβ Monocytes (faibles niveaux) Macrophages activés (forts niveaux) Placenta

Hémopathies malignes : Leucémie myéloïde aigue (70 % des cas) Leucémie myéloïde chronique

Macrophages pathologiques : Maladies inflammatoires Tumor-Associated Macrophages (TAM)

FRγ Cellules hématopoïétiques (rate, moelle osseuse, thymus)

FRδ Ovocytes Lymphocytes T régulateurs (souris)

Tableau 1. Distribution tissulaire des différentes isoformes de la protéine FR


22

d’homologie au sein de leur séquence peptidique primaire et présentent deux (pour FRβ et γ) ou

trois (pour FRα) sites de N-glycosylation (Elnakat et Ratnam, 2004). Ces sites sont impliqués

dans le repliement correct de la protéine, son adressage fonctionnel à la membrane de la cellule,

et confèrent une demi-vie de plus de 24 h à la protéine. En revanche, ils n’interviennent pas dans

la liaison avec le ligand (Shen et al., 1997).

Bien qu’important dans le développement embryonnaire du tube neural (Henderson et al.,

1995), la fonction des FR dans les tissus adultes sains est très limitée et il existe peu de données

sur ce sujet. Ils pourraient être importants lorsque les taux de folates extracellulaires sont faibles

(Elnakat and Ratnam, 2004).

2. Différentes isoformes de FR

Parmi les quatre isoformes de FR qui existent, les formes FRα, FRβ et FRδ sont

caractérisées par des extrémités carboxyles hydrophobes qui contiennent un signal permettant la

fixation d’un motif glycosylphosphatidylinositol (GPI) et donc leur ancrage à la membrane

plasmique (Elnakat and Ratnam, 2004). Contrairement au RFC et au PCFT, les FR sont exprimés

sur une population restreinte de cellules et permettent l’internalisation des folates par un

processus d’endocytose non canonique. Le récepteur FRγ, quant à lui, est dépourvu du signal

entrainant l’ajout de l’ancre GPI. Il s’agit donc d’une protéine constitutivement secrétée. Des

formes solubles de FRα et FRβ, obtenues suite au clivage des formes membranaires ont

également été rapportées dans les fluides extracellulaires (lait maternel, liquide céphalorachidien,

urine...) mais leur rôle reste encore largement méconnu. Dans le lait maternel, ces récepteurs

solubles pourraient faciliter l’internalisation des folates en liant la vitamine pour la protéger de

l’oxydation, pour en faciliter l’absorption intestinale par le nouveau-né ou pour éviter leur

utilisation par des bactéries, (Colman et al., 1981 ; Mason et Selhub, 1988 ; Birn et al., 2005).

Les FR solubles sont également étudiés comme marqueurs sérologiques pour le diagnostic de

tumeurs exprimant cette protéine, leur taux dans le sérum normal étant généralement très bas

(Cheung et al., 2016).

Les isoformes du récepteur de l’acide folique sont exprimées de manière différentielle en

fonction des tissus (Tableau 1). Ces profils d’expression résulteraient principalement de


23

modifications transcriptionnelles et post-transcriptionnelles (épissage alternatif, stabilité des

transcrits, etc., Elnakat and Ratnam, 2004).

a) Le récepteur membranaire FRα

Dans les tissus sains, le récepteur FRα présente une expression restreinte à une variété de

cellules épithéliales polarisées dans lesquelles il est le plus souvent localisé à la face apicale où il

n’est alors pas en contact avec les folates circulants. Il a ainsi été décrit au niveau des tubules

proximaux du rein, du plexus choroïde, des trompes de Fallope, de l’utérus, de l’ovaire, de

l’épididyme, des cellules acineuses du sein, des glandes salivaires sous-maxilaires, des glandes

bronchiques, des pneumocytes de types I et II et au niveau du trophoblaste dans le placenta

(Weitman et al., 1992 ; Ledermann et al., 2015 ; Cheung et al., 2016). En 2000, Chancy et al.

montrent que la forme FRα est également retrouvée dans les cellules pigmentaires de la rétine,

mais elle est cette fois adressée à la face basolatérale de la membrane.

Compte tenu du faible niveau d’expression des FR et de leur localisation à la face apicale

des cellules épithéliales où ils ne sont pas en contact avec les folates circulants, le rôle

physiologique de ces protéines n’est pas toujours évident. Cependant, il a été décrit qu’au niveau

du rein, FRα permet la récupération des folates filtrés par le glomérule et excrétés dans l’urine

primaire (Selhub et al., 1987). Au niveau du plexus choroïde, il est indispensable au maintien

d’une concentration suffisante de folates au sein du liquide céphalorachidien (Serrano et al.,

2012) et au niveau du placenta, il participe au transfert des folates maternels au fœtus (Solanky et

al., 2010).

b) Le récepteur membranaire FRβ

Alors que FRα est principalement exprimé sur les cellules épithéliales, FRβ n’est retrouvé

de manière significative dans les tissus normaux qu’au niveau du placenta et sur certaines

cellules hématopoïétiques, où il peut être considéré comme un marqueur de différenciation de

l’hématopoïèse normale. Son expression est alors restreinte à certaines cellules de la lignée

myélomonocytaire : FRβ est retrouvé à de faibles niveaux sur les monocytes de la moelle

osseuse et du sang périphérique et à des niveaux plus importants sur les neutrophiles matures et

les monocytes/macrophages activés (Ross et al., 1999). Dans ces cellules myélomonocytaires,


24

FRβ est incapable de lier les folates et sa fonction demeure inconnue (Reddy et al., 1999 ; Puig-

Kröger et al., 2009).

c) Le récepteur soluble FRγ

Le récepteur FRγ est une protéine dépourvue de signal permettant son association à la

membrane via une ancre GPI. Elle est donc constitutivement secrétée. L’ARNm de cette protéine

a été détecté par analyse PCR (Polymerase Chain Reaction) dans des cellules hématopoïétiques

saines et malignes présentes dans la rate et le thymus, ainsi que dans les carcinomes ovariens,

cervicaux et utérins (Salazar and Ratnam, 2007). Cette protéine difficilement détectable pourrait,

tout comme les formes solubles de FRα et FRβ, servir à stabiliser les folates extracellulaires

(Elnakat and Ratnam, 2004).

Le gène FOLR3 codant la protéine FRγ est polymorphique. Il présente une version mutée

par délétion de deux nucléotides qui aboutit à l’apparition prématurée d’un codon stop. Il en

résulte une protéine tronquée dont la taille n’est plus que de 104 acides aminés (contre 243

acides aminés pour la protéine non mutée) et qui est alors notée FRγ’ (Shen et al., 1994).

Contrairement à la forme native de la protéine, la forme mutée est incapable de lier les folates,

mais aucun trouble n’est à ce jour associé à ce phénotype (Elnakat and Ratnam, 2004 ; Salazar

and Ratnam, 2007).

d) Le récepteur membranaire FRδ (JUNO)

La recherche d’homologie de séquence au sein du génome humain montre la présence de

quatre gènes distincts de récepteurs de l’acide folique sur le chromosome 11. Le quatrième gène

FOLR4 code une protéine FRδ de 27,7 kDa qui, jusqu’à récemment, n’avait été identifiée que

chez la souris sur une certaine catégorie de lymphocytes T régulateurs (Yamaguchi et al., 2007).

Au cours des deux dernières années, plusieurs équipes ont montré la présence de la protéine FRδ

à la membrane d’ovocyte de plusieurs espèces de mammifères, dont l’homme (Bianchi et al.,

2014 ; Aydin et al., 2016). Associée à la membrane par une ancre GPI mais incapable de lier les

folates, la protéine FRδ permet en réalité la reconnaissance de IZUMO1, une protéine exprimée

par les spermatozoïdes. L’interaction de ces deux protéines est une étape indispensable à la

fécondation puisque les souris n’exprimant pas ces gènes sont stériles (Aydin et al., 2016).


25

Compte tenu de son expression préférentielle et du rôle essentiel qu’elle joue dans la

fécondation, la protéine FRδ a été renommée en 2014 « JUNO », du nom romain de la déesse de

la fécondité.

3. Transport des folates et recyclage de FRα et FRβ

Le transport des folates par les récepteurs FR fait intervenir un mécanisme d’endocytose

non classique appelé potocytose et impliquant les cavéoles (Sabharanjak and Mayor, 2004 ;

Cheung et al., 2016). Suite à la liaison du ligand sur son récepteur, la membrane plasmique

s’invagine et forme une vésicule qui va ensuite fusionner avec des ensodomes et des lysosomes.

Ces fusions permettent l’acidification du milieu vésiculaire et, à un pH de 5, les folates sont

libérés de leur récepteur et transférés vers le cytoplasme par un mécanisme encore inconnu

(Zwicke et al., 2012). Les récepteurs FR sont alors recyclés vers la membrane en quelques

minutes (Sabharanjak et Mayor, 2004 ; Figure 10).

4. Physiopathologies liées au récepteur FRα

a) Déficit de Transport Cérébral des Folates

Comme présenté précédemment, les folates sont impliqués dans de nombreux processus

biologiques majeurs. Au niveau de la barrière hémato-encéphalique, les folates sont transportés

du sang vers le liquide céphalo-rachidien via un mécanisme qui n’est pas encore complètement

élucidé mais qui implique le récepteur FRα (Grapp et al., 2012). Le déficit de transport cérébral

des folates est responsable d’un syndrome neurodégénératif progressif infantile qui se déclenche

dans les quatre à six premiers mois de l’enfant. Il est associé à des mutations au sein du gène

FOLR1 ou à la présence d’anticorps dirigés contre ce récepteur. Ce défaut de FR est caractérisé

par des concentrations fortement réduites de folates dans le liquide céphalo-rachidien et se

traduit, chez l’enfant, par un ensemble de symptômes neurologiques (régression psychomotrice,

épilepsie, autisme, etc. Grapp et al., 2012). Dans la plupart des cas, un traitement par de l’acide

folinique permet d’augmenter la concentration de folates dans le liquide céphalo-rachidien et

d’améliorer significativement la condition du patient (Gordon, 2009).


26

b) Expression de FRα dans le cancer

Régulation du gène FOLR1

La présence ou la surexpression de FRα dans les tissus cancéreux est un phénomène

largement décrit dans la littérature scientifique (pour revues : Elnakat and Ratnam, 2004 ; Xia

and Low, 2010 ; Vergote et al., 2015). Cependant, les mécanismes permettant l’augmentation de

l’expression de FR dans les cellules malignes restent encore obscurs. Souvent, la surexpression

de FOLR1 résulterait de l’amplification du gène, situé sur le chromosome 11q13.3, une zone

décrite comme instable génétiquement (Gibcus et al., 2006). A titre d’exemple, dans les cancers

ovariens, l’amplification du gène FOLR1 est retrouvée dans environ 33 % des prélèvements

analysés (Siu et al., 2012). Des mutations activatrices et des mécanismes épigénétiques

pourraient également être impliqués dans la régulation de l’expression de FOLR1 mais les

données disponibles à ce jour ne permettent pas l’établissement de conclusion (Kelemen, 2006 ;

Vergote et al., 2015).

D’autres facteurs ont également été décrits comme pouvant influencer l’expression du

gène FOLR1. In vitro, il a été montré dans des cellules tumorales que le niveau d’expression de

FRα pourrait être régulé par la concentration extracellulaire en folates du milieu de culture

(Kelemen, 2006). Dans les cellules cultivées dans un milieu déplété en acide folique,

l’expression de FRα serait augmentée. La concentration en folate pourrait entrainer des

variations de régulations transcriptionnelle et post-transcriptionnelle, notamment en modulant la

demi-vie de l’ARNm de FOLR1 (Sadasivan et al., 2002). Ces données sont en accord avec une

autre étude montrant in vitro que l’accumulation d’homocystéine, marquant une déficience

intracellulaire en folate, serait accompagnée d’une augmentation de l’expression de FRα (Antony

et al., 2004).

Par ailleurs, la régulation du gène FOLR1 pourrait également être influencée par

différentes hormones stéroïdiennes. Dans les cellules souches embryonnaires murines, il a été

décrit que l’acide rétinoïque pouvait induire une augmentation du taux d’ARNm du gène FOLR1

(Bolton et al., 1999). Dans les cellules tumorales, les glucocorticoïdes entrainent une

augmentation de l’expression des récepteurs à l’acide folique in vitro et in vivo (Tran et al.,

2005). A l’inverse, les œstrogènes comme l’œstradiol réprimeraient l’expression de FRα dans

différentes lignées de cancers ovariens et cervicaux (Kelley et al., 2003).

Tissus Quantité moyenne de FR (pmoles)/mg de protéine

Expression importante (%)

Expression intermédiaire (%)

Expression négligeable (%)

n

Ovarien Carcinome séreux Carcinome Endométrioïde Carcinome mucineux Métastase Normal

34,31 ± 22,87 15,66 ± 9,26 1,83 ± 1,19 46,36 ± 49,68 1,54 ± 1

100 100 / 100 /

/ / 36 / 25

/ / 64 / 75

7 4 14 4 12

Endomètre Carcinome primaire Métastase Normal

9,32 ± 18,10 8,17 0,95 ± 0,5

20 100 /

20 / /

60 / 100

10 1 7

Sein Carcinome primaire Normal

7,44 ± 5,83 3,99 ± 1,68

43 50

40 60

14 20

7 5

Pancréas Carcinome primaire Métastase Normal

3,56 ± 2,28 8,78 2,43 ± 1,80

10 100 /

60 / 40

30 / 60

10 1 5

Lymphome Carcinome primaire Métastase

1,94 ± 1,77 4,16 ± 2,64

/ 50

12 /

88 50

8 2

Cerveau Carcinome primaire Normal

4,51 ± 6,15 0,32 ± 0,30

25 /

25 /

50 100

4 3

Tableau 2. Niveaux d’expression du récepteur FR (α et β) dans différents tissus humains,

normaux et cancéreux. Les taux de FR ont été obtenus par un test de « binding » d’acide folique

radiomarqué (d’après Parker et al., 2005).


27

Rôles des FR dans le cancer

Bien que souvent associée à un critère d’agressivité, le rôle de la surexpression de cette

protéine n’est pas clairement établi. En plus de son rôle de transporteur de folates, de récentes

études montrent qu’in vitro, FRα pourrait exercer des fonctions de signalisation cellulaire dans

certains cancers. Après liaison à son ligand et internalisation, il serait transloqué vers le noyau où

il agirait comme facteur de transcription et stimulerait l’expression de gènes impliqués dans la

division cellulaire, l’angiogenèse et le processus de métastase (Boshnjaku et al., 2012 ; Hansen

et al., 2015). Cependant, des données supplémentaires sont nécessaires pour comprendre les

conséquences physiologiques de cette découverte.

Expression de FRα en fonction du type de cancer

Compte tenu de son profil d’expression physiologique, FRα est retrouvé dans de

nombreuses tumeurs d’origine épithéliale (Elnakat et Ratnam, 2004 ; Parker et al., 2005 ;

Cheung et al., 2016). Bien que Xia et Low décrivent un nombre moyen de 1 à 3 millions de

récepteurs FRα par cellule (Xia and Low, 2010), le niveau d’expression des FR semble variable

d’un type de cancer à un autre (Tableau 2 ; Parker et al., 2005). Ainsi, FRα est régulièrement

surexprimé dans les cancers gynécologiques (ovaire et endomètre), dans certains cancers

mammaires et cérébraux. D’autres études montrent que FRα est également surexprimé dans de

nombreux cancers pulmonaires (Iwakiri et al., 2008, O’Shannessy et al., 2012). La plupart des

études concernant le développement de médicament ciblant le récepteur FRα sont aujourd’hui

principalement menées pour lutter contre les cancers gynécologiques, mammaires et

pulmonaires.

FRα dans les cancers ovariens. Alors que 80 à 90 % des cancers ovariens présentent une

surexpression de FRα, le niveau d’expression de cette protéine a été corrélé avec le stade et le

grade de la tumeur (O’Shannessy et al., 2013). L’expression de FRα dans les cancers ovariens

est considérée comme un critère d’agressivité de la maladie, et au moins pour les cancers

d’origine séreuse, est associée à un mauvais pronostic (Chen et al., 2012).

FRα dans les cancers mammaires. Le récepteur FRα est surexprimé dans 75 % des cancers

mammaires double-négatifs (pas d’expression des récepteurs aux œstrogènes et à la

progestérone) et dans les cancers triple-négatifs (pas d’expression des récepteurs aux œstrogènes,


28

des récepteurs à la progestérone et des récepteurs HER2 pour Human Epidermal Growth Factor

Receptor-2). Ces derniers représentent un faible pourcentage des cancers mammaires mais se

caractérisent par leur agressivité, leur propension à former des métastases et la forte mortalité

qu’ils entrainent. De la même manière que les cancers ovariens, le taux d’expression de FRα

dans les cancers mammaires est corrélé au stade et au grade de la maladie ainsi qu’aux chances

de survie des patients (Hartmann et al., 2007 ; Zhang et al., 2014).

FRα dans les cancers pulmonaires. FRα est surexprimé dans 70 % des mésothéliomes pleuraux,

mais aucune corrélation n’est pour l’instant établie entre le niveau d’expression du récepteur et le

pronostic de survie du patient (Cheung et al., 2016). Associés à un mauvais pronostic, les

cancers du poumon non à petites cellules représentent entre 75 et 80 % des cancers pulmonaires

et expriment souvent de forts niveaux de FRα. De manière surprenante, l’expression de FRα

dans les cancers pulmonaires est associée à des tumeurs précoces dont les cellules sont bien

différenciées. Contrairement aux cancers ovariens et mammaires, et sans que cette différence soit

à ce jour expliquée, l’expression de FRα dans les cancers pulmonaires est corrélée à un meilleur

pronostic de survie des patients (Iwakiri et al., 2008).

5. Physiopathologies liées au récepteur FRβ

A cause de l’absence d’outils moléculaires efficaces, l’expression de FRβ dans les tissus

pathologiques est nettement moins étudiée que celle de FRα. Cependant, ce récepteur a été

identifié dans différents macrophages pathologiques et dans certaines cellules leucémiques où il

est alors surexprimé. De plus, et contrairement aux FRβ exprimés dans les cellules saines, les

FRβ retrouvés sur les macrophages pathologiques et sur les cellules leucémiques sont

fonctionnels et capables de lier l’acide folique (Nakashima-Matsushita et al., 1999 ; Pan et al.,

2002). Ces différences fonctionnelles seraient liées à des différences de modifications post-

traductionnelles qui restent encore aujourd’hui à identifier (Elnakat and Ratnam, 2004).


29

a) FRβ dans les macrophages pathologiques.

Dans les maladies inflammatoires auto-immunes.

Les macrophages activés surexprimant le récepteur FRβ jouent un rôle important dans la

physiopathologie de maladies auto-immunes inflammatoires (Danks et al., 2002 ; Jager et al.,

2012). C’est notamment le cas dans l’arthrite rhumatoïde où le récepteur FRβ est surexprimé par

des macrophages synoviaux. Ces macrophages produisent des médiateurs pro-inflammatoires qui

peuvent altérer les tissus sains environnant mais également recruter davantage de cellules

inflammatoires (Varghese et al., 2014). Puisque ces cellules participent à la pathogénèse de la

maladie, le récepteur FRβ peut être exploité pour délivrer spécifiquement un agent thérapeutique

à ces macrophages (Nakashima-Matsushita et al., 1999).

Dans le microenvironnement tumoral

Le microenvironnement tumoral contient de nombreuses cellules non transformées

comme des fibroblastes et des adipocytes ainsi que de nombreuses cellules immunitaires telles

que les macrophages (Pollard, 2004). Une des caractéristiques principales des macrophages

réside dans leur plasticité phénotypique. En réponse à différents signaux environnementaux, ils

peuvent acquérir des phénotypes et des fonctions opposés. Alors que les macrophages de type

M1 présentent une activité pro-inflammatoire et des fonctions antitumorales (Cook and

Hagemann, 2013), les macrophages de type M2 sont caractérisés par une faible capacité de

présentation d’antigènes, par une production importante de cytokines immunosuppressives

(IL10) et participent à la résolution de l’inflammation et la réparation tissulaire (Galdiero et al.,

2013). En produisant des facteurs tels que le TGFβ (transforming growth factor) et des

chimiokines comme la CCL2, les tumeurs reprogramment les macrophages présents dans leur

microenvironnement (Josephs et al., 2015). Ces macrophages, appelés TAM pour Tumor-

Associated Macrophages présentent alors un phénotype pathologique « M2-like » et soutiennent

la croissance et la dispersion des cellules tumorales notamment en sécrétant des facteurs de

croissance, des métalloprotéases et des facteurs pro-angiogéniques (Nagai et al., 2009). Une

récente étude montre que les TAM présents dans la plupart des cancers surexpriment le récepteur

FRβ (Shen et al., 2015). De plus, cette étude établit une forte corrélation entre le pourcentage de

cellules exprimant FRβ et le stade de développement du cancer.


30

b) FRβ des cellules leucémiques

En conditions physiologiques, le récepteurs FRβ est un marqueur de différenciation de la

lignée myélomonocytaire. Comme pour FRα, son profil d’expression dans les tissus cancéreux

est lié à celui des tissus sains. Ainsi, il est surexprimé dans certaines hémopathies malignes,

comme par exemple dans les leucémies myéloïdes chroniques et dans 70% des leucémies

myéloïdes aiguës (Ross et al., 1999 ; Pan et al., 2002 ; Clarhaut et al., 2013).

Pour résumer, les récepteurs FRα et FRβ présentent des profils d’expression restreints à

quelques cellules saines. Dans certaines cellules cancéreuses, ces récepteurs sont surexprimés et

sont capables de lier avec une forte affinité (Km < 1 nM) et d’entrainer l’internalisation de

l’acide folique et de ses dérivés chimiques. Ces propriétés font des récepteurs à l’acide folique

des marqueurs tumoraux de choix pour le développement de molécules vectorisées dérivées de

l’acide folique. Le chapitre suivant n’a pas pour vocation de dresser une liste exhaustive des

molécules dérivées de l’acide folique en cours de développement, mais de présenter les plus

innovantes ou les plus avancées.

Figure 11. (A)Structure de la molécule développée par van Dam et al. et composée d’acide folique et de

fluorescéine isothiocyanate. (B) Image en couleurs (gauche) et de la fluorescence (droite) émise par une

tumeur ovarienne exprimant FRα au cours d’une chirurgie (van Dam et al., 2011).

1ere Partie – Etat de l’art 4e Chapitre – Vectorisation et ciblage par l’acide folique

31

4E CHAPITRE

Vectorisation et ciblage par l’acide folique

I. LES VECTEURS DE L’ACIDE FOLIQUE POUR L’IMAGERIE

MEDICALE

A. GENERALITES

L’interaction entre les récepteurs de l’acide folique et leur ligand peut être exploitée pour

le développement d’outils d’imagerie médicale. Les sondes moléculaires couplées à l’acide

folique permettent la localisation et l’identification non invasive de tumeurs solides exprimant

les récepteurs FR par exemple à l’aide des imageries optique, à résonance magnétique (IRM), ou

par ultrasons, ou encore par de la tomodensitométrie, de la tomographie par émission

monophotonique (TEMP) et de la tomographie par émission de positons (TEP ; Zwicke et al.,

2012). Plusieurs molécules vectorisées ont alors été imaginées telles que des boites quantiques

(« quantum dots »), des dendrimères ou des nanoparticules d’oxyde de fer supermagnétiques

couplés à l’acide folique pour un usage en IRM (Konda et al., 2000 ; Yang et al., 2009 ; Meier et

al., 2010). L’acide folique peut également être conjugué à des agents fluorescents dans le cadre

d’une aide à la chirurgie, les qualités optiques des molécules fluorescentes nécessitant une

chirurgie pour l’obtention d’une image (Sega et Low, 2008). Ainsi, en 2011, van Dam et al.

testent pour la première fois chez l’homme l’utilisation d’un conjugué d’acide folique et de

fluorescéine isothiocyanate pour l’aide à la résection par chirurgie de tissus tumoraux (Figure

11).

Les molécules conçues pour l’imagerie peuvent parfois également remplir une fonction

thérapeutique, on parle alors d’outils théranostiques. C’est par exemple le cas des nanoparticules

d’or couplées à l’acide folique qui, utilisées comme agents de contraste, peuvent également être

Figure 12. (A) Etarfolatide (99mTc-EC20, Folcepri®, développé par Endocyte). Dans

l’Etarfolatide, le ligand de ciblage (acide folique) est lié directement par liaison covalente à un

motif chélateur de l’agent d’imagerie, le technétium 99m (99mTc). (B) Image en tomographie par

émission monophotonique montrant l’Etarfolatide s’accumulant dans les tumeurs ovariennes

exprimant les récepteurs FR (FR-positive lesion) mais pas dans celles n’exprimant pas cette

protéine (FR-negative lesion). D’après Vergote et al., 2015.


32

chauffées à l’aide d’une lumière pulsée intense pour la réduction thermique de la tumeur

(Zwicke et al., 2012).

B. EXEMPLE DE L’ETARFOLATIDE

Une des molécules vectorisées dont le développement est le plus avancé est l’Etarfolatide

(Folcepri®, développé par Endocyte), aussi appelé 99mTc-EC20 (Vergote et al., 2015). C’est un

agent d’imagerie radioactif composé d’une molécule d’acide folique liée de manière covalente à

un chélateur de radionucléide, le technétium (99mTc) et conçu pour le diagnostic par TEMP de

tumeurs primaires et métastatiques exprimant les FR (Figure 12A ; Leamon et al., 2002).

L’Etarfolatide a été évalué comme « compagnon » de son homologue thérapeutique (Vintafolide,

Vynfinit®, EC145, développé par Endocyte) dans plusieurs essais cliniques de phase 2 chez des

patients atteints de cancers avancés de l’ovaire, du péritoine, de l’endomètre et du poumon (essai

clinique n°NCT00507741 ; source « clinicaltrials.gov »). Ces études ont établi une corrélation

entre l’expression des FR et l’internalisation du 99mTc-EC20 (Figure 12B). Ainsi, l’utilisation de

ce type d’agent d’imagerie permet de prédire de manière non invasive l’efficacité des thérapies

ciblant les FR sur la base de l’analyse en imagerie de l’incorporation du 99mTc-EC20 (Morris et

al., 2014).


33

II. DES VECTEURS DE L’ACIDE FOLIQUE A VISEE

THERAPEUTIQUE

A. GENERALITES

Compte tenu de leurs propriétés particulières, les FR apparaissent comme des cibles de

choix pour l’adressage aux cellules tumorales de molécules anticancéreuses et éviter ainsi des

effets secondaires sur le reste des cellules saines de l’organisme. Bien que beaucoup soient

encore à des stades précoces de développement, une grande variété de molécules vectorisées et

dérivées de l’acide folique ont été imaginées. Ainsi, l’acide folique peut, entre autre, être ajouté à

la surface de nanoparticules virales, de liposomes et de micelles pour l’adressage d’agents

anticancéreux aux cellules malignes (Xia et Low, 2010) ou de petits ARN interférants et

oligodesoxyribonucléotides antisens pour abolir ou moduler l’expression d’un gène (Rettig et

Behlke, 2012).

L’acide folique peut également être lié directement et de manière covalente à des

principes actifs tels que des haptènes, des motifs hautement immunogéniques reconnus par un

organisme comme étrangers. Après une série de vaccination par injection de l’haptène seul (par

exemple l’haptène de la fluorescéine) et de différentes cytokines stimulatrices du système

immunitaire, le conjugué haptène-acide folique est administré aux patients pour « décorer » la

tumeur et l’éliminer suite au recrutement du système immunitaire via les anticorps anti-haptènes

(Lu et al., 2004). Cette stratégie fut testée jusqu’en phase 2, notamment pour le traitement des

carcinomes à cellules rénales mais les résultats de cette étude n’ont, pour l’instant pas encore été

publiés.

Dans d’autres molécules, l’acide folique est conjugué à des agents anticancéreux utilisés

en chimiothérapie traditionnelle et connus pour leurs propriétés cytotoxiques. Les deux

molécules sont alors reliées par un espaceur qui doit être stable dans la circulation sanguine,

mais être clivable suite à un stimulus extérieur pour permettre la libération de l’agent

anticancéreux actif.

Figure 13. (A) Structure et représentation schématique du Vintafolide (Vergote and Leamon,

2015). (B) Après liaison au récepteur FR, le Vintafolide est internalisé dans la cellule cancéreuse

par endocytose. Au sein de l’endosome, le système disulfide est réduit, aboutissant à la libération

de la vinblastine. L’agent anticancéreux peut alors exercer son activité et entrainer la mort de la

cellule.


34

B. EXEMPLE DU VINTAFOLIDE

Une des molécules emblématiques du ciblage des FR est le Vintafolide (Vynfinit®,

EC145, développé par Endocyte). Ce vecteur est composé d’une molécule d’acide folique et

d’un dérivé de vinblastine, un agent anticancéreux de la famille des vinca-alcaloïdes. Ces deux

éléments sont reliés par un espaceur peptidique et un système disulfide réductible et

autoimmolable (Figure 13A). Le Vintafolide agit comme un cheval de Troie moléculaire : suite à

l’interaction entre le ligand de ciblage et son récepteur, le complexe récepteur-vecteur est

internalisé par endocytose dans la cellule tumorale. Au sein de l’endosome, le système disulfide

est réduit, permettant la libération de l’agent anticancéreux (indépendamment de la libération du

vecteur de son récepteur) et peut exercer son activité cytotoxique. Une fois le récepteur libéré de

son ligand, il est recyclé à la membrane et permet un nouveau cycle (Figure 13B).

Le Vintafolide fut développé et testé conjointement avec l’Etarfolatide décrit plus haut

(voir page 32), l’internalisation de ce dernier permettant d’estimer l’expression tumorale des

récepteurs FR. Plusieurs études cliniques de phases 2 et 3 ont alors été menées chez des patients

atteints de cancers pulmonaires ou ovariens respectivement. Les études de phase 2 menées pour

le traitement des cancers ovariens (essai clinique n°NCT00507741, source « clinicaltrials.gov »)

et pulmonaires (essai clinique n°NCT00511482, source « clinicaltrials.gov ») dans lesquelles le

Vintafolide est utilisé en monothérapie montrent une amélioration du contrôle de la maladie et

une survie globale plus importante chez les patients dont la tumeur présente une forte expression

comparée aux patients dont le niveau de FR tumoral est moindre ou nul (Morris et al., 2014 ;

Vergote et Leamon, 2015). Cependant, malgré les résultats encourageants obtenus au cours

d’une autre étude de phase 2 (essai clinique n°NCT00722592, source « clinicaltrials.gov »)

menées sur 162 femmes atteintes de cancer ovarien et traitées avec du Doxil® seul (un liposome

contenant de la doxorubicine) ou en combinaison avec le Vintafolide, l’étude de phase 3 (essai

clinique n°NCT01170650, source « clinicaltrials.gov ») qui suivit fut annulée au cours du

recrutement de patients. En effet, les données préliminaires obtenues au début de l’étude ont été

jugées statistiquement insuffisantes pour justifier la poursuite de cette phase 3 (Cheung et al.,

2016).

Quoiqu’il en soit, malgré le fait que les molécules présentées ci-dessus n’aient pas atteint

tous les objectifs souhaités, l’étude conjointe chez l’homme de l’Etarfolatide et du Vintafolide a

amené de précieuses informations concernant le ciblage des récepteurs de l’acide folique dans le


35

cadre des chimiothérapies vectorisées. Par exemple, l’étude exploratoire des résultats obtenus

montre que les meilleures réponses cliniques sont obtenues chez les patients dont les lésions

tumorales expriment un fort taux de récepteurs FR. De plus, au cours de ces essais cliniques,

aucun effet supplémentaire dû au Vintafolide n’a pu être observé, les effets indésirables

constatés étant classiquement imputés à la vinblastine elle-même ou au Doxil. En effet, les reins

exprimant des niveaux non négligeables de récepteurs FRα, l’absence de néphro-toxicité

observée au cours de ces études est une étape encourageant la viabilité et l’amélioration des

molécules anticancéreuses ciblant les récepteurs FR.

2E PARTIE

OBJECTIFS DE LA THESE

2e Partie – Objectifs de la thèse

5e Chapitre – Contexte scientifique & travaux antérieurs

36

5E CHAPITRE

Contexte scientifique & travaux antérieurs

Mes travaux de thèse ont été menés en étroite collaboration avec le groupe « Système

Moléculaires Programmés » dirigée par le Pr Papot (UMR-CNRS 7285). Cette équipe travaille

depuis plusieurs années sur le développement de conjugués d’agents anticancéreux, notamment

dérivés de l’acide folique. J’ai rejoint les thématiques du laboratoire en 2012 au cours de mes

stages de master. Deux vecteurs anticancéreux avaient alors été développés par le groupe du Pr

Papot (Thomas et al., 2011 ; Legigan et al., 2012). Ce sont des assemblages moléculaires

complexes dans lesquels une molécule de principe actif (doxorubicine ou Monométhyl

Auristatine E) est reliée via un espaceur central autoimmolable développé par le groupe

(Demande française n° 1053921 - Demande internationale n° PCT/IB2011/052184) à une

molécule d’acide folique et à une gâchette enzymatique galactosylée (Figure 14A). Une fois

internalisée dans la cellule cible, la gâchette enzymatique est hydrolysée par les β-galactosidases,

des enzymes présentes dans les lysosomes des cellules saines et malignes et qui sont notamment

impliquées dans la transformation du galactose en glucose pour la glycolyse. L’activation de la

gâchette galactosylée permet la décomposition spontanée de l’espaceur central et la libération du

principe actif (Figure 14B). Etant à l’origine de mes travaux de thèse, ces deux vecteurs font

l’objet d’une brève description dans les parties suivantes.

Figure 14. (A) Représentation schématique des vecteurs dérivés de la doxorubicine ou de la

MMAE. (B) Suite à sa liaison au récepteur FR, le vecteur est internalisé dans la cellule tumorale

par endocytose. Au sein du lysosome, les β-galactosidases clivent la gâchette enzymatique (en

vert). L’espaceur autoimmolable se décompose libérant l’agent anticancéreux qui peut alors

exercer ses fonctions cytotoxiques. Le récepteur FR, quant à lui, est recyclé à la membrane de la

cellule.



37

I. SYNTHESE ET VALIDATION D’UN VECTEUR DERIVE DE

LA DOXORUBICINE

Le vecteur DGAF (Doxorubicine-Galactoside-Acide Folique) est un conjugué de

doxorubicine, un agent anticancéreux de la famille des anthracyclines qui s’intercale entre les

brins d’ADN et inhibe la topoisomérase II (Figure 15A, Thomas et al., 2011). La doxorubicine

est régulièrement utilisée dans le traitement de différents cancers solides et circulants (Yang et

al., 2014).

Après validation de la stabilité de ce composé à 37 °C dans du PBS ou du sérum bovin, la

libération de la doxorubicine suite au clivage de la gâchette enzymatique a été suivie par

chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) après ajout de β-galactosidase

bovine ou bactérienne (Figure 15B). Le composé a ensuite été testé sur deux lignées tumorales,

les cellules HeLa (cancer du col de l’utérus) qui expriment les récepteurs FR et les cellules A549

(cancer du poumon) qui ne les expriment pas.

En plus de la cytotoxicité qu’elle entraine, la doxorubicine présente une fluorescence

intrinsèque (longueurs d’onde d’excitation/d’émission : 488/590 nm) permettant de suivre par

microscopie confocale l’internalisation du composé DGAF dans les cellules (Figure 16). Alors

que la doxorubicine libre pénètre passivement dans les cellules HeLa et A549, le vecteur DGAF

n’est présent que dans les cellules HeLa. Pour démontrer le rôle des FR dans l’internalisation du

DGAF, une compétition avec de l’acide folique libre a été mise en place. Dans les cellules HeLa,

cette compétition empêche l’internalisation du vecteur. En contrôle, les cellules ont été traitées

avec le composé Dox-gal qui ne contient pas l’élément de ciblage des cellules. Ce composé Dox-

gal ne pénètre dans aucune des deux lignées, témoignant ainsi de l’internalisation spécifique du

vecteur DGAF via les FR. Ces résultats ont ensuite été confirmés par vidéo-microscopie

confocale.

L’activité antiproliférative du vecteur DGAF vis-à-vis des cellules HeLa et A549 a

également été évaluée (Figure 17). Après trois jours de traitement, alors que la doxorubicine

entraine une toxicité à la fois dans les cellules HeLa et A549 (IC50 = 52 nM et 190 nM,

respectivement), le vecteur DGAF ne présente une activité antitumorale que dans les cellules

exprimant les FR, avec une efficacité du même ordre de grandeur que la molécule libre (IC50 =

220 nM).

Figure 15. (A) Structure du vecteur DGAF, composé d’un ligand de ciblage (acide folique, en

orange), d’un agent anticancéreux (doxorubicine, en rouge) et d’une gâchette enzymatique

(galactoside, en vert). Ces trois éléments sont articulés autour d’un espaceur central auto-

immolable (en bleu). (B) Hydrolyse du vecteur DGAF en présence de β-galactosidase suivie par

HPLC. Après ajout de la β-galactosidase, le vecteur DGAF disparait au profit de l’apparition

d’un intermédiaire réactionnel et de la doxorubicine.

Figure 16. Etude par microscopie confocale de l’internalisation de la doxorubicine (longueurs

d’onde d’excitation/d’émission : 488/590 nm). Les cellules HeLa et A549 ont été traitées

pendant 2 heures avec 10 µM de doxorubicine, de vecteur DGAF, de vecteur DGAF en présence

d’acide folique (AF, 1 mM) ou avec le vecteur ne contenant pas l’élément de ciblage appelé

Dox-gal. Images représentatives de 2 expériences, barres d’échelle : 50 µm.

Figure 17. Mesure par test XTT de la viabilité des cellules HeLa et A549 traitées pendant 4

jours avec de la doxorubicine libre ou le vecteur monomérique DGAF. Pour les cellules A549, la

toxicité du vecteur en présence de β-galactosidase exogène a également été déterminée.

Moyennes ± s.e.m. (erreur standard sur la moyenne) de 3 expériences.



38

L’ensemble de ces résultats témoigne de l’activité hautement spécifique du vecteur

DGAF vis-à-vis des cellules cancéreuses exprimant les récepteurs FR. La présence de la gâchette

galactosylée, activable uniquement en intracellulaire, est un grand avantage puisqu’elle devrait

empêcher la libération prématurée du principe actif dans la circulation sanguine ou les tissus non

ciblés.

II. SYNTHESE DU VECTEUR DERIVE DE LA MMAE

Suite à la validation du composé DGAF, les chimistes du groupe ont entrepris la synthèse

d’un composé dérivé d’un des agents anticancéreux les plus puissants existant à ce jour : la

MMAE, une molécule appartenant à la famille des vinca-alcaloïdes qui se fixe au niveau des

microtubules et bloque ainsi la division cellulaire. Le vecteur développé est alors appelé MGAF

pour MMAE-Galactoside-Acide Folique (Figure 18 ; Legigan et al., 2012).

Après synthèse et purification du composé, l’efficacité du vecteur MGAF a été évaluée in

vitro sur différentes lignées cellulaires : les cellules KB, qui expriment fortement les récepteurs

FR, les cellules HeLa, dont l’expression est moindre et les cellules A549 qui ne les expriment

pas. Alors que les trois lignées cellulaires sont sensibles à l’activité antiproliférative de la

MMAE, seules les cellules KB et HeLa sont affectées par le vecteur MGAF (Tableau 3). Ainsi,

après trois jours de traitement, le vecteur MGAF présente une efficacité égale à celle de la

MMAE libre sur les cellules KB (IC50 de 0,240 nM) alors que la toxicité entrainée sur les

cellules HeLa est plus faible (IC50 = 8,408 nM). Ces différences d’efficacité peuvent être la

conséquence de niveaux d’expression de FR différents dans les deux lignées.

A cause de l’hétérogénéité génétique régnant au sein d’une tumeur, certaines cellules

malignes peuvent échapper à l’action du vecteur, notamment parce qu’elles expriment peu ou

pas le marqueur ciblé. Une activation enzymatique efficace au sein des cellules tumorales

exprimant les récepteurs FR pourrait permettre la libération de suffisamment de MMAE pour

éradiquer les cellules cancéreuses voisines dont l’expression du marqueur ciblé est moindre.

Pour tester cette hypothèse, une expérience de coculture en chambre de Boyden a été réalisée

(Figure 19). Les cellules A549 ont été cultivées seules ou co-cultivées avec des cellules KB ou

Figure 18. Structure du vecteur MGAF composé d’un ligand de ciblage : l’acide folique (en

orange), d’un agent anticancéreux : la MMAE (en rouge) et d’une gâchette enzymatique de type

galactoside (en vert). Ces trois éléments sont articulés autour d’un espaceur central auto-

immolable (en bleu).

IC50 (nM)

Cellules Expression FOLR1 MMAE MGAF

KB +++ 0,240 0,240

HeLa ++ 0,630 8,408

A549 - 0,872 195,230

Tableau 3. Niveaux relatifs de l’expression du gène FOLR1 mesurés par PCR quantitative en

temps réel (RT-qPCR) dans les cellules KB, HeLa et A549 et toxicité induite par la MMAE libre

ou le vecteur MGAF dans chacune des lignées après 3 jours de traitement.

Figure 19. Viabilité des cellules A549 cultivées seules (en blan) en chambre de Boyden

(Polytéréphtalate d'éthylène, 0,4 μM pore size, BD Biosciences), ou cocultivées avec des cellules

KB (en orange) ou des cellules A549 (en gris). Les cellules ont été traitées pendant 3 jours avec

5 ou 10 nM de MMAE ou de MGAF. La viabilité des cellules A549 a ensuite été mesurée par

XTT après retrait du compartiment supérieur.

Figure 20. (A) et (B) Suivi par bioluminescence de la croissance tumorale. Des xénogreffes de

tumeurs KB ont été implantées par voie sous-cutanées à des souris nude Balb/c mâles. Les

animaux ont alors reçu par voie intraveineuse une injection 0,1 mg/kg de MMAE libre les jours

4, 7, 10 14 et 17 ou bien une injection de 5 mg/kg de MGAF les jours 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19, 21,

23 et 26. La croissance des tumeurs a été déterminée par la bioluminescence émise par les

cellules tumorales suite à l’administration de 100 mg/kg de d-luciferin. (C) La survie des

animaux au cours de l’étude a également été rapportée.



39

A549. Cette expérience a mis en évidence que l’activation du vecteur MGAF au sein des cellules

KB libérait suffisamment de MMAE pour tuer les cellules A549 co-cultivées.

Enfin, l’efficacité du vecteur MGAF a été évaluée in vivo sur des souris nude auxquelles

des xénogreffes de cellules KB ont été implantées par voie sous-cutanée. Les animaux ont

ensuite été traités par voie intraveineuse trois fois par semaine avec 0,1 mg/kg de MMAE libre

ou avec 5 mg/kg de MGAF. La croissance tumorale a alors été suivie par bioluminescence

(Figure 20A et B). Comparé au groupe de souris non traitées, la MMAE utilisée à 0,1 mg/kg ne

permet que de limiter modérément la croissance tumorale. Une dose supérieure de MMAE a

également été testée (0,5 mg/kg), mais celle-ci était responsable d’une perte de poids chez

l’animal empêchant la poursuite de l’étude. Le vecteur MGAF, quant à lui, entraine une

diminution durable et presque totale de la tumeur au 21e jour, ce qui se traduit par une meilleure

survie des animaux (Figure 20C). Par ailleurs, aucune toxicité du composé n’a pu être détectée

sur les organes des souris au cours de cette étude.



Figure 21. (A) Expression des gènes FOLR1 et FOLR2 mesurée par RT-qPCR dans les lignées

leucémiques KG-1 et HL60. Moyennes ± s.e.m. de 3 expériences. (B) Mesure par test XTT de la

viabilité des cellules KG-1 et HL60 traitées pendant 4 jours avec de la doxorubicine libre, le

vecteur DGAF, ou le vecteur ne contenant pas l’élément de ciblage et noté Dox-gal. Moyennes ±

s.e.m. de 5 expériences.



40

III. TRANSFERT DU CONCEPT SUR CELLULES DE

PATIENTS

Les travaux antérieurs à mon arrivée au laboratoire ont abouti à la synthèse des deux

vecteurs anticancéreux présentés ci-desus et dérivés de la doxorubicine ou de la MMAE. J’ai

rejoint le laboratoire lors d’une étude complémentaire sur l’activité antitumorale ex vivo du

vecteur DGAF. Les résultats obtenus au cours de cette étude ont permis de déterminer les

objectifs de mon sujet de thèse et ont donné lieu à la publication de mon premier article dont

voici la référence :

A galactosidase-responsive doxorubicin-folate conjugate for selective

targeting of acute myelogenous leukemia blasts.

Clarhaut J., Fraineau S., Guilhot J., Péraudeau E., Tranoy-Opalinski I., Thomas M., Renoux B.,

Randriamalala E., Bois P., Chatelier A., Monvoisin A., Cronier L., Papot S., Guilhot F.

Leukemia Research, 2013, 37, 948-955.

Puisque les récepteurs FRβ, codés par le gène FOLR2 sont exprimés dans plus de 70 %

des Leucémies Aigües Myéloblastiques (LAM, Ross et al., 1999), et que les anthracyclines telles

que la doxorubicine sont encore régulièrement utilisées pour le traitement de patients atteints de

cette pathologie, nous avons évalué l’efficacité thérapeutique du vecteur DGAF sur deux lignées

de cellules leucémiques exprimant les récepteurs FRβ : les cellules KG-1 et HL60 (Figure 21A).

Pour ces lignées, le vecteur DGAF présente des IC50 de 200 nM et 300 nM après quatre jours de

traitement, respectivement (Figure 21B). Comme démontrées précédemment, l’internalisation et

l’activation du conjugué sont dépendantes de l’interaction des récepteurs membranaires FR avec

leur ligand, puisque le composé Dox-gal ne contenant pas l’acide folique ne présente pas de

toxicité.

Dans un second temps, le vecteur DGAF a été évalué sur des cellules leucémiques isolées

à partir de la moelle osseuse de 31 patients atteints de LAM. Pour cela, deux groupes de patients

ont d’abord été élaborés selon leur niveau d’expression du gène FOLR2. En effet, ce gène est

Figure 22. (A) Expression du gène FOLR2 mesurée par RT-qPCR dans les blastes issus de

patients atteints de différents types de LAM. (B) Les cellules leucémiques des patients atteints de

LAM de type 0, 1 ou 2 expriment plus faiblement le gène FOLR2 que les cellules malignes des

patients atteints de LAM de type 3, 4, 5 et 7. (C) Pour chaque patient, l’internalisation du vecteur

DGAF a été mesurée par cytométrie en flux dans des lymphocytes (n’exprimant par les FR) et

dans les cellules leucémiques. Pour cela, les cellules ont été traitées 3 heures avec 10 µM de

DGAF. (D) L’internalisation du vecteur DGAF dans les cellules leucémiques traitées pendant 3

heures avec 10 µM de DGAF est corrélée à leur niveau d’expression du gène FOLR2 (Spearman

p = 0,0025).



41

exprimé à des niveaux inégaux selon le sous-type de LAM dont est atteint le patient (Figure

22A). Ainsi, le premier groupe comprend les patients atteints de LAM de type M0, M1 et M2

dont les cellules malignes expriment faiblement le gène FOLR2, avec une valeur médiane de

0,0012 % de GAPDH (Figure 22B). Le second groupe est composé des patients atteints de LAM

de type M3, M4, M5 et M7 dont les blastes ont un niveau d’expression du récepteur FRβ plus

important (médiane : 0,0129 % de GAPDH).

Par la suite, le taux d’internalisation du vecteur DGAF dans les blastes et les lymphocytes

des patients de chaque groupe a été mesuré par cytométrie en flux (Figure 22C). Dans les deux

groupes de patients, et après trois heures de traitement avec 10 µM du composé, le vecteur

DGAF n’est internalisé que dans les cellules leucémiques. Les lymphocytes n’exprimant pas les

récepteurs de l’acide folique, ces résultats démontrent la spécificité de l’internalisation du

composé dans les cellules ciblées.

Par ailleurs, les données individuelles obtenues pour les patients atteints de LAM de type

M0, M1 et M2 montrent que les seuls blastes ayant internalisé le vecteur DGAF sont ceux dont

l’expression de FOLR2 est la plus importante. Avec le raisonnement inverse, les blastes des

patients du second groupe qui internalisent le moins le vecteur sont ceux dont l’expression du

gène FOLR2 est la plus faible.

L’ensemble de ces résultats démontre la spécificité et l’efficacité antitumorale du vecteur

DGAF sur des cellules leucémiques de patients. De plus, au cours de cette étude, nous avons pu

démontrer une forte corrélation entre le niveau d’expression du récepteur FRβ et le taux

d’internalisation du vecteur DGAF (Spearman p = 0,0025 ; Figure 22D). Le niveau d’expression

des récepteurs FR apparait alors comme une information importante dans l’élaboration du

protocole de soins du patient puisqu’il pourrait permettre de prédire l’efficacité des thérapies

ciblant ce marqueur.

Figure 23. (A). Pour optimiser le ciblage des récepteurs à l’acide folique, une première approche

consiste à développer des vecteurs permettant la libération de deux molécules d’agents

anticancéreux avec un nombre de récepteurs FR constant. (B) La seconde approche consiste à

identifier un moyen d’augmenter l’expression du marqueur ciblé, soit les récepteurs FR à la

surface des cellules tumorales.


6e Chapitre – Objectifs des travaux de thèse

42

6E CHAPITRE

Objectifs des travaux de thèse

Les résultats obtenus au cours des évaluations in vitro et ex vivo des vecteurs MGAF et

DGAF indiquent que leur efficacité est dépendante du niveau de récepteurs FR exprimés par les

cellules cancéreuses. Les travaux d’autres groupes parus ultérieurement viennent confirmer cette

hypothèse. Par exemple, lors du développement clinique de l’Etarfolatide, Morris et al. ont

montré une relation entre l’internalisation de cet agent et le taux de récepteurs FR exprimés par

les tumeurs des patients (voir page 32 ; Morris et al., 2014). Ainsi, le niveau d’expression des

récepteurs FR d’une tumeur est un facteur prédictif de l’efficacité des thérapies vectorisées

dérivées de l’acide folique et permet la sélection des patients susceptibles de bénéficier au mieux

de ce type de thérapies.

L’objectif principal de ma thèse a alors été d’optimiser le ciblage des récepteurs FR en

permettant l’internalisation de plus d’agent anticancéreux dans les cellules malignes. Pour cela,

deux approches ont été envisagées. La première approche repose sur la modification chimique

des vecteurs DGAF et MGAF afin de permettre la libération de deux molécules anticancéreuses

(Figure 23A). Deux vecteurs homodimères permettant le transport et la libération de deux

molécules de doxorubicine ou de MMAE ont alors été synthétisés par les chimistes de l’équipe

du Pr Papot. J’ai ensuite réalisé leur évaluation biologique : les vecteurs diDoxorubicine-

Galactoside-Acide folique (diDGAF) et diMMAE-Galactoside-Acide folique (diMGAF) ont été

testés sur différentes lignées cellulaires et/ou sur des cellules malignes de patients et leur

efficacité comparée à celle des vecteurs monomériques correspondants.

En parallèle de l’étude de ces deux vecteurs, une seconde approche a été abordée. Elle

consiste à augmenter le taux de récepteurs FR présents à la surface des cellules cancéreuses afin

d’améliorer l’internalisation d’un conjugué dérivé de l’acide folique dans ces cellules (Figure

23B). Les gènes codant les récepteurs FRα et FRβ présentent des organisations et des

mécanismes de régulation différents. Compte tenu du nombre important de données cliniques

disponibles pour le ciblage du récepteur FRα, c’est sur la stimulation de l’expression de cette


6e Chapitre – Objectifs des travaux de thèse

43

isoforme que s’est focalisé mon travail. Cet axe, qui a représenté la plus grande partie de ma

thèse, s’est articulé autour de trois étapes principales : 1/ détermination des paramètres

(concentrations, durées des traitements, etc.) permettant la stimulation de l’expression du gène

FOLR1 par un mélange d’activateurs transcriptionnels; 2/ démonstration in vivo que ce mélange

est capable d’agir comme un adjuvant d’un vecteur anticancéreux dérivé de l’acide folique en

augmentant son internalisation dans les cellules malignes et 3/ identification des mécanismes

permettant l’augmentation d’efficacité du vecteur en présence du mélange adjuvant.

D’autre part, au cours de ma thèse, j’ai eu l’occasion de travailler sur d’autres types de

ciblage des tumeurs. Ces études, menées en collaboration avec différentes équipes, ont donné

lieu à la publication de plusieurs articles et seront décrites succinctement dans une partie intitulée

« Travaux collaboratifs » située page 98.

3E PARTIE

MATERIELS &

METHODES

3e Partie – Matériels & Méthodes

44

I. CULTURE CELLULAIRE

A. MODELES CELLULAIRES

Les lignées cellulaires utilisées au cours de mes différents travaux de thèse ainsi que leurs

caractéristiques principales sont répertoriées dans le tableau 4. Les lignées tumorales A2780,

A549, HeLa et SKOV-3 proviennent de chez Sigma-Aldrich (European Collection of

Authenticated Cell Cultures). Les cellules cancéreuses KB ont été achetées chez LGC Standards

(American Type culture Collection) et les cellules saines HUVEC chez Lonza. Les cellules

épithéliales bronchiques immortalisées 16HBE14o- ont été généreusement fournies par Sandra

Mirval (CNRS ERL 7368). Enfin les cellules cancéreuses MDA-MB-231-luciférase et MIA-

PaCa-2-luciférase ont été fournies par le Centre d’Imagerie du Petit Animal (CIPA) d’Orléans

(CNRS – TAAM UPS44).

B. DECONGELATION, ENTRETIEN, CONGELATION

1. Décongélation des cellules

Les cellules sont stockées dans l’azote liquide à -196°C. Les cellules sont rapidement

décongelées dans 15 mL de milieu de culture approprié (Tableau 4) puis centrifugées 7 minutes à

1000 rpm (rotations par minute). Après resuspension du culot dans du milieu de culture, les

cellules sont distribuées en boite de Pétri et placées en atmosphère humide dans un incubateur à

37°C et 5% de CO2 pendant au moins 24 heures. Le milieu de culture est remplacé le lendemain.

2. Entretien des cellules

Les cellules saines 16HBE et toutes les cellules cancéreuses sont cultivées dans du RPMI

1640 + GlutaMAXTM (Gibco) dans lequel ont été rajoutés 10% de sérum de veau fœtal (SVF ;

PAN Biotech) et 1% de pénicilline/streptomycine (PS ; Gibco). Les cellules HUVEC sont

cultivées dans du milieu EGM™-2 BulletKit™ composé d’Endothelial cell Basal Medium-2

Cellules tumorales

Nom de la lignée Fournisseur Origine Tissu d’origine Morphologie Milieu de culture

A2780 Sigma-Aldrich (ECACC) Humaine Ovaire Epithéliale RPMI 1640 (Invitrogen)

A549 Sigma-Aldrich (ECACC) Humaine Poumon Epithéliale RPMI 1640 (Invitrogen)

HeLa Sigma-Aldrich (ECACC) Humaine Col de l’utérus Epithéliale RPMI 1640 (Invitrogen)

KB/KB* LGC Standards (ATCC) Humaine Tête et cou Epithéliale RPMI 1640 (Invitrogen)

MDA-MB-231-luc* CIPA Orléans Humaine Sein Epithéliale RPMI 1640 (Invitrogen)

MIA-PaCa-2-luc* CIPA Orléans Humaine Pancréas Epithéliale RPMI 1640 (Invitrogen)

SKOV-3 Sigma-Aldrich (ECACC) Humaine Ovaire Epithéliale RPMI 1640 (Invitrogen)

Cellules saines

Nom de la lignée Fournisseur Origine Tissu d’origine Morphologie Milieu de culture

16HBE14o- CNRS ERL 7368 Humaine Poumon Epithéliale RPMI 1640 (Invitrogen)

HUVEC Lonza Humaine Cordon ombilical Endothéliale EGMTM-2 BulleKitTM

Tableau 4. Récapitulatif des lignées cellulaires utilisées et de leurs principales caractéristiques. *Les cellules ont été transfectées avec un

plasmide contenant le gène de la luciférase. ECACC : European Collection of Authenticated Cell Cultures ; ATCC : American Type Culture

Collection ; RPMI : Roswell Park Memorial Institute ; CIPA : Centre d’Imagerie du Petit Animal (CNRS – TAAM UPS44, Orléans) ; EGM :

Endothelial Growth Medium.


45

(EBM-2 ; Lonza) et d’EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors (SVF, hydrocortisone,

hFGF, VEGF, R3-IGF, acide ascorbique, hEGF et gentamicine/amphotericine-B; Lonza).

Lorsqu’elles arrivent à 80% de confluence, les cellules sont décrochées avec de la

trypsine à 0,25% contenant 0,9 mM d’acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA (Gibco) puis

centrifugées 7 minutes à 1000 rpm. Après comptage sur cellule de Malassez, les cellules sont

ensemencées à la concentration souhaitée dans le milieu adéquat et placées en atmosphère

humide dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2. Les cellules sont utilisées sur environ 10

passages afin d’éviter leur dérive.

3. Congélation des cellules

Afin de stocker les cellules à long terme, celles-ci sont décrochées à l’aide de trypsine

(0,25 %) - EDTA puis centrifugées 7 minutes à 1000 rpm. Le culot cellulaire est resuspendu

dans un mélange contenant le milieu adapté à la lignée cellulaire, 20% de SVF, 1% de PS et 5%

de DMSO (VWR), un agent cryoprotecteur. Les cellules sont placées provisoirement à -80°C

dans une boite de congélation (CoolCell® LX, de Biocision) permettant une diminution de la

température d’1 °C par minute. Les cellules sont transférées à l’azote liquide le lendemain.


46

II. ETUDE DE CYTOTOXICITE

A. MESURE DE LA VIABILITE CELLULAIRE

1. Principe

Afin de déterminer la toxicité entrainée par une molécule, la viabilité des cellules est

mesurée à l’aide du kit Cell Proliferation Kit II, XTT (Roche). Il s’agit d’un test basé sur la

réduction de sels de tétrazolium (XTT) en un composé de couleur orange, le formazan dont la

densité optique peut être déterminée par spectrophotométrie à 490 nm. La réduction des sels de

tétrazolium en formazan étant assurée par les déhydrogénases mitochondriales, cette conversion

ne se produit que dans les cellules métaboliquement actives. Ainsi, la quantité de formazan

formé est proportionnelle au nombre de cellules vivantes.

2. Protocole

Pour réaliser ce test, les cellules sont ensemencées en plaque 96 puits et incubées 24

heures en atmosphère humide dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2. Après traitement des

cellules avec les composés à tester, 25 µL du mélange réactionnel constituant le XTT sont

ajoutés dans chaque puits. Les cellules sont alors incubées 4 heures supplémentaires à 37°C et

5% de CO2 pour permettre la formation de la réaction colorimétrique puis la densité optique du

formazan est mesurée par spectrophotométrie à 490 nm sur un lecteur de plaque (Mithras

LB940TM, Berthold ou Multiskan Go, Thermo Scientific). Chaque expérience est réalisée en

triplicat et reproduite au minimum trois fois.

Pour chaque expérience, la valeur moyenne des absorbances de chaque triplicat est

calculée. La valeur moyenne obtenue pour le puits ne contenant que du milieu (« blanc », soit

sans cellule) est retranchée à l’ensemble des autres valeurs moyennes. Les résultats sont

exprimés en pourcentage de viabilité et normalisés par rapport aux cellules non traitées,

considérées comme étant à 100% de viabilité.


47

B. MESURE DE LA PROLIFERATION CELLULAIRE

1. Principe

La prolifération des cellules est déterminée en suivant l’incorporation de

bromodéoxyuridine (BrdU) à l’aide du kit Cell Proliferation ELISA, BrdU Colorimetric (Roche).

C’est un test colorimétrique reposant sur le dosage de BrdU, un analogue de la thymidine qui est

incorporé au sein de l’ADN nouvellement synthétisé dans les cellules en prolifération. La

quantité de BrdU incorporé est alors proportionnelle au nombre de cellules ayant subi une

division.

2. Protocole

Pour réaliser ce test, les cellules sont ensemencées en plaque 96 puits et incubées 24

heures en atmosphère humide dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2 avant l’ajout des

composés à tester. Vingt-quatre heures avant la fin du traitement des cellules, 10 µM de BrdU

(concentration finale) sont ajoutés dans chaque puits. Après la fin du traitement, le milieu de

culture est retiré puis les cellules sont fixées et l’ADN dénaturé par ajout de 200 µL de la

solution de fixation fournie dans le kit. Après 30 minutes à température ambiante, cette solution

est retirée et 100 µL d’anticorps anti-BrdU couplés à la péroxydase (dilués au 1:100 dans la

solution de dilution fournie dans le kit) sont ajoutés dans chaque puits et incubés pendant 90

minutes à température ambiante. Après 3 lavages avec 200 µL de solution de lavage, 100 µL de

tétraméthyl-benzidine (substrat de la péroxydase) sont ajoutés dans chaque puits et incubés à

température ambiante et à l’obscurité pendant 15 minutes, puis l’action de la peroxydase est

stoppée par ajout de 25 µL d’acide sulfurique 2N dans chaque puits. Après 1 minute

d’incubation, l’absorbance du produit formé suite à l’action de la péroxydase est déterminée par

spectrophotométrie à 450 nm sur un lecteur de plaque (Mithras LB940TM, Berthold ou

Multiskan Go, Thermo Scientific). Cette absorbance est proportionnelle au nombre de cellules

ayant incorporé le BrdU, soit au nombre de cellules ayant subi une division.

Cette expérience est réalisée au minimum trois fois en duplicat. Pour chaque expérience,

la valeur moyenne des absorbances de chaque duplicat est déterminée. La valeur moyenne

obtenue pour le puits ne contenant que du milieu (« blanc », soit sans cellule) est retranchée à

Cellules marquées Hoechst 33342

λex/λem = 350/461 nm

Annexine V – FITC


Ethidium homodimère III


Saines + - -

En apoptose + + -

En apoptose tardive + - +/-

Nécrotiques + + +

Tableau 5. Marquage des cellules par le kit Apoptotic / Necrotic / Healthy Cells Detection Kit

(PromoKine). λ : longueur d’onde, FITC : Isothiocyanate de fluorescéine. Les cellules saines ne

sont marquées que par le Hoechst 33342, une sonde nucléique perméable aux membranes

cellulaires. A cause du « switch » des phoshatidylsérines du feuillet membranaire interne au

feuillet membranaire externe qui se produit dans les étapes précoces de l’apoptose, les cellules

apoptotiques sont marquées par l’Annexine V-FITC et par le Hoechst 33342. L’éthidium

homodimère III est une sonde nucléique imperméable aux membranes cellulaires qui marque

alors les cellules en apoptose tardive et les cellules nécrotiques. Enfin, les cellules en nécrose

sont reconnues par chacun des trois marqueurs.


48

l’ensemble des autres valeurs moyennes. Les résultats sont exprimés en pourcentage de

prolifération et normalisés par rapport aux cellules non traitées, considérées comme étant à 100%

de viabilité.

C. MESURE DE L’APOPTOSE

1. Principe

L’apoptose des cellules est déterminée par cytométrie en flux à l’aide du kit

Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit (PromoKine) qui contient trois marqueurs :

l’Annexin V, L’éthidium homodimère III et le Hoechst 33342. Le Hoechst 33342 (longueur

d’onde d’excitation/d’émission = 350/461 nm) est une sonde nucléique perméable aux

membranes cellulaires qui émet une fluorescence lorsqu’elle est fixée à de l’ADN. Le Hoechst

33342 marque alors l’ensemble des cellules. L’Annexine V, qui est ici couplée à l’isothiocyanate

de fluorescéine (FITC ; longueur d’onde d’excitation/d’émission = 492/514 nm), lie avec une

forte affinité les phosphatidylsérines qui sont transloquées du feuillet membranaire interne au

feuillet membranaire externe au cours des premières étapes de l’apoptose. L’Annexine V-FITC

identifie donc les cellules en apoptose. Enfin, l’éthidium homodimère III (EthD-III ; longueur

d’onde d’excitation/d’émission = 528/617 nm) est une sonde nucléique qui est, contrairement au

Hoechst 33342, imperméable aux membranes des cellules vivantes et apoptotiques. Il marque

alors les cellules nécrotiques ou en apoptose tardive (Tableau 5).

2. Protocole

Pour réaliser ce test, les cellules adhérentes sont décrochées à l’aide de Versene (Gibco)

et mises en commun avec le milieu de culture des cellules qui aura été conservé. Après

centrifugation 10 minutes à 1100 rpm les cellules sont resuspendues dans 1 mL de PBS

(Phosphate Buffered Saline) puis 150 µL de cette suspension cellulaire sont prélevés afin d’être à

nouveau centrifugés 5 minutes à 1000 rpm. Le culot cellulaire est alors repris dans 100 µL de

tampon fourni dans le kit (contient du calcium permettant la liaison de l’Annexine V aux

phosphatidylsérines) auxquels sont rajoutés 5 µL de Hoechst 33342, 5 µL d’Annexine V-FITC et

5 µL d’EthD-III. Après 15 minutes d’incubation à température ambiante et à l’obscurité, les


49

cellules sont diluées dans 400 µL supplémentaires du même tampon et analysées en fonction de

leur marquage par cytométrie en flux (cytomètre Analyseur BD FACS Verse). Pour chaque

échantillon, 3×104 événements sont comptés sur une population de cellules sélectionnées pour

exclure les débris et les agrégats cellulaires.

Chaque expérience est réalisée au minimum trois fois en uniplicat. Cette expérience

permet de comptabiliser le nombre de cellules vivantes, apoptotiques ou nécrotiques présentes

dans un échantillon. Les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules totales.

D. TEST DE MORPHOGENESE SUR MATRIGEL®

Le test de morphogenèse est un test basé sur la capacité des cellules endothéliales à

former spontanément un réseau de tubules lorsqu’elles sont ensemencées sur une matrice telle

que le Matrigel®. Ce test est particulièrement indiqué pour étudier les capacités pro- ou anti-

angiogéniques d’une molécule.

Pour ce test, les puits d’une plaque 48 puits sont recouverts avec 250 µL de Matrigel®

complet (Corning). Après 4 heures d’incubation en atmosphère humide dans un incubateur à

37°C et 5% de CO2, 5×104 cellules HUVEC sont déposées dans chaque puits, dans 500 µl de

milieu EGM-2 (Lonza) supplémenté ou non de la molécule à tester. Après 16 heures en

atmosphère humide dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2, le milieu de culture est

délicatement retiré et les cellules sont incubées 30 minutes avec 25 µM de Calcein AM

(longueur d’onde d’excitation/d’émission = 514/520 nm ; Sigma-Aldrich). Les structures

capillaires sont ensuite fixées pendant 45 minutes avec une solution de formaldéhyde à 2%.

Après deux lavages au PBS, les structures capillaires sont photographiées à l’aide d’un

macroscope (MacroView MVX10 Olympus).

Chaque expérience est réalisée en uniplicat et reproduite au minimum trois fois. La

capacité des cellules endothéliales à former un réseau vasculaire est déterminée à l’aide du

logiciel AngioQuant en mesurant la longueur des tubules formés par les cellules et en comptant

le nombre d’intersections formées entre ces tubules.


50

III. MESURE DE L’EXPRESSION D’UN GENE PAR

REACTION EN CHAINE PAR POLYMERASE

L’expression d’un gène peut être déterminée en mesurant le niveau d’expression de

l’ARN messager (ARNm) correspondant. Pour cela, les cellules sont lysées et le contenu

cellulaire est récupéré. Les ARN totaux sont isolés puis transcrits en ADN complémentaire

(ADNc) par une réaction de transcription inverse employant des amorces dont les séquences sont

aléatoires afin de s’hybrider sur tous les ARN. La quantification de l’ARNm d’intérêt est ensuite

réalisée par une réaction en chaine par polymérisation (PCR, Polymerase Chain Reaction) qui

elle, n’emploie que les amorces spécifiques des gènes étudiés. L’expression d’un gène d’intérêt

est alors mesurée par comparaison d’un gène dit de ménage, c’est-à-dire un gène dont

l’expression n’est pas influencée par le traitement appliqué aux cellules, et notée en pourcentage

d’expression de ce gène.

A. EXTRACTION DES ARN TOTAUX

1. A l’aide du kit Promega

Les ARN totaux sont extraits à l’aide du kit SV Total RNA Isolation System (Promega),

selon les instructions fournies par le fabricant. Pour cela, 1,5×103 à 5×106 cellules ou jusqu’à 30

mg de tissu sont lysés dans 175 µL de tampon de lyse contenu dans le kit et auquel du β-

mercaptoéthanol a préalablement été ajouté. Ce lysat cellulaire est dilué dans 350 µL de tampon

de dilution et placé 3 minutes à 70°C pour permettre la compaction des acides nucléiques. Après

centrifugation 10 minutes à 12 000 rpm, le surnagent débarrassé des débris cellulaires est

mélangé à 200 µL d’éthanol 95% puis déposé sur une colonne contenant une membrane de silice

avant d’être à nouveau centrifugé pendant 1 minute à 12 000 rpm. Cette membrane de silice

présente une charge positive et retient les éléments de charges opposés contenus dans le lysat

cellulaire comme par exemple les acides nucléiques. Après deux lavages avec un tampon

éthanolique fourni dans le kit, la membrane est incubée 30 minutes à température ambiante en

présence d’un mélange contenant de la DNase I, une enzyme permettant la dégradation de

l’ADN pour ne conserver que l’ARN sur la membrane. L’activité de cette enzyme est ensuite


51

stoppée par 200 µL de « DNase Stop Solution ». Après centrifugation d’une minute à 12 000

rpm suivie de deux lavages, les ARN sont élués dans 100 µL d’eau pure sans nucléase, puis

stockés à – 80°C.

2. A l’aide du kit Macherey-Nagel

Les ARN totaux sont extraits à l’aide du kit NucleoSpin® RNA (Macherey-Nagel), selon

les recommandations du fabricant. Pour cela, jusqu’à 30 mg de tissu ou 5×106 cellules sont lysés

dans 350 µL de tampon de lyse contenant du β-mercaptoéthanol puis les débris cellulaires sont

éliminés à l’aide d’un filtre fourni dans le kit. Après centrifugation d’une minute à 12 000 rpm,

350 µL d’éthanol 70 % sont ajoutés au lysat cellulaire. Ce mélange est ensuite déposé sur une

membrane de silice puis centrifugé 30 secondes à 12 000 rpm. La membrane est ensuite

débarrassée des sels qu’elle contient et qui diminuent l’efficacité de la DNase, par ajout de 350

µL de la solution adaptée contenue dans le kit. Après centrifugation d’une minute à 12 000 rpm,

95 µL d’un mélange contenant de la DNase sont ajoutés sur la menbrane et incubés entre 30

minutes à température ambiante. Après inactivation de l’enzyme avec 200 µL du tampon appelé

« RAW2 », la membrane est lavée deux fois avec le tampon de lavage. Les ARN sont alors élués

dans 60 µL d’eau pure sans nucléase puis stockés à -80°C.

3. Extraction d’ARN sur de petites quantités de cellules

Lorsque la quantité de cellules disponibles (maximum 1×105 cellules) pour l’extraction

d’ARN est faible (par exemple pour les cellules HUVEC), un troisième kit d’extraction est

utilisé, le kit NucleoSpin® RNA XS (Macherey-Nagel). Pour cela, les cellules sont lysées dans

100 µL de tampon de lyse du kit auquel 2 µL de TCEP, un agent réducteur, ont été

préalablement ajoutés. Les ARN sont ensuite stabilisés par 5 µL de «Carrier RNA ». Le lysat est

alors filtré comme précédemment puis 100 µL d’éthanol à 70% sont ajoutés au filtrat obtenu. Le

mélange est déposé sur une membrane de silice et centrifugé 30 secondes à 12 000 rpm. Les sels

contenus sur la membrane sont élués avec 100 µL de la solution fournie par le kit à cet effet puis

25 µL d’une solution contenant la DNase sont ajoutés. La membrane est incubée 15 minutes à

température ambiante avant d’inactiver l’enzyme avec 100 µL de tampon d’inactivation. Après

deux lavages, les ARN sont élués dans 10 µL d’eau pure sans nucléase et stockés à -80°C.


52

B. QUALITE ET DOSAGE DES ARN TOTAUX

La qualité des ARN extraits est vérifiée par migration sur un gel contenant 1% d’agarose

d’une fraction de l’éluat obtenu mélangée à du bromure d’éthidium ou du Midori Green

Advanced DNA stain (Nippon Genetics Europe). La concentration en ARN de l’échantillon est

déterminée par spectrophotométrie à 260 nm (Multiskan Go, Thermo Scientific). La pureté de

l’échantillon est estimée par mesure des densités optiques (DO) à 230 et 260 nm. Conformément

aux fiches techniques des kits d’extraction d’ARN, il a été vérifié que les rapports

DO260nm/DO280nm (contamination protéique) et DO260nm/DO230nm (autres contaminations) étaient

compris entre 1,7 et 2,1 dans le premier cas et 1,8 et 2,2 dans le second.

C. TRANSCRIPTION INVERSE DES ARN

1. A l’aide du kit Invitrogen

Pour la transcription inverse des ARN en ADNc, le kit SuperScript® II Reverse

Transcriptase (Invitrogen) est utilisé. Pour cela, 1,5 à 2 µg d’ARN totaux sont incubés pendant 5

minutes à 70°C avec 1,4 µg d’amorces de séquence aléatoire (volume total 12,3 µL, complété

avec de l’eau pure). Après hybridation des amorces sur les matrices d’ARN, leur élongation est

permise en ajoutant au mélange 1 µL de dithiothréitol (0,1 M), 1 µL de

désoxyribonucléotides (dNTP, 10 mM), 4 µL de tampon (250 mM Tris-HCl, 375 mM KCl, 15

mM MgCl2, pH = 8,3) et 0,7 µL de transcriptase inverse (200 unités/µL). Le mélange est alors

incubé à 25°C pendant 10 minutes, à 42°C pendant 50 minutes et enfin à 95°C pendant 15

minutes. Les ADNc obtenus sont stockés à -20°C.

2. A l’aide du kit Quanta

Pour la transcription inverse des ARN, un second kit peut également être utilisé : le

qScriptTM cDNA synthesis Kit (Quanta). Contrairement au kit précédent, il ne contient qu’une

seule étape dans laquelle 1 à 1,5 µg d’ARN sont mélangés à 4 µL du mélange réactionnel

(amorces de séquence aléatoire, dNTP et constituants nécessaires au fonctionnement de

Nom Espèce reconnue Amorces sens Amorces antisens

hFOLR1 Humaine 5’-AGCACCACAAGGAAAAGCCAGG-3’ 5’-GTGCCATCTCTCCACAGTGGTT-3’

hFOLR2 Humaine 5’-CCACTTCATCCAGGACACCTGT-3’ 5’-CATCCAGGAAGCGTTCTTTGCG-3’

hFOLR3 Humaine 5’-CTACACCTGCAAAAGCAACTGGC-3’ 5’-GGAAGTAGGACTCAAAGGTGCTG-3’

hFOLR4 Humaine 5’-TGTCGGAAGCACTTCATCCAGG-3’ 5’-CGGCACATTCACAACTCGCTCT-3’

mFOLR1 Murine 5’-GGACTGAACTTCTCAATGTCTGC-3’ 5’-CTTCCTGGCTTGTGTTCGTGGA-3’

mFOLR2 Murine 5’-CTGACCTAGGGAGAGGCCAA-3’ 5’-TGTCTGTTTCCAGGCCATGT -3’

GAPDH Humaine/murine 5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’ 5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’

hPCFT Humaine 5’-CCTTTGCCACTATCACGCCTCT-3’ 5’-ACCAGCTTGGAGAGTTTAGCCC-3’

hRFC Humaine 5’-CTTTGCCACCATCGTCAAGACC-3’ 5’-GGACAGGATCAGGAAGTACACG-3’

Tableau 6. Liste des amorces utilisées pour l’étape de RT-qPCR. Pour chaque couple d’amorces, l’amplification unique et spécifique du gène

d’intérêt a été vérifiée.


53

l’enzyme) et à 1 µL d’enzyme. Le volume total, qui doit être de 20 µL est complété avec de l’eau

pure. Le mélange obtenu est alors placé à 22°C pendant 5 minutes, à 42°C pendant 30 minutes et

à 85°C pendant 5 minutes. Les ADNc obtenus sont stockés à -20°C.

D. PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL

1. Principe

L’expression d’un gène peut être évaluée en réalisant une PCR quantitative en temps réel

(RT-qPCR). Pour réaliser cette technique, on peut utiliser des agents comme le SYBR Green qui

émettent une fluorescence lorsqu’ils sont liés à des acides nucléiques double brins. La RT-qPCR

consiste alors à mesurer, à chaque cycle de PCR effectué, la fluorescence émise par l’échantillon,

représentative de la quantité d’ADN amplifiée.

2. Protocole

La sensibilité de la RT-qPCR autorise l’utilisation de petites quantités de réactifs. Ainsi,

dans les puits d’une plaque optique à 96 puits (Applied Biosystems) 2,5 µL d’ADNc (dilués au

1/10e dans de l’eau pure) sont mélangés à 5 µL de réactif SYBRGreen (Applied Biosystems), 2,4

µL d’eau, 0,05 µL d’amorces sens (25 µM) et 0,05 µL d’amorces antisens (25 µM). Pour vérifier

la pureté du mélange réactionnel, un puits dans lequel l’ADNc est remplacé par de l’eau est

également réalisé (« blanc »). Les échantillons sont alors placés dans l’appareil GeneAmp 7500

Sequence Detection System (Applied Biosystems) où, après 10 minutes de dénaturation à 95°C,

ils subissent 40 cycles d’amplification (15 secondes à 95°C puis 1 minute à 60°C).

Chaque expérience est réalisée en duplicat et est répétée au minimum trois fois. Les

séquences des amorces utilisées pour cette technique sont répertoriées dans le tableau 6. La

qualité et la spécificité d’amplification ont été vérifiées pour chaque couple d’amorces.

Figure 24. Exemple de courbe obtenue par RT-qPCR. Le Ct, ou cycle seuil correspond au

nombre de cycles de PCR nécessaire pour que la fluorescence émise par un échantillon atteigne

une valeur seuil, fixée dans la partie inférieure de la phase linéaire de la courbe. L’expression

d’un gène peut alors être déterminée par l’expression suivante : % gène de ménage = 100×2-(Ct du

gène d’intérêt – Ct du gène de ménage).


54

3. Analyse des résultats

Le cycle threshold (Ct), ou cycle seuil, correspond au nombre de cycles nécessaires à

l’échantillon pour atteindre une valeur seuil, définie au-dessus de la ligne de base correspondant

au bruit de fond, lorsque l’amplification de l’échantillon entre en phase exponentielle. Ainsi,

moins il y a de matériel génétique dans l’échantillon au début de la réaction, plus il faut de cycle

à cet échantillon pour atteindre la valeur seuil fixée et donc, plus le Ct est élevé (Figure 24). En

calculant la différence de Ct (∆Ct) entre un gène d’intérêt et un gène de ménage, il est alors

possible de réaliser une normalisation des résultats. Il s’agit donc d’une expression relative,

exprimée en pourcentage d’expression du gène de ménage et qui peut être déterminée par le

calcul suivant : % 𝑒𝑥𝑝𝑟𝑒𝑠𝑠𝑖𝑜𝑛 𝑔è𝑛𝑒 𝑑𝑒 𝑚é𝑛𝑎𝑔𝑒 = 100 × 2−∆𝐶𝑡.

IV. ETUDE DE L’EXPRESSION ET DE LA LOCALISATION

D’UNE PROTEINE

A. ETUDE DE L’EXPRESSION PAR WESTERN BLOT

Le niveau d’expression d’une protéine peut être étudié par Western blot. Pour cela, les

cellules sont lysées sur glace dans 100 µL d’un tampon non réducteur (Tris-HCl 10 mM, NaCl

150 mM, Triton X-100 1%, NP-40 0,5%, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, sodium orthovanadate

100 mM, pH = 7,4). La concentration protéique de l’échantillon est déterminée à l’aide du kit

DC protein assay (Bio-Rad) consistant en un dosage colorimétrique qui suit un protocole

amélioré à partir de celui de Lowry. Les lysats sont conservés à -20°C.

Les protéines sont séparées par électrophorèse, à l’aide du système XCell SureLock Mini-

Cell (Invitrogen). Pour cela, une fraction du lysat protéique est mélangée à un tampon de charge

dénaturant (NuPAGE LDS Sample Buffer 4X, Life Technologies) et à un tampon réducteur

(NuPAGE Sample Reducing Agent 10X, life technologies). Le mélange est alors placé 10

minutes à 70°C puis 10 à 100 µg de protéines sont déposés sur un gel de polyacrylamide pré-

coulé Novex 10% Tris-Glycine (Life Technologies). Les protéines sont alors séparées selon leur

poids moléculaire en appliquant un courant électrique à 100 V pendant 1 à 3 heures dans un

Anticorps primaires

Nom anticorps Référence Type Fournisseur Espèce Dilution Tampon de dilution Tampon de lavage

IgG Anti-FRα (FL-257) sc-28997 Polyclonal Santa-Cruz Lapin 1:250 PBS-lait 5% PBS-Tween 0,1%

IgG Anti-α-Tubuline (B-5-1-2) T6074 Polyclonal Sigma-Aldrich Souris 1:2000 PBS-lait 5% -Tween 0,1% PBS-Tween 0,1%

Anticorps secondaires


Anti-Rabbit IgG-HRP A0545 Polyclonal Sigma-Aldrich Chèvre 1:5000 PBS-lait 5% PBS-Tween 0,1%

Anti-mouse IgG-HRP A0168 Polyclonal Sigma-Aldrich Chèvre 1:5000 PBS-lait 5% -Tween 0,1% PBS-Tween 0,1%

Tableau 7. Anticorps primaires et secondaires utilisés en Western blot.


55

tampon d’électrophorèse à 1X (Novex Tris-Glycine SDS Running Buffer 10X, Life

Technologies).

Une fois la migration terminée, les protéines sont transférées sur une membrane de

nitrocellulose (Amersham Hybond-ECL, GE Healthcare) en appliquant un courant de 50 V

pendant 45 minutes dans un tampon de transfert (NuPAGE Transfer Buffer 20X, Life

Technologies). Les sites non spécifiques des protéines sont saturés au cours d’une incubation de

3 heures sous agitation dans une solution de PBS contenant 5% de lait. La membrane est alors

incubée à 4°C sur la nuit avec l’anticorps primaire (Tableau 7). Après trois lavages de 5 minutes,

la membrane est incubée sous agitation 1 heure à température ambiante avec un anticorps

secondaire couplé à la péroxydase de Raifort (HRP ; Tableau 7). Après trois autres lavages de 5

minutes, la protéine d’intérêt est révélée par chimiluminescence, en déposant sur la membrane un

substrat de la HRP (Luminata Forte Western HRP Substrate, Millipore). Le signal produit par la

réaction de chimiluminescence est recueilli sur un film radiographique (Amersham Hyperfilm

ECL, GE Healthcare).

Les films radiographiques obtenus sont numérisés et les images sont analysées à l’aide du

logiciel ImageJ qui va déterminer une intensité moyenne pour les bandes correspondant à la

protéine étudiée. Les résultats sont alors normalisés en calculant le rapport entre la moyenne

d’intensité de signal obtenue pour la protéine étudiée et celle obtenue pour une protéine de

référence. Pour chaque expérience, au moins trois échantillons protéiques sont produits et chaque

échantillon protéique subit au minimum deux Western blot.

B. ETUDE DE LA LOCALISATION PAR IMMUNOFLUORESCENCE

L’immunofluorescence est une technique permettant l’étude de la localisation d’une

protéine. En complément de techniques quantitatives, elle peut également permettre une

représentation du niveau d’expression de la protéine étudiée.

Pour réaliser cette expérience, les cellules sont ensemencées en plaque 12 puits, sur des

lamelles de verre de 12 mm de diamètre. Après traitement, le milieu de culture est retiré et deux

lavages au PBS (NaCl 0,137 M, NaH2PO4 0,05 M, pH = 7,4) sont réalisés. Les cellules sont

fixées par du formaldéhyde (Sigma-Aldrich) dilué à 3,7% dans du PBS pendant 20 minutes sous

agitation à température ambiante. Après deux lavages supplémentaires, les sites non spécifiques

Anticorps primaires


IgG anti-hFOLR1 (548908) MAB5646 Monoclonal R&D systems Souris 1:50 PBS - BSA 1% - Triton X-100

0,3% - sérum de chèvre 1% PBS - BSA 1%

Anticorps secondaires


Alexa Fluor® 488 goat anti-

mouse A11001 Polyclonal

Life

Technologies Chèvre 1:250

PBS - BSA 1% - Triton X-100

0,3% - sérum de chèvre 1% PBS - BSA 1%

Tableau 8. Anticorps primaire et secondaire utilisés en immunofluorescence.


56

sont saturés pendant 45 minutes avec une solution de PBS contenant 10% de sérum de chèvre et

0,3% de Triton X-100. Les cellules sont alors incubées avec l’anticorps primaire dilué dans le

tampon adéquat (Tableau 8) pendant 2h30 à température ambiante. Après deux lavages avec une

solution de PBS contenant 1% de BSA (Bovine Serum Albumin, Sigma-Aldrich), les cellules

sont incubées 45 minutes à température ambiante avec l’anticorps secondaire (Tableau 8). Enfin,

après deux lavages au PBS - BSA 1%, un lavage au PBS et un lavage à l’eau, la lamelle est

montée sur lame à l’aide de Mowiol. Lorsque le montage est sec, les cellules sont observées par

microscopie confocale (FV 1000, Olympus IX-81). Les lames sont stockées à -20°C. Chaque

expérience est réalisée au minimum à deux reprises, et pour chaque expérience, une condition

dans laquelle l’anticorps primaire n’est pas ajouté est réalisée pour mesurer le bruit de fond

entrainé par l’anticorps secondaire.

V. ETUDE DE LA RESISTANCE A L’ANOÏKIS

L’anoïkis est une forme particulière d’apoptose qui se déclenche lorsque des cellules

adhérentes se détachent ou établissent des interactions inappropriées avec leur matrice ou les

cellules voisines. C’est un processus dont l’inhibition est indispensable à la métastase des

cellules cancéreuses, et qui est donc un critère d’agressivité des tumeurs. In vitro, la résistance à

l’anoïkis peut être étudiée en cultivant des cellules normalement adhérentes en condition sans

ancrage ou en les plaçant dans une matrice semi-solide.

A. CROISSANCE SANS ANCRAGE ET MESURE DE L’APOPTOSE

Pour étudier la capacité des cellules à proliférer dans des conditions sans ancrage, celles-

ci sont cultivées sur du poly(2-hydroxyethyl methacrylate) ou poly-HEMA (Sigma-Aldrich), un

polymère qui inhibe l’adhérence des cellules au plastique de la boite de culture. Après

ensemencement, les cellules demeurent donc en suspension.

Les puits d’une plaque 6 puits sont recouverts de 5 mg/cm² de poly-HEMA et, après

séchage sur la nuit et sous atmosphère stérile, 1,5×105 cellules sont ensemencées dans chaque

puits. Suite à un traitement de 3 jours avec 5 nM de vecteur MGAF en présence ou en absence de


57

0,1 µM de dexaméthasone et de 200 µM de VPA, les cellules sont récupérées et l’apoptose est

mesurée par cytométrie en flux, selon le protocole décrit page 48.

B. CROISSANCE EN SOFT-AGAR

Les cellules cultivées en agar ou agarose mou, ou plus communément en « soft-agar »

sont ensemencées dans une matrice semi-solide. Leur capacité à résister à l’anoïkis est alors

traduite par leur propension à former des colonies au sein de cette matrice.

Pour réaliser cette technique, un premier gel à 0,6% d’agarose dans du milieu de culture

RPMI 1640 déplété en acide folique (Gibco) et contenant 10% de SVF est déposé dans des

boites de Pétri de 3,5 cm de diamètre. Une fois ce premier gel solidifié, 5×103 cellules sont

ensemencées dans un second gel à 0,35% d’agarose dans du milieu de culture RPMI 1640

déplété en acide folique et contenant 10% de SVF. Pour permettre le développement des

colonies, les cellules sont placées entre 4 (cellules KB) et 11 jours (cellules HeLa, A2780 et

A549) en atmosphère humide dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2. Au cours de cette

incubation, 750 µL de milieu RPMI 1640 déplété en acide folique (Gibco) et contenant 10% de

SVF sont ajoutés tous les 3 ou 4 jours aux cellules.

A la fin de cette période, les cellules sont traitées 3 ou 6 jours avec 5 nM de vecteur

MGAF en présence ou en absence de 0,1 µM de dexaméthasone et de 200 µM de VPA, les

colonies sont photographiées au microscope (Olympus CKX41) pour l’étude de la taille des

colonies, ou au macroscope (MacroView MVX10 Olympus) pour l’étude du nombre de colonies.

La taille des colonies est mesurée à l’aide du logiciel ImageJ. Pour cela, l’aire des colonies est

déterminée en pixels² et rapportée en µm² à l’aide d’un étalon de taille connue. Le nombre de

colonies est également déterminé à l’aide de ce logiciel. Les colonies prises en compte présentent

alors une taille supérieure ou égale à une taille seuil, elle-même déterminée à partir de la taille

moyenne la plus faible obtenue après 3 ou 6 jours de traitement. Pour chaque condition, trois

champs sont photographiés aléatoirement et les valeurs obtenues pour la taille et le nombre de

colonies sont moyennées. Chaque expérience est réalisée au moins trois fois.


58

VI. QUANTIFICATION DE LA MMAE PAR

HPLC/HRMS

La présence de MMAE au sein des cellules cancéreuses après traitement avec les

composés à tester a été vérifiée par chromatographie en phase liquide à haute performance

couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (HPLC/HRMS). Pour cela, les cellules

issues de culture in vitro ou de 40 à 80 mg de xénogreffes tumorales sont broyées dans 500 µL

d’acétate de sodium à 0,3 M. Après centrifugation 7 minutes à 1500 ×g, le surnageant est

récupéré, ajouté à 1 mL d’éthanol 100% glacé et placé à -20°C pendant 1 heure. L’échantillon

est à nouveau centrifugé, cette fois à 17 000 ×g et 4°C pendant 20 minutes puis le surnageant est

récupéré et mélangé à 500 µL d’acétonitrile-méthanol (quantité volume/volume : 2/1). Après 1

heure supplémentaire à -20°C et une centrifugation de 20 minutes à 4°C et 17 000 ×g, le

surnageant est transféré dans un nouveau tube et à nouveau centrifugé 10 minutes à 17 000 ×g.

Le surnageant obtenu est ensuite analysé par HPLC/HRMS sur un système HPLC Accela couplé

à un spectomètre de masse haute résolution Q-Exactive.

VII. ETUDES IN VIVO

A. ETUDE DE L’EFFICACITE ANTITUMORALE DU VECTEUR MGAF

Toutes les expérimentations ont été réalisées avec l’accord du comité local d’éthique

COMETHEA (« Évaluation de médicaments anticancéreux intelligents », saisine

n°2015061708011100).

Des souris femelles BALB/c nude âgées de 6 à 8 semaines reçoivent par voie sous-

cutanée et en position dorso-latérale 1×106 de cellules KB exprimant le gène de la luciférase et

diluées dans 50% de PBS et 50% de Matrigel® complet (10 mg/mL ; Corning). Tout au long de

l’étude, le poids des souris et les signes de douleur ou de stress sont surveillés quotidiennement.

La croissance tumorale est mesurée deux fois par semaine par bioluminescence in vivo suite à

l’injection par voie intrapéritonéale de D-Luciférine (XenoLight D-Luciferin - K+ Salt

Bioluminescent Substrate ; PerkinElmer) et/ou par mesure au pied à coulisse.


59

Les traitements débutent quatre jours après l’implantation des tumeurs. Les souris

reçoivent alors quotidiennement par voie intrapéritonéale une injection de 2 mg/kg de

dexaméthasone et de 300 mg/kg de VPA ou de solvants (PBS – éthanol 6,8%) et/ou par voie

intraveineuse une injection de 0,5 mg/kg de MGAF ou de solvant (PBS – 5% DMSO) les jours 6,

8, 11, 13 et 15 suivant l’implantation des tumeurs.

A la fin de l’expérimentation, ou s’ils atteignent les points limites définis dans la saisine,

les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse (Isoflurane). Les

tumeurs ainsi que différents organes sont récupérés par dissection puis sont soumis à une

congélation instantanée dans un bain d’azote liquide ou stockés dans du formol à 4% selon les

analyses à effectuer.

B. ANALYSE HISTOPATHOLOGIQUE DES ORGANES

A la fin de l’étude in vivo, le cœur, le foie et le rein des animaux sont prélevés et fixés

dans un bain de formol à 4%. Ces échantillons sont ensuite transférés à un organisme

indépendant (Novaxia) pour leur inclusion en paraffine. Des sections d’environ 4 µm d’épaisseur

sont réalisées au microtome et montées sur lame. Après coloration à l’hématoxyline et l’éosine,

l’analyse histopathologique des lames est réalisée par un pathologiste indépendant de la société

Le Net Pathology Consulting.

4E PARTIE

RESULTATS

4e Partie – Résultats

7e Chapitre – Optimisation chimique

60

7E CHAPITRE

Optimisation chimique

La première approche abordée au cours de ma thèse repose sur la synthèse d’une nouvelle

génération de vecteurs. L’objectif de ces vecteurs est d’augmenter le nombre de molécules

actives internalisées pour un nombre donné de récepteurs FR à la surface des cellules ciblées.

Pour cela, à partir des connaissances acquises sur les vecteurs monomériques, les chimistes de

l’équipe « Systèmes Moléculaires Programmés » ont synthétisé deux vecteurs différents. Le

premier permet l’internalisation et la libération de deux molécules de doxorubicine, le second de

deux molécules de MMAE. Au cours de ces études, mon rôle a consisté à établir des preuves de

concept à travers des techniques simples de biologie cellulaire. Cette collaboration a alors donné

lieu aux deux publications présentées ci-dessous.

I. SYNTHESE ET EVALUATION DU VECTEUR DIDGAF

A. INTRODUCTION ET PRINCIPE DE L’ETUDE

Le vecteur synthétisé dans cette première étude est composé de cinq unités comprenant

une molécule d’acide folique, une gâchette enzymatique activée par la β-galactosidase, un

espaceur central et deux molécules de principe actif articulées autour d’un amplificateur

chimique (Figure 25A). Comme pour les vecteurs DGAF et MGAF, l’internalisation de ce

composé devrait être réalisée par endocytose via les récepteurs FR. Au sein du lysosome, la

gâchette enzymatique du vecteur devrait alors être clivée par les β-galactosidases, déclenchant

ainsi des réarrangements chimiques intramoléculaires aboutissant à la libération successive des

deux molécules actives.

Figure 25. (A) Structure du vecteur diDGAF composé de deux molécules de doxorubicine (en

rouge), d’un élément de ciblage (acide folique, en orange) et d’une gâchette enzymatique

(galactoside, en vert). Ces quatre éléments sont reliés via un espaceur (en bleu) et un

amplificateur chimique (en gris). (B) Suivi par chromatographie en phase liquide à haute

performance couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (HPLC/HRMS) de la

décomposition du vecteur diDGAF et de l’apparition de la doxorubicine en présence de β-

galactosidase (ajoutée à t = 0 minute) dans le milieu réactionnel (tampon phosphate, pH = 7).



61

Compte tenu de ses propriétés cytotoxiques et fluorescentes, la doxorubicine est apparue

comme une molécule de choix pour établir la preuve de concept de cette stratégie. Ainsi, le

vecteur utilisé dans cette étude contient deux molécules de doxorubicine et est appelé vecteur

diDGAF (diDoxorubicine-galactoside-acide folique). La synthèse et l’évaluation de ce composé

ont donné lieu à une publication dont la référence est la suivante :

An enzyme-responsive system programmed for the double release of bioactive

molecules through an intracellular chemical amplification process.

Grinda M., Legigan T., Clarhaut J., Péraudeau E., Tranoy-Opalinski I., Renoux B., Thomas M.,

Guilhot F. and Papot S.

Organic & Biomolecular Chemistry, 2013, 11, 7123-7133.

B. RESULTATS BIOLOGIQUES PRINCIPAUX

Après synthèse du composé par les chimistes, la stabilité du vecteur diDGAF a été testée

par chromatographie en phase liquide après incubation dans du milieu de culture en atmosphère

humide à 37°C et 5% de CO2. Après 24 heures, aucune décomposition n’a été observée.

L’hydrolyse enzymatique du vecteur par la β-galactosidase a ensuite été suivie par

chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/HRMS). Comme

illustré sur la figure 25B, lorsque l’enzyme est ajoutée, on observe une disparition du vecteur

diDGAF au cours du temps, simultanément à l’apparition du signal de la doxorubicine. La

stabilité du vecteur et la libération de la doxorubicine suite à l’activation de la gâchette

enzymatique étant validées, j’ai alors participé à l’évaluation biologique du vecteur diDGAF.

L’un des enjeux majeurs du développement de molécules vectorisées est d’établir une

interaction spécifique du vecteur avec les cellules ciblées. L’internalisation de la doxorubicine

libre et du vecteur diDGAF a donc été étudiée par microscopie confocale sur deux lignées

cellulaires cancéreuses : les cellules A2780 qui expriment les récepteurs à l’acide folique, et les

cellules A549 qui ne les expriment pas. Comme attendu, alors que l’agent anticancéreux libre

pénètre dans les deux types de cellules, le conjugué diDGAF n’est détecté que dans les cellules

Figure 26. Détection par microscopie confocale de la doxorubicine (longueur d’onde

d’excitation/d’émission : 488/590 nm) dans les cellules A2780 et A549 traitées pendant 1 ou 3

heures avec avec 10 µM de doxurbicine libre ou de vecteur diDGAF, respectivement. Images

représentatives de 2 expériences, barre d’échelle : 50 µm.



62

A2780 exprimant le marqueur ciblé (Figure 26). Ces résultats, mis en parallèle de ceux décrits

dans l’article Thomas et al., 2011, confirment l’importance des récepteurs FR pour

l’internalisation de ces vecteurs dérivés de l’acide folique dans les cellules tumorales.

L’efficacité antiproliférative du vecteur diDGAF a ensuite été testée sur les cellules

A2780 et A549 et comparée à celle de son homologue monomérique, le vecteur DGAF (Figure

27, voir également Thomas et al., 2011 ; page 37). Sur les cellules A2780, le vecteur diDGAF

est responsable d’une toxicité 3,7 fois supérieure à celle entrainée par son homologue

monomérique (0,30 µM contre 1,10 µM, respectivement). A l’inverse, aucun des deux vecteurs

testés ne permet d’atteindre l’IC50 sur les cellules A549.

Après vérification in vitro de la spécificité et de l’efficacité du vecteur diDGAF celui-ci a

été testé ex vivo sur des cellules de six patients atteints de LAM et dont les cellules leucémiques

expriment l’isoforme β des récepteurs FR. Ainsi, les lymphocytes et les blastes isolés de la

moelle osseuse de ces patients ont été traités par la doxorubicine libre, le vecteur DGAF ou le

vecteur diDGAF. Le nombre de cellules présentant une fluorescence détectable en cytométrie en

flux a alors été déterminé. Comme pour les cellules A2780 et A549, la doxorubicine pénètre de

manière non sélective dans les lymphocytes et les cellules malignes, ce qui se traduit par une

détection de fluorescence dans la quasi-totalité des cellules (Figure 28). En revanche, les

vecteurs DGAF et diDGAF sont internalisés presque exclusivement dans les cellules malignes,

puisque seuls 2 à 3 % des lymphocytes présentent une fluorescence, respectivment. Cette

observation confirme l’implication des FR dans l’internalisation de ces composés vectorisés.

De plus, suite à leur traitement par le vecteur diDGAF, un plus grand nombre de cellules

leucémiques présente une fluorescence détectable, comparé aux cellules traités avec le vecteur

monomérique (67 et 31 % des cellules, respectivement). Ce résultat montre que, pour un nombre

équivalent de cellules ciblées, le vecteur diDGAF permet la pénétration dans les cellules

tumorales d’une quantité plus importante de doxorubicine que le vecteur DGAF. De ce fait, les

cellules dont l’expression en FR est faible contiennent suffisamment de doxorubicine pour être

détectées par cette technique lorsqu’elles sont traitées avec le vecteur diDGAF alors que la

quantité de doxorubicine est en dessous du seuil de détection lorsque les cellules sont traitées

avec le vecteur DGAF.

L’ensemble des résultats présentés ci-dessus ont permis la validation in vitro et ex vivo

d’un composé homodimérique programmé pour libérer successivement deux molécules actives.

Figure 27. Mesure par test XTT de la viabilité des cellules A2780 et A549 traitées pendant 4

jours avec de la doxorubicine libre, le vecteur monomérique DGAF ou le vecteur dimérique

diDGAF. Moyennes ± s.e.m. de 7 à 11 expériences.

Figure 28. Evaluation par cytométrie en flux de l’internalisation de la doxorubicine. Les

lymphocytes (n’exprimant pas les FR) et les blastes (possédant une forte expression des FR)

isolés de la moelle osseuse de patients atteints de LAM ont été traités pendant 3 heures avec 10

µM de doxorubicine libre, de DGAF ou de diDGAF. Moyennes ± s.e.m. calculées sur les

cellules de 6 patients, test statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, ns (non

significatif) : p-value > 0,05 ; * : p-value ≤ 0,05 ; ** : p-value ≤ 0,01 ; *** : p-value ≤ 0,001

Figure 29. Structure du vecteur diMGAF composé de deux molécules de MMAE (en rouge),

d’un élément de ciblage, l’acide folique ajouté en position α ou γ (en orange) et d’une gâchette

enzymatique de type galactoside (en vert). Ces quatre éléments sont articulés autour d’un

espaceur central (en bleu) et d’un amplificateur (en noir) chimiques.



63

Cette démonstration de l’amplification d’un processus catalysé par une enzyme intracellulaire a

ouvert de nouvelles perspectives quant à la synthèse de molécules vectorisées innovantes.

Cependant, la doxorubicine présente plusieurs inconvénients freinant le développement

préclinique des molécules dérivées de cet agent, notamment sa faible solubilité qui limite

l’évaluation biologique in vivo des vecteurs DGAF et diDGAF. Les chimistes de l’équipe du Pr

Papot ont alors développé un second vecteur homodimère, dérivé d’un agent anticancéreux plus

efficace et plus soluble : la MMAE.

II. SYNTHESE ET EVALUATION DU VECTEUR DIMGAF

A. INTRODUCTION ET PRINCIPE DE L’ETUDE

Du fait de leur structure et de la stratégie de leur synthèse, les vecteurs anticancéreux

permettent le transport de différents composés. Ainsi, les molécules de doxorubicine dans le

vecteur diDGAF présenté ci-dessus sont interchangeables avec des sondes ou d’autres agents

thérapeutiques. Sur la même base stratégique, notre groupe a alors synthétisé un vecteur

permettant la libération de deux molécules de MMAE suite à un unique évènement

d’internalisation et d’activation enzymatique (Figure 29). Après vérification des mécanismes de

libération des molécules de MMAE contenues dans le vecteur, j’ai réalisé la validation

biologique in vitro de ce composé appelé vecteur diMGAF (diMMAE-Galactoside-Acide

Folique) et comparé son efficacité à celle du vecteur monomérique MGAF. Les résultats obtenus

ont été publiés dans l’article dont voici la référence :

A dendritic β-galactosidase-responsive folate–monomethylauristatin E

conjugate.

Alsarraf J., Péraudeau E., Poinot P., Tranoy-Opalinski I., Clarhaut J., Renoux B., and Papot S.

Chemical Communications, 2015, 51, 15792-15795.

IC50 (nM)

Cellules Expression FR

(% GAPDH) MMAE diMGAF MGAF

Ratio

MGAF/diMGAF

HeLa 23,69 1,12 ± 0,41 16,30 ± 3,76 29,36 ± 5,77 1,80

SKOV-3 3,37 0,64 ± 0,08 9,62 ± 1,12 20,16 ± 1,45 2,10

A2780 0,29 6,67 ± 3,54 64,51 ± 14,13 248,23 ± 87,09 3,85

Tableau 9. Valeurs d’IC50 déterminées par mesure de la viabilité (XTT) sur les cellules HeLa,

SKOV-3 et A2780 traitées pendant 4 jours avec la MMAE libre, le vecteur MGAF ou le vecteur

diMGAF. IC50 moyennes ± s.e.m. calculées à partir de 6 expériences.

Aire relative

diMGAF MGAF

Ratio

diMGAF/MGAF

Test 1 56 813 491 13 353 647 4,25

Test 2 58 596 545 14 515 931 4,04

Tableau 10. Quantification par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à

la spectrométrie de masse à haute résolution (HPLC/HRMS) de la MMAE libérée dans les

cellules A2780 après 24 heures de traitement avec 100 nM de diMGAF ou de MGAF. Moyennes

de 3 expériences.



64

B. RESULTATS BIOLOGIQUES PRINCIPAUX

Les cytotoxicités induites par les vecteurs MGAF et diMGAF ont été évaluées sur trois

lignées tumorales exprimant des niveaux différents de récepteurs à l’acide folique : les cellules

HeLa qui les expriment fortement, les cellules A2780 qui les expriment plus faiblement et les

cellules SKOV-3 qui expriment ce récepteur à un niveau intermédiaire (Tableau 9). Après quatre

jours de traitement, le vecteur diMGAF entraine une toxicité environ deux fois plus importante

que le vecteur MGAF sur les cellules HeLa et SKOV-3. Ce résultat est compatible avec

l’hypothèse de la libération de deux fois plus de MMAE (IC50 respectives de 16,30 ± 3,76 et

29,36 ± 5,77 nM pour les cellules HeLa et de 9,62 ±1,12 et 20,16 ± 1,45 nM pour les cellules

SKOV-3 ; Tableau 9). En revanche, la toxicité entrainée par le vecteur diMGAF sur les cellules

A2780 est quatre fois supérieure à celle obtenue avec le monomère MGAF (IC50 respectives de

64,4 et 248,9 nM). Pour vérifier ce résultat, nous avons comparé par chromatographie en phase

liquide couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/HRMS) les concentrations de MMAE libérée

au sein des cellules A2780 traitées par les vecteurs MGAF ou diMGAF. A concentrations égales,

les cellules traitées avec le vecteur diMGAF contiennent approximativement quatre fois plus de

MMAE que celles traitées par le monomère (Tableau 10). Le résultat obtenu sur les cellules

A2780 peut être expliqué par l’étude publiée récemment par Antunes et al. qui a démontré que la

des enzymes lysosomales pouvaient être libérées dans le milieu extracellulaire par les cellules

cancéreuses en nécrose (Antunes et al., 2012). Les résultats que nous avons obtenus à la fois en

test de viabilité et en HPLC/HRMS pourraient alors être la conséquence d’une activation en

extracellulaire du vecteur suite à la libération de la β-galactosidase par les cellules mortes. Ce

phénomène serait moins important lorsque les cellules sont traitées avec le monomère.

En conclusion, à travers ces deux articles résultant de la collaboration de chimistes et de

biologistes, nous avons développé deux conjugués dérivés de l’acide folique permettant le

transport et la libération de deux molécules anticancéreuses suite à un seul évènement

d’internalisation. Ces travaux pourraient être une étape importante dans le développement d’une

nouvelle génération de vecteurs.


8e Chapitre – Optimisation biologique

65

8E CHAPITRE

Optimisation biologique

En parallèle de l’approche chimique reposant sur la synthèse de vecteur permettant la

libération de deux fois plus d’agents anticancéreux, une seconde approche plus biologique a été

entreprise et a constitué le sujet principal de ma thèse. Elle consiste à augmenter la quantité de

récepteurs FR à la surface des cellules tumorales afin de permettre l’internalisation d’une plus

grande quantité de vecteurs monomériques (Figure 23B, page 42). Pour ce faire, j’ai mis au point

un traitement qui agit comme complément du traitement anticancéreux vectorisé et qui, de ce

fait, entre dans la définition des traitements adjuvants proposée par l’INCa.

I. COMMENT MODIFIER L’EXPRESSION DU GENE FOLR1 ?

Le gène FOLR1, localisé sur le chromosome 11, est un gène de 5 à 7 kb constitué de 7

exons et de 6 introns. Malgré le potentiel thérapeutique des thérapies vectorisées dérivées de

l’acide folique, très peu d’études s’intéressent à la stimulation de l’expression des récepteurs FR

dans le but de potentialiser l’efficacité de ces vecteurs. En 2005, Tran et al. montrent in vitro

dans des cellules tumorales HeLa que le promoteur du gène FOLR1 peut être indirectement

activé par un agoniste des récepteurs aux glucocorticoïdes, la dexaméthasone. Cette activation de

FOLR1 se traduit in vitro et in vivo par une augmentation du taux de FRα dans ces mêmes

cellules. Dans cette même étude, ils montrent qu’in vitro, la stimulation de l’expression du gène

FOLR1 par la dexaméthasone est potentialisée par la trichostatine A ou l’acide valproïque, deux

inhibiteurs de déacétylases d’histones (HDAC), des enzymes impliquées dans la modification de

la chromatine. Récemment, un autre groupe a pu montrer in vitro que la stimulation du gène

FOLR1 par de la dexaméthasone permettait l’augmentation de l’internalisation d’une micelle

conjuguée à de l’acide folique et encapsulant un agent fluorescent (la coumarine) ou un agent

anticancéreux (le mitoxantrone, Chen et al., 2013).



66

La dexaméthasone est un corticoïde synthétique principalement utilisé comme anti-

inflammatoire et immunosuppresseur. Elle possède également des propriétés pro-apoptotiques, et

est utilisée en chimiothérapie pour lutter contre différents types de lymphomes (Schmidt et al.,

2004). L’acide valproïque (VPA) est utilisé depuis de nombreuses années comme agent anti-

convulsant et anti-épileptique. Plus récemment, cette molécule a également montré des

propriétés anticancéreuses, notamment en inhibant des HDAC de type I et II (Kuendgen and

Gattermann, 2007).

A partir des données bibliographiques concernant la régulation de l’activité du promoteur

du gène FOLR1, j’ai déterminé les paramètres d’un traitement composé de dexaméthasone et de

VPA. Pour plus de simplicité, ce traitement sera par la suite appelé traitement DV. Le premier

objectif de ce traitement est d’agir comme un activateur transcriptionnel du gène FOLR1 afin

d’augmenter la concentration de récepteurs FR exprimés à la surface des cellules tumorales. En

augmentant le nombre de FR disponibles, il serait alors possible d’entrainer l’internalisation et la

décomposition d’une plus grande quantité de molécules vectorisées. De plus, compte tenu des

propriétés anticancéreuses décrites pour la dexaméthasone et le VPA, le mélange DV pourrait

alors soutenir et compléter l’activité cytotoxique de l’agent anticancéreux libéré par le vecteur.

Dans ces deux cas, le mélange DV agirait comme un adjuvant du vecteur anticancéreux.

Pour tester ces hypothèses, le travail que j’ai mené s’est décomposé en trois parties

principales. La première étape a consisté à tester in vitro les capacités du mélange DV à stimuler

l’expression des FR dans différentes lignées cellulaires. Par la suite, l’efficacité d’un vecteur

anticancéreux dérivé de l’acide folique a été évaluée in vivo chez la souris en présence ou en

absence du mélange DV. Enfin, dans une dernière partie encore en cours d’investigation à

l’heure de la rédaction de cette thèse, j’ai tenté d’identifier l’implication des processus

d’apoptose et de prolifération dans la coopération du vecteur anticancéreux et de l’activité

adjuvante du mélange DV.

Figure 30. (A) Expression des gènes FOLR1 et FOLR2 mesurée par RT-qPCR dans les cellules

KB et A549. Moyennes ± s.e.m. de 8 à 9 expériences. (B) Expression des protéines FRα (100 µg

de protéines totales) et tubuline-α (15 µg de protéines totales) analysées par Western blot dans

les cellules KB et A549. Images représentatives de 3 expériences. (C) Immunocytochimie du

récepteur FRα dans les cellules KB et A549. Photos représentatives de 3 expériences, barre

d’échelle : 50 µm.



67

II. EVALUATION IN VITRO DU MELANGE DV

A. CARACTERISATION DES LIGNEES KB ET A549

Afin de tester l’effet du mélange DV sur l’expression des FR, différentes lignées

tumorales humaines ont été utilisées : les cellules KB, issues d’un carcinome oral et les cellules

A549, provenant d’un carcinome pulmonaire. Les niveaux d’expression basale des gènes FOLR1

et FOLR2 de ces lignées ont été mesurés par RT-qPCR (Figure 30A). Ainsi, les cellules KB

présentent une forte expression du gène FOLR1 (79,91 ± 12,73 % de GAPDH) alors que les

cellules A549, avec une expression de FOLR1 de seulement 0,0021 ± 0,0004 % de GAPDH sont

classiquement utilisées comme témoins négatifs pour l’étude des récepteurs à l’acide folique

(Parker et al., 2005 ; Reddy et al., 2007 ; (Legigan et al., 2012a). Par ailleurs, le gène FOLR2,

qui n’est pas détecté dans les cellules A549, est très faiblement exprimé dans les cellules KB

(0,0017 ± 0,0002 % de GAPDH), si bien que comparée au gène FOLR1, son expression peut être

considérée comme négligeable.

Les profils d’expression obtenus au niveau ARNm pour les cellules KB et A549 se

confirment au niveau protéique (Figure 30B). En effet, l’analyse par Western blot révèle une

bande d’environ 40 kDa correspondant à la protéine FRα dans les cellules KB alors qu’aucun

signal n’est obtenu pour l’extrait protéique A549. Par immunocytochimie, les protéines FRα sont

identifiées à la membrane des cellules KB, une localisation compatible avec leur fonction de

récepteurs membranaires (Figure 30C). En revanche, avec les mêmes paramètres d’analyse,

aucune protéine n’est révélée par cette technique dans les cellules A549, confirmant ainsi les

résultats obtenus en Western blot et le statut de contrôle négatif de cette lignée. Par ailleurs, à

cause du manque d’anticorps commercial efficace dirigé contre le récepteur FRβ, l’expression de

cette protéine n’a pas pu être étudiée par les techniques citées ci-dessus. Néanmoins, compte

tenu de l’expression du gène au niveau ARNm et des données bibliographiques disponibles, il est

raisonnable d’estimer que l’expression de la protéine FRβ dans ces lignées est négligeable

comparée à celle de FRα, d’autant plus que les affinités des deux récepteurs pour l’acide folique

sont équivalentes. Ces profils d’expression établis, j’ai par la suite testé l’effet du mélange DV

sur ces deux lignées cellulaires.

Figure 31. Viabilité mesurée par test XXT des cellules KB et A549 traitées pendant 3 jours avec

0,1 µM de dexaméthasone et/ou 200 µM de VPA (test XTT). Moyennes ± s.e.m. de 5 à 6

expériences. Test statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni ; ns : p-value >

0,05.



68

B. EFFET DU MELANGE DV SUR LES CELLULES KB ET A549

1. Toxicité du mélange adjuvant

Afin de s’affranchir des effets anticancéreux décrits pour les molécules composant le

mélange DV, j’ai traité les cellules avec des gammes de concentrations allant de 25 à 500 nM

pour la dexaméthasone et de 0,1 à 2 mM pour le VPA. L’induction du promoteur de FOLR1 par

la dexaméthasone étant visible à partir de 48 heures (Tran et al., 2005), nous avons opté pour un

traitement de 72 heures afin de nous assurer les meilleurs résultats possibles. Cette étape m’a

permis de choisir des doses non toxiques vis-à-vis des cellules pour chacune de ces deux

molécules. J’ai ensuite utilisé ces doses non toxiques de dexaméthasone et de VPA en

combinaison pour finalement choisir de travailler avec 0,1 µM de dexaméthasone et 200 µM de

VPA. A ces concentrations, après trois jours de traitement, la dexaméthasone et le VPA qu’ils

soient utilisés seuls ou en combinaison n’entrainent pas de variation significative de la viabilité

des cellules KB et A549 (Figure 31). Ces concentrations permettent de se concentrer, in vitro,

sur les fonctions de régulation de la transcription du gène FOLR1.

2. Effet sur l’expression des récepteurs FR

a) Au niveau transcriptomique.

L’effet du mélange DV sur la régulation du gène FOLR1 a été étudié par RT-qPCR

(Figure 32A). Pour cela, les cellules KB et A549 ont été traitées pendant trois jours avec les

concentrations déterminées dans le paragraphe précédent, soit 0,1 µM de dexaméthasone et 200

µM de VPA. Alors que le traitement des cellules KB par l’une ou l’autre des molécules ne

permet pas d’augmentation significative de l’expression de FOLR1, le mélange DV stimule

l’expression du gène d’un facteur 2,2 (179,31 ± 29,05 % de GAPDH, contre 79,91 ± 12,73 % de

GAPDH en condition basale). Dans les cellules A549, ni la dexaméthasone, ni le VPA ou la

combinaison des deux molécules ne modifie l’expression du gène FOLR1.

Puisque FRβ est surexprimé dans certains cancers et est capable de lier et d’entrainer

l’internalisation de vecteurs dérivés de l’acide folique, l’expression du gène FOLR2 a également

été mesurée dans ces deux lignées cellulaires (Figure 32B). Ainsi, le traitement des cellules KB

Figure 32. (A) Expression des gènes FOLR1 et FOLR2 mesurée par RT-qPCR dans des cellules

KB et A549 traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone et/ou 200 µM de VPA.

Moyennes ± s.e.m. de 5 à 9 expériences, test statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test

Bonferroni, ns : p-value > 0,05 ; ** : p-value ≤ 0,01. (B) Images représentatives de l’analyse par

Western blot des protéines FRα (100 µg protéines totales) et tubuline-α (15 µg protéines totales)

extraites de cellules KB traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone et/ou 200 µM de

VPA. Moyennes ± s.e.m de l’intensité des bandes de 10 expériences (4 échantillons protéiques

analysés entre 2 et 3 fois), quantifiées par le logiciel ImageJ. Test statistique : One-way ANOVA

suivi d’un post-test Bonferroni, ns : p-value > 0,05 ; * : p-value ≤ 0,05 (C) Immunocytochimie

de la protéine FRα réalisée sur des cellules KB traitées pendant 3 jours avec le mélange DV.

Images représentatives de 3 expériences, barre d’échelle : 50 µm.



69

par la dexaméthasone et/ou le VPA n’entraine pas de variation de l’expression de FOLR2. Dans

les cellules A549, le traitement par le mélange DV ne permet toujours pas la détection de

l’ARNm de ce gène.

b) Au niveau protéique.

L’analyse par Western blot des extraits de cellules KB montre que les traitements

individuels par la dexaméthasone ou le VPA n’entrainent pas de différence du taux de protéine

FRα (Figure 32C). En revanche, lorsque les cellules sont traitées simultanément avec les deux

molécules, il est possible de détecter environ 7 fois plus de protéine FRα, comparé aux cellules

non traitées. De plus, les protéines surexprimées en réponse au mélange DV présentent une

localisation fonctionnelle et ne sont pas retenues dans un compartiment intracellulaire (Figure

32D). Enfin, en accord avec les résultats obtenus par RT-qPCR, le traitement des cellules A549

avec le mélange DV ne permet pas la détection par immunocytochimie de la protéine FRα dans

ces cellules.

C. EFFET DU MELANGE DV SUR D’AUTRES LIGNEES TUMORALES

1. Caractérisation des lignées cellulaires

Les expériences précédentes montrent que le mélange DV stimule la transcription du

gène FOLR1 dans les cellules KB qui expriment déjà ce gène de manière basale, mais pas dans

les cellules A549 qui ne l’expriment pas. Afin de voir si la stimulation de ce gène par le mélange

DV pouvait être appliquée à d’autres cellules tumorales exprimant les FR, deux autres lignées

cellulaires ont été utilisées : les cellules HeLa, issues d’un cancer du col de l’utérus et qui

expriment FOLR1 à 5,06 ± 0,32 % de GAPDH et les cellules A2780, dérivées d’un carcinome

ovarien et exprimant ce même gène à 0,16 ± 0,02 % de GAPDH (Figure 33A). De plus, comme

pour les cellules KB, FRα est le récepteur à l’acide folique principal dans ces cellules puisque les

HeLa expriment le gène FOLR2 à 0,0005 ± 0,0001 % de GAPDH et les cellules A2780 à 0,0035

± 0,0006 % de GAPDH.

Figure 33. (A) Expression des gènes FOLR1 et FOLR2 mesurée par RT-qPCR dans des cellules

KB, HeLa, A2780 et A549. Moyennes ± s.e.m. de 4 à 9 expériences. (B) Viabilité mesurée par

XTT dans les cellules HeLa et A2780 traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone

et/ou 200 µM de VPA. Moyennes ± s.e.m. de 3 à 4 expériences. Test statistique : One-way

ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni ; ns : p-value > 0,05.



70

2. Toxicité et stimulation de FOLR1 induite par le mélange DV

Avant de tester l’effet du mélange DV sur l’expression du gène FOLR1 dans les cellules

HeLa et A2780, la toxicité induite par ce traitement sur ces cellules a été mesurée par XTT

(Figure 33B). A l’instar des cellules KB et A549, la dexaméthasone et le VPA, utilisés seuls ou

en combinaison, n’entrainent pas de variation significative de la viabilité des cellules HeLa et

A2780 après trois jours de traitement.

Dans les cellules HeLa, la dexaméthasone seule stimule l’expression de FOLR1 d’un

facteur 1,65, l’expression du récepteur étant alors de 8,33 ± 0,67 % de GAPDH contre 5,06 ±

0,32 % de GAPDH en condition basale (Figure 34A). Cependant, le traitement avec le mélange

DV permet une augmentation de l’expression plus importante puisque celle-ci est alors

multipliée par un facteur de 2,90 (14,67 ± 0,51 % de GAPDH). Le VPA seul, quant à lui, n’a pas

d’effet sur l’expression de FOLR1. Dans les cellules A2780, seule l’utilisation simultanée de la

dexaméthasone et du VPA permet d’augmenter le niveau de FOLR1 qui se trouve alors environ

cinq fois plus important qu’au niveau basal (0,79 ± 0,10 % et 0,16 ± 0,02 % de GAPDH,

respectivement).

Par ailleurs, tandis que l’expression du gène FOLR2 n’est pas modifiée dans les cellules

HeLa, celle-ci est stimulée d’un facteur 5,81 dans les cellules A2780 traitées avec le mélange

DV (Figure 34B). Dans ce cas, les cellules expriment ce gène à 0,02 ± 0,003 % de GAPDH, soit

40 fois moins que le gène FOLR1. De ce fait, la suite des tests in vitro se poursuivra seulement

sur le récepteur FOLR1.

Ainsi, les résultats présentés ci-dessus indiquent que le traitement composé de

dexaméthasone et de VPA agit comme un activateur transcriptionnel du gène FOLR1 dans les

cellules tumorales exprimant déjà ce gène de manière basale (cellules KB, HeLa et A2780). En

revanche, dans les cellules tumorales n’exprimant pas les FR, ou l’exprimant à des niveaux

négligeables telles que les cellules A549, le mélange DV n’est pas capable d’amplifier

l’expression de ce gène.

Figure 34. Expressions des gènes FOLR1 (A) et FOLR2 (B) mesurées par RT-qPCR dans des

cellules HeLa et A2780 traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone et/ou 200 µM de

VPA. Moyennes ± s.e.m. de 3 à 4 expériences. Test statistique : One-way ANOVA suivi d’un

post-test Bonferroni ; ns : p-value > 0,05 ; ** : p-value ≤ 0,01 ; *** : p-value ≤ 0,001.



71

D. SPECIFICITE DE LA STIMULATION DE FOLR1

Par la suite, j’ai cherché à savoir si l’augmentation de l’expression de FRα entrainée par

le mélange DV dans les cellules KB, HeLa et A2780 reflétait un phénomène global dans ces

cellules. Pour répondre à cette question, l’expression des gènes des deux autres transporteurs de

folates connus, le RFC et le PCFT, a également été étudiée par RT-qPCR (Figures 35A et 35B,

respectivement). Ainsi, le traitement DV n’a pas d’effet sur l’expression de ces transporteurs,

quelle que soit la lignée tumorale étudiée. La stimulation de la transcription du gène FOLR1 en

réponse au mélange DV ne reflète donc pas un phénomène global, mais résulte d’une activité

préférentielle sur le promoteur de ce gène. La question suivante a alors été de savoir si cette

activité était un processus transitoire ou irréversible.

E. REVERSIBILITE DE L’EFFET DU TRAITEMENT ADJUVANT

Afin de tester la réversibilité de la stimulation de la transcription du gène FOLR1 par le

mélange DV, les cellules KB, HeLa, A2780 et A549 ont été traitées avec le mélange DV selon

différents protocoles (Figure 36A). Dans les deux premières conditions, les cellules ont été

traitées en continu avec le mélange DV pendant trois ou cinq jours avant que l’expression de

FOLR1 ne soit mesurée par RT-qPCR. Dans la dernière condition, les cellules ont été traitées

pendant trois jours avec le mélange DV puis le milieu de culture a été remplacé par du milieu ne

contenant pas les activateurs transcriptionnels. L’expression du gène FOLR1 a alors été mesurée

deux jours plus tard.

Dans les cellules KB, HeLa et A2780, la stimulation de FOLR1 observée après trois jours

de traitement est conservée lorsque ce traitement est maintenu cinq jours (Figure 36B). A

l’inverse, deux jours après l’arrêt du traitement des cellules, l’expression de FOLR1 diminue de

moitié pour les cellules HeLa ou retourne à son niveau basal pour les cellules KB et A2780.

Dans les cellules A549, malgré une tendance à l’augmentation de l’expression de FOLR1, les

différences observées ne sont pas statistiquement significatives.

Figure 35. Expression des gènes RFC (A) et PCFT (B) mesurée par RT-qPCR dans des cellules

KB, HeLa et A2780 traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone et 200 µM de VPA.

Moyennes ± s.e.m. de 3 à 4 expériences, test statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test

Bonferroni ; ns : p-value > 0,05.

Figure 36. (A) Schéma représentatif des protocoles de traitement des cellules. (B) Mesure par

RT-qPCR de l’expression du gène FOLR1 dans les cellules KB, HeLa, A2780 et A549 traitées

avec 0,1 µM de dexaméthasone et 200 µM de VPA selon les protocoles décrits ci-dessus.

Moyennes ± s.e.m de 3 à 5 expériences, test statistique : Two-way ANOVA suivi d’un post-test

Bonferroni ; ns : p-value > 0,05 ; ** : p-value ≤ 0,01 ; *** : p-value ≤ 0,001.

Figure 37. (A) Mesure par test XTT de la viabilité des cellules HUVEC traitées pendant 3 jours

avec 0,1 µM de dexaméthasone et/ou 200 µM de VPA. Moyennes ± s.e.m. de 7 expériences, test

statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni ; ns : p-value > 0,05 ; * : p-value

≤ 0,05 ; ** : p-value ≤ 0,01. (B) Mesure par incorporation de BrdU de la prolifération des

cellules HUVEC traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone et/ou 200 µM de VPA.

Moyennes ± s.e.m. de 5 expériences, test statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test

Bonferroni ; ns : p-value > 0,05. (C) Morphogenèse sur Matrigel® des cellules HUVEC traitées

pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone et/ou 200 µM de VPA. Images représentatives

de 2 expériences, barre d’échelle : 1 mm. (D) Quantification par le logiciel AngioQuant de la

longueur totale des tubules formés par les cellules HUVEC. Moyennes ± s.e.m. de 2 expériences.



72

F. EFFET DU TRAITEMENT ADJUVANT SUR LES CELLULES SAINES

Après avoir montré que le mélange DV stimule de manière réversible l’expression du

gène FOLR1 dans les cellules tumorales, je me suis intéressée à l’effet de ce traitement sur des

cellules saines. Plus particulièrement, et compte tenu de l’importance de l’angiogenèse dans la

progression tumorale, j’ai vérifié que le mélange DV n’avait pas d’effet sur le comportement des

cellules.

La viabilité de cellules endothéliales HUVEC a donc été étudiée après traitement avec les

composants du mélange DV (Figure 37A). Alors qu’après trois jours de traitement, la

dexaméthasone utilisée seule n’entraine pas de variation de la viabilité des cellules, le VPA, qu’il

soit administré seul ou en combinaison avec la dexaméthasone, est responsable d’une faible

diminution de la viabilité (diminutions de 11,4 et 13,7% respectivement). Cet effet ne se retrouve

pas lorsque l’on étudie la prolifération de ces cellules (Figure 37B). Par ailleurs, dans les cellules

HUVEC, aucune expression des gènes FOLR1 et FOLR2 n’est détectable en RT-qPCR. Ce profil

d’expression reste inchangé en présence du traitement DV. Les cellules endothéliales étant

impliquées dans l’angiogenèse tumorale, j’ai également vérifié que le traitement adjuvant ne

stimulait pas la formation de tubules par la technique de morphogenèse sur Matrigel® (Figures

37C et 37D).

En conclusion, le traitement composé de 0,1 µM de dexaméthasone et de 200 µM de

VPA stimule l’expression du gène FOLR1 dans les cellules tumorales exprimant de manière

basale les récepteurs à l’acide folique. En revanche, ce traitement n’en déclenche pas

l’expression dans les cellules saines endothéliales et n’a pas d’incidence majeure sur leur

fonctionnalité. Ces données in vitro établies, le mélange DV a par la suite été testé in vivo chez la

souris.

Figure 38. (A) Mesure par RT-qPCR de l’expression des gènes FOLR1 et FOLR2 dans les

extraits totaux issus de tumeurs KB. Les souris ont été traitées quotidiennement pendant 15 jours

par voie intrapéritonéale avec 2 mg/kg de dexaméthasone et 300 mg/kg de VPA. Moyennes ±

s.e.m. de 6 tumeurs, test statistique : t-test de Student, ns : p-value > 0,05 ; ** : p-value ≤ 0,01.

(B) Analyse par Western blot des protéines FRα et tubuline-α dans les cellules tumorale KB

issues de culture in vitro (puits 1) ou provenant d’extraits totaux de xénogreffes KB (puits 2).



73

III. MODULATION IN VIVO DE L’ACTIVITE D’UN

VECTEUR ANTICANCEREUX

A. LE MELANGE DV AUGMENTE-T-IL IN VIVO L’EXPRESSION TUMORALE

DES FR ?

Au cours des expériences précédentes, nous avons pu observer que le mélange DV

stimulait la transcription de FOLR1 dans les cellules tumorales exprimant ce gène de manière

basale. La question qui se pose à présent est de savoir si cette stimulation est transposable à un

modèle in vivo. Pour cela, des xénogreffes de cellules KB ont été implantées par voie sous-

cutanée à des souris femelles BALB/c nude. Quatre jours après implantation des tumeurs, les

animaux ont été traités quotidiennement par voie intrapéritonéale avec 2 mg/kg de

dexaméthasone et 300 mg/kg de VPA ou avec un mélange de solvants contrôles. Ces doses ont

été choisies sur la base de données bibliographiques indiquant la toxicité de ces molécules et leur

potentiel anticancéreux (Leiva et al., 2012 ; Krishnan et al., 2013 ; Tsai et al., 2013 ; Kervoëlen

et al., 2015). Après quinze jours de traitement, les animaux ont été euthanasiés. Les niveaux

d’expression des gènes FOLR1 et FOLR2 ont alors été mesurés dans les extraits issus des

tumeurs KB ainsi que de différents organes sains.

1. Expression de FOLR1 et FOLR2 dans les tumeurs

Les niveaux d’expression des gènes FOLR1 et FOLR2 ont été mesurés par RT-qPCR

dans les extraits tumoraux. Comme illustrée sur la figure 38A, l’administration du traitement DV

aux souris aboutit à une augmentation de 44% de l’expression de FOLR1 comparée aux souris

traitées avec le mélange de solvants (10,25 ± 0,83 et 7,11 ± 0,35 % de GAPDH, respectivement).

Concernant le gène FOLR2, les résultats sont semblables à ceux obtenus in vitro puisqu’aucune

variation de l’expression de ce gène n’est observée lorsque le mélange DV est administré aux

animaux. Les niveaux d’expression atteints restent par ailleurs négligeables (0,00045 ±

0,00009% de GAPDH) comparés à ceux de l’homologue FOLR1.

Par ailleurs, j’ai également tenté d’étudier l’expression du récepteur FRα au niveau

protéique dans les tumeurs (Figure 38B). Malheureusement, lorsque les cellules proviennent des

Figure 39. Mesure par RT-qPCR de l’expression des gènes mFOLR1 et mFOLR2 dans les

extraits totaux issus de l’ovaire, de l’utérus, du rein et du cœur. Les organes ont été prélevés à

des souris traitées quotidiennement pendant 15 jours avec 2 mg/kg de dexaméthasone et 300

mg/kg de VPA ou avec le mélange de solvants contrôles. Moyennes ± s.e.m. des organes de 6

animaux, test statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, ns : p-value > 0,05.



74

xénogreffes prélevées aux souris, nous observons l’apparition d’une double bande surnuméraire

(puits 2) qui n’est pas observée lorsque les cellules sont issues d’une culture in vitro (puits 1). A

ma connaissance, seule une modification post-traductionnelle de type glycosylation a été

raportée pour le récepteur FRα, compatible avec la présence de plusieurs sites de N-

glycosylation au sein de la molécule (Salazar and Ratnam, 2007). Sans identification, cette

double bande rend difficile l’interprétation des résultats fournis en Western blot. C’est pourquoi,

en attente de tests complémentaires, l’étude de l’expression des récepteurs FR sera limitée à

l’analyse transcriptomique pour la suite de ce travail.

2. Expression de FOLR1 et FOLR2 dans les cellules saines

Les résultats précédents indiquent que le mélange DV stimule la transcription du gène

FOLR1 dans les tumeurs in vivo chez la souris. Il s’agit à présent de vérifier que cet effet n’est

pas retrouvé dans les cellules saines. Dans le cas contraire, le traitement DV pourrait sensibiliser

les cellules saines à l’action d’un vecteur dérivé de l’acide folique et provoquer une toxicité vis-

à-vis de certains organes.

Pour tester cela, l’expression des gènes murins mFOLR1 et mFOLR2 a été mesurée par

RT-qPCR dans des extraits de cellules saines provenant de l’ovaire, de l’utérus, des reins et du

cœur. Comme illustré sur la figure 39, le mélange DV n’entraine pas de variations significatives

de l’expression de ces gènes, comparée aux cellules provenant des animaux traités uniquement

avec le mélange de solvants. Ces résultats établis, l’étude in vivo de l’efficacité d’un vecteur

dérivé de l’acide folique administré seul ou avec le mélange DV a été entreprise.

Figure 40. (A) Suivi de la croissance tumorale (mesure au pied à coulisse). Des xénogreffes de

cellules KB ont été implantées par voie sous-cutanée à des souris femelles BALB/c nude (jour

0). A partir du 4e jour, les animaux ont reçu quotidiennement par voie intrapéritonéale 2 mg/kg

de dexaméthasone et 300 mg/kg de VPA. Les jours 6, 8, 11, 13 et 15, les souris ont également

reçu par voie intraveineuse 0,5 mg/kg de vecteur MGAF. Moyennes ± s.e.m. de 5 à 8 animaux,

test statistique : Two-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, ns : p-value > 0,05 ; ** : p-

value ≤ 0,01 ; *** : p-value ≤ 0,001. (B) Après euthanasie, les tumeurs des animaux de chaque

groupe ont été pesées. Moyennes ± s.e.m. de 5 à 8 tumeurs, test statistique : One-way ANOVA

suivi d’un post-test Bonferroni, ns : p-value > 0,05 ; *** : p-value ≤ 0,001. (C) Mesure par

HPLC/HRMS de la MMAE présente dans les tumeurs des animaux traités avec le vecteur seul

ou en combinaison avec le mélange DV. Moyennes ± s.e.m. pour 6 à 8 tumeurs, test statistique :

t-test de Student, * : p-value ≤ 0,05.



75

B. MODULATION DE L’ACTIVITE ANTITUMORALE D’UN VECTEUR

1. Effet sur la croissance tumorale

Précédemment, notre groupe a mis au point un vecteur appelé MGAF dérivé de la

monométhyl Auristatine E et ciblant les récepteurs FR (Legigan et al., 2012a). Ce vecteur qui est

décrit page 38, a été validé in vitro et in vivo sur des cellules KB. Pour rappel, suite à la liaison

du vecteur au récepteur FR, celui-ci est internalisé par endocytose. Au sein du lysosome, les β-

galactosidases clivent la gâchette enzymatique du vecteur, la MMAE est alors libérée et peut

exercer son activité cytotoxique. Ainsi, en augmentant le nombre de récepteurs à la surface des

cellules tumorales grâce au mélange DV, une plus grande quantité de vecteur devrait pénétrer à

l’intérieur des cellules, et de fait, son efficacité devrait augmenter.

Afin de tester cette hypothèse, des cellules KB ont été implantées comme précédemment

à des souris femelles BALB/c nude. Quatre jours après implantation des tumeurs, 2 mg/kg de

dexaméthasone et 300 mg/kg de VPA ont été administrés quotidiennement aux animaux. Les

souris ont également reçu une injection de vecteur MGAF ou de solvant aux jours 6, 8, 11, 13 et

15. Au cours de l’étude permettant sa validation biologique, il a été montré que le vecteur

MGAF, utilisé à la concentration de 5 mg/kg, entrainait une réduction durable et presque totale

de la masse tumorale (Legigan et al., 2012a). Dans la présente étude, une concentration non

efficace de ce vecteur a volontairement été choisie, soit 0,5 mg/kg de MGAF. Avec cette dose, il

sera alors possible de visualiser, le cas échéant, le gain d’activité du vecteur dû au mélange DV.

Ainsi, comme attendu, le vecteur MGAF administré seul à 0,5 mg/kg n’a pas d’effet sur

le développement des tumeurs, comparé aux souris du groupe contrôle (solvant, Figure 40A). En

revanche, la dexaméthasone et le VPA utilisés sans le vecteur sont à eux seuls responsables

d’une inhibition significative de la croissance tumorale à partir du 11e jour de l’étude. A la fin de

l’expérience, le traitement des souris par le mélange DV aboutit à une inhibition de la croissance

tumorale de 53,9 % (813,4 ± 96,1 mm3 contre 1765,4 ± 204,3 mm3 pour les animaux du groupe

contrôle). Ces résultats sont en accord avec les données bibliographiques décrivant les propriétés

anticancéreuses de la dexaméthasone et du VPA (Tsai et al., 2013 ; Sau and Banerjee, 2014 ;

Geng et al., 2014).

Enfin, dans le dernier groupe, les souris ont été traitées avec le vecteur MGAF (0,5

mg/kg) en plus du mélange DV (Figure 40A). Dans ce cas, la croissance des tumeurs est



76

significativement inhibée dès le 11e jour de l’expérience comparée aux souris du groupe

contrôle. A la fin de l’étude, le cotraitement des animaux par le mélange DV et le vecteur MGAF

aboutit à une inhibition de 81,3 % de la croissance tumorale (329,5 ± 85,5 mm3 contre 1765,4 ±

204,3 mm3 pour les souris traitées avec les solvants) soit environ 30 % de plus que lorsque les

animaux sont traités uniquement avec le mélange DV.

A la fin de l’expérimentation, les tumeurs ont été prélevées et pesées (Figure 40B). Les

tumeurs prélevées aux animaux traitées avec les solvants ou le vecteur MGAF seul pèsent en

moyenne 1,21 ± 0,08 et 1,19 ± 0,11 g, respectivement. Les tumeurs des souris traitées par le

mélange DV présentent quant à elles un poids moyen de 0,48 ± 0,06 g, tandis que celles du

groupe de souris traitées avec le mélange adjuvant et le vecteur anticancéreux pèsent en

moyenne 0,29 ± 0,05 g. Il y a donc une différence d’environ 40 % de la masse des tumeurs de

ces deux groupes expérimentaux, en accord avec les résultats obtenus par la mesure du volume

tumoral.

Ces données suggèrent que le mélange DV, en plus d’exercer une activité antitumorale

qui lui est propre, semble agir comme un adjuvant du vecteur MGAF en permettant

l’internalisation d’une plus grande quantité de vecteur suite à la stimulation de l’expression des

récepteurs FR. Pour vérifier cela, la quantité de vecteur internalisé et métabolisé par les cellules

malignes lorsque celui-ci est administré aux souris seul ou en co-traitement avec le mélange DV

a été mesurée.

2. Mesure de la quantité d’agent anticancéreux libéré

L’effet du traitement DV sur la quantité de MMAE libérée suite à la décomposition du

vecteur MGAF dans les cellules tumorales a été étudié en mesurant la quantité de MMAE

présente dans les tumeurs (Figure 40C). En chromatographie en phase liquide couplée à la

spectrométrie de masse (HPLC/HRMS), l’aire correspondant à la MMAE présente dans les

tumeurs des animaux traités uniquement avec le vecteur représente 480 300 ± 77 670 unités

arbitraires. Dans les tumeurs des souris traitées à la fois avec le mélange DV et le vecteur

MGAF, l’aire de la MMAE représente 744 100 ± 78 640 unités arbitraires. Ainsi, le traitement

DV augmente de 55 % la quantité de MMAE présente dans les cellules malignes. L’ensemble de

ces résultats suggère que l’inhibition de la croissance tumorale observée lorsque les animaux

Figure 41. (A) Suivi du poids des souris traitées quotidiennement à partir 4e jour avec 2 mg/kg

de dexaméthasone et 300 mg/kg de VPA. Les jours 6, 8, 11, 13 et 15, les souris ont également

reçu par voie intraveineuse 0,5 mg/kg de vecteur MGAF ou de solvant. Moyennes ± s.e.m. de 5 à

8 animaux. Test statistique réalisé sur chaque groupe expérimental, comparaison au poids

mesuré au jour 4 : One-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni. (B) Coloration à l’éosine-

hémalun réalisée sur des coupes de reins prélevés à des souris traitées avec le vecteur MGAF

et/ou le mélange DV. Pour chaque condition, images représentatives du rein de 2 animaux.



77

sont traités avec le mélange DV et le vecteur MGAF est en lien avec une internalisation plus

importante du vecteur suite à l’augmentation du nombre de récepteurs FR à la surface des

cellules tumorales. Dans la suite de cette étude, la toxicité et les effets secondaires que pouvaient

entrainer le mélange DV et le vecteur MGAF chez les animaux ont également été étudiés.

C. TOXICITE DU COTRAITEMENT – EFFETS INDESIRABLES

1. Comportement et poids des souris

Au cours de l’expérimentation décrite ci-dessus, la mesure du poids des souris ainsi que

la recherche de signes de douleur ou de stress ont été effectuées quotidiennement. Aucun

changement dans le comportement ou l’activité des animaux n’a alors pu être noté malgré la

différence de poids observée entre les souris recevant le traitement adjuvant (seul ou en

cotraitement avec le vecteur) et les autres (Figure 41A). En effet, alors que le poids des souris

traitées avec les solvants ou avec le vecteur seul augmente régulièrement au cours de l’étude, le

poids des souris recevant le mélange DV n’évolue pas et est stabilisé entre 17 et 18 g dès la

première injection. L’augmentation du poids des souris traitées avec les solvants et le MGAF

seul peut en partie être expliquée par la croissance des tumeurs elles-mêmes qui, à la fin de

l’étude, pèsent en moyenne 1,20 g (Figure 40B). Cependant, les animaux étant âgés de six

semaines au début de l’expérimentation, cette différence peut également être expliquée par

l’administration de la dexaméthasone qui, comme beaucoup de glucocorticoïdes, peut provoquer

un retard ou un ralentissement de la croissance (Schäcke et al., 2002 ; Krishnan et al., 2013).

2. Etude histopathologique des organes sains

Afin de s’assurer de l’innocuité du cotraitement des souris par le mélange DV et le

vecteur, et compte tenu de la perte de poids entrainée par le mélange DV, une analyse

histopathologique a été réalisée sur différents organes tels que le cœur, le foie et les reins. Cette

étude, réalisée par un pathologiste indépendant, n’a alors révélé aucune toxicité due au traitement

des souris par le mélange DV ou par le vecteur MGAF, qu’ils aient été administrés seuls ou en



78

combinaison. A titre d’exemple, les colorations obtenues pour les reins de souris appartenant à

chaque groupe de traitement sont illustrées figure 40B.

En résumé, in vitro comme in vivo, le mélange DV agit comme un activateur

transcriptionnel du gène FOLR1 dans les cellules tumorales mais pas dans les cellules saines. In

vivo, le mélange DV présente deux activités : une activité antitumorale propre et une activité

adjuvante du vecteur MGAF. En effet, suite à l’augmentation de l’expression du gène FOLR1

entrainée par le mélange DV, une plus grande quantité de vecteur MGAF est internalisée par les

cellules tumorales. Cela aboutit à la libération de plus de MMAE dans les tumeurs ce qui se

traduit par un ralentissement plus important de la croissance tumorale, d’où des tumeurs 40 %

plus petites en comparaison des animaux traités uniquement avec le mélange DV. Si de prime

abord ces résultats semblent modestes, ils permettent cependant de valider le concept de l’étude.

En effet, l’utilisation d’une concentration non efficace du vecteur permet de conclure que

l’inhibition supplémentaire de la croissance des tumeurs observée lorsque les souris sont

cotraitées avec le mélange DV et le vecteur MGAF résulte de l’internalisation d’une plus grande

quantité de vecteur dans les tumeurs. Par ailleurs, ces résultats pourraient être améliorés en

augmentant la quantité de vecteur utilisée. Comme précisé au début de la description de cette

étude, la dose de MGAF administrée ici est 10 fois inférieure à la concentration efficace du

vecteur (5 mg/kg, Legigan et al., 2012a). Ainsi, en utilisant une concentration supérieure de

vecteur, par exemple 1 mg/kg, il pourrait être possible d’obtenir une inhibition plus importante,

voir une régression de la masse tumorale.

Dans la dernière partie de ce travail, qui est encore en cours à l’heure actuelle, j’ai

cherché, in vitro, quels mécanismes gouvernaient la coopération entre le mélange DV et le

vecteur MGAF.

Figure 42. (A) Mesure par HPLC/HRMS de la MMAE présente dans cellules KB et A549

traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone et 200 µM de VPA puis 24 heures avec

100 nM de MGAF. Les résultats ont été normalisés par rapport à la MMAE présente dans les

cellules traitées uniquement avec le vecteur. Moyennes ± s.e.m. de 6 expériences, test

statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, ns : p-value > 0,05 ; *** : p-value

≤ 0,001. (B) Mesure par test XTT de la viabilité des cellules KB traitées pendant 3 jours avec 0,1

µM de dexaméthasone et 200 µM de VPA puis pendant 24 heures avec différentes

concentrations de MMAE ou de MGAF. Moyennes ± s.e.m. de 6 expériences, test statistique :

Two-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, ns : p-value > 0,05.



79

IV. MECANISMES IMPLIQUES DANS LA MODULATION

DE L’ACTIVITE DU VECTEUR MGAF

A. INTERNALISATION DU VECTEUR MGAF

Avant de tenter d’identifier les mécanismes impliqués dans la modulation de l’activité du

vecteur MGAF en présence du mélange DV, j’ai cherché à vérifier qu’à l’instar des tumeurs de

l’étude précédente, l’augmentation de l’expression des FR par le mélange DV aboutissait, in

vitro, à l’internalisation et à la métabolisation d’une quantité plus importante de vecteur MGAF.

Pour cela, comme précédemment, la quantité de MMAE libérée à partir du vecteur a été

mesurée par HPLC/HRMS dans les cellules KB et A549 prétraitées ou non avec le mélange DV

(Figure 42A). Dans les cellules A549, le mélange DV n’a pas d’effet sur la quantité de MMAE

libérée. A l’inverse, dans les cellules KB, le mélange DV entraine une augmentation de 74 % de

la quantité de MMAE détectée dans les cellules KB comparée aux cellules traitées uniquement

avec le vecteur. La suite de mon travail a alors consisté à déterminer l’impact de cette

augmentation sur les cellules tumorales. A cette fin, la viabilité des cellules KB traitées avec le

vecteur seul ou en combinaison avec le mélange DV a été étudiée.

B. EFFET DU COTRAITEMENT SUR LA VIABILITE DES CELLULES KB

La toxicité induite sur les cellules KB par le vecteur MGAF en présence ou en absence du

mélange DV a été évaluée par mesure de la viabilité (Figure 42B). De manière surprenante,

quelle que soit la concentration à laquelle le vecteur MGAF est utilisé, aucune variation de son

activité n’est observée en présence du mélange DV. J’ai alors vérifié que l’activité de la MMAE

elle-même n’était pas modifiée en présence du mélange DV (Figure 42B). Ainsi, bien que son

activité ne soit pas altérée, l’augmentation de la quantité de MMAE libérée dans les cellules KB

n’a pas d’impact sur la viabilité de ces cellules in vitro. Pour expliquer les résultats in vivo, une

autre piste a alors été explorée.

Figure 43. (A) Colonies de cellules KB cultivées en matrice semi-solide d’agarose et traitées

pendant 3 ou 6 jours avec 5 nM de vecteur MGAF et/ou 0,1 µM de dexaméthasone et 200 µM de

VPA. Images représentatives de 5 expériences et obtenues au macroscope (MacroView MVX10

Olympus) ou au microscope (Olympus CKX41). La taille (B) et le nombre (C) de colonies ont

été déterminés à l’aide du logiciel ImageJ. Moyennes ± s.e.m. de 4 à 5 expériences, test

statistique : Two-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, ns : p-value > 0,05 ; ** : p-value

≤ 0,01 ; *** : p-value ≤ 0,001.



80

C. TOXICITE DU COTRAITEMENT SUR LES CELLULES CULTIVEES EN

CONDITION SANS ANCRAGE

Plusieurs études ont montré que les agents déstabilisant les microtubules ou perturbant la

formation du fuseau mitotique tels que la paxilline et la staurosporine, entrainaient la mort de

certaines cellules cancéreuses en activant les mécanismes d’une apoptose particulière appelée

anoïkis (Deschesnes et al., 2007 ; Yadav et al., 2015). L’anoïkis est déclenchée notamment

lorsque les cellules saines se détachent ou établissent des contacts inappropriés avec la matrice

extracellulaire ou les cellules avoisinantes (Frisch and Screaton, 2001). C’est un élément clé de

l’homéostasie tissulaire. La dérégulation ou l’échappement des cellules cancéreuses à l’anoïkis

favorise alors leur survie et la formation de métastases. Ainsi, la résistance des cellules

cancéreuses à cette forme particulière d’apoptose est aujourd’hui clairement considérée comme

un facteur d’agressivité (pour revue Paoli et al., 2013).

La MMAE est un puissant agent cytostatique dérivé de la dolastatine 10 qui inhibe la

polymérisation des microtubules en se liant à la sous-unité β de la tubuline (Bai et al., 1990).

Compte tenu de ces données, j’ai testé la capacité du cotraitement par le mélange DV et le

vecteur MGAF à stimuler l’anoïkis dans les cellules KB. Pour cela, et afin de mimer les

conditions nécessaires au déclenchement de l’anoïkis, les cellules n’ont plus été cultivées sous

forme de tapis cellulaire, mais en condition sans ancrage, permettant leur développement en trois

dimensions.

1. Effet sur la croissance des cellules dans une matrice semi-solide

Afin de tester la capacité du mélange DV et du vecteur MGAF à déclencher l’anoïkis, les

cellules KB ont été cultivées dans une matrice semi-solide d’agarose de sorte à empêcher leur

adhérence à la boite de culture. La capacité des cellules à échapper à l’anoïkis a alors été évaluée

en déterminant la taille et le nombre des colonies formées (Figures 43A). Les colonies formées

par les cellules KB non traitées présentent une aire moyenne de 10970,8 ± 831,6 µm² et de

17812,0 ± 2032,2 µm² au troisième et sixième jour de l’expérience, respectivement (Figure 43B).

Alors que seuls, ni le mélange DV ni le vecteur n’ont d’effet sur la taille des colonies, leur

utilisation simultanée entraine une réduction d’environ 50 % après trois jours de traitement, et

d’environ 60 % après six jours, l’aire respective des colonies étant alors de 5648,4 ± 496,6 et

Figure 44. (A) Cellules KB adhérentes ou ensemencées sur poly-HEMA et traitées 3 jours avec 0,1

µM de dexaméthasone et 200 µM de VPA et/ou 5 nM de MGAF. Images représentatives de 4

expériences, barre d’échelle : 150 µm. (B) Mesure par cytométrie en flux de l’apoptose induite dans

les cellules KB après 3 jours de traitement avec 5 nM de MGAF en présence ou en absence de 0,1

µM de dexaméthasone et 200 µM de VPA. Moyennes ± s.e.m. de 4 expériences, test statistique :

One-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, ns : p-value > 0,05 ; * : p-value ≤ 0,05 ; ** : p-

value ≤ 0,01 ; *** : p-value ≤ 0,001. (C) Mesure par RT-qPCR de l’expression du gène FOLR1 dans

les cellules KB adhérentes ou cultivées sur poly-HEMA et traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de

dexaméthasone et 200 µM de VPA. Moyennes ± s.e.m. de 4 expériences, test statistique : Two-way

ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, * : p-value ≤ 0,1 ; ** : p-value ≤ 0,05.



81

7095,3 ± 1056,1 µm². De plus, le nombre de colonies formées par les cellules KB diminue

également au bout de six jours de traitement avec le mélange DV et le vecteur MGAF (Figure

43C). En effet, alors qu’il est possible de compter en moyenne 216,1 ± 27,7 colonies de plus de

7000 µm² lorsque les cellules ne sont pas traitées, il n’y en a plus que 44,2 ± 12,2 après six jours

de traitement.

Ainsi, lorsqu’ils sont utilisés séparément, le mélange DV et le vecteur MGAF n’ont pas

d’effet sur le développement des colonies KB. En revanche, utilisés ensemble, ils entrainent une

diminution d’environ 80 % du nombre de colonies, les colonies restantes étant 60 % plus petites.

Pour tester l’hypothèse de l’anoïkis, j’ai alors cherché à savoir si l’inhibition de la croissance des

colonies de cellules KB était due à une stimulation de l’apoptose.

2. Effet sur l’apoptose dans les cellules KB cultivées en suspension

Malgré les observations intéressantes que fournit la croissance en matrice semi-solide

d’agarose, celle-ci ne permet que difficilement la récupération des cellules pour analyse. C’est

pourquoi, pour la suite de cette démonstration, les cellules KB ont été cultivées en suspension à

l’aide d’un polymère appelé poly-HEMA. Ce dernier est utilisé comme revêtement des boites de

culture et empêche l’adhérence des cellules (Friedrich et al., 2009 ; Kuroda et al., 2013). Les

cellules KB ont alors été traitées avec le mélange DV et/ou 5 nM de MGAF. De prime abord, il

est possible de constater que les cellules KB cotraitées avec le mélange DV et le vecteur MGAF

ne forment pas d’agrégat comme dans les autres conditions (Figure 44A). Le nombre de cellules

apoptotiques a alors été déterminé par cytométrie en flux.

Comme illustrée sur la figure 44B, la culture des cellules sur poly-HEMA n’entraine pas

de variation de la proportion de cellules en apoptose (11,9 ± 0,9 % des cellules) comparée aux

cellules adhérentes (10,7 ± 1,2 % des cellules). De plus, le traitement des cellules KB par le

mélange DV n’a pas d’effet sur l’induction de l’apoptose, quelles que soient les conditions de

culture. A l’inverse, que les cellules KB soient adhérentes ou en suspension, le vecteur MGAF

multiplie par deux la proportion de cellules apoptotiques (23,8 ± 1,8 % de cellules apoptotiques

adhérentes et 22,5 ± 1,8 % de cellules apoptotiques en suspension). Par ailleurs, lorsqu’elles sont

adhérentes, le cotraitement des cellules KB par le mélange DV et le vecteur MGAF n’augmente

pas la proportion de cellules apoptotiques. Au contraire, le nombre de cellules en apoptose est

Figure 45. (A) Taille et (B) nombre de colonies formées par les cellules HeLa, A2780 et A549

en matrice semi-solide d’agarose et traitées pendant 6 jours avec 5 nM de vecteur MGAF en

présence ou en absence de 0,1 µM de dexaméthasone et 200 µM de VPA. Moyennes ± s.e.m. de

2 expériences.



82

alors équivalent à celui observé pour les cellules non traitées. En revanche, lorsqu’elles sont

cultivées en condition sans ancrage, le traitement simultané des cellules KB par le mélange DV

et le vecteur MGAF se traduit par l’induction de l’apoptose dans 59,3 ± 5,2 % des cellules

(contre 22,5 ± 1,8 % des cellules lorsque le vecteur est utilisé seul). Dans ces conditions,

l’activité du vecteur MGAF en présence du mélange DV est alors multipliée par 2,6 fois. Compte

tenu de ces conditions particulières de culture, il a également été vérifié que la capacité du

mélange DV à stimuler la transcription du gène FOLR1 dans les cellules KB était conservée

(Figure 41C).

Ainsi, lorsque les cellules KB sont cultivées en condition sans ancrage, l’activité du

vecteur MGAF est potentialisée en présence du mélange DV. L’inhibition de la croissance

tumorale observée in vivo lorsque les souris sont traitées avec le mélange DV et le vecteur

MGAF impliquerait alors l’induction d’une apoptose de type anoïkis. Par ailleurs, à l’heure de la

rédaction de cette thèse, une étude similaire a été initiée afin de voir si ce phénomène est

retrouvé pour les cellules HeLa, A2780 et A549.

3. Effet sur les cellules HeLa, A2780 et A549

Comme pour les cellules KB, les cellules HeLa, A2780 et A549 ont été ensemencées en

matrice semi-solide d’agarose et le développement des colonies a été observé (Figure 45). Par

manque de temps, seuls des résultats préliminaires sont disponibles à ce jour et l’analyse des

données a été réalisée d’après les paramètres déterminés pour les cellules KB. Cependant, bien

que ces résultats soient à prendre avec prudence (deux expériences seulement), après six jours de

traitement, seul le traitement simultané des cellules HeLa et A2780 semble capable d’inhiber le

développement des colonies, que ce soit en termes de taille (Figure 45A) ou de nombre (Figure

45B). A l’inverse, le développement des colonies de cellules A549 (qui n’expriment pas les

récepteurs FR même suite au traitement par le mélange DV) ne semble pas affecté par le vecteur

MGAF, qu’il soit utilisé seul ou en combinaison avec le mélange DV.

Ainsi, ces premiers résultats sur les cellules HeLa et A2780 semblent amener vers les

mêmes conclusions que celles déduites pour les cellules KB. De plus, l’absence d’effet observé

pour les cellules A549 suggère le rôle primordial des FR et de la stimulation de leur expression

par le mélange DV pour l’augmentation de l’activité du vecteur MGAF. Néanmoins, ces



83

expériences préliminaires nécessitent d’être reproduites et approfondies pour permettre une

analyse plus rigoureuse de ces données.

5E PARTIE

DISCUSSION &

PERSPECTIVES

5e Partie – Discussion & Perspectives

84

I. OPTIMISATION CHIMIQUE DES VECTEURS DERIVES DE

L’ACIDE FOLIQUE

Dans la première partie de ce travail, nous avons vu qu’il était possible d’optimiser le

ciblage des récepteurs à l’acide folique en synthétisant des conjugués capables de doubler la

quantité d’agent anticancéreux internalisée par les cellules tumorales exprimant les récepteurs à

l’acide folique.

Le premier vecteur reposant sur ce concept est le veteur diDGAF, constitué d’une

molécule d’acide folique, de deux molécules de doxorubucine et d’une gâchette enzymatique

galactosylée (Grinda et al., 2013, voir page 64). Les propriétés à la fois cytotoxiques et

fluorescentes de la doxorubicine nous ont permis d’établir des preuves de concept de synthèse

chimique. Cependant, la vectorisation de la doxorubicine aboutit à des composés dont la

solubilité limite l’évaluation in vivo. Ainsi, après cette étude, nous avons fait le choix de nous

concentrer sur la synthèse d’un vecteur homodimérique dérivé de la Monométhyl Auristatine E

(vecteur diMGAF) et qui est aujourd’hui en attente d’évaluation in vivo (Alsarraf et al., 2015,

voir page 64).

In vitro, le vecteur diMGAF a été testé sur trois lignées tumorales exprimant les

récepteurs à l’acide folique. Le traitement de deux de ces lignées, les cellules SKOV-3 et HeLa,

révèle une toxicité environ deux fois plus importante que celle de l’homologue monomère

MGAF, ces résultats étant alors compatibles avec la libération de deux fois plus de MMAE par le

vecteur diMGAF. En revanche, dans la troisième lignée cellulaire utilisée, les cellules A2780, la

toxicité induite par le vecteur diMGAF est environ quatre fois plus importante que celle du

vecteur monomérique. Par spectrométrie de masse, le vecteur diMGAF entraine également la

détection de quatre fois plus de MMAE dans les cellules A2780, comparée aux cellules traitées

avec le MGAF.

En 2012, Antunes et al. décrivent que la nécrose entrainée par des agents toxiques dans

les cellules tumorales peut aboutir au relargage d’une enzyme lysosomale (la β-glucuronidase)

dans le milieu extracellulaire. La MMAE étant un agent cytotoxique et la β-galactosidase une

enzyme lysosomale, ce phénomène pourrait alors expliquer les résultats obtenus sur les cellules

A2780. Dans ces cellules, la libération de deux fois plus de MMAE pourrait déclencher une

nécrose, aboutissant au relargage des β-galactosidases lysosomales dans le milieu de culture des


85

cellules. S’en suivrait alors un cercle vicieux dans lequel une partie du vecteur serait activée en

extracellulaire par la β-galactosidase relâchée dans le milieu alors que l’autre partie continuerait

à être internalisée et activée en intracellulaire. Ce modèle aboutirait ainsi à une toxicité plus

importante sur les cellules A2780 que sur les cellules HeLa et SKOV-3. Cette théorie pourrait

être facilement testée en mesurant à l’aide d’un substrat colorimétrique l’activité des β-

galactosidases présentes dans le milieu de culture des cellules HeLa, SKOV-3 et A2780 traitées

par le vecteur diMGAF.

En plus d’augmenter la quantité d’agent anticancéreux internalisé et libéré dans les

cellules tumorales, les vecteurs dimériques présentent d’autres avantages. Le premier avantage

de ces composés réside dans leur structure et leur stratégie de synthèse qui permettent

d’interchanger l’agent anticancéreux vectorisé. Ces molécules pourraient alors être importantes

dans le développement d’une nouvelle génération de vecteurs entrant dans le concept de

médecine personnalisée, dont l’amélioration constitue le sixième objectif du Plan Cancer 2014-

2019, et qui repose sur l’adaptation du traitement en fonction des caractéristiques biologiques

(génétiques, métaboliques, etc.) d’une tumeur.

Par ailleurs, dans les deux études présentées ici, les vecteurs sont des homodimères. Pour

augmenter l’efficacité antitumorale de ces composés, il est possible de concevoir des composés

hétérodimériques qui transporteraient des agents anticancéreux dont les modes d’action seraient

différents et/ou dont les activités seraient synergiques. Ainsi, on peut imaginer des vecteurs

hétérodimériques conjuguant un agent cytostatique ou cytotoxique (doxorubicine ou MMAE)

dont l’activité serait complétée par un agent anti-angiogénique (Imatinib, Sunitinib, etc.) ou par

un composé permettant le recrutement du système immunitaire (cytokines, chimiokines, motifs

bactériens, etc.).

Dans ce contexte, en utilisant un autre type de ciblage que celui des récepteurs à l’acide

folique, le laboratoire a développé un conjugué contenant une molécule de doxorubicine et un

inhibiteur d’HDAC, le MS-275 (Grinda et al., 2011). En plus de promouvoir la différenciation,

l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose dans les cellules tumorales (Rosato et al., 2003), le MS-

275 pourrait soutenir l’activité de la doxorubicine. Comme il l’a été montré pour d’autres

inhibiteurs d’HDAC, le MS-275 pourrait faciliter l’accès de la doxorubicine à l’ADN en

favorisant un état relâché de la chromatine et ainsi potentialiser l’induction de l’apoptose

(Catalano et al., 2006 ; Pan et al., 2007). De plus, il est maintenant établi que l’usage de

combinaison d’agents anticancéreux présentant différents sites d’action est une stratégie efficace

Figure 46. Modes d’action hypothétiques de la dexaméthasone et du VPA sur la stimulation de

l’expression des récepteurs à l’acide folique (FRα) dans les cellules cancéreuses. (A) Au sein des

cellules, la dexaméthasone lie et active l’isoforme α des récepteurs aux glucocorticoïdes (GRα).

Par la suite, les récepteurs GRα se dimérisent et sont transloqués dans le noyau où ils agissent

comme facteurs de transcription et entrainent la synthèse de novo de facteurs intermédiaires

inconnus. Ces facteurs induisent alors le promoteur P4 du gène FOLR1 aboutissant à la synthèse

de protéines FRα fonctionnelles. Le mode d’action du VPA est plus hypothétique. Il pourrait

favoriser l’accès des facteurs transactivateurs au promoteur P4 du gène FOLR1 en maintenant la

chromatine dans un état relâché (B). Il pourrait également diminuer la proportion de GRβ, qui

s’hétérodimérise avec GRα pour en inhiber l’activité (C) ou inhiber le rétrocontrôle négatif

exercé par la dexaméthasone sur l’expression de GRα (D).


86

pour prévenir l’apparition de résistances dans les cellules tumorales (Chabner and Roberts,

2005 ; Núñez et al., 2016). Cette caractéristique pourrait constituer un argument supplémentaire

pour le développement de vecteurs hétérodimères.

II. OPTIMISATION BIOLOGIQUE DU CIBLAGE DES

RECEPTEURS A L’ACIDE FOLIQUE

A. STIMULATION DU GENE FOLR1

Dans la seconde partie de mes travaux de thèse, nous avons mis en évidence que le

mélange DV, composé de dexaméthasone et de VPA stimulait l’expression du gène FOLR1 dans

les cellules tumorales. Pour le moment, seule une étude fonctionnelle a été menée. Pour

compléter ce travail, il est nécessaire d’identifier les mécanismes par lesquels le mélange DV

aboutit à l’augmentation de l’expression des récepteurs à l’acide folique. Pour cela, plusieurs

pistes peuvent être envisagées.

Le gène FOLR1, situé sur le chromosome 11, est constitué de 7 exons et de 6 introns. Il

possède deux promoteurs alternatifs appelés P1 et P4 et situés respectivement en amont des

exons 1 et 4 du gène (Saikawa et al., 1995 ; Elwood et al., 1997). En 2005, Tran et al. ont

montré que la dexaméthasone stimule indirectement la transcription du gène FOLR1 et isolent la

séquence du promoteur responsable de la réponse à ce glucocorticoïde. Compte tenu du délai

d’activation du promoteur suite au traitement des cellules par la dexaméthasone, ce groupe

suggère qu’en se liant et en activant les récepteurs aux glucocorticoïdes (GR), la dexaméthasone

entrainerait la synthèse de novo de médiateurs permettant l’activation du promoteur P4 du gène

FOLR1 (Figure 46A). Cette hypothèse est renforcée par l’absence d’induction du gène FOLR1

par la dexaméthasone lorsque les cellules sont traitées avec de la cycloheximide, un inhibiteur de

synthèse protéique. Ils observent également que l’induction de l’expression de FOLR1 par la

dexaméthasone dans les cellules HeLa est potentialisée par la trichostatine A (TSA) ou le VPA,

deux inhibiteurs de déacétylases d’histones (HDAC).

Nom du facteur Séquence de fixation Nombre de sites

Maz CCCTCCC 1

E47 ACAGCTG 1

AP4 CAGCTG 2

IK3 GCATTCCC 1

Myc-Max ACCATGTG 2

c-MYB GATTGTTGG 1

MZF1 GGGGA 1

PPARG GGGGGCAAAGGCCA 2

HNF4 GGGCAAAGGCCA 2

DR1 GGGCAAAGGCCA 1

GLI TGGGTGGTC 1

ZIC2 GGTGGT 2

ZIC3 GGTGGT 1

USF CACCTG 2

HNF4 GGGCA 1

SF1 CAAGGCAA 1

LYF1 TCCCAAA 1

PPARA GGTCAAAGGATT 1

SMAD4 GCTGGCTGTCCCCT 1

COUP TGTCCTGTGAC 1

IK2 GGGA 1

GC CCCCACCC 1

SP1 CCACCC 2

MAZR CCCCACC 1

HIF1 CACCT 1

PEBP ACCACA 1

OSF2 ACCACA 1

AML1 ACCACA 1

Tableau 11. Liste des facteurs de transcription possédant des sites de fixation potentiels sur

l’intron 3 (comprenant le promoteur P4) du gène FOLR1. Cette liste a été établie par

comparaison in silico des introns 3 des gènes FOLR1 humain, canin et simien (macaque) à l’aide

du site http://www.dcode.org.


87

L’induction du promoteur de FOLR1 par la dexaméthasone résulte d’un processus autre

que la fixation du complexe GR/dexaméthasone sur un site Glucocorticoid receptor Response

Element (GRE, Tran et al., 2005) un site de liaison des récepteurs GR. L’analyse in silico que

j’ai menée sur l’intron 3 du gène FOLR1 et contenant la séquence du promoteur P4 conforte

cette hypothèse puisqu’elle n’identifie aucun site de liaison GRE. Cette analyse révèle en

revanche la présence de sites de fixation potentiels pour une trentaine de facteurs de

transcription, listés dans le tableau 11. En parallèle, une analyse par puce à ARN, permettrait

d’identifier si l’expression de certains de ces facteurs est modifiée par la dexaméthasone et/ou

par le mélange DV. Pour tester l’interaction des facteurs les plus intéressants, ainsi que l’impact

du traitement de la dexaméthasone sur cette interaction, une expérience d’immunoprécipitation

de la chromatine pourrait être mise en place.

D’autre part, dans nos modèles cellulaires, il faudrait déterminer quel est le rôle du VPA

dans la stimulation du gène FOLR1. Les HDAC sont des enzymes impliquées notamment dans la

structure de la chromatine. En catalysant la perte d’un groupement acétyle sur les histones, les

HDAC favorisent l’interaction entre ces protéines et l’ADN, maintenant de ce fait la chromatine

dans un état compacté souvent associé à une répression de l’expression des gènes (Lane and

Chabner, 2009). Du fait de son activité inhibitrice d’HDAC, le VPA favoriserait au contraire un

état relâché de la chromatine et pourrait faciliter l’accès de facteurs de transcription à leur site de

liaison sur le promoteur P4 du gène FOLR1 (Figure 46B). Pour tester cela, une expérience

d’immunoprécipitation de la chromatine pourrait être mise en place pour étudier le niveau

d’acétylation des histones au niveau du promoteur P4 en présence et en absence de VPA.

Par ailleurs, par épissage alternatif, plusieurs variants de récepteurs aux glucocorticoïdes

sont générés, les deux plus abondants étant les isoformes GRα et GRβ (Oakley et al., 1997).

L’isoforme GRα, qui est exprimé de manière ubiquitaire dans les conditions physiologiques, est

activée par les glucocorticoïdes tels que la dexaméthasone. Après homodimérisation, les

complexes dexaméthasone/GRα sont alors transportés dans le noyau où ils régulent la

transcription de nombreux gènes. A l’inverse, l’isoforme GRβ est incapable de lier les ligands et

son profil d’expression est plus restreint (Lu and Cidlowski, 2006). Il se lie à l’isoforme GRα

pour réprimer son activité transactivatrice (Oakley et al., 1999 ; Figure 46C). En diminuant la

proportion du variant GRβ au profit de la forme GRα, le VPA pourrait soutenir l’activité

transactivatrice de la dexaméthasone sur le gène FOLR1. Enfin, en plus de lier et d’activer les

GR, la dexaméthasone exerce un rétrocontrôle négatif sur leur expression (Dong et al., 1988 ; Xu


88

et al., 2003, Figure 46D). Une diminution de ce rétrocontrôle par le VPA pourrait expliquer le

maintien de la stimulation de l’expression du gène FOLR1 au court du temps, malgré le

traitement continu des cellules par la dexaméthasone.

Au cours de l’étude menée in vivo, nous avons observé que le mélange DV stimulait

l’expression des récepteurs dans les cellules tumorales, au moins au niveau transcriptomique. Au

niveau protéique, l’analyse par Western blot des tumeurs KB révèle une double bande qui n’est

pas détectée lorsque les cellules tumorales proviennent d’une culture cellulaire. Le récepteur

FRα contient trois sites potentiels de N-glycosylation (Wang et al., 1992 ; Salazar and Ratnam,

2007). Les bandes que nous avons observées par Western blot pourraient alors correspondre à

des formes différentes de FRα due à des modifications post-traductionnelles. Après s’être assuré

de la spécificité de l’anticorps en mettant en place une compétition avec une protéine FRα

recombinante ou un peptide mimant l’épitope reconnu par l’anticorps, l’hypothèse d’une

modification post-traductionnelle pourrait être étudiée en incubant les échantillons issus des

tumeurs avec des glycosylases. En 1997, Shen et al. ont montré que la glycosylation des

protéines FR était importante pour leur maturation et leur adressage à la membrane des cellules

(Shen et al., 1997). Dans notre cas, l’étude de la glycosylation des FR est intéressante car elle

pourrait influencer l’efficacité de l’internalisation du vecteur MGAF.

Ainsi, nous avons observé que l’expression du gène FOLR1 pouvait être stimulée par les

récepteurs aux glucocorticoïdes activés par la dexaméthasone et que cette induction pouvait être

potentialisée par un inhibiteur d’HDAC. Hors, une autre hormone stéroïdienne semble

importante dans la régulation du gène FOLR1. Les récepteurs à l’acide folique étant souvent

surexprimés dans les cancers mammaires et d’origine gynécologique (Parker et al., 2005), Kelley

et al. se sont intéressés à la régulation de ce gène par les récepteurs aux œstrogènes (ER). Ils ont

alors montré que l’expression de FOLR1 était réprimée par les récepteurs ER activés par le 17β-

œstradiol (Kelley et al., 2003). Ceci est en accord avec l’observation selon laquelle 70 à 80 %

des cancers mammaires n’exprimant pas les récepteurs aux œstrogènes présentent une forte

expression des récepteurs à l’acide folique (Cheung et al., 2016). Il existe d’ailleurs une

corrélation négative entre les tumeurs qui expriment les récepteurs aux œstrogènes et celles

exprimant les FR (O’Shannessy et al., 2012b ; Zhang et al., 2014). Dans une large étude menée

sur plus de 2900 femmes atteintes de carcinome ovarien, 81 % des tissus examinés présentaient

une expression des récepteurs aux œstrogènes (Voutsadakis, 2016). Compte tenu de leur effet

répresseur quant à l’expression de FOLR1, les récepteurs aux œstrogènes pourraient alors


89

entrainer des variations dans les niveaux d’expression de FRα dans les cancers ovariens et

diminuer l’efficacité thérapeutique de molécules vectorisées telles que le Vintafolide (Cheung et

al., 2016, voir page 34). Dans ce contexte, le mélange d’activateurs transcriptionnels développé

au cours de ma thèse apparait comme une alternative pour potentialiser l’activité anticancéreuse

de ce type de médicaments.

B. EFFETS DU MELANGE DV IN VIVO

Au cours de l’étude in vivo, nous avons observé que le mélange DV était capable à lui

seul d’inhiber la croissance tumorale d’environ 50 % comparée aux animaux traités avec le

solvant. Ce résultat est en accord avec les propriétés anticancéreuses rapportées pour chacune de

des molécules composant le mélange DV. La dexaméthasone est fréquemment utilisée dans les

protocoles de chimiothérapie pour prévenir les effets secondaires dus aux agents anticancéreux

(nausées, vomissements, douleur, etc.) mais aussi pour traiter certains types de leucémies et de

myélomes (Sau and Banerjee, 2014). Elle est également à l’étude pour le traitement de certains

types de cancers solides, notamment de la prostate (Holder et al., 2015 ; Venkitaraman et al.,

2015). L’activité anticancéreuse de la dexaméthasone serait due à ses propriétés anti-

inflammatoires et anti-angiogéniques ainsi qu’à sa capacité de régulation de certains facteurs de

transcription impliqués dans la prolifération, l’invasion et la métastase des tumeurs (Yano et al.,

2006 ; Wang et al., 2015). Par exemple, la dexaméthasone réprime l’expression de NF-κB, un

facteur de transcription impliqué dans la survie et la croissance cellulaires et qui est souvent

activé de manière constitutive dans les cellules cancéreuses (Bosscher et al., 2000).

Le VPA est utilisé depuis les années 1960 comme agent anti-convulsant et stabilisateur

d’humeur pour le traitement de pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie,

dépression, schizophrénie, etc. Chateauvieux et al., 2010). Du fait de son activité inhibitrice

d’HDAC, le VPA présente également un intérêt dans le traitement du cancer. En effet, comme

beaucoup d’inhibiteurs d’HDAC, le VPA est impliqué dans plusieurs processus biologiques

(pour revue : Bracker et al., 2009). En altérant l’expression de protéines régulatrices du cycle

cellulaire, les inhibiteurs d’HDAC peuvent entrainer l’arrêt du cycle cellulaire. Ils peuvent

également induire l’apoptose dans plusieurs types de cancers (mammaire, prostatique,

thyroïdien, leucémie et myélome) en favorisant l’expression de facteurs pro-apoptotiques et en

inhibant l’expression de facteurs anti-apoptotiques (Bracker et al., 2009 ; Chateauvieux et al.,


90

2010). Les quelques essais cliniques utilisant le VPA seul n’ont fourni que de modestes résultats.

En revanche, au cours de différents essais cliniques de phases I et II, l’utilisation du VPA en

combinaison avec des agents cytotoxiques chimiothérapeutiques ont montré des résultats

encourageants pour le traitement de différentes tumeurs solides (cancers mammaires

métastatiques, mésothéliomes, mélanomes métastatiques), voir une amélioration de la survie

globale pour le cancer du col de l’utérus (Brodie and Brandes, 2014).

Lors de cette expérience, nous avons observé que le poids des souris traitées uniquement

avec le vecteur MGAF ou le mélange de solvants augmentait tout au long de l’étude. Au

contraire, lorsque les animaux reçoivent le mélange DV, seul ou en combinaison avec le vecteur,

leur poids n’évolue pas et reste équivalent à celui mesuré le jour de la première injection. Ceci

peut être expliqué par l’utilisation de glucocorticoïdes comme la dexaméthasone qui peut

entrainer un retard ou un ralentissement de croissance (Schäcke et al., 2002 ; Krishnan et al.,

2013), ainsi qu’une perte de poids et une atrophie musculaire chez la souris (Qin et al., 2013 ;

KIM et al., 2015). Le VPA, quant à lui est associé chez l’homme à une prise de poids voir à

l’apparition d’une obésité (Pickrell et al., 2013 ; Verrotti et al., 2009). Chez les rongeurs, il

semble cependant avoir l’effet inverse puisqu’il entraine une perte de poids chez le rat (Wolden-

Hanson et al., 1998 ; Korkmazer et al., 2006).

Par le biais de différentes études, il a été mis en évidence que la dexaméthasone et le

VPA pouvait entrainer une toxicité vis-à-vis du cœur et du foie, respectivement (Oakley and

Cidlowski, 2015 ; Ren et al., 2012 ; Abdel-Dayem et al., 2014). Compte tenu de ces données et

de la différence de poids entre les animaux traités avec le mélange DV et les autres, le cœur et le

foie des animaux de chaque groupe expérimental ont été soumis à une analyse histopathologique,

réalisée par un spécialiste indépendant. Cette étude n’a alors révélé aucune toxicité suite au

traitement des souris par le mélange DV seul ou en combinaison avec le vecteur. D’autre part,

parce que les tubules proximaux des reins expriment les récepteurs à l’acide folique (Low and

Kularatne, 2009), une analyse histopathologique a également été réalisée dans ces organes.

Aucune nephro-toxicité n’a alors été observée pour les reins des animaux traités avec le vecteur

MGAF seul ou en présence du mélange DV. Ces résultats sont en accord avec ceux observés au

cours des essais cliniques menés sur l’Etarfolatide et le Vintafolide (Cheung et al., 2016). En

effet, les études menées chez l’homme pour l’Etarfolatide mais également pour d’autres agents

d’imagerie vectorisés ciblant les récepteurs à l’acide folique, montrent que ces derniers sont

retenus au niveau des reins (Low and Kularatne, 2009). En dépit de cela, lors de l’essai clinique

Figure 47. (A) Mesure par RT-qPCR de l’expression du récepteur FOLR1 dans les cellules KB

traitées pendant 3 jours avec 0,1 µM de dexaméthasone. En plus de la dexaméthasone, les

cellules sont traitées avec 200 µM de VPA, 100 nM de SAHA ou 100 nM de MS-275. Moyennes

± s.e.m. de 4 expériences, test statistique : One-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni, **

: p-value ≤ 0,01 ; *** : p-value ≤ 0,001. (B) Structure hypothétique d’un vecteur

hétérodimérique conjuguant deux molécules actives, la dexaméthasone et le MS-275, reliées par

un amplificateur et un espaceur auto-immolable à une gâchette glucuronylée et un système de

ciblage des vaisseaux tumoraux (ancre maléïmide).


91

du Vintafolide, aucune toxicité liée à ce vecteur n’a pu être notée, les effets secondaires

principaux étant attribués à l’agent anticancéreux lui- même (vinblastine).

La dexaméthasone et le VPA sont deux molécules utilisées depuis plusieurs années en

clinique pour le traitement de diverses pathologies. Les effets secondaires entrainés par ces deux

molécules sont très bien décrits chez l’homme (Berthelot et al., 2013 ; Chateauvieux et al.,

2010). Pour limiter le risque de la survenue de ces effets délétères ou en diminuer l’intensité, il

faudrait déposer ces molécules au niveau des tumeurs à l’aide d’un vecteur hétérodimérique.

Pour ne pas saturer les récepteurs à l’acide folique, qui seront ciblés par le vecteur MGAF, cet

hétérodimère pourrait exploiter l’« effet EPR » (voir page 11) observé dans la vascularisation

pathologique des tumeurs.

La vectorisation de la dexaméthasone est quelque chose d’envisageable puisque

récemment, un groupe de biochimistes a synthétisé un conjugué permettant le transport de ce

glucocorticoïde dans le cadre du traitement de l’arthrite (Bajpayee et al., 2016). Cependant, dans

le cas de ce vecteur hétérodimérique, il serait nécessaire d’utiliser un inhibiteur d’HDAC autre

que le VPA. En effet, les résultats encourageants que nous avons obtenus au cours de l’étude in

vivo ont nécessité l’administration d’une quantité plus importante de VPA (300 mg/kg

quotidiennement) que de dexaméthasone (2 mg/kg quotidiennement). Pour permettre l’efficacité

optimale d’un vecteur hétérodimérique, il faudrait que les deux molécules transportées

présentent des concentrations efficaces du même ordre de grandeur. Dans cette optique, j’ai initié

une étude dans laquelle d’autres inhibiteurs d’HDAC ont été testés en combinaison avec la

dexaméthasone (100 nM). Comme illustré sur la figure 47A, le MS-275 et le SAHA (acide

subéroylanilide hydroxamique) fournissent des résultats préliminaires prometteurs puisqu’à

stimulation de l’expression de FOLR1 équivalente, les concentrations de MS-275 et de SAHA

utilisées sont bien inférieures à celle du VPA (200 µM pour le VPA contre 100 nM pour le MS-

275 et le SAHA). De ce fait, ces inhibiteurs d’HDAC, dont les propriétés anticancéreuses ont

également été décrites (Bracker et al., 2009) pourraient être des candidats de choix pour la

substitution du VPA dans le vecteur hétérodimérique. D’ailleurs, notre groupe possède déjà une

expérience dans la vectorisation de ce type de molécules (Grinda et al., 2011), la structure

hypothétique d’un vecteur conjuguant une molécule de dexaméthasone et de MS-275 peut alors

être proposée (Figure 47B).

Figure 48. (A) Lorsqu’elles sont adhérentes, les cellules établissent des communications avec les

composants de la matrice extracellulaire via les intégrines. En réponse à ces signaux, les intégrines

activent différentes voies de signalisation, dont celles impliquant l’Integrin-Linked Kinase (ILK) et

la Focal Adhesion Kinase (FAK). Une fois phosphorylées, ces protéines activent à leur tour des voies

de signalisation soutenant la survie des cellules. Suite à leur détachement et à la perte de

communication avec les composants de la matrice cellulaire, les cellules entament un programme de

mort cellulaire particulier appelé anoïkis. Cette anoïkis est déclenchée par l’induction des caspases

par la voie extrinsèque, qui implique l’activation de récepteurs de mort membranaires et par la voie

intrinsèque, qui aboutit à la perméabilisation des mitochondries. La voie intrinsèque est régulée par

les protéines pro- et anti-apoptotiques de la famille Bcl-2. Dans ce cas-là, les protéines anti-

apoptotiques sont inhibées au profit des protéines pro-apoptotiques. La protéine pro-apoptotique Bim

(Bcl-2 interfering mediator of cell death) est d’un intérêt particulier dans notre étude puisque dans les

cellules adhérentes, elle est inhibée par séquestration au niveau des microtubules. Lorsqu’elle est

libérée, elle active les protéines Bak et Bax qui sont responsables de la perméabilisation des

mitochondries.


92

C. STIMULATION DE L’ACTIVITE D’UN VECTEUR ANTICANCEREUX

In vivo, nous avons observé que le mélange DV stimule l’expression des récepteurs à

l’acide folique au niveau des tumeurs. Cela entraine une augmentation de l’internalisation et de

la décomposition d’un vecteur appelé MGAF composé d’une molécule d’acide folique, d’une

molécule de MMAE et d’une gâchette enzymatique galactosylée. Ainsi, le mélange DV permet

d’augmenter l’activité du vecteur MGAF, ce qui se traduit in vivo par une inhibition d’environ

80 % de la croissance tumorale comparée aux souris traitées avec les solvants. In vitro, lorsque

les cellules KB sont cultivées dans des conditions permettant leur adhérence, aucune stimulation

de l’activité du conjugué MGAF par le mélange DV n’est observée in vitro alors qu’une plus

grande quantité de vecteur est métabolisée. En revanche, lorsque les cellules KB sont cultivées

en condition sans ancrage ou en suspension, leur cotraitement par le mélange DV et le vecteur

MGAF se traduit par une inhibition du développement des colonies et par une induction de

l’apoptose. La MMAE contenue dans le vecteur MGAF est un agent perturbateur des

microtubules dont elle inhibe la polymérisation (Bai et al., 1990). Pour montrer que le mélange

DV permet d’augmenter l’activité du vecteur MGAF dans ces conditions de culture, il faudrait

mesurer par Western blot la quantité de tubuline non polymérisée ou étudier par microscopie

confocale l’état de polymérisation des microtubules dans les cellules traitées avec le vecteurs

MGAF et/ou le mélange DV.

Par ailleurs, compte tenu des résultats obtenus en croissance sans ancrage, nous avons

émis l’hypothèse que le mélange DV permettait l’internalisation dans les cellules KB d’une

quantité de MGAF suffisante pour déclencher une apoptose de type anoïkis. Dans les cellules

saines (en particulier dans les cellules épithéliales), l’anoïkis est déclenchée lorsque des cellules

adhérentes perdent ou établissent des communications inappropriées avec la matrice

extracellulaire (Paoli et al., 2013). L’implication des intégrines dans le déclenchement ou

l’inhibition de cette forme particulière d’apoptose est alors un phénomène largement décrit

(Boudreau and Jones, 1999 ; Frisch and Screaton, 2001 ; Alanko et al., 2015). Les intégrines sont

des protéines transmembranaires qui servent de médiateurs entre les signaux provenant de la

matrice extracellulaire et la cellule (Harburger and Calderwood, 2009). Colocalisées au niveau

des adhérences focales avec différentes protéines du cytosquelette et des protéines de

signalisation, les intégrines sont ainsi à la base de la régulation de différentes voies de

signalisation cellulaires qui incluent par exemple la voie de l’Integrin-Linked Kinase (ILK) et la

Focal Adhesion Kinase (FAK, Figure 48). Lorsque les cellules sont adhérentes, ces deux kinases


93

sont phosphorylées et entrainent notamment l’activation de la voie Phosphoinositide-3-OH

kinase (PI3K)/Akt, une voie de signalisation soutenant la survie et la croissance des cellules.

Ainsi, dans les cellules cancéreuses, ces deux protéines sont souvent surexprimées ou exprimées

constitutivement (Paoli et al., 2013).

Dans le cas présent, la Focal Adhesion Kinase ou FAK présente un intérêt particulier. Il a

précédemment été montré que la rupture de la dynamique des microtubules par des agents

perturbateurs entrainait l’hydrolyse de la protéine FAK (Deschesnes et al., 2007). Dans les

cellules KB cultivées sans ancrage, le mélange DV entrainerait la libération d’une quantité

suffisante de MMAE perturbant alors la polymérisation des microtubules, ce qui pourrait

entrainer l’hydrolyse de la protéine FAK. Cela interférerait alors avec les voies de signalisation

activées par FAK et participerait à la restauration de l’anoïkis. Cette hypothèse pourrait

facilement être mise à l’épreuve en étudiant par Western blot le clivage de FAK dans les cellules

KB cultivées sans ancrage et traitées avec le vecteur seul ou avec le mélange DV.

En plus des signaux relayés par les intégrines, l’induction de l’anoïkis peut également se

faire par l’activation des caspases, que ce soit par la voie extrinsèque, qui implique l’activation

de récepteurs de mort situés à la surface des cellules, ou par la voie intrinsèque qui résulte de la

perméabilisation des mitochondries (Gilmore, 2005, Figure 48). La voie intrinsèque est régulée

par les protéines pro- et anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 qui régulent la formation de pore

dans la membrane externe des mitochondries et donc la libération de facteurs pro-apoptotiques.

Dans le cadre de notre étude, une protéine particulière de cette famille pourrait jouer un rôle

important dans l’induction de l’anoïkis : la protéine pro-apoptotique Bim (Bcl-2 interacting

mediator of cell death). Dans les cellules adhérentes, Bim est inactivée par séquestration au

niveau des microtubules via la sous-unité LC8 de la dynéine (Puthalakath et al., 1999 ; Paoli et

al., 2013). Suite au détachement des cellules, Bim est libérée et transloquée dans les

mitochondries ou elle active alors deux autres effecteurs, Bak et Bax qui sont responsables de la

formation des pores dans la membrane externe de cet organite (Valentijn et al., 2004). En tant

qu’agent perturbateur des microtubules, la MMAE libérée dans les cellules KB traitées par le

mélange DV pourrait entrainer la libération de la protéine Bim séquestrée au niveau du

cytosquelette et ainsi activer la voie intrinsèque de l’anoïkis. Ceci pourrait être testé par une

expérience de co-immunoprécipitation de la sous-unité LC8 de la dynéine et une analyse par

Western blot de la protéine Bim. Il serait alors possible de comparer la quantité de protéine Bim


94

séquestrée au niveau du cytosquelette lorsque les cellules KB sont traitées uniquement avec le

vecteur ou bien avec le mélange DV en plus.

6E PARTIE

CONCLUSION

6e Partie – Conclusion

95

Les chimiothérapies conventionnelles encore utilisées en clinique exploitent les

propriétés cytotoxiques d’agents non sélectifs qui affectent les cellules à division rapide, qu’elles

soient cancéreuses ou non. Pour délivrer spécifiquement les agents anticancéreux aux tumeurs,

une des stratégies consiste à développer des vecteurs, des structures moléculaires dans lesquelles

les agents anticancéreux sont liés de manière covalente à des ligands de ciblage. A cette fin,

notre laboratoire a synthétisé plusieurs conjugués utilisant l’acide folique comme ligand de

ciblage. Celui-ci permet la reconnaissance de récepteurs particuliers, les récepteurs à l’acide

folique, et l’internalisation du vecteur via un processus d’endocytose. Ces molécules vectorisées

contiennent également une gâchette enzymatique qui est clivée au sein de la cellule cible par des

enzymes appelées β-galactosidase.

Malgré les résultats encourageants que fournissent de telles molécules, les études menées

au sein du laboratoire ainsi que les essais cliniques menés sur l’Etarfolatide et le Vintafolide

montrent que leur efficacité dépend du nombre de récepteurs à l’acide folique exprimés par les

cellules malignes. L’objectif de mes travaux de thèse a alors été d’augmenter l’efficacité

thérapeutique de ces molécules en optimisant le ciblage des récepteurs FR. Dans une première

approche, nous avons démontré qu’il était possible de synthétiser des vecteurs homodimèriques

qui permettent de doubler la quantité d’agent anticancéreux libérée dans les cellules ciblées. Ces

conjugués sont responsables d’une toxicité entre deux et quatre fois plus importante que celles de

leur homologue monomérique vis-à-vis des cellules tumorales. Du fait de leur structure et de leur

processus de synthèse, ces vecteurs présentent un potentiel important dans le développement

d’une nouvelle génération de vecteurs anticancéreux.

La seconde approche aborde un aspect plus biologique et a constitué la majeure partie de

mon travail. A ce jour, très peu d’études s’intéressent à la stimulation de l’expression des

récepteurs à l’acide folique dans le but d’augmenter l’efficacité thérapeutique des vecteurs

anticancéreux. La principale étude, publiée par Tran et al. en 2005, se focalise sur la régulation

du gène FOLR1 (codant l’isoforme α des récepteurs à l’acide folique) par les récepteurs aux

glucocorticoïdes dans les cellules HeLa traitées avec de la dexaméthasone. Ils montrent in vitro

que cette stimulation peut être potentialisée par un cotraitement par de l’acide valproïque (VPA).

Un autre groupe a montré, toujours in vitro sur les cellules HeLa, qu’en présence de

dexaméthasone, une quantité plus importante de micelles couplées à l’acide folique et

transportant de la coumarine (une sonde fluorescente) était internalisée (Chen et al., 2013).


96

Dans ce projet, j’ai développé un traitement composé de dexaméthasone et de VPA. In

vivo, ce traitement appelé mélange DV présente une activité antitumorale propre, compatible

avec les propriétés anticancéreuses décrites dans la littérature pour chacune des deux molécules.

De plus, le mélange DV entraine une augmentation de 44 % de l’expression du gène FOLR1

(codant l’isoforme α des récepteurs à l’acide folique) dans les cellules tumorales KB. J’ai

également testé in vivo l’efficacité d’un conjugué anticancéreux dérivé de l’acide folique en

présence du mélange DV ce qui, à ma connaissance n’a jamais été réalisé. De plus, par

spectrométrie de masse, j’ai mis en évidence que suite à l’augmentation du nombre de récepteurs

à l’acide folique, une plus grande quantité de vecteur était internalisée et métabolisée dans les

tumeurs. Concernant la croissance tumorale, le cotraitement des souris par le mélange DV et le

vecteur entraine une inhibition plus importante d’environ 40 % en comparaison des animaux

traités uniquement avec le mélange DV, le vecteur utilisé seul n’ayant pas d’effet sur le

développement des tumeurs. Sur les organes sains, le mélange DV n’entraine pas de variation de

l’expression des récepteurs de l’acide folique et une étude histophatologique menée par un

spécialiste indépendant n’a révélé aucune toxicité chez les animaux ayant reçu le vecteur et/ou le

mélange DV.

En parallèle, j’ai vérifié dans une étude in vitro que la stimulation du gène FOLR1 était

retrouvée dans trois lignées cellulaires tumorales exprimant les récepteurs à l’acide folique de

manière basale. J’ai également montré que cette stimulation ne reflétait pas un phénomène

général au sein de la cellule, puisque l’expression des deux autres transporteurs de folates, le

transporteur de folates réduits (RFC) et le transporteur de folates couplé aux protons (PCFT)

n’est pas modifiée suite au traitement par le mélange DV. L’action du mélange DV présente

également l’avantage d’être réversible, l’expression du gène FOLR1 retournant à son niveau

basal seulement deux jours après l’arrêt du traitement. Enfin, dans les cellules n’exprimant pas

de manière spontanée les récepteurs à l’acide folique, qu’elles soient cancéreuses comme les

cellules A549 ou saines comme les cellules HUVEC, le mélange DV ne permet pas de

déclencher l’expression du gène FOLR1.

Comme cela a été démontré in vivo, nous avons également montré in vitro par

spectrométrie de masse que le mélange DV permettait la libération d’une plus grande quantité

d’agent anticancéreux dans les cellules KB. J’ai alors émis l’hypothèse que le traitement

combiné des cellules cancéreuses par le mélange DV et le conjugué anticancéreux déclenchait

une apoptose particulière appelée anoïkis. Dans les cellules normales, l’anoïkis est déclenchée


97

suite à la perte ou à l’établissement de liaisons aberrantes avec la matrice extracellulaire ou des

cellules avoisinantes. Ce processus prévient l’attachement et la survie d’une cellule dans un

environnement inapproprié. Dans les cellules tumorales, l’inhibition de cette apoptose favorise la

survenue de métastases et est donc un critère d’agressivité de la maladie. Les lignées cancéreuses

étudiées dans ces travaux sont résistantes à cette anoïkis et se développent sous forme de

colonies lorsqu’elles sont cultivées sans ancrage dans une matrice semi-solide. Cependant, leur

cotraitement par le mélange DV et le vecteur MGAF entraine une diminution de la taille et du

nombre de colonies de cellules tumorales formées, le nombre de cellules en apoptose étant alors

multiplié d’environ 2,6 fois. Ces résultats établissent ainsi pour la première fois un lien entre

l’augmentation du nombre de récepteurs à l’acide folique dans les cellules tumorales et

l’amélioration de l’activité anticancéreuse d’un vecteur dérivé de l’acide folique.

7E PARTIE

TRAVAUX

COLLABORATIFS

7e Partie – Travaux collaboratifs

9e Chapitre – Développement d’un vecteur ciblant le microenvironnement tumoral

98

9E CHAPITRE

Développement d’un vecteur ciblant le microenvironnement tumoral

En parallèle du ciblage de marqueurs membranaires tumoraux tels que les récepteurs à

l’acide folique, le groupe du Pr Papot travaille depuis plusieurs années sur le développement de

molécules vectorisées dont l’activation ne nécessite pas l’internalisation du vecteur au sein de la

cellule cible. Ces molécules sont activées dans le microenvironnement immédiat des tumeurs par

une enzyme particulière appelée β-glucuronidase.

La β-glucuronidase est une glycosyl hydrolase qui, en conditions physiologiques, est

présente dans les lysosomes et est impliquée dans la dégradation et l’élimination des

protéoglycans (Naz et al., 2013). Cependant, plusieurs études établissent la présence d’une

concentration importante de β-glucuronidase active dans les microenvironnements tumoraux,

notamment dans les mélanomes, les cancers mammaires, pulmonaires, ovariens et gastro-

intestinaux (Bosslet et al., 1998 ;Naz et al., 2013 ; Tranoy-Opalinski et al., 2014). En effet, sous

certaines conditions inflammatoires, que l’on peut retrouver au niveau des tumeurs, des enzymes

lysosomales telles que la β-glucuronidase peuvent être libérées par les neutrophiles, les

macrophages (Kawai, 2014) et par les cellules tumorales en nécrose (Antunes et al., 2012). Cette

observation représente un intérêt particulier dans le développement de stratégies visant à délivrer

un agent anticancéreux spécifiquement et de manière contrôlée au niveau de la tumeur. Le profil

d’expression particulier de la β-glucuronidase a alors donné naissance à plusieurs conjugués au

sein desquels un agent anticancéreux est relié de manière covalente à un composé glycosidique

de type glucuronide. Ainsi modifié, l’agent anticancéreux voit son hydrophilie augmenter ce qui

empêche sa diffusion passive à travers les membranes cellulaires. La liaison covalente entre le

glucuronide et l’agent anticancéreux assure la stabilité de la prodrogue jusqu’à son transport dans

le microenvironnement de la zone à traiter. A ce niveau, l’interaction des β-glucuronidases avec

le groupement glucuronide engendre des réarrangements internes au sein du vecteur qui

aboutissent à la libération du principe actif.

Figure 49. Structure du MMAE-Alb. Ce vecteur est composé d’un agent anticancéreux, la

MMAE (en rouge), d’une gâchette glucuronylée (en vert) et d’une ancre maléïmide (en orange)

reliés par un espaceur auto-immolable (en bleu). L’ancre maléïmide permet la formation d’un

complexe avec l’albumine, une macromolécule plasmatique.

IC50 (nM)

MMAE MMAE-Alb MMAE-Alb + β-glucuronidase

KB 0,39 ± 0,06 35,97 ± 8,91 0,46 ± 0,07

MDA-MB-231 1,38 ± 0,72 126,46 ± 57,34 0,084 ± 0,14

MIA-PaCa2 0,73 ± 0,09 76,20 ± 11,79 0,99 ± 0,32

Tableau 12. IC50 mesurées par test de viabilité cellulaire (XTT) sur les cellules cancéreuses KB

(naso-pharynx), MDA-MB-231 (sein) et MIA-PaCa2 (pancréas) traitées pendant 3 jours avec de

la MMAE libre, le vecteur MMAE-Alb en présence et en absence d’enzyme β-glucuronidase.

Moyennes ± s.e.m. de 3 expériences.



99

Dans ce contexte, le groupe du Pr Papot a acquis depuis plusieurs années une certaine

expertise dans la synthèse de molécules dites glucuronylées. Les premières molécules

synthétisées par le groupe étaient constituées d’un ou deux agents anticancéreux (agents tubulo-

affins, inhibiteurs de topoisomérases, d’HDAC ou d’acteurs de la voie Hedghog, etc.) relié par

un espaceur auto-immolable à un motif glucuronide (Thomas et al., 2008 ; Hamon et al., 2010 ;

Renoux et al., 2011 ; Grinda et al., 2011 ; Grinda et al., 2012 ; Legigan et al., 2013 ; Bensalma et

al., 2015). In vivo, ces systèmes de ciblage présentent une activité antitumorale supérieure à celle

des chimiothérapies conventionnelles ainsi qu’une diminution de la toxicité induite chez

l’animal. Cependant, en l’état, le potentiel thérapeutique de ces molécules glucuronylées

demeure limité in vivo du fait de leur rapide élimination rénale qui nécessite l’administration

d’une quantité importante de vecteur à l’animal. Ceci est dû à la glucuronylation naturelle qui se

produit dans l’organisme et qui assure sa détoxification en marquant les molécules à éliminer

(Mazerska et al., 2016).

Pour pallier à ce problème, notre groupe a cherché à augmenter la demi-vie plasmatique

de nos agents, notamment en utilisant l’albumine comme transporteur. L’albumine est une

macromolécule qui présente de nombreux avantages : 1/ elle s’accumule passivement au niveau

de la tumeur par effet « EPR » (« enhanced permeability and retention », voir page 11) ; 2/ sa

rétention y est facilitée par la présence de deux protéines à forte affinité pour l’albumine au

niveau de l’endothélium tumoral (le récepteur gp60) ou des interstices tumoraux (la protéine

SPARC, Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine) et enfin 3/ elle est attirée au niveau des

tumeurs par un phénomène d’hypoalbuminémie dû à une forte dégradation de l’albumine au

niveau de la masse tumorale pour fournir des acides aminés aux cellules hautement prolifératives

(Elsadek and Kratz, 2012 ; Kouchakzadeh et al., 2015).

Par ailleurs, il a été décrit qu’un agent anticancéreux muni d’un groupement chimique de

type « maléïmide » était capable de se lier à la cystéine 34 de l’albumine plasmatique pour être

transporté dans la circulation sanguine (Kratz et al., 2000 ; Legigan et al., 2012b). Le groupe du

Pr Papot a alors synthétisé une nouvelle molécule appelée MMAE-Alb constituée d’un agent

anticancéreux, la MMAE, d’une gâchette glucuronylée ainsi que d’un groupement maléïmide

permettant la formation d’un complexe avec l’albumine (Figure 49).

Après avoir caractérisé les paramètres physico-chimiques du MMAE-Alb (solubilité,

stabilité, sensibilité à l’action de la β-glucuronidase), nous avons évalué ses capacités

thérapeutiques in vitro et in vivo sur différents types de cancer. In vitro, la toxicité de ce composé

Figure 50. Suivi par bioluminescence in vivo de la croissance des tumeurs KB. Des xénogreffes

ont été implantées par voie sous cutanée à des souris nude Balb/c. Les jours indiqués par les

flèches noires, les animaux ont reçu par voie intraveineuse 0,5 mg/kg de MMAE, 2mg/kg de

MMAE-Alb, 1,9 mg/kg de MMAE-glu ou 1,18 mg/kg de MGAF. Moyennes ± s.e.m. des

tumeurs de 8 animaux, test statistique : Two-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni ; ** :

p-value ≤ 0,01 ; *** : p-value ≤ 0,001.



100

est inférieure à celle de la MMAE libre puisque les IC50 déterminées pour les cellules KB

(cancer naso-pharynx), MDA-MB-231 (cancer mammaire) et MIA-PaCa2 (cancer du pancréas)

sont environ 100 fois supérieures à celles de la MMAE (Tableau 12). L’ajout d’enzyme β-

glucuronidase dans le milieu de culture des cellules aboutit à une activation de la molécule, ce

qui se traduit par une toxicité équivalente à celle de la MMAE sur ces trois lignées cellulaires.

Cette prodrogue a par la suite été testée in vivo chez des souris nude Balb/c auxquelles

des xénogreffes de tumeur KB ont été implantées par voie sous cutanée. Les cellules KB

expriment fortement les récepteurs à l’acide folique et sont ainsi très sensibles à l’activité des

vecteurs dérivés des folates tels que le MGAF (Legigan et al., 2012a). Cette première étude nous

a alors permis de comparer l’efficacité d’une libération d’agent anticancéreux catalysée par une

enzyme du microenvironnement avec celle d’une libération nécessitant une internalisation

cellulaire. L’efficacité de la prodrogue ne contenant pas l’ancre maléïmide (appelée MMAE-glu)

a également été évaluée.

Tous les agents anticancéreux vectorisés ont été utilisés avec la même équivalence

molaire de MMAE (0,77 mg/kg). La MMAE libre, elle, n’a pu être administrée qu’à 0,5 mg/kg,

dose correspondant à la dose maximale tolérée. Comme indiqué en figure 50, seul le traitement

avec le vecteur MMAE-Alb (à une dose de 2 mg/kg correspondant à 0,77mg/kg de MMAE)

permet d’obtenir une limitation de la croissance tumorale. Une étude anatomopathologique de

tous ces animaux a été réalisée par un spécialiste indépendant qui n’a observé aucune toxicité sur

les organes sains.

Pour faire suite à ces résultats, le vecteur MMAE-Alb a été testé contre des xénogreffes

de tumeurs MDA-MB-231 ou MIA-PaCa2 implantées de manière orthotopique à des souris

nude. Les animaux ont alors été traités avec 0,5 mg/kg de MMAE libre ou 4 mg/kg de MMAE-

Alb (correspondant à 1,54 mg/kg de MMAE). Par bioluminescence, nous avons pu constater que

la MMAE libre était seulement capable de ralentir la croissance des tumeurs MDA-MB-231 et

MIA-PaCA2 comparée aux animaux traités uniquement avec le solvant (Figures 51A et B,

respectivement). A l’inverse, le vecteur MMAE-Alb entraine une inhibition totale et durable du

développement des tumeurs et même une régression complète des tumeurs puisqu’à la fin de

l’expérience, 33 et 50 % des animaux sont en rémission pour les tumeurs MIA-PaCa2 et MDA-

MB-231, respectivement.

Figure 51. Suivi par bioluminescence in vivo de la croissance des tumeurs MDA-MB-231 (A) et

MIA-PaCa2 (B). Des xénogreffes ont été implantées de manière orthotopique à des souris nude

Balb/c. Les jours indiqués par les flèches noires, les animaux ont reçu par voie intraveineuse 0,5

mg/kg de MMAE ou 4 mg/kg de MMAE-Alb. Moyennes ± s.e.m. des tumeurs de 6 animaux, test

statistique : Two-way ANOVA suivi d’un post-test Bonferroni ; ** : p-value ≤ 0,01 ; *** : p-

value ≤ 0,001.



101

Chez l’homme, le cancer du pancréas est généralement détecté à un stade avancé. Pour

mimer cette condition, des xénogreffes de tumeurs MIA-PaCa2 ont été implantées à des souris

nude comme dans le paragraphe précédent. En revanche, le traitement des souris n’a débuté que

lorsque les masses tumorales eurent atteint une taille comprise en 2,5 et 3,5 cm² (Figure 52A).

Alors que le traitement des animaux avec le solvant aboutit rapidement à la mort de la totalité

des souris (Figure 52B), le vecteur MMAE-Alb entraine une régression très importante de

presque 99 % de la croissance tumorale permettant la survie de 60 % des animaux.

L’ensemble de ces travaux fait l’objet d’un article actuellement soumis dans la revue

Angewandte Chemie et dont voici la référence :

An Enzyme-Responsive Drug Delivery System Targeting the Tumor

Microenvironment for Efficient Therapy of Breast and Pancreatic Cancers

Renoux B., Raes F., Legigan T., Péraudeau E., Eddhif B., Poinot P., Tranoy-Opalinski I.,

Asarraf J., Lerondel S., Le Pape A., Clarhaut J., et Papot S.

Angewandte Chemie, soumis.

En conclusion, le ciblage de la β-galactosidase par des vecteurs anticancéreux

glucuronylés est une stratégie largement validées (Renoux et al., 2011 ; Grinda et al., 2012 ;

Legigan et al., 2013 ; Bensalma et al., 2015). Cependant ces molécules sont rapidement

éliminées de l’organisme et l’obtention d’une efficacité thérapeutique nécessite l’administration

de quantités importantes de composé. Lors de cette étude, nous avons démontré que la liaison à

l’albumine plasmatique était une approche viable pour augmenter la demi-vie plasmatique de ces

composés. Dans ce contexte, l’une des molécules vectorisées reposant sur ce principe et dont le

développement est le plus avancé est l’INNO-206. Il s’agit d’une prodrogue composée de

doxorubicine reliée par un espaceur de type hydrazine à un groupement maléïmide permettant la

liaison avec l’albumine plasmatique. L’acidité observée dans le microenvironnement tumoral

entraine le clivage de l’espaceur et la libération de la doxorubicine (Mita et al., 2015). L’INNO-

206 a été testé avec succès en phase 2b pour le traitement des sarcomes des tissus mous et est

actuellement en étude de phase 3 (Chawla et al., 2015 ; référence des études : NCT01514188

pour la phase 2b et NCT02049905 pour la phase 3 , source : « clinicaltrials.gov »). Il a également

été testé en phase 2 pour le traitement des cancers pancréatiques avancés, mais les résultats de

Figure 52. Des xénogreffes de tumeurs MIA-PaCa2 ont été implantées de manière orthotopique

à des souris nude Balb/c. Lorsque les tumeurs ont atteint une taille comprise entre 2,5 et 3,5 cm²,

les animaux ont reçu par voie intraveineuse 4 mg/kg de MMAE-Alb les jours indiqués par les

flèches noires. La croissance tumorale (A, bioluminescence) et la survie des animaux (B) ont

alors été étudiées. Moyennes ± s.e.m. des tumeurs de 5 animaux. (B) Survie des animaux au

cours de l’étude.



102

cette étude n’ont pas encore été publiés (référence de l’étude : NCT01580397, source :

« clinicaltrials.gov »).

Le vecteur MMAE-Alb que nous avons développé repose sur la même stratégie de liaison

à l’albumine. En revanche, du fait de la présence de la gâchette glucuronylé et de la structure de

l’espaceur central, notre composé pourrait présenter une stabilité plus importante que celle de

l’INNO-206. Le MMAE-Alb présente par ailleurs une efficacité antitumorale sur les cancers

pancréatiques et les cancers mammaires triple-négatifs qui sont caractérisés par une forte

agressivité et un mauvais pronostic et pour lesquels il n’existe pas de traitement efficace. Dans

ce contexte, notre molécule pourrait venir augmenter l’arsenal thérapeutique mis à disposition

des médecins pour le traitement de ces cancers. Le MMAE-Alb a été protégé par un d’un brevet

(n° PCT/IB2011/052184) et une licence d’exploitation a été achetée par la société SYNDIVIA

pour son développement préclinique. Cette étape est, à l’heure de la rédaction, en cours

d’achèvement et les très bons résultats obtenus sont encourageants quant à la réalisation d’une

étude clinique de phase 1 contre les cancers mammaires triple-négatifs qui devrait commencer

début 2018.


10e Chapitre – Autres stratégies de ciblage thérapeutique

103

10E CHAPITRE

Autres stratégies de ciblage thérapeutique

Au cours de ces trois années de thèse, j’ai eu l’opportunité de travailler en collaboration

avec différentes équipes de chimistes sur d’autres stratégies de ciblage et/ou de libération de

principe actif. L’objectif de ces travaux était de valider des concepts de synthèse chimique et de

vérifier biologiquement le fonctionnement des molécules développées. Pour cette raison, ces

deux études ne seront pas développées ici.

Au cours d’un de ces projets, j’ai participé en collaboration avec le Dr Luisa Ronga

(INSERM U1212, UMR CNRS 5320, Bordeaux) au développement de peptides mimétiques du

VEGF, un des acteurs principaux de l’angiogenèse tumorale. Ces peptides agissent comme des

compétiteurs du VEGF pour la fixation sur son récepteur, le VEGFR-2 (Vascular Endothelial

Growth Factor Receptor-2) et présentent ainsi des propriétés anticancéreuses prometteuses. Ce

travail a donné lieu à la publication d’un article dont la référence est la suivante :

Diminished Oligomerization in the Synthesis of New Anti-Angiogenic Cyclic

Peptide Using Solution Instead of Solid-Phase Cyclization

Rubio S., Clarhaut J., Péraudeau E., Vincenzi M., Soum C., Rossi F.,

Guillon J., Papot S., Ronga L.

Peptide Science, 2016, 106 (3), 368-375

Un autre de ces travaux a consisté à développer avec le groupe du Pr Papot un complexe

de molécules entrelacées appelé rotaxane. Ce rotaxane est programmé pour libérer une molécule

de paclitaxel (un agent anticancéreux bloquant la dépolymérisation des microtubules) en réponse

à une série d’activations enzymatiques. Cette étude, dont un exemplaire est fourni ci-après, a été

publiée dans la revue Chemical Science avec la référence suivante :


10e Chapitre – Autres stratégies de ciblage thérapeutique

104

A Mechanically Interlocked Molecular System Programed for the

Delivery of an Anticancer Drug.

Barat R., Legigan T., Tranoy-Opalinsky I., Renoux B., Péraudeau E., Clarhaut J., Poinot

P., Fernandes A. E., Aucagne V., Leigh D. A. et Papot S.

Chemical Science, 2015, 6, 2608-2613.

8E PARTIE

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RESUME

Evaluation et optimisation de l’efficacité de conjugués anticancéreux ciblant les récepteurs de l’acide folique

En dépit des progrès réalisés ces dernières décennies, le cancer demeure un problème majeur

de santé publique. La plupart des chimiothérapies conventionnelles exploitent les propriétés

cytotoxiques d’agents non sélectifs qui affectent les cellules à division rapide, qu’elles soient

cancéreuses ou non, ce qui peut aboutir à une toxicité importante et de sévères effets secondaires. Pour

pallier à ce problème, l’utilisation de ligands de ciblage pour délivrer spécifiquement l’agent

cytotoxique aux cellules malignes tout en épargnant les tissus sains est une approche prometteuse.

Parmi les différents ligands exploités, l’acide folique fait l’objet d’une attention particulière due à la

surexpression préférentielle de son récepteur par de nombreux types de cellules cancéreuses.

Cependant, les essais cliniques menés sur des molécules reposant sur cette stratégie indiquent que leur

efficacité dépend surtout du niveau d’expression du récepteur ciblé.

Dans ce contexte, j’ai développé deux approches permettant d’augmenter l’efficacité du

ciblage des récepteurs à l’acide folique. D’une part, j’ai réalisé la validation biologique de nouveaux

conjugués conçus pour délivrer conjointement deux agents anticancéreux. D’autre part, j’ai mis au

point un traitement capable d’augmenter, in vitro et in vivo, l’expression des récepteurs à l’acide

folique à la surface des cellules tumorales. Cela aboutit à l’internalisation d’une plus grande quantité

de vecteur, qui se traduit in vivo, par une inhibition plus importante de la croissance tumorale, sans

toxicité sur les cellules saines.

Mots clés : Chimiothérapie vectorisée, ciblage thérapeutique, acide folique, récepteurs à l’acide

folique, dexaméthasone, acide valproïque.

Ecole doctorale Biosanté n°524

Discipline Biologie, Médecine, santé

Secteur Biomolécules, pharmacologie, thérapeutique

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