9ème Journées Jeunes Chercheurs / Imagerie

JJC03 : Session Imagerie : Métabolisme cérébral chez le primate par spectroscopie RMN

9ème Journées Jeunes Chercheurs / Imagerie

Fawzi BoumezbeurCEA - SHFJ

Orsay, France

Etude du métabolisme cérébral chez le primate par spectroscopie RMN : application au modèle

3-NP de la maladie de Huntington


Introduction

Spins nucléairesB0

Excitation radiofréquence

Signal de précession libre

raie spectrale pixel dans une image

La Résonance Magnétique Nucléaire en bref

Transformée de Fourier


1H de l’eau

1H de métabolites

Que mesure la Spectroscopie RMN ?Introduction

• Imagerie RMN = détection des 1H de l’eau cérébrale• Spectroscopie RMN = détection des autres molécules


IntroductionL’environnement technique de la RMN

Programmation de séquence Sondes radiofréquences

Hardware

Electronique

Mais aussi : du matériel de stimulation, de monitorage, etc…

Aimant 3 Tesla, corps entier avec gradients et shims performants

Informatique

Traitement des spectresTraitement des images

3.5 3.0 2.5 2.0 1.5

tChotCho tCrtCr GluGlu NAANAA

ppm


IntroductionEtude du métabolisme par spectroscopie RMN

Concentrations des métabolites

Vitesses de réactions biochimiques


Introduction

Plan

• Quantification des concentrations de métabolites cérébraux

• Détermination des vitesses de réactions biochimiques

• Corrélation avec la 18FDG-TEP

• Application à l’étude de la maladie de Huntington


Concentration des métabolites

Voxel striatal (3.9 mL) centré sur le striatum:Spectroscopie localisée à TE court

Segmentation automatique

Liquide céphalo-rachidien

Matière grise / blanche

3.5 3.0 2.5 2.0 1.5

Spectre 1H (PRESS)


Quantification relative d’une huitaine de métaboliltes.

3.5 3.0 2.5 2.0 1.5

Analyse par combinaison linéaire de spectres

En raison de la superposition des pics en spectroscopie du 1H, un logiciel se charge de déconvoluer les différentes contributions à partir d’une base de spectres.

Quantification absolue par rapport à la concentration d’eau prise comme référence interne

Glutamate

NAA Créatine

Choline

Glutamine GABA

InsAsp

NAAGTau Lac

Spectre = combinaison linéaire des spectres de chaque métabolite.

Concentration des métabolites


Pyr/Lac

Cycle de Krebs

Glucose précurseur = U-13C glucose.

CG Glutamate Glutamine


Détection par spectroscopie RMN des cinétiques d’enrichissement 13C du glutamate sur les carbones C4 (1er tour) et C3 (2nd tour) .

Marquage isotopique au 13C

Incorporation du 13C du glucose dans les différents intermédiaires de la glycolyse puis du cycle de Krebs.

U-13C

13C3

13C4

VKrebs

VX Vcycle

13C413C3 13C3

13C isotope stable du carbone, détectable en RMN (contrairement au 12C)faible abondance naturelle : 1,1 %


Estimation de VKrebsCinétique d’incorporation du 13C dans le pool de glutamate*

• Modèle mathématique : conservation de la masse et du 13C équations différentielles couplées résolues numériquement pour une valeur donnée de VKrebs Glu*(t)

• Itération de VKrebs pour minimiser la différence modèle/points expérimentaux

Temps d’infusion

signal 13C(Glu*)

VKrebs(4)VKrebs(3)VKrebs(2)

VKrebs(1)

VKrebs



Detection directe 13C Detection indirecte 1H-{13C}

durée d’acquisition = 17.5 min

gain de sensibilité d’un facteur 5 à 10

13C1H3-CH2OH

Comparaison de sensibilité pour du [2-13C]ethanol à 4.7T

[Novotny et al., MRM 1990]

Détection directe ou indirecte du 13C ?

durée d’acquisition = 2.1 min



Détection indirecte 1H-{13C} • Couplage hétéronucléaire JCHComme des dipôles magnétiques, les spins nucléaires 1H et 13C interagissent.Ce couplage dipôle-dipôle se manifeste par une démultiplication des raies :

Raie 1H-12C Raies 1H-13C

JCH

Lorsque un métabolite s’enrichit en 13C :

Diminution de la raie-mère T T0


Accroissement des raies-satellites


3.5 3.0 2.5 2.0 1.5

3.5 3.0 2.5 2.0 1.5

Spectre de base PRESS :

Spectres de difference : (base - spectres dynamiques)

Glu-H4 Glu-H3

Stabilité du signal et de l’animal

Conditions :

Détection des 1H Glu13C4 et Glu13C3Vitesses de réactions biochimiques


Analyse des spectres de différenceDétection simultanée

e

b

c

d

a

apparition des raies 1H-13C (en négatif) diminution des raies 1H-12C (en positif)

Spectre de différence

Résultat de l’analyse

Résidus de l’analyse

Profil correspondant à l’incorporation de 13C en position C4 du glutamate

Profil correspondant à l’incorporation de 13C en position C3 du glutamate



0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

0 20 40 60 80 100 120

Glu

tam

ate

13C

(en

mM

)

temps d’infusion (en min)

Glu C4

Glu C3

Mesure de VKrebs dans le cerveau de macaque

macaques contrôle : VKrebs = 0.55 ± 0.04 mol.g-1.min-1 (n=4)



Corrélation avec la TEP La 18FDG-TEP en bref

KG Glutamate Glutamine

Pyr/Lac

Cycle de Krebs

Glucose-6-P18FD

VKrebs

VX Vcycle

Glucose18FDCMRglc

CMRglc = vitesse de consommation cérébrale de glucose

= métabolisme glycolytique

VKrebs = métabolisme oxydatif


Mesure de CMRglc dans le cerveau de macaque par 18FDG-TEP

macaques contrôle : CMRglc = 0.24 ± 0.01 mol.g-1.min-1 (n=2)D’où un ratio CMRglc/VKrebs = 0.44

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50

Rad

ioac

tivité

du

18FD

G

(en

kBq/

mL)

temps d’infusion (en min)

activité totale 18F

contribution du 18FDG-6-P

contribution du 18FDG

Recalage IRM/18FDG-TEP

Corrélation avec la TEP


Application à la maladie de HuntingtonLa maladie de Huntington (MH)

Sujet sain MaladeImages Gwenaëlle Douaud CEA-SHFJ

Maladie génétique

Vulnérabilité des neurones striataux

Huntingtine mutée Ht

Atrophie du striatum

Objectifs :• Exploration des altérations du métabolisme cérébral • Diagnostique précoce• Développement pharmacologique sur modèle animal • Suivi thérapeutique chez l’homme


Modèle d’intoxication à l’acide 3-NPLe modèle primate de la MH

ADP ATP

HH++

HH++

NADH NAD

CycleCyclede Krebs SDHSDH

Le cycle de Krebs = synthèse oxydative d’ATP

Mitochondrie

Acétyl CoAGlucose

Modèle de neurodégénérescence sélective du striatum

3-NP inhibition

Application à la maladie de Huntington


Protocole• Macaques (macaca fascicularis, poids ~7kg, n=4)

• 22 Semaines d’intoxication chronique au 3-NP (~25 mg/kg/jour)

• Anesthésie au propofol i.v. et ventilation

• Monitorage Maglife (ECG , PNI, PO2, capno)

ObjectifsSuivi longitudinal des altérations métaboliques accompagnant la dégénérescence : 1. quantification absolue des métabolites

2. mesure du métabolisme oxydatif VKrebs par spectroscopie RMN du glucose marqué au 13C

3. corrélation avec la mesure du métabolisme glycolytique CMRglc par 18FDG-TEP et les données morphométriques.

Application à la maladie de Huntington


ConclusionDu développement méthodologique à la recherche clinique

1997-2001 : Rats sains et intoxication 3-NP aigüe et chronique

2001-2004 : Macaques sains et intoxication 3-NP chronique

À partir de 2004 : Sujets sains et patients MH symptomatiquesG. Douaud CEA-SHFJ

P. Brugière CHU Mondort Créteil

Diminution de VKrebs de 18%


• Suivi des primates au long de l’intoxication chronique au 3-NP et exploitation des résultats.• Passage à l’homme avec des sujets sains puis des malades en collaboration avec l’Hopital Henri Mondort (Créteil)• Suivi thérapeutique sur des patients greffés.

ConclusionPerspectives

• Etude des métabolismes oxydatif (VKrebs) et glycolytique (CMRglc) pendant l’activation cérébral.• Combinaison avec la spectroscopie 31P pour l’étude du couplage mitochondrial synthèse d’ATP/cycle de Krebs.• Combinaison avec la spectroscopie de diffusion pour suivre la compartimentation des métabolites.

Mais aussi :


RemerciementsVincent LebonLaurent BesretJulien Valette

Françoise VaufreyEric GiacominiVelislav Slavov

Gwenaëlle DouaudPierre Brugière

Emmanuel BrouilletPierre-Gilles HenryPhilippe Hantraye

Gilles BlochJacques Bittoun

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