5ème A H1 : Urgence et Garde

D.TREPO

Programme du Module

I- Les sources d’erreurs préanalytiques et analytiques

II- La validation Technique et Biologique Le système expert VALAB

III- l’ Urgence et la Garde en Toxicologie (François PARANT)

Sources d’erreurs préanalytiques et analytiques

A- Introduction B- Les tubes a prélèvement

verre plastique

C- Le prélèvement 1- Le patient 2- La prise de sang 3- La conservation 4- Les interférences

a) Lactescence b) Hémolyse c) Ictère d) Hyperprotidémie

A) Introduction NB1 : notions pratiques «compétence

» et non plus la seule « connaissance »

NB2 : aider à prendre recul et esprit critique sur l’exercice de Biologie

1°) Le GBEA 1 (arrêté du 2 nov 1994) a insisté sur

- « Préanalytique »- Source principale

d’erreurs grossières et d’imprécisions

- le biologiste est responsable de cette phase

1 objectif prioritaire de la démarche qualité

2) La période antérieure au GBEA 1 = contrôle de qualité des années 70 à fin 94

- Démarche volontariste quoique obligatoire - Source de progrès énormes en précision et exactitude pour appareils et réactifs entre 74 et 90

3) La gestation laborieuse de «l’échantillon Biologique »- Décision médicale (1) d’Analyse Biologique - Transmission par Cadres (2) aux infirmières (3)

- Transmission au laboratoire (4)

- Réception (5) , Enregistrement, Pré Traitement (6)

6 acteurs différents, 2 localisations et sources de dysfonctionnements à tous les niveaux et en particulier aux Interfaces

Conséquences pour le clinicien

: résultats jugés aberrants - erreur de malade

- erreur de tube- anticoagulant

- erreur de conservation

et/ou résultats trop tardifs- erreur de destination du prélèvement

4) Rôle du biologiste dans le « Préanalytique »

- Le GBEA précise la responsabilité du biologiste

- La qualité du résultat final en dépend

- Difficile à exercer en milieu hospitalier et même en privé (centres de prélèvements différents des plateaux techniques)

- Doit s’intégrer dans une démarche globale de qualité (Etablissement) ;

dans le cadre de relations « Client-Fournisseur » avec procédures écrites et suivi des dysfonctionnements

par des « fiches de signalement »

- Ceci implique la mise à jour du répertoire des Analyses et conditions de prélèvements .

Cf : Accréditation des Etablissements de soins - Ordonnances JUPPE d’avril 96- Début Accrédiation Avril 2001 ( surtout de 2003 à 2005)

- Certification ( V2) depuis 2006

B) Les tubes à prélèvement

1- Le verre - Le plus utilisé pendant très longtemps - détrôné par les plastiques car : 2 défauts majeurs :

- fragile- non incinérable –

pâte de verre puis machefers- puis retour en force avec les systèmes sous vide type VACUTAINER

2- Les systèmes sous vide - Apparus dans les années 90- vide partiel dans le tube en verre avec cathéter souple et aiguille - stérilité de l’ensemble - très répandu en milieu hospitalier beaucoup moins en secteur libéral

2-1- Avantages - Hygiène et sécurité pour le malade et le préleveur (à la différence du « punctor »)- Stérilité du prélèvement - qualité du prélèvement :

+ volume exact et ratio : sang/anticoagulant respecté

+ pas de pression excessive (hémolyse)

2-2-Inconvénients - prix - verre non recyclé- les systèmes sous vide en plastique sont minoritaires car : plastique difficilement étanche aux gaz.- le système VACUETTE (Greiner Bio-one)

- nécessite double paroi plastique

- sinon péremption trop courte

-Des systèmes plastiques récents sont opérationnels.

3- Les tubes en plastique 3-1- Polystyrène (Cristal)

- Transparant mais très rigide - Peut se fendre et fuites à

centrifugation 3-2- PolypropylèneQue translucide mais souple et incassable3-3- Avantages

- Incinérables sans résidus sans dégagement de Chlore- Bémol : « inclassable » pour

le CIRC, groupe 3 de la classification des cancérogènes

4- les tubes avec adjuvants 4-1- Le gel séparateur (avec héparine)- gel de polyacrylamide- mélange homogène sang+gel puis centrifugation- plasma à la surface du gel globules sous le gel : culot

Avantages :- pas de remise en suspension des GR- barrière étanche aux échanges entre GR et plasma, qui évite

- Hémolyse- K+- Phosphates,

Acide lactique

- glucose, pH

4-2- Billes polystyrènes et activateurs de coagulation pour les tubes secs, afin d’accélérer la coagulation (éviter fibrine)

C- Le prélèvement

1- Le patient 1-1- La variabilité des individus est

grande d’où la notion : intervalle de référence pour les valeurs normales .

1-2- On peut citer de plus chez un même individu certains facteurs :- Age- T° corporelle - prise d’aliments ou de boissons ou le jeûne prolongé- traitements médicamenteux - cycle nycthéméral- stress (adrénaline et hausse glycémie)- position du corps

- Traitements médicamenteux:+ énorme difficulté de ces interférences « xénobiotiques » rarement élucidées dans les bilans isolés.

- Cycle nycthéméral : le matin à jeun : hôpital dès 5h30, LABM dès 7h

- Stress + chez malades hospitalisés en urgence : stress fréquent: hausse glycémie+ si peur de l’aiguille – seringue : idem

- Position du corps :modifie les échanges entre le secteur plasmatique et liquides intersticiels

Variation de la concentration en protéines et substances liées aux protéines.

Donc toujours prélever dans la même position, lors du suivi d’un malade.

2- La prise de sangTrès importante pour la qualité du

résultat source de nombreuses modifications selon que :

2-1- Sang veineux – sang capillaire en pédiatrie vaccinostyle : risque de dilution par liquide interstitiel

2-2- Désinfection éviter alcool pour alcoolémiesi alcool iodé : inhibition de certaines réactions

2-3- Les perfusions en cours ou récentes - Glucose augmente( si Glu)- Protéines diminuent - Hématocrite diminue

2-4- Bulle d’air dans seringue GDS- Augmentation pO2- Baisse pCO2 en 2 à 3 mn

2-5- Le garrot Provoque stase veineuse et augmente la pression :- d’où diffusion d’eau et petits ions vers le secteur extra vasculaire - d’où augmentation grosses molécules : Protéines , Ca, Enzymes

en 1mn30 : alb : augmente 8% Ca : augmente 3%

en 4 mn : alb : augmente 15%Ca : augmente 10%

3- La conservation est critique pour certains paramètres ex : GDS, NH4, P, glucose si AC pas adapté : baisse 7% après 1 heure à T° ambiante.

3-1- Eviter la contamination microbienne - sang : par stérilité du geste et du dispositif ; pour sérothèques : ajout azide de Na 0,2% (1V pour 10 V)- urines : par ajout de désinfectants (Thymol, Merthiolate) par acidification (risque de précipitations)- en effet la pousse microbienne modifie les valeurs :

baisse substances consommées : Urée, créatinine, glucose

hausse substances libérées : NH4

3-2- Facteurs importants pour la conservation

3-2-1- La température : 20°, 4°, -20°,

-80°- en général, T° préconisée

- < 4h à 20°C- < 24h à 4° C- plusieurs mois à -20°C- plusieurs années à -80°C

- certains paramètres très sensibles

- NH4 : < 2 h à +4°C- GDS : < 20 mn à + 4°C- CKMB : perte 10% après

1h à 20° C et après 14h à 4° C

- Congélation parfois CI- sang total- LDH- Amylase urinaire

3-2-2- La lumière ex : Bilirubine très sensible

3-2-3- Traces de détergents ex : - LDH après 48h à

+4°C- sans détergents :

96% activité - avec détergents :

62% activité

3-2-4- L’évaporation - cause une hausse de tous les constituants non volatils- cause une baisse HCO3 de 3 à 5 mmol/l après 4h à 20°.

Les échantillons devraient être conservés bouchés Cette évaporation est très forte en microgodets (Pb en Néonatologie).

- Les solutions - Travail sur tube primaire

bouché (perforation des bouchons)- si mise en godets : les

boucher- à défaut : conserver les

échantillons à +4° avant et après phase analytique

4- Les interférences Distinguer 2 types d’interférences au niveau analytique :

- substances endogènes dont la

source est l’échantillon :

- lactescent

- hémolysé

- Ictérique

- substances exogènes

(Médicaments ….) = Xénobiotiques

4a- Prélèvements Lactescents ou Lipémiques

4a-1- Terminologie : - opalescent + ou ++- Lactescent +, ++, +++

4a-2- Origines de hyperchylomicronémie - pas à jeun- dyslipidémie - alimentation parentérale

lipidiqueLes chylomicrons ont pic d’absorption à 600nm, et sont riches en triglycérides ;

et il existe corrélation entre :- aspect du sérum- DO à 600 nm du sérum au

1/20ème dans sérum physiologique - concentration en Triglycérides

4a-3- quantification lactescence

Aspect Clair Opalescen

t Lactescen

t

+ ++ + ++

DO à 600 nm au

1/20ème

0,020

0,040

0,080

0,120

0,240

Triglycérides

mmol/l2,00 3,00 4,60 5,00 7

4a-4- Mécanismes - Interférence optique de 300 à 700 nm - affecte : colorimétrie en point final (correction par blanc échantillon) mais aussi cinétiques et néphélémétries- Si Trigly > 10 mmol/l Sérum = suspension de particules graisseuses et plus de phase homogène plus de loi de Beer-Lambert et DO > 4 = limite technique Donc nécessite de connaître pour chaque parametre et pour chaque technique la limite supérieure de lactescence acceptable.

4a-5- Evaluation de l’interférence Protocole « VALTEC » de SFBC

- Surcharge d’un pool de plasma avec gamme «INTRALIPID »

- Mesure de l’interférence

- Comparaison à limites acceptabilité définies (+ 10% de valeur cible)

4a-6- Solutions techniques 6-1- Blanc échantillon

- pour point final OK- pour cinétique : pas

possible6-2- Clarification par écrémage

12h à +4°C : pas pratique (phase inférieure limpide)

6-3- Ultracentrifugation : 10 000 g, 20 mn

Minicentrifugeuse à turbine, 5 mn

6-4- Extraction des graisses par solvant (acide Fluorhydrique)

- 1,5 V de sérum ou plasma

- 1 V de solvant - Vortex : 1 mn ,

centrifuger : 17 000g-10 mn- surnageant limpide

pour mesures NB : Tubes plastiques

spéciaux

6-5- Chimie « sêche » type Kodak (VITROS) - Multicouches de réactifs gélifiés - Couche supérieure : Tamis moléculaire- Couche inférieure : réaction sans lipoprotéines - Réflectométrie - OK pour lactescence, hémolyse mais pas pour Bilirubine

6-6- Électrodes sélectives

- mesurent l’activité d’une substances dans l’eau libre de l’échantillon :la phase lipidique n’interfère pas

- Mesure directe sur sang total

(rapidité)

- Société NOVA BioMédical

4b- Prélèvements Hémolysés Origine : éclatement G R et libération de leur contenu dans le plasma.

4b1 – Les 2 mécanismes de l’interférence- augmentation de concentration des métabolites d’origine intra-érythrocytaire - interférence optique due à l’Hb libérée dans le plasma.

4b2- Augmentation Métabolites intra érythrocytaires 2-1- très augmentés par Hémolyse

- Potassium - Hb Plasmatique - LDH et phosphatase acide - Arginase, Créatine

2-2- Le Potassium - pas de corrélation entre intensité d’hémolyse (+,++,+++) et l’augmentation du K.- en effet diffusion du K intra erythrocytaire même en l’absence d’hémolyse, en fonction :

- de l’état de membrane

- du temps de contact

- Intérêt du gel séparateur : K dans sérum > K dans plasma séparé rapidement

= 0,2 m Eq/l

- Information:Hémolysé « capitale » dans un résultat de Kaliémie Si absence = faute grave du labo mais risque de perte en aval d’où 2 attitudes :

a) hémolyse annule le résultat de K : sécurité labo

b) hémolyse accompagne le résultat : plus utile mais dangereux

4-c- Prélèvement ictérique La bilirubine interfère selon 3

mécanismes 1- Interférence optique de 400 à 500 nm. Un blanc échantillon peut corriger.2- Interférence chimique dans certaines réaction Ex : Dans mesure créatinine par JAFFE3- Affinité de la bilirubine pour les protéines (albumine) et interférence négative dans dosage protéines par colorants (bleu de Coomassie, Rouge Ponceau etc…)

4-d-Hyperprotidémie

- Dans Myelomes : protéines totales > 90 et >100g/l

- Viscosité du sérum ou plasma peut entraîner une erreur sur prélèvement échantillon par automates

4-e- Conclusions Interférences Nécessite de bien connaître

pour chaque paramètre 1- La technique

- appareil : rapport de dilution (1/15ème à 1/60ème) - méthode de dosage : spectro, Néphélo, point final, cinétique, électrochimie- Limites de la technique en terme d’interférence

2- L’échantillon + Date et heure de prélèvement

+ Mode d’acheminement, délai (hors labo, dans labo)

+ Aspect du prélèvement

3- Prise de décision

- Rendre ou ne pas rendre le résultat ?

- Quid du malade en réanimation avec perfusion intralipid ? Nécessité d’ une technique de secours .