4_me et 5_me cours de G_n_tique appliqu_e

8/7/2019 4_me et 5_me cours de G_n_tique appliqu_e

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3. Fabriquer une banque3. Fabriquer une banqued¶ADNd¶ADN



3. Fabriquer une banque d¶ADN3. Fabriquer une banque d¶ADN

l¶origine de l¶ADN

L¶ensemble des clones obtenus s¶appelle une « banque d¶ADN »

Les banques d¶ADN sont classées selon :

le vecteur utilisé pour la fabriquer



3.1. Les banques d¶ADN génomique3.1. Les banques d¶ADN génomique



3.2. Les banques d¶ADNc3.2. Les banques d¶ADNc

Définition :

ADN "complémentaire » :copie ADN d'un ARN

copie dépourvue des

introns (séquences noncodantes du gène)



4. Identifier un gène4. Identifier un gènespécifiquespécifique



4.1. Utilisation de sondes4.1. Utilisation de sondes

petit morceau d¶ADN synthétisé dont la séquence correspond

au moins en partie à celle d'un des brins du fragment d¶ADN que

l¶on veut identifier

capable de se fixer spécifiquement sur l'autre brin

complémentaire de l'autre brin de l¶ADN

Le terme utilisé pour identifier un clone est « criblage ».

Sonde :



4.1. Utilisation de sondes4.1. Utilisation de sondes



4.2. Identification directe des clones par hybridation4.2. Identification directe des clones par hybridation

utilisation d¶une sonde marquée(ex : radioactivité)

révélation par autoradiographie



4.3. Analyse de l¶ADN cloné par séquençage4.3. Analyse de l¶ADN cloné par séquençage

Définition :

Le séquençage de l¶ADN est la détermination de la succession

des nucléotides le composant.

Technique de routine en laboratoire

Technique basée sur le mécanisme de réplication de l¶ADN



4.3.1. La méthode de Maxam et Gilbert4.3.1. La méthode de Maxam et Gilbert

un tube par type de coupure (une

après G, après A, après T, après C).

En fonction des concentrations

d¶enzyme et d¶ADN, on obtient une

coupure par molécule avec tous les

cas différents présents.



4.3.2. La méthode de Sanger 4.3.2. La méthode de Sanger

synthèse d¶ADN avec des arrêts de

synthèse, en utilisant des

didésoxynucléotides (ddNTP)

chaque tube contient donc en fin

de réaction une population de

fragments de taille variable, ayant

tous la même extrémité 5¶ et se

terminant tous en 3¶ par le mêmeddNTP à toutes les positions

possibles.



4.4. Analyse par des techniques de transfert4.4. Analyse par des techniques de transfert

4.4.1. Le southern blot4.4.1. Le southern blot

Digestion de l¶ADN par les enzymes de restriction

Séparation des fragments par électrophorèse

Dépôt d¶une membrane absorbante sur legel

Les bandes d¶ADN sont absorbées parcapillarité

Révélation par autoradiographie

Immersion de la membrane dans unesolution contenant la sonde marquée



4.4.2. Autres techniques de transfert4.4.2. Autres techniques de transfert

Mélange d¶ARN séparé dans un gel

Transfert sur une membrane Criblage par une sonde marquée

Principale application :

déterminer si un gène est transcrit dans un tissu donné

ou dans certaines conditions expérimentales.

Northem blot :



4.4.2. Autres techniques de transfert4.4.2. Autres techniques de transfert

Mélange de protéines séparées dans un gel

Transfert sur une membrane

Criblage par une sonde marquée

= anticorps marqués dirigés contre la protéine à identifier

Western blot :



IV. Ingénierie génétique desIV. Ingénierie génétique desplantesplantes



1. Principe de la manipulation génétique1. Principe de la manipulation génétique

Étape 1 : Choix du gène et introduction du gène dans un vecteur

Étape 2 : Introduction du plasmide recombiné dans la bactérie

Étape 3 : Sélection des cellules transformées

Étape 4 : Transfert du gène dans la plante

Méthode de transfert direct (chimique, physique )

Méthode de transfert indirect (Agrobactéries)

Étape 5 : Régénération de la plante



2. Les méthodes de transfert indirect de gènes2. Les méthodes de transfert indirect de gènes

Plusieurs souches d¶agrobactéries dont les plus connues sont :

Agrobactérium rhizogenes qui héberge le plasmide Ri

= responsable du « chevelu racinaire »= développement anormal des racines

Agrobactérium tumefaciens qui héberge le plasmide Ti



2.1. Agrobacterium tumefaciens2.1. Agrobacterium tumefaciens

Bactérie du sol : responsable de la galle du collet

Région du collet (= zone de liaison entre la tige et la racine)

Agrobacterium tumefaciens



2.1.1. La galle du collet2.1.1. La galle du collet

développement anarchique des tissus à l¶emplacement d¶une blessure

galle du collet apparenté à un « cancer végétal »

Nécrose de la partie aérienne et mort de la plante




Cellules de la tumeur fabrique des molécules : les opines

molécules jamais présentes dans les plantes saines

substances nutritives pour les agrobactéries

activent la multiplication des bactéries

synthèse d¶opines détourne les voies du métabolisme normal dela plante




Déviation du métabolisme de ces plantes =

Opération de « génie génétique naturelle »

Responsables :

Les agrobactéries et leur grands plasmides de 200 kb

Exemple : le plasmide Ti



2.1.2. Le plasmide Ti2.1.2. Le plasmide Ti

nommé Ti pour Tumor inducing

responsable de la virulence d'Agrobacterium tumefaciens

Ce plasmide est utilisé de façon routinière pour produire desplantes transgéniques.



Carte simplifiée du plasmide TiCarte simplifiée du plasmide Ti

ORI : Origine de réplication

OCC : zone de dégradation des opines par

la bactérie

ADN-T : partie transférée et s¶exprimantuniquement dans la cellule végétale

� renferme une fonctionONC responsablede la prolifération

� renferme une fonctionOPS responsable

de la synthèse des opinesTaille : 200 kb

� limitée par deux bor dures dites « droites

et gauches »



Carte simplifiée du plasmide TiCarte simplifiée du plasmide Ti

Zone v ir : fonction de virulence,responsable du transfert de l¶ADN-T

Taille : 200 kb

sa capacité à reconnaître des cellules

végétales

à les infecter

à transférer de l¶ADN-T jusqu¶au noyau

à intégrer cet ADN-T au génome de

la cellule végétale



2.1.3. Transfert de l¶ADN dans les cellules végétales2.1.3. Transfert de l¶ADN dans les cellules végétales

L¶intégration de l¶ADN-T au génome de la cellule végétale

responsable =

de la formation de tumeur de la sécrétion des opines

Pour introduire des gènes nouveaux =

Utilisation de la région-T d¶un plasmide Ti désarmé (ne contient

plus les gènes responsables de la tumeur)



2.1.3. Transfert de l¶ADN dans les cellules végétales2.1.3. Transfert de l¶ADN dans les cellules végétales

Les plasmides Ti =

pas de sites uniques de restriction permettant le clonage

direct de l¶ADN

Avant d¶être transmis à Agrobacterium =

gène à transférer doit être introduit dans un vecteur(ex : plasmide)



a. Transfert de l¶ADN par coa. Transfert de l¶ADN par co--intégrationintégration

transfert d¶un gène d¶intérêt dans un plasmided¶E.coli

ce plasmide est appelé « intermédiaire »

le plasmide est transféré dans Agrobacterium

comportant un plasmide désarmé

présence de séquence homologue permet la

recombinaison des deux plasmides

formation d¶un grand plasmide Ti



b. Transfert de l¶ADN par vecteur binaireb. Transfert de l¶ADN par vecteur binaire

constr uction d¶un vecteur intermédiaire :

Bor dure gauche et droite du plasmide Ti

Le gène d¶intérêt + gène de résistance à

antibiotique

le plasmide est transféré dans Agrobacterium

comportant un plasmide désarmé

pas de séquence homologue donc pas de

recombinaison des deux plasmides

quand Agrobacterium parasite la cellule, elle ne

transmet que le plasmide intermédiaire



3. Les méthodes de transfert direct de gènes3. Les méthodes de transfert direct de gènes

Techniques alternatives aux agrobactéries

difficile d¶introduire de l¶ADN dans des cellules végétales (paroi

cellulosique)

traitement des parois avec des cellulases obtient des protoplastes seulement entourés d¶une membrane

plasmique

Protoplaste : cellule végétale artificiellement débarrassée de samembrane cellulosique rigide, garde ses structures essentielles et son

métabolisme



3.1. Transformation chimique3.1. Transformation chimique

Mise en contact avec certains sels :

CaCl2, le CaPO4, les sels de lithium

les cellules deviennent

compétentes :

elles absorbent l¶ADN situédans le milieu extérieur



3.1. Transformation chimique3.1. Transformation chimique

PEG ou polyéthylène glycol

agit en présence de Ca2+ ou Mg2+

déstabilise la membrane des protoplastes facilite la pénétration de l¶ADN

efficacité de la transformation exprimée en :nombre de transformants par µg d¶ADN.



3.2. Transformation électrique : électroporation3.2. Transformation électrique : électroporation

soumettre un mélange de protoplastes et d¶ADN à des chocs

électriques (200 à 1000 volts/cm pendant quelques

millisecondes max)

déstabilise la membrane plasmique

induit la formation de pores à travers lesquels l¶ADN peut

transiter

Avantages :

Plus efficace et plus rapide.

Pas besoin de cellules compétentes.

Nombreuses espèces transformées par cette technique



3.3. La micro3.3. La micro--injectioninjection

fines pipettes en verre (capillaires étirés)

un microscope inversé

permet l¶injection d¶une solution d¶ADN dans le noyau

inconvénient : traitement cellule par cellule



3.4. La biolistique3.4. La biolistique

bombarder à haute vitesse des microparticules de tungstène(1µ de diamètre) enrobées d¶ADN

ADN se réhydrate et peut diffuser

Si la bille a atteint le noyau :

possibilité d¶intégration de l¶ADN

dans le génome.



3.5. L¶agrolistique3.5. L¶agrolistique

dérivée de la biolistique associée à la transformation indirecte

par les agrobactéries

provoque des microblessures dans les tissus

envahir avec plus de facilité et de vigueur

augmenter le rendement de la transformation



4. Conclusions sur les méthodes de transferts4. Conclusions sur les méthodes de transferts

grande batterie de techniques de transformation génétique

facteur limitant : techniques de régénération in v itro

problème : présence de gènes marqueurs utilisés

(gènes de résistances à des produits chimiques ou antibiotiques)



5. La régénération des plantes à partir de cellules5. La régénération des plantes à partir de cellules

régénérer une plante entière à l¶aide de ces cellules transformées

mises dans un milieu de culture (hormones de croissance :des auxines et des cytokines)

apparition de petites pousses

transfert dans un nouveau milieu de culture permettant ledéveloppement des racines

quand racines suffisamment développées : les plantules sontrepiquées



6. Confirmation de la nature transformée des plantes6. Confirmation de la nature transformée des plantes



7. Applications médicales7. Applications médicales

7.1. Exemple du tabac transgénique7.1. Exemple du tabac transgénique

plants de tabac pour fabriquer des protéines

Ex : hémoglobine humaine

transfert des gènes de l'hémoglobine humaine dans un plantde tabac

2 gènes interviennent dans la synthèse de l¶hémoglobinehumaine.




Technique de l'électrophorèse

permet de repérer les allèles

(gènes) dont l'expression donne les

molécules recherchées



7.2. Autres applications médicales7.2. Autres applications médicales



8. Autres applications8. Autres applications

8.1. La protection des cultures

8.1.1. La résistance des plantes aux insectes

Faire synthétiser aux plantes des protéines toxiques pour lesinsectes

Problèmes liés aux herbicides

nuisible à l'environnement

populations d'insectes « résistants »

parfois inefficaces, suivant le stade de développement de

l'insecte



8.1.2. La tolérance des plantes aux herbicides8.1.2. La tolérance des plantes aux herbicides

Introduction d'un " gène de tolérance " dans son génome

Plante de culture " tolérante " aux herbicides

Éliminer les plantes sauvages indésirables

soja, betterave, laitue, melon, pomme de terre, blé,colza, tournesol...

L'expression du gène empêche la substance active de détruirela plante.



8.1.3. La résistance aux maladies8.1.3. La résistance aux maladies

virus

champignons

bactéries phytophathogènes

pomme de terre, melon, concombre, betterave, tomate...

Éviter des pertes de rendements



8.1.4. La résistance aux conditions climatiques8.1.4. La résistance aux conditions climatiques

Espèces résistantes :

au froid à la sécheresse

à la salinité

intérêt pour les pays en développement



8.2. Applications industrielles8.2. Applications industrielles

Peuvent produire par exemple :

des élastomères

des plastiques biodégradables

Ex: le polyhydroxybutyrate (PHB)



8.3. Technique de dépollution8.3. Technique de dépollution

dépollution des sols pollués

Plantes utilisées comme agents bio-indicateurs

Ex : tabac utilisé pour évaluer le degré de pollution par l'ozone (zones

nécrotiques sur les feuilles)

«biocapteurs» : capacité de piéger de grandes quantités de polluants :

Ex : métaux lourds et autres éléments indésirables dans les sols

(ammonium, mercure, césium, arsenic )

Extraction des toxiques après calcination et réductions des cendres

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