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BCM 1502 Catalyse Enzymatique /14

CATALYSE ENZYMATIQUE EFFETS DE pH

La plupart des enzymes sont actifs dans une gamme de pH restreinte, typiquement entre pH 5 à 9. Le pH influence l'activité d'un enzyme à plusieurs niveaux :

1) par la liaison du substrat à l'enzyme 2) de l'activité catalytique 3) de l'ionisation de substrat 4) de la stabilité structurale

La vitesse initiale de beaucoup d'enzymes démontre en fonction de pH un profil ressemblant à une cloche.

- exemple : la cinétique d’aldolase de muscle de lapin

Ces courbes reflètent l'ionisation d'un certain nombre de groupements d’acides aminés au site actif de l'enzyme et suggèrent que certains états d'ionisation sont essentiels pour l'expression de l'activité catalytique. Le modèle suivant est capable d'expliquer une telle dépendance d'activité sur le pH.

1086

18

16

14

12

10

8

6

pH

Vmax

(uni

ts/m

g)

EH + S ESH +E P

E- ES-

EH2+ ESH2

+

k2k1

k-1

KE2

KE1

KES2

KES1


Dans ce modèle simple, seulement EH et ESH possède de la compétence catalytique. Implicite dans ce modèle, il est assumé que l'échange des protons se fait sur le régime de l'équilibre rapide. Ceci est raisonnable vu que la constante de deuxième ordre pour l'échange d'un proton est rapide − 109 M-1.s-1. L'échange rapide parmi les populations fait en sorte que les espèces EH et ESH sont réduites par des facteurs, f1 et f2, dépendant de leur constante d'ionisation ou pKa. Les facteurs f1 et f2 ont la forme suivante :

] H[K + 1 +

K] H[ = f

] H[K + 1 +

K] H[ = f

+ES2

ES1

+

2+E2

E1

+

1 ;

L'équation de Michaelis-Menten pour ce schéma possède la même forme suivante :

] [S + K] [S V = v

app M,

app ,i

MAX

où VMAX,app et KM,app sont des constantes michaeliennes ‘apparentes’ et réfèrent seulement aux formes actives de l'enzyme. Cette relation ressemble à celle obtenue de l’inhibition mixte vu que les constantes sont définis par

VMAX,app = VMAX / f2 et KM,app = KM (f1/f2). L'analyse de la relation log VMAX,app vs pH fournie les valeurs de KES1 et KES2

correspondantes à l’état lié - tandis que la relation de log (VMAX,app / KM,app) vs pH informe sur les valeurs de KE1 et KE2, celles de l’enzyme et substrat libre. Ceci implique la détermination des paramètres VMAX,app et KM,app à des pH différents.

Les pKa (log KEi ou log KESi) déterminés à l’aide des logiciels donnent des indices importants sur l'identité des acides aminés au site actif.

Par exemple, pKa ≈ 4 suggère un résidu Asp ou Glu essentiel pour l'activité de l'enzyme. Des valeurs pKa ≈ 6 ou ≈ 10 suggère des résidus His ou Lys, respectivement. Cependant un groupement carboxylate d'un résidu Asp en pont salin (interaction électrostatique) avec un groupement Lys est stabilisé par la charge positive de Lys et possède un pK plus bas (plus difficile à protoner).

N C

O

O

H

HH

pKa

Lys Asp


Inversement un groupement aminé dans une région peu polaire est moins basique que dans une région polaire. Dans ce cas, il s’agit du fait qu’un résidu chargé est toujours plus difficile à stabiliser dans une région hydrophobe que sa forme neutre correspondante.

Donc il faut être prudent dans l'identification des groupements essentiels pour l'activité catalytique. RÉACTIONS BISUBSTRATS

Les réactions enzymatiques impliquant deux substrats et deux produits représentent ≈ 60% des réactions biochimiques connues.

Presque toutes les réactions bisubstrats sont soient des réactions transférases où l'enzyme catalyse le transfert d'un groupement fonctionnel spécifique, X, d'un substrat à l'autre, soient des réactions oxydation - réduction où des équivalents réducteurs sont transférés entre deux substrats. Parmi toutes les réactions bisubstrats (bi bi) possibles seulement quelques sont observés.

Il y a deux classifications mécanistiques majeures. a) Réactions séquentielles ou tous les substrats doivent combiner avec

l'enzyme avant qu'il y ait transformation de substrat en produit. Le transfert du groupe X de A (= P - X) à B donne P et Q (= B - X) est connu sous le nom de réactions à déplacement simple. Il y a deux sortes de réactions dans l’addition des substrats.

E P - X + B ⇌ P + B - X

NH3

pKa

NH2 Micro-environnementhydrophobique


i) Mécanisme séquentiel au hasard

ii) Mécanisme ordonné ou obligatoire

b) Réactions ping pong où un ou plusieurs produits sont libérés avant que tous les substrats aient participé dans la réaction. Dans la réaction ping pong bi bi, le produit P est libéré après l'attachement de substrat A et l'enzyme devient accepteur du groupement X. La liaison de B à l'enzyme permet le transfert d'X au produit Q. Mécanisme enzyme substitué (ping pong)

- ces réactions connues sous le nom déplacement double impliquent une modification de l'enzyme et les deux substrats, A et B, ne se rencontrent pas sur la surface de l'enzyme.

Les équations cinétiques pour le cas bisubstrats sont plus complexes et il est

possible de distinguer entre les mécanismes différents.

EA E EAB ⇌ EPQ

EB

E E

EP

P

P

Q

Q A

A B

B

A B P Q

E EA ⇌ E’P E’ E’B ⇌ EQ E

E EA EAB ⇌ EPQ EQ E

A B P Q


MÉCANISMES CATALYTIQUES La catalyse est un processus qui augmente le taux par lequel une réaction

atteint l’équilibre. La raison que les enzymes sont des catalyseurs puissants est due à leur

spécificité de liaison au substrat et leurs arrangements optimaux des groupements catalytiques.

Les mécanismes que les enzymes utilisent sont classifiés de manière suivante :

● L'enzyme fournit les groupes accepteur/donneur de protons, dans un mécanisme de catalyse acide/base.

● L’enzyme peut se combiner de façon covalente avec le substrat pour former un intermédiaire qui permet une réaction plus rapide.

● L'enzyme utilise des ions comme co-facteurs, pour stabiliser différentes charges (intermédiaires), pour ioniser les molécules d'eau et les rendre plus nucléophiles, et/ou pour cacher des charges.

● L'enzyme utilise les forces électrostatiques, pour aligner le substrat et stabiliser l'état de transition.

● L'enzyme fixe le substrat de telle sorte que les liens réactionnels sont situés près du site catalytique et sont orientés de telle sorte que l'état de transition est atteint très rapidement.

● L'enzyme peut induire la distorsion et/ou la tension au niveau du lien à couper, ce qui le déstabilise et le rend plus facile à couper. L'enzyme fixe donc préférentiellement le substrat sous forme d'état de transition.

CATALYSE ACIDE/BASE Une catalyse acide générale est un procédé dans lequel le transfert partiel d'un

proton à partir d'un groupe acide (acide Bronsted - une molécule qui peut fournir un proton) abaisse l'énergie libre de l'état de transition.

Une réaction peut aussi être stimulée par la catalyse basique générale, si le taux de réaction est augmenté par l'abstraction partielle d'un proton par une base (base Bronsted - une molécule qui peut attirer un proton).

Certaines réactions utilisent les deux types de catalyse et si les deux réactions sont simultanées, la réaction devient acide - base générale concertée.


Exemple : La tautomérie cétone - énol; l’état de transition [ ] ressemble à un énolate

Catalyse acide générale - l’acide, AH, est donneur de son proton H

Catalyse base générale – la base, :B, joue le rôle d’accepteur de proton cétone H

δ+

δ-

δ- C

CH2

H

R

O C

CH2

H

R

O C

CH2

R

O H

δ+

δ-

δ- δ- δ+ C

CH2

H

R

O C

CH2

H

R

O C

CH2

R

O HH A+ H A

H+

+ A-

H2O

H A + OH-

δ+

δ-

δ-

δ-

C

CH2

H

R

O C

CH2

H

R

O C

CH2

R

O H:B+ + B+

:B + H+

B

H+

H


Réaction catalysée par Ribonuclease A illustre la catalyse acide - base générale La RNase A est un enzyme digestif qui hydrolyse l’ARN. Le profil pH de la

réaction démontre un maximum vers pH de 6 et correspond en effet à l'ionisation de deux groupements, His 12 et His 119.

Deux acides aminés histidines (His 12 et His 119) agissent de façon concertée

dans un mécanisme acide/base. 1) His 12 agit comme la base, retirant un proton du groupe 2'-OH de l’ARN,

ce qui permet une attaque nucléophile sur l'atome de phosphore adjacent. De même, His 119 agit comme un acide et provoque le bris du lien en protonant le groupe R'-O-.

2) L'intermédiaire 2'-3'-cyclique est hydrolysé par le processus inverse de l’acide/base. His 12 est maintenant l'acide et His 119 la base.


CATALYSE COVALENTE La catalyse covalente implique l'accélération de la vitesse par la formation

transitoire d'une liaison catalyseur - substrat. La formation de base de Schiff par l'enzyme représente un des mécanismes le

plus souvent rencontré. Dans l’exemple, l'azote protoné dans l’intermédiaire agit comme puit d'électron afin de réduire la barrière de transition de l’énolate.

La formation et la décomposition de la base de Schiff est très rapide et ne représente pas l'étape limitante de la réaction.

La catalyse covalente se divise en deux étapes : 1) la réaction nucléophile entre le catalyseur et le substrat afin de former une

liaison covalente 2) le retrait d'électron du centre réactionnel par le catalyseur qui est devenu

électrophile

Les résidus utilisés sont les groupements : ε-amine de Lys, la portion

imidazole d'His, le groupement thiol de Cys, la fonction carboxyle d'Asp et le groupement hydroxyle de Ser.

δ- δ-

δ-

C CH2H3C

O

C CH2H3C

NR H

Enolate Imine protoné

N

H

HB

+ C O

AH

N C OH

H

N C + OH -

H

Imine protonée

1 2


CATALYSE MÉTALLO-DÉPENDANTE ● Presque un tiers des enzymes connus sont dépendants des ions métalliques

pour leur catalyse Les métalloenzymes se divisent en deux classes qui sont distinguées par la

force des interactions protéine - ion : a) Métalloenzymes possédant des ions métalliques fortement liés comme Fe2+,

Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, ou Co2+. b) Des enzymes activés par des ions métalliques faiblement lie en solution

comme Na+, K+, Mg2+, ou Ca2+. Les ions de métal participent à la catalyse en trois façons majeures :

1) dans la liaison des substrats afin de l'orienter 2) facilitation des réactions oxydation-réduction par leurs changements réversibles de leur état d'oxydation 3) stabilisation électrostatique des charges négatives

Les métaux sont très souvent des meilleurs catalyseurs que des protons parce que les ions métalliques peuvent être présents en hautes concentrations et possèdent des charges stable > +1 super acides

La coordination par le métal rend les molécules d'eaux attachées plus acides et donc une source OH- à des pH neutres.

- par exemple la molécule d'eau dans le complexe (NH3)5 Co3+ (H2O) ionise

(NH3)5 Co3+ (H2O) ⇌ (NH3)5 Co3+ (OH-) + H+ avec un pKa de 6.6 et qui est quelques 9 unités de pH plus bas que celui de l’eau. La conséquence est la création d'un groupement hydroxyle métallo-dépendant qui est un nucléophile puissant.


L'enzyme d’anhydrase carbonique est un bon exemple. L'enzyme utilise le zinc pour catalyser la réaction :

CO2 + H2O ⇌ HCO3- + H+ en trois étapes.

1) coordination d’une molécule de zinc par trois histidines et une molécule d'eau. Il est postulé que l'ionisation de la molécule d'eau est facilitée par catalyse base générale impliquent le résidu histidine-64 voisin – voir figure.

2) attaque nucléophile par le OH- du CO2 et la conversion en HCO3-

3) régénération du site catalytique par la liaison d'une autre molécule de H2O possiblement avant le départ de HCO3

- à travers un intermédiaire du complexe de zinc penta coordonné.

Zn2+ O

H

+ C

O

O

Zn2+ OH

C

O

O -

Zn2+His

H2O

O

H

C

O

O -

H2O

His

HisZn2+ OH

+ C

O

O -

HOH+ +

2

3

3'

Site actif de l’anhydrase carbonique montrant la surface électrostatique. Le CO2, une fois lié, est immédiatement transformé en HCO3

- au fond du site actif.

Site de liaison de

CO2

5iéme site de coordinance

Site actif montrant l’intermédiaire enzyme - HCO3

- stabilisé par le zinc. His-64 active par un relais de 2 molécules d’eau (non montrées) la molécule d’eau qui sert à attaquer le CO2.

His-64 Glu-106

HCO3-

His-96

His-94 His-119


CATALYSE ÉLECTROSTATIQUE Les distributions de charges dans un site actif sont arrangées afin de stabiliser les états de transition. Les simulations sur ordinateur indiquent que la réduction de la barrière de l’état de transition par des effets électrostatiques est un composant important de catalyse. On pense que l'enzyme pliée fournit un environnement polaire pré-organisé qui déjà est partiellement orienté pour stabiliser l'état de transition.

CATALYSE PAR LES EFFETS DE PROXIMITÉ ET FACTEUR D’ORIENTATION

L'alignement spatial des réactifs sur une surface enzymatique permet leur réaction de façon optimale dans le site actif. Les réactions catalysées sont accélérées par la réduction relative en translation et rotation des réactifs. Le tableau montre des exemples des vitesses relatives de la formation d’anhydrides à partir d’esters ayant des degrés de libertés différents.


La bonne orientation des réactifs augmente encore le taux par un facteur 100.

Les enzymes lient les substrats de manière à les immobiliser et les aligner afin d'optimiser leur réactivité. L'énergie pour réaliser ceci provient de l'énergie libre de liaison du substrat avec l'enzyme. CATALYSE PAR LIAISON À L'ÉTAT DE TRANSITION

Le mécanisme de catalyse parmi les plus importants qui est basé sur la notion que la conformation contrainte du réactif ressemble plus à celle de l'état de transition d’une réaction que la conformation non contrainte correspondante

Ceci d'abord suggéré par Linus Pauling en 1946 et élaboré par Wolfenden et Lienhard. Leur principe est le suivant :

Ce principe peut se comprendre de façon suivante : La formation du produit P à partir du substrat S peut se faire de façon

spontanée ou par catalyse enzymatique soit :

et où kN et kE représentent les constantes de vitesse de premier ordre décrivant

les réactions respectives

S PkN

Les interactions qui favorisent la liaison préférentielle à l'état de transition augmentent sa concentration et par conséquent augmentent de façon

proportionnelle la vitesse de la réaction catalysée

ES EPkE


La relation entre les deux réactions est décrite par le schéma suivant :

Par conséquent KT / KR = [S][ES‡] / [S‡][ES] = KE‡ / KN

‡ . (1) Les vitesses de la réaction non catalysée ou catalysée sont les suivantes :

( ) ( ) catalyséenon réaction lapour ][]‡[][ ‡ SKTkSTkSkv NBBN === (2) ( ) ( ) catalyséeréaction lapour ][][][ ‡‡ ESKTkESTkESkv EBBE === (3)

En manipulant les équations 1-3, on obtient KKKKkk RTNENE == ‡‡ (4)

Cette équation indique que plus l’enzyme favorise la liaison à l’état transitionnel (KT) par rapport à la liaison au substrat (KR), plus l’augmentation de vitesse de la réaction catalysée est grande (kE) par rapport à celle de la réaction non catalysée (kN) ; en d’autres mots

Le rapport en énergie libre entre les deux vitesses s’exprime par :

RTG

RTG

‡NN

E

ee

KK

kk E

/

/‡E

‡N

‡

∆−

∆−

==

alors ( )[ ] RTGENNE eRTGGkk /‡‡exp ∆∆−=∆−∆=

Pour gagner un facteur d’accélération de 106 à 25°C, l’enzyme doit lier l’état transitionnel d’avantage par 34.2kJ.mol-1.

Ceci correspond approximativement à l’énergie libre provenant de la formation de deux ponts hydrogène.

La catalyse enzymatique est due à la liaison et à la stabilisation préférentielle de l’état transitionnel (S‡) par rapport à celle du substrat (S)

KR

KNS

KT

E + S + E P + E où KN =[E][S ]/[E][S]

KR = [ES]/[E][S], KT = [ES ]/[E][S ]

ES ES EP et KE =[ES ]/[ES] sont tous des constantes d'association

KE


Donc la liaison préférentielle à l’état transitionnel due à la formation de seulement deux ponts hydrogène qui ne sont pas présents dans le complexe ES augmenterait la vitesse par un facteur ~106

Dans l’approximation de l’équilibre rapide, KR = 1/KM, ke = kcat et définissant la constant dissociation de l’état de transition par K‡

diss = 1/KT ; l’équation 4 devient

Mettons kN ~ 10-6 s-1 et kcat/KM ~ 106 M-1 s-1 où KM ≈ KS ~ 10-4 M et kcat = 102s-1 K‡

diss = 10-12 M pour l’état de transition d’une enzyme typique • Dans cet optique « un bon substrat ne se lie pas nécessairement à son enzyme

avec une affinité élevée mais pourra le faire lors de l’activation à son état transitionnel » Si un enzyme lie préférentiellement le substrat à l’état transitionnel, il est

donc possible d’envisager des molécules stables qui ressemblent plutôt à S‡ ou une de ses composantes. Ces types de molécules sont considérés des analogues de l’état transitionnel et ils sont des inhibiteurs compétitifs parmi le plus puissant.

non catalysée

Minimum d’énergie puisque l’enzyme favorise

la liaison de ces ligands

Stabilisation implique la réduction de la barrière de l’état de transition

Le fait que les enzymes lient d’avantage les états transitionnels plutôt que le substrat représente le principe fondamental dans le design des médicaments et dépend de la

connaissance au niveau moléculaire du mécanisme réactionnel de l’enzyme.

( )catMNdiss kKkK =‡

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